Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Актиоксидантные и гиполипидемические свойства ликопина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Актиоксидантные и гиполипидемические свойства ликопина"

На правах рукописи

НЕСТЕРОВА Ольга Александровна

-те

ЛНтаОКСИДАНТНЫЕ И ГИПОЛИП11ДЕМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЛИКОПИНА

03.00.04 - Биохимия 14.00.16 - Патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ РФ (Москва).

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор КАПИТАНОВ А.Б. доктор медицинских наук, профессор ЭТТИШПЕР А.П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор ЯГУЖИНСКИЙ Л.С. доктор медицинских наук, профессор ДЕМУРОВ Е.А.

Ведущее учреждение: Институт биомедицинской химии РАМН

Защита состоится "Л? » 1997г.

в /Р часов на заседании Диссертационного Совета Д.084.66.01 в Научно-исследовательском институте физико-химической медицины МЗ РФ по адресу : 119828 Москва, ул. Малая Пироговская, 1а.

С диссертацией можно ознакомиться в бибилиотеке НИИ ФХМ МЗ РФ по адресу: 119828 Москва, ул. Малая Пироговская, 1а.

Автореферат разослан " /у »•уЛЛ^ьц*) 1996 г

Ученый секретарь Диссертационного Совета Сх1 7 у МУРИНА М.А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время хорошо известно, что активные формы кислорода и свободные радикалы принимают участие в патогенезе многих заболеваний. Протекание свободнорадикальных реакций в липидной фазе биомембран приводит к нарушению их физико-химических свойств и изменению работы мембранных ферментных систем [Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972; Журавлев А.И., 1982; Абрамова Ж.И., Оксегендлер Г.И., 1985; Vladimirov Y.A., 1986; Владимиров Ю.А. и др., 1991].

При нормальных условиях аэробные организмы защищены от такого воздействия согласованным функционированием различных антиоксидантных систем, а также определенным соответствием между скоростями процессов метаболизма и катаболизма, протекающих в клетке. Однако, при сдвигах в стационарном протекании радикальных процессов требуется модуляция антиоксидантного статуса организма. В связи с этим большой интерес в последнее время проявляется к харотиноидам - природным пигментам, синтезируемым растениями и микроорганизмами [Canfield L.M. et al., 1992].

Каротиноиды представляют собой Сад-соединения, построенные из восьми изопреновых фрагментов. Активность каротиноидов, как антиоксидантов, связана с наличием у них функциональной полиеновой цепочки. Основная функция каротиноидов в растительной клетке - защита ее структур от повреждающего действия свободных радикалов, образующихся в процессе фотосинтеза [Бриттон Г., 1986; Krinsky N.I., 1994]. У жиеотных каротиноиды не синтезируются de novo, однако, попадая в организм с растительной диетой и включаясь в клеточный метаболизм, проявляют определенную биологическую активность. Помимо провитаминной функции, выявленная в последнее время у Р-каротина и у других каротиноидов антиоксидангная активность помогает объяснить их роль в предотвращении развития катаракты [Barret В.М. et al., 1994], радиационном поражении [Беляев И.К. и др., 1992; Капитанов А.Б. и др., 1994], возникновении и развитии сердечно-сосудистых заболеваний [Kohlraeir L., 1994], а также в ингибировании мутагенеза и трансформации эукариотических клеток [Okuzumi J. et al., 1992; Rousseau E.J. et al., 1992].

Следует отметить, что несмотря на широкий спектр биологической активности каротиноидов и те обстоятельства, что вещества этого класса

нетоксичны, легко доступны и сравнительно дешевы в получении, известны лишь некоторые зарубежные медицинские препараты на основе ß-каротина (обычно в комплексе с витаминами Е и С) [Сергеев A.B. и др., 1992]. Отечественных же лекарственных препаратов, как на основе ß-каротина - самого популярного представителя класса каротиноидов, так и на основе его структурных аналогов, не существует. Наряду с этим известно, что близкие по строению к ß-каротину другие каротиноиды, такие, например, как астаксантин, кантаксантин и ликопин, являются более сильными антиоксидантами [Капитанов А.Б., Пименов A.M., 1996]. Однако разработка эффективных средств лекарственной терапии на основе этого класса соединений требует детального сравнительного изучения их биологической активности.

В связи с вышеизложенным целью данной работы являлось изучение антаоксидантных и гиполипидемических свойств ликопина.

Для этого необходимо было решить следующие конкретные задачи.

1. Разработать метод получения ликопина из растительного сырья.

2. Провести сравнительное изучение антаоксидантных свойств ликопина в условиях in vitro и in vivo.

3. Изучить влияние ликопина на развитие экспериментального гиперхолестериноза у лабораторных животных.

Научная новизна. Разработан метод получения лгасопинсодержащего липидного экстракта (концентрата томатного масла) и ликопина из плодов томатов и проведена их физико-химическая характеристика. Решение поставленных задач позволило впервые установить, что концентрат томатного масла обладает защитным действием при отравлении лабораторных животных четыреххлористым углеродом, а ликопин - гиполипидемическим действием на животных при моделировании у них состояния гиперхолестериноза.

Практическая значимость работы. Концентрат томатного масла и ликопин оказывают выраженный гиполипидсмическнй, антиатерогенный и

антиоксидантные эффекты (Патент РФ №95113015). Полученные результаты являются предпосылкой дня разработки новых фармакологических гепатопротекторных препаратов, а также препаратов для коррекции уровня холестерина в крови больных атеросклерозом.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на заседании лаборатории биотехнологии (1995, 1996), на заседании отдела биохимии (1994, 1996), а также на итоговой научной конференции НИИ ФХМ МЗ РФ (1995), на 2 Международной конференции "Антиоксидантные витамины и бета-каротин в предупреждении заболеваний" (Берлин, 1994), на Международном Симпозиуме по природным антиоксидантам (Пекин, 1995), на 3 Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 1996), на 66 Европейском Антиатеросклеротическом Конгрессе (Флоренция, 1996). Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, экспериментальной части (результаты и их обсуждение), выводов и списка цитируемой литературы. Изложена на 100 стр, включая 12 рисунков. Список литературы содержит 180 ссылок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Материалы и методы исследования Многослойные фосфолипидные липосомы готовили по методике, описанной в [Bangham A.D. et al., 1965]. В случае приготовления эмульсий липосом, содержащих антиоксиданты (а-токоферол (а-ТФ), ß-каротин, ликопин), антиоксиданты предварительно растворяли в хлороформе и добавляли к раствору фосфолипидов. Индукцию перекисного окисления липидов (ПОЛ) (1-с2+-аскорбат) - системой в липосомах и тканевых гомогенатах проводили как описано в [Деев А.И., 1977, 1978]. Содержание ликопина в печени и сыворотке 1фови животных определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии как описано в [Капитанов А.Б. и др., 1994] с небольшими модификациями. Соотношение транс- и цис-формы в препарате ликопина определяли с помощью расчетной программы "Winpeak" ("Biotronik Германия).

При определении липидного состава образцов использовали пластины Kiezeigel 60 ("Merck", Германия). Разделение компонентов и определение их количества проводили по [Грибанов Г.И., 1980], используя липидные стандарты ("Sigma", США). Жирнокислотный состав препаратов определяли с использованием газожидкостной хроматографии [Капитанов А.Б. и др., 1990]. Микросомы печени крыс выделяли с помощью дифференциального

центрифугирования по методике [Archakov A.I. et al., 1973]. Концентрацию белка в пробах определяли микробиурегговым методом [Кочетов Г.А., 1980]. Общий холестерин (ХС) и триглицериды (ТГ) в сыворотке крови животных определяли как описано в [Roeschlau P. et al., 1974] и в [Bucolo G-, David H., 1973], соответственно. Содержание ХС в липопротеидах высокой плотности (ХС-ЛВП) определяли по [Assman G. et al., 1983], ■ • Содержание ХС в печени и аорте

определяли по модифицированному методу Абеля [Duncan I. et al., 1980], а ТГ - по модифицированному методу Готтфрида [Gottflried S., Rosenberg В., 1973]. Морфометрическое исследование аорт лабораторных животных проводили с использованием сетки Автандилова [Автандилов Г.Г., 1973]. Для проверки достоверности различий между средними арифметическими значениями параметров применяли t-критерий Стьюдента. При проведении статистических расчетов использовали компьютерную программу "Statgraphics" ("Statistical Graphics Corp.", США).

2. Основные результаты исследования и их обсуждение 2.1. Разработка метода получения ликонина и концентрата томатного масла Из исходного материала - томатной пасты, экстрагировали липофильные компоненты малополярным органическим растворителем. Препарат ликопина выделяли из полученного экстракта (далее по тексту концентрат томатного масла (КТМ)) кристаллизацией в системе - малополярный органический растворитель / спирт. Изучение сравнительной эффективности эксграгентов, используемых для извлечения ликопина из сырья, выявило, что в таком качестве наиболее выгодно использовать хлористый метилен, а в качестве осаждающего спирта - этанол. После кристаллизации ликопин промывали этанолом и высушивали.

По результатам ТСХ большую часть КТМ составляют диглицериды (ДГ). фосфолипиды (ФЛ) и свободные жирные кислоты (СЖК) (не более 36%, 29% и 20%, соответственно). Жирные кислоты представлены в основном пальмитиновой, линолевой и леноленовой кислотами (соответственно, 34,02 и 39,54 и 18,10% от общего количества жирных кислот). Содержание ликопина составляет не менее 5%. На рис.1 представлены хроматограммы ликопина и КТМ, полученные при 460 нм и

12

Ликопин, Х=460 ни

60.0 (т|г\)

Лнхопин, Я.=210 пн

Концентрат томатного наспа, Х=460 им

50 <5 <0

35 30 25

Концентрат томатного маета, Х=210 вн

о о 20.0 40.0 ЕО 0 (т.11)

Рис. 1. Хроматограммъх препаратов ликопнна и концетрата томатного масла.

он

20 0

210 им. Анализ хроматограмм позволяет сделать вывод о том, что помимо основной составляющей части - ликопина (70 - 75%) кристаллический препарат содержит в виде балласта более полярные липидные компоненты. КТМ содержит как более полярные по сравнению с ликопином липидные компоненты, так и менее полярные. В состав КТМ входит также не более 0,5% 3-каротина. Длины волн, соответствующие максимумам поглощения раствора прапарата ликопина в гексане, удовлетворительно соответствуют литературным данным [ВпИоп О., Ооос1ут ТЛУ., 1982] : Х|=454±2 нм, Хг=472±2 нм, Х,з=504±2 нм. Анализ количественного соотношения цис- и транс-формы ликопина в кристаллическом препарате показал, что в нем содержится 95,8 % трансформы и 4,2% цис-составляющей.

Данная методика позволяет получать 3,5 - 4,0 г КТМ и 90-130 мг ликопина из 1 кг томатной пасты при степени чистоты препарата ликопина не менее 70-75%.

2.2. Изучение стабильности препаратов концентрата томатного масла и ликопина и разработка способа их введения лабораторным животным Из-за склонности ликопина к аутоокисленгао за полгода хранения препарата кристаллического ликопина при температуре 0-(-5)° С содержание восстановленного каротиноида в нем падало в два раза. При использовании водорастворимой липосомальной формы ликопина не удалось достичь желаемой концентрации вещества в органах-мишенях. Так, при внутрибрюшинной инъекции крысам липосомальной эмульсии в обьеме 1,5 мл (концентрация ФЛ в эмульсии 50 мг/мл, молярное соотношение ЛК/ФЛ = 0,3) максимальная концентрации ликопина в тонкой кишке была порядка 0,9х10'3, а в печени - 9х10"3 мкг/г ткани. Исследовали также стабильность водорастворимых комплексов ликопина с циклодекстрином, стабилизированных а-токоферолом, ионолом или аскорбатом. При этом наблюдали быстрое окисление ликопина в препаратах (на 75% - 80%) уже через 16 дней при хранении их в сухом виде при температуре 0-(-5)° С.

Наряду с этим исследовали стабильность раствора ликопина в оливковом масле. Такой масляный раствор сохранял стабильность продолжительное время, однако максимально достижимая концентрация растворенного ликопина составляла 0,22%.

Учитывая эта результаты, в дальнейших фрагментах работы использовали препарат кристаллического ликопина в кратковременных экспериментах и КТМ - при длительных, так как процентное содержание ликопина в КТМ оставалось неизменным в течение полугода хранения при температуре 0-{-5)°С. Наряду с этим использование КТМ повышало биодоступность вещества в органах-мишенях. Так, при том же режиме внутрибрюшинного введения КТМ крысам, что и для описанной выше липосомальной формы, концентрационные параметры абсорбции ликопина тканями тонкого кишечника и печени составляли 0,32 и 0,23 мкг/г ткани, соответственно.

2.3. Ипгибирование ликопином и КТМ ПОЛ в фосфолтщдиых липосомах Сравнительное изучение антиоксидантной активности а-ТФ, 0-каротина и ликопина проводили, исследуя накопление ТБК - активных продуктов в реакционной среде, индуцированное (Ре2+-аскорбат)-системой, при введении веществ в липосо-мальные мембраны. При выбранных экспериментальных условиях ликопин был в 3,3 раза активнее 0-каротана и в 23,5 раза менее активен, чем а-ТФ (рис. 2).

Рис.2. Влияние а-токоферола (1), ликопина (2), Р-каротина (3) и азида натрия (4) на накопление ТБК-активных продуктов в процессе перок-сидации фосфолипидных липосом в присутствии (Ре2+ -аскорбат) - системы (по оси абсцисс снизу - молярное соотношение препаратов (кроме азида натрия) к фосфолипидам, по оси абсцисс сверху - то же для азида натрия).

Инкубация липосом с азидом натрия - известным тушителем 'Ог, к существенному торможению накопления МДА не приводила, несмотря на то, что концентрация азида натрия в 10-1000 раз превышала концентрацию антиоксидантов.Этот факт дает

основание предположить, что антиоксидантный эффект каротиноидов в данной модельной системе обусловлен взаимодействием их с радикалами, образующимися в липидной фазе липосомальных мембран, а не перехватом активных форм кислорода.

Исследование антиоксидантных свойств КТМ в той же модельной системе показало, что его антиоксидантный эффект обусловлен наличием в нем ликопина и р-каротина. Это заключение основано на том. что при одинаковом количестве некаротиноидных компонентов КТМ, введенных в состав фосфолшищных липосом, больший процент ингибирования ПОЛ наблюдался в случае использования в эксперименте 5%-го по ликопину КТМ по сравнению с 0,15%-ым КТМ (рис.3).

ВДА. икМ 3 -Л-

О, 04 0. 08 0, 40 0. 60

m наполнителя/т ФЛ

Рис.3. Зависимость накопления ТБК-ахтивных продуктов от концентрации ликопина в концентрате томатного масла при (Ре2+-аскорбат) - зависимом окислении фосфоли-пидных липосом ( ■¡■I - КТМ с 5%-ым содержанием ликопина,

КИЯ- КТМ с 0,15%-ым содержанием ликопина).

1А. Влияние КТМ на ПОЛ в печени и плазме крови крыс при отравлении их четыреххлорисгым углеродом Моделирование in vitro отравления животных ССЦ и ингибирования этого процесса антиоксидантами проводили на микросомальной фракции печени крыс. Концентрация антиоксидантов, необходимая для ингибирования ПОЛ на 20% (IC20) была равна для р-каротина 20 + 2 мкг, а для ликопина и КТМ - 0,20i0,06 мкг/г белка. Во второй серии экспериментов изучали влияние КТМ как агента, снижающего токсический эффект CCU, на трех группах животных: интактных (I группа),

отравленных CCU (2 группа), и получавших КТМ в дозе по ликопину 50мг/кг одновременно с отравлением CCI« (3 группа). Гистограмма на рис.4 демонстрирует различия в накоплении ТБК-активных продуктов в печени и плазме крови животных трех групп. Анализ данных показал, что уровень накопления МДА в гомогенате

Рис.4. Влияние КТМ на содержание ТБК-активных продуктов в печени и плазме крови крыс при введении им четыреххлористого углерода (И - интактные животные, СС14 - отравленные четы-реххлористым углеродом, ССЬ+КТМ - животные, получавшие КТМ на фоне отравления; ННН ~ эндогенный уровень ТБК-активных продуктов в плазме крови крыс, мкмоль/мл плазмы, ишншишнши -содержание ликопина в печени животных, мкг/г ткани, - эндогенный уровень ТБК-активных продуктов в печени жи-

вотных, мхмоль/г ткани, I I - уровень ТБК-активных продуктов в печени животных при индукции ПОЛ (Ре2+-аскорбат) - системой, мкмоль/г ткани).

са4 cci4 + кгм

печени животных 3-й группы был ниже на 40% (р<0,05), чем таковой у животных 2-й группы в случае эндогенного окисления и на 31% (р<0,00!) - в случае индуцированного. Уровень накопления МДА в плазме крови при эндогенном окислении у животных 3-й группы на 35% ниже (р<0,001), чем у крыс 2-й группы. Различия в интенсивности процессов ПОЛ в тканях печени соотносились с содержанием ликопина в этом органе. Так, у животных третьей группы в тканях печени содержание ликопина составило 16,44±3,94 мкг/г ткани, в то время как в печени крыс первой и второй групп всего лишь 0,0110,001 и 0,02+0,001 мкг/г, соответственно. Полученные данные, на наш взгляд, позволяют сделать вывод о защищающем эффекте КТМ при отравлении крыс ССЦ.

Таким образом, ликопин и КТМ способны проявлять антиоксидантную активность в экспериментах in vitro и in vivo.

2.5. ГЬполипвдемнческое действие ликопина

Согласно Владимирову Ю.А. с соавторами [19913« Беляеву И.К. с соавторами [1992], окисление липопротеидов крови играет основную роль в патогенезе атеросклероза. Для выявления гиполипидемического эффекта ликопина проделаны две группы экспериментов, на крысах и кроликах.

2.5.1. Влияние ликопина на развитие экспериментального гиперхолестериноза

у крыс

На рис.5 показано влияние ликопина (ПК) при добавлении его в диету в составе КТМ на накопление ХС в органах крыс при содержании их на атерогенноб диете и последующей спонтанной регрессии гиперхолестериноза. Потребление ликопина приводило к общему снижению скорости накопления ХС в сыворотке крови и органах в процессе развития холестериноза (группа 3 по сравнению с группой 2), и более быстрому его выведению из тканей в процессе регрессии (группа 5 по сравнению с группой 4).

Динамика изменения содержания ХС по фракциям ЛП сыворотки крови и коэффициента атерогенности (КА) представлена в таблице 1. Видно, что развитие процесса в данной экспериментальной модели характеризовалось возрастанием содержания ХС в составе ЛНП и снижением в ЛВП. Включение ликопина в диету приводило к снижению содержания ХС-ЛНП в два раза при развитии у животных гиперхолестериноза и к снижению этого показателя в 1,4 раза при регрессии процесса по сравнению с контролем. В том и другом случае содержание ХС-ЛВП изменялось незначительно. В результате действие ликопина приводило к замедлению роста КА почти в три раза при развитии гиперхолестериноза и ускорению процесса снижения КА почти в 1,5 раза в ходе его регрессии.

Влияние КТМ на накопление ХС в клетках печени и его последующего выведения не было достоверным. Введение КТМ в рацион животных на атерогенном фоне приводило к 85%-ному снижению уровня ХС в аорте животных 3-й группы по сравнению с атерогенным контролем (2 группа). В ходе регрессии различие в уровне ХС у животных 5 и 4 групп составляло 100%.

ХС, иг/дл

150 100 50-| 0

СЫВОРОТКА КРОВИ (Р2.з <0,05; Р4.5 < 0,05)

О 17

19 недели

ПЕЧЕНЬ (Р2-3; Р4-5 - различия ие достоверны)

19 недели

1.5

ХС. мг/г ткави

АОРТА (Рг-з^ 0,001; Р4.5 <. 0,05)

19 недели

Рис.5. Содержание холестерина в сыворотке крови и органах крыс в процессе развития и в ходе регрессии экспериментального гиперхолесгериноза (1 I - интактные животные и часть интахгных животных, находившихся 17 недель на стандартной диете, .

животные, получавшие КТМ на атерогенном фоне, 1ВН1 - животные, находившиеся на атерогенной диете, - животные, получавшие КТМ в процессе регрессии,

I ■. | - животные, находившиеся на стандартной диете в процессе регрессии).

Таблица 1. Влияние ликопина (5 мг/кг) в составе КТМ на показатели обмена холестерина в сыворотке крови крыс, содержавшихся 17 недель на атерогенной диете и при двухнедельной диетотерапии (М±т; Н-нормальная диета, N - количество животных в группе, ХС-ЛНП рассчитывали по формуле (ХС-ЛНП)=(ХС-(ХС-ЛВП)), коэффициент атерогенности (КА) рассчитывали по формуле КА = (ХС-ЛНП) / (ХС-ЛВП)).

Группа/ Тип диеты N ХС-ЛВП, ХС-ЛНП, КА

Недели мг/дл мг/дл

Интактные/ 0 Н 40 52,5±3,1 . 31,4±3,1 0,6±0,02

1/17 Н 8 53,1±3,0 32,0±3,2 0,6±0,02

2/17 Н+ХС 24 37,9±3,1 115,4±9,6 3,1±0,3

3/17 Н+ХС+ЛК 8 52,0±2,1 64,1+4,5 1,2±0,04

4/19 Н 8 30,0±2,4 100,1±8,6 3,2±0,3

5/19 Н+ЛК 8 30,0±1,3 68,6+7,2 2,4±0,1

Р.-2 ^0,05 <0,01 <0,01

1*2-3 <0,05 <0,05 ¿0,05

Рф5 <0,05 <0,05 <0,05

2.5.2. Влияние ликопина на развитие экспериментального атеросклероза у кроликов

В предварительном опыте на кроликах было выявлено, что потребление животными в процессе регрессии на фоне обычной диеты высоких доз препарата кристаллического ликопина (50 мг/кг в течение 14 дней) в три раза снижало содержание в сыворотке крови общего ХС; при этом уровень ХС-ЛВП возрастал вдвое. Это сопровождалось семикратным снижением концентрации продуктов ПОЛ в сыворотке крови и пятидесятикратным - в печени кроликов, потреблявших препарат ликопина.

Во второй серии экспериментов по динамике развития атеросклероза и последующей регрессии атеросклеротического состояния использовали КТМ. Добавление ликопина в корм животных без холестеринового фона (первая группа) в течение 30 суток приводило к снижению коэффициента атерогенности в 20 раз (рассчитано по данным табл.2). При этом у животных, употреблявших на фоне нормальной диеты КТМ с 0,1%-м содержанием ликопина из расчета одинакового с группой 1 по массе количества некаротиноидных компонентов КТМ (группа 1к), достоверных изменений в липидных параметрах относительно интактных кроликов отмечено не было. Анализ изменения содержания ХС по фракциям показал, что наиболее резкая реакция на атерогенную диету наблюдалась в ЛНП, в составе которых содержание ХС к 60-м суткам кормления возрастало почти в 40 раз; эффект

ликопина сводился к уменьшению интенсивности этого процесса вдвое (табл.2 и рис.6, 3 группа по сравнению со 2). При этом содержание ХС-ЛВП оставалось на прежнем уровне в случае употребления ликопина на фоне нормальной диеты (группы 1 и 1к) и возрастало всего лишь в 1,5 раза как у животных 2-й, так и 3-й группы.

Таблица 2. Влияние ликопина (10мг/кг) в составе ЬСТМ на липидный состав сыворотки крови кроликов при содержании их на атерогенной диете и последующей ее отмене (M±m; N - количество животных в группе, группа 1к получала КТМ с содержанием ликопина 0,1%).

Группа/Дни Тип диеты N ХС, мг/дл ТГ, мг/дл ХС- ЛВП, мг/дл ХС-ЛНП, мг/дл

Интактные/ 0 Н 35 57,7±7,9 191,5±19,1 20,0±2,3 38,6±4,1

1/30 Н+ЛК 6 21,4±8,3 114,8±9,б 20,1 ±0,9 1,5±0,2

1к/30 Н+ЛК 5 49,2±7,8 112,7±8,12 20,5+3,7 28,7±4,7

2/30 3/30 Н+ХС Н+ХС+ЛК 18 6 957,1±212,1 448,3±176,0 221,4+33,1 214,81122,8 29,5±1,0 30,3±4,8 930,2±160,8 420,1 ±210,1

2/60 Н+ХС 18 1447,6±202,7 393,8±120,6 23,2+2.7 1419.3+210,1

3/60 Н+ХС+ЛК 6 856,5±393,4 296,5±176,5 34,5±2,3 820,1 ±92,1

4/70 Н 6 954,3±159,6 258,0±45,5 22,3±1,8 931,6+165,1

5/70 Н+ЛК б 652,0±112,8 428,5± 109,9 22,0±4,0 606,4±73,6

4/84 н 6 625,0±122,0 238,0±22,0 23,0±3,8 600,1 ±84,2

5/84 Н+ЛК 6 350,5±140,9 197,5±9,5 23,5±8,5 325,1±107,4

Ринтакшые/0- 1к/30 Ринтшстные/О-ШО Ри/зо Рг-з/60 P4-J/70 Рч-5/84 <0,01 <0,05 <0,001 <0,001 <0,05 <0,001 <0,05 <0,05 <0,05 <0,01 <0,05 <0,001 <0,05 <0,001

При регрессии состояния искусственно созданной гиперхолестеринемии содержание ХС-ЛНП при добавлении ликопина в диету уменьшалось вдвое быстрее по сравнению с регрессией без ликопина (табл.2, рис.6, группа 5 по сравнению с группой 4). Эффект ликопина на содержание ХС-ЛВП в процессе регрессии также отсутствовал.

Наряду с замедлением накопления ХС у кроликов, получавших КТМ на фоне атерогенной диеты, или его выведением в случае употребления КТМ без холестеринового фона, концентрация ТГ у животных 3 и 2 групп достоверно не различалась в процессе развития гиперхолестеринемии, однако к концу

регрессионного периода наблюдалось достоверное различие в скорости спада этого параметра после отмены атерогенной диеты у животных 4 и 5 групп. При этом уровень ТГ у животных 5 группы был на 40% ниже уровня ТГ у животных 4 группы (табл.2).

Рис.6. Влияние ликопина на коэффициент атерогенности крови кроликов в процессе развития экспериментального атеросклероза и его последующей регрессии (Рг-з(60 дней) <0,01; Р4-5(84дня)<0,05).

Достоверного влияния ликопина на концентрацию ХС и ТГ в печени кроликов как в процессе развития экспериментальной гиперхолестеринемии, так и в ходе регрессии отмечено не было (табл.3).

Таблица 3. Влияние ликопина (10 мг/кг) в составе КТМ на содержание липидов печени кроликов при развитии искусственной гиперлипидемии и последующей ее регрессии (М ± т).

Группа/Дни Тип диеты ХС, мг/г ткани ТГ, мг/г ткани

Интактные/О Н 29,2±1,3 2,1±0,3

2/60 Н+ХС 49,4±8,9 2,7±0,8

3/60 Н+ХС+ЛК 32,1 ±6,4 4,3+1,4

4/84 Н 22,8+3,0 1,2±0,2

5/84 Н+ЛК 26,9±1,5 1,2±0,1

Рг-з/бо Рл-5/84 - -

Развитие искусственно созданной гиперлипидемии сопровождалось накоплением продуктов ПОЛ в сыворотке крови и в печени (рис.7 и 8, соответственно), при этом употребление КТМ с атерогенной диетой приводило к двукратному снижению концентрации ТБК-активных продуктов как в печени, так и в сыворотке животных 3 группы по сравнению с животными 2-ой. Весь спектр описанных выше

изменений сопровождался увеличением почти на два порядка концентрации ликопина в сыворотке крови животных, получавших КТМ на фоне атерогенной диеты по сравнению с животными, находившимися исключительно на атерогенной диете (рис.7, группы 3 и 2). Неожиданным оказался тот факт, что концентрация ликопина в сыворотке крови кроликов 3 группы, употреблявших КТМ на фоне атерогенной диеты, на порядок превышала этот параметр у животных первой группы, употреблявших только КТМ (на рис.7 не отображено). К концу регрессионного периода содержание ТБК-актавных продуктов в сыворотке крови животных 5 группы было в 1,5 раза меньше, чем у животных 4 группы.

Рис.7. Изменение концентрации ТБК-активных продуктов и ликопина в сыворотке крови кроликов при развитии экспериментального атеросклероза и его последующей рецессии ( I I - эндогенный уровень ТБК-активных продуктов, мкмоль/ мл сыворотки,

ШШШШ - концентрация ликопина. нМ)

Морфометрическая оценка степени атеросюгеротического поражения аорты животных после содержания их в течение 2-х месяцев на атерогенной диете дала следующие результаты: в группе 2 у животных было поражено 51,75110,67% площади аорты, в группе 3 - 19,25110,87%. При последующей 24-дневной регрессии этот параметр не изменялся по сравнению со стартовым уровнем при снятии атерогенной нагрузки и составлял для 4 и 5 групп 52,50110,61% и 52,00+6,56%, соответственно. Это может быть связано с недостаточным временем воздействия ликопина в ходе регрессии.

Рис.8. Изменение концентрации ТБК-активных продуктов и содержания ликопина в печени кроликов при развитии экспериментального атеросклероза и его последующей регрессии ( I I - эндо-

генный уровень ТБК-активных продуктов, мкмоль/г ткани, НЯНИ - содержание ликопина, мкг/г таани).

Полученные результаты демонстрируют выраженное

гипохолестеринемическое действие ликопина на лабораторных животных при моделировании экспериментального атеросклероза.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод получения концентрата томатного масла и ликопина из томатов.

Получаемый с его использованием концентрат характеризуется 5%-м содержанием ликопина, а препарат кристаллического ликопина - 70%-й чистотой. Кристаллический ликопин представлен на 95% транс-формой. Содержание ликопина в составе концентрата томатного масла остается неизменным в течение полугода при 0-(-5)°С.

2. В экспериментах с использованием фосфолипидных липосом показано, что ликопин, как антиоксидант, взаимодействует с радикалами в липидной фазе. При отравлении крыс четыреххлористым углеродом концентрат томатного масла тормозит развитие у животных перекисного окисления липидов печени и плазмы крови.

3. Обнаружено гипохолестеринемическое действие ликопина в опытах с использованием экспериментальных моделей атеросклероза.

Введение в питательный рацион крыс и кроликов концентрата томатного масла приводит к торможению накопления холестерина в сыворотке крови, печени и

аорте и к более быстрому его выведению из тканей при регрессии гиперхолесгеринемии.

При развитии гиперхолестеринемии у кроликов, а также при ее регрессии, снижение уровня холестерина в сыворотке крови, обусловленное ликопином, сопровождается снижением концентрации продуктов перекисного окисления липидов в тканях.

4. На основании полученных данных концентрат томатного масла и препарат кристаллического ликопина могут быть рекомендованы в качестве пищевых профилактических добавок, а также в качестве основы гипохолестеринемических лекарственных средств для больных атеросклерозом.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Kapitanov А.В., Nesterova О.А.; Klebanov G.I.; Teselkin Yu.O.; Vandanmagsar B. Antioxidant action of Iycopene. Second International Conference "Antioxidant Vitamins and Beta-Carotene in Disease Prevention", Germany, Berlin, 1994. Programm and Abstracts, p.90.

2. Kapitanov A.B., Pimenov A.M., Nesterova O.A., Klebanov G.I., Teselkin Yu. O., Babenkova I.V., Jambalova B.A. Antioxidant activity and related radioprotective and hypolipoderaic action of Iycopene. Inter. Symposium on Natural Antioxidants, China. Beijing, 1995. Abstracts, P.102.

3. Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Жамбалова Б.А. Ванданмагсар Б., Нестерова О.А. Странадко Е.Ф. Влияние липофильных анти-оксидантов на фотосенсибилизированную производными гематопорфирина пероксидацию липосомальных мембран при облучении гелий-неоновым лазером. Биологические мембраны, 1996, т. 13, N2, 133-137.

4. Нестерова О.А., Пименов A.M., Капитанов А.Б., Клебанов Г.И., Жамбалова Б.А., Антиоксидантные свойства ликопина. 3 Российский национальный конгресс "Человек и лекарство", Москва, 1996. Тезисы докл., 39.

5. Олферьев A.M., Капитанов А.Б., Нестерова О.А., Пименов A.M., Сергиенко В.И. Влияние ликопина на развитие экспериментального атеросклероза. Там же., 40.

6. Olferiev A., Pimenov A., Nesterova О., Sergienko V., Kapitanov A. Inhibition of the atherosclerotic alterations in rabbits by Iycopene. 66th Congress of the European Atherosclerosis Society, Italy, Florence, 1996. Abstract book, p. 143.

7. Капитанов А.Б., Пименов A.M., Нестерова O.A., Сергиенко В.И. Способ профилактики и лечения атеросклероза. Патент РФ № 95113015 от 27.07.95.