Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Зависимость выхода структурных перестроек хромосом от времени после облучения в трех последовательных поколениях клеток китайского хомячка

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Зависимость выхода структурных перестроек хромосом от времени после облучения в трех последовательных поколениях клеток китайского хомячка"

РГБ ОА

1 П АПР Ш5

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В.Л0М0Н0С08А

Биологический факультет

На правах рукописи

КУДРЯШОВА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

ЗАВИСИМОСТЬ ВЫХОДА СТРУКТУРНЫХ ПЕРЕСТРОЕК ХРОМОСОМ ОТ ВРЕМЕНИ ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ В ТРЕХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬ! (ЫХ ПОКОЛЕНИЯХ КЛЕТОК КИТАЙСКОГО ХОМЯЧКА

03.00.01 - радиобиология

Авторе ферат диссертации "а соискани»! ученой степени кзнд:!дата биологкч^сих >'аук

Месим - ""•"•5

РаЛота выполнена в Медицинском радошлогическом научном центре PAVCi.

'Научный, руководитель:

кандидат биологических наук, отвркяй научный сотрудник ХлоЛа A.A. t

Официальные оппоненты:

доктор <5иологи"исюи наук Cicioto A.C.

доктор биохоглчьсюи наук, профессор Шевченко В.А.

Ведущая организация: Медико-генетический научны! центр ГАМН

Защита состоится «JS* 1995 г. в « » часов на

эисодашш длссортадиошюго ^сопота Д.053.05.74 по защитам даосортацкй в Московском государственно» университете но адресу: ПГЮ39, г. Москва. Ленинские торы, Биологический факультет, пуддтг>рия ...

С диссертаций можно ознакомиться в оиолвотеко Биологи-чоск'ич! факультете МГУ'.

Автореферат разослан 1995 г. '

Учшшй гикротярь да '.ссс р т п 1Сюш юг о совета доктор биологических наук, профессор

Кояьс

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы, широкое вовлочошю ндорнмх технологий в повседневную жизнь привело к росту практического значения прогноза отдало шаге послодств^ радиационного воздействия на биологические объекта. Радиационное поражение меток к организма в целом представляет собоП слоаяшЯ многоступенчатой нроие'ч:, ¡язвивакхцийся во времени и приводящий! к цепи собнтий, кпадок из которих может оказать существенное влияние па тследуюдую судьбу организма. Закономерности реализация рядаационио-инлуЦ'фс'-ватшх повреждения во времени явллэтся теоретической основой для практических выводов о последствиях радиационного газдойст-вия. Изучение этих зависимостей - одно аз ^сновгшх направления исследований почти всех разделов радиобиологии, в том числе и радиационной цитогенетики.

За года, прошедшие с начала подобных работ, в цатсгенетяке бил достигнут 'значительный прогресс. Первоначально сущчстглпав-аее представление о необратимости персичних неправде ниа. отзываемых радиацией, и их тождественности наб.тлдаемнм в митозе аберрациям хромосом (Sax, 1938; Lea, 1946) уступило тесто концепций их потенциального характера и сложного пронесся превращения н структурные наругсения хромосом (Корогодин, 1957: луиш;, 1953). Более того, появились факт, позволяющие предполагать что часть первичянх радиационных повреждений связана с долгпжи-гущоа нестабильность» хромосом' и реализуется в иг.меноннч их структур» уже в потомках облученных кдоток (Дубинин, 1573; Weissenborn, Strefrer, IS88; Жлоб», Севанькеев, 1039, 1941).

В последние года существенно расширились экспериментальные возможности исследовании структурных перестроек хромосом, Во-первых, спектр изучаемых хрсмосомих перестроек пополнился он счет сестринских хромьтиднях обметов /СХС'. поскольку бш: создан но-дежшьЧ метод их выявления (Егажта, Захсров, Xrttt, 19/0:

Perry, K'ollf, 1974). Во-вторых. vomялись яг,окпатпкв способw идептифясаиия клеток разных иоколепиД, н посредство:.! тгего разделения рэдипциошшх э№ктов в ста облучеющх клопмх я a irr потомках. ОДЯОКО ДО СИХ пор ДЛЯ пСбррЯЯЯЯ хромосом /АХ/ njl"W«4 ■ lino зависимости иолучкш для незначительного тигоргяла ;un двух -трех случайно рмбрптшх сроков Фяхзациб, огранччг-ки к'уч'-иаг.«« хромосомгшх мутаций толы-'о п первом ног-тралийци^пн >ч мг""-в гетерогенной популяции, состоящей из клетях, - дви* рк«'-.'

-г -

число дзленкЯ после воздействия. и касаются, в основном. лш1о-цт. _>в. Дсшше о зависимости вихода индуцировашшх радиацией 0X0 от времони посло ОбЛУЧВЛЛЯ полностью отсутствуют.

!^сль.^задяти исслсдоваю;!!. Цель» настоящей работа являлось изучи,иш аакг|Цомйраостс'И образования аберрациЛ хромосом и сестринских хроматидных обманов в трех последов итолышх поколениях i/<Vyvomutt к,¡оток к зависимости от времени после гамма-облучения lufioivu ;;,!т«.1с:ког') х-'ишчка Ни Сс И Gj стадии.

Д/м дооти»¡пин поставленной цели било необходимо реашть след!адие конкретнее зода".н:

1. Сушить кинетику клеточных циклов в облученной и нэоблучен-ной популяциях \ишток.

2. П-лучить заниснмости выхода АХ и их типов от времени после тлучония для 1-го, 1-го и 3-го пострадиационных делений.

3. Получить зависимости выхода СХО от времени после облучения для 1-ю, 2-го и 3-го пострадиацжшшх долгчсШ.

•i. ершгать частоту СХО, обраоовавлихся в одних и тах я» циклах

репликации, в днух последовательных клеточных деланиях. &. Исслидовать закономерности образования радиационно-индуциро-тшньх СХО в разных решшкациошшх циклах. И а у чяа я jkob из ша. £5 работа впервые уця изучения зависимости ьремя u'M<jKt h;i хромосомном уровне Использован диапазон фиксаций, в несколько раз нравыатюций средние на популяцию продолжительность мнготического цикла. Шшрвие получени зависимости nuxca a;(rC/!'..'i-.).;miiiux радиацией АХ и СХО от времени после воздействия для трех локол'чШ облученных клеток.

СОпаружоио пошиешю радиочувствительности клеток с увеличением продолжиг&лыпети клеточного цикла по тесту индукции' АХ и отсутствие влияния времени ({¿шеации не радиочувствительность клеток по тосту образовании СХО. Наиболее значительный рост АХ ио ■ иръшчгл ньблюдаотся для клеток 1-го пострадиационного митоза, для ¡«'ото:! 2-го митоза з^ист менее выражен и практически отсутствует а клетках 3-го митоза. Достоверной индукция СХО радиацией .шяпляотсл в трех ноелвдопате.шшх делениях, хотя в каждом по-пос/одуыцом жп'озе рпдиациошшй эффект меньше, чем в предыдущем.

Обнаружено, что кхо-т с иовшытич уровнем СХО аодовдруиг • ¡¡¡¡и делении. Установлено,, что радиация приводит к нестабильности' отдел!,них локусов хромосом, которая приводит к образованию СХО в и тех же локусах хромосом и носдодоватолышх циклах.

Практическая значимость работы. Получешмо рпзультвтн ра'л ширяют су;;.оствуидио лродстяротшш о закономерностях обрэп<лшмн радиациотго-жщуцировягвш.ч' АХ и СХО. (йш могут оказг. .ь^я ноли, ними при определении радиационного поражения клаточной --

и для прогнозирования послодстплй радаациогеги\> юздойстктя потомки облучошшх клото'с, в тага» для ссппршонст!..:ея1|Ия тт-'П СХО как тестя на ДНК-гювррждадаэв поздоЯстшм.

Апробация работы. Основ™? положения диссортяциошюй раб ■•:■■< были доложен» на Радиобиолог .песком сгездо (Киев, TVD3), на 1 ■ съг-зде Вавюговского общество гаютичов и сэлскцяопорор !С.)р;т.;<> 1994). Дисссртагщя была апробирована на няучнсЯ ме.т. набор;.. "орн\ч» конференции экспериментального сиктора WFIüJ Г-WI с ян>apn IViOo ПуСлжшгии. По томе диссертации опубликовано 4 рьб<>ти. Структура и объем диссертации, Диссертация с.;стг:гг то гаю доггия; обзора литоратурц; описания материала и методой гсалвдо-яия: 3 глав, содержащих эксперимент.'¡лыпю результата и ('осуждение; заключения; шводов и списка лктврэтурн. Работа и;:..г.юнг но 153 мшшголжлт страницах, шшпетрировяиа 2Z таблица1« и IH рисунками. Сггиг-о:; литература содержит '.'X/ еттлратумшх истончка.

ЙАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ЖСЛЧДОВАКЛЯ Объект исслсдозаюм. Энстр:моиги прошдоа на ку.тьтуре клеток китайского хомячка (штамм PJW) со ст8бялпирорашм.м каря отипим, содержащим 10 хорошо к&ри.>гтглруеунг хромосом. С{ чдагкя продолжительность клеточного цикла ■ iü часов.

Умови^^ЛЕОшдеши экспв$>шгглрц. !Шты !:y.:i,r;&ip- -наги стандартными методами и синхронист >зяля ч стгда.» (кил [.»«ия клоп« при ксчтатгноЯ чомноратуре омаш с рода) и о **кт>хп» (отбирая мотаЯпзние luiPTHii, чйзддш»« ся ч >i'.гнР'.адчсм п::окч •,■■>. rarim, Tolrcr.ch, 1ЖГ0- Стг';он;ш'.;ров»!Я:1;'• ir.»vni onryws» в или в начало С, стадии на ус-мн"Л;- ¡ж мштау» Сс- ' с дозо 3 гр при мокдости 0.9 Гр/чяь. Что".« игпнг.'Тлщ <• патi> ч^п фнзи 1-го. 2-го и 3-гс постради^щощсп «>\г ;;иЛ л нал»гц.:т» » ОДНИХ К тех МТ! КДРТН>!Х ОДЦпВр|-М')ННС> Л СХО. И {(ЯГЧЯЮЦНЯ »pOMOV , служит;«» критерием радиационного пар.w-hh;i. '¿■er: ¡> »хул » те •шнио одного ччклв репликации ;< <р»др г ии^окой ..ачцчн.-;. .! .• бромдй?ок~аурида.1П /ЪХ1/ (3*10'" «). ттсм ."»•> ^лктрч к- • рэн'-г:игл в ср;-.ду с понижение..*« к '.nieнтппци. а ЦдУ t'x!" ' '''• ^ результате зто1 .фоцо^'Г^ nojrmw-wwf нити | • ' ' "«i

с

к а № С.

С К X 3

с

*

х

3

<х х к и с. ь

>

«о а

/\

ИЙИ5! р!Й1

«и; <:«:»:>;:

—- мезпмшешые нити АНК .----силшвзямещенкые ш нити

........ ц^сти-шизауешеммые 54уиити

кгомйтиш с «усоким □. средним В и низкий О ссоержянием ыу

Рчс. I. Экспгр)шииталышй протыкан трехступенчатого мечэшш хроцосиы, в хотсршс прсюсхгд СКО в 1-ои, 2-он илм 3-еи кжлс репликации.

Показаны шишуклеотэдмне нити (слева) и соответствуйте им иетафаэше хромосош (справа). Стрелки1 указывают ие-ото образованна обмена, цифри - нсмгр цикла репликации, в которой си произошел. В третьем цикле образуются СХ0 двух видор: иезду тсиао- к проиежуточиоокрашоннша хроиаткдаии (За); мэаду светло- и проиежуточноокрашешшми хроматидами (36). СХО, обрюоззвшсся в родительской клетке, наблюдается во Ь№Х се потеках.

дийцкошшх митозах содержали неодинаковое количество гсжорпори-ровапного БдУ, и пследствие этого различались по типу диЭДурон циальной окраски хромосом (рис. I). Использованная схомя Рл/->г< -чэния хромосом (ИШег о! а1., 1976) позволяет определять СХО, ■> клетках 3-го митоза с ярлвкиновой и 3-го - с трехступенчатой окраской хромосом, причем во 2-ом митозе можно определить только суммарное число СХО, образовавшихся в точенио двух поренх тсслои репликации, тогда как в хромосомах 3-го митоза можно ригилчать обмени, образовавшиеся ц определенном роплшациошгсм. цикле.

Для окрашшзашш препаратов былэ модифицирована мотодака дайерэнцзалыюЛ окраски сестринских хрометид без причг-но:г-?я фяшрохромов (Антоидаиэ, Порядкова, 1978).

А)

Б)

^ *ВяУ -БдУ +БлУ Колхицин Фиксация черея

¿1-'_г ■ " 1 ~в | в ««с.

го

рго та.1 >зв г г,

-ВЛУв

сбор клеток

+ БдУ Колцемид

1>Л V Калхинин Фиксация чрре^ _ I 3 I * 12 чле.

г 1го * бб

Едув- высокая (2'10"6М), внУи- низкая (5-10~%) концентрация ЕдУ Рис. 2. Схемы проведения зкепернмгнтэ.

; Для решения поставленных задач использовали двд ?ксгто[лмои ■ тальнпэ схемы (рис. 3). которые различались стадией синхронизации лиюток ^соответственно С0 и штез) и стадией обучения (С0 -С1),- что позволило изучить э^фикт б "лпгкпх. находящихся в различном физиологическом состоянии. Сведение БДУ (рис. ?,А) сразу поме облучения дало возможность определять частоту СХО во ?,-ом я в З-ем'пострадиашонянх митозах, а введение ПдУ через одно деление после облучения (рис. 2Б) - в 1-ом и во 2-ом; при этом р первом случае облучгли тезэшщекнио хромосомы, а во втором - содержанке БДУ в одной жги ДНК.,

Результата экспериментов обрабатывали статистически з программе СюгегаПсч на 1Щ РС,

РЕЗУЛЬТАТЫ Я ОБСУЗДИЩ Шшяттее облучения кэ шггогическу» л М7™.

кость клеток. При интер'фотацик результатов и т

торых оспов'Шми показателями степени рэдазшюшюго пораданик на

minen АХ и СХО, и эфЦект определяется' Во времени отдельно для1 трох первых пзстрадоцношпЙ долёШЙ/ «эобходаю знать состав? клеточн^ популяции' в KOMeift1 фжСагШ ii учуивать влияние облучении на митота ¡осхую аЪтеШэсОД ШЩМШ и продолжительность ынуотичьского цикла отделы«/* KJíériíóx.

На разных сроках фиксации определяли соотношение' мотафаз I-ь-го долиниЯ для контрольной и обдучеююЯ популяций. Несмотря на сшщюннзацию клитки достигали 1-го митоза в разное время', при ifM vteTajML ы 1-го деления обнаруживались даже на самом позднем сроке фиксации, когда большинство клеток ухе находилось во 2 -ом или 3-еч митоза. лналИз делящейся популяции показал, что в использованный диапазои Ф^сйЦЙЁ йопало большинство клеток 1-го и Я Г / митозов; причем лродолгителыюсть 1-го цикла варьировала от 20 до 76 часов, тогда Кок продолжительность последуиода де-ле1Ь.Л м.ыялась в значительно моНьшеЗ cierfaiM.

Облученче к четок 6 коао 3 rjj fia cta¿ií:f с0 но влияло на соотношение числа клеток 1-го; 2-гЬ si 3-го Аш.тЫЙ; при облучении на стадии 0, - начинай с 66 часов п^лДтШнЫа облученных клеток по циклу замедлялось, ó чей повышение числа 1-нх

и сшш»нае 2-iix tí 3-jti йл"к>зоИ rió (¡¡заШшta с контролем. Такой рем.улитат, [¡о-ЫЛМоНу; AfáMéióli СлеДС №йем радиациотю-нндуци-ронанчой задержи tifauilo клеток, продолки-

тельнозть которой -&Й|)аЬт06? Ш мере увеличения числа аберраций на аберрантную RASflqf rf й<#'{фуВ {ийьше наблюдали при более вU' >~ кнх дозах (Lloyti é't íi;. ¡ í'Jti} IMtkkíI с соавт., 1984). В нашем cjiysdu задер&са &Üíia iiteitótia усилением радиационного аффекта, .ЫзЬаннаро Лозой 3 за счет ^шдаосенсабюшуруадего действия

иЬ<орпо^й[юЬ'ай{1й№ ti ¡bita ДНК к моменту облучения. Облуче-н'лэ подавляет чиТоМЧЬскуй активность клеток, снижая скорость их вегушюнйй ii делЫйй.

Ttí'übi образуй; (Ьлученнне результаты свидетельству»*]-, что судя по iMí'01'Иiéckody й««дс»к::у и по доле клеток 1-го - 3-го митозов, и н.;йих 0кСйвр«моитндьпих условиях облучение вызывает сни-¡¡и-йнв общего числа делявдхся клеток и практически не оказывает клияшШ на продолжительность их матотического цикла.

Частота лоареждеша.х клеток и аберрация хромосом на разных ■ pypkns фиксации а 1-оц - 3-еш пскуградиацкониах делениях. Подсчет ■1Йс4а аб ;рентных клеток и пбер', зций хромосом Сил проведен отде-jiisító jytsl кгг.кдого из трех первых после облучения делений в клет-

|КОХ, облучеиннх не стадии С0 и факскровагав/х черве 36 - 70 часов ,рослв этого чорез каэд'е 8 часов, к в клетках, облучешшх нэ .стадии С4 и фиксированных с интервалом в 12 часов чорез ?,п - 62 ■щ)Соп. В основном паблЕ-чались аберрации хроносогаюго тип.), по-(Скольку облучение проводили в предсинтетлческой стадии. Нч рез-уроках фиксации и в разных постраднациогашх делениях споктр дус .щадютиески не менялся.

Экспериментальные результаты хорошо ошюиваптся уравнением Линзой,регрессия (рис. 3). Для обоих опыто»; в контроллх, нолу-явнвнх для (раз!щх мптозов, угдовнз коэффицв^нтн достоверно от нуля из орлдавптсп, хотя во всех случаях о.л положлтольн", т.е. ■вероятность совладения Г00 %. По критерии знаков вероятность такого ссшнадонля $6. ¡Поэтому ,мозию утверждать, 4,1X5 ,в кедтро/в

«л-»». —г-*. митозы ----контроль,

Рис, 3. Зависимость аыходэ довреаденннх цветок (слева) и аберраций хромосом (справа) от,вро/*ни фиксации в контрольно а и в оолучегаои популяциях клеток I-тр. 2-го и 3-го деления. Вверху: облучение на стадии ?нКэу; облучешп на стягот С, .

- а -

}Цш популяций клотон, годвергиихся радиационному воздействию, угловой козфищиант дДЯ 1-го и 2-го долешй достоверно отличен от нуля, для 3-го - близок к нулю. То ость увеличение времени фиксации существенно увеличивает выход зЗгрргкт!мх клеток н АХ н двух первых дао традиционных митозах, причем з№кт во 2-ом делении Bupiixi'ii значительно слабее, чем в 1-ом из-за элиминации част;! аберрантных клеток при делении.

ООнчружешшй оЭДокт шип1 бить обусловлен неодинаковой ра-аиьциошю-индуцированной задетой делания клеток с разным числом поирездения. Тогда со временем должно возрастать число аберрация. нриходн'цихся на аберрантную клетку, что и наблвдается при при облучения клеток на С, стадии. Однако возрастание выхода АХ вс ь|юмонн обнаруживается и в тон случае, когда в клетках содержится всего по одной аберрации (С0 стадия). Кроме того, облучении но высывачт замнтного изменения состава делящейся популяции. Поятсму можно утверждать, что увеличение задержки деления меток с увеличением степени поврвадешюсти клеток не главная причине выявленного аффекта.

Выход дицеитриков и фрагментов на разнах сроках фиксация. Кривив время - аф1вкт били также получены для ацентрических пар-]шг фрчгментов и дацентриков (рас. 4). С течением времзня число фрагментов и дицентриков возрастал( хотя форма полученных зависимостей и доля каждого типа аберраций различались. Таким образом обнаруженный аффект характерен как для обыогашх, так и для иеобмешшх аберраций, и не связан с изменением спектра АХ. П -сколь;су облучали титически и функционально идентичные клотка с ига ^визированные а определенной стадии, то ми полагаем, что первичная поражаемость клоток одинакова и различие радиационного отвьто у клеток с разной продолжительностью митотичоского цикла определяется процессами, протекаицими в клетках между облученном л регистрацией оФ1йкта и приводящими к фиксации поврежденгй. По-видимому, удлините клеточного цикла сопровождается нарушением нормальных физиолох'ичбеких прокосов, и преадо всего процессе репарации. Тем более, что оценигая способность клеток к образовании макроколтмй, те из них, продолжительность митотического цикла которых в 3-4 раза превышает среднее время генерации, по этому тесту однозначно нитятся рипродуктивно погибшими.

Таким образом, нами было обннрукено, что при прочих равных утопиях ii генетически однород.юй популяции клетки с большей

продолжительностью цикла имеют болъшуп радиочувствительность. Данное свойство но является экзотическим, лаборатории, а вполне укладыйается в общие физиологические свойства клеток, поскольку и в контроле ми паблздали иовыштуо нестабильность хромосом в клетках с большей продолжительностью ¡пасла.

с > 10

§ 0.0

§ о.б а

а 0.4

ы

ю 0.2

и.*

с 0.5

а

£0.3 ь 0.2 1 0.1

§ О

^ 0.3

V

ч

СП

О 0.2

3

ы

а о.|

<х с.

» г.

г

м

| ГГ. о- ■

с 2.5

V 2.Й

Я

® «-5

И г.о I 0-5

и.

36 44 ВРЕМЯ

52 бо i 1 75 «5>ихсйции, член

20 32 зремя

44 « 56 68 фихсйции. чясы

1-ый;

-2-

ои-

'--3—!*я митозы

Рис. 4. Зависимость выхода аб<эррац5сЯ (:. ерху>, дащентриков

(в центре) и фрагиентов (внизу) в рззных .трзднащглошх митозах от вреыею! фиксации.

Слева: облучение на ствдкк Сд{ справа: облучение на' стадии С1.

Частота СХО на разных сроках фиксации в 1- ом - 3-ем пострадиационных делениях. Временные зависимости выхода СХО, образовавшихся в первых двух циклах репликации, были получены для ?.-го и 3-го клеточных делений (рис. 5), которые соответствуют 1-му и

2-му пострадиационным делениям для -облученных клеток и 2-му и

3-му пострадиационным делениям для С0-облучэншх кльтм?. гшод СХО от времени как для контрольных, так и для облученных популяций имеет слохный неоднозначный характер. Однако проь^рка час-

тот СХО, наОлйдаекьх на разных сроках Здасации,, до щг

нородности хг показала, что вероятность слунайиос,та ¡разяш.Ш

ВРЕМЯ Ф И K'C.AfUiMt**.

■ - 2-ой МИТОЗ, *> - 0.-)*а ¡митоз

---_ контроль. .-t«№<v»'wcmne

Рнс. 5. Частота овразовявшихся в л»ух,пе!шкх пиклах репликации СХО во П-си и 3-е« митозях «8 разянх,срокахфасяцт. Слева: облучение на стадии G0; справа; -облучение на стадии Cj.

Бхияние облучения па стадии С^ ,и Суна .гтдукнизо СХО. Метод трохступвнчатого мочения хромосом ;г,,т>еозмояюсть определить чи-. ело рад5ш!що1мо-ш1Дуцигювэ1Шнх CXi-"в трех первых после облучения делениях а сравнить частоту СХО, образовавшихся в 1-ом и во 2-ом циклах репликации, в двух последовательных митозах.

Во всех трех митозах облучедае достовэряо индуцирует СХО, при этом их колкчьство в деух последовательных делениях всегда гаи® в парно« из-них (рис. 5). Абсолнтная частота СХО также всегда вьео ш 2-ом hj.5t030, чем V 3-вы я длл контрольной, и для облученной популяций. Чтобы понять с чем ото связано, ми построила расиределанля СХО по клеткам, объединив рмультаты всех фикса^.

Распределение > СХО во .клетка«. Сраш&!Г<ю распределений для 2-го и 3-го дсиаиий покоаиваат, что клоткж с повыаэшша уровнем схс. -¡¡¡блялаемчй .во 2-е*« матозо, отсутствуют в 3-вм как в конт-уовыюа. тьк Л.« Ойлучедаэа популяциях. Отсюда можно з?ключить, что кме'к.т мэс-Tu ■8лввдаа.!%кл:-в?п'Ток с повшшяним уровнем СХО.

дЬ СЖ- пь^ эйишзай9&»> клеток связйвйли исключительно с на-лнадем1 в ¡Мх нвстайапьнМ аберрацай хромосом, а СХО считали событием нейтральна* Для после думца й судьбы клеток. Если исчезновение" клеток 6 шэжес-тпетшмя СХО связано с элиминацией аберрантных клеччж 1 то следует ожидать, что уровень СХО п клзтках с аберрациям.! выше, чем В клетках Сез аберраций. Однако этого не обнаружено (табл. Т><

ТабД. 1, Чаотота СХО в клетках 2-го и Э-го пострадкоцкок-)шх митозов* которые содержат аберрации к без аберраций

W кЯУозя СХО tía' клетку t-критерий Стьюдентя

кЛеТкя без «6<?£|>'ягиrtt клетки п Аберрациями Разность t Г

и в. 6Ы0. i7 ft. 33iO. 30 0. 36iO. 34 1. OS >o. os

т a.iito. ia a.eoio. эз O. SI iO. 39 1. 31 >0. 05

Таким образов/ йи.й показано, что СХО не нейтрально и» по крайней мере, ЧйсТь клеток с повшиеннкм уровнем СХО элиминирует. Принципиально товам является тот факт, что сестринские хроматид-ные обмены могут оКазКвйть влияние на последующую судьбу клеток.

Если предположить* ■ что вероятность реализации первичного повреждения в СХО одинакова во всех клетках, то распределение СХО по клеткам должно йодчигелться распределению Пуассона. Распределение образовавшихся й 1-ом и во 2-ом циклах репликации СХО по клеткам для неоОлучеяной популяции ¡слеток 2-го митоза действительно подчиняется закону Яувссонп. Распределение для клеток 2-го пострадиационного деле mí я значительно отклоняется от пуас-соновского. Зто означает, что вероятности реализации вызываемых радиацией повреждений ДНК. в СХО В разных клетках неодинаковы. Зто свидетельствует о раз'личоч Механизме образования СХО радиэ-циогаюго и нерадиациошого происхсзду ння.

Образование СХО в ряду клеточних Делений. В метафазах с трехступенчатой окраской хромосом отдельно определяли частоту СХО, образовавшихся п I-см, 2-ом или 3-ем цикле репутации. Сравнение частот СХО, образовавшихся в разни* циклях,- в контрольных и в облученных популяциях позволяет судить о судьбе вызиваомых радиацией поврьздпний в последующих делениях» Так, если облучите вызывает повреждения, которые приводят к образованию СХО в атом же цикле, и/или репарируются, то следует ожидать-псдаыюения уровня СХО толь!''} в 1-ом поело воздействия цикле; если повлезде^сия, которые не индуцируют СХО в 1-ом цикле, не репарируются и визы-

вают образование СХО в следующем после воздействия цикле, то увеличение частота СХО будет наблюдаться не только в 1-ом, но и в последующих делениях; и наконец, образование СХО может происходить в одном и том же локусв хромосом в последовательных клеточных делениях, что приводит к снижению частоты СХО во 2-ом пострадиационном делении по сравнению с контрольным уровнем; а также повышении частоты СХО в 3-ем пострадоюциошюм цикле (если ЕдУ вводили сразу после облучения) или в предшествующем облучению цикле репликации (если облучали клетки после завершения цикла репликации в присутствии БдУ). В действительности для персис-бь

» 6

ш С. а 4

с г 2

о X и о

> " I-

и

с:

1 2 о

X

и

ш

л

/

/

/

/

Л

1*1

/

/

/

/

/ Г

✓

/

/

/

/

v 1

П:

1 :

/ /

/ /

I/

V 1

52 6П 08 76 прими фиксации, ч

44 ье 60

время фиксации, ч

□

контрогь, 0 - облучение

Рит. 6. Частота СХО, образовавшееся в1-ом (вверху), 2-ом (в тигр**) кял 5-еи (внизу) цикле репликации, регистрируемых в гч-см ю-.тозе, иг разных сроках фиксации.

Слг-вв: оЗлучегтке на стадии С0; справа: облучение на стадии С,.

тиругздк ПСБрездений возможны оба пути реслгзгшга. что по-разному влияет но частоту С-ХО 3 ¡юсяэдувдих после воздействия деланиях и усложняет интерпретация резулътатоз, которая будет зависеть от соотношения частот обычных и изолокусгага СХО. Однако повыге-ние уровня СХО в цикла, предшествовавкек чоздейсташ, однозначно свидетельствует о возникновении изолокуышх СХО.

Из рис. 6 видно, что частота СХО, в 1-ом пострадиационном цикле всегда выше, чем в контроле; со 2-ом после воздействия ци-ле для некоторых фиксаций частота СХО снижается чмхэ контрольного уровня, тогда пек частота СХО в 3-ем после облучения цикле више, чем в контроле. В популяции, облученной после окончания одного цикла репликации с БдУ, уровень СХО.образоваваихся в 1-ом цикле', значителт.но више чем в контрольной популяции. Эти демнио свидетельствуют, что образование СХО может происходить в одних я тох же локусах хромосом в последователышх клеточных генерациях. Причем вероятность такого события можно составляет более 50Ж от общего числа СХО, образовавшихся за тра цикла репликации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Оснотшо результата, получошша в настоящей работе, в сопоставлешш с дашмми других авторов позволяют висказать повиз соображения о закономерностях образовать радиацйопно-индуциро-ванных структурпих перестоек хромосом в трех »эрвах поколениях облученных клеток.

Полученные дапшв показывают, что для популяции клеток, гетерогенных по продолжительности клеточного цикла, радиочувствительность клеток по тесту индукции АХ возрастает с увеличением времени, необходимого клетке для удшвния. Удлинение клеточного . цикла, по-видимому, сопровождается яэруп:виием нормального функционирования клеток. 3 результате вместо репарации потенциальных повреждений может происходить их фиксация.

В работе получены доказательства того, что радиочувствительность меток по тесту образования СХО не зависит от прела гот после облучения. Однако в последоветелышх пострадиационных митозах частота радиеционно-индуцировашшх СХО уменьшается, несмотря нд то, что согласно классической теории - СХО, раз возникнув з клетке, наблюдаются во всех ее потомках.

Различный вид временной зависимости, полученный для СХО и аберраций, позволяет предполагать различие первичных иовреждчний, лежащих в основе их образования. Другим свидетельством в пользу

- u -

такого предположения является одинаковый уровень СХО в катках, содержащих аберрации и без аберраций.

Изучение структурных перс-строек хромосом в послвАосаюлытх пострадиационных делениях указывает на то, что наряду с элиминацией клеток с аберрациями происходит элиминация ¡слеток с повышенным уровнем СХО; причем такой процесс обнаружен и в леоблуценной популяции. Этот результат ставит под сомнение утверэдениа о том, что СХО - событие нейтральное для судьбы ¡слеток. Скорее ксого, накоплена» большого числа обменов п одной клетке делает новозмояашм ее. нормальное функционирование.

Изучение закономерностей образования СХО в разных циклах репликации позволило сделать вывод о возникновении радиациошю-ин-дуцироваШшх СХО в одних и тох же жжуонх хромосом в последовательна' циклах репликации. До сих пор реальность такого события биле продемонстрирован,ч лишь в одяоЯ работе (Morales- Ramlres et al.; 1У88). Существование изолокусных СХО свидетельствует о том, что радиации вызывает нестабильность отдельных локусов хромосом, которая сохраняется в течение нескольких делений после воздействия и где СХО возникокгг значительно чаще, чем в других мостах.

•Совокупность полученных в работе результатов расширяет существуйте представления об особенностях реализации первичных радиационных повреждений! хромосом и закономерностях образования СХО и. аберраций в овяучюпшх ilzctkcx и их потомках.

ВЫВОДЫ

I. Показано, что облучение клеток китайского хомячка в дозе 3 Гп jm стадии О л л лачйло г,, вызывает снижение общего числа дмлнихсл клеток к не оказывает существенного влияния на скорость iip.'AB.'csoiUffl клеток по циклу.

Л. 3 результате исследования зависимостей выхода аберраций У.р 1st -«ОМ И СССТриНСКЛХ ХрОЧ<)ТНД!ШХ обменов от вромзни фиксации л;!.'!д:-!п< црнцитшачьпю различия закономерностей их образования:

■ В к:''НтроЛиН-..й популяции наблюдается слабы» рост уровня АХ ч yi>'<jri-:ebHf>M продоламгольволта клеточного цикл», тогда к* ры.асим ч.т;- частоты СХ(- от времен* немонотонная.

- Р;де>чл<с1нйТ1.1ЛЬН:>сг«ъ vJievoK но тесту индукции АХ воэрас-•;{,fY с: уюлй'-.-.'гаем с го».-)! ¿тгоацли. м но тесту образования СХЭ у'Х.мщч-тиЯ оф1и;<т hj зависит от времена.

- СХО в кхот.мх не коррелирует с наличием б ялх ДХ. .

.VcTiiii.••■-¡ого. что характер зависимости время - аМ»жт ¡.

контрольной и облученной популяций идентичен как дня СХО. так и для ЛХ.

4. Выявлено, что наиболее значительный рост частота АХ с увеличением сроков фиксации наблюдается в 1-ом пострадиационном митозо, но Я-ом - :)'№жт меннео внражон и практически отсутствует г и-fiM штозе. Для СХО радиационный о^тжт не зависят от времена н трэх. uopuux после облучения делениях, хотя г> кавдом по-слиду^щвм митозе он меньше, чем в предыдущем.

й. В результате сравнения частот струк/урних перестроек хромосом в последователышх клеточных митозах обнаружено, что в облученной популяций происходит элимидпция нэ только клеток с АХ. но также и клеток с повышенным уровнем СХО.

6. Анализ регистрируем!« в 3-ем митозе частот СХО, образовавшихся в разных циклах репликации, в облученной и необлученной популяции свидетельствует о том, что радиация приводит к нестабильности отдельных докусов, в которых с высокой частотой возникают СХО в последовательных клеточных генерациях.

Основные положения диссертации опубликованы в работах;

1. Кондрашоза Т.В., Порядкова H.A., Арефьева О.В., Лучник Н.В. Влияние свободное 5-бромдезоксиуридана на индукцию СХО в лимфоцитах человека, г-облученных на предсинтотической стад!ш первого и второго ми-готических циклов.- Генетика. 19Э0, т. 26, Н, С. 1671-1674.

2. Арефьева О.В., Йлоба A.A. Зависимость зремя-зфрект Для культуры клеток китайского хомячка, подвергнутых радиационному воздействию на стадии Gü. Аберрации хромосом.- В кн.: Радиобиологический съезд.. Киев, 1993. (Тезисы докладов).- Пуарпю, 1993, ч. I, с. 35-3G.

3. Жлоба A.A., Арефьева О.В. Зависимость Еремл-эффокт для культуры ¡слеток китайского хомячка, подвергнута* радиационному воздействии на стадии С0. Сестринские хромзтидныо обметш (СХО).

- В кн.: Радиобиологический съезд. Киев, 1ЭЭЗ. (Тезисы докледоп).

- Пущино, 1993, Ч. I, с. 358-359.

'4. Кудряиюва О.В., Жлобэ A.A. Зависимость выхода аберраций хромосом и СХО от времени фиксации в трех пострадаацлошпк да:-л«х деления клеток.- Материалы 1-го съезди Вявшгавского сбздст-ва генетиков и селеюдеонеров. Саратов, 1994.- Генетика; I994, т. 30, приложение, с. 32.