Запрограммированная гибель клеток и эндонуклеазные активности у растений пшеницы и гороха

Середина, Анна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Запрограммированная гибель клеток и эндонуклеазные активности у растений пшеницы и гороха
ВАК РФ 03.01.05, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Запрограммированная гибель клеток и эндонуклеазные активности у растений пшеницы и гороха"

На правах рукописи

СЕРЕДИНА Анна Владимировна

ЗАПРОГРАММИРОВАННАЯ ГИБЕЛЬ КЛЕТОК И ЭНДОНУКЛЕАЗНЫЕ АКТИВНОСТИ У РАСТЕНИЙ ПШЕНИЦЫ И

ГОРОХА

03.01.05 - физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2010

004604944

Работа выполнена в отделе молекулярных основ онтогенеза Научно-исследовательского института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель - член-корреспондент РАН, доктор биологических

наук, профессор, Ванюшин Борис Федорович

Официальные оппоненты - член-корреспондент Российской академии

естественных наук, доктор биологических наук, профессор,

Загоскина Наталья Викторовна

доктор биологических наук, профессор, Тараканов Иван Германович

Ведущая организация - Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН

II 00

Защита состоится 8 июня 2010 г. в у и часов на заседании диссертационного совета Д220.043.08 при ФГОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева» по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, 49.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке имени Н.И. Железнова ФГОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева

Автореферат разослан 7 мая 2010 г. Автореферат размещен на сайте www.timacad.ru

Ученый секретарь диссертационного совета

^^^КЯ. Белопухов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Запрограммированная гибель клеток (ЗГК) является обязательной составляющей развития животных и растений. В настоящее время активно ведутся исследования запрограммированной клеточной гибели с целью выявления механизмов и путей ее реализации и для классификации различных форм ЗГК. Важными медиаторами клеточной гибели являются фитогормоны и активные формы кислорода (АФК). Фитогормоны принимают участие в регуляции процесса клеточной гибели, однако механизмы такой модуляции пока еще мало изучены. Образование АФК сопровождает многие формы клеточной гибели. Изучение окислительного статуса клетки и характера влияния экзогенных антиоксидантов на интактные растения служит основой для понимания механизмов запрограммированной гибели. Старение листа является одной из форм ЗГК, обычно этот процесс является завершающей стадией развития листа и имеет большое значение для жизнедеятельности всего растения, поскольку при этом происходит не только дегенерация клеток, но и рециркуляция накопленных питательных веществ, их перемещение в молодые листья, развивающиеся семена или запасающие ткани. Многочисленные работы по изучению физиологии, биохимии и молекулярной биологии старения листьев показали, что при старении в клетках листа происходят скоординированные изменения клеточной архитектуры, метаболизма и экспрессии генов. На завершающих этапах гибели клетки, а именно при деградации ядра, важную роль играют нуклеазы. В последние годы особенно активно развиваются исследования, направленные на выявление, выделение и характеристику ансамблей и индивидуальных нуклеаз, связанных с ЗГК у растений.

При постоянно пополняющемся списке феноменов ЗГК у растений все более остро стоит вопрос о разнообразии, классификации и эволюционных взаимосвязях программ ЗГК и молекулярных механизмов их реализации у многоклеточных организмов в целом. Возможно, внешне сходные морфологические проявления ЗГК (апоптоз, аутофагия и нелизосомальная ЗГК) являются результатом реализации разных генетических программ. В связи с этим, изучение эндонуклеаз, индуцируемых или активируемых на различных этапах ЗГК, представляется весьма важным, поскольку эти ферменты являются главными компонентами "молекулярной машины" ЗГК.

Цель работы: изучить влияние некоторых экзогенных факторов (регуляторы роста растений, свет) на реализацию программы клеточной гибели у растений, а также изучить возрастную динамику нуклеазных активностей, ассоциированных с ЗГК.

Экспериментальные задачи:

1. Изучить действие ряда известных регуляторов роста растений с ингибиторным и стимуляторным эффектом (этрел, салицилат натрия, брассиностероиды) на фрагментацию ДНК при ЗГК в проростках пшеницы.

2. Установить как происходит ЗГК у проростков пшеницы при выращивании на свету и сравнить ее с известной ЗГК у растений, выращиваемых в темноте.

3. Выяснить действие антиоксиданта ВНТ (ионол) на ЗГК в листе и колеоптиле при выращивании проростков пшеницы на свету.

4. Изучить возрастные изменения деградации ДНК, набор и некоторые свойства эндонуклеаз пшеницы и гороха при развитии и старении растений. В частности, определить - существует ли у растений пшеницы тканевая и возрастная разнокачественность набора эндонуклеаз и могут ли эти ферменты распознавать статус метилирования ДНК.

Научная новизна работы. У интактных проростков пшеницы, выращенных в условиях нормального светового дня, по мере их развития выявлена типичная дня апоптоза межнуклеосомная фрагментация яДНК. Установлено, что антиоксидант ВНТ не влияет на развитие проростков пшеницы на начальных этапах онтогенеза, а также на содержание активных форм кислорода в данных условиях. У выращенных при нормальном световом режиме проростков должна существовать некая система регуляции, ответственная за баланс активных форм кислорода, которая отличается от таковой у этиолированных проростков (у них она менее эффективна). Впервые обнаружена множественность нуклеазных активностей в ядерной и цитоплазматической фракциях растений пшеницы. На примере растений пшеницы (как представителя класса Однодольные) и растений гороха нормального (А/А/) к афильного (а/а/) генотипов (представителей класса Двудольные) детально изучена возрастная динамика изменения ДНК-азной активности и связанная с этим деградация ядерной ДНК. Найдены изменения набора ДНК-азных активностей в ходе старения органов растения. В листе и колеоптиле проростков пшеницы выявлена клеточная (органная) и субклеточная разнокачественность набора ДНК-аз. В листьях растений гороха нормального (А/А/) генотипа возрастная деградация ДНК происходит раньше, чем у афильного (а/а/) генотипа. Степень деградации ДНК коррелирует с увеличением суммарной нуклеазной активности у обоих генотипов растений гороха.

Практическое значение работы. В настоящее время ведутся активные исследования путей реализации генетических программ развития многоклеточных организмов, в частности запрограммированной клеточной гибели. Старение является одной из форм ЗГК и может влиять на урожайность с/х культур, а также быть причиной порчи с/х продукции в период хранения. Таким образом, изучение механизмов старения не только способствует пониманию фундаментальных биологических процессов роста и развития растений, но и может служить разработке методов улучшения качества урожая и повышения устойчивости растений к стрессовым факторам.

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на 6-ой Международной конференции «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях» (Москва, 2001), международной конференции «Рецепция и

внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2003), на конференции «Физиология растений - фундаментальная основа современной фитобиотехнологии» (Ростов-на-Дону, 2006), на международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), на 7-ой международной научно-практической конференции «Нетрадиционные и редкие растения, природные соединения и перспективы их использования» (Пущино, 2007), на симпозиуме «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007). По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура к объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 165 страницах, иллюстрирована 29 рисунками, 2 схемами и 1 таблицей. Список литературы содержит 291 источник, из них 273 на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты: одним из объектов исследования были проростки озимой пшеницы сортов Мироновская 808 и Московская 35 с момента прорастания по пятнадцатые сутки развития. Растения выращивали в кюветах из винипласта, на влажной фильтровальной бумаге: в термостате в темноте при 24° С для получения этиолированных проростков или в условиях 12-часового светового дня в климакамере («Fisión», Англия) при 24° С. Для изучения влияния на рост и развитие проростка биологически активных соединений воду заменяли на раствор этих веществ на второй день жизни проростков (через 48 часов после начала замачивания семян).

Вторым объектом исследования служили растения гороха садового Pisum sativum L. сорта New Line Early Perfection (NLEP, генотип AfAj) и af листовой мутант (генотип afaj), полученный на основе NLEP как полуизогенная линия, у которого в результате мутации листочки преобразовались в усики (афильный тип). Растения выращивали в вегетационных сосудах в теплице при естественном освещении до завершения вегетативной фазы развития, т.е. до полного формирования 12-го листа. Для анализа использовали целые листья либо отдельно пластинчатые компоненты (прилистники, листочки) и усы (оси и усики).

Методы. Для выделения ДНК растительный материал тщательно растирали в ступке с жидким азотом и к полученному тонкому порошку добавляли лизирующий раствор (50 мМ Трис-HCl, рН 7.5; 25 мМ ЭДТА, 1% ДЦС-Na). Гомогенат тщательно перемешивали и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем к нему добавляли 5 М NaCl до концентрации 1 М и депротеинизировали осторожным встряхиванием со смесью хлороформ:изопропанол (24:1 по объему). Из водной фазы, полученной после 20 мин центрифугирования при 5000 g, осаждали нуклеиновые кислоты добавлением 2.5 объемов 96%-ного этанола. ДНК растворяли

в ТЕ-буфере (10 мМ Трис-НС1; 1 мМ ЭДТА, рН 8.0) и полученные растворы обрабатывали РНКазой, свободной от ДНКаз (100 мкг/мл, 37°С, 1 ч). Обработанные РНКазой растворы ДНК вновь депротеинизировали встряхиванием со смесью хлороформ : изопропанол, и после центрифугирования (5000 g, 20 мин) из полученной водной фазы осаждали ДНК добавлением 96%-ного этанола. ДНК перерастворяли в ТЕ-буфере и измеряли ее концентрацию спектрофотометрически по поглощению раствора при 260 нм. Степень гидролиза ДНК определяли с помощью электрофореза в 1,5% агарозном геле при электрической напряженности 2-3 в/см в 0,09 M Tris-боратном буфере, рН 8,3 с добавлением 0.5 мкг/мл бромистого этидия. Измерение генерации АФК (супероксид-аниона и Н202) целыми проростками проводили по Auclair С. and Voisin Е. (1987). Для получения белковых экстрактов растительный материал растирали в фарфоровой ступке с жидким азотом. Экстракцию водорастворимых белков проводили буфером, содержавшим 150 мМ Трис-HCl, рН 6.8; 0.5 мМ PMSF; 0.1 M дитиотреитол (Fath et al., 2000). Гомогенат центрифугировали 10 мин при 12000 g и супернатант использовали для определения нуклеазной активности; содержание белка определяли по методу Bradford (Bradford, 1976). Фракцию ядер получали в сахарозном градиенте, при 4° С (Domínguez and Cejudo, 2006). Определение нуклеазной активности в растворе основано на учете образующихся под действием ДНКаз кислоторастворимых продуктов ДНК (Thelen and Northcote, 1989). Модификация этого метода (Сибирцев и Рассказов, 2000) позволяет провести независимую количественную оценку активности "щелочных" и "кислых" ДНКаз. Определение нуклеазной активности в агарозном геле дает возможность оценить влияние различных концентраций ЭДТА, ионов Са2+, Mg2+ и Zn2+, а также рН среды, на суммарную нуклеазную активность. Реакционная смесь содержала ДНК фага X (2-цепочечная) dam+ dcm+ (субстрат), 2 мкл; трис НС1 рН 7.0 10 тМ (конечная концентрация в смеси) либо Na-ацетат рН 5.5, 2 мкл; белковый экстракт, 2 мкл; ионы Са2+, Mg2+ в виде солей СаС12, MgCl2 в конечной концентрации 5 тМ, 2 мкл, либо ионы Zn2+ в виде соли ZnS04 добавляли до концентрации 1 тМ, 5 тМ, 10 тМ; при добавлении ЭДТА препараты с ЭДТА инкубировали 20 мин при комнатной температуре; объем смеси доводили HîO до 10 мкл, где необходимо. Реакционную смесь'инкубировали 30 мин при 37°С, а затем анализировали ее с помощью электрофореза. Метод определения ДНК-азной активности в геле (in-sel) позволяет проанализировать активность и состав группы нуклеаз, осуществляющих деградацию ДНК. Метод основан на электрофоретическом разделении белков в 12,5% полиакриламидном геле, содержащем ДНК (в качестве субстрата), в денатурирующих условиях. Гель состоит из разгоняющего (30% АА [30% акриламид + 0.8% бисакриламид)] 6 мл; буфер рН 8.8 [1.5М трис НС1 + 0.4% SDS] 3.75 мл; ДНК (15мкг/мл) + Н20 5.25 мл; 10 % PSA; 2% TEMED) и концентрирующего геля (30% АА [30% акриламид + 0.8% бисакриламид)] 0.65 мл; буфер рН 6.8 [ 0.5 M трис НС1 + 0.4% SDS] 1.25 мл; Н20 3.05 мл; 10 % PSA; 2% TEMED). Для электрофореза берется 1 объем буфера (15.1 г

Trisma base; 72 г глицина; 5 г SDS; Н20 до 1л) и 4 объема Н20. Электрофорез в концентрирующем геле вели при 20 тА, а в «разгоняющем» - при 40 тА. После электрофореза гели трижды по 15 мин отмывали в буфере, содержавшем 10 гаМ трис НС1 рН 7.0 (либо Na-ацетат рН 5.5), 1% тритон Х-100, в присутствии 5 тМ ЭДТА. Затем трижды по 15 мин промывали в буфере, содержавшем 10 гаМ трис НС1 рН 7.0 (либо Na-ацетат рН 5.5) и инкубировали в течение ночи при 37° С в присутствии 5 mM Са2+, Mg2+ или Zn2+, либо без добавления ионов. После инкубации гель отмывали от ионов, «окрашивали» бромистым этидием 0.5 ng/мл в течение 30 мин, затем помещали под ультрафиолетовый свет для визулизации степени гидролиза ДНК. Нуклеазная активность детектировалась по наличию темного пятна без ДНК. Для выявления белкового набора и местоположения действующих нуклеаз гель окрашивали 3 часа буфером с кумасси (кумасси R-250 1 г; СН3СООН 100 мл; С2Н5ОН 450 мл; Н2О 450 мл). Затем гель отмывали от краски в буфере: СН3СООН 70 мл; С2Н5ОН 200 мл; Н20 730 мл. В качестве субстрата использовали коммерческий препарат ДНК селезенки крупного рогатого скота. ДНК предварительно растворяли в воде и переосаждали 2,5 V объемами этилового спирта, промывали 70% этанолом и перерастворяли в воде. Для получения одноцепочечной ДНК ее прогревали на водяной бане, после чего охлаждали на льду, чтобы предотвратить ренатурацию. Концентрацию ДНК определяли по поглощению при 260 нм на спектрофотометре Ultraspec 300.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Фрагментация ДНК в развивающемся колеоптиле проростков пшеницы, выращенных в присутствии регуляторов роста растений.

Ранее было проанализировано влияние экзогенных фитогормонов и биологически активных веществ на фрагментацию ДНК, связанную с ЗГК при старении колеоптилей этиолированных проростков пшеницы (Ванюшин, 2001). Этот список был дополнен этрелом, салицилатом натрия, препаратами «эпин» и «циркон».

У растений, выращенных в присутствии этрела (2-хлорэтилсульфоновая кислота), который является источником этилена (рис. 1), и у растений, выращенных в присутствии салицилата натрия (рис. 2), фрагментация ДНК в колеоптиле отмечается уже у 4-дневных растений, в то время как у контрольных проростков этого же возраста она еще не детектируется и с возрастом усиливается. Причем наблюдаемый характер фрагментации ДНК близок к так называемой «лестнице» -набору продуктов гидролиза ДНК по размеру кратных нуклеосоме, которая характерна для апоптоза и апоптозоподобной ЗГК.

Брассиностероиды - растительные гормоны, известные своей способностью усиливать устойчивость растений к различным стрессам (Asami et al., 2005). Промышленные препараты «эпин» и «циркон» являются эффективными

иммуномодуляторами и обладают широким спектром стимуляторного и защитного от патогенов действия. Действующим веществом «эпина» является эпибрассинолид (синтетический аналог природного гормона), биологическая активность «циркона» определяется смесью гидроксикоричных кислот.

Проростки пшеницы выращивались в присутствии данных препаратов в концентрациях, которые рекомендованы в инструкции по их применению («эпин» 5 мкг/л, «циркон» 10 мкг/л). Анализ степени деградации ДНК колеоптилей этиолированных проростков выявил, что в присутствии иммуномодуляторов ДНК деградирует в меньшей степени по сравнению с контролем (рис. 3).

Таким образом, иммуномодуляторы способны оказывать влияние на реализацию программы клеточной гибели, отдаляя начало деградации ДНК. К 10'5М 10'3М К 1(Г5М 10"3М 1 2 3

ЩЩШ

Рис.1. Рис.2. Рис.3.

Рис. 1. Влияние этрела (10"2 М) на фрагментацию ДНК, выделенной из колеоптилей этиолированных проростков пшеницы. Дорожки: 1 - контроль 4 суток, 2 - контроль 6 суток, 3 - этрел, 4 суток, 4 - этрел, 6 суток. Электрофорез в 1,6 % агарозном геле.

Рис. 2. Влияние салицилата натрия на фрагментацию ДНК, выделенной из колеоптилей этиолированных проростков пшеницы 4- и 6-суточного возраста, выращенных в присутствии салицилата натрия, а - 4-е сутки, 6 - 6-е сутки. Электрофорез в 1,6 % агарозном геле.

Рис. 3. Влияние «эпина» (5 мкг/л) и «циркона» (10 мкг/л) на фрагментацию ДНК, выделенной из колеоптилей этиолированных проростков пшеницы, а - 4-е сутки, б - 6-е сутки. Дорожки 1,4 — контроль, дорожки 2, 5 - «циркон», дорожки 3,6- «эпин». Электрофорез в 1,6 % агарозном геле.

2. Реализация ЗГК у проростков пшеницы, выращенных на свету.

При выращивании в условиях 12-часового светового дня у проростков пшеницы с возрастом наблюдается возрастание степени фрагментации ДНК, что характерно и для этиолированных проростков (рис. 4) (Кирнос с соавт., 1997а; Кирнос с соавт., 1999; Ванюшин с соавт., 2002).

Как видно на рис. 4а, на 4-е сутки развития проростка ДНК колеоптиля этиолированных проростков нативна, на 6-е сутки она имеет заметные признаки фрагментации, а на 8-е сутки роста растения на фоне визуальных признаков старения видна ярко выраженная фрагментация ДНК, причем характер фрагментации носит черты «апоптозной лестницы». На рис. 46 представлена электрофореграмма ДНК, выделенной из колеоптилей проростков, выращенных в условиях 12-часового

светового дня: вплоть до 8-х суток развития растения фрагментация ДНК незначительна, и лишь на 10-е сутки наблюдается выраженная межнуклеосомная

Рис.4. Электрофореграмма ДНК колеоптилей пшеницы, а - ДНК этиолированных проростков, б -ДНК проростков, выращенных на свету. Наверху указан возраст проростка.

Электрофорез в 1,6 % агарозном геле.

Таким образом, световой режим выращивания растений влияет на фрагментацию ДНК - у выращенных на свету проростков выраженная фрагментация ДНК наблюдается позже, чем у этиолированных проростков. Вероятно, задержка старения колеоптиля связана с переходом проростка к автотрофному типу питания и повышением функциональной активности фотоассимилирующих тканей, а также поддержанием напряженных донорно-акцепторных отношений, отражающих проявление интеграции между фотосинтезом и ростом (Мокроносов, 1988).

3. Влияние антиоксиданта ВНТна ЗГК проростков пшеницы, выращенных на свету.

Как было ранее обнаружено (Бакеева Л.Е. с соавт.,2001, Шорнинг Б.Ю. с соавт.,1999), в присутствии ВНТ (0,45 • 10"5 - 2,27 • 10"4 М) при выращивании проростков пшеницы в темноте резко подавляется их рост, изменяется морфология их органов и заметно увеличивается продолжительность жизни колеоптиля. В колеоптиле этиолированных проростков ВНТ предотвращает возрастное снижение содержания суммарных ДНК и белка, апоптозную межнуклеосомную фрагментацию ядерной ДНК, появление в клеточных вакуолях специфических везикул с активными реплицирующими ДНК митохондриями и образование тяжелой мтДНК (р = 1,718 г/см3). Наряду с этим ВНТ вызывает структурные изменения в организации всех органелл клетки (ядро, митохондрии, пластиды, аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум) и образование новых необычных мембранных структур в цитоплазме. ВНТ нарушает деление ядер и клеток, что приводит к появлению многолопастных полиплоидных ядер и многоядерных клеток. Такое действие ВНТ связано с его антиокислительными свойствами (структурный аналог ВНТ 3,5-ди-т/?е/я-бутилтолуол физиологически инертен и не обладает таким действием). Предполагалось, что именно обусловленная ВНТ инактивация активных форм кислорода у этиолированных проростков ответственна за предотвращение апоптоза и нарушение митоза (Ванюшин, 2001).

При выращивании проростков пшеницы при той же концентрации ВНТ, но в условиях нормального светового дня рост растений почти не подавляется и по

8сут бсут 4сут Юсут 8сут бсут 4сут

морфологическим признакам выращенные в присутствии ВНТ (2,27 • 10"4 М) проростки не отличались от контрольных.

к внт

Рис.5. Влияние ВНТ на фрагментацию ДНК колеоптилей проростков пшеницы разного возраста, выращенных на свету. [. ;■ а- 6 суток, 6-8 суток, в - 10 суток роста растений.

|К£| Электрофорез в 1,6 % агарозном геле.

Щ <

> 4:

яв

В отличие от этиолированных проростков, ВНТ не предотвращает апоптозную фрагментацию ДНК в колеоптиле растения, выросшего при нормальном световом дне. При выращивании в присутствии ВНТ при нормальном световом дне фрагментация ДНК в колеоптиле, как и у контрольных (в отсутствие ВНТ) этиолированных растений, выявляется у 6-8-дневных проростков, однако, по-видимому, она выражена в меньшей степени, чем у контрольных этиолированных проростков (рис. 5).

4. Образование проростками активных форм кислорода

Ранее было установлено, что в этиолированных проростках пшеницы происходит интенсивное образование супероксидного радикала (02:), который высвобождается в среду инкубации. Добавленный в среду выращивания ВНТ приводит к снижению измеряемого уровня 02\ следствием чего является подавление скорости реализации ЗГК в колеоптиле этиолированных проростков (Шорнинг с соавт., 1999; 2000).

Было определено количество образующихся супероксид-аниона (02;) и гидроперекиси (Н202) проростками пшеницы разного возраста, выращенных при нормальном световом дне без и в присутствии ВНТ в концентрации 2,27 * 10 "4 М.

Мы предположили, что на свету уровень АФК должен быть выше. Эксперименты показали, что в растении, выращенном в условиях светового дня, содержание 02: и измеряемый независимо уровень Н202 не повышаются, а даже ниже, чем у этиолированных проростков (рис. 6 и 7). ВНТ (ловушка радикалов) не снижал способность проростков генерировать 02' (в отличие от этиолированных проростков) (рис. 6). По-видимому, у проростков пшеницы, выращенных при нормальном освещении, активны ферментативные системы удаления 02. Это реакции образования Н202 при диспропорциоиировании 02 супероксидцисмутазой и разложения Н202 каталазой. Для проверки такой схемы были поставлены эксперименты с ингибиторами каталазной активности салицилатом и азидом натрия. Обработка этими ингибиторами проростка, выращенного на свету, перед измерением в нем количества Н202 приводит к повышению уровня Н202 (рис. 7). У этиолированных проростков ни один из этих ингибиторов не влиял на уровень Н202.

к внт к внт

1 3,0

1 2,0

=а 1.0 В

сэ

0,0

внт

-Ь

+ВНТ

Свет Рис. 6.

Темнота

2 3

Рис. 7.

Рис. 6. Выделение 0{ в среду инкубации за 1 ч 6-дневными проростками пшеницы, выращенными при нормальном световом дне и в темноте, в отсутствие и в присутствии 2,3« 10"1 М ВНТ. Рис. 7. Выделение Н2О2 в среду за 1 мин 6-дневными проростками пшеницы, выращенными при нормальном световом дне (1), в темноте (2) или на свету в присутствии добавленных в среду салицилата (3) или азида натрия (4).

Таким образом, у проростков, выращенных при нормальном световом дне, более активны системы регуляции уровня активных форм кислорода, чем у этиолированных растений.

НУКЛЕАЗЫ, УЧАСТВУЮЩИЕ В ДЕГРАДАЦИИ ДНК В ХОДЕ ЗГК ПРИ СТАРЕНИИ

5. Нуклеазы, участвующие в ЗГК при увядании проростков пшеницы

Данный раздел работы посвящен детальному анализу нуклеазных активностей, участвующих в реализации программы ЗГК в первом листе и колеоптиле пшеницы. Дана оценка общего уровня ДНК-азной активности, детально изучена динамика ее изменения в ходе старения органа, показано изменение набора ДНК-азных активностей в ходе старения, изучена зависимость этих активностей от рН, ионов двухвалентных металлов и степени метилирования субстрата (ДНК), а также распределение нуклеазных активностей в ядерной и цитоплазматической фракциях. Контроль ядерной и цитоплазматической фракции осуществлялся как биохимически (набор белков четко различается во фракциях, рис.8), так и при помощи флуоресцентного микроскопа. Суспензия ядер была обработана красителем 0АР1, который окрашивает хроматин (рис.9).

Рис. 8. Электрофореграмма белковых препаратов. 1 -маркеры, 2 - цитоплазматическая фракция 7-суточных проростков пшеницы, 3 - ядерная фракция 7-суточных проростков пшеницы. Рис. 9. Фракция ядер колеоптиля (а) и апикальной части листа (б) 7-суточных проростков пшеницы.

Рис. 9.

5.1. Изменение нуклеазной активности в ходе развития колеоптиля и первого листа проростков пшеницы

В процессе ЗГК у растений и животных увеличение нуклеазной активности ассоциируется с фрагментацией ядерной ДНК. В этой связи были изучены изменения нуклеазной активности в ходе ЗГК при старении колеоптиля и в апикальной части (1 см) первого листа этиолированных проростков пшеницы. Суммарная нуклеазная активность определялась в белковых экстрактах, полученных из тканей апикальной зоны первого листа и целых колеоптилей. Для анализа были взяты аликвоты белковых экстрактов, содержащие 5 мкг белка, а в качестве субстрата была использована денатурированная тимусная ДНК.

На рис. 10 видно, что в колеоптиле заметный прирост нуклеазной активности наблюдается с 4-х суток развития, она резко увеличивается и достигает максимума к 8 суткам, а затем несколько снижается. В апикальной части первого листа нуклеазная активность начинает расти позже - с 7 суток развития проростка, но ее увеличение происходит медленно и, очевидно, достигает максимальных значений после наблюдаемого интервала времени (после 11 суток развития) (рис.10).

«6 |»5

5 И

Рис. 10. Динамика изменений нуклеазной активности в листе и колеоптиле этиолированных

проростков пшеницы. I - колеолтиль, 2 - отрезок (1 см) апикальной зоны --2 листа (далее лист). Эксперимент был

повторен 5 раз. Максимальное стандартное отклонение от представленных средних величин не превышало 10%.

е замачивания семян

Таким образом, показано возрастание ДНК-азной активности в стареющем колеоптиле и первом листе проростков пшеницы по мере реализации программы ЗГК.

ДНК-азы, принимающие участие в выполнении программы ЗГК, условно разделены на два класса: гп-зависимые («кислые») и Са, 1У^-зависимые («щелочные») (в^уата е1 а1., 2000). Оценка соотношения «кислых» и «щелочных» ДНК-аз представлена на рис. 11.

В развивающемся колеоптиле вплоть до 4 суток на фоне низкой общей нуклеазной активности преобладают «щелочные» ДНК-азы. С 5 суток, когда начинается старение колеоптиля и включается программа ЗГК, до 8 суток, когда идет быстрый рост ДНК-азной активности, это соотношение практически не меняется, но постепенно увеличивается уровень активности «кислых» ДНК-аз. И, наконец, на завершающих стадиях старения (11 сутки) в колеоптиле доля активности «кислых» нуклеаз несколько превышает долю активности «щелочных» (рис.11а). В апикальной части первого листа в первые 11 суток развития проростка соотношение «щелочных» и «кислых» ДНК-аз меняется аналогично (рис. 11 б), однако, к

завершению периода наблюдений соотношение активности двух типов ДНК-аз сохраняется в пользу преобладания «щелочных».

Дни после замачивания семян Дни |Ш» заначиваю« CWW

Рис. 11. Соотношение «щелочных» (1) и «кислых» (2) нуклеазных активностей в колеоптиле (а) и первом листе (6) этиолированных проростков пшеницы. Максимальное стандартное отклонение от представленных средних величин не превышало 10%.

Использование в качестве субстрата ДНК фага лямбда позволяет оценить изменение ДНК-азной составляющей комплекса нуклеазных активностей, действующих на двухцепочечные ДНК, а, кроме того, дает четкую картину изменения суммарной ДНК-азной активности в стареющих первом листе и колеоптиле пшеницы. Показано (рис. 12а), что ДНК-азная активность обнаруживается в суммарном экстракте из первого листа и колеоптиля уже на 2-е сутки развития проростка. Далее по мере формирования этих органов ДНК-азная активность возрастает, причем в листе ее увеличение происходит медленнее, чем в колеоптиле. Существенное возрастание ДНК-азной активности в колеоптиле на 4-е сутки развития проростка совпадает с прекращением клеточных делений и началом фрагментации ДНК. Последующее нарастание ДНК-азной активности в колеоптиле коррелирует с увеличением доли деградированной ДНК. Заметный сдвиг в сторону увеличения ДНК-азной активности в листьях происходит на 6-7 сутки его развития, что также сопровождается появлением первых признаков деградации ДНК в апикальной части листа. На рис. 12 а, б представлены электрофореграммы продуктов гидролиза ДНК фага лямбда экстрактами из листа и колеоптиля развивающихся проростков пшеницы после различной экспозиции. Это дает более отчетливое представление о действии нуклеаз на самых ранних стадиях развития проростка в условиях этиоляции.

Кроме того, использование коммерческих препаратов ДНК фага лямбда, различающихся по статусу метилирования - dam(+) и dam(-), дает возможность выяснить, влияет ли присутствие метальных групп в ДНК на ее доступность для ДНК-аз. На рис.13 видно, что в листе и колеоптиле проростков уже через 24 часа после замачивания семян действуют ДНК-азы, отличающиеся избирательностью по отношению к метилированным сайтам в ДНК-субстрате, dam, dcm<+) - зависимые. Эта особенность ДНК-аз, функционирующих на начальных этапах развития

проростка, становится более выраженной в листе и колеоптиле проростков на 3-4 сутки развития и сохраняется на более поздних стадиях роста проростка.

Рис. 12. Электрофореграммы продуктов гидролиза ДНК фага лямбда (dam, dem)' белковыми экстрактами из тканей колеоптиля и первого листа проростков пшеницы. Время инкубации реакционной смеси а - 1 час, 6-2 часа. Цифры (1...8) - дни после замачивания семян; к- колеоптиль, л - лист, ц -проросток взят целиком.

Рис. 13. Электрофореграммы продуктов гидролиза ДНК фага лямбда с различным статусом метилирования белковым

экстрактом из тканей колеоптиля и первого листа проростков пшеницы, а - неметилированная ДНК фага лямбда (dam, dem)' , б метилированная ДНК фага лямбда (dam, dcm)+. Время инкубации 4 часа при 37°С. Обозначения на треках см. подпись к рис. 12.

колеоптиле этиолированных проростков пшеницы присутствуют нуклеазы, характеризующиеся определенным предпочтением к гидролизу метилированных ДНК.

а б В Г Д рис- 14ш Влияние ЭДТА, ионов двухвалентных

металлов и pH на суммарную нуклеазную активность из колеоптиля проростков пшеницы. Гидролиз ДНК фага лямбда проводили в течение 1 ч при 37 °С. Реакционная смесь содержала а - на фоне 50 мМ ЭДТА: (1) - 10 мМ ZnCl2, (2) - 5 мМ ZnCl2, (3) - 1 мМ ZnCl2, (4) - без ZnCh; б -без ЭДТА, (1)- 10 мМ ZnCh, (2) - 5 мМ ZnCh, (3) - 1 мМ ZnCh, (4) - по 5 мМ ZnCh, MgCI2, СаС12, (5) -без внесения двухвалентных ионов; в - на фоне 50 мМ ЭДТА, (I) - по 5 мМ MgCI2, СаС12, (2) - 5 мМ MgCI2, (3) - 5 мМ СаС12; г -то же что и в на фоне 12.5 мМ ЭДТА; д -ЭДТА в концентрации 50мМ (1), 25мМ (2), 12.5мМ (3), 5 мМ (4), 0.5 мМ (5).

На примере белкового экстракта из фракции ядер 7-суточных колеоптилей нами была изучена чувствительность нуклеазных активностей к ЭДТА и ионам Са+2, Mg+2 и Zn+2. На рис.14 видно, что ЭДТА в концентрации 50 мМ полностью ингибирует суммарную ДНК-нуклеазную активность. Внесение ионов проводили после

Zn Zn Ca, Mg Ca, Mg ЭДТА

12 3 4 12 3 4 5 12 3 12 3 12 3 4 5

pH=5.5 pH=7.0 pH=7.0 pH=7.0 pH=7.0

обработки экстрактов 25 мМ ЭДТА (30 мин. при комнатной температуре). Установлено, что Са+2 и/или М§+2 стимулируют активность значительной доли нуклеаз, внесение ионов Хп+2 вызывает подавление значительной доли нуклеазной активности при рН=7,0 и стимуляцию определенной части нуклеазной активности при рН=5,5. Можно говорить и о подавлении некоторых нуклеазных активностей, об этом можно судить по уменьшению интенсивности шмеров. Характер продуктов гидролиза ДНК фага лямбда нуклеазами, стимуляция которых определяется теми или иными ионами, позволяет предположить наличие различных групп нуклеаз в клетках стареющего колеоптиля.

5.2. Множественность нуклеазных активностей в развивающихся колеоптиле и листе проростков пшеницы.

Нами был изучен состав группы нуклеаз, обладающих ДНК-азной активностью в отношении одноцепочечной ДНК и имеющих оптимум рН близкий к нейтральному в присутствии ионов Са+2 и Mg+2 .

На рис. 15 видно возрастание ДНК-азных активностей этой группы в ходе развития и старения апикальной части первого листа и колеоптиля этиолированных проростков пшеницы. Увеличение ДНК-азной активности происходит по нарастающей, причем, возрастание ДНК-азной активности в листе и колеоптиле происходит в разное время. Так, в целом для колеоптиля, увеличение нуклеазной активности происходит раньше, чем в первом листе: ДНК-азная активность достигает максимума в колеоптиле на 8 сутки развития проростка, а в листе к этому времени уровень ДНК-азной активности значительно ниже. При сравнении изменения ДНК-азной активности в цитоплазме и ядре установлено, что их возрастание происходит параллельно.

Особый интерес вызывает электрофоретическая гетерогенность выявленных ДНК-азных активностей, функционирующих в колеоптиле и первом листе в одно и то же время на различных этапах развития проростка. Показано, что в первом листе и колеоптиле проростков пшеницы присутствуют по крайней мере 7 белков, обладающих ДНК-азной активностью при рН=7,0, молекулярная масса которых варьирует от 16 до 80 кД. Установлено, что набор ДНК-азных активностей различается в листе и колеоптиле: наряду с ферментами, присутствующими в обоих органах (белки 36, 39, 28 кД), в колеоптиле обнаружены специфичные для него ДНК-азы - гидролиз ДНК в ядре на завершающих стадиях увядания осуществляют дополнительные высоко- (56 кД и около 80кД) и низкомолекулярные ферменты (16 кД). Также следует отметить различия в наборе ДНК-азных активностей в ядре и цитоплазме: ядерные ДНК-азные активности более разнообразны, чем цитоплазматические ферменты, в свою очередь в цитоплазме выявлен белок с ДНК-азной активностью, отсутствующий в ядре - 42 кД.

При развитии колеоптиля (рис.15 а), в первые 3 дня с начала набухания семян присутствующие в нем ДНК-азные активности незначительны и уровень их

активностей в ядре и цитоплазме сопоставим. Начиная с 4-х суток наблюдается возрастание ДНК-азных активностей в обоих клеточных компартментах. В ядре с 4-го дня развития наиболее резко увеличивается активность 28 к и 36 кД ферментов, на 6-ой день появляются ДНК-азные активности 16 кД и 56 кД и их возрастание в последующие дни идет достаточно медленно, а на 8 сутки в ядре появляется еще одна высокомолекулярная ДНК-азная активность (80 кД) и на этом, по-видимому, завершается формирование популяции ДНК-азных активностей в ядре стареющего колеоптиля - в ядрах из 10-11 дневных колеоптилей, находящихся на завершающей стадии свой жизни, набор ДНК-азных активностей аналогичен таковому в ядрах клеток 8-дневных колеоптилей.

молл , ЯДРО Ыш м ЯДРО

Рис.15. Определение нуклеазных активностей т-%е1 в экстрактах тканей колеоптиля (а) и листа (6)

этиолированных проростков пшеницы при рН 7.0. Цифры под треками - дни после замачивания семян.

а б

В то же время активность ДНК-аз в цитоплазме клеток колеоптиля в указанный период изменяется иначе: вплоть до 7-х суток развития проростка в цитоплазматической фракции обнаруживаются три основные ДНК-азные активности, причем активность фермента 28 кД остается неизменной, тогда как ДНК-азные активности 36 и 39 кД белков резко увеличиваются и достигают максимума на 8 сутки, после чего несколько снижаются. Кроме того, в цитоплазме клеток колеоптилей 10-11-суточных проростков отмечено появление ДНК-азной активности 42 кД.

Характер изменения ДНК-азных активностей в ядре и цитоплазме первого листа проростков пшеницы на протяжении первых 11 суток развития практически идентичен: активность фермента 28кД остается стабильной, а активности ДНК-аз 39 и ЗбкД начинают увеличиваться с 7 суток в цитоплазме и с 8 суток в ядре (рис. 15,6).

Выявленное нами присутствие как «кислых», так и «щелочных» нуклеаз наглядно продемонстрировано на рис. 16, где представлены результаты определения ДНК-азной активности т gel в белковых экстрактах из ядер и цитоплазмы листа и колеоптиля 5-8 суточных проростков пшеницы в отсутствии ионов Са+2 и М^+2 (рН=7,0) и в присутствии ионов Хп2 (рН=7,0 и рН=5,5). Видно, что отсутствие ионов Са+2 и М£+2 приводит к резкому снижению нуклеазной активности в целом

(сравнение с рис. 15), а внесение ионов Ъх\г вызывает как угнетение одних, так и стимуляцию других ДНК-азных активностей. Так, в ядрах клеток колеоптиля цинком подавляются активности всех нуклеаз за исключением нуклеазы 36 кД, активность которой стимулируется. Кроме того, в присутствии ЪгС2 при рН 5,5 наблюдается проявление нуклеазной активности с молекулярной массой 26 кД, которая не обнаруживается при «проявлении» с Са и Щ+2, рН 7 ,0 (рис.15). В цитоплазме из клеток колеоптиля 2п+2 подавляет активность ДНК-аз 42, 28 и 39 кД и стимулирует активность нуклеазы 36 кД; 28 и 39 кД нуклеазные активности из ядер клеток первого листа также подавляются, однако ЪхС2 стимулирует активность нуклеазы 36 кД. Кроме того, в присутствии Тп*1 при рН 5,5 выявляется низкомолекулярная нуклеаза с кД менее 20, отличная от нуклеазы 16 кД из ядер колеоптиля. В цитоплазме из клеток листа ионы цинка вызывают ту же реакцию, что и в цитоплазме из колеоптиля: активность нуклеаз 28 и 39 кД подавляется, а активность нуклеазы 36 кД стимулируется. Таким образом, установлено, что в клетках колеоптиля и листа присутствуют нуклеазы, различающиеся чувствительностью к ионам 2-х валентных металлов, то есть имеются как Са+2, ]У^+2-зависимые так и Ъъ2-зависимые, а их активность меняется в ходе развития и при старении по-разному.

66785678 5 6 V" 8 5 6 7 8

рН=7.0; Zn рН=5.5; Zn PH-7-°i Zn PH=5'S; Zn

а б

Рис.16. Влияние ионов цинка на «щелочные» нуклеазные активности и выявление Zn-зависимых «кислых» нуклеаз in gel в экстрактах тканей колеоптиля (а) и листа (б) этиолированных проростков пшеницы. Цифры под треками - дни после замачивания семян.

Вопрос о субстратной специфичности выявленных нами нуклеаз несомненно должен быть решен при анализе индивидуальных ферментов, тем не менее, мы попытались выяснить проявляют ли нуклеазы, участвующие в выполнении программы ЗГК в стареющем колеоптиле (6 сутки), предпочтение в отношении ss-или ds-ДНК, и обладают ли они РНК-азной активностью. На рис. 17 видно, что основные ДНК-азы, осуществляющие деградацию ДНК при ЗГК, отдают предпочтение ssflHK. Однако, присутствуют нуклеазы, способные к гидролизу и dsflHK, причем некоторые из них обладают и РНК-азной активностью.

Рис. 17. Субстратная специфичность РНК-азных и ДНК-азных активностей из колеоптилей 7-дневных этиолированных проростков пшеницы.

Таким образом, в гидролизе ядерной ДНК на завершающих этапах ЗГК участвует многокомпонентный ансамбль нуклеаз с различной субстратной специфичностью.

6. Нуклеазы, участвующие в ЗГК при старении растений гороха

6.1. Степень деградации ДНК, выделенной из листьев растений гороха разного возраста

Содержание ДНК в молодых и зрелых листьях было примерно одинаково у растений обоих генотипов гороха, и его уменьшение становилось заметным, начиная с шестого листа. Причем это возрастное снижение количества ДНК в листьях у нормальных растений было более интенсивным, чем у а/~-мутанта (данные не приводятся).

С помощью электрофореза в агарозном геле проанализировали суммарную ДНК из целых листьев гороха. На рис.18 представлена электрофореграмма препаратов ДНК, выделенных из настоящих листьев (с четвертого по двенадцатый) растений гороха нормального и af генотипов.

Видно, что с возрастом в листьях гороха увеличивалась степень деградации ДНК. У растений с обычными листьями в субапикальном первом от верхушки стебля полностью сформированном листе (12-й лист) ДНК практически интактна, в шестом листе деградация ДНК уже весьма ощутима, а в четвертом листе с выраженными внешними признаками старения (пожелтение) доля высокомолекулярной ДНК уже незначительна и деградация ДНК носит массированный характер. Аналогичные изменения в характере деградации ДНК наблюдались и у растений афильного генотипа, однако этот процесс у них был менее активен и явно отложен во времени. По-видимому, это связано с необходимостью поддержания повышенной функциональной активности фотоассимилирующих тканей в связи с повышенной напряженностью донорно-акцепторных отношений между органами растений афильного типа. Ранее у них было установлено повышенное содержание ИУК и цитокининов в прилистниках и усах (Коф с соавт., 2002); вместе с высоким содержанием хлорофиллов и гипертрофированным ростом данная компенсация обеспечивает более продолжительное и активное функционирование фотосинтетического аппарата. В совместных исследованиях с Э.М. Коф, В.В. Карягиным и З.В. Калиберной (2007) было также показано, что старение листьев линии афильного типа сопровождается более интенсивным

накоплением АБК, в то время как у растений А/А/ разница в ее содержании в старых и молодых субапикальных листьях не столь велика.

На электрофореграммах ДНК, выделенных из пластинчатых компонентов листа (прилистники, листочки) и усов растений с обычным листом (рис. 19а) или прилистников и усов растений с афильным генотипом (рис. 196), видны различия в характере деградации ДНК в разных частях листа при старении. При этом в исследованных препаратах на фоне общей существенной деградации ДНК мы не видим четко выраженной межнуклеосомной фрагментации ДНК, характерной для некоторых форм ЗГК, в том числе и для апоптоза. По-видимому, это может объясняться (маскироваться) одновременным массированным действием в стареющих листьях множественных и разных по специфичности и активности

Рис. 18. Электрофореграмма суммарной ДНК, выделенной из целых настоящих листьев двух генотипов {А/А/ и а/а/). Электрофорез проводили в 1,6% агарозном геле. Дорожки (а): ДНК соответственно из 12, 10, 7, 6, 5 и 4 настоящих листьев растений гороха с А$-генотипом. Дорожки 1-6 (б): ДНК

соответственно из 12, 10, 7, 6, 5 и 4 настоящих листьев растений гороха с о/"-генотипом.

Рис. 19. Электрофореграммы ДНК, выделенных из пластинчатых компонентов (прилистники и листочки) и усиков листа гороха (а) А/- и (б) а/-генотипов. Электрофорез проводили в 1,6% агарозном геле. Дорожки 1-3: ДНК из усиков 9, 6 и 4 настоящих листьев. Дорожки 4 - 7: ДНК из пластинчатых компонентов 9, 6, 4 и 3 настоящих листьев.

6.2. Нуклеазная активность в стареющих листьях гороха

Деградация ДНК связана с индукцией и активностью нуклеаз, вовлеченных в процесс ЗГК при старении (Б^уата е1 а1., 2000). Качественные и количественные изменения нуклеазной активности оценивали двумя методами, определяя нуклеазную активность в растворе и в геле. I Результаты количественной оценки суммарной нуклеазной активности в ! стареющих листьях гороха представлены на рис. 20. Образцами для определения нуклеазной активности служили равные по содержанию белка аликвоты белковых экстрактов, полученных из листьев разного возраста растений нормального и а/генотипа. В качестве субстрата мы использовали денатурированную тимусную ДНК.

На рис. 20 видно, что старение листьев гороха сопровождалось заметным увеличением в них суммарной нуклеазной активности. Причем в листьях растений , Л/-типа это происходило гораздо быстрее, чем в листьях афильных растений. Более детальный анализ нуклеазной активности мы провели аналогичным методом в | модификации Сибирцева (Сибирцев, Рассказов, 2000). В листьях разного возраста как у нормальных растений, так и у растений «/-генотипа выявили четкие различия в

нуклеаз гороха.

А/А/-генотип а/а/-гвнотип

123456 123 456

а б

Рис. 18.

Л/А/-генотип а/а/гвнотип

1234567 123456

а б

Рис. 19.

активности щелочных и кислых ДНКаз (рис. 21). Кроме того, у этих двух типов растений с возрастом существенно изменялось соотношение кислых и щелочных ДНКаз.

Рис.20. Соотношение

Суммарная нуклеазная активность в листьях гороха с разным генотипом в процессе старения

Рис.20.

суммарных нуклеазных активностей в

настоящих листьях гороха и листьях а/ мутанта.

Рис.21. Соотношение «щелочных» и

«кислых» нуклеазных активностей в

настоящих листьях гороха, а - с А/генотипом. б - с я/генотипом. 1, 2, 3 - 4, 6, 9 целый лист

а Рис.21. б

При определении суммарной нуклеазной активности с использованием иного субстрата - ДНК лямбда-фага (рис. 22 и 23) получены результаты, хорошо согласующиеся с этими данными. Кроме того, этот подход дает возможность выявить некоторые особенности действия нуклеаз на ДНК в зависимости от статуса метилирования. При определении нуклеазной активности этим методом реакционная смесь содержала белковый экстракт (10 мкг белка), ДНК лямбда-фага и Трис-НС1-буфер, рН 7.5 или ацетатный буфер, рН 5.5. При необходимости в смесь вносили ЭДТА 0.1 мМ (для связывания ионов двухвалентных металлов Са+2, Мили 2п+2). На рис. 22 представлены электрофореграммы суммарных продуктов гидролиза ДНК лямбда-фага нуклеазами, выделенными из целых листьев гороха двух исследованных типов растений. Активность нуклеазы, гидролизующей ДНК лямбда-фага, возрастала по мере старения листьев. При этом отчетливо видно различие в изменении нуклеазной активности в зависимости от положения листа на стебле (его возраста) и морфологии листа (генотипа гороха). Суммарная нуклеазная активность в листьях нормальных растений и растений а/-генотипа различалась. У фрастений четвертый и шестой листья (наиболее старые) обладали примерно одинаковой суммарной нуклеазной активностью при действии на ДНК лямбда-фага, а у нормальных растений нуклеазная активность в этих листьях различалась. При использовании в качестве субстрата разных по статусу метилирования ДНК лямбда-фага различий по суммарной нуклеазной активности не выявили. По-видимому, для действия суммарных нуклеаз из листа гороха статус метилирования субстратной ДНК не имеет существенного значения и заметно не влияет на характер ее деградации (рис. 23).

На рис. 24 представлены результаты исследования влияния ионов двухвалентных металлов на нуклеазную активность листьев гороха. Белковые экстракты, в которых определяли нуклеазную активность, обрабатывали ЭДТА в концентрации 0.1 мМ в течение 45 мин, затем в реакционную смесь, содержавшую

фаговую ДНК, вносили ионы Са2+, М£2+ или в концентрации 1 мМ. Оказалось, что в деградации ДНК при ЗГК участвуют как "щелочные", так и "кислые" нуклеазы, причем их активность была различна как в листьях разного возраста, так и

в листьях растений разных генотипов.

Рис.23. Электрофореграмма в 0,7% агарозном геле продуктов гидролиза ДНК фага лямбда белковым экстрактом из растений листьев гороха. Чувствительность нуклеаз из листьев растений гороха к статусу метилирования субстратой ДНК фага лямбда - (а) неметилированная ДНК (dam, dem)', (6) - метилированная субстратная ДНК фага лямбда (dam, dem)*. Дорожки 1-3: ДНК фата лямбда обработаны экстрактом соответственно из 9, 6 и 4 настоящих листьев растений гороха Af генотипа. Дорожки 4-6: ДНК фага лямбда обработаны экстрактом соответственно из 9, 6 и 4 настоящих листьев растений гороха aif генотипа.

Л/Л/ а/а/ Л/4Г а/а/ Л/Л/ а/а/

Рис.22. Электрофореграмма в 0,7% агарозном геле продуктов гидролиза ДНК фага лямбда белковым экстрактом из листьев гороха. Динамика гидролиза ДНК фага лямбда (dam, dem)', время инкубации реакционной смеси (а) ] 5 мин, (б) 45 мин и (в) 3 ч. Дорожки 1-3: ДНК фага лямбда обработаны экстрактом соответственно из 9, 6 и 4 настоящих листьев растений гороха Af генотипа. Дорожки 4-6: ДНК фага лямбда обработаны экстрактом соответственно из 9, 6 и 4 настоящих листьев растений гороха af генотипа.

Рис.24. Влияние ионов двухвалентных металлов на суммарную нуклеазную активность из листьев гороха. В качестве субстрата была использована ДНК фага лямбда, время инкубации 4 часа, при 37°С. Разделение продуктов гидролиза проводили в 0,7% агарозном геле, а - Влияние ионов (гпС12 , 5 мМ). Дорожки 1 - 3 -продукты гидролиза ДНК фага лямбда нуклеазами из 9, 6 и 4 настоящих листьев растений гороха А/генотипа. Дорожки 4 -6 - продукты гидролиза ДНК фага лямбда нуклеазами из 9, 6 и 4 настоящих листьев растений гороха а/генотипа, б - Влияние ионов Са2+, (СаС]2, Гу^СЬ, 5 мМ). Дорожки 1 -3 - продукты гидролиза ДНК фага лямбда нуыеазами из 9, 6 и 4 настоящих листьев гороха А/ генотипа. Дорожки 4-6 -продукты гидролиза ДНК 9, 6 и 4 настоящих листьев растений гороха а/генотипа.

6.3. Множественность типов нуклеазной активности в стареющих листьях

гороха

В стареющих листьях растений гороха двух генотипов обнаружено несколько белков, обладающих нуклеазной активностью (рис. 25). В целом, набор выявленных нами нуклеаз в листьях растений А/- и а/-генотипов примерно одинаков:

AfAf afaf AfAf afaf

1 2 3 4 5 6 123 456

молекулярная масса белков, обладающих нуклеазной активностью и индуцирующихся при естественном старении листьев, составляла 42, 37, 34, 26 и 21 кД. Вместе с тем, набор нуклеаз и их активность в разных частях листа различны и по-разному изменяются при его старении. В пластинчатых компонентах нормального листа максимальная активность нуклеаз ассоциирована с белками 37 и 26 кД (рис. 25а). Векторы изменения нуклеазной активности у обнаруженных нуклеаз четко различались: на фоне стабильной активности нуклеазы 26 кД по мере старения наблюдалось прогрессивное возрастание активности нуклеазы 37 кД и одновременное снижение активности нуклеаз 42, 34 и 21 кД. Причем скорость инактивации разных нуклеаз в листе различна - нуклеаза 42 кД функционировала в "молодом" 9-м листе и уже не обнаруживалась в 6-м листе, тогда как активность нуклеаз 34 и 21 кД монотонно убывала по мере старения листьев. В усах нормальных растений по мере старения также наблюдали увеличение активности нуклеазы 37 кД, активность нуклеазы 26 кД была более или менее постоянна, а уровни активности нуклеаз 34 и 21 кД были существенно ниже, чем в листочках и прилистниках. Нуклеазу 42 кД в усах нормальных растений не выявили.

пластинчатые компоненты

Рис.25. Определение нуклеазной активности г'я-^е/ в экстрактах из пластинчатых компонентов и усов настоящих листьев растений гороха А/- и а/- генотипов. рН=7,0. а - нуклеазные активности из листьев гороха нормального (А/-) генотипа. Дорожки 1 - 3 нуклеазные активности из усиков 4, 6 и 9 листа; дорожки 4-6 нуклеазные активности из прилистников и листочков в 4, 6 и 9 листа, б - нуклеазные активности из листьев а/мутантов. Дорожки 1 - 3 нуклеазные активности из усиков 4, 6 и 9 листа; дорожки 4 - 6 нуклеазные активности из прилистников из 4, 6 и 9 листа.

В листьях а/-мутанта также наблюдались изменение набора и активности различных нуклеаз, и в общих чертах это аналогично изменениям, происходящим в компонентах листа гороха нормального типа (рис. 256). В прилистниках у мутантной формы гороха также преобладали нуклеазы 37 и 26 кД, причем активность нуклеазы 37 кД увеличивалась по мере старения прилистников, а активность нуклеазы 26 кД оставалась практически неизменной. Так же, как и в пластинке нормальных листьев, активность нуклеаз 34 и 21 кД при старении уменьшалась. Активность нуклеазы 42 кД не была обнаружена ни в прилистниках, ни в усах растений афильного типа. В то же время, в усах а/-мутанта с возрастом на фоне увеличения активности нуклеазы 37 кД более явно была выражена активность нуклеаз 34 и 21 кД, в молодых листьях преобладала нуклеаза 21 кД, а в старом листе этой активности не обнаружили (рис. 25 б).

С целью выявления оптимума рН обнаруженной активности разных нуклеаз гели инкубировали при рН 7.5, 6.8 и 5.5. Максимум активности большинства нуклеаз наблюдали при рН 6.8-7.5. Однако, инкубируя гели при рН 5.5, выявили единственную нуклеазу с мол. массой близкой к 30 кД, фермент может быть отнесен к "кислым" нуклеазам. Причем эта нуклеаза обнаруживалась в усах гороха обоих типов и в прилистниках у афильной формы. В пластинках нормальных листьев ее активность не выявили.

Белковый комплекс с мол. массой более 100 кД, который обладает нуклеазной активностью был обнаружен в усах гороха. Он отличается лабильностью и проявлялся лишь в препаратах, взятых непосредственно после экстракции (рис. 26).

Рис. 26. Нуклеазная активность с мол. м. около 100 кД, препарат из усов растений гороха

ВЫВОДЫ

1. Показано, что ассоциированная с запрограммированной гибелью клеток (ЗГК) фрагментация ДНК в клетках стареющего колеоптиля этиолированных проростков пшеницы стимулируется этрелом (источник этилена) и салицилатом натрия, а препараты «эпин» и «циркон» несколько замедляют этот процесс.

2. При выращивании на свету у проростков пшеницы (в отличие от этиолированных) ЗГК наступает позже, чем в темноте. Антиоксидант ВНТ не влияет на рост и развитие и заметно не ингибирует образование активных форм кислорода. Системы регуляции уровня активных форм кислорода на свету более эффективны, чем при этиоляции.

3. Показано, что старение разных органов у растений пшеницы и гороха сопровождается деградацией (фрагментацией) яДНК и параллельным заметным увеличением ДНК-азной активности. В листьях растений гороха нормального (А/А/) генотипа возрастная деградация ДНК происходит раньше, чем у растений афильного (а/а/) генотипа. С возрастом изменяется соотношение «щелочных» и «кислых» нуклеаз.

4. Выявлено 7 белков с нуклеазной активностью, функционирующих в колеоптиле и первом листе проростков пшеницы в одно и то же время на различных этапах развития. В первом листе и колеоптиле проростков пшеницы и листьях гороха обнаружены Са2+, Mg2+ и Тп2+ - зависимые ДНК-азные активности. Их набор изменяется при старении.

5. В листе и колеоптиле проростков пшеницы выявлена клеточная (органная) и субклеточная разнокачественность набора ДНК-аз. Установлено, что активность этих нуклеаз ингибируется ЭДТА, а Ca2+/Mg2+ - зависимые нуклеазы подавляются ионами Хп2+. Показано, что Ca2+/Mg2+ - зависимые нуклеазные активности проростков пшеницы чувствительны к статусу метилирования субстратных ДНК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ванюшин Б.Ф., Шорнинг Б.Ю., Середина A.B.. Александрушкина Н.И. Влияние фитогормонов и 5-азацитидина на апоптоз у этиолированных проростков пшеницы. // Физиология растений. - 2002. - Т. 49, № 4. - С. 558-564.

2. Александрушкина Н.И., Замятнина В.А., Бакеева JI.E., Середина A.B., Смирнова Е.Г., Ягужинский JI.C., Ванюшин Б.Ф. Апоптоз у проростков пшеницы при нормальном световом дне. // Биохимия. - 2004. - Т. 69, № 3. - С. 356-366.

3. Александрушкина Н.И., Коф Э.М., Середина A.B.. Борзов A.A., Ванюшин Б.Ф. Связанные со старением деградация ДНК и эндонуклеазная активность в листьях гороха нормального и афильного генотипов. // Физиология растений. - 2008.-Т.55, № 1.-С. 27-36.

4. Александрушкина Н.И., Середина A.B.. Ванюшин Б.Ф. Активность эндонуклеаз в колеоптиле и первом листе развивающихся этиолированных проростков пшеницы. // Физиология растений. - 2009. Т. 56, № 2, - С. 170-180.

5. Александрушкина Н.И., Середина A.B.. Федореева Л.И., Замятнина В.А., Бакеева Л.Е., Смирнова Е.Г., Ягужинский Л.С., Ванюшин Б.Ф. Антиоксиданты -регуляторы роста, развития и клеточной дифференцировки растений. - Тез. докл. 6-ой Междунар. конф. «Регуляторы роста и развития растений в биотехнологиях», 2628 июня, Москва, 2001, М.: Изд-во МСХА, С.78.

6. Ванюшин Б.Ф., Александрушкина Н.И., Бакеева Л.Е., Замятнина В.А., Середина A.B., Смирнова Е.Г., Ягужинский Л.С. Активные формы кислорода -сигнальная система регуляции апоптоза, клеточной дифференцировки, роста и развития растений. Матер. Междунар. конф. «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», 16-18 июня 2003, Пущино, С. 288-291.

7. Коф Э.М., Александрушкина Н.И., Середина A.B.. Борзов A.A., Ванюшин Б.Ф. Деградация ДНК, эндонуклеазные активности и содержание АБК, связанные со старением листьев гороха дикого и афильного генотипов. Тез. докл. конф. «Физиология растений -фундаментальная основа современной фитобиотехнологии». 2-6 октября 2006, Ростов-на-Дону.

8. Середина A.B.. Александрушкина Н.И., Коф Э.М., Борзов A.A., Кудряшова И.Б, Харченко П.Н., Ванюшин Б.Ф. Нуклеазные активности и фрагментация ДНК при старении листьев гороха нормального и афильного генотипов. Матер. Междунар. конф. «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Сыктывкар, 2007. С.213-214.

9. Коф Э.М., Александрушкина Н.ИГ, Борзов A.A., Середина A.B.. Ванюшин Б.Ф., Карягин В.В., Калиберная З.В. Уровень фитогормонов, деградация ДНК и эндонуклеазные активности при старении листьев гороха Pisum sativum L. нормального и афильного типов. Матер, симпозиума «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза». Москва, 2007. С.94.

Ю.Коф Э.М., Александрушкина Н.И., Борзов A.A., Середина A.B.. Ванюшин Б.Ф., Карягин В.В., Калиберная З.В. Содержание фитогормонов, нуклеазные активности и деградация ДНК при старении листьев гороха Pisum sativum L. дикого и афильного генотипов. Тез. докл. 7-ой междунар. науч.-практ. конф. «Нетрадиционные и редкие растения, природные соединения и перспективы их использования». 18 - 22 июня Пущино, 2007.

Отпечатано с готового оригинап-макета

Формат 60х84'/|б. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ 257.

Издательство РГАУ - МСХА имени К.А.Тимирязева 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 44

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Середина, Анна Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Запрограммированная клеточная гибель.

1.1. Типы запрограммированной клеточной гибели у животных.

1.1.1. Апоптоз и апоптозоподобная ЗГК.

1.1.2. Аутофагия.

1.1.3. Некроз.

1.2. Запрограммированная гибель клеток у растений.

1.2.1. Развитие растений и запрограммированная гибель клеток.

1.2.1.1. Дегенерация отдельных (особых) клеток.

1.2.1.2. Формирование генеративных органов (цветок).

1.2.1.3. Развитие пыльцевого зерна у голосеменных.

1.2.1.4. Прорастание пыльцевой трубки.

1.2.1.5. Формообразование (лист).

1.2.1.6. Формирование проводящих путей.

1.2.1.7. Гибель клеток корня.

1.2.2. Запрограммированная гибель клеток в ответ на биогенные и абиогенные стрессы.

1.2.2.1. Клеточная гибель при взаимодействии с патогеном.

1.2.2.2. Клеточная гибель в ответ на абиогенные факторы и повреждения.

2. Гибель клеток, ассоциированная со старением.

2.1. Особенности запрограммированной клеточной гибели при старении.

2.2. Физиологические особенности старения.

2.3. Сигналы, регулирующие старение.

2.3.1. Возраст.

2.3.2. Репродуктивный рост.

2.3.3. Сахара.

2.3.4. Оксид азота (NO).

2.3.5. Фитогормоны.

- цитокинины.

- этилен.

- жасмоновая кислота.

- брассиностероиды.

- салициловая кислота.

- абсцизовая кислота.

- ауксин.

2.3.6. Стрессовые воздействия.

3. Молекулярные механизмы запрограммированной клеточной гибели.

3.1. Окислительный стресс, активные формы кислорода.

3.1.1. Действие активных форм кислорода (ROS).

3.1.2. Антиоксидантная система.

3.1.3. Свободные радикалы и старение.

3.2. Нуклеазы, участвующие в запрограммированной клеточной гибели.

3.2.1. Нуклеазы, участвующие в ЗГК при развитии растений.

3.2.2. Нуклеазы, участвующие в ЗГК при старении.

И. ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Объекты исследования. Выращивание растений.

Выделение ДНК.

Электрофорез в 1,5% агарозном геле.

Измерение АФК.

Получение суммарных белковых экстрактов.

Определение содержания белка в анализируемых клеточных экстрактах по методу Бредфорда.

Выделение ядер.

Диализ.

Определение нуклеазной активности в растворе.

Определение нуклеазной активности в агарозном геле.

Определение нуклеазной активности в полиакриламидном геле.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

2. Реализация ЗГК у проростков пшеницы при нормальном световом

3. Влияние антиоксидантаВНТ при нормальном световом дне на ЗГК проростков пшеницы.

4. Образование проростками активных форм кислорода.

Нуклеазы, определяющие деградацию ДНК в ЗГК при старении

5. Нуклеазы, участвующие в ЗГК при старении проростков пшеницы.

5.1. Изменение нуклеазной активности в ходе развития колеоптиля и первого листа проростков пшеницы.

5.2. Множественность нуклеазных активностей в развивающихся колеоптиле и листе проростков пшеницы.

6. Нуклеазы, участвующие в ЗГК при старении растений гороха.

6.1. Степень деградации ДНК, выделенной из листьев растений гороха разного возраста.

6.2. Нуклеазная активность в стареющих листьях гороха.

6.3. Множественность типов нуклеазной активности в стареющих листьях гороха.

Обсуждение результатов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Запрограммированная гибель клеток и эндонуклеазные активности у растений пшеницы и гороха"

Запрограммированная гибель клеток (ЗГК) у растений, как и у животных, является обязательным процессом на разных этапах онтогенеза. У животных выделяют три типа гибели клеток, отличающиеся морфологически: апоптоз, аутофагия и некроз. Термин «ЗГК» широко используется для описания процессов апоптоза и аутофагии, тогда как «некроз» в основном характеризуется как хаотический и неконтролируемый тип клеточной гибели. Что касается растений, то для описания процессов клеточной смерти в большинстве случаев употребляется термин «ЗГК». В настоящее время в литературе описано множество моделей развития в различных системах (культура клеток, ткани, органы, целый организм) и становится очевидным, что существуют определенные отличия в клеточной гибели у животных и растений. У растений имеется несколько типов ЗГК, каждый из которых, вероятно, имеет свои регуляторные механизмы и морфологические особенности. Без ЗГК невозможно нормальное развитие растений (Ванюшин, 2001; Vanyushin et al., 2004). Старение листа является одним из типов ЗГК и имеет отличия от других видов ЗГК (van Doom and Woltering, 2004). Во-первых, старение листа происходит на уровне органа. Во-вторых, скорость гибели клеток при старении листа ниже, чем при других типах ЗГК. В-третьих, биологическая функция старения, по-видимому, заключается в основном в оптимальной реутилизации накопленных питательных веществ за период фотосинтеза и транспорте этих веществ в другие органы растения.

На процесс запрограммированной клеточной гибели влияет множество факторов как внешних, так и внутренних. В первую очередь, начало ЗГК определяется возрастом, репродуктивными и физиологическими процессами. Кроме того, важную роль играет гормональный баланс, а также уровень активных форм кислорода. Неблагоприятные факторы окружающей среды могут индуцировать ЗГК. Понимание механизмов и путей регуляции клеточной гибели имеет важное фундаментальное значение для расшифровки механизмов роста и развития растений.

Одним из маркеров процесса ЗГК является деградация ДНК.

Деградация нуклеиновых кислот есть составная часть старения листьев, она избирательна и обеспечивает дифференциальный оборот индивидуальных мРНК, тРНК или рРНК и их компонентов на протяжении всего процесса старения, а на завершающих стадиях старения листа она носит массированный характер, приводя к разрушению основной массы как РНК, так и ДНК (Farkas, 1982; Kerr et al., 1972; Fukuda and Komamine, 1980). Однако, все еще недостаточно полно изучены особенности и специфические функции ферментов, осуществляющих гидролиз нуклеиновых кислот при старении листа, также не известны механизмы, которые обеспечивают контролируемый и упорядоченный обмен определенных видов нуклеиновых кислот.

Проростки пшеницы оказались удобной моделью для изучения ЗГК при естественном и индуцированном темнотой старении листа и колеоптиля. На этой модели были изучены различные аспекты процесса ЗГК при старении этих органов: ультраструктурная организация, влияние фитогормонов и антиоксидантов, изменение протеолитической активности, а также изменение суммарной нуклеазной активности (Vanyushin et al., 2004). Вторым объектом нашего исследования являлись растения гороха нормального и афильного генотипов как представители класса двудольных.

Данная работа посвящена изучению влияния фитогормонов, некоторых регуляторов роста и света на деградацию ДНК в ходе старения, а также детальному анализу группы нуклеазных активностей, участвующих в реализации программы ЗГК в первом листе и колеоптиле пшеницы, а также у растений гороха нормального и афильного типа.

Заключение Диссертация по теме "Физиология и биохимия растений", Середина, Анна Владимировна

выводы

3. Показано, что старение разных органов у растений пшеницы и гороха сопровождается деградацией (фрагментацией) яДНК и заметным увеличением ДНК-азной активности. В листьях растений гороха нормального (AfAf) генотипа возрастная деградация ДНК происходит раньше, чем у растений афильного (afaf) генотипа. Степень деградации ДНК коррелирует с увеличением суммарной нуклеазной активности с возрастом. С возрастом изменяется соотношение «щелочных» и «кислых» нуклеаз.

4. Выявлена множественность нуклеазных активностей, функционирующих в колеоптиле и первом листе проростков пшеницы в одно и то же время на различных этапах развития. В первом листе и колеоптиле проростков пшеницы и листьях гороха обнаружены Са2+'

-Л I 04

Mg и Zn - зависимые ДНК-азные активности. Их набор изменяется при старении.

5. В листе и колеоптиле проростков пшеницы выявлена клеточная (органная) и субклеточная разнокачественность набора ДНК-аз. Установлено, что активность этих нуклеаз ингибируется ЭДТА, а Ca2+/Mg2+ - зависимые нуклеазы подавляются ионами Zn2+. Показано, что Ca2+/Mg2+ - зависимые нуклеазные активности проростков пшеницы чувствительны к статусу метилирования субстратных ДНК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Запрограммированная гибель клеток генетически заложена у многоклеточных организмов и наблюдается на всех стадиях онтогенеза. Реализация программы клеточной гибели определяется взаимодействием множества эндогенных и экзогенных факторов. Важными медиаторами этого процесса у растений являются фитогормоны и АФК. Регуляторы роста растений могут как стимулировать, так и замедлять процесс клеточной гибели. Так, этрел (продуцент этилена) и салицилат натрия ускоряют деградацию ДНК, ассоциированную с ЗГК, а иммуномодуляторы «эпин» и «циркон» замедляют этот процесс. Такой эффект может быть связан с изменением уровня активных форм кислорода (АФК), поскольку эпибрассинолид опосредованно влияет на активность и биосинтез ферментов окислительного цикла, а гидроксикоричные кислоты активируют антиоксидантную систему клетки. Действие салицилата натрия также может быть связано с изменением уровня АФК вследствие ингибирования активности каталазы, которая нейтрализует Н2С>2.

На реализацию программы клеточной гибели влияет свет. У проростков пшеницы, выращенных на свету, ЗГК наступает позже, чем у этиолированных. При этом гибель клеток в колеоптиле проростков пшеницы, выращенных и в условиях этиоляции, и на свету имеет признаки апоптоза и является запрограммированным элементом их раннего онтогенеза.

Антиоксидант ВНТ не влияет на рост и развитие и заметно не ингибирует образование активных форм кислорода выращенных на свету проростков (в отличие от этиолированных, у которых под действием ВНТ меняется морфология, происходят ультраструктурные изменения, ингибируется образование АФК и фрагментация ДНК). В проростках, выращенных при нормальном световом дне, функционирует система j регуляции уровня АФК, которая, с одной стороны, препятствует накоплению избытка О2, а с другой - не допускает снижения уровня АФК ниже критического для развития растения. Системы регуляции уровня активных форм кислорода на свету более эффективны, чем при этиоляции.

Реализация программы ЗГК при старении обеспечивается различными ферментативными системами, осуществляющими деструкцию клеточного содержимого. Поскольку доступность фосфора для растений ограничена, эффективная реутилизация ДНК и РНК является существенным элементом донорно-акцепторной системы растений. И исследование деградации ДНК при старении объясняет наш интерес к нуклеазным активностям, функционирующим в клетке при ЗГК старения.

У растений пшеницы и гороха старение листа/колеоптиля сопровождается деградацией яДНК и заметным увеличением ДНК-азной активности, причем степень деградации ДНК коррелирует с увеличением суммарной нуклеазной активности и связана с возрастом органа. Впервые показана множественность нуклеазных активностей, функционирующих в одно и то же время на различных этапах развития в колеоптиле и первом листе проростков пшеницы, как и в стареющих листьях гороха. У пшеницы обнаружено по крайней мере 7 белков, обладающих ДНК-азной активностью при рН=7,0, молекулярная масса которых варьирует от 16 до 80 кД, в листьях гороха деградацию ДНК осуществляют 5 нуклеазных активностей с молекулярной массой от 21 до 42 кД. С возрастом изменяется соотношение

2 j / о I 11 щелочных» (Са Mg - зависимых) и «кислых» (Zn" - зависимых) нуклеаз как у растений пшеницы, так и у растений гороха. Впервые установлено, что в листе и колеоптиле проростков пшеницы существует клеточная (органная) и субклеточная разнокачественность набора ДНК-аз, функционирующих в ходе ЗГК при старении. Большой самостоятельный интерес представляет впервые выявленная чувствительность Са Mg - зависимых нуклеазных активностей из проростков пшеницы к статусу метилирования субстратных ДНК.

Афильность, повышающая жизнеспособность растений при сохранении конечной продуктивности, приводит к изменению активности нуклеаз ЗГК старения, результатом чего является отсрочка старения.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Середина, Анна Владимировна, Москва

1. Александрушкина Н.И., Ванюшин Б.Ф. Эндонуклеазы и их участие в апоптозе растений. // Физиология растений. 2009. - Т.56. - С.323-339.

2. Ванюшин Б.Ф. Апоптоз у растений. // Успехи биологической химии. -2001. Т.41. - С.3-38.

3. Ванюшин Б.Ф., Шорнинг Б.Ю., Середина А.В., Александрушкина Н.И. Влияние фитогормонов и 5-азацитидина на апоптоз у этиолированных проростков пшеницы. // Физиология растений. 2002. - Т.49. - С.558-564.

4. Зубо Я.О., Ямбуренко М.В., Кравцов А.К., Кулаева О.Н., Кузнецов

5. B.В. Отделенные от растений листья ячменя как экспериментальная модель для изучения регуляции цитокинином транскрипции пластидных генов. // Физиология растений. 2009. - Т. 56. - С.609-618.

6. Кирнос М.Д., Александрушкина Н.И., Ванюшин Б.Ф. Апоптоз в клетках первого листа и колеоптиля проростков пшеницы: межнуклеосомная фрагментация генома и синтез тяжелых олигонуклеосомного размера фрагментов ДНК. // Биохимия. 1997. - Т.62. - С. 1008-1014.

7. Кирнос М.Д., Александрушкина Н.И., Шорнинг Б.Ю., Бубенщикова

8. C.Н., Ванюшин Б.Ф. (б) Суперпродукция «тяжелой» ДНК в неделящихся клетках стареющего колеоптиля проростков пшеницы при апоптозе. // Биохимия. 1997. - Т.62. - С.1348-1357.

9. Кирнос М.Д., Александрушкина Н.И., Шорнинг Б.Ю., Кудряшова

10. И.Б., Ванюшин Б.Ф. Межнуклеосомная фрагментация и синтез ДНК в проростках пшеницы. // Физиология растений. 1999. - Т.46. - С.48-57.

11. Коф Э.М., Виноградова И.А., Калиберная З.В., Чувашева Е.С, Кондыков И.В. Характеристика гормонального комплекса у генотипов гороха, различающихся по морфологии листа. // Физиология растений. -2002. Т.49. - С. 565-571.

12. Кулаева О.Н. Цитокинины, их структура и функция. М.: Наука, 1973.- 263 с.

13. Малеванная Н.Н., Быховская Н.В. Циркон новый фитопрепарат для сельского хозяйства, полученный на основе нетрадиционного растительного сырья. // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. -2001, №5.

14. Мокроносов А.Т. Взаимосвязь фотосинтеза и функций роста // Фотосинтез и продукционный процесс / Под ред. Ничипоровича А.А. М.: Наука, 1988. С. 109-121.

15. Сибирцев Ю.Т., Рассказов В.А. Влияние ионной силы на оптимум рН, специфичность и механизм действия кислой ДНКазы из зрелых яйцеклеток морского ежа Strongylocentrotus intermedius. // Биохимия. 2000. - Т.65. -С. 1121-1129.

16. Шорнинг Б.Ю., Полещук С.В., Горбатенко И.Ю., Ванюшин Б.Ф. Влияние антиоксидантов на рост и развитие растений. // Известия РАН, «Серия биологическая». 1999. - Т.26. - С.23-29.

17. Шорнинг Б.Ю., Смирнова Е.Г., Ягужинский Л.С.,Ванюшин Б.Ф. Необходимость образования супероксида для развития проростков пшеницы. // Биохимия. 2000. - Т.65. - С.1612-1617.

18. Федореева ЛИ, Смирнова Т.А., Коломийцева Г.Я., Ванюшин Б.Ф. Гистон Ш модулирует гидролиз ДНК эндонуклеазами WEN1 и WEN2 из колеоптилей пшеницы. // Биохимия. 2008. - Т. 73. - С. 1243-1251.

19. Федореева Л.И., Соболев Д.Е., Ванюшин Б.Ф. S-аденозил-Ь-метионинзависимая и чувствительная к статусу метилирования ДНК эндонуклеаза WEN2 из колеоптилей пшеницы. // Биохимия. 2008. - т.73. - С. 1243-1251.

20. Abreu М.Е. and Munne-Bosch S. Photo- and antioxidant protection and salicylic acid accumulation during post-anthesis leaf senescence in Salvia lanigera grown under Mediterranean climate. // Physiol Plant. 2007. - v. 131. - P.590-598

21. Ankarcrona M., Dypbukt J.M., Bonfoco E., Zhivotovsky В., Orrenius S., Lipton S., Nicotera P. Glutamate-induced neuronal death: a succession of necrosis or apoptosis depending on mitochondrial function. // Neuron. 1995. - v. 15. -P.961-973.

22. Archambault D.J., Li X., Foster K.R., Jack T.R. A screening test for the determination of ethylene sensitivity. // Environ Monit Assess. 2006. - v. 115. -P.509-530.

23. Aoyagi S., Sugiyama M., Fukuda H. BEN1 and ZEN1 cDNAs encoding SI-type DNases that are associated with programmed cell death in plants. // FEBS Letters. 1998. - v. 429. P. 134-138.

24. Asami Т., Nakano Т., Fujioka S. Plant brassinosteroid hormones. // Vitam Horm. 2005. - v.72. P.479-504.

25. Auclair C., Voisin E. In CRC Handbook of Methods for Oxygen Radical Research; Greenwald, R. A., Ed.; CRC Press, Inc.: Boca Raton, FL. 1987. - P. 123-132.

26. Aval'baev A. M., Bezrukova M. V., Shakirova F. M. Effect of brassinosteroids on the hormonal balance in wheat seedlings. // Doklady Biological Sciences. 2003. - v.391. - P.337-339.

27. Azad K., Ishikawa Т., Ishikawa Т., Sawa Y., Shibata H. Intracellular energy depletion triggers programmed cell death during petal senescence in tulip. // J. Exp. Bot. 2008. - v.59. - P.2085-2095.

28. Baron W.F., Pan C.Q., Spencer S.A., Ryan A.M., Lazarus R.A., Baker K.P. Cloning and characterization of an actin-resistant DNasel-like endonuclease secreted by macrophages. // Gene. 1998. - v.215. - P.291-301.

29. Barry M.A. and Eastman A. Identification of deoxyribonuclease II as an endonuclease involved in apoptosis. // Arch Biochem Biophys. 1993. - v.300. -P.440-450.

30. Bassham D.C., Laporte M., Marty F., Moriyasu Y., Ohsumi Y., Olsen L.J., Yoshimoto K. Autophagy in development and stress responses of plants. // Autophagy. 2006. - v.2. - P.2-11

31. Beers E.P. Programmed cell death during plant growth and development. // Cell Death Differ. 1997. - v.4. - P.649-661.

32. BeMiller J.N., Liu T.U. Y.S., Liu C.R., Pappelis A.J. Relationship of nuclease activity and synthesis to senescence of com (Zea mays L.) stalk pith, cob parenchyma and first developed leaf tissues. // Mech. Ageing. Dev. 1976. - v.5. -P.427-436.

33. Blank A. and McKeon T.A. Single-strand-preferring nuclease activity in wheat leaves is increased in senescence and is negatively photoregulated. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - v.86. - P.3169-3173.135

34. Blank A. and McKeon T.A. (a) Expression of three RNases during natural and dark-induced senescence of wheat leaves. // Plant Physiol. 1991. - v.97. -РД 409-1413.

35. Blank A. and McKeon T.A. (6) Three RNases in senescent and nonsenescent wheat leaves. // Plant Physiol. 1991. - v.97. - P. 1402-1408.

36. Bortner C.D., Oldenburg N.B., Cidlowski J.A. The role of DNA fragmentation in apoptosis. // Trends Cell Biol. 1995. - v.5. - P.21-26.

37. Bosch M. and Franklin-Tong V.E. Self-incompatibility in Papaver: signalling to trigger PCD in incompatible pollen. // J Exp Bot. 2008. - v.59. -P.481-490.

38. Boujrad H., Gubkina O., Robert N., Krantic S., Susin S.A. AIF-mediated programmed necrosis: a highly regulated way to die. // Cell Cycle. 2007. - v.6. -P.2612-2619.

39. Bradford M.M. A Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. 1976. - у.12. - P.248-254

40. Bredesen D.E. Key note lecture: toward a mechanistic taxonomy for cell death programs. // Stroke. 2007. - v.38. - P.652-660.

41. Broker L.E., Kruyt F.A., Giaccone G. Cell death independent of caspases: a review. // Clin Cancer Res. 2005. - v. 11. - P.3155-3162.

42. Buchanan-Wollaston V., Earl S., Harrison E., Mathas E., Navabpour S., Page Т., Pink D. The molecular analysis of leaf senescence—a genomics approach. // Plant Biotechnol J. 2003. - v.l. - P.3-22.

43. Calderon-Urrea A. and Dellaporta S.L. Cell death and cell protection genes determine the fate of pistils in maize. // Development. 1999. - v. 126. - P.435-441.

44. Casano L.M., Martin M., Sabater B. Sensitivity of superoxide dismutase transcript levels and activities to oxidative stress is lower in mature-senescent than in young barley leaves. // Plant Physiol. 1994. - v. 106. - P. 1033-1039.

45. Castillo M.C. and Leon J. Expression of the beta-oxidation gene 3-ketoacyl-CoA thiolase 2 (KAT2) is required for the timely onset of natural and dark-induced leaf senescence in Arabidopsis. // J Exp Bot. 2008. - v.59. -P.2171-2179.

46. Cao J, Jiang F, Sodmergen , Cui K. Time-course of programmed cell death during leaf senescence in Eucommia ulmoides. IIJ Plant Res. 2003. - v.l 16. - P.7-12.

47. Cheng Y.C., Hsueh С.С., Lu S.C., Liao Т.Н. Identification of three crucial histidine residues (His 115, His 132 and His297) in Porcine Deoxyribonuclease II. // Biochem. J. 2006. - v.398. - P.177-185.

48. Chichkova N.V., Galiullina R.A., Taliansky M.E., Vartapetian A.B. Tissue disruption activates a plant caspase-Iike protease with TATD cleavage specificity. // Plant Stress. 2008. - v.2. - P.89-95.

49. Clouse S.D. and Sasse J.M. Brassinosteroids-.essential regulators of plant growth and development. // Annu. Rew. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. -v.49. - P.427-451.

50. Counis M.F., Chaudun E., Arruti C., Oliver L., Sanwal M., Courtois Y., Torriglia A. Analysis of nuclear degradation during lens cell differentiation. // Cell Death Differ. 1998. - v.5. - P.251-261.

51. Counis M.F. and Torriglia A. DNases and apoptosis. // Biochem Cell Biol. -2000. -v.78. -P.405-414.

52. Counis M.F. and Torriglia A. Acid DNases and their interest among apoptotic endonucleases // Biochimie. 2006. - v.88. - P. 1851-1858.

53. Crafts-Brandner S.J. and Egli D.B. Sink removal and leaf senescence in soybean: cultivar effects. // Plant Physiol. 1987. - v.85. - P.662-666.

54. Dangl J.L., Dietrich R.A., Richberg M.H. Death don't have no mercy: cell death programs in plant-microbe interactions. // Plant Cell. 1996. - v.8. - P. 17931807.

55. Danon A., Delorme V., Mailhac N., Gallois P. Plant programmed cell death: a common way to die. // Plant Physiol.Biochem. 2000. - v.38. - P.647-655.

56. Dekkers B.J., Schuurmans J.A., Smeekens S.C. Interaction between sugar and abscisic acid signalling during early seedling development in Arabidopsis. // Plant Mol Biol. 2008. - v.67. - P. 151-167.

57. Desharnais P., Dupere-Minier G., Hamelin C., Devine P., Bernier J. Involvement of CD45 in DNA fragmentation in apoptosis induced by mitochondrial perturbing agents // Apoptosis. 2008. - v. 13. - P. 197-212.

58. Ding В., Haudenshield J.S., Willmitzer L., Lucas W.J. Correlation between arrested secondary plasmodesmal development and onset of accelerated leaf senescence in yeast acid invertase transgenic tobacco plants. // Plant J. 1993. -v.4. - P.179-189

59. Dickinson C.D., Altabella Т., Chrispeels MJ. Slow-growth phenotype of transgenic tomato expressing apoplastic invertase. // Plant Physiol. 1991. - v.95. -P.420-425.

60. Dominguez F., Moreno J., Cejudo F.J. A gibberellin-induced nuclease is localized in the nucleus of wheat aleurone cell undergoing programmed cell death // J. Biol. Chem. 2004. - v. 19. - P.l 1530-11536.

61. Drew M.C., He C.J., Morgan P.W. Programmed cell death and aerenchyma formation in roots. // Trends Plant Sci. 2000. - v.5. - P. 123-127.

62. Dunigan D.D., Madlener J.C. Serine/threonine protein phosphatase is required for tobacco mosaic virus-mediated programmed cell death. // Virology. -1995.-v.207.-P.460-466.

63. Dyrkheeva N.S., Khodyreva S.N., Lavrik O.I. Multifunctional human apurinic/apyrimidinic endonuclease 1: the role of additional functions. // Mol Biol (Mosk). 2007. - v.41. - P.450-466.

64. Ellis C.M., Nagpal P., Young J.C., Hagen G., Guilfoyle T.J., Reed J.W. AUXIN RESPONSE FACTOR 1 and AUXIN RESPONSE FACTOR2 regulate senescence and floral organ abscission in Arabidopsis thaliana. // Development. -2005. -v. 132. P.4563-4574.

65. Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. //Nature. 1998. - v.391. - P.43-50.

66. Evans C.J., Aguilera R.J. DNase II: genes, enzymes and function. // Gene. -2003. v.322. -P.l-15.

67. Fan Z., Beresford P J., Oh D.Y., Zhang D., Lieberman J. Tumor suppressor NM23-H1 is a granzyme A-activated DNase during CTL-mediated apoptosis and the nucleosome assembly protein SET is its inhibitor. // Cell. 2003. - v. 112. - P. 659-672.

68. Farkas G.L. Ribonucleases and Ribonucleic Acid Breakdown. // In D.Parthier, D.Boulter, eds. Encyclopedia of plant physiology, New Series. Springer-Verlag New York. 1982. - V.14B. - P.291-309

69. Fath A., Bethke P.C., Jones R.L. Barley aleurone cell death is not apoptotic: characterization of nuclease activities and DNA degradation. // Plant J. -1999. v.20. - P.305-315.

70. Fath A., Bethke P.C., Lonsdale J., Meza-Romero R., Jones R. Programmed cell death in cereal aleurone. // Plant Mol. Biol. 2000. - v.44. - P.255-266.

71. Fedoreeva L.I., Sobolev D.E., Vanyushin B.F. Wheat endonuclease WEN1 dependent on S-adenosyl-L-methionine and sensitive to DNA methylation status. // Epigenetics. 2007. - v.2. - P.50-53.

72. Fischer H., Eckhart L., Mildner M., Jaeger K., Buchberger M., Ghannadan M., Tschachler E. DNase 1L2 degrades nuclear DNA during corneocyte formation. // J. Investigative Dermatology. 2007. - v. 127. - P.24-30.

73. Franklin D.J. and Berges J.A. Mortality in cultures of the dinoflagellate Amphidinium carterae during culture senescence and darkness. // Proc Biol Sci. -2004. v.271. - P.2099-2107.

74. Fukuda H. and Komamine A. Establishment of an experimental system for the study of tracheary element differentiation from single cells isolated from the mesophyll of Zinnia elegans. // Plant Physiol. 1980. - v.65. - P.57-60

75. Gaido M.L. and Cidlowski J.A. Identification, purification, and characterization of a calcium-dependent endonuclease (NUC 18) from apoptotic rat thymocytes. NUC 18 is not histone H2B. // J. Biol. Chem. 1991. - v.266. -P.18580-18585.

76. Gan S. and Amasino R.M. Inhibition of leaf senescence by autoregulated production of cytokinin.// Science. 1995. - v.270. - P.1986-1988.

77. Gao C., Xing D., Li L., Zhang L. Implication of reactive oxygen species and mitochondrial dysfunction in the early stages of plant programmed cell death induced by ultraviolet-C overexposure. // Planta. 2008. - v.221. - V.155-161.

78. Garcia-Heredia J.M., Hervas M., De la Rosa M.A., Navarro J.A. Acetylsalicylic acid induces programmed cell death in Arabidopsis cell cultures. // Planta. 2008. - v.228. - P.89-97.

79. Gilchrist D.G. Programmed cell death in plant disease: the purpose and promise of cellular suicide. // Annu Rev Phytopathol. 1998. - v.36. - P.393-414.

80. Gladish D.K., Xu J., Niki T. Apoptosis-like programmed cell death occurs in procambium and ground meristem of pea (Pisum sativum) root tips exposed to sudden flooding. // Ann Bot (Lond). 2006. - v.97.- P.895-902.

81. Glauser G., Grata E., Dubugnon L., Rudaz S., Farmer E.E., Wolfender J.L. Spatial and temporal dynamics of Jasmonate synthesis and accumulation in Arabidopsis in response to wounding. // J Biol Chem. 2008. - v.283. - P. 1640016407

82. Gozuacik D. and Kimchi A. Autophagy and cell death. // Curr Top Dev Biol. 2007. - v.78. - P.217-245.

83. Green D.R. and Kroemer G. Pharmacological manipulation of cell death: clinical applications in sight? // J Clin Invest. 2005. - v. 115. - P.2610-2617

84. Gregersen P.L. and Holm P.B. Transcriptome analysis of senescence in the flag leaf of wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Biotechnol. J. 2007. - v.5. -P. 192-206.

85. Gunawardena A.H. Programmed cell death and tissue remodelling in plants. // J Exp Bot. 2008. - v.59. - P.445-451.

86. Gunawardena A.H., Pearce D.M., Jackson M.B., Hawes C.R., Evans D.E. Characterisation of programmed cell death during aerenchyma formation induced by ethylene or hypoxia in roots of maize (Zea mays L.). // Planta. 2001. - v.212. -P.205-214

87. Hammargren J., Salinas Т., Marechal-Drouard L., Knorpp C. The pea mitochondrial nucleoside diphosphate kinase cleaves DNA and RNA. // FEBS Lett. 2007. - v.581. - P.3507-3511.

88. Hanus J., Kalinowska-Herok M., Widlak P. The major apoptotic endonuclease DFF40/CAD is a deoxyribose-specific and double-strand-specific enzyme. // Apoptosis. 2008.- v.13. - P.377-382.

89. He P., Osaki M., Takebe M., Shinano Т., Wasaki J. Endogenous hormones and expression of senescence-related genes in different senescent types of maize. // J Exp Bot. -2005.-v.56. -P.l 117-1128.

90. He R., Drury G.E., Rotari V.I., Gordon A., Wilier M., Farzaneh Т., Woltering E.J., Gallois P. Metacaspase-8 modulates programmed cell death induced by ultraviolet light and H202 in Arabidopsis. // J Biol Chem. 2008. -v.283. - P.774-83.

91. He X. and Kermode A.R. Nuclease activities and DNA fragmentation during programmed cell death of megagametophyte cells of white spruce (Picea glauca) seeds // Plant Mol. Biol. 2003. - v.51. - P.509-521.

92. He Y.H., Fukushige H., Hildebrand D.F., Gun S.S. Evidence supporting a role of jasmonic acid in Arabidopsis leaf senescence. // Plant Physiol. 2002. -v.128. - P.876-884.

93. He Y.H., Xu R., Zhao Y. Enhancement of senescence by ep/brassinolide in leaves of mung bean seedling. // Acta Phytophysiol. Sinica. 1996. - v.22. - P.5862.

94. Hensel L.L., Grbic V., Baumgarten D.A., Bleecker A.B. Developmental and age-related processes that influence the longevity and senescence of photosynthetic tissues in Arabidopsis. // Plant Cell. 1993. - v.5. - P.553-564.

95. Hong S.B., Sexton R., Tucker M.L. Analysis of gene promoters for two tomato polygalacturonases expressed in abscission zones and the stigma. // Plant Physiol. 2000. - v.123. - P.869-881.

96. Huang D., Wu W., Abrams S.R., Cutler A.J. The relationship of drought-related gene expression in Arabidopsis thaliana to hormonal and environmental factors. // Exp Bot. 2008. - v.59. - P.2991-3007.

97. Hughes Jr. F.M., Evans-Storms R.B., Cidlowski J.A. Evidence that noncaspase proteases are required for chromatin degradation during apoptosis. // Cell Death Differ. 1998. - v.5. - P.1017-1027.

98. Jiang C.Z., Rodermel S.R., Shibles R.M. Photosynthesis, Rubisco activity and amount, and their regulation by transcription in senescing soybean leaves. // Plant Physiol. 1993. - v.101. - P.105-112.

99. Jing H.C., Schippers J.H., Hille J., Dijkwel P.P. Ethylene-induced leaf senescence depends on age-related changes and OLD genes in Arabidopsis. // J Exp Bot. 2005. - v.56. - P.2915-2923.

100. Jones A.M. Programmed cell death in development and defence. // Plant Physiol. 2001. - v. 125. - P.94-97

101. Jung C., Lyou S.H., Yeu S., Kim M.A., Rhee S., Kim M., Lee J.S., Choi Y.D., Cheong J.J. Microarray-based screening of jasmonate-responsive genes in Arabidopsis thaliana. // Plant Cell Rep. 2007. - v.26. - P. 1053-1063.

102. Kagedal K., Zhao M., Svensson I., Brunk U.T. Sphingosine-induced apoptosis is dependent on lysosomal proteases. // Biochem J. 2001. - v.359. -P.335-343

103. Kalinowska-Herok M., Wudlak P. High mobility group proteins stimulate DNA cleavage by apoptotic endonuclease DFF40/CAD due to HMW-box interactions with DNA // Acta Biochim. Pol. 2008. - v.55. - P.21-26.

104. Kawai M. and Uchimiya Y. Coleoptile senescence in rice (Oryza sativa L.). // Annals of Botany. 2000. - v.86. - P.405-414.

105. Kawane K., Fukuyama H., Kondoh G., Takeda J., Ohsawa Y., Uchiyama Y., Nagata S. Requirement of DNase II for definitive erythropoiesis in the mouse . fetal liver. // Science. 2001. - v.292. - P. 1546-1549.

106. Kawane K., Fukuyama H.,Yoshida H., Nagase,Y. Ohsawa H., Uchiyama V., Okada K., Iida Т., Nagata S. Impaired thymic development in mouse embryosdeficient in apoptotic DNA degradation. // Nat. Immunol. 2003. - v.4. - P. 138144.

107. Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics. // Br. J Cancer. -1972.-v.26. -P.239-257.

108. Khan R.I. and Choudhuri M.A. Influence of reproductive organs on plant senescence in rise and wheat. // Biol. Plant. 1992. - v.34. - P.241-251.

109. Kim C.Y., Bove J., Assmann S.M. Overexpression of wound-responsive RNA-binding proteins induces leaf senescence and hypersensitive-like cell death. //New Phytol. 2008. - v. 180. - P.57-70.

110. Kim D.O. and Lee C.Y. Comprehensive study on vitamin С equivalent antioxidant capacity (VCEAC) of various polyphenolics in scavenging a free radical and its structural relationship. // Crit Rev Food Sci Nutr. 2004. - v.44. -P.253-273

111. Kolodziejek I., Koziol-Lipinska J., Waleza M., Korczynski J., Mostowska A. Aspects of programmed cell death during early senescence of barley leaves: possible role of nitric oxide. // Protoplasma. 2007. - v.232. - P.97-108.

112. Krieser R.J., MacLea K.S., Park J.P., Eastman A. The cloning, genomic structure, localization, and expression of human deoxyribonuclease II beta. // Gene. 2001. - v.269. - P.205-216.

113. Krishna P. Brassinosteroid-mediated stress responses. // J Plant Growth Regul. 2003. - v.22. - P.289-297.

114. Z.G., Zhang C.M., Zha Z.H. LDFF, the large molecular weight DNA fragmentation factor, is responsible for the large molecular weight DNA degradation during apoptosis in Xenopus egg extracts // Cell Research. 2004. -v.14. - pp.134-140.

115. Marchetti S., Zaina G., Chiaba C., Pappalardo C., Pitotti A. Isolation and characterization of an endonuclease synthesized by barley (Hordeum vulgare L.) uninucliate microspores // Planta. 2001. - v.213. - P. 199-206.

116. Masclaux C., Valadier M.H., Brugiere N., Morot-Gaudry J.F., Hirel B. Characterization of the sink/source transition in tobacco (Nicotiana tabacum L.) shoots in relation to nitrogen management and leaf senescence. // Planta. 2000. -v.211. - P.510-518.

117. McCabe P.F., Levine A., Meijer P.J., Tapon N.A., Pennell R.I. A programmed cell death pathway activated in carrot cells cultured at low cell density. // The Plant Journal. 1997. - v. 12. - P.267-280

118. McConkey D.J. and Orrenius S. The role of calcium in the regulation of apoptosis. // J Leukoc Biol. 1996. - v.59. - P.775-783.

119. Mcllory D., Tanaka M., Sakahira H., Fukuyama H., Suzuki M., Yamamura K., Ohsawa Y., Uchiyama Y., Nagata S. An auxiliary mode of apoptotic DNA fragmentation provided by phagocytes // Genes Dev. 2000. - v. 14. - P.549-558.

120. Mergemann H. and Sauter M. Ethylene induces epidermal cell death at the site of adventitious root emergence in rice. // Plant Physiol. 2000. - v.l24. -P.609-614

121. Miller A., Schlagnhaufer C., Spalding M., Rodermel S. Carbohydrate regulation of leaf development: Prolongation of leaf senescence in Rubisco antisense mutants of tobacco. // Photosynth Res. 2000. - v.63. - P. 1-8.

122. Mishina tE., Lamb C., Zeier J. Expression of a nitric oxide degrading enzyme induces a senescence program in Arabidopsis. // Plant Cell Environ. -2007. v.30. - P.39-52.

123. Mittler R. and Lam E. Identification, characterization, and purification of a tobacco endonuclease activity induced upon hypersensitive response cell death. // The Plant Cell. 1995. - v.7. - P.1951-1962.

124. Mittler R. and Lam E. Characterization of nuclease activities and DNA fragmentation induced upon hypersensitive response cell death and mechanical stress. // Plant Mol Biol. 1997. - v.34. - P.209-21.

125. Mittler R., Simon L., Lam E. Pathogen-induced programmed cell death in tobacco. // J Cell Sci. 1997. - v.l 10. - P.1333-1344.

126. Moore В., Zhou L., Rolland F., Hall Q., Cheng W.H., Liu Y.X., Hwang L, Jones Т., Sheen J. Role of the Arabidopsis glucose sensor HXK1 in nutrient, light, and hormonal signaling. // Science. 2003. - v.300. - P.332-336.

127. Morris K., Mackerness S.A., Page Т., John C.F., Murphy A.M., Carr J.P., Buchanan-Wollaston V. Salicylic acid has a role in regulating gene expression during senescence. // Plant J. 2000. - v.23. - P.677-685.150

128. Mukae N., Enari M., Sakahira H., Fukuda Y., Inazawa J., Toh H., Nagata S. Molecular cloning and characterization of human caspase-activated DNase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - v.95. - P.9123-9128.

129. Munne-Bosch S. and Alegre L. Plant aging increases oxidative stress in chloroplasts. // Planta. 2002. - v.214. - P.608-615.

130. Munne-Bosch S. and Penuelas J. Photo- and antioxidative protection, and a role for salicylic acid during drought and recovery in field-grown Phillyrea angustifolia plants. // Planta. 2003. - v.217. - P.758-766.

131. Nagata S. Apoptosis by death factor. // Cell. 1997. - v.88. - P.355-365.

132. Nagata S. DNA degradation in development and programmed cell death. // Annu. Rev. Immunol. 2005. - v.23. - P.853-875.

133. Napirei M., Wulf S., Eulitz D., Mannherz H.G., Kloeckl T. Comparative characterization of rat deoxyribonuclease 1 (Dnasel) find murine deoxyribonuclease l-like 3 (DnaselB). // Biochem J. 2005. - v.389. - P.355-364.

134. Naseem I., Hadi S.M. Single-strand-specific nuclease of pea seeds: glycoprotein nature and associated nucleotidase activity. // Arch Biochem Biophys. 1987.-v.255.-P.437-445.

135. Neill S., Barros R., Bright J., Desikan R., Hancock J., Harrison J., Morris P., Ribeiro D., Wilson I. Nitric oxide, stomatal closure, and abiotic stress. // Journal of Experimental Botany. 2008. - v.59. - P. 165-176.

136. Nishimura Y. and Lemasters J.J. Glycine blocks opening of a death channel in cultured hepatic sinusoidal endothelial cells during chemical hypoxia. // Cell Death Differ. 2001. - v.8. - P.850-888.

137. Nishimura К. and Tanuma S. Presence of DNase gamma-like endonuclease in nuclei of neuronal differentiated PC 12 cells // Apoptosis. 1998. -v.3. - P.97-103.

138. Noh Y.S. and Amasino R.M. Identification of a promoter region responsible for the senescence-specific expression of SAG 12. // Plant Mol Biol. -1999. v.41. - P.181-194.

139. Noh Y.S. and Amasino R.M. Regulation of developmental senescence is conserved between Arabidopsis and Brassica napus. // Plant Molecular Biology. -1999. v.41. - P.195-206.

140. Nooden L.D. and Penney J.P. Correlative controls of senescence and plant death in Arabidopsis thaliana (Brassicaceae). // J Exp Bot. 2001. - v.52. - P.2151-2159.

141. Obara K., Kuriyama H., Fukuda H. Direct evidence of active and rapid nuclear degradation triggered by vacuole rupture during programmed cell death in Zinnia. // Plant Physiol. 2001. - v.125. - P.615-626.

142. Ohsumi Y. Molecular dissection of autophagy: two ubiquitin-like systems. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. - v.2. - P.211-216.

143. Oleson A.E., Janski A.M., Clark E.T. An extracellular nuclease from suspension cultures of tobacco. // Biochim Biophys Acta. 1974. - v.366. - P.89-100.

144. Oppenheim R.W. Naturally occurring cell death during neural development. // Trends Neurosci. 1985. - v. 17. - P.487-493.

145. Padron-Barthe L., Lepretre C., Martin E., Counis M.-F., Torriglia A. Conformational modification of serpins transforms leukocyte elastase inhibitor into an endonuclease involved in apoptosis. // Mol. Cell. Biol. 2007. - v.27. - P.4028-4036.

146. Panavas Т., LeVangie R., Mistier J., Reid P.D., Rubinstein B. Activities of nucleases in senescing daylily petals. // Plant Physiology and Biochemistry. 2000.- V.38.-P.837-843.

147. Pandey S., Walker P.R., Sikorska M. Identification of a novel 97 kDa endonuclease capable of internucleosomal DNA cleavage. // Biochemistry. 1997. -v.36.-P.711-720.

148. Parrish J. E., Ciccodicola A., Wehhert M., Cox G. F., Chen E., Nelson D. L. A muscle-specific DNase I-like gene in human Xq28. // Hum. Mol. Genet. -1995. v.4. - P.1557-1564.

149. Parrish J., Li L., Klotz K., Ledwich D., Wang X., Xue D. Mitochondrial endonuclease G is important for apoptosis in C. elegans. // Nature. 2001. - v.412.- P.90-94.

150. Patel S., Caplan J., Dinesh-Kumar S.P. Autophagy in the control of programmed cell death. // Curr Opin Plant Biol. 2006. - v.9. - P.391-396.

151. Peitsch M.C., Polzar В., Stephan H., Crompton Т., MacDonald H.R., Mannherz H.G. Characterization of the endogenous deoxyribonuclease involved in153nuclear DNA degradation during apoptosis (programmed cell death). // EMBO J. -1993.-v.12.-P.371-377.

152. Pesquet E., Ranocha P., Legay S., Digonnet C., Barbier O., Pichon M., Goffner D. Novel markers of xylogenesis in zinnia are differentially regulated by auxin and cytokinin. // Plant Physiol. 2005. - v. 139. - P. 1821-1839.

153. Pic E., de La Serve B.T., Tardieu F., Turc O. Leaf senescence induced by mild water deficit follows the same sequence of macroscopic, biochemical, and molecular events as monocarpic senescence in pea. // Plant Physiol. 2002. -v.128. - P.236-246.

154. Pourtau N., Jennings R., Pelzer E., Pallas J., Wingler A. Effect of sugar-induced senescence on gene expression and implications for the regulation of senescence in Arabidopsis. // Planta. 2006. - v.224. - P. 556-568.

155. Quirino B.F., Noh Y.S., Himelblau E., Amasino R.M. Molecular aspects of leaf senescence. // Trends Plant Sci. 2000. - v.5. - P.278-282.

156. Quirino B. F., Normanly J., and Amasino R.M. Diverse range of gene activity during Arabidopsis thaliana leaf senescence includes pathogen-independent induction of defense-related genes. //Plant Mol. Biol. 1999. - v.40. -P.267-278

157. Rami A. Ischemic neuronal death in the rat hippocampus: the calpain-calpastatin-caspase hypothesis. //Neurobiol Dis. 2003. - v.13. - P.75-88.

158. Reape T.J., McCabe P.F. Apoptotic-like programmed cell death in plants. //NewPhytol. 2008. - v. 180. - P. 13-26.

159. Richmond A.E. and Lang A. Effect of kinetin on protein content and survival of detached Xanthium leaves. // Science. 1957. - v.125. - P.650-651.

160. Rodriguez A.M., Rodin D., Nomura H., Morton C.C., Weremowicz S., Schneider M.C. Identification, localization and expression of two novel human genes similar to deoxyribonuclease I. // Genomics. 1997. - v.42. - P.507-513.

161. Rogers H J. Cell death and organ development in plants. // Curr. Top. Dev. Biol. 2005. - v.71. - P.225-261.

162. Rogers H.J. Programmed cell death in floral organs: how and why do flowers die? // Annals of Botany. 2006. - v.97. - P.309-315.

163. Rolland F., Moore В., Sheen J. Sugar sensing and signaling in plants. // Plant Cell. 2002. - v.14. - P.185-205.

164. Roulin S. and Feller U. Light-independent degradation of stromal proteins in intact chloroplasts isolated from Pisum sativum L. leaves: Requirement for divalent cations. // Planta. 1998. - v.205. - P.297-304.

165. Ryerson D.E. and Heath M.C. Cleavage of nuclear DNA into oligonucleosomal fragments during cell death induced by fungal infection or by abiotic treatments. // Plant Cell. 1996. - v.8. - P.393-402.

166. Rzepecki R., Markiewicz E., Adamiec R., Szopa J. Interaction of the Pisum sativum nuclear matrix proteins with SAR DNA. // Acta Biochim Pol. -1995. v.42. -P.75-81.

167. Sadras V.O., Echarte L., Andrade F.H. Profiles of leaf senescence during reproductive growth of sunflower and maize. // Ann.Bot. 2000. - v.85. - P. 187195.

168. Sakahira H., Enari M., Nagata S. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis. // Nature. 1998. - v.391. -P.96-99.

169. Salvesen G.S. and Dixit V.M. Caspases: intracellular signaling by proteolysis. // Cell. 1997. - v.91. - P.443-446.

170. Sanmartin M., Jaroszewski L., Raikhel N.Y., Rojo E. Caspases. Regulating death since the origin of life. // Plant Physiol. 2005. - v. 137. - P.841-847.

171. Samejima K. and Earnshaw W.C. Trashing the genome: the role of nucleases during apoptosis. // Mol. Cell Biol. 2005. - v.6. - P.677-688.

172. Saura J., MacGibbon G., Dragunow M. Etoposide-induced PC 12 cell death: apoptotic morphology without oligonucleosomal DNA fragmentation or dependency upon de novo protein synthesis. // Mol. Brain Res. 1997. - v.48. -P.382-388.

173. Schafer P., Cymerman I.A., Bujnicki J.M., Meiss G. Human lysosomal DNase Ha contains two requisite PLDsignature (HxK) motifs: Evidence for a pseudodimeric structure of the active enzyme species. // Protein Sci. 2007. - v. 16. - P.82-91.

174. Schindler C.K., Pearson E.G., Bonner H.P., So N.K., Simon R.P., Prehn J.H., Henshall D.C. Caspase-3 cleavage and nuclear localization of caspase-activated DNase in human temporal lobe epilepsy. // J. Cereb. Blood Flow Metab. -2006. v.26. - P.583-589.

175. Schippers J.H., Hille J., Dijkwel P.P. Ethylene-induced leaf senescence depends on age-related changes and OLD genes in Arabidopsis. // J Exp Bot. -2005. v.56. - P.2915-2923.

176. Schussler E.E. and Longstreth DJ. Changes in cell structure during the formation of root aerenchyma in Sagittaria lancifolia (Alismataceae). // American Journal of Botany. 2000. - v.87. - P. 12-19.

177. Schwerchel J.U. and Merker H.J. The morphology of various types of cell death in prenatal tissues.// Teratology.- 1973.- v.7.-P.253-266.

178. Shiokawa D., Kobayashi Т., Tanuma S. Involvement of DNase gamma in apoptosis associated with myogenic differentiation of C2C12 cells. // J. Biol. Chem. 2002. - v.277. - P.31031-31037.

179. Shiokawa D., Ohyama H., Yamada Т., Takahashi K., Tanuma S. Identification of an endonuclease responsible for apoptosis in rat thymocytes. // Eur. J. Biochem. 1994. - v.226. - P.23-30.

180. Shiokawa D., Ohyama H., Yamada Т., Tanuma S. Purification and properties of DNase gamma from apoptotic rat thymocytes. // Biochem. J. 1997. -v.326. - P.675-681.

181. Shiokawa D., Shika Y., Tanuma S. Identification of two functional nuclear localization signals in DNase gamma and their roles in its apoptotic DNase activity. // Biochem. J. 2003. - v.376. - P.377-381.

182. Shiokawa D. and Tanuma S. DLAD, a novel mammalian divalent cation-independent endonuclease with homology to DNase II. // Nucleic Acids Res. -1999. -v.27. P.4083-4089.

183. Shiokawa D. and Tanuma S. Characterization of human DNase I family endonucleases and activation of DNase gamma during apoptosis. // Biochemistry. -2001.-v.40. -P.143-152.

184. Shiokawa D. and Tanuma S. Differential DNases are selectively used in neuronal apoptosis depending on the differentiation state. // Cell Death Differ. -2004. v.l 1. -P.l 112-1120.

185. Steffens B. and Sauter M. Epidermal cell death in rice is regulated by ethylene, gibberellin, and abscisic acid. // Plant Physiol. 2005. - v.139. - P.713-721.

186. Subbaiah C.C. and Sachs M.M. Molecular and cellular adaptations of maize to flooding stress. // Annals of Botany. 2003. - v.90. - P.l 19-127.

187. Sugiyama M., Ito J., Aoyagi S., Fukuda H. Endonucleses. // Plant Mol. Biol. 2000. - v.44. - P.387-397.

188. Thelen M.P. and Northcote D.H. Identification and purification of a nuclease from Zinnia elegans L.: A potential marker for xylogenesis. // Planta. -1989. v.179. - P.181-195.

189. Thompson A.R., Vierstra R.D. Autophagic recycling: lessons from yeast help define the process in plants. // Curr Opin Plant Biol. 2005. - v.8. - P. 165173.

190. Vidya Vardhini B. and Rao S.S. Acceleration of ripening of tomato pericarp discs by brassinosteroids. // Phytochemistry. 2002. - v.61. - P.843-847.

191. Walden A.R., Walter C., Gardner R.C. Genes expressed in Pinus radiata male cones include homologs to anther-specific and pathogenesis response genes. // Plant Physiol. 1999.-v. 121.- P.l 103-1116.

192. Wang C.C., Lu S.C., Chen H.L., Liao Т.Н. Porcine spleen deoxyribonuclease II. Covalent structure, cDNA sequence, molecular cloning, and gene expression. //J. Biol. Chem. 1998. - v.273. - P. 17192-17198.

193. Wang H., Li J., Bostock R.M., Gilchrist D.G. Apoptosis: A functional paradigm for programmed plant cell death induced by a host-selective phytotoxin and invoked during development. // Plant Cell. 1996.- v.8. - P.375-391.

194. Wang X., Yang C., Chai J., Shi Y., Xue D. Mechanism of AIF-mediated apoptotic DNA degradation in caenorhabditis elegans. // Science.- 2002. v.298. -P.1587-1592.

195. Wani A.A. and Hadi S.M. Partial purification and properties of an endonuclease from germinating pea seeds specific for single-stranded DNA. // Arch. Biochem. Biophys. 1979. - v. 196. - P.l38-146.

196. Weaver L.M., Gan S.S., Quirino В., Amasino R.M. A comparison of the expression patterns of several senescence-assosiated genes in response to stress and hormone treatment. // Plant Mol. Biol. -1998. v.37. - P.455-469.

197. Widlak P. and Garrard W.T . Discovery, regulation, and action of the major apoptotic nucleases DFF40/CAD and endonuclease G. // Journal of Cellular Biochemistry. 2005. - v.94. - P. 1078-1087.

198. Widlak P. and Garrard W.T. Unique features of the apoptotic endonuclease DFF40/CAD relative to micrococcal nuclease as a structural probe for chromatin.// Biochem. Cell Biol. 2006. - v.84. - P.405-410.

199. Widlak P., Lanuszewska J., Cary R.B., Garrard W.T. Subunit structures and stoichiometries of human DFF proteins before and after induction of apoptosis. // J. Biol. Chem. 2003. - v.278. - P.26915-26922.

200. Widlak P., Li L.Y., Wang X., Garrard W.T. Action of recombinant human apoptotic endonuclease G on naked DNA and chromatin substrates: cooperation with exonuclease and DNase I. // J. Biol. Chem. 2001. - v.276. - P.48404-48409.160

201. Widlak P., Li P., Wang X., Garrard W.T. Cleavage preferences of the apoptotic nuclease DFF40 (caspase-activated DNase or nuclease) on naked DNA and chromatin substrates. // J. Biol. Chem. 2000. - v.275. - P.8226-8232.

202. Wingler A., Purdy S., MacLean J.A., Pourtau N. The role of sugars in integrating environmental signals during the regulation of leaf senescence. // J Exp Bot. 2006. - v.57. - P.391-399.

203. Wingler A. and Roitsch T. Metabolic regulation of leaf senescence: interactions of sugar signalling with biotic and abiotic stress responses. // Plant Biol (Stuttg). 2008. - v.10. - P.50-62.

204. Woltering E.J. Death proteases come alive. // Trends Plant Sci. -2004. -v.9. P.469-72.

205. Woo E.J., Kim Y.G., Kim M.S., Han W.D., Shin S., Robinson H., Park S.Y., Oh B.H. Structural mechanism for inactivation and activation of CAD/DFF40 in the apoptotic pathway. // Mol. Cell. 2004. - v.14. - P.531-539.

206. Woo H.R., Goh C.H., Park J.H., Teyssendier de la Serve В., Kim J.H., Park Y.I., Nam H.G. Extended leaf longevity in the ore4-l mutant of Arabidopsis with a reduced expression of a plastid ribosomal protein gene. // Plant J. 2002. -v.31. - P.331-340.

207. Wood M., Power J.B., Davey M.R., Lowe K.C., Mulligan B.J. Factors affecting single strand-preferring nuclease activity during leaf aging and dark-induced senescence in barley (Hordeum vulgare L.). // Plant Sci. 1998. - v. 131. -P. 149-159.

208. Wyen N.V., Erdei S., Farkas G.L. Isolation from avena leaf tissues of a nuclease with the same type of specificity towards RNA and DNA. Accumulation of the enzyme during leaf senescence. // Biochim. Biophys. Acta. 1971. - v.232. -P.472-483.

209. Wyllie A.H. Glucocorticoid-induced thymocyte apoptosis is associated with endogenous endonuclease activation. //Nature. 1980. -v.284. - P.555-556.161

210. Xiao F., Widlak P., Garrard W.T. Engineered apoptotic nucleases for chromatin research. //Nucleic Acids Research. 2007. - v.35. - P.93-97.

211. Xu С .J., Chen K.S., Ferguson I.B. Programmed cell death features in apple suspension cells under low oxygen culture. // J Zhejiang Univ Sci. 2004. - v.5. -P.137-143.

212. Xu Y. and Hanson M.R. Programmed cell death during pollination induced petal senescence in petunia. // Plant Physiology. 2000. - v. 122. - P. 1323-1333.

213. Yakimova E.T., Kapchina-Toteva V.M., Laarhoven L.J., Harren F.M., Woltering E.J. Involvement of ethylene and lipid signalling in cadmium-induced programmed cell death in tomato suspension cells. // Plant Physiol Biochem. -2006.-v.44.-P.581-589.

214. Yakimova E.T., Kapchina-Toteva V.M., Woltering E.J. Signal transduction events in alluminium-induced cell death in tomato suspension cells. // J.Plant Physiol. 2007. - v. 164. - P.702-708.

215. Yakovlev A.G., Wang G., Stoica B.A., Boulares H.A., Spoonde A.Y., Yoshihara K., Smulson M.E. A Role of the Ca/Mg-dependent endonuclease in apoptosis and its inhibition by poly(ADP-ribose) polymerase. // J.Biol. Chem. -2000. v.275. - P.21302-21308.

216. Yamashima T. Ca2+-dependent proteases in ischemic neuronal death: a conserved 'calpain-cathepsin cascade1 from nematodes to primates. // Cell Calcium. -2004. -v.36. -P.285-293.

217. Yang В., Wen X., Kodali N.S., Oleykowski C.A., Miller C.G., Kulinski J., Besack D., Yeung J.A., Kowalski D., Yeung A.T. Purification, cloning, andcharacterization of the CEL I Nuclease. // Biochemistry. -2000. v.39. - P.3533-3541.

218. Yasuda Т., Takeshita H., Iida R., Nakajima Т., Hosomi O., Nakashima Y., Kishi K. Molecular cloning of the cDNA encoding human deoxyribonuclease II. // J. Biol. Chem. 1998. - v.273. - P.2610-2616.

219. Yen C.H. and Yang C.H. Evidence for programmed cell death during leaf senescence in plants. Plant Cell Physiol. 1998. - v.39. - P.922-927.

220. Yoshida H., Okabe Y., Kawane K., Fukuyama H., Nagata S. Lethal anemia caused by interferon-beta produced in mouse embryos carrying undigested DNA. // Nat. Immunol. 2005. - v.6. - P.49-56.

221. Yoshida A.3 Pommier Y., Ueda T. Endonuclease activation and chromosomal DNA fragmentation during apoptosis in leukemia cells. // Int. J. Hematol. 2006. - v.84. - P.31-37.

222. Yoshimori T. Autophagy: a regulated bulk degradation process inside cells.// Biochem Biophys Res Commun. 2004. - v.313. -P.453-458.

223. Young Т.Е. and Gallie D.R. Analysis of programmed cell death in wheat endosperm reveals differences in endosperm development between cereals. // Plant Mol. Biol. 2000. - v.42. - P.397-414.

224. Young Т.Е., Gallie D.R., DeMason D.A. Ethylene-mediated programmed cell death during maize endosperm development of wild-type and srunken2 genotypes. // Plant Physiol. 1997. - v.l 15. - P.737-751.

225. Yupsanis Т., Symeonidis L., Kalemi Т., Moustaka H., Yupsani A. Purification, properties and specificity of an endonuclease from Agropyron elongatum seedlings. // Plant Physiol. Biochem. 2004. - v.42.- P.795-802.

226. Zaina G., Morassutti C., De Amicis F., Fogher C., Marchetti S. Endonuclease genes up-regulated in tissues undergoing programmed cell death are expressed during mail gametogenesis in barley. // Gene. 2003. -v. 15. - P.43-50.

227. Zimmermann P. and Zentgraf U. The correlation between oxidative stress and leaf senescence during plant development. // Cell. & Mol.Biol. Letters. 2005. - v.10. - P.515-534.

228. Zhang L. and Xing D. Methyl jasmonate induces production of reactive oxygen species and alterations in mitochondrial dynamics that precede photosynthetic dysfunction and subsequent cell death. // Plant Cell Physiol. 2008. -v.49. - P. 1092-1 111.

229. Zhao Y., Xu R., Luo W. Antagonist effect of ABA on detached cucumber cotyledon senescence induced by eBR. Chinese Sci. Bullet. -1990. v.35. - P.928-931.

230. Zhao Т., Zhang H., Guo Y., Zhang Q., Hua G., Lu H., Hou Q., Liu H., Fan Z. Granzyme К cleaves the nucleosome assembly protein SET to induce single-stranded DNA nicks of target cells. // Cell Death Differ. -2007. v. 14. - P.489-499.

231. Zhivotovski В., Gahm A., Orrenius S. Two different proteases are involved in the proteolysis of lamin during apoptosis. // Biochem. Biophys. Res. Comm. -1997.-v.233. -P.96-101.

232. Zhou J., Zhuo H.Z., Dai Y.R. Effect of ethrel on apoptosis in carrot protoplasts. // Plant Growth Regul. 1999. - v.21. - P.l 19-123.

233. Zong W.X. and Thompson C.B. Necrotic death as a cell fate. // Genes Dev. -2006.-v.20.-P.l-15.

234. Zuppini A., Bugno V., Baldan B. Monitoring programmed cell death triggered by mild heat shock in soybean-cultured cells. // Functional Plant Biology. 2006. - v.33. - P.617-627.1. БЛАГОДАРНОСТИ

235. Выражаю искреннюю благодарность за неоценимую помощь в работе Александрушкиной Надежде Ивановне, сотрудникам отдела МОО (Молекулярных Основ Онтогенеза), а также сотрудникам отдела Электронной Микроскопии.

Информация о работе

Середина, Анна Владимировна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.05

Диссертация

Запрограммированная гибель клеток и эндонуклеазные активности у растений пшеницы и гороха - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы