Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Защитное действие клеточного иммунитета при экспериментальном бешенстве у мышей

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Защитное действие клеточного иммунитета при экспериментальном бешенстве у мышей"

рге ол

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ "МНЩИЦИНСКИХ НАУК

- () ДНИ 1990НСТИТУТ ПОЛИОМИЕЛИТА И ВШУСНЫХ ЭНЦЕФАЛИТОВ

ТОДОРОВ Славей Йорданов

ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ БЕШЕНСТВЕ У МЫШЕЙ

03.00.06 - Вирусология

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

На правах рукописи

Автореферат

Москва - 1993 г.

Работа выполнена в Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов Российской Академии медицинских наук.

Научный руководитель: доктор медицинских наук В.В.ХОЗЯЙСКИЙ

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Л.Б.аПЬБЕРТ,

доктор биологических наук

Ведущая организация: Государственный научно-исследовательский

на заседании специализированного совета Д.001.27.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН (142782, Мооковокая область, ц/о Института полиомиелита).

. С диссертацией мскло ознакомиться в библиотеке Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАШ.

А.В.ПРОНИН

институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича

1993 г. в

Ш.ч а

чаоов

Учэный секретарь Специализированного совета, кавдвдат биологических наук

О.А.Ыедведкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бешенство'представляет серьезную проблему для органов здравоохранения большинства стран мира, за исключением Австралии и рада островных государств. Ежегодно в мире от гидрофобии погибает около 1000 человек и евшие I миллиона нуждается в лечебно-профилактической антирабической помощи ( WHD, 1991, 1992). Для Российской Федерации эти показатели в последние годы составляют 6-25 и 100000 человек соответственно (Черкасский БД., 1985; Ботвинкин А.Д., 1992). По данным экспертов ВОЗ бешенство входит в пятерку экономически наиболее значимых зоонозов, Это обстоятельство обусловлено повсеместным распространением природных очагов рабической инфекции, что оо-здает потенциальную угрозу для человека даже в относительно благополучных в отношении бешенства, экономически развитых странах Западной Европы и США, где в последние годы не отмечалось случаев гидрофобия (Черкасский БД., 1985; wm, 1991. 1992). Несмотря на значительные успехи, достигнутые в исследования бешенства, многие отороны патогенеза этой инфекции остаются неизвестными. Парадоксально/ но именно роль иммунной системы и, особенно, ее отдельных компг—>нтов в патогенезе заболевания до конца не яона. Это отнооитоя не только к эффекторным субподуляцияы Г-, В-дим$оцитов, макрофагов, естественных киллеров, зависимого от антител цитотохсического действия клеточного иммунитета и шцуяорехуляторным клеткам, знания о которых ограничиваются ^-помощниками; но и к вируовейтрализущим антителам, о которыми а^адиционно связывают обеспечение резистентнооти организма С инфекция (Koprowakl H.'et al., 1950? Turner G.3. et al., 1976-, Joac J.H. et al., 19771 Lagrange P.II. ot al., 197ft; Miller et al., I978; SzaradkiewlCh. et al., 1988; Erte H.C.J, et al., 1999).

Противоречивость имеющихся данных касается как роли отдельных субподуляций им'.унэкомпе тантных клеток в элиминации вируса из организма, как, например, цитотолсические Т-лим$оциты, так и механизмов, реализация которых приводит к выздоровлении. Последнее касается фагоцитарной функции макрофагов и нейтрализации вируса вирусспецифическими антителами, которые согласно мнению одних авторов являются одним из ведущих компонентов антирабического иммунитета, а с точки зрения других, не играю? кардинальной роли в становлении резистентности организма к инфекции (Ваег, 1975; Turner G.S. et al., 1976; Miller A. et al., 1978; Muflne K. et al., 1981; Dietzschold B. et al., 1987, 1989; Charlton K.M., 1988; Gonsalea C.A. et al., 1990; Kawano H. et al., 1990; Ertl H.C.J., ot el., 1991). Остаются недостаточно изученными условия проявле- . ния и роль реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), а также зависимого от антител защитного действия клеточного иммунитета (ЗАЗДКИ) в патогенезе бешенства, хотя феномен ГЗТ к вирусу бешенства описан ин зиво, а способность неивдушшх иымуноком-пегоятных клэток оказывать цитотолоичеокое действие на зараженную культуру клеток в присутствии противовирусных антител выявлена ин витро у вакцинированных мыаей (tagrange Р.Н. et al., 1978; Taiang К. et al., 1930; Hozaki-Benard J. et al., 1981). ИСХОДЯ из вышеизложенного и сформулированы представленные шиш цели и задачи настоящего исследования.

Цель и задачи исследования. Ооновной целью исследований было изучить в экспериментальных условиях некоторые, не известные ранее, механизмы развития иш^унного ответа при экспериментальном бешенстве, определить наиболее эффективные механизмы, обеспоча-вавдие резистентность к вирусу и на основа патогенетических ис- ' следований усовершенствовать диагностику бешенства. При этом

юсгавлены следующие задачи: " ■

1. Изучить закономерности активации вирусспецифических эффекторов 13Т и регулирующих их активность супрессоров.

2. Идентифицировать и изучить некоторые свойства эффекторов Ш и ограничивающих их активность клеток.

3. Определить роль различных эффекторов иммунного ответа а обеспечении резистентности мышей к вирусу бешенства.

4. Разработать метод ускоренной диагностики бешенства на юнове использования для биопробы мышей, обработанных циклофос-заяом (ЦФН).

Научная новизна работы и положения, выноснмнэ на защиту

Впервые идентифицированы вируоспецифические Т-эффекторы ТЗТ при экспериментальном бешенстве у мышей и показано, что их иктивпость подчиняется прашшу Н-2 рестрикции. Показано, что ятивность описанных эффекторов резко возрастает у животных, [редварительно за 48 часов до заражения обработанных ЦФН.

Впервые установлено, что относительно низкая активность лрусспецифических эффекторов ГЗТ у иммунокомпетэнтных мышей об-словлена активацией вирусопецифических Т-супрессоров. Взаимо-;ействие обоих типов Т-кл^ток Н-2 рестриктировано, не связано пролиферацией супрессоров и подавляется после обработки нмцу-орегуляторных клеток ингибитором белкового синтеза - циклогек-имидом.

Впервые описано зависимое от антител защитное действие кле-очного иммунитета (ЗАЗДКИ) при экспериментальном бошанотве ин иве Противовирусные антитела, макрофаги и специфически сенси-I¡дотированные спленоциты оказались значительно менее или не ффективны в защите инфицированных животных.

Макрофаги являются основной популяцией имт^нокомлетентгавс

клеток, оказывающих ЗАЗДКИ при экспериментальном бешенстве ин виво. Защитное действие самих по себе макрофагов связано скорее с их участием в кооперативных процессах, приводящих к продукции вирусспецифических антител, а не с фагоцитозом вирусов.

Впервые продемонстрировано, что одной из причин неэффективности проводимой при экспериментальном бешенстве серотерапия может явиться дефект макрофагов. Вторичный иммунный дефицит, связанный с дефектом Т- и В-дим$сцитов, но оказывает существенного влияния на протоктивную активность противовирусных антител.

Показана принципиальная возможность ускорения диагностики бешенства путем использования при постановке биопробы мышей с подавленным ЦФН имцунным ответом, что позволяет ускорить поста-' новку диагноза животному на 2-5 суток по сравнению с традиционным к, соответственно, назначать в более короткие сроки более адекватный куро лечебно-профилактических мероприятий пациенту, имевшему контакт о этим животным.

Теоретическое значение результатов работы определяется экспериментально обоснованными оригинальными положениями, расшифровывающими неизвестные ранее эффекторные и имцунорегуляторные механизмы развития иммунного ответа - вирусспецифических Т-эф-фекторов 13Т и угнетающих их активность Т-супресооров, взаимодействие противовирусных антител и макрофагов и рсшь отдельных компонентов шлмункого ответа в обеспечении эффективной защиты организма от раб ¡леской инфекции.

• Практическая значимость

Показана принципиальная возможность использования для ускоренной диагностики бешенства мшаей с подавленным при помощи цшс-лофос-Ьака иммунным ответом.

Апробация работы. Материалы диссортации докладывались на

Международной конференции по проблемам инфекционных болезней (г. София, Болгария, I9S2 г.); на Международном симпозиума "Проблемы патологии и охраны здоровья диких животных, экологическое взаимодействие болезной диких и сельскохозяйственных животных" (г. Астрахань, 1992 г.); на заседании межлабораторного ученого совета Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РА1Л1 по проблемам "Общей вирусологии (июль 1993 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Объем и структура работы. Диссертация яэлояена на 175 страницах машинописного текста, иллюстрирована 9 рисунками и 16 таблицами. Работа состоит из введения, обзора литература (3 главы), описания материалов и методов, экспериментальной части (5 глав), обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 289 источников.

СОБСТВЕННЫЕ ИССВДОВАНШ

Материалы и методы

Вирусы. В работе использовали фиксированный вирус бешенства (штаил ста) ,22 штамма уличного бешенства (I серотип лиссааиру-оов), 2 штамма арктического бешенства (I серотип, подтип арктическое бешенство), 2 шташа, выделенные в неарктической зоне, но имеющие маркер F-4I, и штамм Юли (5 серотип лиссавирусов). Штаммы cvs и Юли длительное время культивировали в головном мозге 5-6 х*. мышей и хранили при -70°С. Все остальные штаммы, гатериал (как правило головной мозг) от подозрительных на бешенство животных или погибших от гидрофобии лвдей, поступали в лабораторию профилактики бешенства Института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН от органов здравоохранения и веторинарной

службы в период с 1991 по 1992 гг. В некоторых опытах использовали вирус, выращенный в культуре клеток ВНК-21. Титрование ви-русоЕ проводили на 5-6 г мышах путем введения серийных разведений материала в головной мозг. Расчет титров вируса проводили по методу Кербера (Ашмария И.П. и др., 1962).

Кквотные, в опытах использовали нелинейных мышей массой-5-6 и 10-12 г, иябредных мышей линий: Ва1Ъ/с, СБА, С57Б1 или гибридов (СБА. X С57В1) и ^ (ВВА х С?7В1) массой 16-18 г, которых получали из питомника РАМН "Столбовая".

Реактивы. Иммуномодулятора - циклофосфан (Минмедпром РФ) и гидрокортизон (Реанал, Еекгрия). Ингибиторы белкового синтеза - цкклогексимзд (Сше, США) и штошцин С (Серва, Германия).

Сыворотки. В качестве источника антирабических антител использовали сыворотки мышей, иммунизированных трехкратно с недельным интервалом коммерческой концентрированной вакциной против бешенства (ЙПВЭ РАШ) или лошадиный антирабический гамма-глобулин (Харьков, ЕУ ). Разрушение Т- и В^лшфэцитов проводили при помощи анти-гьу 1,2 (Институт микробиологии и эпидемиологии им, Н.Ф.Гамалеи РАШ) и сыворотки против гамма-глобулинов мышей (ХШ, США), соответственно.

Иммгнокомдетевтяце клетки: ссленоциты, тимоциты или клетки лимфатических узлов получали общепринятыми методами. Макрофаги из популяций исследуемых иммунокомпетонтных клеток удаляли путем контакта о плаотиковой поверхноотью. Фагоцитирующую активнее :ь макрофагов ин виво оценивали цо времени удаления из крово- . тси;а частиц туши ( К1егзепЪашп вt а1., 197*).

. Методы исследования клеточного имотнитэта ин виво и ая вит-

Защитное действие клеточного иммунитета исследовали методом адоптивного переноса нвищушшх или иммунных к вирусу бешенства

иммунокомпетентяых клеток зараженным сингешгом реципиентам. Активность эффекторов ГЗТ и супрессоров оценивали ия виво, используя тест отека лапки (bagrange Р.н. et al., 1978). Неспецифи-ческуга активность Т- я В-литлфоцитов оценивали ли виво методом локальной реакции трансплантат против хозяина (РТПХ), индуцированной родительскими спленоцитами у гибридов первого поколения и методом локального гемолиза эритроцитов барана ин витро, соответственно (Каледин и др., 1975; Маянский А.Н. и др., 1978).

Противовирусные антитела определяли при помощи раакции нейтрализации ин виво и непрямого имгдуноферментного метода (Селимов М.А. и др., 1964; Ботвинник А.Д. я др., 1986).

Итогеокалоидные антигены лиссавирусов выявляли у зараженных мышей исследованием отпечатков головного мозга при помощи метода фшооросцирущих антител (Селимов М.А. и др., I9S4).

Статистическую обработку результатов проводили при помощи критерия Стьвдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Условия активации эсКбекторов гипэрчувствятельнооти

" замедленного типа (ГЗТ) и их свойства при экспериментальном бешенстве

На первых этапах исследований нами было проведено изучение ГЗТ. Следует отметить, что этот феномен исследовался при экспериментальном бешенстве и ранее. Однако свойства эффекторов ГЗТ и закономерности их активации оставались не изученными ( bagrange • Р.н. et al., -1978; Tsiang н. et ai., 1980). Как и в эксперимент х предшественников, появление .реакции обнаруживали у зараженных штаммов CV3 мышей на 4-5 сутки инфекции и прослеживали до момента гибели животных на 10-12 дни опыта. Аналогичные результаты были получены и в опытах с адоптивным переносом сало-

ноцлтов зараженных мышей, которые получали на 2, 4, б ... 12 дни после подкожного введения в область бедра вируса и шокулировали в вену не зараженным сингенным реципиентам. Сыворотка крови зараженных доноров, полученная в аналогичные сроки,была не способна переносить состояние I3T реципиентам. Реакция такие не воспроизводилась, если реципиентам инокулировали спленоциты незаразен-них доноров. Описываемая реакция была направлена против вируса бешенства к строго специфична. Об этом свидетельствуют результаты опытов, в которых мышам, зараженным вирусом, размноженном в головном мозге мышей, в качестве разрешающей дозы инокулировали вирус, пассируемый в культуре клеток BHK-2I, надосадочную жидкость с незараженкой культуры BHK-2I шш суспензию шзга незара-кешж или мышей, инфицированных вирусом желтой лихорадки (штамм 17D ). Развитие положительной реакции наблюдали только при работе с материалом, о одержал им рабичоский вирус.

Проведенные эксперименты позволяют заключить, что иммуно-хомпетентше клетки,опосредующие развитие отека стопы, инокули-рованной вирусом бешенства лапки у адоптивно иммунизированных реципиентов, относятся к популяции Т-лимооцитов. Во всех случаях яктявцыми в индукции реакции оказались чувствительные к действию анти- Thy 1.2 сыворотки, не прилипающие к пластиковой поверхности, резистентные к действию сыворотки против иммуноглобулинов мышей спленоциты. Кроме селезенки, эти клетки были обнаружены в популяции лимфоцитов лимфатических узлов и отсутствовали в тимуса и костном мозге зараженных мышей. Реализация активности выявленных T-эффекторов подчинялась правилу Н-2 рестрикции. В опытах о адоптивным переносом специфически сенсибилизированных к вирусу бешенства клеток, положительная реакция воспроизводилась только у сингекных, сеыисингекных или реципиентов, икездих общие аллели

главного комплекса гйстосовместимости о донорами. Резюмируя вышеизложенное, можно констатировать, что при экспериментальном бешенстве у мышей активируются вирусспецифические Т-эффекторы I3T, действие которых Н-2 рестриктировано, т.е. по своим свойствам (в исследованных пределах) эти клетки не отличаются от конвенциональных эффекторов ГЗТ, описанных при других вирусных инфекциях (Leung K.N. et al., 1980i 1981; 1982; Mokophidia V.J. et al., 1988).

При анализе полученных результатов обращает на себя внимание предельно низкий уровень экспрессии реакции. Эту закономерность наблюдали при воспроизведении 1ST как у зараженных, так и у адоптивно ищунизированных специфически сенсибилизированными клетками нвз аракенных реципиентов. Подобное же явлэние отмечали . и цитировавшиеся выше французские авторы, в работе которых достаточно высокие уровни ГЗТ к вирусу бешенства воспроизводились лишь у ШШЭЙ, Предварительно ИММунИЗИрОВаННЫХ BCG (Lagrange р.н. et al., 1976; Tsiang н. at al., 1980).Механизм этого явления остается неизвестным. В наших опытах показано, что предварительное, sa 48 часов до заражения, введение циклофосфана (ЦФН) способствует значительному усилению экспрессии реакции I3T к вирусу, не сопровождающееся изменением динамики ее развития. Так, если показатели интенсивности реакции, воспроизводимой у иммуяокомпетент-ных мышей с 4 по 12 дни инфекции не превышали 23 %, то на фоне предварительной обработки имйуномодулятором возрастали до 37 %. Совокупность полученных данных позволяет заключить, что наблвда-емо- на фоне введения ЦФН усиление экспрессии IST связано с усилением активности Т-эффекторов ГЗТ под воздействием иммуномоду-лятора. Спленоцяты обработанных ЦФН зараженных доноров во все исследованные сроки (с 4 по 12 сутки инфекции) при адоптивном переносе нозараженным донорам, индуцировали у реципиентов реак-

цгоо на более высоком уровне по сравнению с клетками зараженных иммунокомпетенткых доноров. Как и в вышеприведенных опытах с клетками иммунокомпетентных мышей, эффект был обусловлен Т-лЛим-фоцитами, активность которых была Н-2 рестриктирована.

2. Выявление активности и характеристика вирусиндуциро-ванных антигенспецгокчзских Т-супрзссоров. ограничи-ваэдк активность вирусспецифическкх эффекторов ГЗТ при экспериментальном бешенстве у мыше^

В доследукяцих экспериментах, результаты которых представлены в настоящем разделе, нами была экспериментально проверена гипотеза о возможной роли вярусиздуцированных супрессоров в регуляция описанных эффекторов ГЗТ при экспериментальном бешенотве у мышей. При планировании опытов исходили из предположения, что низкий уровоиь реакции ГЗТ у зараженных ищунокомпетентных мышей и относительно высокий у животных, предварительно получавших ЦФН, обусловлен различной чувствительностью клеток-предшественников эффекторов ГЗТ и гипотетических супрессоров к действию пммуно-модаятора ( Ып тм.. et а1.,1931;Хозинский■В.В., 1986). Для проверил этого предположения использовали метод адоптивного переноса клеток иммунной системы зараженным на фоне введения ЦФН реципиентом ели иммунокомтетентным мышам-реципиентам, которые получали смесь спленоцитов, обладающих высокой активностью в индукции ГЗТ (предварительно обработанные ЦФН) с клетками различных органов иммунной системы инфицированных иммунокомпетентных аавотдах, х аракте ризующяхс я низкими показателями экспрессии 13Т. В обоих случаях показатели ГЗТ у таких реципиентов были значительно ниже во вое исследованные срсыи (с 4 по 12 дни инфекции) по сравнении с группами животных, в которых использовали только обработанных до заражения ЦФН реципиентов шш доноров и по своей

интенсивности на отличались от значений, полученных при работа с клетками зараженных пкэду некомпетентных доноров. То ость, спле-яощ1ты, зараженных на фоне интактной иыцучноя системы, в обоих исследованных вариантах - в зараженном или адоптивно ищунизиро-ванном организма мышей, ограничивали экспрессию 13Т. Аналогичные результаты били получены при работе с популяциями иммунокомпе-тентных клеток тимуса и лимфатических узлов. Во всех исследованных ситуациях клетки незараженных доноров не обладали способностью подавлять реакцию ИТ. Согласно имеющимся данным, вирусин-дуцирозанные супрессоры, угнетающие активность эффекторов 1БТ, могут принадлежать к различным популяциям ппьунокомпетентных клеток ( Иааь А.А., et аХ., 1981( 1983). При экспериментальном бешенстве наш Лыли выявлены талью Т-супрессоры. Способностью угнетать активность Т-эффекторов 13Т сохраняли ин виво и плено-циты, клетки лимфатических узлов шш тиыоциты зараженных доноров после предварительной их обработки ин витро сывороткой против гамма-глобулинов мышей или лишенные прилипающих к пластиковой поверхности популяции клеток. В то лее время, супрессорной активностью не обладали клетки, обработанные анти-тьу 1.2 сывороткой, или клетки, прилипающие к пластиковой поверхности. Высказанное выше предположение о том, что низкий уровень 13Т у зараженных иммунокомпетентных мышей и высокий - у предварительно обработанных ЦФН, нашло подтверждение при работе с тимоцитами зараженных на фоне обработки ЦФН животных. Во все исследованные орояи, начиная со второго дня инфекции и до момента гибели к 10-12 дням опыта, тимоциты таких доноров на обладали способностью снижать интенсивность ГЗТ при адоптивном переносе.

Взаимодействие описанных эффекторов ОТ и угне?ал;гпх их активность Т-супрессоров ограничивается аьткгенаик Е-?, генного

комплекса, не требует пролиферации имвдгнорегуляторных клеток и зависит от сохранения синтеза белка в последних. Как известно, эффекторы ГЗТ определяют развитие воспалительной реакции в организме. При нейроияфекции этот процесс выражается в развитии ме-нингоэнцефалитов, проявления которых в одних случаях способствует защите, в других - развитию иммунопатологических реакций. И в этой ситуации супрессоры, угнетающие этот процесс, могут способствовать или препятствовать гибели организма. Не исключено, сто описанные Т-супрессоры являются тем материальным субстратом, который определяет незначительные морфологические проявления энцефалита у экспериментальных животных при бешенстве ( Johnson к.т., 1965; Еаег G.M., 1975).

3. Роль зависимого от антител защитного действа? клеточного юя.тунлтета (ЗАЗЖИ) в обеспечении розистентности мышей к'бешенству

Как известно, выздоровление организма при вирусных инфекциях обеспечивается взаимодействием различных популяций и субпопуляций шдлунококпотантишс клеток и их продуктов, приводящем к элиминации возбудителя из организма (Семенов Б.Ф. и др., 1982; Хозинский В.З., 1986; Doherty P.c., 1991). Несмотря на существование общих закономерностей развития ш,лунного ответа и участия в реализации противовирусного иммунитета определенных rpyns иг.тдунокомпетенгных клеток, их удельный' вес при разных вирусных инфекциях различен. Наш проведено ин вкво сравнительное исследование защитного действия противовирусных антител, специфически сенсибилизированных к вирусу бешенства Т- и В-%лимроцитов, макрофагов к И1.'луноко1.1потентных клеток неиммунных доноров шш их комбинаций методом эдоптизного переноса зараженным и одновременно обработанным Ц'Ж животнш. Адоптивный перенос во всех случаях

проводили через 24 часа после заражения псд когку бедра 100000 ЛДзд (штамм с^з) вируса и введения 200 мг/кг массы животного ЦФН. Для демонстрации ЗАЗДКИ зараженным на фоне введения ЦФК мышач вводили сшеноциты незараженных сингенных доноров (2-3 х 10^) и противовирусные антитела (0,3 мл, титр в реакция нейтрализации ин в ив о 1:3125). Контрольным животным вводили только клетки или лошадиный антирабический гамма-глобулин. Инокуляция спленоцитов нззаракен-ных мышей или противовирусных антител не оказывала существенного влияния на течение инфекции. Однако, если реципиенты получали антитела и им^нокошетентные клетки, около половины животных (46,2 %) выживало до 50 дач опыта (срок наблюдения). За весь период наблюдения у этих животных не наблюдали развития с: и/л томов заболевали.', в то время как во всех остальных исследуемых группах почти все животные погибали на фоне развития характерных признаков нейроинфекции. Аналогичную картиду наблюдали при проведении экспериментов в которых вирус инонулироваля непосредственно в головной мозг (100 ЛДзд). Как и в предыдущих опытах, введение только пмцунокомпетентных клеток или гетерологачных противовирусных антител было значительно менее эффективно, чем совместное введение обоих ингредиентов. Совместное действие клеток и антител обеспечивало защиту 52,8 % зараженных животных до' 30 дня опыта (срок наблюдения), что значительно превышало аналогичные показатели групп, получавших только антитела или клетки (15 %). В последующих сериях экспериментов были проведены сравнительные исследования защитного действия ЗАЗДКИ и специфически сенсибилизированных (зараяеншк доноров) ш.му яоко!."се те и т та кля-ток. Последние псисучали в конце инкубационного периода заболевания - на 7 день инфекции, т.е. в сроки развитая первичного тжуя-

ного ответа (интенсивность I3T - 23,4 %). Оказалось, что иммунные, как и нсимцунные сплоноциты, в исследуемых условиях, оыли не эффективны в задате эдоптивно иммунизированных, зараженных щ фоне введения ДФН реципиентов. В обоих группах, так же как и в группе, получившей только антитела, в равной мере погибали практически все животные. Однако введение противовирусных антител или ш.аунных клеток, в отличиэ от ньиммунных, сопровождалось увеличением средней продолжительности жизни (СП!) подопытных животных на 3,2 и 2,6 суток, соответственно. Незначительный защитный эффект иммунных клеток, выражающийся только в увеличении СПЖ, по-вндш.юму, был обусловлен частично Т- и В-лимфоцптами, но не макрофагами. Иммунные клетки, обработанные анти-Thy 1.2 или сывороткой против гамма-глобулинов мышей в присутствии комплемента сохраняли некоторый защитный потенциал, хотя он и был малозначителен. В то же время, удаление из популяции иммунных клеток прилипающих к пластиковой поверхности элементов, не оказывало влияния на защитные свойства исследуемых клеток при адоптивном переносе.

Тот факт, что ЗАЗДКИ, которое по мнению большинства исследователей является аналогом воспроизводимой ин витро реакции зависли/,ого от антител цитотолсического действия клеточного иммунитета, оказалось наиболее эффективно в защите зараженных вирусом бе-танстга i.-JULH&ii, нет ничего невероятного, так как известно, что о?от вирус распространяется ин витро в культуре клеток от клетки . к клетке и проникает в центральную нервную систецг по периферическим нервным стволам, минуя кровь ( Еаег G.M., 1975i Charlton К.:.;., 1988). Логично полагать, что эта особенность инфекции мо-улт опт-едодять особую эффективность механизмов защдты, направлен'

них на внутриклеточный вирус, каким и является ЗАЗДКП, а не на свооодные вирионы. Косвенным подтверждением этого предположен:^ являются появившиеся данные по защитой роли клонированных :ш витро специфически сенсибилизированных к вирусу бешенства цито-токсических Т-лимроцитов, рестриктированных по I классу антигенов Н-2 (Kawano H. et al., 1990).

4. Роль мзкройагов в патогенезе экспериментального бешенства у мышей

Существует две точки зрения на роль макрофагов в кс/унном ответе к вирусу бешенства. Согласно одной из них, патоген может элиминироваться ira организма в результате захвата вирусных частиц макрофагами с последующей деградацией виряонов, обеспечнваю-щей защиту организма (Turner G.s. et al.,1976). Вторая, наоборот, предполагает, что быстрое разрушение вирусного антигена в фагоцитах может явиться причиной последующего недостаточного предъявления антигена лимфоцитам, развитием слабого иммунного ответа и, соответственно, снижением резистентности организма к инфекции ( Gonsaies с.A. et âl.,1990). В наших экспериментах показано, что подавление фагоцитарной активности макрофагов ян виво сопровождается более быстрой гибелью животных. Наиболее вероятной причиной этого явления, по-видимому, является подавление именного ответа. По нашим данным, у таких животных (фагоцитоз подавляли введением в вену порошка железа) была подавлена продукция просизовируснкх антител, что свидетельствует скорее в пользу преобладания в ускоренной гибели животных нарушения функции презентации антигена лимфоцитам, нежели прямого фагоцитоза. В пользу этого предположения также свидетельствует тот факт, что макрофаги солэззнкн не бшш эффективны в защите зараженных и обработанных ЦШ реципиентов при адоптпшом переносе.

Как показали наши эксперименты, вторым механизмом, осуществляющимся посредством макрофагов и играющим существенную роль в защите мышей от бешенства, является ЗАЗДКИ. Как оказалось, прилипающие к пластиковой поверхности, не чувствительные к действие антя- Thy 1.2 и сыворотки против гамма-глобулинов мышей клетка являются ответственными за реализацию этой реакции ин ви-ео. Вторым доказательством, свидетельствующим о важной роли взаимодействия макрофагов с противовирусными антителами в обеспечении резистентности мышей к вирусу бешенства, явились результаты опытов, в которых гомологичные антитела вводили группам зараженных под коку стопы задней конечности ищунокомпетентных, обра- -боташшх ЦуН или порошком келеза животных. Обработка ЦФН, в исследованных условиях, но затрагивала сущеотвенно активности фагоцитирующих клеток, но подавляла активность Т- и В-дтфоцитов. Введение-порошка железа сопровождалось транзиторным подавлением фагоцитарной реакции ин.виво, но не повреждало функциональной активности Т- к В-лкмфоцитов. В этих условиях вводимые в день заражения антитела одинаково эффективно защищали ищунокомпетентных (56,9 %) и шией, обработанных ЦФН (58,2 %), но были неэффективны в защите животных с подавленной функцией макрофагов (18,7 %). То есть, для реализации защитного действия противовирусных антител (титр в реакции нейтрализации ин виво 1:3125). Присутствие функционально активных Т- и В-дим$оцитов не влияло на протективные свойства антител. Подученные факты позволяют предполагать, что существенным компонентом успешного проведения серотерапии бешенства у людей может явиться функциональное состояние макрофагов.

5. Разработка метода ускоренной диагностики бешенства у животных на основе использования для биопробы мышей о подавленным ПФН иммунным ответом

Своевременность и адекватность назначаемого пациенту курса антирабических лечебно-профилактических мероприятий во многом определяется сроком постановки диагноза животному, с которым человек имел контакт (Селшов М.А., 197Й; víid , 1984). В РЗ для постановки окончательного диагноза - бешенство - используют биопробу на мышах, подтвержденную МФА. Как альтернатива биопробе были предложены несколько тестов, в частности, реакция диффузной преципитации, заражение культуры клеток нервной системы, о последующим определением вирусных антигенов ША или имгдуно-фермеятным методом (Ботвинкин А.Д. и др., 1986; Rollin P.E., 1991; GoBztongi G., 1992). И, хотя эти метода позволяют поста-■ вить диагноз в течение 24-48 часов, они не нашли широкого применения, либо как недостаточно информативные, либо сложные технически для выполнения в условиях ветеринарных станций. Был предложен более простой метод ускорения диагностики бешенства при использовании секционного материала подозрительных на бешенство животных в биопробе на мышах с подавленным гидрокортизоном (ГКЗ) иммунным ответом (Помирко Т.И. и др., 1982). Нами показано, что. для воопроиэведения ускоренной биопробы на мышах возможно использование дан, который более экономичен и эффективен по сравнению с ПО. Кроме того, нами показана принципиальная возможность ускорения постановки биопробы на мышах не только с уличным вирусом,.но я циркулирующими ва территории Россия вирусом арктического вирусе, и лиссавирусом 5 серотипа (Юля). В работе использовали 22 "штампа вируса уличного бешенства, 2 а?а:.:.:а

арктического бешенства (Р41+), 2 штамма, выделенные в неаркти-чоской зоне, но имеющие маркер Р41+, и штамм Юли. Среднее время постановки диагноза у иммунокомпетентных животных суммарно для всех штампов было 7,2 суток, а у кшуносупрвссированных этот показатель был 4,7 суток, т.е. время ускорения диагноза в среднем составило 2,5 суток. Преимущество использования мышей с подавленным им.^нитето;.1 заключалось не только в ускорении постановки диагноза, но и в существенном увеличении числа зара-кеннш: ¡животных, у которых происходило быстрое накопление специфически;: антигенов в тканях головного мозга. Уже на 4-5 сутки антиген выявляли у внешне здоровых мышей при работе почти о 9С$ исследуема штаммов вируса и до 8 дня опыта включительно, подо-» житэльную реакцию отмечали в опытах со всеми штаммами. В группе имлунокомпотонтных кквотных к 6 дню опыта индуцировали положительную 'реакцию лишь около четверти исследованных вирусов и лишь к 10 дню опыта антиген обнаруживали у всех зараженных мышей. Введение Ц5Н (50 мг/кг) также сопровождалось более быстрой элспресскей вирусных антигенов у большого числа животных в группах зараг.ешшх отдельным штаммами и большей выраженностью реакции, что в значительной степени облегчало постановку диагноза. В отличие от ЦЗН, введение 1КЗ (максимальная нетоксичная доза 125 мг) не сопровождалось столь выраженным ускорением накопления вирусного антигена в головном мозге, В одном из пяти исследованных случаев ГКЗ не инициировал ускорения накопления анти-гопд, а при работе с тре?/я из пяти штаммов, у животных, получавши Ц-5Н, антиген выявляли на 1-2 дня раньше, по сравнению с об-р:»0от2шш:.я гор:.;оно;.!.

ВЫВОДЫ

1. Развитие экспериментального бешенства у мышей сопровождается появлением аятигенспецифических Т-эффекторов гиперчувствительности замедленного типа (I3T) в популяции клеток селезенки и лимфатических узлов. Активность описанных а$фекторов Н-2 рестриктирована и резко возрастает после предварительного, за 48 часов до заражения, введения циклофосфана (ЦФН), что обусловлено подавлением иммуномодулятором дифференцировки антлгэн-специфических Т-супрэссоров.

2. При экспериментальном бешенстве активируются вирусинду-цированные Т-супрессоры, ограничивающие активность эффекторов IST, Взаимодействио обоих типов клеток Н-2 рестриктировано, не связано с пролиферацией супрессоров и на реализуется после обработки ингибитором синтеза белка - циклогексимздом.

3. В опытах с адоптивным переносом иммунокомлетентных клеток сингенным зараженным реципиентам показано, что наиболее эффективным аятигенопецифическим механизмом, обеспечивающим резистентность мышей к вирусу бешенства, является зависимое ст антител защитное действие клеточного иммунитета (ЗАЗДКИ). Вирусспе-цифические антитела, специфически сенсибилизированные спленоци-ты и макрофаги, оказались значительно менее или не эффективны

в защите инфицированных животных.

4. Фагоциты являются основной популяцией имчунокомдегенг-ных клеток, оказывающих ЗАЗДКИ при экспериментальном бешенство и защитное действие макрофагов само по себе связано скорее не с фагоцитозом вируса, а с участием последних в кооперативных процессах, приводящих к продукции вирусспецифических антител.

5. Экспериментально показано, что одной из причин неэффективности проводимой серотерапии при бешенстве может явиться дефект макрофагов, дефицит Т- и В-лим^оцитов не оказывает существенного влияния на протективную активность противовирусных антитол.

6. Предложен модифицированный метод диагностики бешенства, основанный на использовании при постановке биопробы мышей с подавленным ЦФН иммунным ответом, позволяющий уокорить постанову диагноза на 2-5 суток по сравнению с традиционным. Продемонстрирована возможность использования этого теста дая диагностики всех серотипов ляссавирусов, циркулирующих на территории Рооояи

и стран СНГ - I серотип (вирус уличного бешенства, подтип I сбро-( типа - арктическое бешенство) и 5 серотип.'

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТШЕ ДИССЕРТАЦИЙ

1. Тодоров С.И., Гришина К.Г., Савинов А.П., Хозинский В.В. Ролята на макрофагите и антителата в патогенезата на експеримен-талния бяс и полиомиелит. Слухебен Бюлетин УШ Брой I. Национален центр по заразни и паразитарни болести. София, 1992, с. 8-9.

2. Тодоров С.И., Куваев В.В;, 1^шина К.Г., Хоэинский В.В. Ббектори на хиперчувствительността от забавэн тип (ХЗТ). Подтио-касци действието им Т-супрессори от вабавея тип (То) в патогенезата на експерементални невровирусни инфекции. Служебен Бюлетин УШ Брой I. Национален центр по заразни и паразитарни болести. София, 1992, о. 10-12.

3. Хозчнский В.В., Тодоров С.И., Селимов М.А., Магитвдзе Ц,3. Роль клеточного иммунитета в патогенезе экспериментального бешенства. Тез. докл. Мевдунар. Симп. "Проблемы патологии и ох-

раны здоровья диких животных, экологическое взаимодействие болезней диких и сельскохозяйственных животных". Астрахань, октябрь 1992 Г., с. 56-58.

4. Тодоров С.И., Хозинский В.В., Магигвдзе ц.з. Хиперчув-ствительност от забавен тип при экспериментален бяс. Условия за активирана и яякои свойства на ефекторите. 1993,

XXX, 1, С. 32-35.

тю мпо а. Илд т. юо _ 03 р>