Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Защитные реакции пульмонат (Gastropoda)

ВАК РФ 03.00.08, Зоология

Автореферат диссертации по теме "Защитные реакции пульмонат (Gastropoda)"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

ПРОХОРОВА Елена Евгеньевна

ЗАЩИТНЫЕ РЕАКЦИИ ПУЛЬМОНАТ (GASTROPODA)

03.00.08 -зоология

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009

003468175

Работа выполнена на кафедре зоологии факультета биологии Российского государственного педагогического университета им. А. И. Герцена

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Геннадий Леонидович Атаев

Научный консультант: , ,

' доктор биологических наук, профессор

Александр Витальевич Полевщиков

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Кирилл Владимирович Галактионов

доктор биологических наук, профессор Александра Давидовна Харазова

Ведущее учреждение: Государственный научно-

исследовательский институт озерного и речного рыбного хозяйства

Защита диссертации состоится «^» А^-О^Я- 2009 г. в ^часов на заседании совета Д 212.232.08 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, ауд. 133.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «.

Учёный секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Сведения о функционировании системы иммунитета у организмов разных таксонов составляют основу сравнительно-иммунологических построений, раскрывающих пути её становления. Легочные брюхоногие моллюски (Pulmonata) в этом отношении являются одной из наиболее интенсивно изучаемых моделей среди беспозвоночных. За время своего существования они приобрели широкий круг симбионтов, включающий как комменсалов, так и специфичных паразитов. Особое место среди последних принадлежит трематодам, многие из которых являются возбудителями опасных заболеваний человека и животных.

Именно при изучении пульмонат (Biomphalaria, Lymnaea, Helix) были впервые получены сведения о защитных реакциях брюхоногих моллюсков на трематодную инвазию, бактериальное заражение, описан клеточный ответ на пересадку трансплантатов органов и тканей (Lie, Heyneman, 1975, 1976; Jourdane, Cheng, 1987).

Высказано предположение, что основными эффекторными элементами защитной системы пульмонат являются циркулирующие клетки гемолимфы - гемоциты (Атаев, Полевщиков, 2004). Они проявляют свойства, характерные для фагоцитов, вовлеченных в реакции врожденного иммунитета: способны к хемотаксису, адгезии, фагоцитозу, генерации активных форм кислорода, а также внутриклеточному накоплению микробицидных факторов (Купер, 1980). Гемоциты обеспечивают распознавание, изоляцию и элиминацию чужеродных факторов, а также восстановление внутренней среды от последствий защитных реакций (Connors, 2003). Однако остаются слабо изученными процессы гемопоэза, пути дифференцировки и функциональной специализации гемоцитов.

Считается, что гуморальные компоненты гемолимфы также участвуют в реализации всех этапов защитных реакций пульмонат (Adema et al., 2001). Так, у моллюсков с разным уровнем резистентности к трематодам выявлены различия в интенсивности экспрессии факторов защитных реакций (Davids et al., 1999; Mitta et al., 1999; Guillou et al., 2007 и др.). Однако остаются невыясненными механизмы регуляции клеточного и гуморального ответов, пути взаимодействия гуморальных и клеточных компонентов. Поэтому, несмотря на большой интерес к данному вопросу, сведения о защитных реакциях легочных моллюсков во многом фрагментарны. Для выяснения механизмов формирования защитных реакций пульмонат, прежде всего, необходим комплексный анализ клеточных и гуморальных компонентов этой системы, а также расширение количества изучаемых моделей.

Цель работы: анализ защитных реакций лёгочных моллюсков.

Соответственно были определены следующие задачи исследования:

1) изучить гемопоэз и морфологию гемоцитов моллюсков Р1апогЬагш согпеш и ВютрИа1аг1а glabrata\

2) охарактеризовать функциональную активность гемоцитов моллюсков Р1апогЬапш согпеиу,

4) проанализировать экспрессию генов факторов защитных реакций у моллюсков Р1апогЬагшз сотеиз при заражении трематодами;

3) оценить специфичность клеточного и гуморального ответов пульмонат на заражение партенитами трематод;

5) оценить роль клеточных и гуморальных факторов в реализации защитных реакций пульмонат.

Научная новизна работы. Получены данные об амебоцит-продуцирующем органе (АПО) моллюсков Р1апогЬагшз согпеш. Показано наличие в гемолимфе изученных пульмонат двух популяций гемоцитов - гранулоцитов и гиалиноцитов. Впервые методом проточной цитофлуориметрии подтверждена роль клеток гемолимфы в защитных реакциях на заражение трематодами и иммунизацию бактериями. Впервые проведен анализ особенностей клеточного и гуморального ответов легочных моллюсков Р1апогЬапиз согпеш на заражение разными видами трематод. Впервые показано изменение клеточного состава гемолимфы моллюсков Р1апогЬагшз сотеиз в зависимости от зараженности разными видами трематод. Установлено, что соотношение гранулоцитов и гиалиноцитов в гемолимфе зависит от размеров моллюска. Впервые для моллюсков Р1апогЬапиз согпеих на уровне транскрипции исследована экспрессия генов, кодирующих ряд факторов защитных реакций при заражении трематодами. Показано, что уровень экспрессии генов фибриногенподобного белка, С-подобного лектина, кальций-связывающего белка и цистатинподобного белка различен у моллюсков, зараженных разными видами трематод. Выявлена разная интенсивность экспрессии этих генов в гемолимфе и гепатопанкреасе зараженных трематодами и незаряженных моллюсков.

Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты исследования важны для понимания механизмов реализации и путей становления не только защитных реакций моллюсков, но и беспозвоночных животных в целом. Полученные данные об особенностях проявления клеточных и гуморальных защитных реакций пульмонат при заражении различными видами трематод расширяют представления о механизмах устойчивости паразито-хозяинной системы «трематоды-моллюск». Эти сведения имеют особое значение для разработки мер биологического контроля над распространением опасных трематодных инвазий. Методические разработки могут быть использованы для изучения защитных реакций представителей других групп беспозвоночных. Получены нуклеотидные

последовательности (кДНК), соответствующие факторам защитных реакций моллюсков Planorbarius corneus. Эти данные будут представлены в открытые базы данных и могут быть использованы для изучения экспрессии генов факторов защитных реакций у других моллюсков. Данные диссертации могут быть введены в курсы зоологии беспозвоночных, цитологии, паразитологии, молекулярной биологии и сравнительной иммунологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Основными эффекторными элементами защитных реакций пульмонат являются циркулирующие клетки гемолимфы - гемоциты, представленные двумя типами -гранулоцитами и гиапиноцитами. Гемоциты участвуют как в реализации клеточного ответа, так и в продукции гуморальных факторов защитных реакций.

2. Амебоцит-продуцирующий орган, приуроченный к перикарду, является центральным источником гемопоэза пульмонат.

3. У моллюсков Planorbarius corneus, зараженных разными видами трематод, соотношение гранулоцитов и гиалиноцитов в циркуляции различно. Кроме того, гранулоциты и гиалиноциты преимущественно фагоцитируют разные виды бактерий.

4. У моллюсков Planorbarius corneus, зараженных разными видами трематод, различается уровень экспрессии генов, кодирующих факторы защитных реакций.

Реализация работы. По теме диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 6 статей и 12 тезисов.

Апробация работы. Результаты работы представлены в форме устных докладов и стендовых сообщений на: межвузовской конференции «Герценовские чтения» (Санкт-Петербург, 2003-2008), международной летней школе «Current trends in comparative immunology» (Санкт-Петербург, 2005), политехническом симпозиуме «Молодые учёные -промышленности Северо-западного региона» (Санкт-Петербург, 2007), IV Всероссийском Съезде Паразитологического общества при Российской Академии наук «Паразитология в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2008), 12-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008), заседании научного семинара кафедры зоологии беспозвоночных СПбГУ (2009).

Личный вклад соискателя состоит в участии в выборе экспериментальных подходов, получении основной части результатов, их обсуждении и написании статей. Препараты для изучения гемопоэза у моллюсков Biomphalaria glabrata и В. pfeifen были предоставлены Г. Л. Атаевым. Исследования на проточном цитометре проводились совместно с И. В. Кудрявцевым (Отдел иммунологии, НИИЭМ СЗО РАМН). Секвенирование амплификатов осуществлено коммерческой фирмой «АТГ Сервис-Ген» (Санкт-Петербург).

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературных данных по рассматриваемому вопросу, описание материалов и методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение. Материал иллюстрирован 55-ю рисунками и 2-мя таблицами. Список цитируемой литературы содержит 175 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава I. Обзор литературы Выполнен анализ современных представлений о клеточном и гуморальном иммунитете брюхоногих моллюсков. Особое внимание уделено оценке роли гемоцитов в защитных реакциях, их морфологической и функциональной характеристике. Обобщены имеющиеся сведения о гемопоэзе и вариантах классификации гемоцитов. Большое внимание уделено механизмам клеточных и гуморальных реакций. Также рассмотрены данные о генетических основах резистентности пульмонат к заражению трематодами.

Глава II. Материалы и методы Объекты исследования: легочные моллюски Biomphalaria glabrata, В. pfeiferi (лабораторные линии), Planorbarius corneus, Planorbis planorbis (собранные в водоёмах Ленинградской области); трематоды Cotylurus sp. (сем. Strigeidae), Notocotylus sp. (сем. Notocotylidae), Plagiorchis sp. (сем. Opistorchiidae), Bilharziella polonica (сем. Schistosomatidae), представитель сем. Echinostomatidae; бактерии Escherichia coli и Staphilococcus aureus.

Основные методы исследования.

Гемопоэтические структуры моллюсков изучали на парафиновых срезах (микротом Leica RM), окрашенных гематоксилинами Майера и Эрлиха с подкраской раствором эозина.

Анализ клеток гемолимфы. Живые гемоциты изучали в капле на предметном стекле с лунками, для длительного наблюдения гемолимфу инкубировали во влажной камере в течение 4-8 часов. Часть препаратов фиксировали и окрашивали эозин метиленовым синим по Май-Грюнвальду и гематоксилин-эозином Эрлиха. Подсчет числа клеток осуществляли в камере Горяева. Препараты фотографировали в режимах светлого поля и фазового контраста с использованием светофильтров (микроскоп Leica-DM5000). Цитофлуориметриический анализ использовали для изучения особенностей клеточного состава гемолимфы Planorbarius corneus, зараженных разными видами трематод, определения соотношения типов гемоцитов у моллюсков разных размеров, а также для оценки фагоцитарной активности гемоцитов. В последнем случае моллюскам предварительно инъецировали суспензии бактерий Escherichia coli и Staphilococcus aureus, меченных флуоресцеин-5-изотиоционатом (ФИТЦ). Контрольной группе вводили физиологический раствор.

Гемолимфу забирали непосредственно перед анализом на проточном цитометре (Вескшап Coulter). Методы флуоресцентной микроскопии были использованы для анализа фагоцитарной активности гемоцитов Planorbarius corneus. Моллюскам инъецировали суспензию меченных ФИТЦ бактерий Staphilococcus aureus и раствор нейтрального красного. Затем гемоциты анализировали в режимах фазового контраста, флуоресценции и совмещенном режиме. Для выявления пероксидазы в гемоцитах был адаптирован метод Амитэджа для мазков крови (Глик, 1950). Свежие мазки фиксировали 4 % параформальдегидом на фосфатном буфере, инкубировали в свежеприготовленном бензидиновом реактиве. После промывки и обезвоживания мазки подкрашивали раствором Романовского-Гимзы. Методы кариотипировапия применяли для выявления делящихся клеток среди циркулирующих гемоцитов. Для работы с гемоцитами были адаптированы методики работы с лейкоцитами позвоночных животных (Макгрегор, Варли, 1986). Препараты из тканей ноги и гонады приготовляли по описанной ранее методике (Ford, Hamerton, 1956).

Изучение экспрессии генов, кодирующих факторы защитных реакций. Тотальную РНК изолировали с использованием реактива "TRIzol Reagent" в соответствии с инструкцией производителя. По данным электрофореза (в 1% агарозном геле) полученные препараты РНК (А260/280=1,9) не содержали примесей ДНК и продуктов деградации РНК. Концентрацию РНК выравнивали по содержанию 28S рРНК. Синтез кДНК в реакции обратной транскрипции проводили на тотальной РНК со случайными праймерами или олиго^Т)-затравкой (Васин и др., 2004). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на полученной кДНК проводили со специфическими праймерами для амплификации предположительно транскрибируемого участка (Платонова и др., 2004). Гель-электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 1,4 % агарозе или в 8 % ПААГ, гели окрашивали соответственно бромистым этидием или AgNCh (Sambrook et al., 1989). В качестве маркеров использовали ДНК-маркеры молекулярных весов («Сибэнзим», Новосибирск).

Компьютерные программы. Для фотографирования препаратов клеток и тканей, оценки размеров и площадей клеток, была использована программа «Image Scope». Для работы с нуклеотидными последовательностями использовали открытые базы данных нуклеотидных «GenBank на сервере» NCBI, программы «BLAST», «BioEdit 7.0», «CLUSTAL W» (McGinnis, Madden, 2004). Для подбора праймеров и расчета условий амплификации использовали программу «Gene Runner 3.0». Для оценки интенсивности электрофоретических зон использовали программу «Scion Image 4».

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программы Microsoft Excel. Для определения различий между группами нормально

распределенных данных использовали Т-критерий Стьюдента для независимых и зависимых выборок. Для оценки взаимосвязи между различными признаками использовали коэффициент корреляции Пирсона. Различия считались значимыми при р<0,05.Данные выражены как среднее значение с указанием среднего квадратичного отклонения.

Глава III. Результаты

3.1. Клеточный состав гемолимфы

Анализ гистологических препаратов подтвердил наличие у моллюсков Biomphalaria glabrata и В. pfeiferi специализированной гемопоэтической структуры - АПО, расположенного между эпителиями перикардиальной и мантийной полости и состоит из групп удлиненных клеток (узелков). Несмотря на морфологическую и функциональную обособленность, топографически АПО остается связанным с перикардиальным эпителием. Заражение трематодами Echinostoma caproni и Schistosoma mansom активизирует АПО, что сопровождается увеличением размеров узелков в результате пролиферации входящих в их состав клеток, а также увеличением количества самих узелков.

Предварительное изучение гемопоэтических структур катушек Planorbarius corneus показало у них сходную локализацию АПО. Однако здесь отмечается большая его топографическая приуроченность к перикардиальному эпителию.

Гемоциты Planorbarius corneus представлены двумя основными типами -гранулоцитами и гиалиноцитами. Гранулоциты - хорошо распластывающиеся на субстрате клетки, размером 9,5+5,94 х 12,95±7,89 мкм. Они имеют овальные ядра, размером 4,08±2,76 х 5,26+2,18 мкм. Среднее ядерно-цитоплазматическое соотношение - 0,12. Внутренняя часть цитоплазмы этих клеток содержит многочисленные гранулы и везикулы. Гранулоциты хорошо распластываются на субстрате, формируя при этом филоподии и лобоподии. Гиалиноциты - округлые клетки, размером 6,12±1,24 х 8,13±,54 мкм. Они имеют округлые или овальные ядра, размером 2,56±1 х 3,32±1,35 мкм. Среднее ядерно-цитоплазматическое соотношение - 0,25. Гиалиноциты способны формировать лобоподии.

Гемоциты Biomphalaria glabrata также представлены гранулоцитами и гиалиноцитами. Гранулоциты биомфалярий имеют размеры 28±5 мкм, их ядра - 7±1,2 мкм. Размер гиалиноцитов составляет 7,2±1,0 мкм, их ядер - 3,5+0,6 мкм.

Инкубирование гемоцитов. Установлено, что гемоциты Planorbarius corneus сохраняют жизнеспособность во влажной камере на протяжении 4-8 часов (в зависимости от объема пробы и физиологического состояния моллюска). В дальнейшем происходит гибель клеток гемолимфы. Инкубирование с суспензиями бактерий и красителя значительно ускоряет этот процесс. Гранулоциты за время наблюдения распластываются на субстрате, изменяя форму и одновременно перемещаясь относительно первоначального места

прикрепления. Гиалиноциты медленнее закрепляются на субстрате и в течение временн наблюдения практически не меняют свою форму.

При инкубировании во влажной камере более 5 часов среди гранулоцитов преобладают крупные клетки с ядрами, содержащими крупные глыбки гетерохроматина. Именно такие клетки дольше других сохраняют жизнеспособность. Гранулоциты часто формируют скопления, включающие от 2 до 10 клеток.

Хромосомный анализ. Для изготовления препаратов хромосом использовали осажденные гемоциты моллюсков Р1апогЬаг1из согпеия, предварительно выдержанных в растворе колхицина. Также изготовляли контрольные препараты - из тканей ноги и гонады. На контрольных препаратах выявлены многочисленные метафазные пластинки (2п = 36). На препаратах из клеток гемолимфы митозов не обнаружено, что косвенно свидетельствует об отсутствии делящихся клеток в составе гемоцитов.

Зависимость соотношения морфологических типов циркулирующих гемоцитов от зараз/сепия моллюска. На основе цитофлуориметрического анализа в гемолимфе зараженных и незараженных моллюсков Р1апогЬагшз сотеия выявлены две популяции гемоцитов: мелкие клетки с небольшим числом гранул и крупные, более гранулярные клетки. По относительным размерам и гранулярности данные популяции гемоцитов соответствуют описанным выше гранулоцитам и гиалиноцитам.

Рисунок 1. Цитофлуорограмма гемолимфы моллюсков Р1апогЬапи.ч согпеия.

Регион \¥- гиалиноциты, регион V - гранулоциты. Ось абсцисс - прямое светорассеивание, ось

ординат - боковое светорассеивание.

У незараженных моллюсков гиалиноциты составляют 58,52±6,51%, а гранулоциты -37,08±7,28% от всех гемоцитов. при этом не выявлено четкой границы между выделенными популяциями. У моллюсков, зараженных трематодами Со(у/игиз эр., четко выделяются две популяции клеток. Гиалиноциты составляют 32,87±11,7%, а гранулоциты - 57,42±8,37% от всех клеток гемолимфы. У моллюсков, зараженных партенитами ЫоЮсо1у1т ер. наблюдается схожая картина: гранулоциты и гиалиноциты составляют, соответственно, 34,07±9,13% и 56,10±10,6% от всех клеток гемолимфы. У моллюсков, зараженных трематодами Pla.giorch.is ер., соотношение популяций клеток оказывается близким к соотношению гемоцитов у незараженных особей: гранулоцитов - 31,68±5,13%, гиалиноцитов - 56,32+4,96%. Однако в этом случае отмечена более четкая граница между гранулоцитами и гиалиноцитами. У катушек, зараженных партенитами сем. ЕсЫпо5К)таПс1ае, гранулоциты составляют в среднем

V

37,8±7.28 ? -158,52±6.51%.''''

31,68±5.13%

Незаряженный Зараженный Со1у1иги\ ер.

Зараженный Р1йк'а>гс1ш эр.

г

41,31±8,Ю%, а гиалиноциты - 38,06±11,48% от всех гемоцитов. Таким образом, заражение различными видами трематод по-разному влияет на соотношение популяций гемоцитов в гемолимфе моллюсков.

Рисунок 2. Соотношение клеточных типов в гемолимфе моллюсков Planorbarius corneus по данным цитофлуориметрического анализа. По оси абсцисс: 1 - незараженные особи, 2-5 - особи, зараженные трематодами: 2 -Cotylurus sp., 3 - Notocotylus sp., 4 -Plagiorchis sp., 5 - сем. Echinostomatidae. По оси ординат: процент клеток от общего числа в циркуляции.

80 60 40 20 о

□ гиалиноциты □ гранулоциты f

Соотношение морфологических типов циркулирующих гемоцитов у моллюсков разных размеров. Дополнительно был выполнен анализ корреляции между размерами моллюска и соотношением гиалиноцитов и гранулоцитов в циркуляции. Установлено наличие достоверной отрицательной корреляции между этими параметрами (г =-0,93, тг=0,076, при п=31). У мелких моллюсков гранулоцитов меньше, а гиалиноцитов больше, чем у более крупных особей (Рис. 3).

80 70 60 50 40 30 20

гиалиноциты гранулоциты

22—25

26—29

30—33

34—37

Рисунок 3.

Соотношение гранулоцитов и гиалиноцитов у моллюсков Р1апогЪапт сотеш с разным диаметром раковины. По оси абсцисс: классы с разным диаметром раковины (мм). По оси ординат: процент клеток от общего числа в циркуляции.

Численность циркулирующих гемоцитов. В 1 мм гемолимфы моллюсков Planorbarius corneus содержится от 215 до 1089 клеток (в среднем 439). Прямой зависимости численности циркулирующих гемоцитов от зараженности и размеров моллюска нами не выявлено.

Фагоцитоз. Для исследования фагоцитарной активности гемоцитов моллюскам вводили суспензии бактерий Escherichia coli и Staphylococcus aureus, меченных ФИТЦ. Цитофлуориметрический анализ показал, что наибольшая интенсивность флуоресценции гемоцитов наблюдается через 3 часа после инъекции (Рис. 4). Кишечную палочку фагоцитируют 49,31±12,39%, а стафилококка - 78,5±7,14% гемоцитов. При этом кишечную палочку интенсивнее фагоцитируют гиалиноциты, а стафилококка - гранулоциты. Через 6-12 часов происходит снижение флуоресценции, что может указывать на переваривание бактерий.

А

■FT

Рисунок 4. Поглощение меченых ФИТЦ бактерий Staphylococcus aureus гемоцитами Planorbarius corneus. А. Гистограмма. Б. Цитофлуорограмма. По оси абсцисс: боковое светорассеивание. По оси ординат-, интенсивность флуоресценции ФИТЦ.

Гемоциты моллюсков, зараженных трематодами, менее интенсивно фагоцитируют бактерий. Только 50,13+5,30% гемоцитов улиток, зараженных партенитами Cotylurus sp., поглощают меченных ФИТЦ Staphylococcus aureus.

Микроскопический анализ клеток гемолимфы инъецированных моллюсков показал наличие в цитоплазме гранулоцитов флуоресцирующих структур размером 2-4 мкм, что значительно превышает размеры бактериальных клеток. Учитывая время взятия пробы после инъекции, можно предположить, что это фагоцитарные вакуоли (вторичные лизосомы), содержащие частично переваренные бактерии. Через 4-6 часов после инъекции флуоресцирующие структуры были найдены лишь в единичных гранулоцитах. В гиалиноцитах флуоресцирующих структур не обнаружено.

Инкубация гемоцитов с ФИТЦ-мечеными бактериями in vitro в течение 15-30 мин приводит к появлению в цитоплазме гранулоцитов флуоресцирующих структур, по размерам соответствующих бактериальным клеткам. При более длительной инкубации в гемоцитах обнаруживаются крупные флуоресцирующие структуры.

Одновременно был проведен анализ поглощения гемоцитами красителя нейтрального красного. Раствор красителя инъецировали моллюскам, а также добавляли к гемоцитам, инкубируемым во влажной камере. В обоих случаях через 15-60 минут в цитоплазме как гранулоцитов, так и гиалиноцитов обнаруживаются скопления красителя в виде крупных гранул. Гранулы локализуются преимущественно в цитоплазме вблизи ядра.

Пероксидазная активность гемоцитов. Инкубирование гемоцитов с 0,02% раствором диаминобензидина показало пероксидазную активность части гранулоцитов. Наличие пероксидаз может указывать на фагоцитарную активность этих клеток.

3. 2. Анализ экспрессии генов, кодирующих факторы защитных реакций, у зараженных трематодами моллюсков. Для исследования были выбраны факторы, которые по последним данным принимают участие в защитных реакциях пульмонат при заражении партенитами трематод: фибриногенподобный белок (FREP), кальций-связывающий белок (СаВР), С-подобный лектин (CLECT), цистатинподобный белок (Cyst)(Guillou et al., 2007).

В настоящее время в публикациях и электронных базах данных отсутствуют сведения по нуклеотидным последовательностям, соответствующим факторам защитных реакций

Planorbarius corneus. В связи с этим специфические праймеры для изучения экспрессии генов исследуемых в работе факторов защитных реакций Planorbarius corneus подбирали по консервативным участкам соответствующих нуклеотидных последовательностей других пульмонат, имеющимся в электронных базах данных (геномные ДНК и мРНК) (Табл.1).

Исследования проводили на препаратах тотальной РНК, которую выделяли из всего тела моллюска, а также гепатопанкреаса и гемолимфы незараженных и зараженных партенитами особей. Уровень экспрессии изучаемых генов определяли относительно активности гена р - актина в тех же препаратах РНК.

Таблица 1. Праймеры, использованные для анализа экспрессии р-актина и факторов защитных реакций у моллюсков Р1апогЬапий согпеи$

мРНК Номер в «GcncBank» Нуклеотидные последовательности прямого (F) и обратного (R) праймеров Расчетная длина продуктов ПЦР, п.н. t отжига, °С

actin AF329436 F 5' ATTATGAGGTTAGATTTGGCTGGTC 3' R 5' CTGTGATTTCTTTCTGCATTCTGTC 3' 432 59

FREP 7.1 AY028462 F 5'TATAGAGGCTGGCAGGAGTATCGTG 3' R 5' GACATGTGCAGTTTGAAGTAGCGTG 3' 433 63

CLECT ЕВ 709537 F 5' ACCAATGGAGGAGGCTAC 3' R 5' TCAATGCAATCTTCGTTTC 3' 221 63

СаВР ЕВ 709539 F 5' CTTGCTATTATTGCTGTTG 3' R 3' AAGAGATGGAAGATGTGTG 3' 308 60

Cyst ЕВ 709538 F 5' GGATCCCGTCTGTAACTC 3' R 5' ACAATGAAAGGCAATGG 3' 597 50,5

Экспрессия генов факторов защитных реакций. мРНК FREP выявлена во всех исследуемых образцах. Размер получаемого с помощью специфических праймеров ПЦР-продукта по результатам электрофоретического анализа приблизительно 560 п.н., т. е. больше расчетного приблизительно на 130 п.н. Уровень экспрессии гена FR ЕР у незараженных и зараженных разными видами трематод моллюсков различается (Рис. 6). При заражении партенитами Cotylurus sp. и Bilharziella polonica экспрессия гена, кодирующего FREP, выше, чем у незараженных моллюсков. У катушек, зараженных Notocotylus sp. и Plagiorchis sp. уровень экспрессии гена значительно ниже, чем у незараженных. Кроме того, в гепатопанкреасе зараженных трематодами моллюсков ген, кодирующий FREP, экспрессируется интенсивнее, чем у незараженных. В то же время, в гемолимфе зараженных моллюсков уровень его экспрессии значительно ниже, чем у незараженных. В среднем экспрессия мРНК FREP выше в гепатопанкреасе, чем в гемолимфе.

Специфические праймеры, позволяющие амплифицировать выбранный нами консервативный участок гена CLECT, на разных кДНК выявляли продукты разной длины: приблизительно 290 и 510 п.н. Для измерения уровня экспрессии гена CLECT были

использованы образцы, в которых представлен продукт длиной 290 п.н. Полученные данные показывают, что экспрессия гена СЬЕСТ у зараженных моллюсков значительно выше, чем у незараженных (Рис. 5, 6).

1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

i

Si

[i

Рисунок 5. Экспрессия генов факторов защитных реакций в гепатопанкреасе и гемоцитах моллюсков Planorbarius corneus.

А - гемоциты незараженных, Б -гемоциты зараженных, В гепатопанкреас зараженных, Г -гепатопанкреас незараженных. По оси ординат: уровень экспрессии относительно ß-актина. По оси tn абсцисс: 1 - FREP, 2 - CLECT, 3 -1 2 3 4 СаВР, 4-Cyst.

1234 1234 1234

Праймеры, специфичные выбранному участку гена СаВр, также выявляют два продукта - длиной около 390 и 600 п.н. Уровень экспрессии гена СаВр у моллюсков, зараженных СоГуШгиБ Бр. и ВНИап^еИа ро1опка, выше, а Ыо1осо[у1из эр. и Р1а£югМз эр. ниже, чем у незараженных (Рис.6). В гемоцитах зараженных моллюсков мРНК СаВр экспрессируется значительно интенсивнее, чем у незараженных. В то же время, уровень экспрессии СаВр в гемолимфе зараженных моллюсков лишь незначительно отличается от незараженных моллюсков (Рис. 5).

1,0

0,8 -

0,6

0,0

В

й

IÍÜ

д

rill

Рисунок 6. Экспрессия генов факторов защитных реакций у моллюсков Planorbarius corneus, зараженных размыми видами трематод. А - незараженные моллюски, Б - Д - зараженные трематодами моллюски: Б Cotylurus sp., В -Notocotylus sp. Г -Plagiorchis sp., Д - Bilhariiella polonica. По оси ординат: уровень экспрессии гена относительно ß-актина. По оси абсцисс: 1 - FREP, 2 - CLECT, 3 - СаВР, 4 - Cyst.

1234 1234 1234 1234 1234

Праймеры, используемые нами для выявления мРНК Cyst, на разных препаратах кДНК зараженных трематодами моллюсков направляли синтез амплификатов разных размеров: 250, 400, 450 и 700 п.н. В препаратах мРНК, полученного из всего тела и из гемолимфы незараженных моллюсков, соответствующий Cyst ПЦР-продукт не выявляется, в то время как в гепатопанкреасе он был обнаружен у одной из незараженных особей. Таким образом, мРНК Cyst экспрессируется в идентифицируемых количествах только у зараженных трематодами моллюсков (Рис.6). Оказалось, что уровень экспрессии гена Cyst значительно выше в гепатопанкреасе, чем в гемолимфе зараженных моллюсков (Рис. 5).

Анализ нуклеотидных последовательностей кДНК факторов защитных реакций Planorbarius corneus. Полученные ПЦР-продукты, предположительно соответствующие ß -актину, PREP, CLECT и СаВР, были секвенированы. Выявленные последовательности сравнивались с нуклеотидными последовательнотями Biomphalaria glabrata, по которым производился подбор специфических праймеров.

Анализ данных секвенирования показал, что нуклеотидная последовательность амплификата Planorbarius corneus (442 п.н.), полученного с использованием специфических праймеров для ß-актина, на 90% совпадает с последовательностью мРНК Biomphalaria glabrata, по которой производился подбор праймеров. Последовательность нуклеотидов ПЦР-продукта (566 п.н.), полученная с праймерами для гена FREP, на 79 % совпадает с последовательностью мРНК биомфалярии, по которой производился подбор праймеров. Однако полученная кДНК содержит участок, длиной 97 п.н., отсутствующий в соответствующем гене биомфалярии. На оставшемся участке последовательности совпадают на 86%. В случае СаВР нуклеотидная последовательность ПЦР-продукта (393 п.н.) на 65,5 % совпадает с последовательностью мРНК биомфалярии, по которой производился подбор праймеров. При этом полученная кДНК содержит участок, длиной 36 п.н., отсутствующий в кДНК, соответствующей мРНК биомфалярии. На оставшемся участке последовательности совпадают на 78,5 %.

Глава IV. Обсуждение

Основными эффекторными элементами защитных реакций пульмонат являются циркулирующие клетки гемолимфы - гемоциты. Это подтверждается изменением клеточного состава гемолимфы и функциональной активности гемоцитов при воздействии чужеродных объектов, в частности трематод и бактерий.

Периодически появляются сообщения о том, что клеточный и гуморальный ответы на заражение разными паразитами имеют специфические особенности (Lewis et al., 2001). Полученные с помощью цитофлуориметрического анализа данные подтверждают видоспецифичность клеточного ответа на заражение партенитами разных видов трематод. Возможно, это связано с различными стратегиями развития трематод в моллюске (Добровольский и др., 1983; Bayne et al., 2001).

Основным проявлением реализации защитных реакций пульмонат является изменение активности гемоцитов. Полученные данные подтверждают наличие в гемолимфе пульмонат двух клеточных типов - гранулоцитов и гиалиноцитов (Ottaviani, 1989). Среди гранулоцитов нами описаны крупные клетки, которые при инкубировании дольше других гемоцитов сохраняют жизнеспособность. Морфологически похожие клетки были описаны ранее в составе капсул вокруг дегенерирующих спороцист (Cheng, Galloway, 1970). Возможно,

именно такие клетки являются специализированной группой гранулоцитов, участвующих в процессах инкапсуляции. Помимо морфологических различий, нами отмечены функциональные особенности этих клеточных типов. Так, гранулоциты преимущественно фагоцитируют Escherichia coli, а гиалиноциты - Staphylococcus aureus, что указывают на функциональную специализацию гемоцитов в отношении антигена.

Отмеченное нами снижение интенсивности фагоцитоза бактерий гемоцитами зараженных моллюсков подтверждает предположение, что продукты жизнедеятельности спороцист способны подавлять активность гемоцитов. Кроме того, снижение фагоцитоза бактерий возможно связано с участием гемоцитов в инкапсуляции спороцист. По некоторым данным в состав капсул и мантий вокруг паразитов входят в основном гранулоциты (Stumpf, Gilbertson, 1978). Снижение фагоцитоза бактерий Escherichia coli, которых, по нашим данным, поглощают именно гранулоциты, подтверждает эти данные. В пользу предположения об основной роли гранулоцитов в защитных реакциях свидетельствует и то, что только для них обнаружена пероксидазная активность. Кроме того, у более крупных моллюсков соотношение клеточных типов в гемолимфе заметно смещается в сторону гранулоцитов. С возрастом моллюски подвергаются влиянию большего количества антигенов - соответственно, должно возрастать число функционально активных клеток.

Полученные нами данные подтверждают точку зрения, что источником гемопоэза у пульмонат является АПО, расположенный в кровеносных синусах между эпителиями перикардиальной и мантийной полости. При этом топографически АПО сохраняет связь со стенкой перикарда, являясь, на наш взгляд, его производным. Мы не обнаружили делящихся клеток среди циркулирющих гемоцитов, что также свидетельствует о центральной роли АПО в гемопоэзе.

Анализ экспрессии генов факторов защитных реакций пульмонат подтвердил видоспецифичность гуморальных реакций пульмонат. У моллюсков, зараженных партенитами Cotylurus sp. и Bilharziella polonica, повышается уровень экспрессии всех анализированных генов факторов защитных реакций, а у катушек, зараженных Nolocotylus sp. и Plagiorchis sp.- только генов, кодирующих CLECT и Cyst.

Анализ нуклеотидных последовательностей ПЦР-продуктов, полученных со специфическими праймерами для изучаемых генов, которые подбирали по имеющимся в литературе последовательностям (генов или мРНК) других моллюсков, подтвердил факт выявления транскриптов именно рассматриваемых факторов. Результаты молекулярно-генетического анализа подтверждают роль гемоцитов и клеток гепатопанкреаса в продукции гуморальных факторов защитных реакций. Например, у незараженных моллюсков уровень экспрессии гена, кодирующего FREP, выше в гепатопанкреасе, чем в гемоцитах. При

заражении он повышается в гепатопанкреасе и резко снижается в гемоцитах. Гепатопанкреас является основным местом паразитирования спороцист, a FREP участвуют в межклеточных взаимодействиях и, по некоторым данным, в формировании капсул вокруг паразитов (Adema et а!.. 1997). Резкое снижение экспрессии гена FREP в гемолимфе может быть связано с подавлением иммунного ответа моллюска паразитом (Sire et al., 1998). У моллюсков, зараженных трематодами, происходит значительное повышение уровня экспрессии генов, кодирующих CLECT и СаВР. Это подтверждает роль соответствующих белков в подавлении патогенов Согласно литературным данным, лектины С-типа участвуют в процессах распознавания чужеродного, опсонизации, а СаВР - в регуляции подвижности клеток (McGreal et al., 2004; Santamaria-Kisiel et al., 2006).

ВЫВОДЫ

1. Клеточные реакции являются преобладающими в реализации защитных реакций легочных моллюсков на чужеродные факторы. Основным проявлением защитных реакций пульмонат является изменение активности гемоцитов. Центральным источником гемопоэза пульмонат служит амёбоцит-продуцирующий орган, расположенный между перикардиальным и мантийным эпителиями. Случаев деления циркулирующих гемоцитов не обнаружено. С использованием цитофлуриметрического анализа подтверждено наличие в гемолимфе пульмонат двух основных типов клеток: гранулоцитов и гиалиноцитов, различающихся морфологически и функционально.

2. Полученные данные о способности гемоцитов к фагоцитозу, формированию активных форм кислорода, участии в экспрессии гуморальных факторов подтверждают их роль как основных эффекторных элементов клеточных и гуморальных защитных реакций пульмонат.

3. Клеточный ответ пульмонат на трематодную инвазию и бактериальное заражение видоспецифичен. Соотношение типов гемоцитов различно у моллюсков Planorbarius corneus, зараженных трематодами родов Cotylurus, Notocotylus, Plagiorchis и семейства Echinostomatidae. Гиалиноциты активнее фагоцитируют бактерии Escherichia coli, а гранулоциты - Staphylococcus aureus.

4. Гуморальный ответ пульмонат на заражение трематодами также видоспецифичен: уровень экспрессии генов фибриногенподобного белка, С-лектина, кальций-связывающего белка и цистатинподобного белка различны у незараженных молюсков Planorbarius corneus и моллюсков, зараженных трематодами Notocotylus sp., Plagiorchis sp, Cotylurus sp. и Bilharziella polonica.

5. Гемоциты и клетки гепатопанкреаса пульмонат участвуют в продукции гуморальных факторов защитных реакций. Это подтверждают результаты анализа экспрессии генов,

кодирующих факторы защитных реакций гастропод: у моллюсков Planorbarius corneus, зараженных трематодами, уровень экспрессии генов С-лектина и кальций-связывающего белка повышается в гемоцитах, а генов фибриногенподобного и цистатинподобного белков - в гепатопанкреасе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи, опубликованные в журналах, рекомендованных ВАК:

1. Атаев Г. JI., Ерёмина (Прохорова) Е. Е„ Полевщиков А. В. 2005. Защитные реакции брюхоногих моллюсков. Гуморальные реакции // Паразитология. Т.39, №1. СПб.: Санкт-Петербургская издательская фирма РАН. С. 3-15.

Другие публикации:

1. Атаев Г. Л., Ерёмина (Прохорова) Е. Е. 2003. Современные преставления о клеточном иммунитете пульмонат// Функциональная морфология, экология и жизненные циклы животных. Сб. научн. трудов каф. зоологии РГПУ им. А. И. Герцена. СПб.: ТЕССА, С. 33-42.

2. Ерёмина (Прохорова) Е. Е. 2005. Клеточный состав гемолимфы моллюсков Biomphalaria glabrata (Gastropoda, Pulmonata) // Вестник студенческого научного общества РГПУ им. А. И. Герцена: Сб. лучших научн. работ 2005 г. СПб.: изд-во РГПУ. С. 227-229.

3. Прохорова Е. Е. 2006. Основные подходы к изучению генетических основ резистентности у гастропод. // Функциональная морфология, экология и жизненные циклы животных. Сб. научн. трудов каф. зоологии РГПУ им. А. И. Герцена. СПб.: ТЕССА. Вып. 6. С. 33-42.

4. Прохорова Е. Е. 2007. Клеточный состав гемолимфы моллюсков Planorbarius corneus (Gastropoda, Pulmonata) // Функциональная морфология, экология и жизненные циклы животных. Сб. научн. трудов каф. зоологии РГПУ им. А. И. Герцена. СПб.: ТЕССА. Вып. 7. С. 70-75.

5. Прохорова Е. Е„ Атаев Г. Л. 2008. Генетические основы резистентности гастропод // Известия РГПУ им. А.И. Герцена. Т. 10, вып. 64. С. 86-96.

6. Ерёмина (Прохорова) Е. Е. 2003. Изучение гемоцитов моллюсков рода Biomphalaria (Gastropoda)// Герценовские чтения. Вып. 3. СПб.: ТЕССА. С. 42-43.

7. Ерёмина (Прохорова) Е. Е. 2004. О роли лектинов в защитных реакциях брюхоногих моллюсков//Герценовские чтения. Вып. 4. СПб.: ТЕССА. С. 37-39.

8. Ерёмина (Прохорова) Е. Е. 2005. Методы изучения гемоцитов моллюсков Biomphalaria glabrata (Pulmonata)// Герценовские чтения. Вып. 5. СПб.: ТЕССА. С. 42-43.

9. Ereraina (Prokhorova) Е. Е. 2005. Defense reactions of Biomphalaria glabrata (Mollusca: Pulmonata)// Abstracts of DAAD Summer School on "Current trends in comparative immunology". St. Peterburg. P. 15.

10. Прохорова E. E. 2007. Изучение экспрессии факторов защиных реакций у моллюска Planorbarius corneus (Gastropoda, Pulmonata)// Герценовские чтения. Вып. 7. СПб.: ТЕССА. С. 65-69.

П.Прохорова Е. Е., Разумова Т. А. 2007. Использование молекулярно-генетических методов в исследовании иммунитета беспозвоночных // Молодые учёные - промышленности Северо-западного региона. Материалы конференции политехнического симпозиума 2007 года. - СПб.: Изд-во Политехнического университета. С. 126-127.

12. Прохорова Е. Е„ Емельяненко М. С. 2008. Изучение факторов защитных реакций моллюска Planorbarius corneus (Gastropoda, Pulmonata) II Герценовские чтения. Вып. 8. СПб.: ТЕССА. С. 58-61.

13. Виноградова Е.О., Прохорова Е. Е. 2008. Факторы защитных реакций, экспрессирусмые гемоцитами гастропод // Герценовские чтения. Вып. 8. СПб.: ТЕССА. С. 51-53.

14. Разумова Т. А., Прохорова Е. Е. 2008. Изучение гемоцитов моллюсков Planorbarius corneus (Gastropoda, Pulmonata) // Герценовские чтения. Вып. 8. СПб.: ТЕССА. С. 61 - 62.

15. Прохорова Е. Е., Атаев Г.Л. 2008. Основные подходы к изучению генетических основ резистентности моллюсков. Материалы IV Всероссийского Съезда Паразитологического общества при Российской академии. Т. 3. СПб.: ЛЕМА. С. 69-72.

16. Прохорова Е. Е. 2008. Изучение экспрессии пектинов у моллюсков Planorbarius corneus, зараженных партенитами трематод. Биология - наука XXI века: Сб. тезисов 12-й Пущинской международной школы-конференции молодых ученых (10-14 ноября 2008 года). Пущино. С. 146.

17. Васильева Е. А., Виноградова Е. О. Прохорова Е. Е. 2009. Изучение хромосом моллюсков Planorbarius corneus (Gastropoda, Pulmonata) // Герценовские чтения. Вып. 9. СПб.: ТЕССА. С. 59-60.

Благодарности

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность Г. Л. Атаеву, А. В. Полевщикову, А. А. Добровольскому и Н. В. Цымбаленко за многолетнее внимание к моим исследованиям и помощь в подготовке диссертации. Отдельная благодарность заведующему кафедрой зоологии РГПУ им. А. И. Герцена М. А. Гвоздеву и всему коллективу кафедры. Также хочу поблагодарить за практические консультации, помощь и поддержку, которую мне оказали С. В. Барабанова, И. В. Кудрявцев, С. А. Клотченко, Р. Пяткявичюте, П. В. Озерский.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 05-04-48520, гранта Министерства образования 2.1.1./5290, стипендии Фонда им. В. И. Вернадского и стипендии Правительства Санкт-Петербурга.

Подписано в печать 04.04.2009г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 1148.

Отпечатано в ООО «Издательство "J1EMA"»

199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д.24, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@mail.ru http://www.lemaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Прохорова, Елена Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ

Список условных обозначений

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Клеточные защитные реакции пульмонат

I. 1. 1. Гемопоэз

I. 1.2. Численность циркулирующих гемоцитов

I. 1.3. Морфология гемоцитов

I. 1.4. Функциональная активность гемоцитов

I. 1. 5. Механизмы клеточных реакций

1. 2. Гуморальные защитные реакции пульмонат

I. 2. 1. Молекулярные основы гуморальных реакций пульмонат

I. 2. 2. Проявления гуморальных реакций пульмонат

I. 3. Генетические основы резистентности пульмонат

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

II. 1. Объекты исследования

II. 2. Методы исследования

II. 2. 1. Содержание моллюсков 37 II. 2. 2. Определение зараженности 37 II. 2. 3. Методы изучения и гемоцитов 38 II. 2. 4. Методы изучения экспрессии генов факторов защитных реакций

II. 2. 5. Компьютерные программы

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ

III. 1. Клеточный состав гемолимфы

III. 1.1. Гемопоэз 44 III. 1.2. Морфологический и количественный анализ клеток гемолимфы 47 III. 1. 3. Функциональная активность гемоцитов

III. 2. Анализ экспрессии генов, кодирующих факторы защитных реакций у моллюсков, зараженных партенитами трематод 69 III. 2. 1. Поиск нуклеотидпых последовательностей и подбор праймеров, соответствующих факторам защитных реакций

III. 2. 2. Экспрессия генов, кодирующих факторы защитных реакций

III. 2. 3. Анализ нуклеотидных последовательностей кДНК факторов защитных реакций Planorbarius corneus

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

IV. 1. Анализ клеточных реакций пульмонат

IV. 2. Анализ гуморальных реакций пульмонат

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Защитные реакции пульмонат (Gastropoda)"

Сведения о функционировании системы иммунитета у организмов разных таксонов составляют основу сравнительно-иммунологических построений, раскрывающих пути её становления. Легочные брюхоногие моллюски (Gastropoda, Pulmonata) в этом отношении являются одной из наиболее интенсивно изучаемых моделей среди беспозвоночных. За время своего существования они приобрели широкий круг симбионтов, включающий как комменсалов, так и специфичных паразитов. Особое место среди последних принадлежит трематодам, многие из которых являются возбудителями опасных заболеваний человека и животных.

Первые работы, посвященные изучению проявлений иммунитета у моллюсков, появились в середине XX века. Во многом это обусловлено возросшим интересом исследователей к изучению партеногенетических поколений трематод, паразитирующих в моллюсках (см.: Гинецинская, 1968; Добровольский и др., 1983; Dobrovolskij, Ataev, 2003). Первоначально защитные реакции моллюсков рассматриваются именно как фактор, определяющий или ограничивающий развитие партенит (Files, Cram, 1949; Schreiber, Schubert, 1949).

Трематоды, как правило, демонстрируют узкую специфичность не только по отношению к конкретным видам моллюсков, но и к отдельным «расам» своих хозяев. Это явление и стало предметом первых исследований, посвященных генетическим основам устойчивости моллюсков к заражению трематодами (Newton, 1953, 1954, 1955). Результатом стало выведение линий моллюсков, характеризующихся выраженной резистентностью или чувствительностью к заражению трематодами. Фенотипическим проявлением устойчивости к заражению является формирование клеточной реакции, подавляющей развитие партенит (Richards, 1970).

Таким образом, на протяжении последних десятилетий защитные реакции моллюсков стали предмеюм специальных исследований не только трематодчиков, по и широкого круга паразитологов, а также специалистов в области сравнительной иммунологии (Галактионов, 1995; Adema et al., 2001; Connors, 2003). В тоже время, отечественные работы, посвященные изучению иммунитета легочных моллюсков, появляются только с середины 90-х годов и весьма немногочисленны (см.: Галактионов, 1995; Полевщиков, 1996; Атаев, Полевщиков, 2004 и др.).

Следует отметить, что именно при изучении пульмонат (Biomphalaria, Lymnaea, Helix) впервЕле получены сведения о защитных реакциях моллюсков на трематодную инвазию, бактериальное заражение, пересадку трансплантатов органов (Lie, Heyneman, 1975, 1976; Jourdane, Cheng, 1987). Но в настоящее время, значительная часть исследований защитных реакций моллюсков выполняется на представителях двустворчатых (Cheng, 1996; Lacoste et al., 2002; Bachere et al., 2004). Для работы с бивальвиями были адаптированы многие методы, используемые традиционно для изучения иммунитета позвоночных (иммуногистохимические, молекулярно-генетические и другие).

Большинство исследований, посвященных защитным реакциям пульмонат, затрагивают только отдельные аспекты функционирования их внутренних защитных систем. Например, подробно исследуются проявления клеточных и гуморальных реакций, описываются специфические особенности ответа на заражение разными группами патогенов. При этом во многом остаются невыясненными механизмы регуляции клеточного и гуморального ответов, пути взаимодействия гуморальных и клеточных компонентов. Поэтому, несмотря на большой интерес к данному вопросу, сведения о защитных реакциях легочных моллюсков остаются во многом фрагментарными, а зачастую и противоречивыми.

Кроме того, большинство исследований в этой области выполнено на ограниченном круге моллюсков. Для выяснения механизмов формирования защитных реакций пульмонат, прежде всего, необходим комплексный анализ клеточных и гуморальных компонентов этой системы, а также расширение количества изучаемых моделей.

Следует отметить важную терминологическую особенность, присущую работам в области защитных реакций моллюсков и беспозвоночных в целом. Термины «иммунитет» и «иммунный ответ» сформировались для определения реакций приобретенного иммунитета позвоночных животных. Поэтому, если и применяются по отношению к беспозвоночным, то только с определенными оговорками (см.: Атаев и др., 2005). Соответственно, в зарубежной, а позднее и отечественной литературе сложилась терминология для определения иммунных реакций беспозвоночных. Процессы, направленные на поддержание постоянства внутренней среды организма беспозвоночных обозначают как «защитные реакции» (defense reactions) (Van der Knaap, 1990; Атаев и др., 2006). При этом, имеются ввиду не физико-химические барьеры (например, раковина, слизь) и поведенческие реакции моллюсков (см.: Галактионов, 1995), а клеточные и гуморальные компоненты внутренней среды, обеспечивающие распознавание и элиминацию чужеродных агентов. Этой терминологией мы и будем преимущественно пользоваться в рамках данного исследования.

Целью данной работы явился анализ защитных реакций лёгочных моллюсков. Соответственно были определены следующие задачи исследования:

1) изучить гемопоэз и морфологию гемоцитов моллюсков Planorbarius corneus и Biomphalaria glabrata;

2) охарактеризовать функциональную активность гемоцитов моллюсков Planorbarius corneus;

4) проанализировать экспрессию генов факторов защитных реакций у моллюсков Planorbarius corneus при заражении трематодами;

3) оценить специфичность клеточного и гуморального ответов пульмонат на заражение партенитами трематод;

5) оценить роль клеточных и гуморальных факторов в реализации защитных реакций пульмонат.

Считаю своим приятным долгом выразить глубокую благодарность Г. J1. Атаеву, А. В. Полевщикову, А. А. Добровольскому и Н. В. Цымбаленко за многолетнее внимание к моим исследованиям и помощь в подготовке диссертации. Отдельная благодарность I заведующему кафедрой зоологии РГПУ им. А. И. Герцена М. А. Гвоздеву и всему коллективу кафедры. Также хочу поблагодарить за практические консультации, помощь и поддержку С. В. Барабанову, И. В. Кудрявцева, С. А. Клотченко, Р. Пяткявичюте, Н. А. Михайлову, П. В. Озерского.

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

Список сокращений, принятых в тексте:

АПО - амёбоцит-продуцирующий орган; ЛПС — липополисахариды; МС -материнская спороциста; кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота; ИЛ - интерлейкин; НАДФН - никотинамиадениндинуклеотидфосфат; ОТ-ПЦР -полимеразная цепная реакция, сопряжённая с обратной транскрипцией; ПЦР -полимеразная цепная реакция; ПААГ — полиакриламидный гель; п. н. — пара нуклсотидов; п. з. - после заражения; т. п. н. - тысяча пар нуклеотидов; ФИТЦ - флуоресцеин-5-изотиоционат; FREP - фибриногенподобный белок; СаВР - кальций-связывающий белок; CLECT - С-лектин; Cyst - цистатинподобный белок.

Список условных обозначений к иллюстрациям: а — аорта; апо — амёбоцит-продуцирующий орган; Г -гранулы; ж - желудочек сердца; м - митоз; мп - мантийная полость; пк - перикард; Я -ядро; FREP — фибриногенподобный белок; СаВР — кальций-связывающий белок; CLECT — С-лектин; Cyst - цистатинподобный белок; FLUO — режим флуоресценции; FLUO/PH — режим флуоресценции, совмещенной с фазовым контрастом; РН — режим фазового контраста.

Заключение Диссертация по теме "Зоология", Прохорова, Елена Евгеньевна

выводы

1. Клеточные реакции являются преобладающими в реализации защитных реакций легочных моллюсков па чужеродные факторы. Основным проявлением защитных реакций пульмонат является изменение активности гемоцитов. Центральным источником гемопоэза пульмонат служит амёбоцит-продуцирующий орган, расположенный между перикардиальным и мантийным эпителиями. Случаев деления циркулирующих гемоцитов не обнаружено. С использованием цитофлуриметрического анализа подтверждено наличие в гемолимфе пульмонат двух основных типов клеток: гранулоцитов и гиалиноцитов, различающихся морфологически и функционально.

2. Полученные данные о способности гемоцитов к фагоцитозу, формированию активных форм кислорода, участии в экспрессии гуморальных факторов подтверждают их роль как основных эффекторных элементов клеточных и гуморальных защитных реакций пульмонат.

3. Клеточный ответ пульмонат на трематодную инвазию и бактериальное заражение видоспецифичен. Соотношение типов гемоцитов различно у моллюсков Planorbarius corneus, зараженных трематодами родов Cotylurus, Notocotylus, Plagiorchis и семейства Echinostomatidae. Гиалиноциты активнее фагоцитируют бактерии Escherichia coli, а гранулоциты - Staphylococcus aureus.

4. Гуморальный ответ пульмонат па заражение трематодами также видоспецифичен: уровень экспрессии генов фибриногенподобного белка, С-лектина, кальций-связывающего белка и цистатииподобиого белка различны у незараженных молюсков Planorbarius corneus и моллюсков, зараженных трематодами Notocotylus sp., Plagiorchis sp., Cotylurus sp. и Bilharziella polonica.

5. Гемоциты и клетки гепатопанкреаса пульмонат участвуют в продукции гуморальных факторов защитных реакций. Это подтверждают результаты анализа экспрессии генов, кодирующих факторы защитных реакций гастропод: у моллюсков Planorbarius corneus, зараженных трематодами, уровень экспрессии генов С-лектина и кальций-связывающего белка повышается в гемоцитах, а генов фибриногенподобного и цистатинподобного белков - в гепатопанкреасе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Прохорова, Елена Евгеньевна, Санкт-Петербург

1. Аванесян А. А. 2002. Влияние защитных реакций моллюсков на развитие партенит трематод (на примере семейства Echinostomatidae): Автореф. дис. . канд. биол. наук. СПб: СПбГУ, 18 с.

2. Алякринская И. О. 1970. Количественная характеристика гемолимфы и гемоглобина роговой катушки Planorbis corneus (Gastropoda, Pulmonata) // Зоологический журнал, 69 (3): 349-353.

3. Атаев Г. J1. 2000. Развитие партенит трематод: Автореф. дис. .докт. биол. наук. СПб: СПбГУ, 34 с.

4. Атаев Г. Л., Добровольский А. А. 1992. Развитие микогемипопуляций редий Philophtalmus rhionica, природно-заражённых другими видами трематод // Паразитология, 26: 227-233.

5. Атаев Г. Л., Дьячков И. С., Полевщиков А. В. 2006. Сравнительно-иммунологический анализ защитных реакций брюхоногих моллюсков // Известия РГПУ им. Герцена, 39(1): 265-281.

6. Атаев Г. Л., Ерёмина Е. Е., Полевщиков А. В. 2005. Защитные реакции брюхоногих моллюсков: 2. Гуморальные реакции // Паразитология, 39 (1): 3—15.

7. Атаев Г. Л., Полевщиков А. В. 2004. Защитные реакции брюхоногих моллюсков: 1. Клеточные реакции // Паразитология, 38 (4): 342—351.

8. Галактионов В. Г. 1995. Очерки эволюционной иммунологии. М.: Наука, 256 с.

9. Галактионов К. В., Добровольский А. А. 1998. Происхождение и эволюция жизненных циклов трематод. СПб: Наука, 402 с.

10. Гипеципская Т. А. 1968. Трематоды, их жизненные циклы, биология и эволюция. Л.: Наука, 411с.

11. Глик Д. 1950. Методика Гисто- и цитохимии. М.: Изд-во Иностр. Литературы, 516 с.

12. Добровольский А. А., Галактионов К. В., Мухамедов Г. К., Синха Б. К., Тихомирова И. А. 1983. Партеногенетические поколения трематод // Труды Ленинградского общества естествоиспытателей, 82 (4), 108 с.

13. Ерёмина-Е. Е. 2005. Клеточный состав гемолимфы моллюсков Biomphalaria glabrata (Gastropoda, Pulmonata) // Вестник студенческого научного общества РГПУ им. А. И. Герцена. СПб.: РГПУ, 227-229.

14. Ивантер Э. В., Коросов А. В. 1992. Основы биометрии. Петрозаводск: ПГУ, 168 с.

15. Канев И. 1987. Инкапсулиране и инактивиране на спороцисти на Echinostoma revolution (Froelinch, 1802) (Trematoda: Echinostomatidae) на тьканите и хемолимфата на охлюви Lymnaea stagnalis (L.) (Mollusca: Gastropoda) // Хельминтология. София, 24: 26-31.

16. Кульберг А. Я. 1985. Молекулярная иммунология. М.: Высшая школа, 285 с.

17. Купер Э. 1980. Сравнительная иммунология. М.: Мир, 422 с.

18. Лахтин В.М. 1987. Лектины в исследовании белков и углеводов // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. Т.2. М.: ВИНИТИ, 288 с.

19. Лилли. Р. 1969. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М.: Мир, 645 с.

20. Луговская С. А., Морозова В. Т., Почтарь М. Е., Долгов В. В. 2002. Лабораторная гематология. М.: ЮНИМЕД-пресс, 120 с.

21. Макгрегор Г., Варли Дж. 1986. Методы работы с хромосомами животных. М.: Мир, 268с.

22. Полевщиков А. В. 1996. Лектины в защитных реакциях беспозвоночных // Журнал общей биологии, 57 (6): 718-739.

23. Прохорова Е. Е. 2007. Клеточный состав гемолимфы моллюсков Planorbarius corneus (Gastropoda, Pulmonata) // Функциональная морфология, экология и жизненные циклы животных. Сб. научи, трудов каф. зоологии РГПУ им. А. И. Герцена. СПб.: ТЕССА, 7: 70-75.

24. Прохорова Е. Е., Атаев Г. Л. 2008. Генетические основы резистентности гастропод // Известия РГПУ им. А.И. Герцена, 10 (64): 86-96.

25. Сорокина 3. А., Зеленская В. С. 1967. Особенности электролитного состава гемолимфы брюхоногих моллюсков// Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 3 (1): 25-30.

26. Abdul-Salam J. М., Michelson Е. Н. 1980. Biomphalaria glabrata amocbocytes: assay of factors influencing in vitro phagocytosis // Journal of invertebrate pathology, 36: 52-59.

27. Abrahamson M., Alvarez-Fernandez M., Nathanson С. M. 2003. Cystatins // Biochemical Society symposium, 70: 179-199.

28. Adema С. M., Hertel L. A., Loker E. S. 1999. Evidence from two planorbid snails of a complex and dedicated response to digenean (echinostome) infection // Parasitology, 119: 395404.

29. Adema С. M., Hertel L. A., Miller R. D., Loker E. S. 1997. A family of fibrinogen-related proteins that precipitates parasite-derived molecules is produced by an invertebrate afterinfection // Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 94: 8691-8696.

30. Adema С. M., van Deutekom-Mulder E. C., van der Knaap W. P., Sminia T. 1994. Schistosomicidal activities of Lymnaea stagnalis haemocytes: the role of oxygen radicals // Parasitology, 109 (4): 479-485.

31. Allam В., Ashton-Alcox K. A., Ford S. E. 2001. Haemocyte parameters associated with resistance to brown ring disease in Ruditapes sp. Clams // Developmental and comparative immunology, 25 (5-6): 365—375.

32. Allam В., Ashton-Alcox K. A., Ford S. E. 2002. Flow cytometric comparison of haemocytes from three spccics of bivalve mollusks // Fish & shellfish immunology, 13 (2): 141—158.

33. Ataev G. L., Coustau C. 1999. Cellular response to Echinostoma caproni infection in Biomphalaria glabrata strains selected for susceptibility/ resistance // Developmental and comparative immunology, 23: 187-198.

34. Ataev G. L., Dobrovolskij A. A., Fournier A., Jourddane J. 1997. Migration and development of mother sporocysts of Echinostoma caproni (Digenea: Echinostomatidae) // Journal of Parasitology, 83 (3): 444-453.

35. Azevedo С. M., Borges С. C., Andrade Z. A. 2006. Changes induced in Biomphalaria glabrata (Say, 1818) following trials for artificial stimulation of its internal defense system // Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 101: 199-203.

36. Bachere, E. Y., Gueguen, M., Gonzalez J., de Lorgeril J., Gamier В., Romestand M. 2004. Insights into the anti-microbial defense of marine invertebrates:the penaeid shrimps and the oyster Crassostrea gigas //Immunological reviews, 198: 149-168.

37. Barracco M. A., Medeiros I., Moreira F. M. 1999. Some haemato-immunological parameters in the mussel Pernaperna II Fish & Shellfish Immunology, 9 (5): 387-404.

38. Basch P. F., Lie K. J., Heyneman D. 1969. Antagonist interaction between strigeid and schistosome sporocysts within a snail host // Journal of Parasitology, 55: 753-758.

39. Bayne C. J., Boswell C. A., Loker E. S., Yui M. 1985. A. Plasma components which mediate cellular defaces in the gastropod mollusk Biomphalaria glabrata II Developmental and Comparative Immunology, 9: 523-530.

40. Bayne C. J., Yoshino T. P. 1989. Determinants of compatibility in mollusc-trematode parasitism // American Zoologyst, 29: 399^107.

41. Bayne C.J. 1982. Molluscan immunobiology: isolation of an Aeromonas formicans which escapes the internal defence system of Helix pomatia И Developmental and Comparative Immunology, 6 (4): 675-682.

42. Benson D. A., Karsch-Mizrachi I., Lipman D. J., Ostell J., Wheeler D. L. 2008. GenBank // Nucleic Acids Research, 36: 25-30.

43. Bezerra F. S., Coelho P. M., Chaves M. M., Martins R. L., Nogueira-Machado J. A. 1999. Comparative study on the effect of cyclic nucleotides related to the function of

44. Biomphalaria glabrata hemocytes and human granulocytes // Acta Tropica, 72 (3): 275280.

45. Borges С. M. C., Azevedo С. M., Andrade Z. A. 2006. A contribution to the pathobiology of Biomphalaria glabrata hemocytes // Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 101: 193198.

46. Bouchut A., Roger E., Coustau C., Gourbal В., Mitta G. 2006a. Compatibility in the Biomphalaria glabrata!Echinostoma caproni model: Potential involvement of adhesion genes // International Journal for Parasitology, 36: 175-184.

47. Bouchut A., Sautiere P. E., Coustau C., Mitta G. 2006b. Compatibility in the Biomphalaria glabrata!Echinostoma caproni model: Potential involvement of proteins from hemocytes revealed by a proteomic approach // Acta Tropica, 98: 234—246.

48. Butt D., Raftos D. 2008. Phenoloxidase-associated cellular defence in the Sydney rock oyster, Saccostrea glomerata, provides resistance against QX disease infections // Developmental and Comparative Immunology, 32 (3): 299-306.

49. Byrd E. E., Maples W. P. 1969. Intramolluscan stages of Dasymetra conferta Nicoll, 1911 (Trematoda: Plagiorchiidae) // Journal of Parasitology, 55 (3): 509-526.

50. Chai L-Q., Tian Y-Y., Yang D-T., Wang J-X., Zhao X-F. 2008. Molecular cloning and characterization of a C-type lectin from the cotton bollworm, Helicoverpa armigera // Developmental and Comparative Immunology, 32 (1): 71 -83.

51. Cheng Т. C. 1975. Functional morphology and biochemistry of molluscan phagocytes // Annals of the New York Academy of Sciences, 266: 343 -379.

52. Cheng Т. C. 1984. A classification of molluscan hemocytes based on functional evidence // Comparative Pathobiology, 6: 111-146.

53. Cheng Т. C., Cali A. 1974. An electron microscope study of the tegument of the fate of bacteria phagocytized by granulocytes of Crassostrea virginica II Contemporary topics in immunobiology, 4: 25-35.

54. Cheng Т. C., Galloway P. C. 1970. Transplantation immunity in mollusks: the histoincompatibility of Helisoma duryi normale with allografts and xenografts // Journal of invertebrate pathology, 15 (2): 177-192.

55. Cheng Т. C., Jourdane J. 1987. Transient cellular reaction in Biomphalaria glabrata (Mollusca) to heterotopic isografts // Journal of invertebrate pathology, 49: 273 -278.

56. Cheng Т. С., Rifkin Е. 1970. Cellular reactions in marine mollusks in response to helminth parasitism // Symposium on diseases of fishes and shellfishes, 5: 443^496.

57. Cheng, Т. C. 1996. Hemocytes: forms and functions // The eastern oyster factors in marine bivalves, 18: 178-188.

58. Combes C. 1995. Interactions durables //Ecologie et evolution du parasitisme. Paris- Milan-Barcelone. Masson, 524 p.

59. Connors V. A. 2003. The schistosome-snail interaction: factors involved in host immunodefense activation and parasite killing in susceptible and resistant Biomphalaria glabrata. II Taxonomy, ecology and evolution of mctazoan parasites. Tome I: 203-224.

60. Connors V. A., De Buron I., Jourdane J., Theron A., Agner A., Granath W. O. 1998. Interleukin -1 mediated killing of Schistosoma mansoni primary sporocysts in Biomphalaria glabrata //Journal of Parasitology, 84: 920-926.

61. Connors V.A., Yoshino T. P. 1990. In vitro effect of larval Schistosoma mansoni excretory-secretory products on phagocytosis-stimulated superoxide production in hemocytes from Biomphalaria glabrata II Journal of Parasitology, 76 (6): 895-902.

62. Conte A., Ottaviani E. 1995. Nitric oxide synthase activity in molluscan hemocytes // FEBS letters, 365 (2-3): 120-124.

63. Davids B. J., Wu X. J., Yoshino T. P. 1999. Cloning of a beta-integrin subunit cDNA from an embryonic cell line derived from the freshwater mollusk Biomphalaria glabrata. Gene, 228: 213-223.

64. Davids B. J., Yoshino T. P. 1998. Integrin-like RGD-dependent binding mechanism involved in the spreading response of circulating molluscan phagocytes // Developmental and Comparative Immunology, 22 (1): 39-53.

65. Deininger M. H., Meyrmann R., Schluesener H. J. 2002. The allograft inflammatory factor-1 family of proteins // FEBS letters, 514 (2-3): 115-121.

66. Dikkeboom R., van der Knaap W. P., van den Bovenkamp W., Tijnagel J. M., Bayne C. J. 1988.The production of toxic oxygen metabolites by hemocytes of different snail species // Developmental and Comparative Immunology, 12 (3): 509-520.

67. Dobrovolskij A. A., Ataev G. L. 2003. The nature of reproduction of digenea rediae and sporocysts // Taxonomy, ecology and evolution of metazoan parasites. Tome I: 249-272.

68. Doolittlc R.F. 1992. A detailed consideration of a principal domain of vertebrate fibrinogen and its relatives// Protein science, 1: 1563-1577.

69. Duclermortier P., Lardans V., Serra E., Trottein F., Dissous C. 1999. Biomphalaria glabrata embryonic cells express a protein with a domain homologous to the lectin domain of mammalian selectins // Parasitology research, 85: 481^186.

70. Feng S.Y. 1965. Heart rate and leucocyte circulation in Cassostrea virginica (Gmelin) // The Biological bulletin, 128: 198-210.

71. Files V., Cram E. B. 1949. A study on the comparative susceptibility of snail vectors to strains of Schistosoma mansoni II Parasitology, 41: 264-269.

72. Foley D. A., Cheng Т. C. 1975. A quantitative study of phagocytosis by hemolymph cells of the pelecypods Crassostrea virginica and Mercenaria mercenaria II Journal of Invertebrate Pathology, 25 (2): 189-197.

73. Ford С. E., Hamerton J. L. 1956. A colchicine, hypotonic citrate, squash sequence for mammalian chromosomes // Stain technology. 31 (6): 247-251.

74. Fraser I. P., Ezekowitz R. A. B. 1999. Receptors for microbial products: carbohydrates // Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates: 515-523.

75. Glinski Z., Jarosz J. 1997. Molluscan immune defenses // Archivum immunologiae et therapiae experimentalis, 45 (2-3): 149-155.

76. Gorbushin A. M., Iakovleva N. V. 2006. Haemogram of Littorina littorea II Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom, 86: 1175-1181.

77. Gorbushin A. M., Iakovleva N. V. 2008. The enigma of the haemogram "left-shift" in periwinkles infected with trematodes // Fish & Shellfish Immunology, 24 (6): 745-751.

78. Gourdine J-P., Markiv A., Smith-Ravin J. 2007. The three-dimensional structure of codakine and related marine C-type lectins // Fish & Shellfish Immunology, 23: 831-839.

79. Granath W. O., Spray F. J. 1987. Analysis of the interlacing components between larval Schistosoma mansoni and schistosome-susceptible and resistant Biomphalaria glabrata II Memorias do Instituto Oswaldo Cruz, 82: 229-230.

80. Granath W. O., Yoshino Jr., Yoshino T. P. 1984. Schistosoma mansoni: Passive transfer ofresistance by serum in the vector snail Biomphalaria glabrata // Experimental Parasitology, 58: 188-193.

81. Guillou F., Mitta G., Galiniera R., Coustau C. 2007. Identification and expression of gene transcripts generated during an anti-parasitic response in Biomphalaria glabrata II Developmental and Comparative Immunology, 31: 657-671.

82. Hahn U. K., Bender R. C., Bayne C. J. 2001. Killing of Schistosoma mansoni sporocysts by hemocytes from resistant Biomphalaria glabrata: role of reactive oxygen species // Journal of Parasitology, 87 (2): 292-299.

83. Hall T. A. 1999. BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT // Nucleic acids symposium series, 41: 95-98.

84. Hartmann S., Lucius R. 2003. Modulation of host immune responses by nematode cystatins // International journal for parasitology, 33(11): 1291-1302.

85. Hernroth B. 2003. The influence of temperature and dose on antibacterial peptide response against lipopolysaccharide in the blue mussel, Mytilus edulis II Fish & Shellfish Immunology, 14 (1): 25-37.

86. Humbert E., Coustau C. 2001. Refractoriness of host haemocytes to parasite immunosuppressive factors as a putative resistance in the Biomphalaria glabrata — Echinostoma caproni system. // Journal of Parasitology, 122: 651-660.

87. Jiang Y., Loker E. S., Zhang S. 2006. M. In vivo and in vitro knockdown of FREP2 geneexpression in the snail Biomphalaria glabrata using RNA interference // Developmentaland Comparative Immunology, 30: 855-866.

88. Jimenez-Vega F., Vargas-Albores F., Soderhall K. 2005. Characterisation of a serine proteinase from Penaeus vannamei haemocytes // Fish & Shellfish Immunology, 18: 101-108.

89. Jourdane J., Cheng Т. C. 1987. The two-phase recognition process of allografts in Brazilian strain of Biomphalaria glabrata II The Journal of Invertebrate Parasitology, 49: 145158.

90. Mahmoud A. H., Rizk M. Z. 2004. Free radical scavengers in susceptible/resistant Biomphalaria alexandrina snails before and after infection // Comparative Biochemistry and Physiology, 138: 523-553.

91. Malham S. K., Runhama N. W., Secombes C. J. 1998. Lysozyme and antiprotease activity in the lesser octopus Eledone cirrhosa (Lam.) (Cephalopoda) // Developmental & Comparative Immunology, 22 (1): 27-37.

92. Matozzo V., Marina M. G., Cimaa F., Ballarina L. 2008. First evidence of cell division in circulating haemocytes from the Manila clam Tapes philippinarum // Cell Biology International, 32 (7): 865-868.

93. Matricon-Gondran M., Letocart M. 1999a. Internal defenses of the snail Biomphalaria glabrata.

94. Characterization of hemocytes and fixed phagocytes // Journal of invertebrate pathology, 74 (3): 224-234.

95. Matricon-Gondran M., Letocart M. 1999b. Internal defenses of the snail Biomphalaria glabrata.1.. Defense cells have different phagocytic responses to various injected foreign material // Journal of invertebrate pathology, 74 (3): 235-247.

96. McGinnis S., Madden T. L. 2004. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools // Nucleic acids research, 32 (Web Server issue): 20-25.

97. McGreal E. P., Martinez-Pomares L., Gordon S. 2004. Divergent roles for C-type lectins expressed by cells of the innate immune system // Molecular immunology, 41(11): 1109— 1121.

98. Mitta G., Vandenbulcke F., Hubert F., Roch P. 1999. Mussels defensins are synthesized and processed in granulocytes then released into the plasma after bacterial challenge // Journal of Cell Science, 112: 4233^1242.

99. Mitta G., Vandenbulcke F., Noel Т., Romestand В., Beauvillain J. C., Salzet M., Roch P. 2000a. Differential distribution and defence involvement of antimicrobial peptides in mussel // Journal of cell science, 113 (15): 2759-2769.

100. Mitta G., Vandenbulcke F., Roch P. 2000b. Original involvement of antimicrobial peptides in mussel innate immunity// FEBS letters, 486 (3): 185-190.

101. Mouachid A., Mone H. 1990. Interference of Echinoparyphium elegans with the host- parasite system Bulinus truncates — Schistosoma bovis in natural conditions // Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 84 (4): 341-348.

102. Newton W. L. 1953. The inheritance of susceptibility to infection with Schistosoma mansoni in Australorbis glabratus II Experimental Parasitology, 2: 242-257.

103. Newton W. L. 1954. Albinism in Australorbis glabratus И Proceedings of the Helminthological Society of Washington, 21: 72-74.

104. Newton W. L. 1955. The establishment of a strain of Australorbis glabratus which combines albinism and high susceptibility to infection with Schistosoma mansoni II Journal of Parasitology, 29: 539-544.

105. Novas A., Barcia R., Ramos-Martinez J. I. 2007. Nitric oxide production by haemocytes from Mytilus galloprovincialis shows seasonal variations // Fish & Shellfish Immunology, 23: 886-891.

106. Ottaviani E., Franchini A. 1988. Ultrastructural study of haemocytes of the freshwater snail Planorbarius corneus (Gastropoda, Pulmonata) 11 Acta Zoolologica, 69 (3): 157—162.

107. Ottaviani E., Franchini A., Cassanelli S., Genedani S. 1995. Cytokines and invertebrate immune responses//Biology of the cell, 85 (1): 87-91.

108. Ottaviani E., Franchini A., Fontanili P. The presence of immunoreactive vertebrate bioactive peptide substances in hemocytes of the freshwater snail Viviparus ater (Gastropoda, Prosobranchia)// Cellular and molecular neurobiology, 12 (5): 455^162.

109. Pan С. Т. 1958. The general histology and topographic microanatomy of Australorbis glabratus II Bulletin of Museum of Comparative Zoology. Harvard collection, 119: 237—299.

110. Parisi M.-G., Lia H., Jouvetc L. B. P., Dyryndac E. A., Parrinellob N., Cammaratab M., Rocha P. Differential involvement of mussel hemocyte sub-populations in the clearance of bacteria // Fish & Shellfish Immunology, 25 (6): 834-840.

111. Pereira C.A.J., Martins-Souza R.L., Coelho P.M.Z., Limaa W.S., Negrao-Correa D. 2006. Effect of Angiostrongylus vasorum infection on Biomphalaria tenagophila susceptibility to Schistosoma mansoni II Acta Tropica, 98: 224-233.

112. Pipe R. K., Farley S. R., Coles J. A. 1997. The separation and characterisation of haemocytes from the mussel Mytilus edulis II Cell and tissue research, 289: 537-545.

113. Pruitt K. D., Tatusova Т., Maglott D. R. 2007. NCBI reference sequences (RefSeq): a curated non-redundant sequence database of genomes, transcripts and proteins // Nucleic acids research, 35 (Database issue): 61-65.

114. Qiu L., Song L., Yu Y., Xu W., Ni D., Zhang Q. 2007. Identification and characterization of a myeloid differentiation factor 88 (MyD88) cDNA from Zhikong scallop Chlamys farreri I I Fish & Shellfish Immunology, 23: 614-623.

115. Richards C. S. 1970. Genetics of a molluscan vector of schistosomiasis // Nature, 227: 806-810.

116. Richards C. S. 1980. Genetic studies on amoebocytic accumulations in Biomphalaria glabrata II Journal of invertebrate pathology, 35: 49-52.

117. Richards C. S. 1984. Influence of snail age on genetic variations in susceptibility of Biomphalaria glabrata for infection with Schistosoma mansoni II Malacologia, 25: 493502.

118. Richards C. S., Shade P. C. 1987. The genetic variation of compatibility in Biomphalaria glabrata and Schistosoma mansoni II Journal of Parasitology, 73: 1146-1151.

119. Rodelaud D., Barthe D. 1981. The development of the amoebocyte-producing ogan in Lymnaea truncatula Muller infected by Fasciola hepatica L. // Zeitschrift fur Parasitenkude, 65: 331-341.

120. Rondelaud D., Barthe D. 1980. Description and characteristics of an ameboeytic reaction in Lymnaea truncatula Miiller infested by Fasciola hepatica L. // Zeitschrift fur Parasitenkunde, 61 (2): 187-196.

121. Sambrook J., Fritsch E. F., Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual // New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Second Edition. Tome 1-3.

122. Santamaria-Kisiel L., Rintala-Dempsey A. C., Shaw G. S. 2006. Calcium-dependent and -independent interactions of the SI 00 protein family // The Biochemical journal, 396 (2): 201-214.

123. Schreiber F. G., Schubert M. 1949. Results on exposure, of the snail Australobis glabratus to varying numbers of miracidia of Schistosoma mansoni II The Journal of Parasitology, 37: 42-^-7

124. Sire C., Rognon A., Theron A. 1998. Failure of Schistosoma mansoni to reinfect Biomphalaria glabrata snails: acquired humoral resistance or intra specific larval antagonism? // Parasitology, 117: 117-122.

125. Sminia T. 1974. Haematopoiesis in the freshwater snail Lymnaea stagnalis studied by electron microscopy and autoradiography// Cell and tissue research, 150: 443-454.

126. Sminia Т., Barendsen L. 1980. A comparative morphological and enzymes histochemical study on blood cells of the freshwater snails Lymnaea stagnalis, Biomphalaria glabrata, and Bulinus truncatus II Journal of morphology, 165: 31-39.

127. Sorensen R. E., Minchella D. J. 2001. Snail-trematode life history interactions: past trends and future directions // Parasitology, 123: 3-18.

128. Souza S. S., Andrade Z. A. 2006. On the origin of the Biomphalaria glabrata hemocytes // Memorias do Institute Oswaldo Cruz, 101: 213-218.

129. Stumpf J. L., Gilbertson D. E. 1978. Hemocytes of Biomphalaria glabrata: Factors affecting variability // Journal of invertebrate pathology, 32: 177-181.

130. Sullivan J. T. 1988. Hematopoiesis in three species of Gastropods following infection with Echinostoma paraensei (Trematoda: Echinostomatidae) // Transactions of the American Microscopical Society, 107 (4): 335-361.

131. Sullivan J. T. 1990. Long-term survival of heterotopic allografts of the amoebocyte-producing organ in Biomphalaria glabrata (Mollusca: Pulmonata) // Transactions of the American Microscopical Society, 109 (1): 52-60.

132. Sullivan J. Т., Ни P. С. 1996. Fate of Shistosoma mansoni in Biomphalaria obstructa II The Journal of Parasitology, 82 (2): 743-747.

133. Sullivan J. Т., Spence J. V. 1999. Factors affecting adoptive transfer of resistance to Schistosoma mansoni in the snail intermediate host, Biomphalaria glabrata. II Journal of Parasitology, 85 (6): 1065-1071.

134. Swarnakar S., Chowdhury P.S., Sarkar M. 1991. N-glycolylneuraminic acid specific lectin from Pila globosa snail // Biochemical and biophysical research communications, 178 (1): 8594.

135. Thompson J. D., Gibson T. J., Plewniak F., Jeanmougin F., Higgins D. G. 1997. The CLUSTALX windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools // Nucleic acids research, 25 (24): 4876^1882.

136. Tripp M. R. 1961. The fate of foreign materials experimentally introduced into the snail Austalorbis glabratus II Journal of Parasitology, 23: 90-133.

137. Van der Knaap W.P.W., Loker E. S. 1990. Immune mechanisms in trematode snail interactions // Parasitology today, 6 (6): 176-182.

138. Wootton E. C., Pipe R. K. 2003. Structural and functional characterisation of the blood cells of the bivalve mollusk, Scrobicularia plana II Fish & Shellfish Immunology, 15 (3): 249262.

139. Yayne С.J., Boswell С.A., Loker E.S., Yui M.A. 1985. Plasma components which mediate cellular defenses in the gastropod mollusk, Biomphalaria glabrata II Developmental and Comparative Immunology, 9 (3): 523-530.

140. Yssel E., Wolmarans С. T. 1989. Factors influencing the leukocyte concentration of the freshwater snail Bulinus africanus. I I Journal of invertebrate pathology, 53 (2): 269-271.

141. Zelck U. E., Gege В. E., Schmid S. 2007. Specific inhibitors of mitogen-activated protein kinase and PI3-K pathways impair immune responses by hemocytes of trematode intermediate host snails // Developmental and Comparative Immunology, 31:321-331.

142. Zhang S.M., Loker E. S. 2004 Representation of an immune responsive gene family encoding flbrinogen-related proteins in the freshwater mollusk Biomphalaria glabrata, an intermediate host for Schistosoma mansoni II Gene, 341: 255-266.