Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Адаптивная роль ДНКазы II в сперматозоидах вьюнов (Misgurnus fossilis L.)

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нечаевский, Юрий Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Цель исследования и постановка задачи 9 Новизна полученных данных и научно-практическое значение работы

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ (ДНКаза II в ядрах клеток и ее биологическая роль).

1.1. Ядерная фракция ДНКазы II

1.1.1. Распределение ДНКазы II в клетках (тканях) животных

1.1.1.1. ДНКаза II в активно пролиферирующих тканях

1.1.1.2. ДНКаза II в неделящихся терминально дифференцированных клетках

1.1.1.3. ДНКаза II в генеративных органах и клетках

1.1.2. Субклеточная локализация ДНКазы II

1.2. Функция ядерной фракции ДНКазы II

1.2.1. Характеристические свойства ДНКазы II

1.2.2. Корреляция активности ДНКазы II с фазой клеточного цикла

1.2.3. ДНКаза II в программированной клеточной гибели (апоптозе)

1.2.3.1. Клетки яичников китайского хомячка

1.2.3.2. Миелоидные клетки человека

1.2.4. ДНКаза II в дифференциации специализированных клеток, функционирующих в безъядерном состоянии

Введение Диссертация по биологии, на тему "Адаптивная роль ДНКазы II в сперматозоидах вьюнов (Misgurnus fossilis L.)"

Эндодезоксирибонуклеаза II (ЕС 3.1.22.1), которая расщепляет фосфодиэфирные связи двухцепочечной ДНК и имеет оптимум активности в кислой области рН в отсутствие двухвалентных катионов, найдена в клетках различных организмов [Allfrey, Mirsky, 1952; Cordonnier, Bernardi, 1968]. Предполагаемая функция кислой ДНКазы: участие в процессах деградации чужеродной ДНК («пищеварительная» роль), основана на факте ее локализации в лизосомах, которые содержат все ферменты, необходимые для деградации нуклеиновых кислот [Bernardi, 1971; Liao et al. 1989]. Однако одновременно с работами цитируемых авторов появились исследования, демонстрирующие существование ядерного пула ДНКазы II и, соответственно, предполагающие другую биологическую роль фермента [Lesca, 1968; Slotki et al., 1989; Smith, Beresney, 1983; Swingle, Cole, 1964; Torriglia et al., 1995]. Эти исследования демонстрировали очевидную связь между уровнем активности ядерного пула ДНКазы II и синтезом ДНК в процессах органогенеза или регенерации ткани.

Независимое представление об иной, не «пищеварительной», роли ДНКазы II могут дать исследования этого фермента в репродуктивных органах и клетках самцов животных. Кислая ДНКаза в сперме млекопитающих была обнаружена более 50 лет назад [Zamenhof, 1950]. Затем появились сообщения об этом ферменте в семенниках макрели [Cordonnier, Bernardi, 1968] и в сперме человека [Quinn, 1968]. В относительно недавней работе, специально посвященной исследованию ДНКаз в репродуктивных органах самцов кроликов, показано, что уровень активности ДНКазы II в семенниках, эпидидимусе, простате и сперме в 2-5 раз выше, чем в почках, печени и селезенке [Takeshita et al., 1994].

Вместе с тем, в настоящее время нет данных об активности ферментов метаболизма ДНК в сперматозоидах (в качестве примера безуспешных попыток см. [Waldschmidt et al., 1964; Takeshita et al., 1994]). На основании подобных исследований сложился современный взгляд на зрелые мужские гаметы, как на клетки с инактивированным геномом. Ядро зрелого спермия образовано плотно упакованным метаболически инертным хроматином; в нем отсутствуют не только ферменты метаболизма ДНК, но практически отсутствуют кислые белки вообще [Костомарова, Князева, 1982]. Таким образом, сперматозоиды в качестве модельной клеточной системы для изучения функциональной роли ферментов метаболизма ДНК в неделящихся клетках, были исключены из сферы внимания современных исследователей.

К настоящему времени получено много данных о том, что суперспиральная конформация ДНК играет значительную роль в метаболизме эукариотических клеток: показано ее влияние на процессы репликации in vitro [Buongiorno-Nordelli et al.1982; Mattern, Painter, 1979 a, b] и транскрипцию [Colman, Cook, 1977; Dimri, Das, 1988; Liu, Wang, 1987]. Другой подход к выяснению функциональной значимости конформации ДНК состоит в исследовании изменений in vivo суперспиральной плотности ДНК в зависимости от физиологического состояния клетки и организма. Физиологически обусловленное изменение (чаще уменьшение) суперспиральной плотности

ДНК обычно связывают с изменением уровня молекулярно-генетических процессов, например, при дифференцировке клеток [Cock, Brazell, 1976; Лучник, 1983]. И, наоборот, в клетках с постоянно высокой активностью молекулярно-генетических процессов (злокачественные клетки) сохраняется повышенная плотность сверхспиральных витков, которая не снижается в ходе их культивирования [Hartwig, 1979; Лучник, 1983].

В качестве объекта исследований были выбраны спермии вьюна. Рыбы - наиболее многочисленный в видовом отношении класс позвоночных, освоивший в результате адаптивной эволюции практически все экологические ниши водной среды, являются благодатным объектом для исследования механизмов адаптаций к факторам внешней среды. Такими факторами в условиях эксперимента являются, в частности, быстрое изменение температуры среды содержания (температурный стресс) и ионизирующее излучение. Известно, что в результате стресса происходит повреждение ДНК соматических клеток позвоночных животных [Liu et al., 1996; Minizini et al, 1994], которое, очевидно, может проявляться в релаксации суперспиральной структуры макромолекулы. Однако состояние ДНК сперматозоидов в процессе стресс-реакции практически не изучено, хотя мужские гаметы могут представлять подходящую модель для исследования влияний факторов внешней среды, потому что они являются in vivo объектом воздействий, приводящих к критическим последствиям в развитии организма.

Цель исследования и постановка задачи

Целью настоящей работы явилось исследование процесса нормальной и патологической деградации ДНК сперматозоидов вьюна при действии физических и физиологических факторов.

Логика исследований, предпринятых для достижения поставленной цели, неизбежно привела к поиску и последующей идентификации фермента метаболизма ДНК -ДНКазы II в этих терминально дифференцированных клетках и изучению его функциональной роли. В соответствии с этим были поставлены и решены следующие задачи:

1. Выявление суперспиральной конформации ДНК сперматозоидов вьюнов.

2. Исследование влияния на структуру ДНК этих клеток физических (температурный стресс и\или опосредованное и непосредственное действие ионизирующей радиации) факторов среды, а также длительного лабораторного содержания рыб.

3. Изучение развития икры, оплодотворенной спермиями рыб, подвергнутых облучению или температурному стрессу.

4. Идентификация ДНКазной активности в сперматозоидах вьюнов.

5. Выделение и очистка ДНКазы II и изучение ее v свойств.

6. Исследование функциональной роли фермента в спермиях в системе адаптивных реакций.

Новизна полученных данных и научно-практическое значение работы.

Впервые в сперматозоидах обнаружено существование суперспиральной конформации ДНК, что предполагает готовность макромолекулы к последующей экспресии генома в составе зиготы и к энзиматической деградации непосредственно в клетке (отрицательная суперспирализация ДНК, создавая топологическое напряжение в макромолекуле, способствует образованию одноцепочечных участков, которые являются сайтами энзиматического действия).

Впервые в сперматозоидах обнаружен фермент метаболизма ДНК - ДНКаза II. Такой факт позволяет предполагать, что негативная селекция репродуктивных клеток у рыб может происходить непосредственно на уровне зрелых половых клеток.

Впервые обнаружено, что влияние физических и физиологических факторов приводит к релаксации сверхспиральных витков ДНК спермиев. Эти результаты интерпретируются, как доказательство того, что конформация ДНК в сперматозоидах регулируется in vivo.

Изменения третичной структуры ДНК под действием факторов среды коррелировали с многочисленными нарушениями развития икры, оплодотворенной сперматозоидами вьюнов, подвергнутых этим воздействиям. Полученные данные указывали на важное функциональное значение для спермиев влияния изучаемых условий внешней среды.

Продемонстрировано, что температурный стресс или облучение вьюнов индуцируют, субклеточное перераспределение ДНКазы II среди хроматиновых субфракций сперматозоидов с увеличением связывания ее хроматином и внутриклеточное закисление до величины рН, достаточной для инициации кислой ДНКазы in vitro.

Полученные факты позволяют полагать, что, во-первых, ДНКаза II участвует в представленной здесь термо- и радиоиндуцированной релаксации суперспиральной ДНК сперматозоидов и, во-вторых, функционирование ДНКазы II в этих клетках связано с нормальной (сезонная элиминация сперматозоидов, оставшихся в семенниках после нереста) или патологической, индуцированной внешними повреждающими воздействиями, деградацией ДНК.

В результате диссертационного исследования разработана новая модельная клеточная система, представленная сперматозоидами вьюнов (приоритетные характеристики модели: суперспиральная конформация ДНК и наличие ДНКазы II), позволяющая изучать in vivo и in vitro роль компактной упаковки генома в физиологической регуляции на этапе передачи генетической информации в последующих поколениях животных. Использование здесь этой системы позволило изучить влияние физических и физиологических факторов на ДНК и охарактеризовать функциональную роль ДНКазы II в зрелых мужских гаметах. Разработанная модельная клеточная система может иметь исключительное значение для исследования механизма программированной гибели мужских половых клеток.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ (ДНКаза II в ядрах клеток и ее биологическая роль)

Эндодезоксирибонуклеаза II (ЕС 3.1.22.1), которая расщепляет внутрицепочечные фосфодиэфирные связи двухцепочечной ДНК при кислом оптимуме рН в отсутствие двухвалентных катионов, найдена в клетках различных организмов [Allfrey, Mirsky, 1952; Cordonnier, Bernardi, 1968]. Она является хорошо известным нуклеолитическим энзимом с предполагаемой функцией - деградация чужеродной ДНК, интерес к фундаментальным исследованиям которого, казалось, уже исчерпан. Но в последние годы ситуация изменилась: появились новые факты, которые ведут к определению другой биологической роли ДНКазы II и, следовательно, инициируют новый период ее изучения: в функциональном аспекте. Пищеварительная функция ДНКазы II, предложенная некоторыми авторами, основана на факте ее локализации в лизосомах, содержащих все энзимы, необходимые для деградации нуклеиновых кислот, которые выделяются панкреатическими клетками внутрь кишечного тракта [Bernardi, 1971; Liao et al., 1989]. Так, в ранних работах деДюв с соавт. [de Duve et al., 1962] и Боуэрс [Bowers, 1964] описали ДНКазу II как лизосомный энзим, а присутствие ее в ядерной и митохондриальной фракциях - как загрязнение их лизосомами. В то же время, в ряде работ была выявлена корреляция между митотической активностью клеток и уровнем ДНКазы II [Kurnick, Kernen, 1962; Lehman, 1967; Lesca, 1968], обнаружена ядерная локализация ДНКазы II [Brown et al., 1952; Lesca, 1968; Slotki et al., 1989; Smith,

Beresney, 1983; Swingle, Cole, 1964; Torriglia et al., 1995], и продемонстрирована активация ядерного пула энзима в клетках, инициированных к делению [Allfrey, Mirsky, 1952; Lesca, 1968; Smith, Beresney, 1983]. На этом основании было сделано контрастное предположение о вовлечении ДНКазы II в такие фундаментальные клеточные процессы как репликация, репарация или рекомбинация ДНК [Lehman , 1967; Lesca, 1976]. Но, последующая идентификация разнообразных ДНКаз в различных клетках животных, более подходящих на соответствующие роли в биологических процессах синтеза ДНК [Татарская, 1976; Ivanov et al., 1988; Lindahl, 1982; Sierakowska, Shugar, 1977; Slor, Lew, 1972] и лизосомный пул ДНКазы II, сделали пищеварительную («лизосомную») функцию этого энзима общепринятой.

Однако, в последнее время на основании ряда исследований, связанных, прежде всего, с изучением спонтанной (программированной) клеточной гибели, вновь поднят вопрос о функции ядерной фракции ДНКазы II. Посредством адекватных исследований, активно развивающихся в настоящее время, доказано участие ДНКазы II в апоптозе (биологическом механизме элиминации клеток) в ответ на специфические физиологические (моделируемые экспериментально) стимулы некоторых типов клеток [Barry, Eastman, 1993; Gottlieb et al., 1995; Gottlieb et al., 1996]. Таким образом, сейчас начался новый этап в исследовании биологической роли ДНКазы И.

Одним из ключевых критериев апоптоза является деградация ядерной ДНК. Этот процесс можно представить в виде двух этапов: начальное расщепление ДНК - введение оци дц-разрывов - и деградация ДНК генома на фрагменты, кратные 180-200 п.о., т.е. расщепление линкерной ДНК между нуклеосомными корами - появление характеристической «лестницы» на геле после электрофореза продуктов деградации ДНК. Сейчас следует предполагать, что, по крайней мере, три различные эндонуклеазы могут участвовать во фрагментации ДНК, приводящей к появлению свободных нуклеосом: Ca/Af^-зависимая ДНКаза I, как показано при исследовании ядер после глюкокортикоидной обработки тимоцитов [Peitsch et al., 1993]; нуклеаза, названная NUC18, активность которой также коррелирует с апоптозом в тимоцитах [Hughes, Jr., Cidlowski, 1994; Montague et al., 1994] и ДНКаза II, идентифицированная в клетках яичников китайского хомячка (СНО) [Barry, Eastman 1993]. Из них единственная ДНКаза II обладает уникальными свойствами: кислым рНопт, при котором она активна в отсутствие ионов металлов, и механизмом реакции, удобным для разрушения ДНК, но не подходящим для функционирования в биологических процессах синтеза ДНК [Drew, 1984]. Другая биологическая роль ДНКазы II, по-видимому, связана с дифференциацией некоторых высокоспециализированных клеток, таких как, например, фибриллярные клетки хрусталика глаза [Torriglia et al., 1995], приводящей к потере клеточного ядра. Эта роль энзима в созревании клеток принципиально отличается от его участия в апоптозе - механизме клеточной гибели.

Целью данного обзора является анализ основных фактов, касающихся ядерной локализации и функции ядерной фракции ДНКазы II в различных клетках животных.

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Нечаевский, Юрий Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Впервые показано, что ДНК в сперматозоидах сверхспирализована.

2. В сперматозоидах вьюна обнаружена сезонная релаксация in vivo сверхспиральной ДНК.

3. Впервые в сперматозоидах обнаружен фермент метаболизма ДНК - ДНКаза.

4. ДНКаза выделена, очищена в 139 раз и исследованы ее свойства: фермент имеет мол. массу ~ 30 kDa, превращает при рН0ПХ. 5,5 ковалентно-замкнутую кольцевую (двухцепочечную) ДНК с образованием линейной формы в отсутствие двухвалентных катионов. Свойства эндонуклеазы сперматозоидов позволяют отнести ее к типу ферментов, подобных ДНКазе II.

5. Под влиянием температурного стресса или рентгеновского облучения головы в сперматозоидах вьюнов происходит ряд событий: 1) внутриклеточное закисление до величины рН, достаточной для активации ДНКазы II in vitro; 2) увеличение степени связывания фермента хроматином; 3) снижение сверхспиральной плотности ДНК; 4) нарушение развития икры от интактных самок, оплодотворенной спермиями рыб, перенесших указанные воздействия.

6. Полученные факты позволяют выдвинуть гипотезу, что функция ДНКазы II в сперматозоидах вьюнов связана с физиологической (сезонная элиминация спермиев, оставшихся в семенниках после нереста) или индуцированной внешними повреждающими воздействиями деградацией ДНК.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю, горячую признательность члену-корреспонденту АН СССР A.M. Кузину, благодаря работам которого и личному общению с которым складывалось мое мировоззрение.

Я благодарю:

Н.Б. Стражевскую, моего многолетнего руководителя и соавтора, за административное и материальное обеспечение экспериментальной части работы и постоянное внимание к задачам исследования и обсуждению результатов.

В.А. Иванова, участвовавшего в работе на всех ее стадиях, касающихся исследования фермента, от постановки экспериментов до их обсуждения и оформления в печать. Будучи руководителем моей диссертационной работы, Владимир Александрович оказал непосредственную и действенную помощь в интерпретации результатов и логическом объединении материала.

О.Н. Озолинь, редактировавшая эту работу и сделавшую несколько существенных замечаний.

Выражаю признательность сотрудникам разных институтов, обучавших меня методам иссследований, предоставлявших экспериментальных животных, реактивы, возможность использовать оригинальные установки и приборы, а также участвовавших в отдельных экспериментах и обсуждении полученных результатов: В.Н. Афанасьеву, В.В. Жеромскому, В.П. Зинченко, В.А. Печатникову, Т.И. Смолихиной, В.А. Шлектареву (ИБК РАН); В.И. Емельяненко (ИТЭБ РАН); А.С. Гинзбург, А.А. Нейфаху, Н.Н. Ротт (ИБР РАН); Н.В. Беловой, А.П. Макеевой (МГУ); Н.П. Кузьмину (ИБФМ РАН).

Хочу выразить благодарность A.M. Аксирову за помощь в оформлении экспериментального материала.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данная работа посвящена изучению действия физических факторов внешней среды: быстрого изменения температуры и радиационного излучения, - на зрелые мужские гаметы рыб. Она включает различные аспекты (уровни) исследований, представляя: 1) эксперименты по развитию зародышей; 2) идентификацию клеточной мишени (ДНК), воспринимающей внешние воздействия; 3) систематические исследования, выполненные с применением различных модельных систем {in vivo, in situ, in vitro), общим в которых был метод тестирования изменений в ДНК; и 4) клеточный механизм реализации этих воздействий (энзиматический механизм, основанный на идентификации ДНКазы II в клетках этого типа). Для оформления представленного материала выбрана «энзиматическая модель» по следующим рассуждениям. Во-первых, клеточная мишень, отвечающая на внешние воздействия - суперспиральная ДНК сперматозоидов вьюнов, в результате идентификации которой и были разработаны основные экспериментальные модельные системы, использованные здесь, является (в клетках этого типа, по-видимому, однозначно) активированным субстратом, «приготовленным» для деградационного фермента. Во-вторых, идентификация ДНКазы II и выяснение нового содержания ее функции в клетках этого типа (см. выше) являются наиболее значительным результатом, определяющим, в основном, актуальность настоящего дисертационного исследования (для деталей, см. о «новой» жизни «старого» фермента в Главе I и раздел ОБЩЕЕ ОБСУЖДЕНИЕ). В-третьих, ДНКаза II, являясь ключевым элементом механизма энзиматической деградации ДНК сперматозоидов вьюнов, инициируемой внешними воздействиями, представляет и наиболее глубокий (молекулярный) аспект настоящей работы и, таким образом, перспективную основу для возможной постановки новых экспериментальных задач в будущем. Например, в рамках исследования апоптоза с использованием разработанной здесь модельной клеточной системы, представленной сперматозоидами вьюнов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нечаевский, Юрий Владимирович, Пущино

1. Бакулина Ж.Д., Покровская Г.Л., Романов Д.Д., 1962. О радиочувствительности спермиев вьюна (Misgurnus fossilis L.). Радиобиология, 2: 92-100.

2. Белова Н.В., 1981 .Эколого-физиологические особенности спермы прудовых карповых рыб. Сообщение 2. Изменение физиологических показателей сперматозоидов некоторых карповых рыб под воздействием ряда факторов внешней среды. Вопр. ихтиологии, 21: 10391050.

3. Брегадзе М.А., Лагидзе Т.П., 1978. Некоторые данные о морфологических изменениях мозжечка и гонад облученных животных. В сб.: 11-я радиобиол. конф. соц. стран. 1978, Варна. София: С. 45.

4. Ващенко В. И., Колюбаева С. Н., Климов Н. А., Комар В.

5. Е., 1980. Изменение суперспиральной структуры ядерной

6. ДНК лимфоцитов периферической крови крыс при уоблучении. Радиобиология, 20: 483-488,

7. Ветух В.А., Малаховский М., 1991. Сравнительная оценкагенетических эффектов равномерного внутреннего (137Cs)и локального рентгеновского (семенники) облучениякрыс. Радиобиология, 31: 302-310.

8. Гуковская А.С., Зинченко В.П., 1986. Механизминдуцированного митогенами повышения концентрации4

9. Са в цитоплазме тимоцитов крысы. Биомембраны, 3: 920-930.

10. Дроженников В.А., Переверзенцева О.С., Орлова Е.Б., 1979. Увеличение активности лизосомальной ДНКазы впечени мышей при развитии вирусного лейкоза Френд. Биохимия, 44: 649-657.

11. Иванов В.А., Третьяк Т.М., Смирнова Т.Н. 1977. Изучение нуклеаз ткани головного мозга крыс. Биохимия, 42: 287-292.

12. Иванов В.А., Третьяк Т.М., Терпиловская О.Н., Смирнова Г.Н., 1987. Механизм действия ДНКазы головного мозга крыс. Биохимия, 52: 842-845.

13. Кржыжановский С.Г., 1949. Эколого-морфологические закономерности развития карповых, вьюновых и сомовых рыб (Cyprinoidei и Suluroidei). Тр. Ин-та морф, животных1. АН СССР, вып. 1, с. 186.

14. Кузин A.M., 1977. В кн.: Стимулирующее действие ионизирующего излучения на биологические процессы. М.: Атомиздат, с. 136.

15. Сибирцев Ю.Т., Мензорова Н.И., Шастина В.В., Рассказов В.А., 2001. Множественность ДНКаз в спермиях морского ежа Strongylocentrotus intermedius. ДАН, 376: 117-119.

16. Татарская Р.И., 1976. Нуклеазы. Биологическая роль.

17. Молекуляр.биология, 10: 235-259.

18. Тинников А.А., 1990. Роль гипоталамо-гипофизарнонадпочечниковой системы в регуляции половогоразвития. Успехи соврем, биологии, 110: 419-429.

19. Третьяк Т.М., Иванов В.А., Терпиловская О.Н., 1979.

20. Нуклеазы клеточных фракций ткани головного мозгакрыс. Украин. журн. биохим. 51: 624-628.

21. Турдаков А. Ф., 1972. Воспроизводительная системасамцов рыб. Фрунзе: Илим, с. 144.

22. Шахбазян Г.К., Бронштейн И.Б., Кафиани К.А., 1984.

23. Выделение и характеристика ДНК-топоизомеразы изооцитов вьюна. Биохимия, 49: 1281-1291.

24. Akrigg A., Cook P.R., 1980. DNA gyrase stimulatestranscription. Nucl. Acids Res., 8:845-854

25. Alfert M., 1956. Chemical differentiation of nuclear proteinsduring spermatogenesis in the salmon. J. Biophys. and

26. Biochem. Cytol., 2: 109-114.

27. Allan D.J., Harmon B.V., Kerr J.F.R., 1987. Cell death in spermatogenesis. In: Perspectives on mammalian cell death, (ed. Potten C.S.) New York: Oxford University Press, P. 229-258.

28. Allfrey V., Mirsky A.E., 1952. Some aspects of the desoxyribonuclease activities of animal tissues. J. Gen. Physiol., 36: 227-241.

29. Anzai N., Kawabata H., Hirama Т., Masutani H., Ueda Y., Yoshida Y., Okuma M., 1995. Types of nuclear endonuclease activity capable of inducing internucleosomal

30. DNA fragmentation are completely different between human Cd34(+) cells and their granulocytic descendants. Blood, 86: 917-923.

31. Benyajati Ch., Worcel A., 1976. Isolation, characterization, and structure of the folded interphase genome of Drosophila, melanogaster. Cell, 9: 396-407.

32. Bernardi G., 1971. Spleen acid deoxyribonucleases. In: The Enzymes (ed. Boyer P.D.). New York London: Acad. Press, 4: 271-287.

33. Blocher D., Pohlit W., 1982. DNA double strand breaks in Ehrlich ascites tumour cells at low dpses of X-rays. II. Can cell death be attributed to double strand breaks? Int. J. Radiat. Biol., 42: 29-338.

34. Bowers W., 1964. Characteristics of rat spleen lysosomes. J. Cell Biol., 23: 13A (Abstract).

35. Bradford M.M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analit. Biochem., 72: 248254.

36. Burkitt M.J., Milne L., Tsang S.Y., Tam S.C., 1994. Calcium indicator dye Quin 2 inhibits hydrogen peroxide induced strand break formation via chelation of iron. Arch. Biochem. Biophys., 31 1: 321-328.

37. Cook P R., Brazell I A., Lost E., 1976. Characterization of nuclear structures containing superhelical DNA. J. Cell Sci., 22: 303-324.

38. Cook P.R., 1973. Hypothesis on differentiation and the inheritance of gene superstructure. Nature (Lond.), 24: 2325.

39. Cook P.R., Brazell I.A., 1975. Supercoils in human DNA. J. Cell Sci., 19: 261-279.

40. Delvalle G., Taniguchi N., 1995. Genetic variation of some phisiological traits of clonal ayu (Plecoglossus altivelis) under stressed and nonstressed conditions. Aquaculture. 137: 193-202.

41. Dimri G.P., Das H.K., 1988 Transcriptional regulation of nitrogen fixation genes by DNA supercoiling. Mol. Gen. Genet., 212: 360-363.

42. Drew H.R., 1984. Structural specificities of five commonly used DNA nucleases. J. Mol. Biol., 176: 535-557. Eskin В., Morgan A.R., 1978. DNA nicking-closing activity from salmon testis. Canad. J. Biochem. and Physiol., 56: 8991.

43. Gottlieb R.A., Nordberg J., Skowronski E., Babior B.M.,1996. Apoptosis induced in Jurkat cells by several agents is preceded by intracellular acidification. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 93: 654-658.

44. Goutier R., Leonard A., 1962. The relation between acid deoxyribonuclease activity and growth in the rat. Exp. Cell. Res. 28: 335-343.

45. Grieb A., 1937. Die larvale Periode in der Entwicklung des

46. Schlammbeissers (Misgurnus fossilis). Acta zool., 18.

47. Grimes S.R., 1986. Nuclear proteins in spermatogenesis.

48. Сотр. Biochem. Physiol., 83: 495-500.

49. Grinstein S., Goetz-Smith J.D., Steward D., Beresford B.J.,

50. Mellors A., 1986. Protein phosphsrylation during activationof Na-H+-exchange by phorbol esters and by osmicshrinking. J. Biol. Chem., 261: 8009-8016.

51. Gusse M., Chevaillier Ph., 1980. Electron microscopeevidence for presence of globular structures in differentsperm chromatins. J. Cell Biol., 87: 280-284.

52. Gusse M., Chevaillier Ph., 1980. Molecular structure ofchromatin during sperm differentiation of the dogfish

53. Scyliorhinus caniculus L.). Chromosoma, 77: 57-68.

54. Kavenoff В., Zimm В., 1973. Chromosome sized DNA in Drosophila. Chromosoma, 41: 1-27.

55. Kiang J.G., McKinney L.C., Gallin E.K., 1990. Heat induced intracellular acidification in human a-431 cells: role of Na+-H+ exchange and metabolism. Am. J. Physiol., 259: C727-C737.

56. McConkey D.J., Hartzell P., Chow S.C., Orrenius S., Jonkal M., 1990. J. Biol. Chem., 265: 3009-3011. McCready S.J., Godwin J., Mason D.W., Brasell I.A., Cook P.R., 1980. DNA is replicated at the nuclear cage. J. Cell Sci., 46: 365-386.

57. McDonald M.R., 1962. Deoxyribonuclease from salmon tesnis. I Purification and properties. J. Gen. Physiol., 45: 7781.

58. McMaster-Kaye R., Kaye J.S., 1980. Organisation of chromatin during spermatogenesis: beaded fibers, partly beaded fibers, and loss of nucleosomal structure. Chromosoma, 77:41-56.

59. Montague J.W., Gaido M.L., Frye C., Cidlowski J.A., 1994. A calcium-dependent nuclease from apoptotic rat thymocites is homologous with cyclophilin. J. Biol. Chem., 269: 1887718880.

60. Muel A.S., Chaudun E., Courtois Y., Counis M.F., 1986.9 -4

61. Nuclear endogenous Ca -dependent endodeoxyribonuclease in differentiating chick embryonic lens fibers. J. Cell. Physiol., 127: 167-174.

62. Pechatnikov V.A., Afanasyev V.N., Korol B.A., Korneev V.N., Rochev Y.A., Umansky S.R., 1986. Flow cytometry of DNA degradation in thymocites of y-irradiation or hidrocortizone treated rats. Gen. Physiol. Biophys., 5: 273284.

63. Quinn P.J., 1968. Deoxyribonuclease activity in semen. J.

64. Reprod. Fertil., 17: 35-39.

65. Savkovic N., Radivojevic D., Hajducovic S., 1964. Effects of whole body and local X-irradiation on the reproductive ability of male rats irradiated in infantile period and changes in the first generation. Bull. "B.Kidric" Inst. Nucl. Sci., 15: 27-47.

66. Segal R., Mori F., Bacallao R., Kurtz I., 1991. FASEB J., 5: 743 (Abstract).

67. Shi L., Kraut R.P., Aebersold R., Greenberg A.H., 1992. A natural-killer-cell granule protein that induces DNA fragmentation and apoptosis. J. Exp. Med., 175: 553-566.

68. Shiokawa D., Tanuma S., 1998. Cloning of cDNAs encoding porcine and human Dnase II. Biochem. Biophys. Res. Commun., 247: 864-869.

69. Sierakowska H., Shugar D., 1977. Mammalian nucleolitic enzymes. In: Progress in nucleic acids research and molecular biology. New York-London: Acad. Press, 20: 59130.

70. Slor H., 1973. Purification of 14C-labelled deoxyribonuclease II from HeLa S3 liposome and its use as a marker for the study of nuclear deoxyribonuclease II. Biochem. J., 136: 83-87.

71. Stanley H.P., 1969. An electron microscope study of spermatogenesis in the teleost fish Oligocottus maculosus. J. Ultrastr. Res., 27: 230-243.

72. Stefanini M., De Martino C., D'Agostino A., 1974. Nucleolaractivity of rat primary spermatocytes. Exp. Cell Res., 86: 166-170.

73. Swingle K.F., Cole L.J., 1964. Acid deoxyribonuclease in ratliver cell nuclei isolated in the presence of calcium ions. J.

74. Histochem. Cytochem., 12: 442-447.

75. Takano V.S., Harmon B.V., Kerr J.F.R., 1991. Apoptosisinduced by mild hyperthermia in human and murine tumorcell lines a study using electron- microscopy and DNA gelelectrophoresis. J. Phatol., 163: 329-336.

76. Takeshita H., Yasuda Т., Nadano D., and Tenjo E., Sawazaki

77. K., Iida R., Kishi K., 1994. Detection of deoxyribonuclease1.and deoxyribonuclease-II (DNAse-I and DNAse-II) activities in reproductive-organs of male rabbits. Int. J. Biochem., 26: 1025-1031.

78. Wang J.C., 1974. The degree of unwinding of the DNA helix by ethydium. I. Titration of twisted PM2 DNA molecules in alkaline caesium chliride density gradients. J. Mol. Biol., 89: 783-797.