Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние характера метилирования геномной ДНК и числа копий гена SMN2 на тяжесть спинальной мышечной атрофии

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Влияние характера метилирования геномной ДНК и числа копий гена SMN2 на тяжесть спинальной мышечной атрофии"

На правах рукописи

ЖЕЛЕЗ НЯКОВА Галина Юрьевна

ВЛИЯНИЕ ХАРАКТЕРА МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК И ЧИСЛА КОПИЙ ГЕНА ЯМШ НА ТЯЖЕСТЬ СПИНАЛЬНОЙ МЫШЕЧНОЙ АТРОФИИ

03.02.07-Генетика 03.01.04 — Биохимия

2 О ФЕВ 2014

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 2014

005545263

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О.Отга» Северо-Западного отделения Российской Академии Медицинских Наук, в лаборатории пренатальной диагностики наследственных и врожденных заболеваний человека, в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет» на кафедре биохимии биолого-почвенного факультета.

Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент

Тищенко Людмила Ивановна, ФГБУ «Санкт-Петербургский государственный университет»

член-корреспондент РАМН Баранов Владислав Сергеевич

ФГБУ «НИИ акушерства и гинекологии им.Д.О.Отга» СЗО РАМН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Горбунова Виктория Николаевна,

профессор кафедры медицинской генетики ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения

доктор биологических наук, профессор Паткин Евгений Львович,

заведующий лабораторией молекулярной цитогенетики развития млекопитающих ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН

Ведущая организация: ФГБУ «Институт цитологии» РАН

Защита состоится « 014 г. в ¿^часов на заседании Диссертационного

совета Д 212.232.12 при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат

разослан г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.232.12

доктор биологических наук

Мамон Людмила Андреевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Спинальная мышечная атрофия (СМА) - аутосомно-рецессивное нервно-мышечное заболевание, характеризующееся дегенерацией альфа-моторных нейронов в передних рогах спинного мозга. Наряду с муковисцидозом и миодистрофией Дюшенна, СМА является одной из самых тяжелых наследственных болезней, приводящих в большинстве случаев к летальному исходу. Частота встречаемости заболевания 1 на 6000-10000 новорожденных, частота носительства 1 на 40-50 человек. СМА подразделяется на I, II, III и IV тип в зависимости от возраста манифестации и тяжести заболевания. Развитие всех форм СМА вызвано мутациями в гене выживания моторных нейронов SMN1. 95% пациентов имеют гомозиготную делецию 7 экзона гена SMN1, в то время как у остальных индивидуумов, страдающих заболеванием и сохранивших хотя бы одну копию гена SMN1, были обнаружены внутригенные мутации. Ген SMN1 кодирует белок SMN, принимающий участие в биогенезе мяРНП и созревании пре-мРНК различных генов. Белок SMN выполняет специфические функции в моторных нейронах. Так SMN вовлечен в транспорт мРНК ß-актина, организацию актинового цитоскелета через Што-ГТФазы-ЯОСК путь. Но точный механизм патогенеза СМА остается неясным.

Ген SMN1 имеет центромерно ориентированную копию - ген SMN2, количество которого, как было показано, может варьировать от 0 до 8, и коррелирует с тяжестью СМА. Ген SMN2 не способен полностью компенсировать отсутствие гена SMN1 из-за однонуклеотидной замены в 7-м экзоне, которая приводит к формированию мРНК гена SMN2, лишенной 7 экзона из-за альтернативного сплайсинга, снижению количества полноразмерной мРНК гена SMN2 и, соответственно, к образованию нестабильного, неполноразмерного белка SMN. Тем не менее, с гена SMN2 может считываться около 20% полноразмерной мРНК, следовательно, образуется небольшое количество функционального белка SMN. Этот факт объясняет зависимость тяжести спинальной мышечной атрофии от числа копий гена SMN2. Большинство пациентов со СМА I типа имеют одну или две копии гена SMN2, пациенты со СМА II типа имеют три копии гена SMN2, и у большинства пациентов со СМА III типа обнаруживается три или четыре копии гена SMN2. Пациенты с IV типом заболевания могут нести от четырех до шести копий гена SMN2. Понимание молекулярных основ патогенеза СМА позволило разрабатывать подходы к лечению заболевания. Для ряда веществ, т.н. ингибиторов деацетилаз гистонов — вальпроевой кислоты, гидроксимочевины, фенилбутирата и других - была показана способность влиять на течение СМА

путем стимуляции экспрессии гена SMN2 и восстановления корректного сплайсинга пре-мРНК гена SMN2, что приводит к увеличению уровня функционального белка SMN. Таким образом, число копий гена SMN2 рассматривается как наследственный фактор, который может учитываться при прогнозе течения заболевания и предсказания эффективности лечения.

Значимость гена SMN2 для развития более легкой формы спинальной мышечной атрофии подтверждается также случаями бессимптомных носителей, которые являются гомозиготами по делеции гена SMN1, но имеют достаточно большое число копий гена SMN2. В то же время были обнаружены редкие случаи сибсов, в которых родные братья и сестры имеют одинаковые мутации в гене SMN1 и равное число копий гена SMN2, но разное фенотипическое проявление заболевания. Также были выявлены случаи бессимптомных носителей заболевания с числом копий гена SMN2, соответствующим числу копий гена SMN2 у больных СМА. Это указывают на то, что существуют дополнительные генетические, а также эпигенетические факторы, влияющие на тяжесть развития заболевания.

Исследование этих факторов является актуальным для изучения патогенеза СМА, а также для исследования влияния лекарственных препаратов на течение заболевания и поиска эффективного лечения СМА.

Ранее было выявлено влияние белков пластина 3 и профилина IIa, а также замены c.859G>C в гене SMN2 на тяжесть СМА (Prior et al., 2009; Oprea et al., 2008; Boyer et al., 2010). Но действием данных факторов может быть объяснено ограниченное число дискордантных случаев СМА. Одним из возможных факторов, влияющих на тяжесть СМА, может быть изменение профиля метилирования ДНК у больных СМА. Изменения в метилировании ДНК ассоциированы с различными патологическими процессами. Так, неоднократно сообщалось о значимых различиях в метилировании ДНК лейкоцитов между пациентами с различными формами рака и здоровыми индивидуумами, подтверждая возможность использования этой характеристики в качестве биомаркера заболевания (Hsiung et al., 2007; Roupret et al., 2008). Достоверные различия в степени метилирования CpG динуклеотидов вблизи сайта начала трансляции гена SMN2 были выявлены между пациентами со СМА I и III типа (Hauken et al., 2009).

Таким образом, наряду с числом копий гена SMN2, характер метилирования геномной ДНК может быть важным фактором, модифицирующим тяжесть СМА.

Цель работы - оценить влияние числа копий гена SMN2 и профиля метилирования геномной ДНК на тяжесть спинальной мышечной атрофии.

Конкретные задачи:

1. определить число копий гена SMN2 у пациентов со СМА I, II и III типа и сравнить данные по распределению числа копий для каждого типа;

2. проанализировать профиль метилирования геномной ДНК больных СМА с тяжелой и легкой формами заболевания и здоровых индивидуумов соответствующего возраста;

3. определить гены, профиль метилирования которых отличается у больных СМА и здоровых индивидуумов;

4. провести сравнение профиля метилирования данных генов у больных с различными типами СМА.

Научная новизна. Впервые изучена частота встречаемости одной, двух, трех и четырех копий гена SMN2 у российских больных СМА I, II, III типов. Впервые на группе больных из России со спинальной мышечной атрофией исследована корреляции между числом копий гена SMN2 и тяжестью заболевания, и выявлены достоверные различия частот встречаемости двух, трех и четырех копий гена SMN2 у больных СМА I, II и III типов. Впервые при анализе индивидуумов со СМА из России была подтверждена значимость числа копий гена SMN2 в развитии легкой или асимптотической форм заболевания.

Впервые на больных со спинальной мышечной атрофией был проведен полногеномный анализ характера метилирования геномной ДНК. Впервые было показано, что изменения в уровне метилирования геномной ДНК могут быть связаны с развитием и патогенезом спинальной мышечной атрофии. Впервые были выявлены достоверные различия в характере метилирования 40 генов у больных спинальной мышечной атрофии и соответствующих им по возрасту здоровых индивидуумов. Впервые было показано, что изменения уровня метилирования регуляторных областей генов SLC23A2, NCOR2, CDK2AP1 коррелируют с тяжестью СМА.

Теоретическая и практическая значимость результатов. Полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярных механизмов, приводящих к гибели моторных нейронов, и в разработку новых методов лечения СМА. Гены, для которых были обнаружены изменения в уровне метилирования, могут рассматриваться в качестве факторов, модифицирующих тяжесть СМА и молекулярных маркеров для прогнозирования тяжести заболевания. Продукты генов с достоверными различиями в уровне метилирования связаны с регуляцией экспрессии генов, формированием микрофиламентов и микротрубочек, апоптозом, процессом локальной трансляции в моторных нейронах. Изучение характера метилирования геномной ДНК важно для

предсказания эффекта фармакологических препаратов, разрабатываемых для лечения СМА, многие из которых обладают ДНК-деметилазной активностью.

Проведенный анализ числа копий гена 8МЫ2 у пациентов со СМА из России подтвердил корреляцию между числом копий гена 5МУ2 и тяжестью заболевания, позволил усовершенствовать методы молекулярно-генетической диагностики СМА по оценке тяжести заболевания. Определение числа копий гена 8МЫ2 проводится у больных СМА в качестве уточняющего анализа, позволяющего с вероятностью около 80% предсказать тип развития заболевания.

Положения, выносимые на защиту:

• Тяжесть спинальной мышечной атрофии у больных из России зависит от числа копий гена Число копий гена БАШ2 может учитываться при предсказании развития типа заболевания.

• Сравнение профиля метилирования с помощью полногеномного анализа свидетельствует о наличии достоверных различий в характере метилирования геномной ДНК у больных СМА и здоровых индивидуумов соответствующего возраста.

• В ходе полногеномного анализа профиля метилирования отмечается понижение уровня метилирования регуляторных областей генов СНМЬ, БЬС23А2, СБК2АР1, КРЬ9 и достоверное повышение метилирования регуляторной области гена АКНСАР22 у больных спинальной мышечной атрофией в сравнении с контролями.

• Изменения в уровне метилирования регуляторных областей генов БЬС23А2, ШОК2, СИК2АР1 коррелируют с тяжестью СМА.

Личный вклад автора. Основная часть экспериментальной работы выполнена автором самостоятельно. Разработка метода ПЦР в реальном времени для определения числа копий гена БМЫ2 выполнена совместно с сотрудниками лаборатории пренатальной диагностики НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, что нашло отражение в совместных публикациях. Анализ данных полногеномного профиля метилирования проведен совместно с биоинформатической группой лаборатории Функциональной фармакологии отделения Нейробиологии Уппсальского университета, что нашло отражение в совместной публикации.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены в виде постерных презентаций на Европейской конференции по генетике человека (Гетеборг, 2010), на 28-ом Симпозиуме Эрнста Кленка по молекулярной медицине (Кельн, 2012), а также на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), конференциях Европейского

общества генетики человека (Вена, 2009, Нюрнберг, 2012), VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009), 14-ой Санкт-Петербургской Ассамблеи молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 4 статьи в журналах перечня ВАК, 11 тезисов отечественных и международных конференций.

Структура работы и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материала и методов, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы, приложений. Библиографический указатель включает 246 источников, их низ 239 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 26 рисунками, содержит 2 приложения.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование проведено на 151 образце геномной ДНК периферической крови больных СМА из коллекции лаборатории пренатальной диагностики НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отто СЗО РАМН, в том числе 44 образцах больных СМА I типа, 77 образцах II типа СМА и 30 образцах III-IV типа СМА. В качестве контроля для полногеномного анализа использованы образцы неродственных здоровых индивидуумов мужского пола в возрасте, соответствующем возрасту больных.

Выделение ДНК из лейкоцитов крови. Выделение геномной ДНК из лейкоцитарной фракции периферической крови проводилось методом фенольно-хлороформной экстракции.

Определения числа копий гена SMN2 проведено методом ПЦР в реальном времени. В качестве референсного гена был использован ген бета-глобина (HBВ). Анализ проводился с помощью метода относительного количественного определения (Relative Quantitation). Последовательности праймеров и Taq-Man зондов соответствовали опубликованным последовательностям (Hjelm et al., 1998; Anhuf et al., 2003). Статистический анализ корреляции между числом копий гена SMN2 и типом заболевания был проведен с использованием метода % с поправкой Йетса в статистической программе GraphPad Prism5. Полногеномиый анализ профиля метилирования. Бисульфитная обработка геномной ДНК проводилась с использованием Epitect 96 Bisulfite Kit (Qiagen, Германия) согласно прилагаемому протоколу. Анализ образцов проводился с использованием Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, США). Для последующей обработки данных и статистического анализа использовалась статистическая программа R вместе с lumi, limma и IMA статистическими

пакетами. Для оценки уровня метилирования вводилась характеристика - р-значение (отношение интенсивности сигнала флуоресценции от метилированнной пробы к сумме интенсивности сигналов метилированной и неметилированной пробы).

Анализ уровня метилирования регуляторных областей генов CHML, ARHGAP22, CDK2AP1, SLC23A2, RPL9, NCOR2 проведен с использованием метода бисульфитного секвенирования. Последовательности праймеров для амплификации были подобраны с помощью программного обеспечения Methyl Primer Express® vi.О (Applied Biosystems, США). Амплификацию фрагментов проводили по стандартному протоколу. Очистка ампликонов проводилась с помощью GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Scientific, Эстония) согласно прилагаемому протоколу. Секвенирование проводилось на базе Uppsala Genome Center (Уппсала, Швеция). Данные анализировали с помощью программного обеспечения ESME (Epigenetic Sequencing Methylation Analysis) (Lewin et al., 2004).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Определение числа копий гена SMN2 у больных спинальной мышечной атрофией

Анализ числа копий гена SMN2 у пациентов с различными типами СМА показал, что большинство пациентов с I типом заболевания имеют 2 копии гена SMN2 (77,27%), большинство пациентов со II типом СМА имеют 3 копии гена SMN2 (79,22%), среди пациентов с III типом заболевания в большинстве случаев обнаруживается четыре (53,33%) или три копии гена SMN2 (43,33%) (Рис. 1). Сравнение частоты встречаемости двух, трех и четырех копий гена SMN2 у пациентов с различными типами СМА показало, что среди пациентов с I и II типом СМА существуют достоверные различия в частоте встречаемости 2 и 3 копий гена SMN2. Также среди пациентов со II и III типом СМА существуют достоверные различия в частоте встречаемости 3 и 4 копий гена SMN2. Таким образом, впервые для российских больных СМА была выявлена корреляция между числом копий гена SMN2 и тяжестью проявления заболевания.

Ранее было показано, что число копий гена SMN2 коррелирует не только с тяжестью проявления симптомов спинальной мышечной атрофии, но также с возрастом манифестации заболевания и продолжительностью жизни у больных СМА I типа и показателями SMAFRS (SMA functional rating scale) у взрослых больных СМА (Feldkotter et al., 2002; Cusco et al., 2006; Rudnik-Schoneborn et al., 2009; Elsheikh et al., 2009).

1 КОПИЯ

2 КОПИИ 3 копии

Число копий гена SMN2

***_ достоверные различия, р< 0,0001. Рис. 1. Распределение числа копий гена SMN2 у пациентов со СМА I, П, III типа

Анализ данных позволяет заключить, что при наличии 2 копий гена SMN2 наиболее вероятно развитие I типа СМА, поскольку более 75% пациентов со СМА I типа несут 2 копии гена SMN2, а среди пациентов со СМА П типа 2 копии гена SMN2 обнаруживаются менее чем в 8% случаев, а среди пациентов со СМА Ш типа - только в 3% случаев. Наличие 3 копий гена SMN2 позволяет предсказать развитие II формы заболевания с большей вероятностью, чем III формы заболевания, поскольку 79% пациентов со СМА II типа имеют три копии гена SMN2 по сравнению с 43% пациентов со СМА III типа. Только 13% пациентов со СМА II типа имеют 4 копии гена SMN2, следовательно, в 87% случаев наличие 4 копий гена SMN2 определяет развитие III формы заболевания.

Таким образом, число копий гена SMN2 может учитываться при раннем прогнозе развития тяжелой или легкой формы заболевания, но данный показатель нужно рассматривать как дополнительный к существующим клиническим симптомам, так как данная корреляция является неабсолютной. Полногеномный анализ профиля метилирования геномной ДНК у больных СМА и здоровых индивидуумов

В рамках данного исследования впервые проведен полногеномный анализ профиля метилирования геномной ДНК, с целью выявить различия в уровне метилирования между больными СМА и здоровыми индивидуумами. Анализ

проводился в двух группах, первая группа включала больных с тяжелой формой СМА и соответствующих им по возрасту здоровых индивидуумов. Во вторую группу входили больные с легкой формой СМА и соответствующие им контроли. В первой и второй анализируемых группах обнаружено соответственно 1512 и 873 CpG динуклеотидов, достоверно различающихся по уровню метилированию между пациентами и контролями (Рис.2).

А — более метилированные у больных СМА, чем у контролей. В — менее метилированные у больных СМА, чем у контролей.

Рис.2. Диаграмма СрО динуклеотидов с достоверными различиями в уровне метилирования

СрО динуклеотиды с различиями в уровне метилирования были разделены на две группы: с одной стороны Срй динуклеотиды с положительным изменением в метилировании (более метилированы у пациентов по сравнению со здоровыми индивидуумами), с другой стороны Срв динуклеотиды с негативным изменением в метилировании (менее метилированы у пациентов по сравнению со здоровыми людьми). В первой группе было выявлено 564 СрО динуклеотида с положительным изменением в уровне метилирования и 908 СрО динуклеотидов с негативным изменением в уровне метилирования. Соответственно, во второй анализируемой группе было обнаружено 470 СрО динуклеотидов с положительным изменением в уровне метилирования и 363 СрО динуклеотида с негативным изменением в уровне метилирования (Рис. 2).

При дальнейшем анализе учитывались только Срй динуклеотиды, показывающие одинаковое изменение в метилировании для обеих анализируемых групп. В сумме было выявлено 40 СрО динуклеотидов с достоверными различиями в уровне метилирования, общих для двух анализируемых групп. Для 15 из них были характерны положительные

изменения в уровне метилирования и для 25 негативные изменения в уровне метилирования. 10 Срй динуклеотидов имели наиболее достоверные различия в уровне метилирования между больными СМА и контролями в двух анализируемых группах. Два СрО динуклеотида показывали положительное, 8 СрО динуклеотидов - негативное изменение в уровне метилирования (Рис. 3). 6 СрО динуклеотидов были ассоциированы с генами СНМЬ, АКНСАР22, СОК2АР1, БЬС23А2, ЯР 19, СУТБВ.

□ Контроли

□ Пациенты

I

I

1

Э.С23А2 ЫАВРРИ СИМиОРИЗ сд05712748 сд023970С1 С13м11в СГТБВ АРНБАР22 сд1273&24в

ОрС динуклеотид или геи, ассоциированный с СрС динуклеощдом

Приведена стандартная ошибка среднего.

Рис. 3. Гистограмма р-значений для СрО динуклеотидов, достоверно различающихся в уровне метилирования у больных СМА и контролен

В 5 генах {СНМЬ, АЯНСАР22, С1Ж2ЛР], 8ЬС23А2, ЯРЬ9) выявленные СрО динуклеотиды находились в регуляторных областях генов, что может свидетельствовать о возможном влиянии изменения уровня метилирования на уровень экспрессии данных генов. Изменение уровня метилирования одного СрО динуклеотида может указывать на изменение в степени метилирования Срй области, включающей данный динуклеотид.

При полногеномном анализе профиля метилирования геномной ДНК у пациентов со СМА был выявлен пониженный уровень метилирования СрО динуклеотида, ассоциированного с областью дистального промотора гена СНМЬ (1500 п.н. выше по течению от сайта начала транскрипции) и

повышенный уровень метилирования CpG динуклеотида, расположенного в 3'UTR области гена ARHGAP22. Ген CHML кодирует REP2 (Rab Escort Protein 2), участвующий в постгрансляционном изопренилировании большинства Rab ГТФаз. ARHGAP22 кодирует белок, активирующий Rho ГТФазы, (RhoGAP). Rab и Rho ГТФазы являются важными регуляторами полимеризации, деполимеризации актина, сборки актин-миозиновых филаментов. Аксональные и синаптические патологии могут играть важную роль в развитии СМА. У модельных мышей с тяжелой формой СМА были обнаружены морфологические и функциональные изменения нервномышечных соединений, агрегация актин-миозиновых филаментов (Bowerman et al., 2012; Kariya et al., 2009). Также наблюдались дефекты в росте аксонов моторных нейронов, уменьшение конуса роста аксонов (Carrel et al., 2006; Dimitriadi, 2010). Все эти процессы связанны с нарушениями регуляции сборки-разборки актиновых филаментов актин-связывающими белками (Letourneau, 2009). Все вышесказанное позволяет предполагать, что белки, регулирующие активность Rab и Rho ГТФаз могут быть факторами, модифицирующими тяжесть СМА. Анализ уровня метилирования регуляторных областей генов CHML, ARHGAP22, CDK2AP1, SLC23A2, RPL9, NCOR2

Регуляторные области генов CHML, ARHGAP22, CDK2AP1, SLC23A2, RPL9, NCOR2, для которых в предшествующем полногеномном анализе были выявлены различия в метилировании отдельных CpG динуклеотидов, были проанализированы с помощью метода бисульфитного секвенирования. Указанные области помимо интересующего CpG динуклеотида включали и ряд соседних CpG динуклеотидов.

При сравнении уровня метилирования 5'UTR области гена SLC23A2 (усредненное значение метилирования всех CpG динуклеотидов) было выявлено достоверное различие у пациентов с Ш-IV типом по сравнению с пациентами I и II типа заболевания (Рис. 4). Был установлен достоверно пониженный уровень метилирования CpGl динуклеотида (первый в анализируемой области) у больных с Ш-IV типом СМА по сравнению с больными I, II типа, и достоверно повышенный уровень метилирования CpG4 динуклеотида у больных с I типом СМА по сравнению с больными со II, Ш-IV типом (Рис. 4). В соответствии с данными полногеномного анализа были обнаружены достоверные различия в уровне метилирования CpG2 динуклеотида между больными СМА II и III-IV типа мужского пола. Кроме того, было выявлено достоверное различие в частоте аллелей полиморфизма rs 1279683 (g.G>A), расположенного в CpG2 динуклеотиде, между пациентами I и Ш-IV типа. Повышенная частота аллели А полиморфного варианта rs 1279683

у пациентов с 1И-1У типом заболевания также предполагает пониженную степень метилирования данного региона, т.к. в таком случае разрушается СрО динуклеотид.

Ген 5ЪС23А2 принадлежит к семейству 8ЬС23 Ыа-аскорбатных котранспортеров. В нейронах центральной нервной системы концентрация аскорбата является одной из самых высоких по сравнению с другими тканями организма, что обеспечивается, главным образом, транспортером 8ЬС23А2. В ЦНС аскорбат выполняет несколько функций, включая антиоксидантную защиту, пептидное дезаминирование, формирование миелина, обновление а-токоферола в мембранах. Аскорбат обладает нейропротекторными свойствами в условиях оксидативного стресса, связанного с различными нейродегенеративными заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, хорея Хантингтона.

Тип эа^арведа*™

Тип ■аёзап&хАнш

Тип заболевания

*,**- достоверные различия, р<0,05, р<0,01, соответственно. Приведено стандартное отклонение.

Рис. 4. Уровень метилирования CpGl динуклеотида (А), CpG4 динуклеотида (В), средний уровень метилирования региона (С) 5'UTR гена SLC23A2 у больных с различными типами СМА

При полногеномном анализе был обнаружен пониженный уровень метилирования CpG динуклеотида в 5'UTR гена SLC23A2 у больных СМА по сравнению с контрольной группой. Анализом с помощью метода бисульфитного секвенирования выявлен пониженный уровень метилирования (на 10% и более) как проанализированного региона в целом, так и отдельных CpG динуклеотидов у пациентов с III-IV типом заболевания по сравнению с пациентами с I типом заболевания. Пониженный уровень метилирования предполагает повышенный уровень экспрессии этого гена. Эти результаты могут свидетельствовать о том, что ген SLC23A2 может выполнять в моторных нейронах определенную компенсаторную функцию и способствовать их

выживанию у больных СМА. Повышенный уровень продукта гена БЬС23А2 может способствовать развитию более легкой формы СМА.

В ходе полногеномного анализа был также выявлен пониженный уровень метилирования Срв динуклеотида, расположенного 1500 п.н. выше по течению от сайта начала транскрипции гена СОК2АР1. Как для больных СМА, так и для контролей было характерно гипометилирование этого СрО динуклеотида (Рис.3). Анализ региона методом бисульфитного секвенирования выявил промежуточный уровень метилирование интересующего СрС динуклеотида в трех проанализированных группах больных, на фоне гиперметилирования соседних Срв сайтов в данной области. Были обнаружены достоверные различия в уровне метилирования СрйЗ, СрОб, СрС9 динуклеотидов в проанализированной области, с наибольшим значением доли метилирования для пациентов с Ш-Г/ типом заболевания (Рис. 5). Продукт гена СВК2ЛР1 является коровой субъединицей нуклеосомо-ремодулирующего и гистон-деацетилирующего комплекса (ЛиКО), ассоциированного с метил-СрО-домен-связывающими белками 2 и 3 (МВ02 и МЕЮЗ), приводящего к ингибированию транскрипции различных генов.

в

у у

Тип эаЁшнхМ1«ия

*,***- достоверные различия, р<0,05, р<0,001, соответственно. Приведено стандартное отклонение.

Рис. 5. Уровень метилирования СрвЗ (А), СрСб (В) и СрС9 (С) динуклеотидов в области, расположенной на 1735-1398 п.н. выше по течению от сайта начала транскрипции гена СОК2АР1 у пациентов с различными типами СМА

В ходе полногеномного анализа уровня метилирования был выявлен повышенный уровень метилирования Срв динуклеотида в 5 'иТЯ области гена ЫСОЯ2 у больных с тяжелой формой СМА по сравнению со здоровыми индивидуумами. Это согласуется с данными, полученными при анализе уровня метилирования у больных с различными типами СМА методом бисульфитного секвенирования. Уровень метилирования Срв динуклеотида, выявленного в ходе полногеномного анализа (СрС4), и соседнего СрО динуклеотида (Ср05)

оказался на 9-17% ниже у пациентов с III-IV типом заболевания по сравнению с больными СМА I типа (Рис. 6). Пониженная степень метилирования может свидетельствовать о повышенном уровне экспрессии данного гена у больных с III-IV типом СМА. Ген NCOR2 кодирует белок - медиатор сайленсинга для рецепторов тиреоидного гормона и ретиноевой кислоты (silencing mediator for retinoid and thyroid hormone receptor, SMRT). Белок входит в состав репрессионного комплекса, содержащего деацетилазы гистонов, способствующего транскрипционному сайленсингу генов-мишеней.

Тип заболеваний Тип заболевания

* — достоверные различия, р<0,05. Приведено стандартное отклонение.

Рис. 6. Уровень метилирования Ср(34 (А), Срв5 (В) динуклеотидов в 5'ЦП*. области гена

№С0112 у больных с различными типами СМА

Взаимодействие продуктов генов СБК2АР1 и N00112 с ингибиторами деацетилаз гистонов различных классов может быть значимым для больных СМА, т.к. большинство лекарственных препаратов для лечения заболевания, проходящих клинические испытания, являются ингибиторами деацетилаз гистонов.

Согласно полногеномному анализу, уровень метилирования Срв динуклеотида, расположенного 1500 п.н. выше по течению от сайта начала транскрипции гена СНМЬ понижен у больных СМА по сравнению с контролями. Анализ уровня метилирования Срв динуклеотида методом бисульфитного секвенирования не выявил достоверных отличий у больных с различными типами СМА. Уровень метилирования повышался с понижением тяжести заболевания, т.е. был наибольшим у больных с III-ГУ типом СМА.

Для СрС динуклеотида в З'иТЯ области гена АВНСАР22 при полногеномном анализе был обнаружен повышенный уровень метилирования у больных СМА по сравнению с контролями. При сравнении уровня метилирования данного СрС динуклеотида у больных с разными формами

СМА методом бисульфитного секвенирования, выявлен гетерогенный характер метилирования во всех анализированных группах. В уровне метилирования соседнего Срв динуклеотида, расположенного 25 п.о. ниже по течению от СрО сайта интереса, в опытной и контрольной группах не было обнаружено значительной вариабельности среди индивидуумов. Таким образом, для некоторых больных СМА был характерен уровень метилирования данного Срв динуклеотида, близкий к уровню метилирования у здоровых индивидуумов (гипометилирование). Для других было характерно промежуточный уровень метилирования или гиперметилирование. Повышенный уровень метилирования может свидетельствовать о пониженной экспрессии данного гена и, соответственно, о пониженном уровне ингибирования Юю ГТФаз у больных СМА. Соответственно, пониженный уровень метилирования данного Срй динуклеотида может указывать на повышенную экспрессию гена А1ШСАР22 и, следовательно, повышенный уровень ингибировании Шю ГТФаз. Вариабельный характер метилирования этого Срв динуклеотида может указывать на различную регуляцию экспрессии гена А1иЮАР22 у больных СМА и, как следствие, разную степень ингибирования Мю ГТФаз. Эта регуляция необязательно коррелирует с тяжестью СМА.

При полногеномном анализе у больных СМА выявлен значительно пониженный уровень метилирования Срв динуклеотида, ассоциированного с областью дистального промотора гена ИРЬ9 (1500 п.н. выше по течению от сайта начала транскрипции). При анализе методом бисульфитного секвенирования во всех проанализированных группах отмечено гипометилирование этого региона, хотя не было выявлено достоверных различий между больными с различными формами СМА. Белок, кодируемый геном КРЬ9, относится к группе Ь6Р семейства рибосомальных белков. Разнонаправленные изменения в уровне рибосомальных белков были зафиксированы в мышцах у новорожденных мышей со СМА (М^ваеге е1 а1., 2011). Изменения уровня рибосомальных белков, рРНК и рибосом в нейронах описаны при болезни Альцгеймера (Маз1гоеш е1 а1., 2010). Можно предполагать, что наблюдаемые изменения являются следствием значительных изменений в метилировании геномной ДНК, потери стабилизации метилирования ДНК в нейронах у больных с нейродегенеративными заболеваниями.

Таким образом, гены, для которых в ходе полногеномного анализа были обнаружены различия в уровне метилированния, по-видимому, могут рассматриваться в качестве факторов, модифицирующих тяжесть спинальной мышечной атрофии. Продукты данных генов связаны с регуляцией сборки-

разборки цитоскелета, развитием аксонов и нейромышечных соединений, процессом апоптоза, регуляцией экспрессии генов. Как показал анализ с помощью бисульфитного секвенирования, изменения в уровне метилирования регуляторных областей генов SLC23A2, CDK2AP1, NCOR2 коррелируют с тяжестью спинальной мышечной атрофии.

ВЫВОДЫ

1. Методом ПЦР в реальном времени показано, что между пациентами с I, II, III типами спинальной мышечной атрофии существуют достоверные различия в частоте встречаемости двух, трех, четырех копий гена SMN2. Данные о достоверности различий в частоте встречаемости числа копий гена SMN2 могут учитываться при раннем прогнозе развития тяжелой или легкой формы спинальной мышечной атрофии.

2. Сравнение профиля метилирования с помощью полногеномного анализа выявило достоверные различия в характере метилирования геномной ДНК у больных СМА по сравнению со здоровыми индивидуумами соответствующего возраста.

3. Полногеномный анализ профиля метилирования показал достоверное понижение уровня метилирования областей дистальных промоторов (1735-1330 п.н. выше по течению от сайта инициации транскрипции) генов CHML, CDK2AP1, RPL9 и 5'-нетранслируемой области (5'UTR) гена SLC23A2 и достоверное повышение уровня метилирования 3'-нетранслируемой области (3'UTR) гена ARHGAP22 у больных СМА по сравнению с контрольной группой.

4. С помощью бисульфитного секвенирования выявлены достоверные различия в уровне метилирования 5'UTR генов SLC23A2 и NCOR2, а также области дистального промотора гена CDK2AP1 (1735-1398 п.н. выше по течению от сайта инициации транскрипции) между группами пациентов с различными типами СМА.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в журналах, рекомендованных ВАК

1) Zheleznyakova G.Yu., Voisin S., Kiselev A.V., Almen M.S., Xavier M.J.,

Maretina M.A., Tishchenko L.I., Fredriksson R., Baranov V.S., Schioth H.B.

Genome-wide analysis shows association of epigenetic changes in regulators of

Rab and Rho GTPases with spinal muscular atrophy severity // European Journal

of Human Genetics. 2013. V.21(9). P. 988-993.

2) G. Zheleznyakova, A. Kiselev, V. Vakharlovsky, M. Rask-Anders en, R.

Chavan, A. Egorova, H. Schioth, V. Baranov. Genetic and expression studies of

SMN2 gene in Russian patients with spinal muscular atrophy // BMC Medical Genetics. 2011,12:96.

3) Маретина M.A., Киселев A.B., Железнякова Г.Ю., Егорова A.A., Вахарловский В.Г., Тищенко Л.И., Баранов B.C. Определение числа копий гена SMN2 у больных спинальной мышечной атрофией Северо-Западного региона России // Медицинская генетика. 2012. №4. С. 25-28.

4) Баранов B.C., Киселев A.B., Вахарловский В.Г., Железнякова Г.Ю., В.Н. Команцев, Малышева О.В., Глотов A.C., Иващенко Т.Э., Баранов А.Н. Молекулярная природа, идентификация мутаций и опыт фармакогенетической терапии тяжелого нервно-мышечного заболевания -проксимальной спинальной мышечной атрофии // Генетика. 2008. Т. 44. № 10. С. 1315-1327.

в других журналах, включая тезисы

5) М. А. Маретина, Г. Ю. Железнякова, А. А. Егорова, А. В. Киселев. Изучение генетических факторов, влияющих на тяжесть спинальной мышечной атрофии // Медицинский академический журнал. 2012. Т. 12. № 4. С. 31-32.

6) М. Maretina, A. Kiselev, G. Zheleznyakova, A. Egorova, V. Baranov. Study of positive modifiers of spinal muscular atrophy severity in Russian patients // The European Human Genetics Conference 2012. June 22-23, 2012. Nürnberg, Germany. V.20. P. 334-335.

7) G. Zheleznyakova, A. Kiselev, V. Vakharlovsky, V. Baranov. Quantification of SMN2 gene copies number for molecular diagnostics in Russian SMA patients // The European Human Genetics Conference 2010. June 12-15, 2010. Gothenburg, Sweden. V.18. P. 345.

8) V. Vakharlovsky, G. Zheleznyakova, A. Kiselev, M. Danilova, A. Glotov, V. Komantsev, A. Baranov, V. Baranov. Pharmacogenetic approach to the treatment of SMA patients with valproic acid and carnithin preparations // The European Human Genetics Conference 2009. 23 - 26 May, 2009. Vienna, Austria. V.17. P. 363.

9) Железнякова Г.Ю., Киселев A.B., Вахарловский В.Г., Баранов B.C. Определение числа копий гена SMN2 у больных спинально-мышечной атрофией П и III типов // VI съезд Российского общества медицинских генетиков, 14-18 мая, Ростов-на-Дону, 2010. С. 62.

10) Вахарловский В.Г., Железнякова Г.Ю., Киселев A.B., Команцев В.Н., Егорова A.A., Сезнева Т.Н., Юрьева Р.Г., Вахарловская М.В., Баранов А.Н., Баранов B.C. Опыт лечения с проксимальной спинально-мышечной

атрофией (СМА) препаратами вальпроевой кислоты // VI съезд Российского общества медицинских генетиков, 14-18 мая, Ростов-на-Дону, 2010. С.35.

11) Железнякова Г.Ю., Киселев A.B., Вахарловский В.Г., Баранов B.C. Метод ПЦР в реальном времени для определения числа копий гена SMN2 у больных спинальной мышечной атрофией // VI международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность», 10-11 ноября, Москва, 2009. С.92-93.

12) Железнякова Г.Ю. Разработка метода ПЦР в реальном времени для молекулярной диагностики спинально-мышечной атрофии // 14-ая Санкт-Петербургская Ассамблея молодых ученых и специалистов, 11 декабря, Санкт-Петербург, 2009. С.70.

13) Маретина М., Киселев А., Железнякова Г. Количество копий гена SMN2 как диагностический критерий, определяющий тяжесть спинальной мышечной атрофии // XIX Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», 9-13 апреля 2012, Москва. С. 91-92.

14) М.А. Маретина, Г.Ю. Железнякова, A.A. Егорова, A.B. Киселев. Изучение генетических факторов, влияющих на проявление спинальной мышечной атрофии // Юбилейная Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей (с международным участием) «Фундаментальная наука и клиническая медицина. Человек и его здоровье», 21 апреля, Санкт-Петербург, 2012. С.181-182.

15) М.А. Маретина, Г.Ю. Железнякова, A.A. Егорова, A.B. Киселев. Изучение генетических факторов, влияющих на тяжесть течения спинальной мышечной атрофии // Международная конференция "Биология — наука XXI века". 24 мая, Москва, 2012. С. 540-542.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

мРНК — матричная рибонуклеиновая кислота.

мяРНП — малая ядерная рибонуклеопротеиновая частица.

п.н. - пар нуклеотидов.

СМА - спинальная мышечная атрофия.

3'UTR - З'-нетранслируемая область.

5'UTR — 5'-нетранслируемая область.

HD АС — histone deacetylase (деацетилазы гистонов).

SMN1 — survival motor neurons gene (ген выживания моторных нейронов).

Подписано в печать 24.01.2014г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,1. Тираж 100 экз. Заказ №3381.

Отпечатано в ООО «Издательство "ЛЕМА"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, 1-я линия В.О., д.28 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Железнякова, Галина Юрьевна, Санкт-Петербург

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

04201456935 Железнякова Галина Юрьевна

ВЛИЯНИЕ ХАРАКТЕРА МЕТИЛИРОВАНИЯ ГЕНОМНОЙ ДНК И ЧИСЛА КОПИЙ ГЕНА 8М№ НА ТЯЖЕСТЬ СПИНАЛЬНОЙ МЫШЕЧНОЙ АТРОФИИ

03.02.07 - Генетика 03.01.04 — Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук,

доцент Л.И. Тищенко

доктор медицинских наук, профессор,

член-корреспондент РАМН

B.C. Баранов.

Санкт-Петербург 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................4

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................9

1.1. Клиническая картина и диагностика спинальной мышечной атрофии ....9

1.1.1. Классификация спинальной мышечной атрофии...................................9

1.2.1 Общая характеристика СМА региона....................................................11

1.2.2 Гены SMN1 и SMN2.................................................................................12

1.2.3. Экспрессия генов SMN1 и SMN2............................................................14

1.2.4. Белок SMN..............................................................................................17

1.2.4.1. Функции SMN белка - продукта гена домашнего хозяйства............18

1.2.4.2. Нейронспецифические функции SMN................................................20

1.2.4.3. Функции SMN, специфичные для мышц............................................22

1.3. Основные модификаторы тяжести спинальной мышечной атрофии......23

1.3.2. Пластин 3, профилин Да, Rho- и Rab-ГТФазы как возможные модификаторы тяжести СМА.....................................................................................23

1.3.3 Метилирование ДНК как возможный фактор, влияющий на тяжесть СМА.............................................................................................................................25

1.3.4. Пролактин и другие белки, связанные с тяжестью СМА (белки апоптоза, белок ZPR1, содержащий домен «цинковые пальцы»). Связь тяжести

СМА с полом...............................................................................................................28

1.4 Лечение СМА.............................................................................................29

1.4.1 Фармакотерапия СМА.............................................................................30

1.4.2 Генная терапия........................................................................................38

1.4.3 Клеточная терапия СМА.........................................................................40

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ..............................................................................43

2.1. Материал исследования............................................................................43

2.2. Методы исследования...............................................................................45

2.2.1. Выделение ДНК из лейкоцитов крови...................................45

2.2.2. Полиморфизм конформации одноцепочечных фрагментов ДНК (Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP)) для анализа генов SMN1 и SMN2...............................................................................................45

2.2.3. Проведение мультиплексной ПЦР в реальном времени для определения числа копий гена SMN2..........................................................46

2.2.4. Полногеномный анализ профиля метилирования.................47

2.2.5. Бисульфитное секвенирование...............................................50

2.2.6. Выделение РНК из лейкоцитов крови....................................52

2.2.7. Проведение обратной транскрипции.....................................54

2.2.8. Проведение ПЦР в реальном времени для определения концентрации полученной кДНК................................................................54

2.2.9. Проведение ПЦР в реальном времени для определения уровня транскриптов генов АЮОЯ2 и АИНСАР22......................................54

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ................................................................................................56

3.1. Определение числа копий гена БМЫ2 у больных спинально-мышечной атрофией методом ПЦР в реальном времени.............................................................56

3.2. Полногеномный анализ профиля метилирования геномной ДНК у больных СМА и здоровых индивидуумов.................................................................58

3.3. Анализ уровня метилирования регуляторных областей генов АЯтАР22, СОК2АР1, СНМЬ, ЫСОЯ2, 8ЬС23А2, ЯРЬ9...........................................62

3.4. Анализ уровня экспрессии генов АЯНСАР22 и АТС(Ж2..........................81

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ..................................................................82

4.1. Число копий гена БМШ как основной фактор, влияющий на тяжесть СМА.............................................................................................................................83

4.2. Метилирование ДНК как фактор, влияющий на развитие спинальной мышечной атрофии.....................................................................................................87

ВЫВОДЫ.......................................................................................................................109

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................................................110

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ..............................................................................................111

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Спинальная мышечная атрофия (СМА) - это аутосомно-рецессивное нервно-мышечное заболевание, характеризующееся дегенерацией альфа-моторных нейронов передних рогов спинного мозга. Наряду с муковисцидозом и миодистрофией Дюшенна, СМА является одной из самых тяжелых наследственных болезней, приводящих в большинстве случаев к летальному исходу. Частота встречаемости заболевания 1 на 600010000 новорожденных, частота носительства 1 на 35-50 человек (Biros and Forrest, 1999). СМА подразделяется на I, II, III и IV типы в зависимости от возраста начала развития симптомов и тяжести заболевания (Munsat and Davies 1992; Zerres and Rudnik-Schoneborn, 1997). Развитие всех форм СМА вызвано мутациями в гене выживания моторных нейронов SMN1 (Lefebvre et al., 1995). 95% пациентов имеют гомозиготную делецию 7 экзона гена SMN1, в то время как у остальных индивидуумов, страдающих заболеванием и сохранивших хотя бы одну копию гена SMN1, были обнаружены внутригенные мутации (Parson et al., 1996; Talbot et al., 1997; Parson et al., 1998). Ген SMN1 кодирует белок SMN, принимающий участие в биогенезе мяРНП и созревании пре-мРНК различных генов. SMN белок выполняет специфические функции в моторных нейронах. Так SMN вовлечен в транспорт мРНК Р-актина, организацию актинового цитоскелета через Rho-ГТФазы-ROCK путь (Hua and Zhou, 2004; Briese et al., 2005; Nolle et al., 2011). Однако точный механизм патогенеза СМА остается неясным. Существует две точки зрения на роль белка SMN в развитии СМА. Согласно первой, СМА — это непосредственное следствие дефектов в биогенезе мяРНП и сплайсинге пре-мРНК различных генов, развивающихся при пониженном уровне белка SMN. Согласно второй, в развитии СМА важную роль играют специфические функции белка SMN для моторных нейронов спинного мозга, критичные для их выживания.

Ген SMN1 имеет центромерно ориентированную копию — ген SMN2, количество которого, как было показано, может варьировать от 0 до 8, и коррелирует с тяжестью СМА (Lefebvre et al., 1995; Feldkotter et al., 2002). Ген SMN2 не способен полностью компенсировать отсутствие гена SMN1 из-за однонуклеотидной замены в 7-м экзоне, что приводит в процессе альтернативного сплайсинга к формированию мРНК гена SMN2, лишенной 7 экзона, снижению количества полноразмерной мРНК гена SMN2 и, соответственно, образованию нестабильного, неполноразмерного белка SMN (Lefebvre et al., 1997). Тем не менее, с гена SMN2 может считываться около 20% полноразмерной мРНК, следовательно, образуется небольшое количество функционального белка SMN.

Этот факт объясняет зависимость тяжести данного заболевания от числа копий гена SMN2. Большинство пациентов со СМА I типа имеют одну или две копии гена SMN2, пациенты со СМА II типа имеют три копии гена SMN2, и у большинства пациентов со СМА III типа обнаруживается три или четыре копии гена SMN2. Пациенты с IV типом заболевания могут нести от четырех до шести копий гена SMN2 (Feldkotter et al., 2002; Cusco et al., 2006). Понимание молекулярных основ патогенеза СМА позволило начать разработку подходов к лечению заболевания. Для ряда потенциальных препаратов для лечения СМА, а именно ингибиторов деацетилаз гистонов - вальпроевой кислоты, гидроксимочевины, фенилбутирата и других - была показана способность влиять на течение СМА путем стимуляции экспрессии гена SMN2 и восстановления корректного сплайсинга пре-мРНК гена SMN2, что приводит к увеличению уровня функционального белка SMN (Chang et al., 2002; Brichta et al., 2003; Brahe et al., 2005). Таким образом, число копий гена SMN2 рассматривается как генетический фактор, который может учитываться при прогнозе течения заболевания и предсказания эффективности лечения.

Значимость гена SMN2 для развития более легкой формы спинальной мышечной атрофии подтверждается также случаями бессимптомных носителей, которые являются гомозиготами по делеции гена SMN1, но имеют достаточно высокое число копий гена SMN2 (Prior et al., 2004). В то же время были обнаружены редкие случаи сибсов, в которых родные братья и сестры имеют одинаковые мутации в гене SMN1 и равное число копий гена SMN2, но разное фенотипическое проявление заболевания (Helkmen and Wirth, 2000). Также были выявлены случаи бессимптомных носителей заболевания с числом копий гена SMN2, соответствующим числу копий гена SMN2 у больных СМА (Swoboda et al., 2005). Данный факт указывает на то, что существуют дополнительные генетические, а также эпигенетические факторы, влияющие на тяжесть развития заболевания.

Исследование этих факторов является актуальным для изучения патогенеза СМА, а также для исследования влияния лекарственных препаратов на течение заболевания и поиска эффективного лечения СМА.

В предыдущих работах было выявлено влияние белков пластина 3 и профилина Па, а также замены c.859G>C в гене SMN2 на тяжесть СМА (Oprea et al., 2008; Prior et al., 2009; Bowerman et al., 2010). Но действием данных факторов может быть объяснено только ограниченное число дискордантных случаев СМА. Одним из возможных факторов, влияющих на тяжесть СМА, может быть изменение профиля метилирования ДНК у больных СМА. Изменения в метилировании ДНК ассоциированы с различными патологическими процессами. Так неоднократно сообщалось о значимых различиях в метилировании ДНК лейкоцитов у пациентов с различными формами рака и здоровыми

индивидуумами, что подтверждает возможность использования этого показателя в качестве биомаркера заболевания (Hsiung et al., 2007; Roupret et al., 2008). Достоверные различия в степени метилирования CpG динуклеотидов, расположенных около сайта начала трансляции гена SMN2, были выявлены у пациентов со СМАI и III типа (Hauke et al, 2009).

Таким образом, наряду с числом копий гена SMN2, характер метилирования геномной ДНК может быть важным фактором, модифицирующим тяжесть СМА.

Цель работы - оценить влияние числа копий гена SMN2 и профиля метилирования геномной ДНК на тяжесть спинальной мышечной атрофии. Конкретные задачи:

1. определить число копий гена SMN2 у пациентов со СМА I, II и III типа и сравнить данные по распределению числа копий для каждого типа;

2. проанализировать профиль метилирования геномной ДНК больных СМА с тяжелой и легкой формами заболевания и здоровых индивидуумов соответствующего возраста;

3. определить гены, профиль метилирования которых отличается у больных СМА и здоровых индивидуумов;

4. провести сравнение профиля метилирования данных генов у больных с различными типами СМА.

Научная новизна

В рамках данного исследования впервые была изучена частота встречаемости одной, двух, трех и четырех копий гена SMN2 на группе больных из России со спинальной мышечной атрофией I, II и III типа. Впервые на группе больных из России со спинальной мышечной атрофией исследована корреляция между числом копий гена SMN2 и тяжестью спинальной мышечной атрофии, и выявлены достоверные различия в частоте встречаемости двух, трех и четырех копий гена SMN2 у больных с I, II и III типом заболевания. Впервые при анализе индивидуумов со спинальной мышечной атрофией из России была подтверждена значимость числа копий гена SMN2 в развитии легкой или асимптотической форм заболевания.

Впервые на больных со спинальной мышечной атрофией был проведен полногеномный анализ характера метилирования геномной ДНК. Впервые было показано, что изменения в уровне метилирования геномной ДНК могут быть связаны с развитием и патогенезом спинальной мышечной атрофии. Впервые были выявлены достоверные различия в характере метилирования 40 генов у больных спинальной мышечной атрофией и соответствующих им по возрасту здоровых индивидуумов. Впервые было показано, что

изменения уровня метилирования регуляторных областей генов БЬС23А2, N00112, СИК2АР1 коррелируют с тяжестью СМА.

Теоретическая и практическая значимость результатов

Полученные результаты вносят вклад в понимание молекулярных механизмов, приводящих к гибели моторных нейронов при спинальной мышечной атрофии, и в разработку новых методов лечения данного заболевания. Гены, для которых были обнаружены изменения в уровне метилирования, могут рассматриваться в качестве факторов, модифицирующих тяжесть СМА, молекулярных маркеров для прогнозирования тяжести заболевания. Продукты генов с достоверными различиями в уровне метилирования связаны с регуляцией экспрессии генов, формированием микрофиламентов и микротрубочек, апоптозом, процессом локальной трансляции в моторных нейронах. Изучение характера метилирования геномной ДНК также важно для предсказания эффекта фармакологических препаратов, разрабатываемых для лечения СМА, многие из которых обладают ДНК-деметилазной активностью.

Проведенный анализ числа копий гена БМЫ2 у пациентов со СМА из России подтвердил корреляцию между числом копий гена БМЫ2 и тяжестью заболевания. Это позволило также усовершенствовать методы молекулярно-генетической диагностики при определении тяжести спинальной мышечной атрофии, проводимой в лаборатории пренатальной диагностики врожденных и наследственных болезней НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН. Каждый год обследование в лаборатории проходит примерно 30-40 семей с детьми, больными СМА. В настоящее время определение числа копий гена БМЫ2 проводится у больных СМА в качестве уточняющего анализа, позволяющего на 80% предсказать вероятность развития одной из форм СМА. Положения, выносимые на защиту

• Тяжесть спинальной мышечной атрофии у больных из России зависит от числа копий гена ЗМШ. Число копий гена БМШ может учитываться при предсказании развития типа заболевания.

• Сравнение профиля метилирования с помощью полногеномного анализа свидетельствует о наличии достоверных различий в характере метилирования геномной ДНК у больных СМА и здоровых индивидуумов соответствующего возраста.

• В ходе полногеномного анализа профиля метилирования отмечается понижение уровня метилирования регуляторных областей генов СНМЬ, БЬС23А2, СРК2АР1, ИРЬ9 и достоверное повышение метилирования регуляторной области гена АЯНСАР22 у больных спинальной мышечной атрофией в сравнении с контролями.

• Изменения в уровне метилирования регуляторных областей генов SLC23A2,

NCOR2, CDK2AP1 коррелируют с тяжестью СМ А.

Апробация работы

Результаты исследования были представлены в виде постерных презентаций на Европейской конференции по генетике человека (Гетеборг, 2010), на 28-ом Симпозиуме Эрнста Кленка по молекулярной медицине (Кельн, 2012), а также на VI съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010), конференциях Европейского общества генетики человека (Вена, 2009, Нюрнберг, 2012), VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009), 14-ая Санкт-Петербургской Ассамблеи молодых ученых и специалистов (Санкт-Петербург, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 4 статьи в журналах перечня ВАК, 11 тезисов отечественных и международных конференций.

Структура работы и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы, приложений. Библиографический указатель включает 246 источников, их низ 239 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 9 таблицами и 26 рисунками, содержит 2 приложения.

ГЛАВА 1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Клиническая картина и диагностика спинальной мышечной атрофии

Проксимальная спинальная мышечная атрофия (СМА) — это прогрессирующее заболевание, характеризующееся дегенерацией а-моторных нейронов спинного мозга и начинающееся с мышечной гипотонии, слабости, что в конечном итоге приводит к мышечной атрофии. Мышечная слабость развивается с мышц проксимальных конечностей, сначала мышц ног, затем мышц рук. Для отдельных пациентов со СМА может быть характерна фасцикуляция мышц языка. Мышцы лица и глазные мышцы обычно не поражаются. При электромиографическом исследовании пациентов со СМА наблюдается картина деинервации, потеря потенциала действия чувствительного нейрона, значительное понижение в скорости нервной проводимости. При гистохимическом анализе мышечной биопсии наблюдаются признаки деинервации скелетной мышцы, группы атрофических и гипертрофических мышечных фибрилл (Lunn and Wang, 2008).

В 1992 году Международным консорциумом по спинальной мышечной атрофии были определены основные критерии для подтверждения проксимальной спинальной мышечной атрофии (Munsat and Davies, 1992). В 1999 году были внесены небольшие изменения, согласно новым данным о заболевании. К критериям подтверждения СМА относят: симметричные парезы конечностей, поражение проксимальных отделов больше, чем дистальных, ноги поражены больше, чем руки. Исключающими кри