Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Жизнеспособность фрагментов мицелия почвенных микроскопических грибов в разных экологических условиях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванова, Анна Евгеньевна, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ИМ.М.В.ЛОМОНОСОВА _ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ_

На правах рукописи

ИВАНОВА Анна Евгеньевна

ЖИЗНЕСПОСОБНОСТЬ ФРАГМЕНТОВ МИЦЕЛИЯ ПОЧВЕННЫХ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ ГРИБОВ В РАЗНЫХ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЯХ

03.00.07 - микробиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук О.Е.Марфенина

Москва - 1999

СОДЕРЖАНИЕ

Введение...............................................................................................4

Обзор литературы

1. Вопросы оценки живого мицелия в почвах..................................................7

2. Особенности существования микроскопических грибов

в почвенных условиях...........................................................................13

2.1. Особенности развития и формирования колоний микроскопических

грибов в почвенных условиях..........................................................13

2.2. Причины возможной фрагментации мицелия грибов в почвах....................26

3. Рост и развитие колоний микроскопических грибов

на твердых питательных средах...............................................................30

3.1. Характеристика фаз роста "типичной" грибной колонии..........................31

3.2. Механизмы роста мицелия при развитии "типичной" грибной колонии......39

Экспериментальная часть

4. Объекты и методы исследования.............................................................47

4.1. Объекты.......................................................................................47

4.2. Методы исследования.....................................................................49

Результаты

5. Определение жизнеспособности фрагментов мицелия грибов.........................55

5.1. Влияние на жизнеспособность фрагментов мицелия и прорастание спор

микроскопических грибов различных способов обработки, используемых при подготовке к почвенным микробиологическим анализам.................55

5.2. Оценка жизнеспособности фрагментов мицелия

с использованием красителей..........................................................60

5.3. Определение величины жизнеспособного фрагмента гифы......................63

5.4. Зависимость жизнеспособности фрагментов мицелия

А. alternata от плотности закладки септ в гифах....................................66

5.5. Влияние экологических условий на жизнеспособность

фрагментов мицелия микроскопических грибов...................................69

5.6. Сопоставление уровня прорастания спор грибов и жизнеспособности

фрагментов мицелия в исследованном интервале

экологических условий.......................................................................................77

2

6. Особенности формирования микроколоний грибов из фрагментов

мицелия и из спор в разных экологических условиях...................................79

6.1. Формирование микроколоний из фрагментов гиф и из спор

в стандартных условиях культивирования...........................................79

6.2. Фунгистатический эффект при прорастании спор

и фрагментов мицелия........................................................................81

6.3. Влияние загрязнения кадмием на показатели роста мицелия...................91

6.4. Сроки спорообразования в микроколониях грибов................................94

6.5. Влияние экологических факторов на морфологию мицелия грибов...........95

7. Жизнеспособность фрагментов мицелия и спор микроскопических

грибов в почвенных условиях...............................................................104

7.1. Жизнеспособность спор и рост их них мицелия в почве........................104

7.2. Жизнеспособность фрагментов мицелия и их рост в почве.....................106

8. Обсуждение......................................................................................111

Выводы.............................................................................................124

Список литературы............................................................................125

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Почвенные микроскопические грибы - важные функциональные компоненты наземных экосистем. Именно почвенными грибами активно осуществляются процессы деструкции и трансформации органических, ряда минеральных веществ в почвах, что происходит благодаря развитой у грибов мицелиальной системе, адсорбционному типу питания, большому пулу экзометаболитов и т.д. [Аристовская, 1980; Звягинцев и др., 1992; Мюллер, Леффлер, 1995; Lynch, 1988; Rayner, 1988; Christensen, 1989]. В природе микроскопические грибы могут находиться в виде мицелия и спор. Особенности прорастания спор, феномен фунгистазиса, формирование из спор колоний грибов, кинетические основы роста - изучены достаточно подробно и в лабораторных и в некоторых естественных условиях [Мирчинк, 1988; Van Etten et al., 1983; Trinci, 1984; Lockwood, 1992; Prosser, 1993; Rayner et al., 1995; и др.]. Однако, и в природе, и при посевах на питательные среды развитие колоний грибов происходит не только из спор, но и из мицелия или его частей. Фрагментация мицелия грибов в почвах происходит в результате жизнедеятельности беспозвоночных животных [Козловская, 1984; Гузев и др., 1986; Dash et al., 1986; Lynch, Hobbie, 1988; Hedlung, Augustsson, 1995], роста корней растений, высыхания, замерзания, оттаивания почв и т.д. [Почвоведение, 1989], а также в лабораторных исследованиях при подготовке почвенных образцов к микробиологическим анализам [Методы ..., 1991]. Тем не менее, жизнеспособность отдельных фрагментов гиф, их дальнейший рост, закономерности развития из них колоний грибов - до сих пор фактически не изучены.

Цель работы. Изучение жизнеспособности фрагментов мицелия некоторых видов почвенных микроскопических грибов и особенностей развития из них микроколоний в ряде экологических условий для более полного понимания их роста в почве.

Задачи исследования:

1. Определение влияния фрагментации мицелия некоторых видов почвенных микроскопических грибов на жизнеспособность фрагментов мицелия разной длины в лабораторных и почвенных условиях.

2. Исследование влияния на жизнеспособность фрагментов грибного мицелия ряда экологических факторов (концентрации органического вещества, температуры, кислотности, загрязнения тяжёлым металлом).

3. Изучение особенностей развития мицелия из фрагментов гиф микроскопических грибов в зависимости от экологических условий.

4. Выявление специфики роста микроколоний почвенных грибов при развитии из спор и фрагментов мицелия.

Научная новизна. В работе впервые исследовано влияние фрагментации мицелия почвенных грибов на его жизнеспособность. Установлено, что жизнеспособность фрагментов мицелия зависит от 1) строения мицелия гриба; 2) начальной длины фрагмента; 3) экологических условий среды.

Для исследованных видов грибов определены размеры минимальных способных к росту фрагментов мицелия; введено понятие "критической величины фрагмента" - КВФ; показано, что величина минимального способного к росту фрагмента определяется строением мицелия (септированный, несептированный), плотностью закладки септ в гифах, зависит от способа фрагментации грибного мицелия и может увеличиваться в неблагоприятных условиях среды.

Обнаружено, что используемые в почвенных микробиологических анализах способы обработки образцов - ультразвуковое воздействие и взбалтывание на качалке - не одинаково влияют на способность к росту фрагментов мицелия и на уровень прорастания спор грибов, что может определять качественный и количественный состав учитываемых в посевах микроскопических грибов.

В ряде экологических условий установлено наличие явления фунгистазиса как при прорастании спор, так и при росте фрагментов мицелия грибов.

При вегетативном (из фрагментов мицелия) и бесполом (из спор) размножении на ранней стадии роста микроколоний грибов отмечены отличия в длительности лаг-фазы, экспоненциальной фазы роста, скоростях роста и характере ветвления растущего мицелия, которые в линейной фазе роста нивелируются.

Показано, что оптимальные условия для начала образования колоний микроскопических грибов при вегетативном и бесполом размножении могут различаться, так как жизнеспособность фрагментов мицелия и прорастание спор

грибов могут достигать наибольших значений при разном уровне проявления экологических факторов.

Практическая ценность. Данные о жизнеспособности фрагментов мицелия почвенных грибов и особенностях роста фрагментов гиф и спор - разных колониеобразующих единиц (КОЕ) - имеют методическое значение при выборе способа обработки образцов для почвенно-микологических анализов и интерпретации результатов.

Установленные закономерности формирования микроколоний грибов при вегетативном и бесполом размножении в исследованном интервале экологических условий дают более полное представление о развитии микроскопических грибов и судьбе фрагментов грибного мицелия в почвах.

Выявленные особенности развития микроскопических грибов могут использоваться при решении практических задач в целях биотехнологии для культивирования колоний грибов, развивающихся из разных КОЕ.

Материалы диссертации используются на факультете почвоведения МГУ им.М.В. Ломоносова при чтении курса лекций "Почвенная микология".

Автор выражает глубокую и искреннюю признательность своему научному руководителю ст.н.с., к.б.н. О.Е.Марфениной, приносит слова благодарности всем сотрудникам каф. биологии почв ф-та почвоведения МГУ, и особенно проф., д.б.н. Д.Г.Звягинцеву, проф., д.б.н., проф. М.М.Умарову, доц., к.б.н. И.П.Бабьевой, д.б.н. Г.М.Зеновой, к.б.н. А.В.Куракову, к.б.н. П.А.Кожевину, к.б.н. Б.А.Бызову, к.б.н. И.Н.Скворцовой, к.б.н. Т.Г.Добровольской, к.б.н. Л.В.Лысак за проявленный интерес и полезные советы в процессе работы над диссертацией, а также А.Семиколенных за помощь в подготовке иллюстративных фотографий.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ВОПРОСЫ ОЦЕНКИ ЖИВОГО МИЦЕЛИЯ ГРИБОВ В ПОЧВАХ

Для понимания процессов функционирования почвенной микобиоты, играющей значительную роль в глобальном круговороте веществ и естественной биотической регуляции окружающей среды [Аристовская, 1980; Почвенные организмы ..., 1984; Мирчинк, 1988; Звягинцев и др.,1992; Lynch, 1988; Rayner, 1988; Cristensen, 1989; The fungal community ..., 1992; и др.], необходима оценка разнообразия грибных организмов, их общей биомассы, биомассы активного мицелия, а также закономерностей развития грибов в почвах. Грибы создают в почвах значительные запасы биомассы. И хотя ее запасы по данным различных исследователей отличаются, очевидно, что биомасса грибов во многих почвах существенно превышает биомассу бактерий и составляет более двух третей от общей биомассы почвенных микроорганизмов [Мирчинк, Паников, 1985; Полянская, 1996; Lynch, Panting, 1980; West, 1986; Neely et al., 1991; Berg et al., 1998; и др.].

К настоящему времени разработан целый ряд разнообразных методов прямого учета, позволяющих оценивать биоморфологическую структуру биомассы грибов, то есть определять соотношение мицелия и спор [Методы..., 1991]. Это позволило установить основные закономерности распределения почвенных грибов в разных экосистемах, изучить содержание мицелия и спор в разных типах почв, под разными растительными ассоциациями, исследовать сезонную динамику грибной биомассы и т.д. [Мирчинк, Степанова, 1982; Демкина, Мирчинк, 1983(a), 1984; Егорова, 1986; Паринкина, 1989; Каратыгин, Нездойминого, 1994; Кирцидели и др., 1995,1996; Великанов, 1997; Microorganisms in ..., 1988; Kjoller, Struve, 1990].

Для характеристики роли грибов в круговороте веществ, понимания особенностей развития этих организмов в почвах необходимо иметь представление о доле жизнеспособного мицелия, так как создание основных запасов биомассы, процессы трансформации веществ, образование метаболитов и т.д. осуществляются в почвах именно мицелием грибов.

Долгое время количественное содержание грибов в почве характеризовали по

числу колоний, вырастающих на агаризированных питательных средах при посеве почвенной суспензии. При подготовке почвы к анализу для десорбции микроорганизмов с поверхности почвенных частиц используют ряд предварительных обработок почвенных суспензий [Методы..., 1991], благодаря которым происходит дезагрегация грибных колоний и грибной мицелий разбивается на относительно близкие по размерам фрагменты [Звягинцев, 1987]. В результате, грибные колонии на питательных средах могут развиваться из жизнеспособных фрагментов мицелия, из спор, а также из групп спор или комочков мицелия. Количественный учет при этом носит достаточно условный характер, так как данным методом не представляется возможным оценить колонии грибов, выросшие из фрагментов мицелия, и колонии, развившиеся из спор. Предполагается, что при таком методе анализа, грибные колонии развиваются преимущественно из спор. Насколько сохраняется при фрагментации жизнеспособность кусочков мицелия - до сих пор оставалось не выясненным.

За последние десятилетия предложен целый ряд прямых методов определения живого и мертвого мицелия в почвах. На наш взгляд, самым простым подходом к определению живого мицелия грибов в почве является определение его способности к росту. «Способность грибов к прорастанию можно рассматривать как показатель их жизнеспособности»[Мирчинк, 1988].

Определение способности к росту лежит в основе ряда методов оценки активного мицелия грибов в почвах. Одним из таких методов является метод почвенных камер, предложенный академиком Н.Г.Холодным [1949, цит. по Новогрудский, 1956]. Из подлежащей исследованию почвы готовится небольшая квадратная (18x18 мм) пластинка почвы с цилиндрической полостью (диаметром 4 мм) посередине. Препарат инкубируется во влажной камере и «скоро внутрь его начинают врастать различные микроорганизмы, которые частично располагаются по поверхности покровного стекла». Предполагается, что при этом улавливается именно активный мицелий грибов, а не споры, которым необходимо время для прорастания. То есть метод почвенных камер дает представление о присутствии жизнеспособного мицелия грибов в почвах в конкретный промежуток времени.

Позже предложен и ряд других, основанных на аналогичных подходах

способов выделения и идентификации грибов, находящихся в почвах в виде активного вегетативного мицелия - это трубки Честерса, стёкла Торнтона [Звягинцев и др., 1980], и другие методы. Например, при помещении комочков почвы на край стерильного покровного стекла в чашках Петри с агаризированной средой активные гифы грибного мицелия первоначально (1-2 суток) растут по стеклу, а затем достигают питательной среды, где происходит образование колоний, которые просматривают и пересевают для видовой идентификации грибов [Марфенина, 1990]. Однако, долю живого мицелия в почвах данными методами учесть невозможно.

Д.М.Новогрудским был предложен количественный учет грибов по методу высева мелкозема [1956]. Частички мелкозема равномерно распределяют по поверхности агаровой пластинки, инкубируют при 20-25°С, и через 1-2 суток после посева проводят учет. В приготовленных по определенной методике агаровых дольках при помощи микроскопа подсчитывают число почвенных частиц с развивающимися грибными гифами. В данном методе «учитываются только быстро растущие виды грибов, находящиеся в активном состоянии».

Для оценки имеющегося в почве жизнеспособного мицелия грибов интересен метод проращивания грибных пропагул на препаратах [Полянская и др., 1995]. Приготовленные в виде капель обработанной ультразвуком почвенной суспензии и помещённые на предметные стёкла препараты для подсчёта общей биомассы грибов методом люминесцентной микроскопии не фиксируют, а помещают на 2 суток во влажную камеру (при 28°С). Затем препараты высушивают, фиксируют и окрашивают. О прорастании спор судят по наличию ростовой трубки, а о прорастании мицелия - по удлинению и образованию боковых гиф. Согласно этим оценкам, большая часть грибной биомассы, даже в нижней части почвенного профиля - жизнеспособна. Так, количество жизнеспособного мицелия составило от 50% в нижних почвенных горизонтах (кроме нижнего горизонта бурозема) до 85% в верхней части профилей почв.

Однако, эти данные, показывающие высокий уровень жизнеспособного мицелия для разных групп почвенных грибов, отличаются от данных, полученных другими методами, приводимых ниже.

Большинство современных методов определения живого мицелия грибов в почвах основано на отличии в прокрашивании живого и мёртвого мицелия

разными красителями [Мирчинк, Паников, 1985; Cohen, 1984; и др.]. Однако при использовании различных методик окрашивания получают часто различающиеся данные.

Наибольшей популярностью до настоящего времени пользуется метод измерения метаболитически активной грибной биомассы с помощью окрашивания красителем флуоресцеин диацетатом [Stamatiadis et al., 1990; Newell, 1992]. Метод был предложенный более 20 лет назад [Söderström, 1977], и основан на том, что ФДА представляет собой флюорогенный субстрат, флюоресцирующий лишь при гидролизации живого вещества. Выявляя только живые, обладающие эстеразной активностью клетки грибного мицелия, ФДА не окрашивает фон, что позволяет широко использовать данный краситель в почвенных исследованиях [Мирчинк, Паников, 1985; Ingham, Klein, 1982; Cohen, 1984; Baath, Söderström, 1988; Morgan et al., 1991]. Оказалось, что лишь очень малая часть от всей грибной биомассы — 2,44,3% - проявляет ФДА-активность: например, в дерново-подзолистых почвах под хвойными лесами Швеции ФДА-окрашенные гифы составляли не более 10% от всего грибного мицелия [Söder