Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Значение определения числа копий генов локуса 5q13 в диагностике проксимальных спинальных мышечных атрофий I-IV типа

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Значение определения числа копий генов локуса 5q13 в диагностике проксимальных спинальных мышечных атрофий I-IV типа"

На правах рукописи

Забненкова Виктория Владимировна

ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСЛА КОПИЙ ГЕНОВ ЛОКУСА 5я13 В ДИАГ НОС ТИКЕ ПРОКСИМАЛЬНЫХ СПИНАЛЬНЫХ МЫШЕЧНЫХ АТРОФИЙ 1-1У ТИПА

03.02.07 "Генетика"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации иа соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 У АР 1Ш

МОСКВА-2012

005015711

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук

Научный руководитель -

Научный консультант -

Официальные оппоненты -

Ведущая организация -

доктор биологических наук, профессор Поляков Александр Владимирович

доктор медицинских наук, профессор Дадали Елена Леонидовна

Илларношкин Сергей Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр неврологии» Российской академии медицинских наук, заместитель директора по научной работе

Куцев Сергей Иванович

доктор медицинских наук, доцент Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени НИ. Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, заведующий кафедрой морфологии

Государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования «Российская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится « 19 » марта 2012г. в часов на заседании

Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук (115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Медико-генетический научный центр» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1.

Автореферат разослан «У4Л> 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д 001.016.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор / Зинченко Рена Абульфазовна

Актуальность темы

Проксимальная сиинальная мышечная атрофия (СМА) - одно из наиболее тяжелых нейромышечных заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования. Клинические проявления заболевания характеризуются прогрессирующими симптомами вялого паралича вследствие дегенерации а-мотонейронов передних рогов спинного мозга. Выделяют четыре клинических типа заболевания на основе различий в возрасте начала, тяжести течения и продолжительности жизни. Эти типы СМА являются аллельными генетическими вариантами, развитие которых обусловлено мутациями в гене SMN. Ген картирован на хромосоме 5 в локусе 5ql2.2-ql3.3 и имеет цеитромерную (SMNc) и теломерную копии (SMNt). К возникновению проксимальных СМА приводят мутации в теломерной копии гена SMNt, который состоит из девяти экзонов (1, 2а, 2Ь, 3-8) и кодирует белок выживаемости мотонейронов (survival motor neuron). Основным типом мутаций в этом гене являются делеции экзонов 7 и/или 8, которые выявлены у 95% больных. Остальные 5% больных являются компаунд-гетерозиготами по делеции в одной копии гена SMNt и точковой мутации в другой.

Обнаружение делеции экзонов 7 и/или 8 в гомозиготном состоянии позволяет подтвердить диагноз СМА у больного. Показано, что оба гена SMN расположены в области инвертированного повтора, в котором локализовано, по крайней мере, ещё три гена - NAIP, SERF1A (H4F5), GTF2H2, также представленные теломерной и центромерной копиями. Исследования, проведенные рядом авторов, показали, что различия в возрасте манифестации и тяжести течения аллельных вариантов проксимальных СМА [-IV типов могут быть обусловлены модифицирующим влиянием как числа копий гена SMNc, так и других генов этого региона - NAIP, SERFIA (H4F5), GTF2H2. Установлено, что у больных со СМА II-III типов число копий гена SMNc больше, чем у лиц с I типом заболевания. Показано, что приблизительно у 80% людей в популяции в целом наблюдается 1-2 копии гена SMNc, а у 5-10% здоровых людей обнаруживается отсутствие гена SMNc. У пациентов со СМА разнообразие числа копий гена SMNc гораздо больше и может варьировать от 1 до 6 копий. Таким образом, изучение количества центромерных и теломерных копий генов SMN может быть полезным для прогнозирования тяжести течения заболевания. Кроме

того, при проведении медико-генетического консультирования возникает проблема повторного расчета риска рождения больного ребенка в отягощенной семье или в новом браке родителей пробанда с проксимальной СМА. Это требует уточнения генетического статуса консультирующихся, направленного на выявление носительства ими мутации в гене 5А/А'" в гетерозиготном состоянии. Учитывая значительную частоту заболевания, проведение анализа носительства мутаций в этом гене показано для вновь созданных супружеских пар. Принимая во внимание, что показатели частоты заболевания в различных популяциях варьируют от 1:6000 до 1:10 ООО новорожденных, можно рассчитать, что гетерозиготным носителем мутации в гене 5М\Г является каждый 40-50 человек.

Однако традиционная молекулярная диагностика проксимальной спинальной мышечной атрофии представляет собой качественную детекцию делеции экзонов 7 и/или 8 гена 8МШ, которая не дает возможность выявлять всех носителей мажорной мутации в гене БАМ! в гетерозиготном состоянии. Это связано с тем, что при использовании полуколичественного метода определяется не число копий генов на геном, а соотношение числа центромерных и теломерных копий гена 5АСу. Отклонение данного соотношения от единицы может быть обусловлено как снижением числа копий гена ЯМУ/, так и увеличением числа копий гена БМА'с. Ограничения, возникающие при использовании качественных методов детекции гетерозиготного носительства мутаций в гене 5Л/Л'/, могут создать значительные трудности при проведении медико-генетического консультирования отягощенных семей. Отсутствие уверенности в существовании гетерозиготного носительства не позволяет:

- подтвердить диагноз СМА у умершего ребенка, биологический материал которого не доступен, рассчитать риск рождения больного ребенка в семье и провести дородовую диагностику;

- точно определить статус носительства мутации в гене у партнера облигатного носителя при вступлении им в новый брак;

- сформировать группу больных со СМА, имеющих делецию в гетерозиготном состоянии для поиска точковых мутаций в другой копии гена.

Эти проблемы могут быть решены при разработке методов количественного анализа числа копий генов БММ и БМК'с, использование которых позволит

прогнозировать тяжесть течения СМА, оптимизировать процесс определения гетерозиготного носительства, а также проводить тестирование донорских половых клеток при проведении ЭКО. Значительная распространенность СМА обуславливает необходимость проведения скрининга доноров спермы и яйцеклеток, и в случае выявления носительства, исключать его из данной программы.

Цель исследования

В соответствии со всем выше изложенным поставлена следующая цель работы: решение проблемы анализа гетерозиготного носительства гена проксимальной спинальной мышечной атрофии путем совершенствования молекулярно-генетических методов диагностики СМА и оценка частоты носительства гена у чувашей, удмуртов и жителей московского региона.

Задачи исследования

1. Разработка системы количественного анализа генов локуса 5ql3 на основе специфической лигазной реакции.

2. Оценка влияния числа копий генов SMNc, NAIP, GTF2H2, RAD 17 на тяжесть клинических проявлений и течение заболевания в выборке российских больных.

3. Выявление взаимосвязи между числом копий генов SMNc, NAIP, GTF2H2, RAD 17 и тяжестью течения двух клинических вариантов СМА I типа и двух клинических вариантов СМА III типа.

4. Определение частоты носителей делеций в гене SMNt в гетерозиготном состоянии и дупликаций гена SMNc у чувашей, удмуртов и жителей московского региона.

Научная новизна

Впервые в России разработана новая количественная методика анализа генов локуса 5ql3, ответственных за развитие проксимальной СМА I-IV типов, на основе мультиплексной проба-зависимой лигазной реакции с последующей амплификацией, позволяющая определять абсолютное число копий генов SMNc, NAIP, GTF2H2 и RADI 7.

Впервые проведена оценка частоты гетерозиготного носительства делеций в гене SMNl и установлена частота дупликаций гена SMNc у чувашей, удмуртов и

жителей московского региона с помощью количественного анализа генов локуса 5ql3.

Впервые проведен анализ влияния числа копий генов SMNc, NAIP, GTF2H2, RADI 7 на тяжесть клинических проявлений проксимальной СМА у российских больных.

Выявлена взаимосвязь между числом копий генов SMNc, NAIP, GTF2H2, RAD 17 и тяжестью течения двух клинических вариантов СМА I типа в выборке российских больных.

Практически и значимость

Разработанный количественный метод оценки числа копий генов локуса 5ql3, ответственных за развитие проксимальной спинальной мышечной атрофии I-IV типов, повышает точность диагностики гетерозиготного носительства гена проксимальной СМА. Использование этого метода сделает более эффективным медико-генетическое консультирование семей, в которых недоступен материал больного ребенка или вновь созданных супружеских пар, в которых один из супругов является облигатным гетерозиготным носителем гена проксимальной СМА.

Новая методика может быть использована, для скрининга гетерозиготного носительства гена проксимальной СМА у доноров, участвующих в программе ЭКО, а также для оценки популяционной частоты носительства гена проксимальной СМА.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана эффективная методика количественного анализа генов локуса 5ql3 (SMNt, SMNc, NAIP, GTF2H2, RAD 17) на основе мультиплексной проба-зависимой лигазной реакции с последующей амплификацией.

2. Показано влияние числа копий гена SMNc на тяжесть течения проксимальной СМА. У большинства пациентов со СМА I типа обнаружено две копии гена SMNc, в то время как у больных СМА II-III типа чаще встречается 3-4 копии этого гена. Выявлено наличие взаимосвязи между числом копий гена SMNc и тяжестью течения заболевания внутри одной клинической формы СМА I типа.

4

3. Обнаружено влияние делении гена NAIP на тяжесть течения СМА. Показано, что ген NAIP делетирован у 36,4% больных СМА I типа. Число копий генов GTF2H2 и RAD 17 не оказывает влияния на тяжесть клинических проявлений и течение заболевания.

4. Частота носительства делений в гене SMNt в гетерозиготном состоянии составляет 1 на 37 человек у чувашей и 1 на 36 человек у удмуртов и жителей московского региона. Частота дупликаций гена SMNc у чувашей, удмуртов и жителей московского региона составляет 1,5%, 4% и 2,5%, соответственно.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены: на VI съезде Российского общества медицинских генетиков 2010, на конференциях European Human Genetics Conference 2010,2011.

Личный вклад автора в проведение исследования

Автором проанализирована отечественная и зарубежная литература по теме диссертации, сформирована группа обследования. Автор лично выполнил всю экспериментальную работу. Автор провел статистический анализ полученных данных, сформулировал выводы и опубликовал результаты работы в научных журналах.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 6 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата медицинских наук.

Внедрение результатов работы

Результаты диссертационной работы по определению числа копий генов локуса 5ql3 в диагностике проксимальных спинальных мышечных атрофий I-IV типа внедрены в практику медико-генетического консультирования при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Медико-генетический научный центр" Российской академии медицинских наук (ФГБУ "МГНЦ" РАМН).

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованной литературы. Библиография содержит 100 источников, из них 8 отечественных и 92 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 27 таблицами и 13 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Материалом для исследования служили образцы ДНК выделенной из крови пробандов.

Для анализа частоты носительства гена проксимальной СМАI-IV отобраны образцы здоровых ДНК людей, принимавших участие в эпидемиологическом исследовании лаборатории генетической эпидемиологии ФГБУ "МГНЦ" РАМН, а так же образцы ДНК из банка лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ "МГНЦ" РАМН и ФГБУ" НИИ медицинской генетики " СО РАМН (г. Томск).

Исследованы образцы ДНК 260 здоровых чувашей из неродственных семей, образцы ДНК 253 здоровых удмуртов из неродственных семей. При формировании выборки учитывалась этническая принадлежность, т.е. все лица, принимавшие участие в исследовании, являются коренными чувашами и удмуртами, соответственно.

Исследованы образцы ДНК 285 здоровых жителей Москвы и Московской области из неродственных семей.

Для оценки влияния числа копий генов локуса 5ql3 на тяжесть течения проксимальной СМА I-IV отобраны образцы ДНК пациентов научно-консультативного отдела ФГБУ "МГНЦ" РАМН и медико-генетической консультации г. Воронежа.

Исследованы образцы ДНК 201 пациента из неродственных семей с диагнозом СМА I-III типов. Больные СМА I типа составили п=77 человек. Больные СМА II типа составили п=58 человек. Больные СМА III типа составили п=65 человек. СМА IV типа представлена одним больным. Пациенты отобраны

на основе критериев Европейского консорциума по изучению нервно-мышечных заболеваний. Кроме этого, диагноз у всех пациентов подтвержден молекулярно-генетическим методом с помощью ПЦР-ПДРФ-анализа. Все пациенты СМА имеют делению экзонов 7-8 гена SMNt в гомозиготном состоянии.

Контрольная выборка взята из банка ДНК лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ "МГНЦ" РАМН. Ее составил 141 необследованный неродственный человек.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови выполнено с помощью набора реактивов для выделения Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, USA) по протоколу производителя.

Амплификация всех исследуемых фрагментов ДНК проведена методом ПЦР на программируемом термоциклере МС2 фирмы «ДНК-технология» (Россия)

Определение числа копий генов SMNt, SMNc, NAIP, GTF2H2, RADII осуществлено методом мультиплексной проба-зависимой лигазной реакции с последующей амплификацией (MLPА). Математическую обработку результатов количественной ПЦР проводили с помощью программы CoffalyserVS, представленной в свободном доступе на сайте MRC-Holland (www.rnlpa.com).

Статистическая обработка проведена с использованием программы Statistica 7.0. При анализе предполагаемых различий между выборками исходили из нуль-гипотезы об отсутствии различий, которую проверяли с помощью критерия yj2 и его сравнения с табличными данными. Уровень значимости р<0,05 принят достаточным для признания различий достоверными.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Анализ числа копий генов SMN на плазмидных моделях

Для определения числа копий генов SMN создана система, в основе которой лежит мультиплексная проба-зависимая лигазная реакция с последующей амплификацией (Multiplex ligation-dependent probe amplification, MLP А), впервые предложенная в 2002 году компанией MRC-Holland. Подробности метода и последовательности праймеров представлены в разделе «Материалы и методы».

Разработка осуществлена в два этапа.

Задачей первого этапа стало тестирование новой методики на соблюдение количественности при анализе числа копий генов SMN.

Для выполнения первой задачи сконструированы плазмидные модели нескольких вариантов генотипов СМА (ген SMNt : ген SMNc) - «0:2», «2:0», «2:2», «1:2», «2:1», «2:3».

Система включала в себя последовательности экзонов 7, 8 гена SMNt и гена SMNc, в качестве внутренних контролей выбраны последовательности генов ТВР и В2М, которые присутствуют в геноме человека всегда в количестве двух копий, другие варианты детальны.

Все необходимые фрагменты ДНК клонированы в лаборатории ЗАО «Евроген» с использованием стандартного бактериального вектора pGEM®-T Easy (Promega, USA).

В ходе работы проанализированы смоделированные варианты генотипов СМА (ген SMNt : ген SMNc) - «0:2», «2:0», «2:2», «1:2», «2:1», «2:3», по 15 образцов каждого генотипа.

Метод MLPA продемонстрировал хорошую воспроизводимость и соблюдение количественности при анализе числа копий генов в изучаемой модельной системе, что послужило стимулом к переходу к следующему этапу разработки количественной методики на уровне геномной ДНК.

Анализ числа копий генов SMN и других генов локуса 5ql3 в геномной

ДНК

На втором этапе в систему введены дополнительные пробы.

Поскольку при расчетах число копий анализируемых генов определяется относительно внутренних контролей для повышения точности метода количество контрольных генов увеличено с двух до четырех: добавлены последовательности генов SIRT3 и USP3, также представленных в геноме двумя копиями.

Расширен спектр анализируемых генов локуса СМА для выявления возможного их модифицирующего влияния на тяжесть течения заболевания. Введены последовательности, соответствующие экзону 5 гена NAIP (два

фрагмента), экзону 4 гена вТР2Н2, фрагмент гена МИП в качестве индикатора целостности региона.

Анализ генов БММ и БМИс дополнен общими последовательностями экзонов 1 и 6.

Оценка числа копий генов локуса 5qlЗ проводилась в образцах геномной ДНК.

Так как изначально не известно, сколькими копиями представлен ген SMNt у того или иного индивидуума, в качестве нормальных контролен отобраны образцы ДНК здоровых сибсов из семей СМА, не являющихся носителями делеций гена 5ММ, т.е. унаследовавших от родителей разные с пробандом хромосомы 5, что подтверждено косвенной диагностикой с использованием полиморфных ДНК-маркеров, тесно сцепленных с геном БМКЧ. Контролями по делеции служили пробанды из семей СМА с подтвержденной методом ПЦР-ПДРФ-анализа делецией экзонов 7-8 гена БММ. В качестве образцов носителей гена СМА использована ДНК родителей больных СМА.

На рисунках 1 и 2 представлены результат фрагментарного электрофореза для расширенной системы МЬРА-БМА и результаты обработки числовых параметров фрагментарного анализа продукта реакции МЬРА с помощью программы У8.

Разработанный метод детекции числа копий генов локуса 5я13 применен для решения поставленных в данном исследовании задач.

Рисунок 1. Фрагментарный анализ продукта реакции MLPA на приборе ABI Prism 3130 ("Applied Biosystems").

LL_A

Ii

ÜlL

.uiii SAL\c_»r8 SMNMI |i 1 —A J\J SMNc exi /¡rBp ^Г] Ii J II дл S.u\c,«7 If JlX RAD17 . GTF4 B2M ii J

mi a

.Iii II -л .11J A hhU Jl Л ili ........

mi ш

J 1 I j i , J J, ЛМП»Я rrH'Ji •'t Л Л SMMnNAlP i i 1

W"

Iii J -Л lu 1 iJ III li il i'—

*

aA Л

Примечание: На электрофореграмме представлен паттерн

сигналов, соответствующий последовательностям генов ТВР, В2М, SMNt (экзоны 7, 8), SMNc (экзоны 7, 8), SMN(t+c) (экзоны 1, 6), NAIP (экзон 5, два фрагмента), GTF2H2 (экзон 4), RAD 17, для различных вариантов

генотипов.

Рисунок 2. Результаты обработки числовых параметров фрагментарного анализа продукта реакции МЬРА с помощью программы Со£Га1узег У8.

В2М GTF RADI 7

SMNc ex 7 SMNt ex 7

S1RT3 SMNex 6 NAIP ex 5(1)

SMNt ex 8

SMN ex I

Примечание: Каждый столбец соответствует анализируемым последовательностям в системе.

Высота столбца характеризует число копий соответствующего фрагмента ДНК. Делеции

соответствует диапазон значений по оси Y от 0 до 0.3, одной копии - от 0.3 до 0.7, двум копиям - от

0.7 до 1.3, трем копиям - от 1.3 до 1.7, четырем копиям - 1.7-2.3.

Диаграммы №1, 2 - норма.

Диаграмма № 3- делецш SMNt, 4 копии SMNc.

Диаграмма № 4 - делеция SMNt, 2 копии SMNc, делеция NAIP.

Диаграмма № 5 - делеция SMNt, 3 копии SMNc.

Диаграмма № б- делег/ия SMNt, 2 копии SMNc.

Анализ числа копий гена ЗМЛ'с в группе больных СМА1-1У типов

Методом мультиплексной проба-зависимой лигазной реакции с последующей амплификацией проанализирована выборка российских больных спинальной мышечной атрофией 1-1У типов с целью выявить взаимосвязь между числом копий гена ЯМЛ'с и тяжсстыо течения заболевания.

В выборку вошел 201 пациент из неродственных семей с диагнозом СМА I-IV типов. Больные со СМА I типа составили п=77 человек, со СМА II - п=58 человек, со СМА III - п=65 человек. СМА IV типа представлена одним больным. Диагноз у всех пациентов подтвержден молекулярно-генетическим методом с помощью ПЦР-ПДРФ-анализа. Все больные СМА имеют делецию экзонов 7-8 гена в гомозиготном состоянии.

Результаты исследования представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Число копий гена ШУс у больных СМА в анализируемой выборке.

Число копий гена SMNc

Тип СМА,

количество 1 2 3 4 5

пациентов (п)

CMAI 3,9% 77,9% 14,3% 3,9%

п=77 п=3 п=60 п=Н п=3

СМА И 39,6% 46,4% 14%

п=58 п=23 п=27 п=8

СМА III 21,4% 24,5% 50,5% 3,6%

п=65 п=14 п=16 п=33 п=2

Число копий гена SMNc статистически значимо различается: в группах больных СМА I-II типа / ==26.35, uO.OOl; в группах больных СМА I-III типа j2 =5 8.93, а<0.001; в группах больных СМА II-III типа /=21.92, aO.OOl. Показано, что у больных со СМА I типа преобладают две копии гена SMNc -77,9%, у больных СМА II типа чаще встречается три копии - 46,4%, у больных СМА III типа - четыре копии гена SMNc - 50,5%.

Данные для спинальной мышечной атрофии IV типа в таблице не представлены в связи с малочисленностью выборки: п=1. В результате количественного анализа у больного зарегистрировано пять копий гена SMNc.

Для сравнения, у 88% здоровых людей в контрольной выборке, представленной 141 необследованным неродственным человеком из банка лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ "МГНЦ" РАМН, выявлено 1-2 копии гена БМИс, а у 9% он отсутствует.

Для сравнения обратимся к литературным данным. (Таб. 2)

Таблица 2. Число копий гена БМКс у больных СМА (обобщенные литературные данные).

Число копий гена SMNc

Тип СМА 1 2 3 4 5

СМА I 5,5% 67,8% 26,7%

СМА II 0,5% 7,7% 83,6% 8,2%

СМА III 2,6% 46,7% 49,2% 1,5%

При сравнении полученных данных результаты для больных СМА I типа соответствуют литературным (Feldkotter М. et all., 2002; Scarciolla О. et all., 2006; Zapletalova E. et all., 2007; Jedrzejowska M. ct all., 2009). Однако можно заметить расхождение в случае с результатом анализа для больных СМА II и III типа. Возможно, данное различие обусловлено критериями формирования выборки. Существуют различные критерии отнесения больных ко II и III типам СМА. Так, одни авторы в качестве основного критерия отнесения больных к СМА III рассматривают возможность больных к самостоятельной ходьбе, в то время как другие учитывают лишь различный возраст появления первых симптомов. В данной работе в качестве разграничения этих двух групп использован критерий возможности самостоятельной ходьбы. Если больные какое-то время имели возможность ходить самостоятельно, то они были включены в III группу СМА.

Таким образом, можно предположить, что в нашей работе часть больных, которые могли бы быть отнесены к СМА И авторами других исследований по данной тематике, включена в группу больных со СМА III.

Однако эти противоречия не исключают основного вывода, который можно сделать в результате проведенных исследований о влиянии числа копий гена SMNc на тяжесть течения заболевания.

При анализе числа копий экзонов 1,6,7 и 8 генов SMN установлено, что ген SMNt полностью делетирован у 93,5% (п=72), 96,6% (п=56) и 90,8% (п=59)

больных СМА I, II и III типа, соответственно. У 6,5% (п=8), 3,5% (п=2) и 9,2% (п-6) больных СМА I, II и III типа выявлена делеция только экзонов 7-8 гена SMNt. Так как последовательности экзонов 1,6 являются общими для обоих генов SMN, при расчете учитывался вклад числа копий гена SMNc.

Анализ числа копий генов NAIP, GTF2H2, RAD 17 в группе больных СМА I-IV типов

Поскольку полагают, что клинический полиморфизм проксимальной спинальной мышечной атрофии I-IV типов может обуславливаться не только числом копий гена SMNc, но также свой вклад могут вносить и другие гены, лежащие в локусе 5ql3, проведен анализ числа копий генов NAIP, GTF2H2, RAD 17 в выборке больных СМА.

Установлено, что ген NAIP делетирован у 36,4% (п=28) больных СМА I типа, 6,9% (п=4) и 4,6% (п=3) больных СМА II и III типа, соответственно. Результаты анализа числа копий генов GTF2H2 и RAD 17 представлены в Таблице

3.

Таблица 3. Число копий генов СТР2П2 и ЯА017 в анализируемой выборке российских больных СМА.

Тип СМА 0 копий гена GTF2H2 1 копия гена GTF2H2 2 копии гена GTF2H2 2 копии гена RAD 17

СМА I, п=77 п=0 п=7 п=70 п=77

СМА II, п=58 п=1 п=2 п=55 п=58

СМА Ш, п=65 п=0 п=1 п=64 п=65

Таким образом, зарегистрирована одна копия гена GTF2H2 у 9% больных СМА I, оставшиеся 91% имеют две копии гена. Среди больных СМА II одна копия гена зарегистрирована у 3,4% обследованных, две копии - у 94,8%, ген делетирован у одного больного СМА II (1,7 %). Среди больных СМА III одна копия гена выявлена у одного больного (1,5%), у оставшихся 64 обследованных зарегистрировано две копии гена (98,5%). Ген RAD17 присутствует у всех больных СМА в анализируемой выборке в количестве двух копий.

Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что число копий генов NAIP, GTF2H2, RADI 7 не оказывает существенного влияния на тяжесть клинических проявлений у больных проксимальной СМА. Однако отсутствие

гена NAIP, свидетельствующего о значительной протяженности делеции в локусе СМА, может являться дополнительным критерием, модифицирующим тяжесть течения заболевания.

Анализ числа копий генов SMNc, NAIP, GTF2H2, RAD 17 у больных СМА 1а и СМА Ib типов

Проведен анализ взаимосвязи между количеством копий генов локуса 5ql3 и тяжестью течения заболевания внутри одной клинической формы СМА.

Для этого из выборки больных СМА I типа отобрана группа пациентов (п=59), для которых имелись клинические данные, позволяющие выделить две подгруппы - СМА 1а (СМА 0, врожденная, характеризующаяся слабой внутриутробной подвижностью плода, асфиксией и слабостью с рождения) и СМА Ib (классическую тяжелую СМА). В результате анализа установлено, что более тяжелой группе соответствует преобладание меньшего числа копий гена SMNc (Таб. 4).

Таблица 4. Число копий гена SMNc у больных СМА la-Ib типа.

Число копий гена SMNc

Тип СМА, Количество пациентов (п) 1 2 3 4

СМА 1а п=28 10,7% п=3 85,7% п=24 3,6% п=1

СМА Ib п=31 61,3% п=19 29% п=9 9,7% п=3

Число копий гена SMNc в группах больных СМА la-Ib типа статистически значимо различается: £г=12.86, а=0.005.

При анализе числа копий генов NAIP, GTF2H2 и RAD] 7 установлено, что ген NAIP делегирован у 35,7% больных СМА 1а и у 25,8% у больных СМА Ib.

Среди больных СМА 1а и СМА Ib одна копия гена GTF2H2 зарегистрирована у 17,8% и 6,5% обследованных, соответственно. У оставшихся пациентов зарегистрировано две копии гена GTF2H2. Ген RAD17 присутствует у всех больных СМА в анализируемой выборке в количестве двух копий.

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод о том, что в пределах одной клинической формы СМА I так же существует влияние числа копий гена SMNc на тяжесть клинических проявлений. Гены GTF2H2 и RAD17 не оказывают модифицирующего влияния. Отсутствие гена NAIP служит индикатором протяженности делецнй в локусе СМА и выявляется в большем проценте случаев с более тяжелой клиникой заболевания.

Анализ числа копий генов SMNc, NAIP, GTF2H2, RAD17 у больных СМА Illa и СМА Illb типов

Согласно литературным данным, среди больных СМА III типа так же можно выделить две подгруппы: Illa и Illb, характеризующиеся возрастом манифестации заболевания до трех лет и после трех лет, соответственно.

В анализируемой выборке необходимые для дифференцировки данные доступны для 38 пациентов со СМА III. В группу СМА Illa вошло 12 больных. 26 обследуемых составили группу СМА Illb.

В результате исследования установлено, что все пациенты, как в группе СМА Illa, так и в группе СМА Illb имеют по две копии генов NAIP, GTF2H2 и RAD17.

Данные анализа числа копий гена SMNc представлены в Таблице 5.

Таблица 5. Число копий гена SMNc в анализируемой выборке больных СМА Illa и Illb.

Число копий гена SMNc

Тип СМА, Количество пациентов (п) 2 3 4

СМА Ша 25% 58,3% 16,7%

п=12 п=3 п=7 п=2

СМА ШЬ 7,7% 42,3% 50%

п=26 п=2 п=11 п=13

Число копий гена SMNc в группах больных СМА Illa-IIIb типа статистически значимо не различается: ,г2=4.63, а=0.099.

Таким образом, для клинических форм СМА III типа (Ша и Illb) значимых различий по количеству копий гена SMNc не выявлено, что противоречит

имеющимся литературным данным (\Virth В., 2006). Возможно, данное расхождение может быть обусловлено размерами анализируемой выборки.

Анализ частоты гетерозиготного носительства делеций в гене БМИ( и дупликаций гена БМ№ у чувашей, удмуртов и жителей московского региона

До настоящего времени в Российской Федерации не проводилось оценки частоты носительства делеций экзонов 7-8 в гене БМЫ1 и дупликаций гена БМЫс количественным методом, как в общей популяции, так и среди различных этнических групп.

В данной работе оценена частота носительства гена спинальной мышечной атрофии у чувашей, удмуртов и жителей московского региона.

Частота носительства спинальной мышечной атрофии у чувашей составила приблизительно 2,7% (1 на 37 человек, 7/260). (Таб. 6) Расчетная частота встречаемости заболевания составила 1 на 5476 человек.

Частота носительства спинальной мышечной атрофии у удмуртов составила приблизительно 2,8% (1 на 36 человек, 7/253). (Таб. 6) Расчетная частота встречаемости заболевания составила 1 на 5184 человек.

Частота носительства спинальной мышечной атрофии у жителей московского региона составила приблизительно 2,8% (1 на 36 человек, 8/285). (Таб. 6) Расчетная частота встречаемости заболевания составила 1 на 5184 человек.

Таблица 6. Число копий гена в анализируемых этнических группах

Российской Федерации.

Этническая группа 1 копия гена Ш 2 копии гена 5М№ 3 копии гена БМШ Расчетная частота встречаемости заболевания Всего

п частота п частота п частота

Чуваши 7 2,7% 1:37 252 96,9% 1 0,4% 1:5476 260

Удмурты 7 2,8% 1:36 245 96,8% 1 0,4% 1:5184 253

Жители Москвы и Московской области 8 2,8% 1:36 274 96,1% 3 1,1% 1:5184 285

Всего 22 2,8% 1:36 771 96,6% 5 0,6% 1: 5184 798

Статистический анализ сравнения числа копий гена БМАЧ в трех анализируемых выборках удмуртов, чувашей и жителей московского региона не выявил достоверных различий: чуваши-удмурты/ =0.001, а=0.998, чуваши-жители московского региона /=0.84, а=0.656, удмурты-жители московского региона /=0.79, а=0.675.

Анализ литературных данных показал, что приблизительная частота носительства гена спинальной мышечной атрофии популяции в целом составляет 1 на 40 человек. (Таб. 7)

Таблица 7. Число копий гена SMNt в популяции в целом по Ogino et al.

1 копия гена 2 копии гена 3 копии гена 4 копии гена Всего

SMNt SMNt SMNt SMNt

п частота п частота п частота п частота

30 2,5% 1080 89,8% 86 7,1% . 7 0,6% 1203

Полученные данные не выявили различия со среднепопуляционными. Такая «общность» частоты носительства, по-видимому, объясняется особенностями региона, в котором лежит ген БМЫг, так как локус СМА, состоящий из большого числа повторяющихся последовательностей, псевдогенов, ретротранспозонных элементов, является крайне нестабильным регионом и часто подвергается неравным перестройкам между высокогомологичными элементами, результатом чего являются делеции, дупликации и генные конверсии.

Также получена оценка частоты гетерозиготного носительства дупликаций псевдогена БМЫс у чувашей, удмуртов и жителей московского региона.

Три копии гена 5МЫс зарегистрированы у 1.5% чувашей, 3,6% удмуртов и 2.5% жителей московского региона. Четыре копии гена БМЫс выявлено лишь у одного удмурта. Результаты проведенного исследования представлены в Таблице 8.

Таблица 8. Число копий гена БМЫс в анализируемых этнических группах Российской Федерации.

Этническая группа 0 копий гена 1 копия гена 2 копии гена 3 копии гена 4 копии гена

БШс 5МЫс Шс 8МЫс 8Шс Всего

п частота п частота п частота п частота п частота

Чуваши 4 1.5% 45 17.3% 207 79.7% 4 1.5% 1:65 0 260

Удмурты 16 6.3% 47 18.6% 180 71.1% 9 3.6% 1:28 1 0.4%) 1:253 253

Жители

московского 23 8% 76 26.7% 179 62.8% 7 2.5% 1:40 0 285

региона

Статистический анализ сравнения частот дупликаций гена БМЫс в трех анализируемых выборках удмуртов, чувашей и жителей московского региона значимых различий не выявил: чуваши-удмурты =2.815, а=0.093, чуваши-жители московского региона %2 =0.579, а-0.447, удмурты-жители московского региона /=0.981,(1=0.322.

Обращает на себя внимание низкая частота делеций гена БМЫс у чувашей -1,5%. Однако, поскольку делеция гена БМЫс в гомозиготном состоянии является вариантом нормы, данная находка не является существенной.

Полученные данные не противоречат среднепопуляционным. Показано, что у 5-15% здоровых людей в различных популяциях ген БКШс может отсутствовать. У 80% индивидуумов присутствуют 1-2 копии гена ЗМИс. У оставшихся 5%-15% людей имеются дупликации и тетрапликации гена.

Стоит отметить, что исходя из ранее опубликованных работ по популяционной генетике проксимальной спинальной мышечной атрофии в Удмуртской Республике, ожидалась более высокая частота гетерозиготного носительства гена заболевания.

Комплексное медико- и популяционно-генетическое изучение населения Удмуртской Республики проведено сотрудниками ФГБУ "МГНЦ" РАМН совместно с органами здравоохранения и медико-генетической консультацией республики. Скринирующим методом обследовано население шести районов республики с численностью 267655 человек, из которых 155346 составляют удмурты. При выборе районов исследователи ориентировались на максимальное количество представителей титульной нации в районе.

По архивным данным лаборатории ДНК-диагностики ФГБУ "МГНЦ" РАМН при оценке частоты гетерозиготного носительства гена проксимальной спиналыюй мышечной атрофии в данном исследовании проанализированы образцы ДНК 441 здорового коренного удмурта. Детекция делеции гена ЯАЛМ осуществлялась методом ПЦР-ПДРФ-анализа. В результате исследования зарегистрирован 31 случай гетерозиготного носительства гена проксимальной СМА. Таким образом, согласно полученным данным, частота носительства делеции гена5ММ в гетерозиготном состоянии составила 1 на 14 человек или 7% (Таб. 9).

Таблица 9. Частота гетерозиготного носительства гена ЯМ'М по результатам настоящего исследования и ранее проведенных работ.

Количество обследованных человек, п Количество зарегистрированных случаев гетерозиготного носительства делеции гена 5МЫ1, п Количество зарегистрированных случаев носительства дупликаций гена 8МЫс,а Расчетная частота встречаемости заболевания

п частота п | частота

п=441 (ранее проведенные исследования) 31 7% 1:14 не анализировалось 1:784

п=253 (собственные данные) 7 2,8% 1:36 10 4% 1:5184

п=441 (симуляция) 30 6,8% 1:15 - 1:900

При такой частоте носительства гена проксимальной СМА должен регистрироваться гораздо больший процент заболевания среди новорожденных по сравнению со среднепопуляционным (расчетная частота встречаемости заболевания составляет 1 на 784 живорожденных). И поскольку проксимальная СМА является заболеванием с ранней детской смертностью, соответствующие показатели так же должны быть завышены. Однако таких данных нет.

Полуколичественные методы определяют не число копий генов на геном, а соотношение числа центромерных и теломерных копий гена 5МЧ что не всегда информативно, т.к. отклонение данного соотношения от единицы может быть

обусловлено как увеличением числа копий гена SMNc, так и снижением числа копий гена SMNt. Исходя из этого, мы можем предположить, что не все зарегистрированные методом ПДРФ-анализа случаи гетерозиготного носительства гена проксимальной СМА являются истинными делениями гена SMNt. Возможно, что в данном случае свой вклад внесли дупликации псевдогена SMNc, анализ которых в данной работе не проводился.

По данным настоящего исследования процент носительства дупликаций псевдогена SMNc у удмуртов достаточно высок и составляет 4% с учетом встретившейся тетрапликации.

Рассмотрим результаты ранее проведенного исследования так, если бы в нем детекция делеций гена SMNt осуществлялась количественным методом MLP А, а не с помощью ПЦР-ПДРФ-анализа. Для этого включим в расчет полученные для удмуртов частоты дупликаций (Таб. 9).

Таким образом, получены 30 случаев «гетерозиготного носительства» гена проксимальной СМА, что сравнимо с исходным 31.

В итоге подобных преобразований получена частота гетерозиготного носительства гена проксимальной СМА, статистически не различимая с частотой, рассчитанной в результате популяционного исследования СМА, в котором диагностическим инструментом служил метод ПДРФ-анализа (/=0.018, а=0.894).

Подводя итог, мы можем утверждать, что завышение значений частоты гетерозиготного носительства делении гена SMNt объясняется вкладом дупликаций гена SMNc, что обусловлено недостатками молекулярно-генетического метода диагностики на основе ПЦР-ПДРФ-анализа. Новая разработанная количественная методика позволяет дифференцировать дупликации псевдогена SMNc и истинные делеции гена SMNt в гетерозиготном состоянии, что дает возможность более точно оценивать частоту носительства гена СМА в популяциях.

Интересно отметить ещё один факт, свидетельствующий в пользу высокой распространенности дупликаций псевдогена SMNc в удмуртской популяции. ,

В ходе популяционного исследования в четырех районах Республики Удмуртии (Можгинский, Малопургинский, Шарканский, Дебесский),

проведенного лабораторией генетической эпидемиологии ФГБУ "МГНЦ" РАМН (Зинченко P.A. и др. (2004)), выявлено 7 случаев проксимальной спинальной мышечной атрофии. У всех больных зарегистрирована делеция экзонов 7-8 гена SMNt в гомозиготном состоянии. Из них СМА I типа зарегистрирована у одного человека, СМА II типа - у одного человека, СМА III типа - у четырех человек, СМА IV типа - у одного человека. Таким образом, больные с мягкой формой течения заболевания - I1I-IV тип, составили 71%. Поскольку, согласно полученным данным, число копий гена SMNc является основным модифицирующим фактором тяжести клинических проявлений СМА, можно предположить, что распространенность дупликаций гена SMNc у удмуртов является одной из причин преобладания больных с более мягким фенотипом.

выводы

1. Разработанная количественная молекулярно-генетическая методика диагностики спинальной мышечной атрофии на основе мультиплексной лигазной реакции с последующей амплификацией, на сегодняшний день является наиболее оптимальной для анализа числа копий генов локуса 5ql3.

2. Выявлено наличие зависимости тяжести течения проксимальной СМА I-IV типа от числа копий гена SMNc на основании изучения российской выборки из 201 больного. Показано, что у больных со СМА I типа преобладают две копии гена SMNc - 77,9%. У больных со СМА II типа чаще встречались три копии гена SMNc (46,4%), а со СМА III типа - четыре копии гена SMNc (50,5%). Полученные данные позволяют сделать заключение, что число копий гена SMNc является модифицирующим фактором тяжести течения СМА.

3. На основании анализа числа копий генов NAIP, GTF2H2, RAD 17 в исследуемой выборке установлено, что ещё одним фактором, влияющим на тяжесть течения СМА, является ген NAIP. Делеция в этом гене зарегистрирована у 36,4%, 6,9% и 4,6 % больных СМА I, II и III типа, соответственно. Количество копий генов GTF2H2, RAD 17 не вносит существенный вклад в модификацию фенотипа СМА.

4. Выявлено наличие взаимосвязи между числом копий гена SMNc и тяжестью течения клинических форм СМА I типа (1а и Ib).

5. Проведена оценка частоты гетерозиготного носительства гена проксимальной спинальной мышечной атрофии среди чувашей, удмуртов и жителей московского региона. Частота гетерозиготного носительства гена СМА составила 2,7% (1 на 37 человек), 2,8% (1 на 36 человек) и 2,8% (1 на 36 человек) для чувашей, удмуртов и жителей московского региона, соответственно.

6. Установлена частота носительства дупликаций гена SMNc в исследуемых группах, которая составила 1,5% для чувашей, 4% для удмуртов и 2,5% для жителей московского региона. Выявленная высокая частота дупликаций гена SMNc среди удмуртов позволяет объяснить гипердиагностику гетерозиготного носительства гена SMNt в данной популяции в ранних исследованиях, проводившихся методом ПЦР-ПДРФ-анализа.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ

1. Zabncnkova V. V., Dadali Е. L., Polyakov А. V. The assessment of influence of 5ql3 locus genes copy number on Ihe severity of spinal muscular atrophy in Russian patients // European Journal of Human Genetics. - 2010. - V. 18. S. 1 -p. 344.

2. Забненкова B.B., Дадали Е.Л., Поляков A.B. Влияние числа копий генов локуса 5ql3 на тяжесть течения спинальных мышечных атрофии у российских больных // Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков. Медицинская генетика. - 2010. - прил. № 5. - С. 64.

3. Zabnenkova V. V., Dadali Е. L., Polyakov А. V. Incidence of Spinal Muscular Atrophy in Chuvashia // European Journal of Human Genetics. - 2011. - V. 19. S. 2-p. 343.

4. Забненкова B.B., Дадали ЕЛ., Поляков A.B. Модифицирующие факторы, оказывающие влияние на тяжесть течения спинальных мышечных атрофий I-IV типов// Медицинская генетика.-2011.-Т. 10, №5.-С. 15-21.

5. Забненкова В.В., Дадали ЕЛ., Поляков А.В. Анализ носительства делеций в гене SMN, ответственном за возникновение спинальной мышечной атрофии I-IV типа // Медицинская генетика. - 2012. - Т. 11, № 1. - С. 3-9.

6. Забненкова В.В., Дадали Е.Л., Руденская Т.Е., Галкина В.А., Федотов В.П., Поляков А.В. Анализ фено-генотипической корреляции у российских больных СМА I-IV типа// Медицинская генетика. - 2012. - Т. 11, № 1. - С. 15-21.

СОКРАЩЕНИЯ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов

СМА - спинальная мышечная атрофия

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

В2М - beta-2-microglobulin (ген, кодирующий белок бета-2-микроглобулин) GTF2H2 - general transcription factor IIH, polypeptide 2 (ген, кодирующи субъединицу 4 главного транскрипционного фактора IIH) FAM - краситель карбоксифлуоресцеин FL-SMN - full length-SMN (полноразмерный белок SMN) MLPA - multiplex ligation-dependent probe amplification (мультиплексная проба-зависимая лигазная реакция с последующей амплификацией)

NAÏP - neuronal apoptosis inhibitory protein (ген, кодирующий белок-ингибитор нейронального апоптоза)

RAD17 - гомолог гена radl7 у дрожжей Schizosaccharomyces pombe SERF1A - small EDRK-rich factor 1A (ген, кодирующий белок малого EDRK-богатого фактора)

SMN - survival motor neuron (ген, кодирующий белок выживаемости мотонейронов)

SMNt - survival motor neuron (telomeric) (ген, кодирующий белок выживаемости мотонейропов, теломерная копия)

SMNc - survival motor neuron (centromeric) (ген, кодирующий белок выживаемости мотонейронов, центромерная копия)

SIRT3 - sirtuin 3 (ген, кодирующий белок сиртуин 3)

ТВР - TATA-box binding protein (ген, кодирующий ТАТА-бокс связывающий белок)

USP3 - ubiquitin specific peptidase 3 (ген, кодирующий убиквитин-специфическую пептидазу 3)

Подписано в печать:

09.02.2012

Заказ № 6623 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru