Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Зеленый флавопротеин из Photobacterium leiognathi - очистка, свойства и принадлежность к люминесцентной системе

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Зеленый флавопротеин из Photobacterium leiognathi - очистка, свойства и принадлежность к люминесцентной системе"

АКАД5ШЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

На правах рукописи УДК 577.3:577.158.54

Райбекас Андрей Альбертович

ЗЕЛЕНЫЙ ОЛАЕОПГ-ОТЕШ ИЗ РШСОВАСТЕЫим ЬЕХОСМАТЩ . ОЧИСТКА, СВОЙСТВА И ПРИНАДПЕЕНОСУЬ К ЛШИНЕСЦЕНТКОЙ СИСТЕМЕ

03.00.02 - Биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук '

Красноярск - 1990

Работа выполнена в Институте биофизики OQ АН СССР

Научный руководитель: член-корреспондент АН СССР,

профессор И.И. Гительзон

. <

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор В.М. Гольд .

кандидат биологических наук H.A. Тюлькова

Ведущая организация - Институт биохимии АН УССР

Защита состоится ^рс^Ся^а 199/; г. в / г~

часов на э асе да" ии Специализированного Совета Д 003.45.01 по защитам диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Институте биофизики ГО АН СССР (660036, г.Красноярск, Академгородок).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО АН СССР.

Автореферат разослан '¿^У" 1990г.

Ученый секретарь Совета кандидат физ.-мат. наук . \J(!L<-иЛ ' . Л.Г. Косолапова

JQj

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Излучение света живши организмами - широко распространенное явление. Среди организмов, обладающую способностью к биолюминесценции (бактерии, водоросли, кишечнополостные, мол.оски, грибы, черви), наиболее иатзнсивио изучались и изучаются светящиеся бактерии в силу юс простейшей клеточной организации и возможности крупномасштабного культивирования в лабораторных условиях... Тем'не^менее, на сегодня исслё-дования люминесцентной системы бактерий находятся лииь на начальном атапе. Видимо,это связан^ с тем, что большинство работ было посвящаю изучению центрального фермента, катализирующего билю-минесцентную реакцию - бактериальной лгоциферазе, субстратами которой ia vlLro являются длинноцепочечный алифатический альдегид, восстановленный флавинмононуклеотид и молекулярный кислород. Установлено, что томимо поци^еразы в состав люмкнесцет.лой системы входит комплекс рерук^азы ж"рной кислоты, состоящий из трех различных субъединиц, который осуществляет наработку альдегидного субстрата для биолюминесцентной реакции. Что касается фла-вкнового субстрата, то по-прежнему нет данных о метаболическом пути его синтеза, и восстановления in -Ivo. Несмотря н_ высокую специфичност:. in vitro люциферазы к восстановленное í^i t отсутствуют прямые доказатель; tlí его идентичности флаЕ::новому субстрату in vxvo . К люминесцентнс.: системе Photobacterium относят и люмазиновый белок, который ia vitro сдвигает спектр биолюминесценции в голубую область, близкую к а-.алогичному "лект-ру in vivo , однако вопрос о его участии Есе ещь остается открытым. В последние годы успешное .использование методов генной инженерии позвол,шо расширить наши представления о люгчнесцент-ной системэ бактерий. Оказалось, что гены комплекса редуктазы жирной кислоты и люциферазы локализованы в 1м области и подчиняются единому регуляторному механизму. У ibrio harveyi и Vibrio fiseheri организация структурных.генов lux области . выглядит гак: lux с^аВЕ , где гены CLü - эдируют лште > по-

липентидов редуктазы жирной кислоты, а AB - субъедгаищ люци-форазц. Lux область rhotobacteriua phosphoreuip выглядит соответственно как cd/vbíe и отличается наличием дополнитель-ИОРО lvx í гена. У Photobacterium leiognath. , за lux В также был обнаружен и секвенирован аналогичный ген lux G(N; . Наличие дополнительного lux гена является на сегодня основным отличием в организации структурных lux генов Photobac-torium л Vibrio. Таким образом, только для двух компонентов (лю цифер аз а и комплекс редуктазы жирной кислоте) окончательно доказана их принадлежность к люминесцентной системе бактерий.

Установление истинных компонентов люминесцентной системы, ее структурная организация и связь с Общим метаболизмом бактерий важно на только в фундаментальном, но и прикладном аспекте, поскольку успехи в данной области позволят существенно расширять возможности для подбора и создания индикаторные тест-систем в биолюминесцентном микроанализе.

Целья работы было исследование зеленого флавопротеина и установление его связи с люминесцэнтной системой Photobrcterium leiognathi.

Задачи работы включали:

1. Разработку метода шделения и очистки зеленого флавопротеина из бесклеточных экстрактов Photobacterium leiognathi .

2. Исследование свойств белка к его хромофора.

3. Установление принадлежности белка к люминесцентной системе Photobacterium leiognathi.

Научная новизна и практическая ценность.

I., Разработал метод очистки зеленого флавопротеина из бесклеточных экстрактов Photobacteríuo lei„gnathi хроматог-рэфическимй методами до гомогенного состояния.

?.. С помощью хтоматографии и электрофореза определены молекулярная масса и изоэлектри^5ская точка белка. Показано, что натившй белок защищен от действия таких протеаз как трипсин и химотрипсин. Белок содержит флавиновый хромофор, который прочно, ио нековалентно связан с анобелком. Помимо основной формы, балок существует ещь в двух изофорыах, котгрыг различаются га заряду и спектру поглощения. Хромофор белка обладает необычны-

ми'гидрофобными свойствами и, следовательно, отличается по структуре от иЕвестных природных фиавинов. Кроме то:.о, он содержит фосфатную группу и, вероятно, является аналогом фла-винмононуклеотида.

■ 3« Определена. N - концевая последовательность 23 аминокислот белка, которая полностью совпала с соответствующей последовательностью, кодируемой 1чх геном РЬо1;оЪа<^ег1ит lfci.oen.athi.

Полученные результаты дащт практические возможности для' использования белка в системах, основанных на создании искус-стве1!ных цепей1 переноса электронов.

Апробация работы. Результаты работы- докладывались на советско-шведском семинаре "Современные методы разделения и характеризацш белков и пептидов" (Новосибирок, 1989) и нр 1-й международной школе по биологической люминесценции (Польша, 1989). По материала!/ диссертации опубликована I ст&?ья и 2 препринта. .

Со^ердание и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного листа и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения результатов работы, заключения, выводоа й использованной библиографии ( источников).

Диссертация иллюстрирована 24 рисунками и 3 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОД! ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили светящиеся- б актер/,и РЬойо-Ъасгег1тап 1э1оепа1:Ь1 , штамм 208 из коллекции Институ-

та биофизики СО ЛН СССР.

Биомасса .светящихся бактерий Р. 1010,311^ , вы-

ращенная в стандартных условиях {Воробьева.и др., 1980), была получана от сектора биотехнологии Института. Клетки бактерий разрушали методом замораживания-о^гаивакия. Обложи .клеток осаждали центрифугированием. Полученный экстракт фракционировали сульфатом аммония в диапазоне от 40 до 80% насыщения. Дальнейшая очистка белка вклачала четыре стадии: I) препаративную гель-фильтрацию на колонка с сефадексом 3-75 ;

2) гидрофобную хроматографию на колонке с фенилсефарозой ;

3) гель-ф..льтрацию на колонке с ультрогелем АсА 44 ; 4) хрома-■играфт на антюобиенуой колонке MornQ (система íplc ).

Количественное содержание белка после каждого jara очистки определяли ш методу Брэдфорд ( Bradford , 1976). Процесс очистки бе л.л контролировали спет;тро фотометрически и при помощи sj)S -электрофореза (ЭЗ) в 12,5% полкакриламидном геле (ПААГ) ( Lsammli , 1974). • • •

Молек! .шрную массу нативного белка определяли ге/ -фильтрацией на колонке Superóse 12 (FPLC).

Моле1сулярную массу в денатурирующих условиях определяли миграцией белка ь течение sus - Э$ в IZ,5% ПААГ относительно стандартных белков.

Ияоточку белка определяли иэоэлектрофокусированием на Phast System (Phart. icia).

Хромофор изолировали от белка с помощью этанола, Очистку хромофора проводили хроматографией с обращенной фазой на колонке РерЕРС' (í'PLC) i градиенте ацетонитрила.

Хромофор идентифицировали по его относительной подвгадости при: а) хроматографии с обращенной фазой; б) тонкослойной хромате -"рафии.

При г-еолитическое расщепление. белка с помощью трипсина и хи-..ютрипсина прободили согласно (Уилкинсон, 1989), Процесс расщепления контролировали ■ BD3 - ЕФ в L5% ПААГ.

Спектры поглощения белка и хромофора записывали на спектрофотометре uv-3-O (Shimadzu). Спектры фчуоресценции хромофора записывали на спектрофлуориметре F-4000 (Hitachi).

N - концевую аминокислотную последовательность белка определяли при помощи пептидно-белкового секвенатора 477 A (Applied BioBjatems) и анализатора ФТГ- .фоизв^дных аминокислот (той

не фирмы1,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ¿ВСУВД&ШЕ

Получение очищенного белка из бесклеточного экстракта .leiopnathi___. Очистка зеленого фчавопротеина

- б -

Таблица I

Параметры очистки 5?Р

СТАДИИ ^28О/см А440/см АЙЗО"м"¿мл степень

.белок Аф|0 ^440 очистки

фращиониро вал ие

сульфатом аммония 2632 132.0 3.4 . 38.8 II.0 . . «

Сефадекс G-75 801 4.3 0.2 21.5 18.2 3

Фенилсефароза 180 0.8 0.1 s.o S.4 15

Ультрогель АсА 44 54 4.5 0.6 7.Ь 5.6 49

Moho Q IO/IO 12 2.2 0.8 2.7 а.з 219

(green иауорвотвш ', off ) состоит из пятя этапов. Параметры очистки приведены в таблице I, На первой стадии (фракционирование сульфаток ш'монил) удаляются плохорастворимые белки, липопротеи-ны и низкомолекулярные вещества. На второй стадии (сефадекс) удаляются" высокомолекулярные (свыше 100 ООО) и низкомолекулярные (ниже 25 0С0* белки. Последние включают цитохрош и фрторесцент-ный флавопротеин (Рай^екас, Петушков, 1983), присутствие которого затрудняет спектральную идентификацию GE? . Следующая стадия . . включает гидрофобную хроматографию нг ■1енилсефарозе. и позволяет эффективно отделить gfp от люциферазы. Дело в том, что белок имеет сходство с люциферазой помолекулярной массе и заряду, что существенно затрудняет его очистку методами гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. Хроматография на фенилсефарозе позволяет преодолеть ото препятствие. На четвертой и пятой стадиях использовались соответственно гель -фильтрация на ультрогеяз АсА 44 ионообменная хроматография на Moho Я. . Очищенный белок ло результатам SDS -электрофореза в полиакриламвдгом геле является гомогенным и при окраске (СВВ H - 25С) дазт только одну полосу (рис.1). -

Свойства белка и его хропфора, ( Ggp chromephore,GPPC).

I. Молекулярная масса Сзяка, определенная гель-фильтрацией в нативных условиях, 51 -ООО, a. sos - электрофорез d ПААГ дает

Рис.1. БОБ -электрофорез в 12,55? ПААГ: 2,4,6 - образец после I стадии очистки (сы.табл.1); 3,5,7 - образец после стадии Моноя ; 1,8 - белки-маркеры

-5

Рис.2. .Спектр поглощения окисленного GFi' (3,5 х 10" М) е 0,02 М растворе Tris HCl • , рЧ 7,5 с 0,3 М N&31. Для снятия слектра в области от 300 нм и ниже образец был разведен в два раза.

одйу полосу на 27 ООО (рис.1). Следовательно, белок состоит ' "из двух идентичных субъединиц, t.j. является гомодх. зром.

2. Изоэлектрическая точка белка, определенная с помощью изоэлектрофокусиров? яя, лежит в кислой области (.4,5), характерной для глобулярных белков.

3. Белок содержит флавиновый хромофор и имеет характерный спектр поглощения с максимумами 268, 383 и 439 нм (рис.2). Коэффициенты экстинкции чистого белка для указанных длин; волн соответственно равны 80, 24.8 я 23.1 мМ""* х см~*. Белок не содержит гем поскольку полоса Соре отсутствует в спектре поглощения между 400 и 420 нм. ,

Все флавопротеины характеризуются определенными максимумами в видимой области их спектров поглощения, благодаря присутствию флавинсвых хромофоров (рибофлавина, И®, или ). Первый максимум лежит в области 370-380 нм, а второй - 440-460 нм. Коэффициенты экстинкции для указанных длин волн у флавопротеи-нов яарьируют в достаточно узком диапазоне от 9 до 13 мМ~* х и соответствуют соотношению одге белок-один хромо;"op ( Ghisla et al., 1974 )• Полученные для gep величины коэффициентов экстинкции примерно в две раза выше и это объяснимо если учесть, что белок является го мод имер^м и кавда.; йз субъ^дишп, вероятно, несет хромофср. Следовательно, на одну молекулу белка прг-одится две молекулы хромофора.

4. Хромофор прочно связан с апоб гам и не диссоциирует при обработке Ъ% раствором трихлоруксусной кислоты или 5 М мочевиной. Нэ эта связь не является ковалентной, поскольку :ш освобождрется в б М растворе гуанидинхлорида, этаноле, а также г^и температур' ном (ЮОаС). воздействии.

Одной из особенностей фяавопротеинов является характер связи между белком и хромофором. Чаще всего это водородные связи, которые возникают между пиримидиновым кольцом флавина и гидрофильной поверхностью флавин-связывающего сайта лпобелка ( Ghisla

and Massey, 1986; 1989 ). Некоторые фвдодоксины содержат доу-таточно слабо связагн^й хромофор и дисс^цпир. зт на НЯЯ н апо-бэлок при их обработке Ъ% раствором-трихлоруксусной кислоты. С другой стороны, существугт ф^авоп^. теины, у которых флавин кова-лентио присоединен к белку. Примером монет служить сукцинатде-

- q -

I 2 3 4 5 6 7 .8

Рис.3. SDS -электрофорез в 1Ь% ПААГ. Деградация после

двух часовой инкубации с трипсином: ' I - белок + фермент (Ю0:1) + Q,l% sds ; 2-6 - то же, что и (I) + Т(Ю0°С) с инкубацией в течение 15/5,60,90 и 105 сек ; 7 - белок + 0,1$ SDS + Т(Ю0°С) с инкубацией в течение 105 сек ; 8 - белки-маркеры

Рис.4. Спектр поглощения окисленного GFPC в 0,02 М iris HCl, pH 7,5 с 27% ацетонитри.;а. Для скят»л спектра в области ниже 300 нм раст вор с образцом быт. разведен в два раза.

гидрогенаэа - мембраневязанный белок, в молекуле которого находится присоединенный ковалентно флавинадзниадицуклеотцц

£ pad ).

5. Нативный белок защищен от воздействия таких протеаз, как трипсин и хймотрипсин. Лишь после соответствующей обработки (Ю0°С и 0,1% SDS ) с последующей двух часовой инкубацией происходит неполный протеолиз gfp трипсином с образованием крупных полипептидных фрагментов в области 25 ООО и 10 ООО, а также набора мелких пептидов (рис.3). При аналогичных уело г :ях обработки химотрипсином происходит подавляющая деградация белка с образованием фрагментов от 6 ООО и ниже.

Известно, что люциф'раза быстро ииактивирупод воздействием различных протее-j ( НЗио et al.,'1974- ). Скорость инактивации люцифе^азы параллельна деградации альфа-субьедини'щ, которая из полипептида молекулярной массой 42 ООО деградирует на полипептид в 28 ООО и несколько мелких фрагментов. Однако, также н^к и gfp , бзта-субьедкница нз подвергается воздействию протеаз при неденатурирующих условиях ( Baldw'.n, 1974 ). Это несомненно важное, характерное для обоих белков ссойство, которое, пзможно, является следствием нз только высокой гомо-> логии мелщу gfp и бета-субъединицзй Аюцифвразы (см.нже), но также близостью их третичных структур.

6. Спектр поглощения очищенного хромофора g?f (gfpc) имеет характерные максимумы 266 , 389 и 441 км (рис.4) и отличг. ется от спектров поглощения известных природных флавкнов (максимумы поглощения для 3?*'Ч - 373 , 445 нм и fad - 375 , 450 нм).

7. Хромофор обладает ярко выраженными гидрофоб.ааш свой-г.твамй и, следовательно, от'ччается по структуре от изкестнцх природных флавиНов. Оо этом свидетельствуют данные о его подвижности относительно стандартных флавкнов при тонкослойной хроматографии (ТСХ) и хроматографии с обращенной фазой (табл.

2 и 3). Эти свойства определяют неподвижность хромофора при ТСХ б системе с : . полярным элюентом {Ъ% раствор динатр.-Лгидрофосфа-та) и время удерживания, характерное для сильно г'-црофобных .

- IJ. -

_ . _ТУблица 2 Значения относительной подвижности (В^ ) еп?с при тонкослойной хроматографии на силикагельных пл стинах

подвижная фаза флавнн-------;------

I 2 3 4

ЙГРС 0.00 0.24 С.52 0.76 '■

рибофлавин 0.38 0.60 ■ 0.64 . 0.76

РЫК 0,63 • 0.05 • 0.45 0.63

Ш> 0.69 0.12 0.22 0.54

1-5% еодный раствор динатрийгидрофосфата; 2 - и-бутанол-эта-нол-вода (4:1:1); 3 - н-бутаиол-уксусная кислота-вода (4:1:1); 4 - н-бутанол-укс.кислота-вода (2:1:1) "

Таблица 3

Поведение йгРС при хроматографии с обращенной фазой на колонке РорЕРС С^/С^ в линейном градиенте ацетонитрила от 0 до 7ОЙ •

йГРС рибофлавин ЕН> ГШ

Т удерживания, мин 10.5 6,3 3.2

600 5S0--

дпт eoxsx ( кн )

Рис.5. Спектр флуоресценции gfpc в 0,02 М раствора Trie ("Ji, рН 7,5 с I2S& -идетонитрила. Возбуждение на 440 нм.

I: 2 3

Рис.6. Действие щелгчной фосфатазы на. структуру сетс.

Тонкослойная хроматография с подвижными фазами: А -н-бутанол - этанол - вода (4:1:1), Б - 5% раствор динат-рийгидрофосфата. Образцы: I - ГШ ; 2 - СТРС , .обработанный фосфатазой ; 3 - сррс • -контроль ; 4 - ри5офлавин.

А

соединений (например, липидов) при хроматографии с обращенной фазой.

9. Спектр флуоресценции хромофора типичен для фяавинов и имеет макетам 525 на (рис.5). Интенсивность флуоресценции йи-с составляет 10—13% от интенсивности флуоресценции нш , при их приблиэ"тельно равной концентрации, исходя из экстинк-ции на 440 нм. Эти данные также указывают на имеющиеся структурные различия между йЕРС и вин.Известно, например, что каВ обладает уровнем флуоресценции на порядок ниже по ерэч-нению с идо или рибофлавином, тушение которой происходит'за счет присутствия аденина в его молекуле.

9. Рис.6 иллюстрирует, действие щелочной фосфатазы на структуру хромофора. Известно, что фосфатазы катализируют гидролиз фосфорных офчров с образованием неорганического фосфата. Среди природных флавинов только содержит эфир фосфорной кис-

лоты. Из рис. видно, чг о под воздействием фосфатазы резко меня-, ется подвижность хромофора и, следовательно, происходит отщеп- • ление фосфатной группы (рис.6а). Тем не мене , ее действие не влияет на гидрофобные свойства хромофора (рис.66). Таким образом, оррс , вероятно, является аналогом флавинмонону; леотида и исходя из данных, изложенных выше, содержит гидрофобный .(возможно, липидный) заместитель.в одном из голоданий иэоаллшсса-зинового кольца уьш .

Выделение и некоторые свойства изомерных форм белка. Несмотря на то, что при хроматографии на фанилсефарозе эффективно отделяется от люциферазы, последняя содержит его примеси, возможно . вследствие белок-белковых взаимодействий. Дальнейшая очистка люцифоразы на глион^обменной колонке Коно§ приводит к появлению трех фракций белка (рис.7). Третия фракция (37-39), котор"я олюируется с колошей за люциф^раэой, является огР , а первая (27-29) и вторая (31-33) содержат его изомерные формы, соответственно СЕР-1 и- й1-Р_2, Белки имеют различия 1 ! только по заряду, благодаря чему они разделяются на ионообменнике, но и по спектру поглощения (рис.8). Интересно отметить, «то спектр поглощения йгр -I наиболее близок спектру поглощения хромофора игр , а й?р -2 по спектру занимает про-

28 32 38

Рис.7. sds - ЭФ в 15% ПААГ последовательных фракций, элюи-рующихся с колонки Mohoq: 27-28 - gfp- I ; 31-33 -Gît _ 2 ; 37-39 - gfp ; 28-33 - люцифераза.

длина волны (нм)

Рис.8. Спектры поглощения GFP и его изомерных форм GFP — I (---) И GFP-2 (...) е ^,02 М растворе Tris HCl , pH 7,5 после гее разделения и дальнейшей очистки на колонке ,.!оноЭ,.

межуточное положение между Gïp. и ' gfp -I. Эти данные указывают на различия кежду бэлками :в конфсрмации флавинсвязыва-ицих сайтов. Чем же обусловлено многообразие форм белка? Изменения в. данном случае возможны либо на уровне хромофора как следствие участия белка в неком метаболическом процессе, либо они затрагивают первичную структуру белка. Сравнительный анализ при помощи ТСХ не выявил каких-либо различий между изолированными хромофорами GFP , GFP -I и gïp -2. Однако, ТСХ не позволяет выявить тонкие различия в структуре хромофоров в особенности если они не затрагивают непосредственно иэоаллок-сазнновое кольцо. Поэтому, предположение о том, что появление изомерных форм белка, возможно, связано с изменениями в структуре, его хромофора остается в силе.

Идентификация белке с продуктом ltre в(Ю • гена. Выше доминалось о том, что основным отличйам в организации структурных lux генов Vibrio И Pho^cbacteriua является присутствие у последних дополнительного lux гена. . На рис.S изображена определенная у GFP N - концевая поеледо- ' вательность 23 аминокислот. Она полностью совпадает с соответствующей последовательностью, кодируемой lux G(H> геном P.leiog-nathi . Эти данные однозначно показывают, что lux G(N) ген

кодирует синтез gfp . • Таким образом, зелены'' флаво про теин яв-

__ __

МЕХ - НЕ - LYS - ТЕ? - ASI - ТШ - GLY - YÂL - И5Н - РНЕ -

МЕТ - THR - LYS - TRP - ASH - TYR - GLY - VAL - РНЕ - РНЕ -

11

' LEU - ASI - РНЕ - TYP. - IIIS - ЧЬх. - GLY - Ш1 - GUI - 6LÜ -

LEU - ASM - РНЕ - TYR - HIS - VAL - GLY - GLU - GLN - ÜLU -

21

. PRO - SER - LEU -

РЧО - SER - LEU -'THR - MET - SER - ASM - ALA - LEU - .....

Рис.9. n - концевая последовательность 23 аминокислот gît.

Ниже приведена соответствующая последовательность аминокислот, кодируемая 1чх J(H) геном (Illarionov et al.,

1988).

ляется структурным компонентом люминесцентной системы Photo-bacterium lelognathi. Исходя из дачных сравнения аминокислотных последовательностей ьелок имеет высокую (болеч 30^) степень гомологии с бетаусубьединицей лтоциферазы, а это означает, что gît и люцифераэа - родственше белки. Однако, в отличие от люди "ере-зы, GFP имеет два, присущих только ему, сайта: сайт связывания необычного по структуре флавина и сайт, определяющий связывание субъединиц белка в гомадимер.

вывода

1. Разработан метод очистки зеленого флавопротеина из p.lei^gnathi до гомогенного состояния.

2. С помесью хроматографии и электрофореза, что белок имеет молекулярную массу около 54 ООО и состоит из двух идентичных субъединиц. Определена изоэлектричаская точка белка, которая лепит в районе 4,5.

3. Показано, что натнвный белок запущен от действия таких протеаз как трипсин и химотряпсин.

4. Белок содержит флавиношй хромофор, который прочно, ко кековалентно связан с апобелком. В видимой области белок тлеет характерный спектр поглощения, который отличается ог спектра поглощения его хромофора. В свою очередь спект-* поглощения хромофора отличается от спечтров поглощения известных природцавг флавино-.

5. Показано, что помимо основной формы, белок существует еще в двух изоформвх, ксторые отличается по спектру поглощения ч заряду.

6. Хромофор белка обладает необычными гидрофобными свойст -вами в отличие 6т известных природных флавиков. Кромэ того, он содержит фосфатную групяу и, вероятно, является аналогом флавиюга-нонуклеотида. Спектр флуоресценции хромофора тшичен для флавиков, однако ее интенсивность на порядок нгске по сравнению с интенсивностью флуоресценции фяавинмононуклэотида,

7. Определена Н « концевая последовательность 23 аминокислот белка, которая полностью совпала с соответствующе^ последовательностью, кодируемой lui G(n) геном P.leiognathi . Таким образом, зеленый флавопротеин являеггя продуктам tus с.(Я) гена и, следовательно, структурным компонентом люминесцентной системы Photobacterium Laiognathi.

Основные положения диссертации опубликована в следующих работах:

1. Райбекас A.A., Петушков В.Н. Флавопротеииы светящихся бактерий Phot obact er tum lelognathl : выделение и свойства..-Препринт №91 Б, Красноярск: Изд-во И CG АН CGC", I9é8, с.32.

2. Райбекас A.A., Петупков В.Н. Выделение и сравнительное изучедие 'Двух флуоресцентных флавопротергов из светящихся бактерий Phctobacteriua leiognathi Биофизика, 1990, т.35, вып.2,,

с.386-388.

3. Райбекас A.A. Зеленый флавопротеин из светящихся бактерий Photofcacterium leiognathi : очистка, свойства и идентификация с lus G(N) геном,- Препринт И2б Б, Красноярск: Иэд-ео ИБФ СО АН СССР, 19^0, с.35.

Подписано к печати 6.II.90 г. .

Уч.-изд.л. I. Тир. 100 экз. Зак.560

660036 Красноярск, Академгородок, Инсаитут 'изики СО АН СССР