Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Дезоксирибонуклеазы спермиев морского ежа Strongylocentrotus intermedius: свойства, специфичность и функциональная роль
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Дезоксирибонуклеазы спермиев морского ежа Strongylocentrotus intermedius: свойства, специфичность и функциональная роль"
На правах рукописи
ШАСТИНА Валерия Владимировна
ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗЫ СПЕРМИЕВ МОРСКОГО ЕЖА 8ггоп8у1осепггогп8 тйптеМш:: СВОЙСТВА, СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
03.00.04-биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
ВЛАДИВОСТОК 2004
Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии Дальневосточного отделения Российской академии наук
Научный руководитель:
кандидат биологических наук Сибирцев Ю.Т.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Костецкий Э.Я.
кандидат химических наук
Сова В.В.
Ведущая организация:
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» МЗ'РФ
Защита состоится « 4 » июня 2004 г. в « 10 » часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ. Факс: (4232) 31-40-50.
С диссертацией можно ознакомиться в филиале Центральной научной библиотеки ДВО РАН (г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).
Автореферат разослан « 30 » апреля 2004 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета, к.х.н.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Особый интерес к изучению дезоксирибонуклеаз (ДНКаз) обусловлен получением убедительных доказательств их участия в программируемой гибели клеток или апоптозе. Многочисленные исследования механизмов реализации апоптоза в различных клетках и поиск возможных путей его модулирования выдвинули проблему исследования ДНКаз, являющихся одними из основных участников апоптотического процесса, в ряд наиболее актуальных задач современной биохимии.
К настоящему времени выявлены два типа ДНКаз, принимающих участие в апоптозе: металлозависимые (Mg2+- и Са2+, Мg2+-зависимые ДНКазы) и катион-независимые кислые ДНКазы.
Современные исследования показали, что физиологическая гибель дефектных или «лишних» мужских половых клеток млекопитающих в течение сперматогенеза является апоптотическим процессом. У морских беспозвоночных функцию контроля количества и качества развивающихся половых клеток выполняет процесс резорбции. Однако, исследований механизмов, лежащих в основе процесса резорбции половых клеток в ходе их созревания в морских организмах, с точки зрения апоптотического процесса, до сих пор не проводилось.
В настоящее время информация об апоптотическом процессе в зрелых мужских половых клетках весьма ограничена. В существующих единичных работах по исследованию апоптоза в сперматозоидах млекопитающих не изучались ни механизмы его реализации, ни ДНКазы, участвующие в этом процессе. Исследование апоптоза в половых клетках морских организмов было проведено только в одной работе, выполненной на яйцеклетках морского ежа, в которой авторы так же не определяли ДНКазы в апоптотическом процессе. Исследования участия ДНКаз в апоптотическом процессе в репродуктивных органах или сперматозоидах ограничиваются единственной работой, в которой было показано вовлечение кислой ДНКазы в апоптоз клеток яичника китайского хомячка.
На сегодняшний день существуют всего несколько работ, посвященных исследованию ДНКаз в мужских половых продуктах. Непосредственно в мужских половых клетках кислая ДНКаза II была обнаружена только в сперматозоидах вьюна М1я£;игпш/о55Ш5 L. В то же время было показано, что спермин кролика не содержат активностей ДНКаз.
Таким образом, цель данного исследования определили следующие факторы: недостаточность и противоречивость информации о присутствии ДНКаз в сперматозоидах разных организмов; данные об инициации апоптотического процесса в зрелых сперматозоидах млекопитающих; отсутствие исследований процесса резорбции в морских беспозвоночных с точки зрения апоптоза.
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось исследование ДНКаз репродуктивных органов и половых клеток самцов морского ежа З^оп^оеепМш МегтеЛш и определение их функциональной роли.
В соответствии с целью работы, были поставлены следующие задачи:
1. Выявить присутствие ДНКаз в спермиях морского ежа ШегтеШш и разработать схему очистки для выделения индивидуальных препаратов ферментов.
2. Определить основные физико-химические и ферментативные свойства выделенных ферментов.
3. Исследовать специфичность действия ферментов спермиев с использованием синтетических олигонуклеотидов различной нуклеотидной последовательности и длины.
4. Определить уровень удельной активности эндогенных щелочных и кислых ДНКаз в репродуктивных органах самцов морского ежа в течение годового репродуктивного цикла.
5. Выявить корреляцию процессов резорбции половых клеток в семенниках морского ежа в ходе репродуктивного цикла с изменением уровня активности эндогенных ДНКаз.
6. Выявить наличие в зрелых транскрипционно неактивных спермиях морского ежа 5". ШвттвШш программы физиологической гибели клеток (апоптоза) и показать участие в этом процессе эндогенных ДНКаз.
Положения, выносимые на защиту:
1. Спермин морского ежа 5. МвгтвШш содержат активности двух щелочных металлозависимых и одной кислой катион-независимой дезоксирибонуклеаз.
2. Выделенные ДНКазы спермиев морского ежа обладают индивидуальными физико-химическими и ферментативными свойствами и отличаются по специфичности действия.
3. Транскрипционно неактивные спермин морского ежа имеют программу физиологической гибели клеток (апоптоза), индукция которой происходит в результате замораживания-оттаивания спермиев, находящихся в смеси 20%-ный глицерин-морская вода.
4. В реализации программы апоптотической гибели спермиев принимает участие эндогенная Са2+, Mg2+- зависимая ДНКаза.
Научная новизна и практическая ценность. В результате проведенных исследований впервые показано, что в спермиях морского ежа 5. МвгтвШш присутствуют три эндодезоксирибонуклеазы, принадлежащие к двум типам: две щелочные металлозависимые и кислая катион-независимая ДНКазы. Разработана схема очистки, которая позволила выделить в индивидуальном виде препараты трех ДНКаз, не содержащие примесей других нуклеаз. Определены их основные физико-химические и ферментативные свойства.
С использованием метода фут-принтного анализа определена специфичность выделенных ДНКаз спермиев. Впервые исследована специфичность фермента, принадлежащего к группе Са2+, Мп2+- зависимых ДНКаз эукариот, - Са, Мп-ДНКазы спермиев морского ежа. Показано, что синтетические одноцепочечные олигонуклеотиды абсолютно устойчивы к действию Са, Mg-ДНКазы спермиев морского ежа.
Впервые установлена корреляция процесса резорбции половых клеток морского ежа в течение репродуктивного цикла с изменением уровня удельной активности эндогенных щелочных и кислых ДНКаз.
Впервые показано, что в спермиях морского ежа, несмотря на то, что они находятся в транскрипционно и трансляционно неактивном состоянии, существует программа реализации апоптотической гибели клеток.
Впервые с использованием электронной микроскопии исследована кинетика морфологических изменений спермиев морского ежа в течение процесса апоптоза.
Новизна выбранного подхода для решения поставленных задач заключается в комплексном исследовании: с одной стороны, выделение и определение свойств ДНКаз спермиев морского ежа, как потенциальных участников программируемой
гибели клеток, с другой стороны, получение доказательств их участия в апоптотическом процессе.
Са, Mg-ДНКаза спермиев, в связи со способностью сохранять активность в природной морской воде, может быть рекомендована для использования в биологическом тестировании уровня загрязненности морской воды ионами тяжелых металлов. Выявленная строгая специфичность Са, Mg-ДНКазы к двухцепочечному субстрату, позволит использовать данный фермент для генно-инженерных работ. Спермин морского ежа могут использоваться в качестве удобной модели для исследования способности различных веществ являться модуляторами апоптотического процесса Проведенное изучение процесса апоптоза в спермиях морского ежа вносит существенный вклад в развитие дальнейших исследований его молекулярных механизмов и определение путей его регуляции, с целью решения проблемы мужской стерильности.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 10th International symposium on Marine Natural Products (Nago, Okinawa, 2001); Первой Международной конференции "Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки" (Москва, 2002), 23 rd International symposium on the chemistry of natural products (Florence, Italy, 2002); 1-ом съезде Общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2003).
Публикации. По материалам исследований опубликовано 7 печатных работ (3 статьи и 4 тезисов конференций).
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 194 публикации. Диссертация изложена на 128 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 27 рисунков.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ РЕЗУЛЬТАТЫ II ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ДНКаз СПЕРМИЕВ МОРСКОГО ЕЖА 1.1. Очистка ДНКаз спермиев морского ежа
В работе использовали спермин морского ежа Strongylocentrotus intermedius, заготовленные в период осенней половой зрелости самцов. Для полноты экстракции ферментов в ходе лизиса спермиев была экспериментально подобрана лизирующая смесь, которая содержала 1 М NaCl и 0,5% тритона Х-100. Схема очистки ферментов спермиев включала серию последовательных хроматографий на ДЭАЭ-целлюлозе и фенил-сефарозе, высокоэффективную ионообменную хроматографию на колонке Sourse 15Q РЕ и гель-фильтрацию на колонке Superdex 75 HR, что позволило получить в индивидуальном виде препараты трех ДНКаз, не содержащие примесей других нуклеаз, с удельной активностью для Са2+, Mg2+-зависимой (Са, Mg-ДНКазы)
- 11000, Са2+, Мп2+-зависимой (Са, Мп-ДНКазы) - 70 и кислой ДНКазы (К-ДНКазы)
- 4700 ед/мг белка. Результаты очистки трех ДНКаз представлены в табл. 1.
Поскольку Са, Mn-ДНКаза имела низкую активность на фоне высокой активности Са, Mg-ДНКазы и К-ДНКазы, оценить выход этого фермента на первых стадиях очистки не представлялось возможным. Поэтому в таблице не приведены данные удельной активности Са, Мn-ДНКазы в экстракте и после хроматографии на колонке с ДЭАЭ-целлюлозой.
Активность ферментов на всех стадиях очистки и при исследовании их свойств
определяли двумя методами: качественно и количественно. Качественную оценку проводили по способности ферментов в оптимальных условиях катализировать переход ДНК фага в низкомолекулярные фрагменты или сверхскрученной ДНК pBR322 (форма I) в открытую кольцевую (форма II) и линейную (форма III) ДНК (метод 1). Количественную оценку проводили по выходу кислоторастворимых олигонуклеотидов, образующихся при гидролизе нативной ДНК в оптимальных условиях действия ферментов. За единицу активности ДНКаз принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 оптической единицы (о.е.) олигонуклеотидов при гидролизе ДНК в течение 1 ч при 37°С (метод 2).
Таблица 1. Очистка ДНКаз спермиев морского ежа S. intermedius
Стадии Белок, Удельная Выход, Степень
очистки ДНКазы мг активность, % очистки
едУмг
Экстракт К-ДНКаза 142 4 5,5 100 1
Са, Mg-ДНКаза 142 15,2 100 1
Са, Мп-ДНКаза 142 - - -
ДЭАЭ- К-ДНКаза 11 50 70 9
Целлюлоза Са, Mg-ДНКаза 10,5 118 66 9
Са, Мп-ДНКаза И - - -
Фенил - К-ДНКаза 0,13 1900 32 350
сефароза Са, Mg-ДНКаза 0,71 1400 45 92
Са, Мп-ДНКаза 0,35 20 - -
5оигее 15(} РЕ Са, Mg-ДНКаза 0,11 5500 27 360
8ирегаех75 11Я К-ДНКаза 0,035 4700 21 865
Са, Mg-ДНКаза 0,023 11000 11,4 720
Са, Мп-ДНКаза 0,013 70 - -
1.2. Физико-химические и ферментативные свойства ДНКаз спермиев
морского ежа
Молекулярная масса и рН-оптимум активности ферментов. Молекулярная масса Са, Mg-ДНКазы, Са, Mn-ДНКазы и К-ДНКазы, определенная методом гель-фильтрации на Supeгdex 75 HR, равна 63,25 и 37 кДа соответственно.
Результаты, представленные на рис. 1, показывают, что при рН 7,5 Са, Mg-ДНКаза в присутствии 1 мМ СаСТ2 и 5 мМ MgCI2 проявляет максимальную активность. В присутствии только одних ионов Са2+, Mg2+ или Со2+ фермент проявляет незначительную активность (менее 15%). Следует отметить, что в присутствии ионов Мп2+ фермент проявляет немного большую активность (30%), причем, рН-оптимум, как и при добавлении ионов Со2+ (20% активности), смещается в кислую область на одну единицу рН, по сравнению с оптимальными условиями, и становится менее выраженным. Таким образом, рН-оптимум Са, Mg-ДНКазы в значительной степени зависит от природы активирующих этот фермент двухвалентных катионов металлов. Активность Са, Mn-ДНКазы проявляется в широкой области рН от 6,5 до 9,5 с максимумом при рН 8,5. рН-оптимум кислой ДНКазы имеет выраженный пик активности с максимумом при 5,5.
Таблица 2. Влияние ионов двухвалентных металлов на активность Са, Л^-ДНКазы и Са, Мп-
Влияние
Ионы Концен Активность
металлов трация, ДНКаз*, %
мМ Са, Са, Мп-
ДНКаза ДНКаза
(0,5 мМ ЭГТА) I - 10
+М82+ 2 - 6
3 6 -
5 7 -
Са" 2 - 0
5 5 -
Мп" I 8 10
3 15 18
1 мМ Са'++ 3 82 -
Мй2+ 5 100 -
2 мМ Са'Ч 3 — 73
Мй2+ 4 - 70
2 мМ Са2++ 1 15 80
Мп3+ 2 15 100
0,001 59 -
+гп2+ 0,002 18 —
0,01 0 -
(Саг++ МП'1)" 0,01 - 83
+гп2+ 0,05 - 43
0,1 - 21
Относительно максимальной активности в оптимальных условиях, "Оптимальные концентрации Са2+ + Mg2+ или Са2+ + Мп2+.
ионов металлов.
данные ионы Mg2+,
двухвалентных
Полученные показывают, что Са2+ и Мп2+ по отдельности оказывают слабое
активирующее влияние на Са, Mg-ДНКазу и Са, Мп-ДНКазу (табл. 2). Однако; при условии одновременного присутствия и при строго определенных соотношениях ионов Са2+ и Mg2+ или Са2+ и Мп2+, ферменты проявляют максимальную
активность с явно выраженным эффектом синергизма.
Активность Са, Mg-ДНКазы в этом случае увеличивается в 14 раз, а Са, Мп-ДНКазы - более чем в 5 раз. Следовательно, выделенные ферменты
являются Са2+, Mg2+- и Са2+, Мп2+-зависимыми ДНКазами. Следует отметить очень высокую степень
ингибирования Са, Mg-ДНКазы минимальными
концентрациями ионов Zn2+. Для ингибирования 50%-ной исходной активности Са, Mg-
ДНКазы достаточно 10-6 М ионов цинка, что в 50 раз меньше, чем требуется для ингибирования Са, Мп-ДНКазы (5х10-5М). Учитывая известный факт, что ионы Zn2+ в низких концентрациях ингибируют активность апоптотических эндонуклеаз, можно предположить, что данные ферменты спермиев, в большей мере это касается Са, Mg-ДНКазы, могут принимать участие в апоптотическом процессе.
Таблица 3. Влияние некоторых ионов и реагентов на активность К-ДНКазы из спермиев морского ежа£ МегтесНиз
Ионы, реагенты Концентрация, мМ Активность*, %
без ЭДТА - 100
ЭДТА 1,0 115
Са^ 5,0 98
Ми" 5,0 94
Мя^ + Са2* 5,0+1,0 68
Ме^ + ЭГТА 5,0 + 0,1 68
2п>+ 3,0 45
^-ацетат 175 50
активность определили в ч
ацетатном буфере, рН 5,5.
К-ДНКаза спермиев
морского ежа не активируется ионами двухвалентных металлов, а некоторые из этих ионов оказывают ингибирующее
действие (табл. 3). В большей степени активность фермента иyгибируется ионами магния и цинка. Слабая активация фермента в присутствии ЭДТА, видимо, вызвана ее
способностью связывать
возможные примеси катионов двухвалентных металлов в реакционной среде.
Влияние ионной силы. Влияние ионной силы на активность ДНКаз является одним из характерных свойств этих ферментов. Как видно на рис. 2, в наибольшей степени №0 влияет на активность Са, Мп-ДНКязы, в присутствии 75 мМ №0 активность фермента снижается на 50%. Активность Са, Mg-ДНКазы и К-ДНКазы снижается на 50% при 175 и 150 мМ №0 соответственно. Следует особо отметить, что способность Са, Mg-ДНКазы из спермиев морского ежа, типичной металлозависимой ДНКазы, полностью сохранять ферментативную активность в природной морской' воде (эквивалентно 450 мМ №СТ) является необычным свойством. Са, Mn-ДНКаза и К-ДНКаза в природной морской воде неактивны.
Влияние ингибиторов. Отношение к специфическим ингибиторам является существенной характеристикой ДНКаз, позволяющей отнести их к определенному типу. В табл. 4 показано, что полиамин — спермидин, влияющий на конформацию ДНК, в гораздо большей степени ингибирует активность К-ДНКазы по сравнению с Са, Mg-ДНКазой: 50%-ное ингибирование К-ДНКазы достигается при концентрациях спермидина в 1,6 раза меньших, чем это необходимо для 50%-ного ингибирования Са, Mg-ДНКазы. Следует отметить, что О-актин, являющийся специфическим ингибитором ферментов типа панкреатической ДНКазы I и не ингибирующий активность ядерных Са2+, Mg2+ -зависимых ДНКаз, на активность Са, Mg-ДНКазы спермиев морского ежа также не влияет. К-Этилмалеимид, реагирующий с сульфгидрильными группами в активном центре некоторых ферментов, и, таким образом, ингибирующий их активность, не оказывает влияния на Са, Mg-ДНКазу спермиев. Предварительная инкубация фермента с дитиотреитолом, который восстанавливает дисульфидные связи в молекулах белка, не вызывает изменения ферментативной активности. Таким образом, очевидно, что для проявления активности Са, Mg-ДНКазы сульфгидрильные группы и дисульфидные связи не являются функционально важными. В то же время необходимо отметить высокую чувствительность К-ДНКазы к К-этилмалеимиду, что позволяет предполагать наличие свободных сульфгидрильйых групп в молекуле этого фермента, значимых для его каталитической активности.
Таблица 4. Влияние реагентов на активность Са, ДНКазы и К-ДНКазы из спермиев морского ежа & ШегтесНив
Реагенты Концен- Активность
трация ДНКаз*, %
Са,Мё- к-
ДНКаза ДНКаза
Иодуксусная 0,2 мМ 100 65
кислота 0,4 мМ 100 53
0,8 мМ 96 23
1,2 мМ 95 15
2,0 мМ 93 6
Спермидин 0,1 мМ 84 81
0,15 мМ 73 31
0,2 мМ 51 4
0,3 мМ 14 2
О-Лктин 15 мкг/мл 100 95
100 мкг/мл 100 70
М-Этилмале- 0,1 мМ - 50
имид 0,5 мМ - 20
1 мМ 100 0
4 мМ 100 0
Активность ДНКаз определяли в оптимальных условиях действия ферментов
Особый интерес
вызывает влияние на активность К-ДНКазы
спермиев иодуксусиой
кислоты, которая при концентрации 0,4 мМ ингибирует фермент на 50%. Известно, что иодуксусная кислота специфически
взаимодействует с
ферментами, активные
центры которых имеют суммарный положительный заряд и в которых находится остаток гистидина. В связи с этим можно предположить, что активный центр К-ДНКазы спермиев содержит функционально важный
остаток гистидина, а суммарный положительный заряд активного центра играет важную роль в образовании эффективного ДНК-
ферментного комплекса.
Механизм действия. Анализ кинетики гидролиза ДНК pBR322 выделенными ферментами показал, что Са, Mg-ДНКаза и К-ДНКаза расщепляют сверхскрученную ДНК (форму I) без накопления кольцевой ДНК (формы II) (рис. 3, дорожки 3-5 и 11— 13 соответственно). На рис. 3 видно, что линейная форма ДНК (форма III) и фрагменты меньшей длины образуются в значительном количестве даже при сохранении в инкубационной смеси определенного количества исходной I формы ДНК. Следовательно, ферменты действуют по одноударному механизму, одновременно расщепляя обе цепи ДНК без внесения одноцепочечных разрывов. В результате этого формы I и II (последняя, как правило, в небольших количествах присутствует в исходной ДНК) сразу переходят в линейную форму III с последующим ее расщеплением на более мелкие фрагменты.
Анализ кинетики расщепления ДНК pBR322 Са, Mn-ДНКазой показал, что механизм действия этого фермента иной. Вначале наблюдается расщепление сверхскрученной ДНК с одновременным накоплением II и III форм ДНК, затем их количество уменьшается с увеличением числа фрагментов меньшей длины (рис. 3, дорожки 7-9). Очевидно, что в процессе гидролиза одноцепочечные разрывы накапливаются в противоположных цепях ДНК и по мере их накопления перекрываются, вследствие чего форма II переходит в линейную форму III с последующим расщеплением до фрагментов меньшей длины. Из этого следует, что фермент расщепляет двухцепочечную ДНК по двухударному механизму.
Для сравнения приведена кинетика расщепления сверхскрученной ДНК панкреатической ДНКазой I (рис. 3, дорожки 14-17), которая является типичным представителем ДНКаз с двухударным механизмом действия.
Са, Мд-ДНКаза
2 3 4 5
Са, Мп- | I
ДНКаза I К-ДНКаза | ДНКаза!
9 1011 12131415161718
6 7 8
г»*»«* ЧНМ --—»»"
'W ЙгЗйЫ.MS.
Рис. 3. Кинетика гидролиза ДНК рВЮ22 Са, Мя-ДНКазой, Са, Мп-ДНКазой и К-ДНКазой спермиев морского ежа и ДНКазой I в оптимальных условиях: 1 - гидролизат ДНК - II форма Фага ^ рестриктазой Нт& III; -III форма 2, 6, 10, 14 - ДНК без -I форма фермента (контроль); 3, 7, 11, 15 — 10 мин инкубации; 4, 8, 12, 16 - 20 мин инкубации; 5, 9, 13, 17 — 30 мин инкубации; 18 - гидролизат ДНК рВЮ22 рестриктазой ЕсоК I.
Локализация ферментов. При определении ферментативной активности ДНКаз в лизате ядер спермиев морского ежа, с использованием в качестве субстрата сверхскрученной ДНК pBR322 (метод 1), показано, что в ядрах присутствует Са, Mg-ДНКаза, тогда как К-ДНКазы там не было обнаружено. Локализацию ферментов также определяли, исследуя полученные лизаты ядер при помощи электрофореза в 14%-ном полиакриламидном геле с заполимеризованной нативной ДНК (100 мкг/мл) (метод ДДС- Na-ПААГ-ДНК), как описано ранее (Rosenthal, Lacks, 1977). Этим методом было показало присутствие в ядрах только Са, Mg-ДНКазы (рис. 4). Следует
отметить, что подвижность белковой полосы с активностью Са, Mg-ДНКазы в лизате ядер совпадает с подвижностью фермента, выделенного из спермиев в результате его очистки. Приведенные данные позволяют сделать вывод, что Са, Mg-ДНКаза локализуется в ядре. Дополнительным подтверждением этого факта является резистентность активности Са, Mg-ДНКазы к ингибирующему действию G-актина, что характерно для группы ядерных Са2+, Mg2+- зависимых ДНКаз. Отсутствие лизосом в спермиях морского ежа, позволяет предположить иную функциональную роль внеядерной К-ДНКазы спермиев в мужских половых клетках по сравнению с кислыми ДНКазами лизосомного происхождения.
Рис. 4. Определение активности Са, Мё-ДНКазы в ДДС-Ыа-ПААГ-ДНК после электрофореза лизата ядер (1) и Са, Г^-ДНКазы спермиев, полученной в результате очистки (2).
2. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДНКаз СПЕРМИЕВ МОРСКОГО ЕЖА 2.1. Специфичность Са, Mg-ДНКазы спермиев морского ежа
Исследование специфичности действия ДНКаз спермиев морского ежа S. intermedius проводилось методом фут-принтного анализа с использованием меченных по 5'-концу радиоактивной меткой [у-32Р]-АТФ синтетических одно- и двухцепочечных олигодезоксирибонуклеотидов разной длины и нуклеотидной последовательности. Радиоавтографы, полученные после электрофореза продуктов гидролиза в денатурирующем 20%-ном полиакриламидном геле, сканировали и проводили компьютерный анализ результатов при помощи программы Gel-Pro Analyzer 32. Эффективность расщепления отдельных связей в олигонуклеотиде определяли в процентах как отношение интенсивности каждой полосы на радиоавтографе к сумме интенсивностей всех полос.
Было показано, что Са, Mg-ДНКаза спермиев в оптимальных условиях с высокой эффективностью гидролизует только длинные фрагменты ДНК. Для определения оптимальной длины субстрата, необходимой для эффективного гидролиза Са, Mg-ДНКазой, исследовали эффективность расщепления шести двухцепочечных фрагментов ДНК длиной от 910 до 166 пар нуклеотидов (п.н.). Фрагменты были получены в результате гидролиза плазмиды pUC19 рестриктазой Bst DE I.
При гидролизе рестрикционных фрагментов разной длины в зависимости от времени инкубации было показано, что в стандартных условиях Са, Mg-ДНКаза спермиев с максимальной эффективностью расщепляет фрагмент длиной в 910 п.н. (рис. 5). Незначительное снижение эффективности (около 10%) наблюдается при гидролизе фрагмента длиной в 540 п.н. С наименьшей эффективностью (в 2,0-3,5 раза) фермент расщепляет самый короткий фрагмент, длиной в 235 п.н. (в течение 15 и 30 мин инкубации эффективность равна 13 и 20% соответственно) (рис. 5). Таким образом, можно сделать вывод, что при оптимальных условиях инкубации Са, Mg-ДНКаза спермиев гидролизует с примерно одинаково высокой эффективностью субстраты с длиной цепи более 500 п.н. Следует отметить, что такое свойство Са,
1 2
ДНКаза
Mg-ДНКазы спермиев, не отмечено ни для одной из известных ДНКаз и поэтому является уникальным для дезоксирибонуклеаз.
Рис. 5. Кинетика гидролиза рестрикционных фрагментов РиС19+В5ШЕ I Са, М£-ДНКазой спермиев морского ежа в оптимальных условиях
реакционной среды. Инкубация с Са, \^-ДНКазой в течение 15 (1), 30 (2) и 60 мин (3).
Для осуществления эффективного гидролиза коротких двухцепочечных 35-, 21/25- и 20- звенных олигонуклеотидов Са, Mg-ДНКазой спермиев, было необходимо изменить соотношение фермент-субстрат в сторону многократного уменьшения количества субстрата (около 10 раз) и увеличить продолжительность реакции до 10 ч. При этом одноцепочечные синтетические олигонуклеотиды, независимо от их длины и последовательности, проявляли абсолютную резистентность к действию Са, Mg-ДНКазы спермиев. Эти данные указывают на то, что фермент обладает ярко выраженной специфичностью к вторичной структуре субстрата.
Гидролиз коротких двухцепочечных олигонуклеотидов показал, что фермент с наибольшей эффективностью расщепляет фосфодиэфирную связь CpG, находящуюся в составе вставки pCCGC. Так, в 35-звенном дуплексе с максимальной эффективностью гидролизуется связь CpG (28,5%) в 5 положении (рис. 6). Дуплекс 21/25 содержит четыре pCCGC вставки, которые также являются местом предпочтительного действия Са, Mg-ДНКазы спермиев, но их гидролиз осуществляется с меньшей эффективностью, чем в 35-звенном дуплексе. Так, связь CpG в 9 и 15 положении гидролизуется с эффективностью 5,2 и 3,8% соответственно (рис. 7). CpG-связи, расположенные на концах этого дуплекса в 3 и 22 положении, расщепляются с гораздо меньшей эффективностью, равной 0,2 и 0,5% соответственно. Такую высокую резистентность к расщеплению фосфодиэфирных связей CpG, расположенных во вставках на концах олигонуклеотида, можно объяснить структурой данного дуплекса, который имеет 3'- и 5'- «липкие» одноцепочечные концы, состоящие из двух нуклеотидов. Поскольку, Са, Mg-ДНКаза спермиев гидролизует только двухцепочечные субстраты, то, возможно, наличие таких одноцепочечных «липких» концов препятствует образованию продуктивного субстрат-ферментного комплекса, необходимого для эффективной работы фермента. Следует отметить, что с высокой эффективностью кроме связи CpG гидролизуются связи СрС и GpC в пределах последовательности pCCGC, связи вне этой вставки расщепляются Са, Mg-ДНКазой спермиев с меньшей эффективностью. Особенно ярко данная закономерность проявляется при гидролизе 35- звенного олигонуклеотида, содержащего одну pCCGC вставку. В пределах указанной последовательности связи СрС, CpG и GpC гидролизуются с эффективностью 3,5;
28,5 и 7% соответственно (рис. 6). В 21/25- звенном олигонуклеотиде содержатся четыре таких вставки, на две из них, находящиеся в центре, приходятся все эффективно расщепленные связи (рис. 7). Возможно, что данная последовательность, насыщенная пиримидиновыми основаниями (три С) и встроенным в нее пурином имеет определенную локальную конформацию ДНК, обеспечивающую создание продуктивного ДНК-ферментного комплекса. Помимо фосфодиэфирной связи CpG, Са, Mg-ДНКаза спермиев также с достаточно высокой эффективностью расщепляет связь ApG (13%) в 9 положении 35- звенного дуплекса, но эта же связь в 7 положении 20- звенного дуплекса гидролизуется с эффективностью только 3,5%. Причиной такой высокой эффективности гидролиза связи ApG в 35- звенном дуплексе, возможно, является ее расположение вблизи GC обогащенного участка — в так называемых «фланкирующих участках» pCCGC вставки, что, вероятно, повысило эффективность гидролиза. В то время как, связь ApG в 20- звенном дуплексе, находящаяся вне влияния pCCGC вставки, расщеплялась с эффективностью всего в 3,5%.
30
23
20
15
10
е»
о
■--- _. — - ------------------— .......
11
5-Т АСССОСТАОСТООАССТООТСАТАТОСАТССТТ О-Э'
Рис. 6. Эффективность расщепления связей в 35-звенном дуплексе Са, Р^-ДНКазой спермиев морского ежа 5. ШегтееНм.
6
#
í 5
X
и
I4
? 3
I 2 в А
£
5'-0 ССОСТСССОСАТССОСТООССОО С-3' З'-О СОАССССОТАООСОАСССО С-5'
хит^уу
1д1
ДлДддЯядд.
Рис. 7. Эффективность расщепления связей в 21/25-звенном дуплексе Са, ДНКазой спермиев морского ежа 5. ШегтесИиз.
2.2. Специфичность Са, Мп-ДНКазыспермиевморскогоежа
Проведенные нами исследования показали, что Са, Mn-ДНКаза и Са, Mg-ДНКаза спермиев морского ежа существенно отличаются по специфичности действия. Во-первых, для Са, Мn-ДНКазы, в отличие от Са, Mg-ДНКазы, скорость гидролиза природных и синтетических субстратов не зависит от длины субстрата. Во-вторых, Са, Mn-ДНКаза не проявляет абсолютной специфичности к двухцепочечной структуре субстрата. Одноцепочечные олигонуклеотиды также гидролизуются этим ферментом, но с меньшей эффективностью, чем дуплексы аналогичной последовательности. Интересной особенностью Са, Мn-ДНКазы спермиев является её необычно высокая специфичность к определенной связи в одноцепочечном олигонуклеотиде. Так, связь СрТ в 17 положении 35-звенного одноцепочечного олигонуклеотида расщепляется с эффективностью в 4,7%, в то время как остальные связи подвергаются равномерному слабому гидролизу с эффективностью около 0,3% (рис. 8). Таким образом, связь СрТ расщепляется в 16 раз эффективнее, чем окружающие её аналогичные связи. Можно предположить, что высокая специфичность к связи СрТ в 17 положении определяется фланкирующими ее последовательностями, состоящими из чередующихся пуриновых и пиримидиновых оснований. Тенденция к эффективному расщеплению СрТ связи сохраняется и в двухцепочечном 35-звенном олигонуклеотиде с аналогичной последовательностью (рис. 9). Так, связь СрТ в 17 положении расщепляется с эффективностью 5,5%, что только в 2 раза выше относительно окружающих связей. В положениях 11 и 32 связь СрТ гидролизуется Са, Mn-ДНКазой с большей эффективностью, чем в одноцепочечном фрагменте (2,8 и 3,6% соответственно), тем самым, позволяя предположить, что выраженная специфичность к этой связи может модулироваться вторичной структурой субстрата, в котором находится данная связь. Необходимо отметить, что общий профиль эффективности расщепляемых связей в двухцепочечном олигонуклеотиде, по сравнению с одноцепочечным, в значительной мере изменился, - специфичность фермента к определенным связям стала менее выраженной, что, вероятно, свидетельствует о влиянии вторичной структуры на специфичность Са, Мп-ДНКазы спермиев. Так, наряду со связью СрТ в 11, 17 и 32 положениях Са, Mn-ДНКаза с достаточно высокой эффективностью расщепляет связи GpA, CpA и АрТ - 4,5; 3,4 и 3,6% соответственно в 14, 28 и 29 положениях 35-звенного олигонуклеотида (рис. 9). Следует отметить, что связи, последовательно расположенные в пределах З'-концевой последовательности pCATCCTTG 35-звенного дуплекса (28-34 положения), подвергаются гидролизу с достаточно высокой эффективностью от 2,5 до 3,6%. Указанная последовательность характеризуется высоким содержанием пиримидиновых оснований и относится к единственному участку 35-звенного олигонуклеотида, где расположены 5 пиримидинов подряд.
Таким образом, следует говорить о специфичности Са, Мп-ДНКазы спермиев к определенной конформации сахаро-фосфатного остова субстрата, обусловленной химической природой основания. Выявленная специфичность характеризуется эффективным расщеплением определенных связей и в большей степени проявляется при гидролизе ферментом одноцепочечного субстрата. При этом на эффективность расщепления связей, вероятно, влияют как фланкирующие эту связь последовательности нуклеотидов, так и вторичная структура субстрата.
5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1
0,5 0
5,-ТАСССОСТАОСТООАССТОаТСАТАТОСАТССТТ С-У
п^ллЛллЛДдЛллЛл, ЛДдД-г
Рис. 8. Эффективность расщепления связей в одноцепочечном 35-звенном олигонуклеотиде Са, Мп-ДНКазой спермиев морского ежа ШегтесИш.
2.3.. Специфичность К-ДНКазы спермиев морского ежа
Нами показано, что одиоцепочечный 35-звенный олигонуклеотид расщепляется К-ДНКазой с большей эффективностью, по сравнению с дуплексом аналогичной последовательности. При всех равных условиях проведения ферментативных реакций в одноцепочечном фрагменте фермент расщепляет 18 связей с эффективностью более 2%, в то время как в двухцепочечном фрагменте с такой же эффективностью фермент расщепляет только 9 связей (рис. 10, 11). Таким образом, К-ДНКаза спермиев, в отличие от большинства кислых ДНКаз, проявляет предпочтение к расщеплению одноцепочечных субстратов.
Анализ расщепленных связей в исследуемых олигонуклеотидах показал, что специфичность К-ДНКазы спермиев морского ежа к определенным связям в большей степени проявляется при гидролизе 35-звенного дуплекса. Так, в этом фрагменте с максимальной эффективностью расщепляются связи GpA (7,2%), СрА (7,3%), СрТ (8,2%) в положении 14,22 и 32 соответственно (рис. 11). С меньшей эффективностью расщепляются связи ТрА (3,1%), СрА (4,2%) и ТрС (5,4%) в 8, 28 и 30 положении
соответственно. Следует особо отметить, что связь ОрЛ в 14 положении расщепляется с высокой эффективностью независимо от вторичной структуры субстрата, причем, в одноцепочечном фрагменте она расщепляется даже с большей эффективностью (10 %), чем в двухцепочечном (7,2%) (рис. 10, 11). Аналогично, связь СрТ в 17 положении в одноцепочечном фрагменте расщепляется с эффективностью 6,9%, в то время как в двухцепочечном — с эффективностью 1,2%. Можно предположить, что фермент, гидролизуя отдельные связи, таким образом «узнает» определенную локальную конформацию сахаро-фосфатного остова субстрата, которая зависит от химической природы оснований и от фланкирующих эту связь нуклеотидов. Причем, на преимущественность гидролиза определенных связей оказывает влияние вторичная структура олигонуклеотида. В то же время, связь СрТ в 32 положении в двухцепочечном фрагменте расщепляется с большей эффективностью, чем в одноцепочечном: эффективность 8,2 и 4,2% соответственно (рис. 11). Аналогичным образом можно объяснить наблюдаемую высокую эффективность расщепления (14%) связи СрС в 12 положении 20-звенного дуплекса, хотя в других положениях как в двухцепочечных, так и в одноцепочечном олигонуклеотидах данная связь расщепляется с гораздо меньшей эффективностью (от 0,2 до 2,5% для дуплекса и от 1,0 до 3,5% для одноцепочечного олигонуклеотида).
Таким образом, выявленная специфичность гидролиза К-ДНКазы спермиев морского ежа определенных фосфодиэфирных связей в зависимости от фланкирующих последовательностей и влияния вторичной структуры субстратов полностью отличается от специфичности двух металлозависимых ДНКаз спермиев морского ежа.
Рис. 10. Эффективность расщепления связей в одноцепочечном 35-звенном олигонуклеотиде К-ДНКазой спермиев морского ежа 5. ¡МегтесИш.
3. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ДНКаз СЕМЕННИКОВ И СПЕРМИЕВ МОРСКОГО ЕЖА.
3.1. Исследованиеучастия ДНКаз врезорбции половых клеток в гонадах
морского ежа
Репродуктивная активность иглокожих имеет годовую цикличность, объективным показателем которой является изменение массы семенника и яичника. Такие сезонные изменения характеризуются значениями гонадного индекса (ГИ), которые определяются как процентное отношение массы гонад к массе всего тела морского ежа (Хотимченко и др., 1993). Наши исследования показали, что максимальные значения ГИ для самцов и самок в репродуктивный сезон 2001-2002 приходятся на апрель-май (рис. 12). Сравнение средних значений суммарного количества белка (КБ) в гонадах самцов (семенниках) показало, что их профили в значительной мере коррелируют с профилями ГИ (рис. 13).
Максимальные значения ГИ, полученные нами в 2001-2002 г. для самцов и самок серого морского ежа, обитающих в зал. Петра Великого, наблюдались в более ранние сроки (на три месяца) по сравнению с данными, полученными в 1980 году (Хотимченко и др., 1993) (рис. 12).
Такое смещение максимальных значений ГИ подтверждается соответствующей динамикой КБ в гонадах самцов и, видимо, объясняется сезонным повышением
температуры окружающей среды в 2002 г. Полученные данные о значениях ГИ и КБ позволили нам обозначить два основных, хорошо прослеживаемых периода развития. Период, когда наблюдаются минимальные значения ГИ (декабрь-март), по литературным данным характеризуется как середина стадии пролиферации, когда процесс резорбции протекает наиболее интенсивно. Конец стадии пролиферации определяется максимальными величинами КБ и ГИ (апрель-май). Четко прослеживается еще один период, в котором снижение максимальных значений ГИ совпадает с пиком зрелости гонад, и, следовательно, с нерестовой стадией (Хотимченко и др., 1993). Учитывая эти данные, мы можем с достаточной точностью обозначить временные рамки стадии пролиферации сезона 2001-2002 года — декабрь-
Рис. 13. Изменение средних значений суммарного количества белка в гонадах самцов морского ежа ШегтесИш в течение репродуктивного цикла, рассчитанных на 100 г массы особи. Вертикальные линии у точек- отсчета среднее квадратичное отклонение.
Определение средних значений удельной активности щелочных и кислых ДНКаз (ЩД и КД) в процессе репродуктивного цикла самцов морского ежа показало, что удельная активность КД в семенниках начинает увеличиваться в декабре и достигает максимума в марте, затем наблюдается резкий спад активности до минимальных значений, который продолжается до начала нового репродуктивного цикла (рис. 14). При этом профиль максимальных значений активности КД в семенниках (март) не совпадает с максимальными значениями ни ГИ, ни КБ. Более того, именно в этот период ГИ и КБ имеют минимальные значения за весь репродуктивный цикл. Активность ЩД в семенниках достигает максимального уровня в еще более ранние сроки (февраль), но ее значение в это время почти в 3 раза меньше максимальной активности КД. Удельная активность КД и ЩД в спермиях морского ежа является незначительной и практически не отличается от значений активности этих ферментов в семенниках в период нереста.
Динамика средних значений удельной активности ЩД и КД является следствием определенных морфологических и биохимических процессов, происходящих в гонадах самцов морского ежа в ходе репродуктивного цикла. Данные, представленные на рис. 14, показывают, что середина периода пролиферации (декабрь-март) в семенниках характеризуется резким увеличением удельной активности КД и ЩД. Известно, что в течение пролиферации основным содержимым ацинусов являются вспомогательные клетки (фагосомы), которые в этот период утилизируют не только экзогенно поступающие вещества, но также развивающиеся и дефектные половые клетки, и таким образом, увеличение количества гамет сопровождается усилением их резорбции. Затем, на стадии
май и стадия нереста — июнь-сентябрь.
дифференцировки, происходит ослабление процесса резорбции, вследствие чего количество гамет увеличивается и площадь, занимаемая фагосомами в ацинусах, постепенно снижается и на стадии нереста составляет 5% общей площади ацинусов (Вараксина, 1985). Сравнительный анализ динамики удельной активности ЩД и КД с профилями ГИ и КБ в период пролиферации показывает, что прирост удельной активности ДНКаз в этот период не может быть вызван ни пролиферацией половых клеток, ни разрастанием фагосом. Этот вывод следует из отсутствия корреляции
Рис. 14. Изменение средних значений удельной активности щелочной и кислой ДНКаз в гонадах самцов морского ежа Я. ШегтесНиз в течение репродуктивного цикла и спермиях. 1 - ЩД гонад (-□-); 2 - ЩД спермиев (-♦-); 3 -КД гонад ' (-■-); 4 - КД спермиев (-а-). Вертикальные линии у точек отсчета -среднее квадратичное
отклонение.
Таким образом, проведенный анализ позволяет сделать вывод, что резорбция, связанная с селекцией половых клеток, проходящая в период пролиферации, играет определяющую роль в динамике КД и ЩД в гонадах самцов морского ежа. Ряд авторов отмечают, что процесс резорбции может быть ведущим в течение значительной части гонадного цикла как непосредственно после нереста, так и в зимние и, частично, весенние месяцы. Наши данные показывают, что активность ЩД и КД в семенниках в феврале-марте действительно достигает своих максимальных значений (рис. 14). Таким образом, резорбция, вероятно, является тем единственным динамичным процессом в гонадах, в котором ДНКазы играют ключевую роль.
Выявленная нами корреляция процессов резорбции со значительным увеличением удельной активности ДНКаз и данные современных исследований, свидетельствующие о том, что в семенниках млекопитающих в ходе сперматогенеза реализуются процессы элиминации развивающихся половых клеток, посредством апоптотического механизма, позволяют предположить, что механизм инициации резорбции в ходе сперматогенеза морского ежа является апоптотическим процессом. Запуск апоптоза, возможно, приводит к индукции эндогенной щелочной ДНКазы, максимальный уровень активности которой наступает на один месяц раньше, чем максимум активности кислой ДНКазы (рис. 14). Можно предположить, что при развитии апоптоза начальная фрагментация хромосомной ДНК спермиев осуществляется щелочной ДНКазой. Дополнительным аргументом в пользу этого предположения служит способность ЩД эффективно действовать при нейтральном и слабощелочном рН, и, вероятно, рН среды ацинусов гонад, имеющий соответствующее значение, является наиболее подходящим для действия ЩД. Возможно, что процесс окончательной деструкции спермиев происходит при участии КД вспомогательных клеток, и основной пул наблюдаемой высокой активности КД может приходиться на активность кислых ДНКаз фагосом.
удельной активности ДНКаз и прироста ГИ и КБ.
3.2. Исследованиеучастия Са, Ы§-ДНКазы в апоптотическом процессе спермиев
морского ежа
Полученные нами данные об активации эндогенных ДНКаз в ходе резорбции половых клеток, выявленное сходство некоторых свойств Са, Mg-ДНКазы спермиев со свойствами известных апоптотических ДНКаз и уникальная способность фермента осуществлять гидролиз ДНК в морской воде, позволили нам предположить участие Са, Mg-ДНКазы в элиминации зрелых спермиев путем реализации апоптотического механизма.
Было показано, что замораживание (до — 10°С) и оттаивание спермиев, находящихся в смеси 20%-ный глицерин-морская вода, является инициирующим фактором апоптотического процесса, для дальнейшего развития которого необходимо выдерживание спермиев при 2-5°С в течение 24 ч. В результате этого в спермиях происходит активирование эндогенной Са, Mg-ДНКазы, которая затем, в ходе инкубации спермиев в растворе с высокой ионной силой, расщепляет хроматин по межнуклеосомным участкам, с образованием апоптотической «лестницы», появление которой является одним из основных биохимических признаков, свидетельствующим о развитии апоптотического процесса (рис. 15). В то же время в образцах спермиев, которые хранились без замораживания, апоптоз не проявлялся, и их инкубация в условиях высокой ионной силы не приводила к деградации хроматина, что свидетельствует об отсутствии активации эндогенной Са, Mg-ДНКазы спермиев.
Особо следует отметить, что необходимым условием для выявления специфичного расщепления ДНК является инкубация спермиев в буфере с высокой ионной силой. Так, инкубация спермиев в буфере, оптимальном для действия очищенной Са, Mg-ДНКазы in vitro (с низкой ионной силой), не приводит к межнуклеосомному расщеплению хроматина. В то время как при инкубации спермиев в морской воде или в буфере с 0,5 М NaCl в присутствии ионов Са2+ и Mg2+ была получена характерная «лестница» олигонуклеосомной фрагментации хромосомной ДНК (рис. 15). Молекулярные массы полученных фрагментов хромосомной ДНК спермиев морского ежа были оценены в 260, 520, 760 и 1040 п.н. соответственно. Это согласуется с литературными данными, свидетельствующими о том, что нуклеосома спермиев морского ежа содержит 260 ± 26 п.н. ДНК (Keichline, Wassarman, 1977). Следовательно, деградация хромосомной ДНК произошла по межнуклеосомным линкерным участкам. Более того, увеличение глубины гидролиза ДНК с течением времени указывает на ферментативный характер расщепления (рис. 15, дорожки 2-6). Аналогичная нуклеосомная «лестница» ДНК была получена при инкубации в морской воде ядер, выделенных из спермиев, в которых был
инициирован апоптотический процесс. С учетом установленной нами ядерной локализации Са, Mg-ДНКазы, можно предположить участие именно этого фермента в межнуклеосомной фрагментации хромосомной ДНК спермиев.
Известно, что необходимым условием действия эндогенных ДНКаз является наличие участков хроматина с открытой структурой ДНК. Однако, хроматин спермиев морских ежей имеет очень плотную упаковку, которая в большей мере обеспечивается наличием двух молекул линкерного гистона III на одну нуклеосому. Показано, что при ионной силе в пределах 0,4-0,6 М NaCl происходит диссоциация линкерных гистонов H1 (Osipova et al., 1990). Можно предположить, что 0,5 М NaCl в сочетании с ионами Са2+ и Mg2+, так же как и морская вода, способствуют диссоциации гистонов H1 от линкерных областей нуклеосомы морского ежа, что является одним из возможных механизмов «разрыхления» хроматина и обеспечения доступности ДНК к действию эндогенных ДНКаз.
Одним из биохимических маркеров ДНКаз, участвующих в программированной клеточной гибели, является их ингибироваиие низкими концентрациями ионов Zn2+ и, как следствие, подавление межнуклеосомной фрагментации ДНК (Cohen, Duke, 1984). Проведенные нами исследования показали, что 0,5 мМ ZnCI2 полностью блокирует межнуклеосомное расщепление хромосомной ДНК спермиев эндогенной Са, Mg-ДНКазой in vivo (рис. 15, дорожка 7). Значительное понижение порога чувствительности фермента к ионам Zn2+ in vivo, по сравнению с данными по полному ингибированию очищенной Са, Mg-ДНКазы in vitro (10-5 М ZnCl2), видимо, обусловлено разными условиями нахождения фермента в системах in vivo (целый спермий) и in vitro (очищенный фермент).
Для дополнительного подтверждения участия Са, Mg-ДНКазы спермиев морского ежа в межнуклеосомной деградации ДНК в качестве субстрата были использованы ядра клеток HeLa S3 и Vero E6. Было показано, что экзогенная Са, Mg-ДНКаза расщепляет хроматин ядер клеток HeLa и Vero E6 с образованием олигонуклеосомной «лестницы»; без добавления фермента фрагментация ДНК не наблюдалась (рис. 16).
1 2 3
1 Т.П.Н.—
200 п.н,-
Рис. 16. Межнуклеосомное расщепление хроматина ядер клеток Vero Е6 экзогенной Са, Mg-ДНКазой спермиев морского ежа после инкубации в буфере, содержащем 0,5 М NaCl, 13 мМ СаС12, 26 мМ MgCb при 25°С в течение 15 мин - (3). 1 - реперная ДНК, 2 - инкубация ядер клеток Vero Е6 без добавления экзогенной Са, Mg-ДНКазы (контроль).
Помимо биохимических маркеров апоптоза, для идентификации апоптотических клеток используют так же морфологический критерий. При помощи электронной микроскопии нам удалось зафиксировать типичные признаки изменения морфологии как хроматина ядер, так и плазматической мембраны спермиев (рис. 17). Так, в контрольных образцах спермиев морского ежа морфология клеток и структура хроматина сохраняют целостность (рис. 17А). На рис. 17Б показан спермий после замораживания-оттаивания и выдерживания при 2-5°С в течение 24 ч, морфологические характеристики которого изменились: отсутствует хвост,
митохондрия сморщена и разгруппирована. На следующем рисунке, показывающем спермин после инициации апоптотического процесса и инкубации в условиях высокой ионной силы, можно отметить появление клеток с инвагинацией ядерной мембраны (рис. 17В). Далее процесс «вспенивания» мембраны и агрегация хроматина проявляется в большей степени (рис. 17Г, Д), и, наконец, наблюдается полная деструкция ядер спермиев и их распад на отдельные фрагменты, апоптотические тельца, - пикноз ядерного хроматина (рис. 17Е).
А Б В
Рис. 17. Кинетика морфологических изменений спермиев морского ежа в ходе апоптотического процесса: А — спермин без инкубации (контроль); Б - спермин после замораживания-оттаивания и выдерживания при 2-5°С в течение 24 ч, без инкубации (контроль); В, Г, Д, Е - спермии, инкубированные в морской воде при 25°С в течение 2 ч.
Увеличение: рис. 5Л: х 17,500, рис. 5Б: х 18,000, рис. 5В: х 24,500, рис. 5Г: х 18,500, рис. 5Д: х 17,300, рис. 5Е: х 20,500.
Таким образом, проведенные нами исследования показали, что в зрелых транскрипционно и трансляционно неактивных спермиях морского ежа 5". МвгтвШш существует программа реализации апоптотической гибели клеток, в которой принимает участие ядерная Са, Mg-ДНКаза спермиев.
выводы
1. Показано, что в спермиях морского ежа З^ст^уЬсеиМш ШегтеШш присутствуют три разные эндодезоксирибонуклеазы: Са, Mg-ДНКаза, Са, Мп-ДНКаза и К-ДНКаза. Разработана схема их очистки, в результате получены гомогенные по активности препараты ДНКаз.
2. Установлено, что Са, Mg-ДНКаза является ядерным белком с молекулярной массой 63 кДа и оптимумом рН 7,5, не ингибируется G-актииом и N этилмалеимидом, и сохраняет максимальную активность в природной морской воде. Активность фермента в присутствии ионов двухвалентных металлов убывает в ряду (Са2+ + Mg2+) > Mn2+ = (Са2+ + Mn2+) > (Mg2+ + ЭГТА) > Са2+. Фермент осуществляет гидролиз двухцепочечной ДНК по одноударному механизму.
3. Са, Mn-ДНКаза имеет молекулярную массу 25 кДа и оптимум рН 8,5. Активность фермента в присутствии ионов двухвалентных металлов убывает в ряду (Са2+ + Мп2+) > (Са2+ + Mg2+) > Mn2+ > (Mg2++ ЭГТА). Показано, что Са, Mn-ДНКаза расщепляет двухцепочечную ДНК по двухударному механизму.
4. Показано, что К-ДНКаза не является ядерным белком, имеет молекулярную массу 37 кДа и оптимум рН 5,5, не активируется ионами двухвалентных металлов, ингибируется ^этилмалеимидом и иодуксусной кислотой, осуществляет гидролиз двухцепочечной ДНК по одноударному механизму.
5. Методом фут-принтного анализа показано, что каждая ДНКаза спермиев морского ежа обладает определенной специфичностью к локальной конформации сахаро-фосфатного остова субстрата, обусловленной химической природой оснований. Установлено, что Са, Mg-ДНКаза не расщепляет синтетические одноцепочечные олигонуклеотиды независимо от их длины и нуклеотидной , последовательности и с максимальной эффективностью гидролизует дуплексы с длиной цепи более 500 п.н.
6. Выявлена корреляция процесса резорбции половых клеток в семенниках морского ежа в ходе годового репродуктивного цикла с изменением в них уровня удельной активности щелочных и кислых ДНКаз.
7. С использованием электронной микроскопии и биохимических методов показано, что в транскрипционно и трансляционно неактивных спермиях морского ежа существует программа реализации апоптотической гибели клеток, индукция которой происходит в результате замораживания-оттаивания спермиев, находящихся в смеси 20%-ный глицерин-морская вода.
8. Установлено, что в результате индукции апоптоза активируется эндогенная Са, Mg-ДНКаза, которая расщепляет хромосомную ДНК спермиев по межнуклеосомным участкам с образованием апоптотической «лестницы».
Основные публикации по теме диссертации
1. Сибирцев Ю.Т., Мензорова Н.И., Шастина В.В., Рассказов В.А. Множественность ДНКаз в спермиях морского ежа Strongylocentrotus intermedius //Доклады Академии наук. 2001. Т. 376. № 1. С. 117-119.
2. Shastina V.V, Menzorova N.I., Sibirtzev Ju.T., Rasskazov V.A. Purification and Properties of the DNases from Spermatozoa and Mature Eggs of Sea Urchin Strongylocentrotus intermedius II 10th International symposium on Marine Natural Products. X MaNaPro. Book ofAbstracts. Nago. Okinawa. 2001. P. 152.
3. Шастина В.В., Жибровская Е.М., Мензорова Н.И., Сибирцев Ю.Т., Рассказов В.А. Уровень ДНКазых активностей в гонадах и гаметах морского ежа Strongylocentrotus intermedius в процессе их созревания // Материалы Первой Международной научно-практической конференции «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». М.: ВНИРО. 2002. С. 230-236.
4. Шастина В.В., Жибровская Е.М., Мензорова Н.И., Сибирцев ЮХ, Рассказов В.А. Уровень ДНКазых активностей в гаметах и гонадах морского ежа S. intermedius в ходе их созревания // Первая Международная конференция «Морские прибрежные экосистемы: водоросли, беспозвоночные и продукты их переработки». Тезисы докладов. Москва. 2002. С. 91.
5. Shastina V.V, Sibirtzev Ju.T., Menzorova N.I., Rasskazov V,A. Ca2+, Mg2+-dependent Dnase from spermatozoa of sea urchin Strongylocentrotus intermedius as participant for apoptosis // 23rd International symposium on the chemistry of natural products. Book ofAbstracts. Florence. Italy. 2002. P. 332.
6. Шастина В.В., Мензорова Н.И., Сибирцев Ю.Т., Рассказов В.А. Очистка и характеристика Са2+, Mg2+-, Ca2+, Мп2+- зависимых и кислой ДНКаз из сперматозоидов морского ежа Strongylocentrotus intermedius II Биохимия. 2003. Т. 68. №5. С. 712-724.
7. Шастина В.В., Мензорова Н.И., Рассказов В.А., Нагорская В.П., Реунов А.В., Сибирцев Ю.Т. Участие эндогенной Са2+, Mg2+- зависимой ДНКазы в программированной гибели сперматозоидов морского ежа Strongylocentrotus intermedius II Цитология. 2003. Т. 45. № 9. С. 946-947.
Шастина Валерия Владимировна
ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗЫ СПЕРМИЕВ МОРСКОГО ЕЖА ¡Нтоп&ЬсепЬоШ 1МегтеЛш: СВОЙСТВА. СПЕЦИФИЧНОСТЬ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ РОЛЬ
Автореферат
ЗАО «Фартоп» г. Владивосток, ул. Алеутская, 28 Тираж 100 экз. Отпечатано 29 апреля 2004 г.
Р-В489
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шастина, Валерия Владимировна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
1. ВВЕДЕНИЕ.
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.:.
2.1. ОБЩИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ДНКазах ЭУКАРИОТ.
2.1.1. Классификация ДНКаз.
2.1.2. Распространение и функциональная роль ДНКаз.
2.2. СВОЙСТВА И ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА МЕТАЛЛОЗ АВИСИМЫХ ДНКаз.
2.2.1. Физико-химические свойства щелочных ДНКаз.
2.2.2. Ферментативные свойства щелочных ДНКаз.
2.2.3. Первичная структура и активные центры металлозависимых ДНКаз.
2.3. СВОЙСТВА И ПЕРВИЧНАЯ СТРУКТУРА КИСЛЫХ ДНКаз.
2.3.1. Физическо-химические свойства кислых ДНКаз.
2.3.2. Ферментативные свойства кислых ДНКаз.
2.3.3. Первичная структура и активные центры кислых ДНКаз.
2.4. ДНКазы КАК УЧАСТНИКИ АПОПТОТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА.
2.4.1. Молекулярные механизмы апоптоза.
2.4.2. ДНКазы - участники апоптотического процесса.
2.5. АПОПТОТИЧЕСКИЙ ПРОЦЕСС В ПОЛОВЫХ КЛЕТКАХ.
2.5.1. ДНКазы в мужских репродуктивных органах и половых клетках.
2.5.2. Апоптотический процесс в половых клетках.
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ДНКаз СПЕРМИЕВ МОРСКОГО ЕЖА.
4.1.1. Очистка ДНКаз из спермиев морского ежа.
4.1.2. Физико-химические и ферментативные свойства ДНКаз из спермиев морского ежа.
4.2. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДНКаз СПЕРМИЕВ МОРСКОГО ЕЖА.
4.2.1. Специфичность Са, Mg-ДНКазы из спермиев морского ежа.
4.2.2. Специфичность Са, Мп-ДНКазы из спермиев морского ежа.
4.2.3. Специфичность К-ДНКазы из спермиев морского ежа.
4.3. БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ДНКаз СЕМЕННИКОВ И СПЕРМИЕВ
МОРСКОГО ЕЖА.
4.3.1. Исследование участия ДНКаз в резорбции половых клеток в гонадах морского ежа.
4.3.2. Исследование участия Са, Mg-ДНКазы в апоптотическом процессе спермиев морского ежа.
5. ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Дезоксирибонуклеазы спермиев морского ежа Strongylocentrotus intermedius: свойства, специфичность и функциональная роль"
В важнейших генетических процессах, происходящих в клетке, таких как репликация, рекомбинация и репарация, существенная роль отводится ферментам метаболизма ДНК, в частности, - эндодезоксирибонуклеазам (ДНКазам). Особый интерес к изучению ДНКаз в последние годы обусловлен получением убедительных доказательств их участия в программируемой гибели клеток или апоптозе. Многочисленные исследования механизмов реализации апоптоза в различных клетках и поиск возможных путей его модулирования выдвинули проблему исследования дезоксирибонуклеаз, являющихся одними из основных участников апоптотического процесса, в ряд наиболее актуальных задач современной биохимии.
К настоящему времени выявлены два типа ДНКаз, принимающих участие в апоптозе: металлозависимые ДНКазы (М§2+- и Са2+, М§2+ -зависимые ДНКазы) и катион-независимые кислые ДНКазы. Считается, что эти ферменты различаются определенной специфичностью действия к структурным особенностям хроматина, расщепляя разные его области - розетки, петли и линкерную область нуклеосом. Более того, полагают, что активация в ходе апоптоза определенных ДНКаз зависит от типа клеток, от факторов, инициирующих апоптотическую гибель, и от пути ее реализации.
Современные исследования показали, что физиологическая гибель дефектных или «лишних» мужских половых клеток млекопитающих в течение сперматогенеза является апоптотическим процессом. У морских беспозвоночных функцию контроля количества и качества развивающихся половых клеток, выполняет процесс резорбции. Однако исследований механизмов, лежащих в основе процесса резорбции половых клеток в ходе их созревания в морских организмах, с точки зрения апоптотического процесса, т.е. с привлечением определенных морфологических и биохимических критериев его идентификации, до сих пор не проводилось.
В настоящее время информация об апоптотическом процессе в зрелых мужских половых клетках весьма ограничена. В существующих единичных работах по исследованию апоптоза в сперматозоидах млекопитающих не изучались ни механизмы его реализации, ни ДНКазы, участвующие в этом процессе. Исследованию апоптоза в половых клетках морских организмов посвящена только одна работа, выполненная на яйцеклетках морского ежа, в которой авторы регистрировали апоптотический процесс, но участие ДНКаз в нем так же не определяли. Исследования участия ДНКаз в апоптотическом процессе в репродуктивных органах или сперматозоидах ограничиваются единственной работой, в которой было показано вовлечение кислой ДНКазы в апоптоз клеток яичника китайского хомячка.
На сегодняшний день исследованию ДНКаз мужских половых продуктов посвящены всего несколько работ. Так, было показано, что семенная плазма быка содержит Са2+, М§ -зависимую ДНКазу, а семенная плазма человека - как ДНКазу I, так и кислую ДНКазу II. Однако непосредственно в мужских половых клетках кислая ДНКаза II была обнаружена только в сперматозоидах вьюна Misgurnus /о5$1Ш Ь. В то же время было показано, что спермии кролика не содержат активности ДНКаз.
Таким образом, недостаточность и противоречивость информации о присутствии ДНКаз в сперматозоидах разных организмов; данные об инициации апоптотического процесса в зрелых сперматозоидах млекопитающих и отсутствие исследований процесса резорбции в морских беспозвоночных с точки зрения апоптоза определили цель данной работы - исследование ДНКаз репродуктивных органов и половых клеток самцов морского ежа ЗКопяуЬсеЫШт ШегтесНиз и определение их функциональной роли. В соответствии с заявленной целью работы, были поставлены следующие задачи:
1. Выявить присутствие ДНКаз в спермиях морского ежа & ШегтесНю и разработать схему очистки для выделения индивидуальных препаратов ферментов.
2. Определить основные физико-химические и ферментативные свойства выделенных ферментов.
3. Исследовать специфичность действия ферментов спермиев с использованием синтетических олигонуклеотидов различной нуклеотидной последовательности и длины.
4. Определить уровень удельной активности эндогенных щелочных и кислых ДНКаз в репродуктивных органах самцов морского ежа в течение годового репродуктивного цикла.
5. Выявить корреляцию процессов резорбции половых клеток в семенниках морского . ежа в ходе репродуктивного цикла с изменением уровня активности эндогенных
ДНКаз.
6. Выявить наличие в зрелых транскрипционно неактивных спермиях морского ежа 5. ШегтесИт программы физиологической гибели клеток (апоптоза) и показать участие в этом процессе эндогенных ДНКаз.
В результате проведенных исследований впервые показано, что в спермиях морского ежа 5. \ntermedius присутствуют три эндодезоксирибонуклеазы, принадлежащие к двум типам: две щелочные металлозависимые и кислая катион-независимая ДНКазы. С использованием современных методов очистки белков ДНКазы спермиев были выделены в индивидуальном виде. Определены их основные физико-химические и ферментативные свойства. Методом фут-принтного анализа с использованием синтетических олигонуклеотидов показана специфичность действия ферментов.
Впервые установлена корреляция процесса резорбции половых клеток в течение годового репродуктивного цикла с изменением уровня удельной активности щелочных и кислых эндогенных ДНКаз.
Впервые показано, что в спермиях морского ежа, несмотря на то, что они находятся в транскрипционно и трансляционно неактивном состоянии, существует программа реализации апоптотической гибели клеток.
Новизна выбранного подхода для осуществления поставленных задач заключается в комплексном исследовании: с одной стороны, выделение и определение свойств ДНКаз сперматозоидов морского ежа, как потенциальных участников программируемой гибели клеток, с другой стороны, получение доказательств их участия в апоптотическом процессе спермиев.
Проведенное изучение процесса апоптоза в спермиях морского ежа вносит существенный вклад в развитие дальнейших исследований его молекулярных механизмов и определение путей его регуляции, с целью решения проблемы мужской стерильности. Кроме этого, спермии морского ежа могут использоваться в качестве удобной модели для исследования способности различных веществ являться модуляторами апоптотического процесса.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шастина, Валерия Владимировна
5. ВЫВОДЫ
Показано, что в спермиях морского ежа БКоп&ЬсепКоШз ШегтесИю присутствуют три разные эндодезоксирибонуклеазы: Са, М£-ДНКаза, Са, Мп-ДНКаза и К-ДНКаза. Разработана схема их очистки, в результате получены гомогенные по активности препараты ДНКаз.
Установленно, что Са, М§-ДНКаза является ядерным белком с молекулярной массой 63 кДа и оптимумом рН 7,5, не ингибируется О-актином и И-этилмалеимидом и сохраняет максимальную активность в природной морской воде. Активность фермента в присутствии ионов двухвалентных металлов убывает в ряду (Са2+ + Мё2+) > Мп2+ = (Са2+ + Мп2+) > (М§2+ + ЭГТА) > Са2+. Фермент осуществляет гидролиз двухцепочечной ДНК по одноударному механизму.
Са, Мп-ДНКаза имеет молекулярную массу 25 кДа и оптимум рН 8,5. Активность
2+ фермента в присутствии ионов двухвалентных металлов убывает в ряду (Са + Мп2+) > (Са2+ + Мв2+) > Мп2+ > (Мв2+ + ЭГТА). Показано, что Са, Мп-ДНКаза расщепляет двухцепочечную ДНК по двухударному механизму.
Показано, что К-ДНКаза не является ядерным белком, имеет молекулярную массу 37 кДа и оптимум рН 5,5, не активируется ионами двухвалентных металлов, ингибируется И-этилмалеимидом и иодуксусной кислотой, осуществляет гидролиз двухцепочечной ДНК по одноударному механизму.
Методом фут-принтного анализа показано, что каждая ДНКаза спермиев морского ежа обладает определенной специфичностью к локальной конформации сахаро-фосфатного остова субстрата, обусловленной химической природой оснований. Установлено, что Са, М§-ДНКаза не расщепляет синтетические одноцепочечные олигонуклеотиды независимо от их длины и нуклеотидной последовательности и с максимальной эффективностью гидролизует дуплексы с длиной цепи более 500 п.н.
Выявлена корреляция процесса резорбции половых клеток в семенниках морского ежа в ходе годового репродуктивного цикла с изменением в них уровня удельной активности щелочных и кислых ДНКаз.
С использованием электронной микроскопии и биохимических методов показано, что в транскрипционно и трансляционно неактивных спермиях морского ежа существует программа реализации апоптотической гибели клеток, индукция которой происходит в результате замораживания-оттаивания спермиев, находящихся в смеси 20%-ный глицерин-морская вода.
Установлено, что в результате индукции апоптоза активируется эндогенная Са, \^-ДНКаза, которая расщепляет хромосомную ДНК спермиев по межнуклеосомным участкам с образованием апоптотической «лестницы».
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шастина, Валерия Владимировна, Владивосток
1. Баснакьян А.Г., Бубнов Н.В., Вотрин И.И. ДНКазы клеточных ядер: множественность и гетерогенность// Биохимия. 1989. Т. 54. № 2. С. 273-283.
2. Бронштейн И.Б., Шахбазян Г.К., Кафиани К.А. Термостабильная ДНКаза из яиц рыб, производящая специфические разрывы в суперспиральной ДНК // Докл. АН СССР. 1983. Т. 264. № 66. С. 1500-1503.
3. Бубнов Н.В., Баснакьян А.Г., Вотрин И.И. Мп- зависимая эндонуклеазная активность хроматина//Биохимия. 1986. Т. 51. С. 1194-1202.
4. Вараксин А.А. Развитие половой железы и дифференцировка пола у морского ежа 51гоп%у1осеп1гоШ пийю II Зоол. журн. 1980. Т. 59. С. 1895-1898.
5. Вараксина Г.С. Морфология вспомогательных клеток в репродуктивном цикле морских ежей // Биол. моря. 1980. № 5. С. 38-44.
6. Вараксина Г.С. Гистофизиология вспомогательных клеток гонады морского ежа Б^оп^осеЫгоШ пийт II Биол. моря. 1985. №. 2. С. 46-52.
7. Винтер В.Г., Аскарова А.Н., Зоткина Н.Л., Куликов В.В., Дризе О.Б., Шлянкевич М.А.1. Л 1
8. Зависимость репликации ДНК от активности нейтральной Мп зависимой ДНКазы хроматина//Биохимия. 1990. Т. 55. № 1. С. 109-113.
9. Дин Р. Процессы распада в клетке. М.: Мир. 1981. С. 28-30.
10. Заленская И.Л., Бухгольц П., Заленская Е.О., Заленский А.О. Сравнительные электрофоретические исследования гистонов спермиев морских ежей // Цитология. 1978. Т. 20. С. 778-783.
11. Касьянов В. Л. Репродуктивная стратегия морских двустворчатых моллюсков и иглокожих (под ред. Белоусова Л.В.). Л: Наука. 1989. С. 66-74.
12. Мензорова Н.И., Рассказов В.А. Выделение и некоторые свойства Са, Mg-зaвиcимoй ДНКазы из эмбрионов морского ежа ^гоп^осеЫгоШ гМегтесИю II Биохимия. 1980. Т. 45. Вып. 3. С. 544-543.2+ 2+
13. Мензорова Н.И., Рассказов В.А. Исследование субстратной специфичности Са , М§ -зависимой ДНКазы из эмбрионов морского ежа 81гоп%у1осеЫго1и5 Шегтес/ш И Биохимия. 1981. Т. 46. Вып. 5. С. 872-880.1. Л I «
14. Мензорова Н.И., Рассказов В.А. Са , М§ зависимая ДНКаза эмбрионов морского ежа Бкоп^осеМШт ¿ШегтесНия специфична к локальным конформациям В-ДНК // Биохимия. 1983. Т. 268. Вып. 6. С. 1501-1504.
15. Мензорова Н.И., Зинатулин Р.Ф., Фаворов В.В., Рассказов В.А. Выделение и исследование свойств Ca, Mg-зависимой эндонуклеазы из гепатопанкреаса краба Paralithodes camtschaticall Биохимия. 1993. Т. 58. С. 681-691.
16. Найденко Т.Х. Лабораторная культура морского ежа Strongylocentrotus intermedins II Биол. моря. 1983. № 1.С. 51-55.
17. Нечаевский Ю.В., Иванов В.А. ДНКаза II в сперматозоидах вьюнов (Misgurnns fossilis L.) II Биохимия. 1999. Т. 64. С. 587-593.
18. Никонова Л.В., Наназашвили М.Г., Кротова К.Е., Назарова Л.Ф., Рябая H.A., Прусакова О.В., Белецкий И.П. Сравнительное исследование Ca, Mg-зависимых нуклеаз тимуса млекопитающих //Известия АН, сер. Биологическая. 1998. № 2. С. 180-186.
19. Сибирцев Ю.Т., Конечный A.A., Рассказов В.А. Выделение и свойства кислой сайт-специфичной эндонуклеазы из зрелых яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedins II Биохимия. 1985. Т. 50. Вып. 7. С. 1095-1104.
20. Сибирцев Ю.Т., Рассказов В.А. Влияние ионной силы на оптимум pH, специфичность и механизм действия кислой ДНКазы из зрелых яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedins II Биохимия. 2000. Т. 65. Вып. 8. С. 1121-1129.
21. Сурвиладзе З.Г., Дудкин С.М. Стационарная кинетика расщепления ДНК панкреатической дезоксирибонуклеазой А в присутствии Са2+ // Сообщ. ГССР. 1980. Т. 100. № 2. С. 445-449.
22. Сурвиладзе З.Г., Дудкин С.М. Стационарная кинетика расщепления ДНК панкреатической дезоксирибонуклеазой А в присутствии ионов Са2+ и Mg2+ // Сообщ. ГССР. 1980. Т. 100. С. 685-689.
23. Соколова И.А., Ходарев Н.И., Александрова С.С., Вотрин И.И. Выделение и исследование свойств Ca, Mg-зависимой. эндонуклеазы из клеточных ядер лимфоцитов селезенки человека // Биохимия. 1988. Т. 53. С. 1163-1173.
24. Хотимченко Ю.С., Деридович И.И., Мотавкин П.А. Биология размножения и регуляция гаметогенеза и нереста у иглокожих. М.: Наука. 1993. 168 с.
25. Шапот B.C. Нуклеазы. М.: Медицина. 1968.212 с.
26. Щепин Ю.В., Гнездилова С.М. Сезонная характеристика аминокислот в гонадах морского ежа Strongylocentrotus nudus II Биол. моря. 1984. № 4. С. 50-54.
27. Alnemri E.S., Livingston D.J., Nicholson D.W., Salvesen G., Thornberry N.A., Wong W.W., Yuan J. Human ICE/CED-3 protease nomenclature // Cell. 1996. Vol. 87. P. 171.
28. Alvarez J.G., Storey B.T. Evidence for increased lipid peroxidative damage and loss of superoxide dismutase activity as a mode of sublethal cryodamage to human sperm during cryopreservation// J Androl. 1992. Vol. 13. P. 232-241.
29. Anai M., Sasaki M., Muta A., Miyagawa T. Purification and properties of a neutral endodeoxyribonuclease from guinea pig epidermis // Biochem. Biophys. Acta. 1981. Vol. 656. №2. P. 183-188.
30. Anai M., Muta A., Umeno M. Purification and properties of an acid deoxyribonuclease from rat small intestinal mucosa//J. Biochem. 1983. Vol. 94. № 2. P. 339-344.
31. Anzar M., He L., Buhr M., Kroetsch T., Pauls K. Sperm apoptosis in fresh and cryopreserved bull semen detected by flow cytometry and its relationship with fertility // Biol. Reprod. 2002. Vol. 66. P. 354-360.
32. Ashkenazi A., Dixit V.M. Death receptors: signaling and modulation // Science. 1998. Vol. 281. P. 1305-1308.
33. Baccetti B., Collodel G., Piomboni P. Apoptosis in human ejaculated sperm cells (Notulae seminologicae 9) // J. Submicrosc. Cytol. Pathol. 1996. Vol. 28. P. 587-596.
34. Baker K.P., Baron W.F., Henzel W.J., Spencer S.A. Molecular cloning and characterization of human and murine DNase II // Gene. 1998. Vol. 215. № 2. P. 281-289.
35. Baldridge G.D, Fallon A.M. Evidence for DNA endonuclease activity in nuclear extracts from mosquito cells // Comp. Biochem. Physiol. 1995. Vol. 110B. P. 17-32.
36. Baron W.F., Pan C.Q., Spencer S.A., Ryan A.M., Lazarus R.A., Baker K.P. Cloning and characterization of an actin-resistant DNase I-like endonuclease secreted by macrophages //Gene. 1998. Vol. 215. № 2. P. 291-301.
37. Barry M.A, Eastman A. Endonuclease activation during apoptosis: the role of cytosolic Ca2+ and pH // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. Vol. 186. № 2. P. 782-789.
38. Barry M.A., Eastman A. Identification of deoxyribonuclease II as an endonuclease involved in apoptosis // Arch. Biochem. Biophys. 1993. Vol. 300. P. 400-406.
39. Bernardi G. Dimeric structure and allosteric properties of spleen acid deoxyribonuclease // J.
40. Mol. Biol. 1965. Vol. 13. № 2. P. 603-605. Bernardi G. Mechanism of action and structure of acid deoxyribonuclease // Advances in
41. Carrara M., Bernardi G. Studies on acid deoxyribonuclease. V. The oligonucleotides obtained from deoxyribonucleic acid and their 3'-phosphate termini // Biochem. 1968. Vol. 7. № 3. P. 1121-1131.
42. De Lamirande E., Gagnon C. Impact of reactive oxygen species on spermatozoa: a balancing act between beneficial and detrimental effects // Hum Reprod. 1995. Vol. 10. P. 15-21.
43. De Maria A., Arruti C. Bovine DNase I: gene organization, mRNA expression, and changes in the topological distribution of the protein during apoptosis in lens epithelial cells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. Vol. 312. P. 634-641.
44. Dickerson R.E., Drew H.R. Structure of a B-DNA dodecamer. 2. Influence of base sequence on helix structure // J.Mol.Biol. 1981. № 149. P. 761-786.
45. Donnelly C.T., O'Connell M., McClure N. Differences in nuclear DNA fragmentation and mitochondrial integrity of semen and prepared human spermatozoa // Hum Reprod. 2000. V. 15. P. 1552-1561.
46. Douvas A., Prise P.A. Some effects of calcium and magnesium ions on the activity of bovine pancreatic deoxyridonuclease A// Biochem. Biophys. Acta. 1975. Vol. 395. P. 201-212.
47. Drew H.R. Structural specificities of five commonly used DNA nucleases // J. Biol. Chem. 1984. V. 176. №4. P. 535 -557.
48. Dulaney J.T., Touster O. Isolation of deoxyribonuclease II from rat liver lysosomes // J. Biol. Chem. 1972. V. 247. № 5. P. 1424 1432.
49. Eastman A. Deoxyribonuclease II in apoptosis and the significance of intracellular acidification // Cell Death Differ. 1994. Vol. 1. P. 7-9.
50. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD // Nature. 1998. Vol. 391. P. 43-50.
51. Furlong I.J., Ascaso R., Lopez Rivas A., Collins M.K. Intracellular acidification induces apoptosis by stimulating ICE-like protease activity // J. Cell Sci. 1997. Vol. 110. P. 653661.
52. Gaido M.L., Cidlowski J.A. Identification, purification, and characterization of a calcium-dependent endonuclease (NUC18) from apoptotic rat thymocytes. NUC18 is not histone H2B//J. Biol. Chem. 1991. Vol. 266. №28. P. 18580-18585.
53. Gandidi L., Lombardo F., Paoli D. Study of apoptotic DNA fragmentation in human spermatozoa//Hum. Reprod. 2000. Vol. 15. P. 830-839.
54. Gorman A.M, Zhivotovsky B. Challenging the dogmas // Cell Death Differ. 1999. Vol. 6. № 2. P. 207-211.
55. Gottlieb J., Muzyczka N. Substrate specificity of HeLa Endonuclease R. A G-specific mammalian endonuclease // J Biol Chem. 1990. Vol. 265. № 19. p. 10842-10850.
56. Gottlieb R.A., Giesing H.A., Engler R.L., Babior B.M. The acid deoxyribonuclease of neutrophils: a possible participant in apoptosis-associated genome destruction // Blood, 1995. Vol. 86. №6. P. 2414-8.
57. Green D.R. Apoptosis. Death deceiver // Nature. 1998. Vol. 396. P. 629-30.
58. Halenbeck R., MacDonald H., Roulston A., Chen T.T., Conroy L., Williams L.T. CP AN, a human nuclease regulated by the caspase-sensitive inhibitor DFF45 // Curr. Biol. 1998. Vol. 8. № 9. P.537-540.
59. Hammerstedt R.H. Maintenance of bioenergetic balance in sperm and prevention of lipid peroxidation: a review of the effect on design of storage preservation systems // Reprod Fertil Dev. 1993. Vol. 5. P. 675-690.
60. Harosh I., Binninger D.M., Harris P.V., Mezzina M., Boyd J.B. Mechanism of action of deoxyribonuclease II from human lymphoblasts // Eur J Biochem. 1991. Vol. 202. № 2. P. 479-484.
61. Hashida T., Tanaka Y., Matsunami N., Yoshihara K., Kamiya T., Tanigawa Y., Koide S.S. Purification and properties of bull seminal plasma Ca, Mg-dependent endonuclease. J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257. № 21. P. 13114-13119.
62. Hebert M.J., Takano T., Holthofer H., ■ Brady H.R. Sequential morphologic events during apoptosis of human neutrophils. Modulation by lipoxygenase-derived eicosanoids // J Immunol. 1996. Vol. 157. № 7. P. 3105-3115.
63. Hoffmann P.J. Mechanism of degradation of duplex DNA by DNase induced by Herpes simplex virus // J. Virology. 1981. Vol. 38. № 3. P. 1005-1014.
64. Holt W.V., North R.D. Effects of temperature and restoration of osmotic equilibrium during thawing on the induction of plasma membrane damage in cryopreserved ram spermatozoa // Biol. Reprod. 1994. Vol. 51. P. 414-424.
65. Hori K., Baba M., Arai Y., Moriya T. Deoxyribonuclease A from chick embrio. Partial purification and characterization of the enzyme // J. Biol. Chem. 1983. Vol. 258. № 2. P. 960-966.
66. Jacobson M.D., Weil M., Raff M.C. Programmed cell death in animal development // Cell. 1997. Vol. 88. P. 347-354.
67. Junowicz E., Spenser J.H. Studies of bovine pancreatic DNase A. I. General properties and activation with different divalent metals // Biochem. Biophys. Acta. 1973. Vol. 312. № 1. P. 72-84.
68. Katkov H., Katkova N., Critser J.K., Mazur P. Mouse spermatozoa in high concentrations of glycerol: chemical toxicity vs. osmotic shock at normal and reduced oxygen concentrations // Criobiology. 1998. Vol. 37. P. 325-338.
69. Keichline L.D., Wassarman P.M. Developmental study of the structure of sea urchin embryo and sperm chromatin using micrococcal nuclease // Biochim Biophys Acta. 1977. Vol. 475. № l.P. 139-151.
70. Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wideranging implication in tissue kinetics // Br. J. Cancer. 1972. Vol. 26. P. 239-257.
71. Kim H.S., Liao T.-H. Isoelectric focusing of multiple forms of DNase in thin layers of polyacrilamide gel and detection of enzymatic activity with symogram method following separation//Anal. Biochem. 1982. Vol. 119. № 1. p. 96-101.
72. Kluck R.M., Bossy-Wetzel E., Green D.R., Newmeyer D.D. The release of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2 regulation of apoptosis // Science. 1997. Vol. 275. P. 1132-1136.
73. Krieser R.J., Eastman A. The cloning and expression of human deoxyribonuclease II. A possible role in apoptosis // J Biol Chem. 1998. Vol. 273. № 47. P. 30909-30914.
74. Krieser R.J., MacLea K.S., Park J.P., Eastman A. The cloning, genomic structure, localization, and expression of human deoxyribonuclease Ilbeta // Gene. 2001. Vol. 269. P. 205-216.
75. Kroemer G., Zamzami N., Susin S. A. Mitochondrial control of apoptosis // Immunol Today. 1997. V. 18.№ l.P.44-51.
76. MacLea K.S., Krieser R.J., Eastman A. Revised structure of the active form of human deoxyribonuclease Ilalpha // Biochem Biophys Res Commun. 2002. Vol. 292. № 2. P. 415-421.
77. MacLea K.S., Krieser R.J., Eastman A. Structural requirements of human DNase II alpha for formation of the active enzyme: the role of the signal peptide, N-glycosylation, and disulphide bridging // Biochem J. 2003. Vol. 371. P. 867-876.
78. Mannherz H.G., Kreuder V., Koch J., Dieckhoff J., Drenekhahni D. The inhibition of bovine and rat parotid deoxytribonuclease I by skeletal muscle aclin // Biochem. J. 1982. Vol. 207. № 2. P. 305-313.
79. McKenna W.G., Maio J.J., Brown F.L. Purification and properties of a mammalian endonuclease showing site-specific cleavage of DNA // J. Biol. Chem. 1981. Vol. 256 № 12. P. 64356443.
80. McKenna W.G., Brown F.L., Musich P.R., Maio J.J. cleavage of mammalian repetitive deoxyribonucleic acids by a mammalian site-specific endodeoxyribonuclease // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 154. № 2. P. 379-384.
81. Mishra N.C. Nucleases: molecular biology and applications // NJ: Wiley-interscience. 2002. P. 22-195.
82. Montague J.W., Gaido M.L., Frye C., Cidlowski J.A. A calcium-dependent nuclease from apoptotic rat thymocytes is homologous with cyclophilin. Recombinant cyclophilins A, B, and C have nuclease activity // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. P. 18877-18880.
83. Moore S. Pancreatic DNase // The Enzymes. 1981. Vol. 14. P. 281-296. New York: Academic press (ed. Ph.D. Boyer).
84. Nagae S., Nakayama J., Nakano I., Anai M. Purification and properties of a neutral endodeoxyribonuclease from rat small intestinal mucosa // Biochemistry. 1982. Vol. 21. № 6. P. 1339-1344.
85. Nakamura M., Sakani Y., Watanabe N., Takagy Y. Purification and characterization of the Ca2+ plus Mg2+-dependent endodeoxyribonuclease from calf thymus chromatin // J. Biochem. 1981. Vol. 89. №1. P. 143-152.
86. Nicholson D.W. ICE/CED3-like proteases as therapeutic targets for the control of inappropriate apoptosis //Nat Biotechnol. 1996. Vol. 14. № 3. P. 297-301.
87. Nishikawa A., Shiokawa D., Umemori K., Hayashi H., Tanuma S. Occurrence of DNase y- like apoptotic endonucleases in hematopoietic cells in Xenopus laevis and their relation to metamorphosis//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. Vol. 231. P. 305-308.
88. Nissen-Meyer J., Nes I.F. Purification and properties of DNA endonuclease associated with Friend leukemia virus //Nucl. Acid Res. 1980. Vol. 8. P. 5043-5055.
89. Omori A., Ishizuka-Kobayashi M., Uchida T. Isolation and some properties of a deoxyribonuclease from Turbo cornutus II J. Biochem. 1978. Vol. 83. № 2. P. 607-615.
90. Oshima R.G., Price P.A. Alkylation of an essential histidine residue in porcine spleen deoxyribonuclease // J Biol Chem. 1973. Vol. 248. № 21. P. 7522-7526.
91. Osipova TN, Karpova EV, Vorob'ev VI. Chromatin higher-order structure: two-start double superhelix formed by zig-zag shaped nucleosome chain with folded linker DNA // J Biomol Struct Dyn. 1990. Vol. 8. № 1. P. 11-22.
92. Pandey S. P., Walker P.R., Sikorska M. Separate pools of endonuclease activity are responsible for internucleosomal high molecular mass DNA fragmentation during apoptosis // Biochem. Cell Biol. 1994. Vol. 72. P. 615-623.
93. Pandey S., Wolker P.R., Sikorska M. Identification of a novel 97 kDa endonuclease capable of internucleosomal DNA cleavage // Biochemistry. 1997. Vol. 36. P. 711-720.
94. Peitsch M.C., Irmler M., French L.E., Tschopp J. Genomic organisation and expression of mouse deoxyribonuclease I // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. Vol. 207. № 1. P. 62-68.
95. Pergolizzi R., Appierto V., Bosetti A., DeBellis G.L., Rovida E., Biunno I. Cloning of a gene encoding a DNase I-like endonuclease in the human Xq28 region // Gene. 1996. Vol. 168. № 26. P. 267-270.
96. Polzar В., Mannherz H.G. Nucleotide sequence of a full length cDNA clone encoding the deoxyribonuclease I from the rat parotid gland // Nucleic Acids Res. 1990. Vol. 18. P. 7151-7158.
97. Print C.G., Loveland K.L. Germ cell suicide: new insights into apoptosis during spermatogenesis // Bioassays. 2000. Vol. 22. P. 423-430.
98. Quinn P.J. Deoxyribonuclease activity in semen // J Reprod Fertil. 1968. Vol. 17. P. 35-39.
99. Ramos L., Wetzels A. Low rates of DNA fragmentation in selected motile human spermatozoa t assessed by the TUNEL assay // Hum. Reprod. 2001. V. 16. P. 1703-1707.
100. Ribeiro J.M., Carson D.A. Ca, Mg-dependent endonuclease from human spleen: purification, properties and role in apoptosis // Biochemistry. 1993. Vol. 32. № 35. P. 9129-9136.
101. Rodriguez A.M., Rodin D., Nomura H., Morton C.C., Weremowicz S., Schneider M.C. Identification, localization, and expression of two novel human genes similar to deoxyribonuclease I // Genomics. 1997. Vol. 42. № 3. P. 507-513.
102. Rosamond J. Purification and properties of an endonuclease from the mitochondrion of Saccharomyces cerevisiae II Eur. J. Biochem. 1981. Vol. 120. № 3. P. 541-546.
103. Rosenthal A.L., Lacks S.A. Nuclease detection in SDS-polyacrylamide gel electrophoresis // Anal Biochem. 1977. Vol. 80. № 1. P. 76-90.
104. Russel A.P., Patt D.I., Terner C. Invertebrate acid deoxyribonucleases // J. Cellular Comparat. Physiol. 1974. Vol. 63. № 1. P. 71-75.
105. Sakkas D., Meriethoz E., Manicardi G., Bizzaro D., Biachi P.G., Biachi U. Origin of DNA damage in ejaculated human spermatozoa // Rev Report. 1999. Vol. 4. P. 31-37.
106. Shak S., Capon D., Hellmiss R., Marsters SA., Baker C.L. Recombinant human Dnase I reduces the viscosity of cystic fibrosis sputum // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P. 9188-9192.
107. Sharma K., Srikant C.B. G protein coupled receptor signaled apoptosis is associated with activation of a cation insensitive acidic endonuclease and intracellular acidification // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. Vol. 242. № 1. P. 134-140.
108. Shiokawa D., Ohyama H., Yamada Т., Tanuma S. Purification and properties of DNase у from apoptotic rat thymocytes // Biochem. J. 1997a. Vol. 326. P. 675-681.
109. Shiokawa D., Iwamatsu A., Tanuma S. Purification and characterization, and amino sequencing of DNase у from rat spleen // Arch. Biochem. Biophys. 19976. Vol. 346. P. 15-20.
110. Shiokawa D., Tanuma S. Molecular cloning and expression of a cDNA encoding an apoptotic endonuclease DNase y // Biochem. J. 1998. Vol. 332. P. 713-720.
111. Shiokawa D., Tanuma S. DLAD, a novel mammalian cation-independent endonuclease with homology to Dnase II // Nucl. Acids Research. 1999. Vol. 27. № 20. P. 4083-4089.
112. Shiokawa D., Tanuma S. Isolation and characterization of the DLAD/Dlad genes, which lie head-to-head with the genes for urate oxidase // Biochem Biophys Res Commun. 2001. Vol. 288. №5. P. 1119-1128.
113. Sinha-Hikim A.P., Swerdloff R.S. Hormonal and genetic control of germ cell apoptosis in the testis // Rev Reprod. 1999. Vol. 4. P. 38-47.
114. Slor H. Purification of C-laballed deoxyribonuclease II from HeLa S3 lysosomes and its use as a marker for the study of nuclear deoxyribonucleasen II // Biochem J. 1973. Vol. 136. № 1. P. 83-87.
115. Spadafora C. Sperm cells and foreign DNA: a controversial relation // BioEssays. 1998. Vol. 20. P. 955-964.
116. Sun X.M., Cohen G.M. Mg(2+)-dependent cleavage of DNA into kilobase pair fragments is responsible for the initial degradation of DNA in apoptosis // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269. №21. P. 14857-14860.
117. Takeshita H., Yasuda T., Nadano D., Tenjo E., Sawazaki K., Iida R., Kishi K. Detection of deoxyribonucleases I and II (DNases I and II) activities in reproductive organs of male rabbits // Int. J. Biochem. 1994. Vol. 26. № 8. P. 1025-1031.
118. Takeshita H., Yasuda T., Iida R., Nakajima T., Hosomi O., Nakashima Y., Mori S., Nomoto H., Kishi K. Identification of the three non-identical subunits constituting human deoxyribonuclease II // FEBS Lett. 1998. Vol. 440. P. 239-242.
119. Tanuma S, Shiokawa D. Cloning of a cDNA encoding a rat DNase II-like acid Dnase // Biochem Biophys Res Commun. 1999. Vol. 265. № 2. P. 395-399.
120. Thompson C.B. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disease // Science. 1995. Vol. 267. P. 1456-62.
121. Urbano A., McCaffrey R., Foss F. Isolation and characterization of NUC70, a cytoplasmic, hematopoietic apoptotic endonuclease // J. Biol. Chem. 1998. Vol. 273. № 52. P. 3482034826.
122. Vaux D.L., Korsmeyer S.J. Cell death in development // Cell. 1999. Vol. 96. № 2. P. 245-254 Voronina E., Wessel G. Apoptosis in sea urchin oocytes, eggs and early embryos // Mol. Reprod.
123. Devel. 2001. Vol. 60. P. 553-561. Waldschmidt M., Karg H., Kinzler M. Vorkommen von desoxyribonuklease in mannlichen
124. Yamamoto M. Purification and some properties of an acid deoxyribonuclease from testes of chinook salmon Oncorhynchus tshawytscha II Biochim. Biophys. Acta. 1971. Vol. 228. № l.P. 95-104.
125. Yamanaka M., Tsubota Y., Anai M., Ishimatsu K., Okumura M., Katsuk S., Takagi Y. Purification and properties of acid deoxyribonucleases from human gastric mucosa and cervix uteri // J. Biol. Chem. 1974. Vol. 249. № 12. P. 3884-3889.
126. Yanagawa H., Ogawa Y., Miyakawa A., Egami F. DNase A1, poly(dA) and poly(dT)-spesific deoxyribonuclease from Achatina fulica. Purification and characterization // J. Biochem. 1981a. Vol. 90. № 5. P. 1463-1478.
127. Yanagawa H., Ogawa Y., Miyakawa A., Egami F. DNase A1, poly(dA) and poly(dT)-specific deoxyribonuclease from Achatina fulica. Further investigation on the specificity // J. Biochem. 19815. Vol. 90. № 5. P. 1479-1485.
128. Yasuda T., Sawazaki K., Nadano D., Takeshita H., Nakanaga M., Kishi K. Human deoxyribonuclease I (DNase I): purification, enzymological and immunological characterization and origin // Clin. Chin. Acta. 1993. Vol. 218. P. 5-16.
129. Yasuda T., Kishi K., Yanagawa Y., Yoshida A. Structure of the human deoxyribonuclease I (DNase I) gene: identification of the nucleotide substitution that generates its classical genetic polymorphism // Ann. Hum. Genet. 1995. Vol. 59. P. 1-15.
130. Yasuda T., Takeshita H., Iida R., Nakajima T., Hosomi O., Nakashima Y., Kishi K. Molecular cloning of the cDNA encoding human deoxyribonuclease II // J Biol Chem. 1998. Vol. 273. №5. P. 2610-2616.
131. Yin Y., Stahl B.C., DeWolf W.C., Morgentaler A. p-53-Mediated germ cell quality control in spermatogenesis // Dev Biol. 1998. Vol. 204. P. 165-171.
-
Шастина, Валерия Владимировна
-
кандидата биологических наук
-
Владивосток, 2004
-
ВАК 03.00.04
- Получение моноклональных антител к Mn2+-зависимой ДНКазе хроматина печени крыс
- Морфофункциональная оценка гамет и их потенций при воздействии светом на морского ежа Strongylocentrotus Intermedius
- Биохимические основы биотических взаимоотношений серого морского ежа Strongylocentrotus intermedius и бурой водоросли Laminaria japonica
- Адаптивная роль ДНКазы II в сперматозоидах вьюнов (Misgurnus fossilis L.)
- Дезоксипмбонуклеазы хроматина
