Аденозиндезаминаза и обмен адениннуклеотидов тромбоцитов при хроническом миелолейкозе

Пестина, Тамара Ивановна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Аденозиндезаминаза и обмен адениннуклеотидов тромбоцитов при хроническом миелолейкозе
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Аденозиндезаминаза и обмен адениннуклеотидов тромбоцитов при хроническом миелолейкозе"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ И МЕДИЦИНСКОЙ ХИМИИ

На правах рукописи УДК 616.155-07:616.155.

ПЕСТИНА Тамара Ивановна

АДЕНОЗИНДЕЗАМИНАЗА И ОБМЕН АДЕНИННУКЛЕОТИДОВ ТРОМБОЦИТОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ МИЕЛОЛЕЙКОЗЕ

Сгтэииаль кость г биохияия - 03. 00. 04

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пссквз, 1992 г.

Работа выполнена в лаборатории ферментов обмена нуклеиновых кислот Института биологической и кедчцннской хинин РАМН

Научные" руководители: член-корреспондент РАИН, профессор Вотрия И.И. кандидат биологических наук Соковнина Я. И.

О&ицнальные оппоненты: доктор биологически): наук Уварив В-Ю. доктор биологических наук Потапова Г.И.

Ведущая организация Московская Медицинская Акадеиия

ни. И. И. Сеченова

Защита состоится « » _1992 г. в _ часоэ

на заседании специализированного совета Д.001. ID, 01 пря Институте биологической к ледацинсксй химки РА!1Ч по адресу: Косква, 119ВЗН. Погодинская уя. , 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

Автореферат разослан « » _1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Павлихнва Д.В.

■"•-КШП]

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Диагностика лейкозов является одной из актуальных задач в современной неяицине из-за прогрессирующего роста заболеваемости и высокой летальности. Хронический инелолей-коз СХИГО, наиболее частая форма среди нелкмфоидных лейкозов. развивается вследствие аномалии гекопоэтической стволовой клетки. Появившаяся аномалия определяет патологию клеток гранулоцитарного. эрцтроцнтарного и иегакарноцитарного ряда. При этой наиболее ранние биохимические изменения наблюдаются в иегакариоцитарном ростке костного козга и тромбоцитах, являющаяся цятоплазяатическики осколками негакариоцнтов. Поэтому биохимические дефекты, обнаруживает.» в тромбоцитах при патологических состояниях, являются наиболее ра-ннин отражением изменений на уровне кроветворного ростка.■

Исследования последних лет показали, что функциональная активность тромбоцитов в основном зазисит от обменных процессов, регулирующих метаболизм аденозинд и их нарушений, обусловленных дефицитом аденозиндезакнназы САДА, КО 3.3.4.45. АДА — вагяейютй фермент на пути утилизации аденозика, катализирует реакции дезамини-рования аденозика до инозина к дезоксиаденозина до дезоксиикозияа.

Нарушение процесса утилизации аденозика приводит к его накопления и как следствие — к нарушению агрегационной функции тромбоцитов. Для получения более точной информации о механизме нарушений Функциональной активности этих клеток кеобхояико детальное исследование обмена адениннуклеотидов. занинающях центральное место в трокбообразовании я обеспечивающих энергетическое обеспечение этапов гемостаза; агрегации, реакции высвобождения. ретракции кровяного сгустка. Для тромбоцитов характерно высокое содержание адениннуклеотидов, ассоциированных в трех функционально и морфологически различных фондах: "пуле хранения". метаболическом пуле и Г-актии-АД®.

Изучение активности и свойств АДА., и роли адениннуклеотидов в яоврездекик тромбсцитарного звена гемостаза, язляется актуальным исследованиек для выяснения возможных причин функциональной неполноценности тромбоцитов з патогенезе ХИЛ.

Цель я задачи исследования. Целья настоящего исследования явилось появление нарушений з активности аденозиндезаниназы, изу— че.чяг свойств данного фермента з тромбоцитах при хроническом

ииелолейкозе в сравнении с АДА доноров, н изучение патогенетической роли адениннухлеотидов в повреждении тронбоцитариого звена гемостаза при ХИЛ.

Для выполнения цех,и исследований необходимо было решить следуюпие задачи :

- определить активность аденозиндезаинназы в тромбоцитах периферической крови при хроническом пиелолейкозе и других миело-и лимфопролиферативных заболеваниях,

- сравнить физико-хиничесхие и кинетические свойства АЛА тромбоцитов доноров и больных ХИЛ,

- изучить корреляцию нехду изменением активности АДА и агрегацион-ной способностью тромбоцитов,

- исследовать уровгнь адекиинуклеотидов (АТО, АД®) на разных стадиях лейкозной иеоплазии, н возможность использования изменений данных показателей для прогнозирования течения ХИЛ и определения функциональной полноценности тромбоцитов.

Научная иовизяа. Изучены физико-хииичаские н кинетические характеристики АДА троябоцитоа в норме и при ХМД. Проведено сравнительное исследование гранулярного и метаболического пула адекик-нуклеотидов иа разных стадиях хронического ииелолейкоза, Выявлены различия в свойствах АДА тромбоцитов больных ХОД в сравнении с донораяи по действие ряда ингибиторов, ионов металлов и теипера-туры. Выявлен биохимический дефект в содержании аяешшнуклеотидов САТ4>, АДФЗ гранул хранения тромбоцитов в разных фазах ХКП. Установлена прогностическая ценность определения уровня АТФ и АД®, разработаиы критерии диагностики фаз заболевания ХМЛ для оценки характера течения патологического процесса и его перехода из одной фазы в другую.

Практическая значимость. Полученные данные об изменении свойств АДА тромбоцитов при ХИЛ иогут быть использованы в качестве показателей анояальиости фермента при дайной патологии, в частности в тех случаях, когда активность АДА находится в пределах или незначительно отличается от нормы. Метод определения аденннкукле-отидов в плотных гранулах тромбоцитов может быть рекомендован для практического здравоохранения в качестве дополнительного критерия определения фаз заболевания ХЩ, функциональной полноценности

тромбоцитов. и для характеристики костко-нозгового кроветворения.

Апробация работы состоялась 2S января 1992 года на межлабораторной конференции НИИ биологической и медицинской химии РАИН.

Основные положения диссертации докладывались на V Всесоюзном биохииическом съезде врачей-лаборангоа СТаллин. 19855. на II Всесоюзном съезде генатологов и трансфузиологов СЛьвов. 19853. на V Всесоюзном биохимическом съезде СКиев, 1986Э. Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы диагностики заболеваний системы крови" ССухуми, 19885, симпозиуме "Генатологкческие к цитологические исследования в клинической лабораторной диагностике" СИвактеевса, 19903, III Всесоюзной съезде гематологов и трансфузиологов СКиров, 1991^.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов. Текст диссертации включает 14,0 страниц, О рисунков, 22 таблицы. Список цитируемой литературы состоит из 246 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТ«

Материалы и метод« исследования.

Работа выполнена на тромбоцитах, выделенных из венозной крови доноров к больных ХИЛ, в период выра.теккой клинической картины заболевания . Вольные находились на лечении в I-ои гекатологическом отделении Всесоюзного гематологического научного центра РАИН. Диагнозы подтверждались данными клинических и цитохимических исследований.

Активность АДА определяли в экстрактах тромбоцитов. Фракцию тромбоцитов получали методой центрифугирования на Фиколле—Пак. В качестве антикоагулянта использовали З.ВУ. раствор цитрата натрия. Выделенные тромбоциты разрушали ультразвуком;, центрифугировали при 2500 g в течение 20 кия, и надосадочнуга жидкость использовали для определения ферментативной активности. Активность АДА определяли раднохиническни методом при насыщающих концентрациях аденозина и !3 условиях линэГшой зависииости количества образующегося продукта СипозпнаЗ от количества фернента я времени инкубации. Реакцией—

пая спесь объемом 300 мкл содержала: 25 кМ (20 кБк ) [8-"с] аде-нозина в 0,05 И трис-HCl. рН 7,4, и 15 мкл (10 миг белка) лизата тромбоцитов. Пробы инкубировали 20 мин при 37°. Реакцию останавливали помещением на 2 мин в хилящую водяную баню с последу»™« охлаждением на льду. Кнозин, образовавшийся в ходе реакции, отделяли от аденозина нисходящей ионообменной хроматографией на бумаге "Whatraan" DE-ei в дистиллированной воде в течение 2 часов. В качестве свидетелей использовали немеченые адеиозин н инозин. Хронато-гранну высушивали и просматривали в ультрафиолете при 254 им. Радиоактивность участков бумаги , соответствующих пятнай аденозина и инозина, определяли в жидкостном сцинтилляционнои счетчике. Удельную активность АДА выражали в наноколях образовавшегося инозина на 1 иг белка экстракта за 1 час. Белок определяли по нетоду Лоури CLowry et al., 1951).

Для расчета Ки АДА пользовались методом линейной трансформации уравнения Михазляса-Шнтен, предложенным Лайнуивером и Бэрком СКорииш-Боуден, 1979Э. Вычисления проводили по программе линейной регрессии на ПКЭВМ "Искра-226 ".

Агрегационную Функции тромбоцитов измеряли по методу Борна С Boni, 1964Э на агрегометре "Elvi-840". Агрегации определяли по изменению трансмиссии света при добавлению к плазме , богатой тромбоцитами , агрегирующего агента н Екраха ли в процентах к каксниаль-но возможной. В качестве индукторов агрегации использовали: АДС в концентрациях (12,5 нМ и 1 мМ), трокбин (0,4 НЕ/ил), адреналин (1 х Ю-' М), коллаген (4 икг/ил) и рнстомицин (1,5 мг/мл).

Электрофорез белков проводили по методу Laemrall CLaemali. 1970Э в вертикальных блоках 12.SX полиакрилаиидного геля, размерами 160 х 160 х 1,5 мя. Разделявший гель содеркал : 12,5% акриламид, 0, 375 H трис-HCl. рН в, 8,.. 0,025* ПСА , 0,025% ТЭМЭД, 0,IX SDS. После полимеризации геля сливали оставшийся SDS, подсушивали границу. Концентрирующий гель включал: 5,IX акрилаиид, 0,125 M трис-HCl, рИ 6,9, 0,1% SDS, 0.013Я ТЭМЭД, 0,028; ПСА. Раствор перемешивал!!, деаэрировали поя вакуумом и заливали в форму . Электродный буфер готовили из расчета: 25 мМ трис-HCl, рН 8,8, 0,192 H глицин, 0,1% SDS. Белковый образцы объепоя 25 нкл состояли из 15 мкг белка, 2 иМ трис-HCl. рН 6,8. 0,2 Mil ЗДТА , 0,5% SDS, 1% 2-меркаптозтакола , 0,0002%'бромфенолового синего СБФСЗ . Электрофорез проводили при 50 V, пока краситель полностью не по-

кидал концентрирующий гель (1 час), а затея пря 120 7 до тех пор пока БОС не доходил до конца разделяющего геля (4 часа).

В качестве стандартов молекулярной массы белков применяли скесь низкомолекулярных белков фирмы "Pharmacia"- фосфорилаза В (94 кД), альбумин (67 кД ), озальбумии (43 кД), карбоангидраза (30 кД ), ингибитор трипсина (20,1 кД ) и Ь-лактальбуиин (14,4 кД). В качестве стандарта аденознндезамнназы был использован препарат АДА слизистой кишечника теленка фирмы "Bochrinser Hannhelm" с молекулярной массой 38 кД. 10 икг в 5 мкл.

После окончания электрофореза гель разрезали на две части . Одна часть, с белковыми стандартами, со стандартом АДА и опытными образцами , была использована для локализации белковых зон в ПААГ окраской кумасси С 0,1% кумасск , 25% изопропанола, 10% уксусной кислотьО . Не связанный с белками краситель отказали 7% уксусной кислотой . Другую часть геля аналогичного состава проб, но без предварительного прогревания в SDS. использовали для специфического окрашивания АДА по методу Spencer С Spencer, 1568Э. Перед окрашиванием гель отмывали в 0,1 M трис-KCl буфере. pH В,О, с несколькими сменами раствора, з течение часа. Краситель содержал: 500 ил 0,1 И трис-HCl, pH 8,0, 50 нг адекозина, 10 иг MTX-тетразо-лиосой соли, 10 мг феназин нетасульфага, 150 иг арсената натрия, 25 ед. ксаитнкоксидазы, 23 ед, нуклеозидфосфорялазы. Гель инкубировали R этом растворе при 37° в течение часа. Активность АДА выявляли по появлению коричневого гжр^АТ1ивання.

03геи содержание аденкннуслеотидоз и содержание нуклеотидов н "пуле хракення " определяли бколюиипссцситныя истодом с использованием АТФ-раагента С"ЬКВ"5 на лэтишометре "1250 LKB-Wallac" . Количестзо АЛО измеряли после предварительного фосЗорилироваиия пнруваткиназой СПКЭ в присутствии ^осфоенолпкрувата СФЕПЭ, используя препараты ПК и <5£П фирмы "Boehringer" С Heinsen. Weiss 1979; Daniel и соазт19805. Концентрации АТФ и АДС" выражали s наноко-. лях на 10° клеток.

Содержание ад=ниннукл5сти:доз метаболического пула оценивали радиохимически« методом по интексизносгя включения радиоактивного предшественника в АТФ и АД0 после иякубацни кнтактных тромбоцитов с рз-14,СЗ-адеаикок <0,2 ккКи-'мл) а течение 2-х часов при 37°. Радиоактивность адонкмнуклеогилоз регистрировали на счетчике "'.210 in.trcbota' (ГЛЯЗ") поел:» разделения снсси АТФ и АДФ истодом

нисходящей хроматографии на бумаге "Whatman 1 " Б системе растворителей: н -бутанол : ацетон : ледяная уксусная кислота : аммиак С 25» : вода, в соотношении 45:1 Б". 10:2:28. Обпс» радиоактивность нуклеотидов выражали в импульсах в нин на 10s* тромбоцитов. Удельную радиоактивность АТО и АДФ выражали в импульсах в мин на 1 нмоль соответствующего нуклеотида CHblasen. Heiss, 1972).

Определение достоверности различий между группани данных проводили с использованием критерия Стьюдента в соответствии с руководством Бронштейна С1986Э. Для анализа данных использовали ниии-компыотер "Hewlett-Packard" НР67 Спакет статистических програнмЭ.

ОСНОВЯЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСЯКДЕШШ

Для определения общей направленности изменений активности АДА при XMJI, и сравнения ее с активностью АДА при других гематологических заболеваниях была сбследована группа из 107 больных острыми и хроническими киело- и линфопролиферативными заболеваниями, а такэе анемиями. В качестве контроля обследовали 30 здоровых доноров. Результаты представлены в таблице 1. Как видно из таблицы при целом ряде генатологических заболеваний наблюдаются отклонения от нормы в активности АДА, что, вероятно, ведет к нарушению метаболических процессов, обеспечивающих структурную и функциональную полноценность тромбоцитов.

Из результатов, приведенных в табл. 1, видно что основное изменение при хронических ниелопролиферативных заболеваниях сводилось к снижению уровня удельной активности АДА тромбоцитов. При сопоставлении показателей удельной активности фермента в тромбоцитах доноров и больных было выявлено снижение активности АДА при XMJ1 на 48Й, при XMJ1 с бластной трансформацией и мегакариобластном кризе - соответственно на 5S>i и ЫУ. от норны.

При исследовании тромбоцитов крови пациентов с лийфопроли-феративными заболеваниями также выявлено изменение уровня ферментативной активности. Среди больных хроническим ллмфолейкозом было обнаружено две подгруппы,- с увеличенной в 1,6 раза по сравнению с нормой, к с уменьшенной активностью АДА. При иеходжкинской лилфоне показатели активности АДА у одной группы больных были в пределах нормы, а у другой - снижены на 74У. от норны.

При мнелоке и нахрогяобулинемки Вальяенстрема было установлено

снижение ферментативной активности соответственно на 70У. и 39Я от корны.

Таблица 1. Удельная активность АДА (няоль/иг/час)

тронбоцитов кровн доноров и больных с различными гематологическими заболеваниями

Заболевания

АДА

Ниело пролифератизные: Хронический мнелолейкоз

112.4 ± 0,7 (60)

Хронический ниелолсйкоз бластная трансформация

Хронический миелолейкоз яегакариобластный криз

Острый лейкоз: Острый лнкфобластный Острый миелобластный

Лкмф опролифератавные: Неходжкинская лнмфоиа

Хронический лин&олейкоз

Ниелома

Иакроглобулинемия Вальденстрема Лнемнк

Ми кросфероцитарная Гкпопласткческая Аутоиммунная гемолитическая

Э0,0 ± 14,7 (6)

83,0 (1)

65,0 (2) 28,0 (1)

229.0 £ 42,6 (6) 56,0 ± 5,4 (3) 354.0 ± 52,0 (4) 63,4 ± 13,6 (Э) 63,7 ± 6,8 (6) 132,0 ± 25.0 (3)

59.0 (1) 49,2 ± 9,0 (5) 216,6 ± 5,4 (3)

Доноры 214.7 ± 7,9 (30)

Примечание: в скобках указано число больных и доноров.

Обращали на себя внимание выраженные различия удельной активности фермента при анемиях: снижение этого показателя при никро-сфероцитарной и гипопластической анемиях соответственно на 73:< и 77м по сравнений с нормой, однако активность АДА при аутоиммунной гемолитической анемии была в пределах нормы.

Острый миелобластный лейкоз характеризовался болыпкн снижением активности АДА по сравнению с острый лияфобластньи лейкозом.

Но:»ло предполагать, что отклонения в активности АДА обусло-

влены изненениен генетической программы стволовой кроветворной клетки в процессе опухолевой трансформации. По-видимому, дезорганизацию ферментных систем можно рассматривать как раннее проявление поражения клеток крови.

С целью получения дополнительной информации о причинах выявленного нами дефицита удельной активности АДА при ХМЛ было проведено сравнительное изучение физихо-хнмичесхих и кинетических свойств АДА тромбоцитов доноров и больных ХКЦ.

С этой целью нами были использованы различные структурные аналоги пурина, у которых в 6-м положении пуринового кольца ЫНг-группа замеяена на хлор-, иеркапто-, или.метил- группы, а также аналоги пуринов, модифицированные в имидазольнон кольце — азааденин и формицин.

Таблица 2. Влияние пуриновых аналогов на удельную активность АДА тромбоцитов доноров и больных ХИЛ.

Ингибирование, %

Пуриновые аналоги, -

2,5 нМ Доноры Больные ХМЛ

Пг-8 п»в

6-иетилакикопурия 53,6+4,9 34, 3£2, 6

6-хлорпуринрибозид 43,4±6,1 25,1±3, 7

6-иеркаптопурин 45, 3±6, 3 37,1+5,6

6-хлорпурии 4В,3+3,0 37,3+3,2

2,6-диаминопурин 84,3+7,0 81,02:8,0

Н"-метиладенозин 100,0+0,0 100,010,0

Адении 70,0+4,1 82,0+6,8

формицин 41,3+6,3 ■ 39,8+2,8

В-азааденин 12, 1± 5,4 42,Э±5,2

Примечание: п - число Больных и доноров.

Как видно из табл. 2, в норме и при ХШ1 наблюдались различия в степени ингибироваяия ахтивности АДА тромбоцитов некоторыми структурными аналогами пурина. АДА при ХМЛ была менее чувствительна к действию 6-иетилакинопурина и 6-хлорпуринрибозида примерно в 1,8 раза по сравнению с нормой. Азааденин подавлял активность АДА

при ХМЛ. в большей степени Св 3.5 раза} по сравнению с АДА доноров. Действие всех других исследованных веществ на активность АДА доноров и больных ХИЛ было идентичным.

Изучение влияния ионов кеталлов на активность АДА доноров и больных ХИЛ показало, что Си1*, Cd2* " Ва2*" ингибировали активность АДА при ХМЛ с той xs эффективностью, что я фернент доноров Стабл.33 . Однако значительные различия выявлены в ннгибировании активности АДА конами Мпг*. которое было более чем вдвое выке по сравнению с донорами. Добавление ионов Mgz* не вызывало ингиби— руюшего эффекта активности АДА. влияние ионов Сз* было незначительным.

Таблица 3. Влияние ионов металлов на удельную активность АДА тромбоцитов доноров и больных ХНЛ.

Ингибирование. %

Катионы, доноры больные ХМЛ

2.5 яП а=е п=8

Си3" _ 100,0±0,0 100,0±0,0

Со?4" 93,5±3,0 Ю0,0±0,0

Ва" 18,6£3,7 21,0±5,1

Мп2" 30,0±7,1 62,5±2,7

fig" 0,0 0,0

Cs* 0,0 13.7±3.5

Примечание: п - число больных и доноров.

Исследование термолабильности АДА тромбоцитов в норке и при ХМП показало, что фернент больных является более чувствительным к температурному воздействию по сравнению с ферментом доноров. Как видно из рис.1. 50Х ингибирование фермента при ХМЛ наступало после 40 мин тепловой обработки при 60°. в то время как в норне -только после 90 кнн инкубации при той хе температуре.

Таким образом, полученные данные о действии ряда ингибиторов, ионов металлов и температуры свидетельствуют об изменении свойств АДА тронбоцитов больных ХИЛ по сравнению с нормой.

Значения константы Михазлнса АДА тромбоцитов доноров и боль—

ных ХИЛ, рассчитанные графически« методой Лайнуивера и Бэрка представлены в табл. 4. Средние показатели Кн Скаж. 5 по аденозину, были равны соответственно 33.9 ± 3,1 ккМ у доноров, и 36,г±6,4 икМ у больных ХМВ.

Сравнительный анализ данных Стабл.4Э свидетельствовал об отсутствии статистически значимых отклонений от нормальных значений Км АДА тронбоцитоз больных ХМЛ, хотя небольшие вариации в значениях исследуемых параметров все гее присутствовали. У больной К-а С73 показатель Км СкажЭ был в 2 раза выше нормы, фермент больных Д-н и 0-й характеризовался вдвое более низкими значениями Км по сравнению с норной.

Таблица 4. Константа Нихазлиса по аденозину АДА тромбоцитов больных ХМЛ и доноров

Больные ХМЛ Км СмкГО Доноры Км СикЮ

1. С-я. 40,0 1. 33,3

г. к-э. 40,0 2. 28,6

3. Д-н. ' 12,5 О 33,3

4. К-в. 40,0 4. ¿0,0

5. 0-й. 14,7 5. 31.0

6. Ш-й. гз.г 6. 31,0

7. К-а. 76,9 7. 54.0

8. Е-н. 40, D Б. 28,6

9. С-в. 38.5 9. ES .0

И ± » 36»,2±Ь,4 И ± m 33,9±3,1

Полученные результаты свидетельствуют, что по Км АДА тромбоцитов не отличается от АДА эритроцитов. В опытах по определении Ки АДА эритроцитов, где были использованы как очищенные препараты, так и гоиогенаты клеток, различий в показателях Ки доноров и больных такая не обнаружено CDaddoxm i960, 1977). Следовательно, наши результаты, полученные при изучении АДА экстракта тромбоцитов, подтверждают данные литературы.

Далее нани была определена молекулярная насса АДА тромбоцитов доноров и больных ХИЛ, и исследован кзоферментный спектр этого ферк&нта . Как видно из рис .2, специфическое окрашивание гелей на

Активность ДЦА {% от исходной)

Вреыя инкубации (ыен)

Рис.1. Определение термолабнльности при 60° АДА доноров Са5 и больных ХИЛ (б ).

1 2 3 4 5 6 7

УЧИ НГ.У# _ '_ _ ,_„ _

«т»--

•Я»

сз

Рис.2. Электрофорез в ЭЙБ - полнакрнланяднок геле АДА тронбоцитов доноров С2-3} и больных ХМЗ (4-5), 7 - контроль АДА "БосЬг1пгег МаппЬеАпГ ~ окраска иа активность АДА. 1,6 - стандарты молекулярной массы - окраска кумасси.

АДА выявило 2 мажорные полосы активности АДА тромбоцитов как у доноров , так и у Сольных ХМЛ. Одна из полос, с молекулярной нассой 44 кД, была близка по электрофоретической подвижности к АДА препарата из слизистой кишечника теленка, с молекулярной массой 38 кД. Выявленная нами низкомолекулярная изоформа АДА — 44 кД была аналогична описанной ранее эритроцитарной АДА CDaddona, 1977; Van der Weyden, ig?©. Природа второго полипептида 71 кД не ясска» возможно он является,модифицированной формой низкомолекулярного полипептида.

Профиль сканирования окрашенных на активность АДА полнакри-лаиидных гелей доноров и больных в целом был идентичен. Однако, в одном случае (рис. 2, больная 4) обнаружено полное отсутствие изо-формы с молекулярной массой 44 кй. При этом экстракты тромбоцитов больной имели повышенную в 2 раза в сравнении с коркой активность АДА. В этом случае правомерно предположение, что нарушение в активности АДА может бьггь сопряжено с изменением изоферментного состава при ХМЛ. К сожалению, наличие данных только по единственному больному не позволяют сделать однозначных выводов. Можно ожидать, что другие больные с повышенной активностью АДА при ХМЛ будут также иметь подобного рода изменения изофериентного спектра АДА.

Принимая во внимание, что агрегационная активность тромбоцитов является отражением их функциональной активности, мы исследовали агрегацию тромбоцитов in vitro под воздействием ряда ведаете: АДФ в высокой и низкой концентрациях, тромбина, коллагена, адреналина, ристомицкна. Результаты исследований показали, что ликфо-и миелопролиферативкые заболевания сопровождались дисфункцией тромбоцитов.

У большинства больных ХМЛ, в ток числе с бласткой трансформацией, агрегация со всеми использованными нами агрегирующими веществами. была значительно снижена по сравнению с таковой у здоровых доноров, что свидетельствует о дефекте как первой, так и второй фазы агрегации. Нарушение второй фазы агрегации тромбоцитов..выявленное у обследованных больных, позволяет выдвинуть предположение о наличии в них дефекта запасных пулов адениновых нуклеотидов.

Характерно, что в группе больных ХМЛ были выявлены также лица с повышенной агрегационной активностью тромбоцитов. У этих больных увеличение агрегации связано с гиперчувствительностью тромбоцитов к агрегирующим агентам и сопровождается тромбозами.

Таблица 5. Адениннуклеотнды тромбоцитов доноров и больных в разных фазах XMJI.

Стадии Общий пул Метаболический пул Пул хранения

ХМП АТФ АДФ АТФ АДФ АТФ АДФ

Снмоль/"10РклЭ С кип/'мин/'l 0°кл3 Сниоль^Ю ^клЭ

Хрони- 47.6± 26.5+ 3825,3+ 544.1+ 9,7+ 13,5+

ческая 0.3 0.1 352,4 63. В 0,4 0,4

С103 С1Ю C10Í C10Í С10Э СЮ}

Прогрес- 17.1± 8,6+ 3853,2± 595,2+ 3,2+ 4,5+

сирующая 0,4 0, 4 171.2 43,7 0.4 0.4

С10Э С10Э СЮ) CIO} С13? С13Э

Терми- 6,8+ 2,7 + 4060,5+ 569,6+ 1.7+ 1 ,2+

нальная 0.6 0,3 287,5 39,1 0.2 0,3

С10Э СЮЭ С10> С10Э С21Э С 215

ДОНОРЫ 51,4 + 29,0+ 4325,7+ 556.9+ 11.4 + 16.4 +

2.3 1 .4- 603,2 79,4 0.5 1.2

С14? С14Э С143 С14Э С143 С145

Примечание: в скобках указано число больных и доноров.

При ХИЛ у;™ на начальной - хронической стадии - наблюдалось снижение ЛТ® н АДФ з I,2 раза. в то время как в прогрессирующей стадии заболевания содержание АХ® и АДФ уненьшальсь s 3,6 раза. Наиболее зыра?К!Шь:е изменения ;з уровне АТФ — в 6,7 раза и АДФ - в 13,7 раз я сравнении с нормой били з терминальной стадии. Как видно из таблицы 5, для каждой фазы заболевания характерны определенные уровни АТФ и АДФ, и показатели одной фаза достоверно отличаются от данных другой фазы.

Следует отнеткть, что выраяенккй дефект гранул хранения тром-боц ¡тов в зависимости от стадно заболевания был показан нами впервые.

Поскольку адениннуклеотнды, находящиеся з плотных гранулах тромбоцитов, не синтезируются и не вступают в реакции обкена с адениннуклеотидаяи тромбоцитов, участзуастми з метаболических процессах, изменение содержания АТФ и АДФ вероятно является отражением первоначальных изменений в иегакариоцитах. Недостаточность в урознэ адениннуклеотидоз при ХИЛ говорит о дефекте "запасных

Установлено, что в 35У. случаев при ХМЛ имеет место спонтанная агрегация.

Аналогичное снижение функциональных свойств отмечается у больных с лиифопролиферативными заболеваниями Схроническин лияфолей— козой. лияфомойЭ. Таким образом нами выявлено, что в основе целого ряда гематологических заболеваний лежит качественная неполноценность тромбоцитов, сопровождаемая нарушением агрегационных функций. <

С цель» выяснения механизма нарушения функциональной активности этих клеток проведено сравнительное исследование уровня адениннуклеотидов в различных отделах тромбоцитов доноров и больных ХМЛ. Адениннуклеотиды представлены несколькими "пулами отличающимися по своей функции и находящимися в разных органеллах тромбоцитов. Значительные количества АТФ и АД4 .содержатся в плотных гранулах и не участвуют в метаболических процессах, формиру»т "пул хранения ". играющий важную роль в агрегации тромбоцитов. В цитоплазме, митохондриях, мембране адениннуклеотиды представлены метаболическим пулом, обеспечивающим энергетические реакции клетки, и частично утилизирующимся в процессе реакции высвобождения.

Показатели, характеризующие общее содержание адениннуклеотидов, концентрацию АТФ и АДФ "пула хранения" и метаболического пула тромбоцитов доноров» приведенные в табл.5, совпадают с данными литературы COgurbil et al, 1978; Daniel, 1980).

Результаты определения общего пула адениннуклеотидов тромбоцитов больных ХМЛ указывали на аномальные значения концентрации ATO и АДФ, являющиеся отражением дефицита адениннуклеотидов "пула хранения", тогда как содержание метаболического пула практически не изменялось по сравнению с норной Стабл.55.

Было обследовано 44 больных на разных стадиях ХМЛ: хронической, прогрессирующей и терминальной. Стадии ХМЛ характеризуют эволюцию заболевания от первональной — хронической, стабильной фазы, хорошо переносимой больными, к скоротечной - прогрессирующей фазе, с высокой степенью злокачественности, и затем - к терминальной стадии. При этом характерной особенностью перехода из одной фазы в другу» является властная трансформация с резким ускорением течения ХМЛ.

Наиболее информативными оказались результаты, полученные при исследовании адениннуклеотидов в гранулах хранения тромбоцитов.

пулов" тромбоцитов. Дефицит содержания АТФ и АДФ в плотных гранулах может быть использована в качестве дополнительного критерия диагностики различных стадий заболевания наряду с известныни спо-собани прогноза по комплексу клинических и лабораторных показателей.

Ретроспективный анализ изменений АТФ и АДФ в гранулах хранения по всей изученным группам больных показал, что нарушения в уровне АТФ и АДФ выявляются до появления клинической картины фазы заболевания. Это дает дополнительную возможность для определения ранней тактики лечения, определения ремиссии в одних случаях, или предупреждения перехода в фазу ухудшения в других.

В практике терапии лейкозов важно своевременное изменение тактики лечения больных при качественных изменениях патологического процесса. Поэтому появление новых информативных биохимических тестов для определения различных стадий лейкозного процесса представляется исключительно важным. Проведение прогрессивных ко'мплексных клинико-биохимических исследований повышает точность прогноза течения заболевания.

ВЫВОДЫ

1. В тромбоцитах периферической крови человека при различных ниелопролиферативных и линфопролиферативных заболеваниях выявлены разнонаправленные изменения удельной активности аденозиндезаминазы и .нарушения агрегацяонкоЯ функции тромбоцитоз.

2. Большинство больных хроническим «иелолейкозон характеризовалось снижением удельной активности аденозиндезаминазы в экстрактах тромбоцитов С до 52V. от нормы} и уменьшением их агрегационной способности» что свидетельствует о качественной и функциональной неполноценности тромбоцитов при данной патологии.

3. Аденозиндезаминаза больных хроническим яиелолейкозом отличалась от фермента здоровых доноров большей чувствительностью к ингибированип азааденинон и ионами и меньшей — к ннгиби-ровани» 6-нетилаиинопуриком и 6-хлорпуринрибозидом. Термостабнль-ность фермента больных снинена.

4. Показано, что АДА в тромбоцитах периферической крови доноров н больных представлена двуня нзоформаки с молекулярной яас-сой 44 и 71 кД. По нолэкулярной массе изоформ. их содержанию, и сродству к субстрату СКн по адеиозннуЭ достоверные отличия у

доноров и больных отсутствовали.

5. Выявлен биохимический дефект в содержании адениннуклеоти-дов CATO, АДФЗ плотных гранул тромбоцитов, отражающий нарушение в формировании "запасных пулов" на уровне иегакариоцитов, при отсутствии изменений метаболического фонда этих веществ.

6. Установлена корреляция между степенью дефицита адениннук-леотидов гранулярного пула тромбоцитов и фазой прогрессии неопластической трансформации при хроническом миеяолейкозе. .Данный подход может быть использован в качестве дополнительного критерия даагно-стки фазы хронического миелолейкоза в комплексе клинических и лабораторных показателей.

СПИСОК. РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Соковнина Я.М. , Пестика Т. И. .Чижова А. И. , Лагутина Н.Я. . Тенцова И.А. , Вотрин К. И. Аденозиндезакиназа и пуриниуклеозидфос-форилаза тромбоцитов крови при различных гематологических заболеваниях IV Всесоюзный симпозиум по медицинской.энзимологни: Тез. докл. -Алма-Ата, 1983.-с. 235-236.

2. Соковнина Я.М. , Пестика Т. И. . Чизхэва А. И., Тенцова И. А., Вотрин И.И. Аденозиндезаминаза и пурнннуклеозидфосфорилаза тромбоцитов крови при различных гематологических заболеваниях //Вести. Ätü! CCCP.-19S4.-H.B.-С.75-ВО.

3. Соковнина Я. М. , Пэстина Т.К.. Тенцова И. А., Вотрин И. И. Пуркнкуклеозидфосфор;:лаза тромбоцитов при различных гематологических заболеваниях крови //Волр. мед. химии.-1935.-N. 7.-с. 75-79.

<1. Соковнина Я. М. , Пестика Т.К. , Чижова А. К. , Тенцова К. А. , Лагутина Н. Я. , Фриновская И. В. , Кан Т.Н., Куравлев B.C., Макеева H.A., Вотрин И.И. Аденозиндезаминаза при различных заболеваниях крови //Вопр. ' мед. хикии.-19Ё5.—Н. 3.-с. 2.6-30.

5. Соковнина Я. М. . Пестина Т. И., .Лагутина Н. Я.. Тенцова К. А., Чижова А. И. Нарушение функции тропбоцитоз np:i некоторых заболеваниях системы крови /VII Всесоюзный съезд гс:(гтологоз и трансфузи-олологов: Тез. докл. -Львоо, 19D5. -с. 452-453.

6. Соковнина Я.М. , Песткнг Т.Н. , Богданова H.H. , Мареевг Т. В. , Вотрик И.И. Серпенты обмена пуринсз тромбоцитов при наследственных и приобретенных троибоцитопатиах //V Есгсоюзньй биохимически.'! съ«зл: Тез. сообщ. -Киев, 1986.-с. 307-ЗОЕ.

7. Соковнина Я. И. , Пестика Т. И., Туркина А. Г. , Вотрин И. И. Сравнительная характиристика каталитических свойств аденозиндеза-ниназы в норне и при хроническом ниелолейкозе //Волр. нед. химии. -19B7.-N. 3.-с. 71-74.

8. Вотрин И. И., Соковнина Я. М. . Мареева Т. Б., Пестика Т. И. Ферменты обмена пуриновых нуклеотидов в диагностике начальных стадий заболевания лейкозом //Тезисы Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы диагностики заболеваний системы крови". -Сухуми, 1988.-с. 145.

9. Мареева Т.Е. . Пестина Т.Н. . Морозова Н.Г. . Соковнина Я.М. Информативность биолюиинесцентного метода определения аденин-нуклеотидов в тромбоцитах в плане диагностики течения гематологических заболеваний ✓/Тезисы симпозиума "Гематологические и цитологические исследования в клинической лабораторной диагностике ". -Ивантеевка, 1990. -с. 26.

10. Пестина Т.Н. , Мареева Т. Б. , Морозова Н.Г. . Соковнина Я. М. Встрни И.И. Значение исследований аденознндезаминазы и функциональной активности тромбоцитов при некоторых заболеваниях системы крови //III Всесоюзный съезд гематологов и траксфузиологов.-Киров, 1991.-с. 642. « -

11. Пестина Т.Н. , Мареева Т. Б. , Морозова Н. Г. , Соковкяна Я. М. Еотрии И.И, Значение исследования уровня адениннуклеотидов тромбоцитов в разнь"^ фазах заболевания хроническим миелолейкозом //Вопр. Иг д. Химии.-1791.-Н 5.-с. 53-56.

1Г. Кареева Т. Б. , Песткнз Т.К. , Морозова Н.Г. , Соковнина Я. М. Вотрнн ii. К. Исследования уровня адениннуклеотидов пула хранения тромбоцитов для оценки течении генобластозов //Гематология и трансфузиология. -1991.-N 5.-е. 26-31.

ОСНОВНЫЕ ПРИНЯТЫЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

АДФ - аденозин-5'—дифосфат

АГФ - аденозин-5 трифосфат

кД. - килодальтон

ФЕП - фосфоенолпируват

ПК ~ — пирузаткиназа

ЭДТА - этялендиаминтетраацетат

ПСА - персульфат аммония

ТЭИЗД - N,Н,Н',N'-тетраиетилэтилендиамин

БОЗ - додецилсульфат натрия

ПААГ - полиакриламидный гель

БФС - брокфекол синий