Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности хемилюминесценции при дезаминировании аминокислот в водных растворах в присутствии перекисиводорода

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Закономерности хемилюминесценции при дезаминировании аминокислот в водных растворах в присутствии перекисиводорода"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н.Н.СЕМЕНОВА

. На правах рукописи

БАСКАКОВ ИЛЬЯ ВЛАДИМИРОВИЧ

Закономерности хемилюминесценции при дезаминировании аминокислот в водных растворах в присутствии перекиси

водорода

Специальность: 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва -1995

Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. ММШе-мякина и Ю.АОвчинникова РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук,

доцент В.Л.Воейков

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор И.И.Иванов доктор химических наук Э.Ф.Брин

Ведущая организация: Химический факультет

Московского Государственного Университета им.М.В.Ломоносова

Защита состоится 1996 г. в И часов

на заседании Диссертационного Совета Д 002.26.07 в Институте химической физики имени КН.Семенова РАН, по адресу: 117977, Москва, ул.Косыгина 4, ИХФ РАН.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической физики РАН.

Автореферат разослан ■г?" ¿/¿а^АЗ 1995 г.

Ученый секретарь кандидат химических наук

М. А. Смотряева

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Хорошо известно, что окислительные процессы являются основными поставщиками энергии в клетке, которая запасается в виде макроэргических связей АТФ. С другой стороны существует значительное количество окислительных реакций, протекающих с участием активных форм кислорода, в результате которых образуются продукты в электронновозбужденном состоянии. Полученные в последнее время экспериментальные данные свидетельствуют , что за счет энергии электронного возбуждения продуктов биохимических реакций протекают различные энергоемкие биосинтетические реакции. Поэтому данные процессы можно рассматривать как источник свободной энергии в клетке. Кроме того, в 80-е годы была выдвинута гипотеза о том, что активные формы кислорода являются новым классом вторичных мессенджеров. Например, такие ключевые события в клетке, как митоз и апоптоз, опосредуются активными формами кислорода и в значительной степени определяются уровнем цепных окислительных процессов. В этой связи представляет интерес изучение цепных окислительных реакций, протекающих с участием активных форм кислорода и сопровождающихся генерированием электронновозбужденных состояний.

Одной из наиболее изученных систем в данной области является перекисное окисление липидов, протекающее по механизму вырожденных разветвленных цепных реакций. С другой стороны еще в 30-е годы А.Г.Гурвичем были приведены некоторые сведения о том, что процессы, инициируемые сверхслабым УФ-светом в водных растворах аминокислот, также обладают свойствами вырожденных разветвленных цепных реакций и сопровождаются сверхслабым УФ-излучением. Но все экспериментальные данные были получены с использованием единственного метода, основанного на регистрации сверхслабого УФ-света биологическими детекторами. Аналогичными свойствами обладал и раствор глицина при добавлении перекиси водорода. Дальнейшего развития эти исследования не получили, хотя они представляют несомненный интерес для выяснения механизмов многих биохимических процессов, поскольку рассматривают реакции, протекающие в водном растворе в условиях, близких к физиологическим, и с участием биологически важных молекул.

Цель работы. Целью настоящей работы было изучение закономерностей хемилюминесценции, сопровождающую реакцию, протекающую в водном растворе аминокислот и перекиси водорода.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые проведено детальное инструментальное изучение реакции в водных растворах аминокислот и перекиси водорода. С использованием люминофоров изучены макрокинетические закономерности хемилюминесценции. Для люминофоров определен диапазон оптимальных концентраций. Показано, что хемилюминесценция сопровождает процесс окисления аминокислот. Предложена гипотетическая схема реакции. Идентифицирован один из основных продуктов реакции. Показан общий характер реакции, свойственный не только глицину, но и другим природным а-аминокислотам. Изучена температурная зависимость интенсивности хемилюминесценции в ходе процесса в зависимости от стадии процесса. Предполагается, что исследованная реакция может служить модельной системой для анализа свойств водорастворимых антиоксидантов.

Апробация работы и публикации. Результаты исследований доложены на Международном симпозиуме "Неравновесные и когерентные системы в биофизике, биологии и биотехнологии" (Москва, 1994); 2 Международном симпозиуме 'Механизмы действия сверхмалых доз" (Москва, 1995). Основные результаты опубликованы в 8 печатных работах.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками и 3-мя таблицами и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы (246 ссылок)

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Все эксперименты проводились с Использованием дистиллированной деионизированной воды, ^аминокислот со степенью чистоты •апа1уиса! дгас1е'-И выше. Хемипюминесценцию (ХЛ) регистри^ ровали посредством жидкостных сцинтилляционных счетчиков радиоактивности с включенной схемой совпадений (где не указано особо) или оборудования, работающем по принципу счета фотонов (при исследовании температурной зависимости ХЛ).

В растворах аминокислот после введения перекиси водорода развивается процесс, сопровождающийся длительной XJ1, если в системе присутствует люминофор, в частности, бромистый этидий. Типичная кинетка XJ1 имеет индукционный период, стадию автоускорения, описываемую экспоненциальной функцией и период снижения интенсивности излучения.

Анализ изменения концентрации Н202 в растворе глицина проводили посредством пероксидазного теста. Обнаружено, что через 50-80 мин после внесения перекиси водорода в раствор аминокислоты наблюдался прирост концентрации Н202 в растворе (табл.1). Максимум концентрации приходился на стадию экспоненциального роста кривой ХЛ (рис.1) Достоверность прироста в максимуме относительно начальной концентрации оценивалась по критерию знаков и по результатам 9 экспериментов была достоверна с уровнем значимости а = 0.02. Снижение концентрации Н202 по сравнению с исходной отмечалось в разных опытах через 2-4 ч после запуска реакции, когда начинался спад интенсивности ХЛ.

Концентрация глицина в процессе реакции уменьшается незначительно (табл. 1). Вследствие этого различие в концентрации в начальный момент реакции и по прошествии 17 ч. не является достоверным, а имеется лишь тенденция к снижению концентрации. В то же время в реакционной смеси накапливается аммиак. Концентрация аммиака через 17 ч. реакции соответствует дезаминирова-нию 3% всей аминокислоты.

Сравнение кинетической кривой накопления аммиака с интегральной кривой ХЛ показало, что существует функциональное соответствие, выражаемое формулой:

С в А(Е1 т)п , (1)

где С - концентрация аммиака в данный момент времени, ХЬсл -сумма зарегистрированных кэтому моменту времени импульсов (рис. 2а). Показатель п по результатам 5 экспериментов составил 0.691 ± 0.055 (коэффициент корреляции экспериментальных данных формуле 1 в каждом эксперименте был не ниже 0.997). Скорость накопления аммиака не зависит от присутствия в реакционной системе бромистого этидия, если люминофор используется в оптимальной концентрации, равной 20 мкМ (рис. 26), т.е. люминофор не влияет на ход дезаминирования.

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют, что ХЛ соответствует процессу окисления аминокислоты, а не ка-

1-.*10 пап - вин

Н20г.%

Рис. 1.2- изменение концентрации Н202, представленное в процентах относительно начальной концентрации, в реакционной смеси (0.8 М глицин, 350 мМ Н202, 20 мкМ бромистый этидий); 1 -соответствующая кривая ХЛ.

100

Время, мин

¿1х„*Ю ,имп№ юоооз

шн;],«м (2) 20

160 зоо

Бремя мин

!МЮ мМ|2,3)

Время, мин

Рис.2. Кинетика накопления аммиака в растворе глицина (0.8 М) и Н202 (0.75 М) в отсутствии (кривая 3) и в присутствии (кривая 2)_ -бромистого этидия (20 мкМ).1- интегральнаякривая ХЛ (11от) воб-разце с бромистым этидием. Данные представлены в полулогарифмических - (а) и прямых - (б) координатах. Концентрацию аммиака измеряли методом Несспера.

ким-либо другим реакциям, происходящих, например, с участием микропримесей. Окислению подвергается лишь небольшой процент аминокислоты и реакция ингибируется задолго до исчерпания субстрата. Аналогичные результаты были получены при использовании аспарагина.

Таблица 1. Изменение концентрации Н202 входе реакции*.

Время, мин Концентрация Н„0„ (% относительно начальной)

опыт 1 опыт 2 опыт 3

0 100 + 1.5 100 + 1.2 100 ± 1.9

12 99.5 ± 2.1

24 101.9 + 2.5

36 100.3 ± 2.2 101.4+1.4 100.7 ± 2.3

43 100.4 ± 2.0

60 102.3 ± 2.2

72 110.7 ±3.0 1064+2.6 105.3+3.5

96 104.6+1.8

120 102.8+ 1.9 103.0+1.7 102.2 + 2.6

'Состав реакционной смеси: 0.8М глицин, 0.35 М Н„02, 20 мкМ бромистый

этидий.

Таблица 2. Изменение концентрации глицина* и аммиака** в ходе реакции.

Время, ч Концентрация глицина, (мМ) Концентрация аммиака, (мМ)

А Б

0 800+24 800+34 0

4 787+25 792+24 6+2

17 753+28 786+38 22+2

'Определена методом ТСХ в различных системах растворителей А и Б с использованием [2- 14С] глицина.

"Концентрацию аммиака определяли с использованием реактива Несслера.

Анализ хемилюминесценции в присутствии различных люминофоров.

ХЛ, сопровождающую реакцию дезаминирования, можно наблюдать при добавлении в реакционную смесь различных люминофоров: водорастворимого флюоресцентного зонда Cascade Blue, тирозина, триптофана и др. При этом обнаруживаются те же закономерности, что и в присутствии бромистого этидия: индукционный период, стадия экспоненциального роста интенсивности ХЛ, за которой следует затухание излучения. Зависимость величины общего количества имульсов, регистрируемых в процессе реакции, от концентрации люминофора имеет экстремальную форму (рис. 3).

Рис.3. Зависимость максимальной интенсивности излучения (1) и общего количества импульсов (2), суммированных за 15 часов реакции, от начальной концентрации бромистого этидия (ось абсцисс -логарифмический масштаб) в стандартной реакционной смеси (0.9 М глицин, 0.72 М Н202> объем реакционной смеси - 12 мл).

-№!, м

'хл>1ШП/МИН 1ь,имп/ыш

_ а__:_:-б---

Рис.4. Кинетика ХЛ стандартной реакционной смеси при различной концентрации бромистого этидия представленная в полулогарифмических координитах. Концентрация указана на рисунке в мкМ (1=22°С).

Область оптимальных концентраций люминофоров соответствует диапазону 10-50 мкМ и несколько варьирует для каждого из них. Различия между конкретными люминофорами проявляются в абсолютных значениях интенсивности излучения. По этому признаку люминофоры располагаются в следующем порядке: Туг < Тгр < бромистый этидий < Cascade Blue.

С помощью фильтров, в качестве которых использовались водные растворы красителей, установлена область спектра, в которой регистрировалось излучение. Экспериментальные данные свидетельствуют, что спектры ХЛ должны быть индивидуальны для различных люминофоров, хотя до 95% излучения находится в диапазоне 420-600 нм для всех люминофоров. Спектр для тирозина и триптофана сдвинуты в синюю область относительно спектров бромистого этидия и Cascade Blue. Спектры ХЛ не совпадают со спектрами флуоресценции люминофоров, по крайней мере для трех из них: (Макс^Туг^ЗОЗ нм, Максфл(Тгр)=348, MaKc^( cascade blue)=423 нм); и отличаются от спектра излучения синглетного кислорода (1макс=632 нм). Спектральная область ХЛ соответствует фосфоресценции люминофоров и частично перекрывается с областью триптофан-зависимой или тирозин-зависимой люминесценцией, наблюдаемой в некоторых ферментативных окислительных реакциях.

Обнаруженные закономерности позволяют предположить, что в системе осуществляется безызлучательный перенос энергии с электронновозбужденных триплетных продуктов реакции на люминофоры с последующим переизлучением, что позволяет рассматривать хемилюминесценцию с точки зрения сенсибилизированной люминесценции. Явление сенсибилизированной люминесценции используется для идентификации образующихся в процессе реакций синглетных или триплетных электронновозбужденных продуктов. В случае последних часто удается увеличить квантовый выход ХЛ, а в ряде случаев люминесценция из реакционной системы наблюдается только в присутствии люминофоров.

Увеличение концентрации люминофоров выше оптимальной приводит не только к уменьшению интенсивности ХЛ, но и к замедлению скорости развития реакции. Например, бромистый этидий в концентрации 1 мМ (рис. 4а), тирозин в концентрации 1 мМ (рис. 5) или Cascade Blue в концентрации 0.5 мМ (рис. 6) в значительной степени замедляют развитие процесса. Аналогичное действие оказывает триптофан. Более наглядно тенденция видна при исследо-

4

200 400

Время, мин

«00 600 1200

Время, млн

Рис.5 Кинетика ХЛ стандартной реакционной смеси в присутствии различных концентраций тирозина (указана в мкМ). К - контрольный образец, содержащий 100 мкМ тирозин, но в отсутствии глицина. (t=22°C). (ХЛ регистрировали при выключенной схеме совпадений).

Рис.6. Кинетика ХЛ стандартной реакционной смеси в присутствии различных концентрации Cascade blue (указана в мкМ). (t=18°C)

ш «10

3.5

\

5 50 500

Концентрация, мкМ

1nh;I , %

120 г

Рис.7. Зависимость т от концентрации бромистого этидия (1) и тирозина (2). т рассчитана из экспериментальных данных по уравнению /=Ае™', где / -интенсивность излучения (имп/мин),/-время (мин), полученных для реакции в стандартных условиях.

б SO 500

__Концентрация J/'.wtii]-

Рис.8. Зависимость выхода аммиака, образующегося в течение Зч реакции в стандартной реакционной системе от концентрации тирозина Данные приведены в процентах относительно образца без тирозина. Суммированы результаты 8 экспериментов.

вании изменения параметра т в зависимости от концентрации люминофоров (рис. 7). Увеличение концентрации люминофоров выше оптимальных приводит к значительному снижению величины т, хотя аналогичная тенденция наблюдается и при концентрациях люминофоров ниже оптимальных. В этом диапазоне концентраций кинетика ХЛ уже не отражает кинетику дезаминирования. Данный факт объясняется тем, что люминофоры подвергаются деструкции в процессе реакции, что было показано по уменьшению максимума поглощения соответствующих люминофоров входе процесса. Поэтому при слишком низкой их концентрации излучательная способность реакционной системы быстро снижается, что приводит к недооценке интенсивности и продолжительности процесса (рис. 46). В случае использования люминофора в оптимальной концентрации данный эффект минимален. Так, добавление люминофора в реакционную систему на стадии снижения интенсивности ХЛ в образцы, в которых люминофор изначально присутствовал в оптимальной концентрации, не приводит к увеличению ХЛ.

Ингибирующее действие люминофоров проявляется на стадии автоускорения реакции. Так, увеличение концентрации тирозина выше 50 мкМ приводит к снижению количества аммиака, нарабатываемого в системе на данном этапе реакции (рис. 8). Таким образом, хемилюминесценция реально отражает макрокинетические закономерности реакции, только если люминофор используется в оптимальной концентрации. Уменьшение или увеличение концентрации люминофора приводит либо к недооценке, либо к ингибиро-ванию скорости реакции, соответственно.

Зависимость скорости реакции от начальной концентрации аминокислот и Яе2\

Форма кинетической кривой ХЛ существенно зависит от начальной концентрации аминокислоты. Так, начальные скорости реакции и максимальные значения скорости счета закономерно снижаются, а индукционный период и время достижения максимальной интенсивности излучения увеличиваются со снижением начальной концентрации аминокислоты (рис. 9,10). Суммарное количество импульсов (площадь под кинетической кривой) стремится к одной величине для реакционных систем с различной начальной концентрацией глицина (рис. 9). Данный факт указывает на то, что параметром, определяющем ингибирование реакции является не глубина окис-

4

'х-*10'-

2вО 620

Рис.9. Кинетика ХЛ реакционных смесей в стандартных условиях при различных концентрациях глицина: 0.9 М (1), 0.45 М (2), 0.225 М (3) и 0.112 М (4)

Рис.10. Кинетика ХЛ реакционных смесей в стандартных условиях при различных концентрациях аспарагина: 0.2 М (1), 0.1 М (2), 0.05 М (3), 0.025 М (4).

, МО", хшп МИН

и "V

ф!

. а -

¡Га*

лт - Г -

ОА Ч

Рис.11. Кинетика ХЛ реакционных смесей в стандартных условиях при различных концентрациях аспарагина (М):

-1-0.05-

2-0.04 3 - 0.03 4-0.02.

400 600

», ИШ1

ления, а возможно, накопление некоторых промежуточных или конечных продуктов реакции до определенного уровня.

Данные по интенсивности излучения (/), регистрируемые на стадии автоускорения ХЛ, были аппроксимированы к различным математическим функциям. Наилучшее соответствие (с коэффициентами корреляции 0.999 - 0.9999) было получено для экспоненциальной функции вида:

1=А

где / - интенсивность ХЛ в момент времени А- коэффициент, причем экспериментальные данные соответствуют экспоненциальной функции на протяжении длительного времени (до 3 часов).

Кроме того, было показано, что для аспарагина существует нижняя критическая концентрация - 25 мМ, ниже которой при постоянстве физических условий и химического состава реакция не развивается (рис. 10,11). С учетом данного факта экспериментальные данные лучше согласуются с механизмом вырожденно разветвленной цепной реакции, чем автокаталитической реакции.

При сравнении кинетики ХП препаратов глицина нескольких фирм было обнаружено, что различия в продолжительности индукционного периода составляли несколько десятков минут. Эти различия можно объяснить присутствием в препаратах глицина микропримесей, в значительной степени влияющих на инициацию процесса. Так, при использовании препарата глицина, в растворе которого реакция после добавления Н202 не развивалась в течение 24 ч индукционный период сокращается при добавлении Ре2* (рис. 12). Известно, что Яе2+ катализирует разложение Н202 (реакция Фенто-на) с образованием реакционных промежуточных продуктов, что сопровождается вспышкой излучения. Причем интенсивность и продолжительность вспышки может служить оценкой количества распавшейся Н202. Как показано экспериментально, количество импульсов, регистрируемых от реакции Фентона, проводимой при различных начальных концентрациях Ре2*, связано с продолжительностью индукционного периода ХЛ реакции, проводимой в растворе глицина в присутствии соответствующих концентраций Яе2*, гиперболической функцией (коэффициент корреляции - 0.999) (рис. 13). Данный факт указывает на то, что ключевую роль в инициации процесса играют активные промежуточные продукты, образующиеся при разложении незначительного количества перекиси водорода в реакции Фентона.

400

600 800 1000 Время, мин

1200

1400

Рис.12. Кинетика ХЛ стандартной реакционной смеси (0.9М глицин, 0.75 М Н202, 20 мкМ бромистый этидий) в зависимости от от концентрации РеБ04 (концентрация указана в нМ); К - контрольный образец - безРе304.

1ИВД, мин 2000]

Рис.13. Зависимость продолжительности индукционного периода ХЛ реакционных смесей представленных на рис.12, от суммарного количества импульсов, регистрируемых в течение первых 10 мин от реакции Фентона (0.75 М Н202, РеЭОД определенного при соответствующих концентрациях ревО,: _1, _10, А ООнМ, _1 ,_10-МкМ.-

II, имп*10"2

Данные представлены в логарифмических координатах. (Излучение регистрировали при выключенной схеме совпадений).

Зависимость скорости реакции от соотношения объем/поверхность реакционного сосуда.

С использованием стандартных флаконов для сцинтилляци-онного счета в качестве реакционных сосудов было обнаружено, что значение ускорения т зависит от объема реакционной смеси при неизменных концентрациях всех ее компонентов. При увеличении объема смеси показатель т растет (рис. 14), а его значения удовлетворительно аппроксимируются к кривой, описывающей зависимость объем/поверхность от объема реакционной смеси. Увеличение ускорения реакции с увеличением объема нельзя объяснить, исходя из предположения, что реакция является экзотермической, а при увеличении отношения объем/поверхность условия теплоотвода ухудшаются и поэтому ускорение процесса возрастает. Эксперименты, в которых посредством термоэлемента с чувствительностью 0.1°С производилась регистрация температуры в реакционной смеси, показали, что температура в ходе реакции не меняется и не зависит от объема смеси.

Зависимость скорости от объема реакции нельзя объяснить и какими-либо оптическими эффектами, связанными с различиями в поверхности светосбора. Во-первых, зависимость наиболее ярко обнаруживается лишь на стадии автоускорения, т.е. стадии, которая описывается экспоненциальной функцией, но не на последующих этапах реакции. Именно на стадии автоускорения отношение интенсивностей излучения, регистрируемых, например, из реакционной смеси с большим объемом к реакционной смеси с меньшим объемом, максимально (рис. 15). Максимальное значение данного отношения четко соответствует пику кривой, полученной путем дифференцирования кинетической кривой ХЛ. С дальнейшим ходом реакции отношение интенсивностей излучения уменьшается, стремясь к ожидаемому значению.

Во-вторых, в случае использования раствора аспарагина, было обнаружено, что от объема реакционной смеси в данном случае зависит не только показатель т, но и продолжительность индукционного периода (рис.16). Так, в образцах объемом 3 мл. процесс развивался всегда с опозданием на 40-150 мин. (на рисунке представлен один из экспериментов) по сравнению с образцами объемом 6-18мл., хотя реакция во всех образцах была инициирована одновременно.

Рис.14. Зависимость т от объема (V) реакционной смеси -о; зависимость отношения объем/поверхность (V/S) от объема (V) для стандартного флакона - сплошная линия, т рассчитана из экспериментальных данных по уравнению 1=А&"\ где / -интенсивность излучения (имп/ мин), t-время (мин), полученных для реакции в стандартных условиях.

ш-10

V, мп

V/S

Рис.15. 1 - отношение интенсивности излучения реакционной смеси объемом 18 мл к таковой объемом 12 мл. Реакция проводилась в стандартных условиях. 2 - дифференциальная кривая кинетической кривой ХЛ реакционной смеси объемом 18 мл

А'х, ♦10~ (2)

7.5

6 -

4.5 - Щ/ Я М

' $

3 -

1.5 • Ф \

1 \

0 ■ h

-1.5 --3 % с

"WD

' Хл18 " XnlZ

460 t, Ю]Н

МИН

Рис.16. Зависимость ХЛ реакционных смесей с ас-парагином (100 мМ аспара-гин, 375 мМ Н202, 20 мкМ -б ро м и стый~этидий )^от объема смеси. Реакция проводилась в стандартных реакционных флаконах.

100

Время, мин

2.7

Изучение температурной зависимости кинетики ХЛ.

При изучении температурной зависимости ХЛ регистрировали посредством фотоэлектронного оборудования, разработанного в Международном Институте Биофизики (г.Кайзерслаутерн, ФРГ). При увеличении температуры от 25° до 46°С энергия активации (Еакт) возрастет от практически нулевого значения в диапазоне 25°-33°С до значений в десятки ккал/моль при приближении к 46° С с тенденцией к дальнейшему увеличению (рис. 17а). Как известно, даже для классических бимолекулярных реакций Еакт. и предэкспоненциапь-ный член (А) в уравнении Аррениуса для скорости реакций

у/ - А е -ЕактЛ<Т

несколько меняется с температурой, однако это изменение невелико и в пределах погрешностей измерений часто не обнаруживается. При наличии заметных отклонений от закона Аррениуса полагают, что предэкспоненциальный член и энергия активации являются функциями температуры. В этом случае следовало бы ожидать снижения скорости реакции при уменьшении температуры, причем форма кривой Аррениуса при этом должна была бы повторять кривую, полученную при повышении температуры. Ход графика на рис. 17а свидетельствует о принципиально иной закономерности. При более медленном изменении температуры и в более узком температурном интервале данный эффект выражен более ярко (рис. 176): после начала охлаждения раствора интенсивность излучения продолжает возрастать и увеличивается в 1.24 раза при падении температуры на 2°С, что формально можно трактовать как "отрицательную Е \ Только после этого кривая выходит на плато ('нулевая

С каждым следующим циклом изменения температуры угол между кривой, отвечающей повышению температуры, и кривой, отвечающей ее последующему снижению, уменьшается (рис. 17а,б). Соответственно уменьшается разница между средними наклонами двух кривых, т.е. различия между усредненными эмпирическими Еакт., отвечающими полуциклу повышения и полуциклу снижения температуры.

При достижении максимальной интенсивности ХЛ график Аррениуса приближается к классическому виду: Еакт. имеет положительное значение как на фазе повышения температуры, так и на фазе ее снижения, графики становятся почти линейными и в среднем параллельными друг другу (рис. 18а).

Рис.17. Зависимость интенсивности ХЛ реакции на стадии автоускорения в реакционной смеси (50 мМ аспартат, 100 мМ НгОг, 20 мкМ бромистый этидий) при циклических изменениях температуры со скоростью 1°С/2.5 мин -а, со скоростью 0.1°С/2.5 мин - 6, представленная в координатах Аррениуса. Обозначения (1-3) - последовательные полуциклы нагревания (1°Т) и охлаждения (1°4-).

а б

Рис.18. Зависимость интенсивности ХЛ реакции на стадии с максимальной интенсивностью излучения - (а), и стадии снижения скорости реакции - (б) в реакционной смеси (50 мМ аспартат, 100 мМ Н202 , 20 мкМ бромистый этидий) от циклических изменений температуры, производимых со скоростью 1°С/2.5 мин для а и со скоростью 0.1°С/2.5 для б. Пунктирные кривые - полуциклы нагревания, сплошные кривые - полуциклы охлаждения. Обозначения (1-3) - последовательные полуциклы нагревания (^Т) и охлаждения

Характер инерционности системы на этапе снижения скорости реакции проявляется более ярко, если температура раствора меняется медленно и в узком интервале (рис. 186). При повышении температуры интенсивность ХП почти не возрастает. Сравнение графика на рис. 186, с графиком на рис. 17а показывает, что поведение системы на стадии замедления скорости реакции противоположно ее поведению на стадии автоускорения. Исходя из совокупности графиков, отвечающих всем стадиям реакции, можно заключить, что траектория зависимости 1д(1) от 1/Т в трехмерном пространстве, где третья ось - ось времени, имеет вид спирали.

Для выяснения того, как меняются кажущиеся значения Еакт на протяжении всей реакции, ХП регистрировали при циклических изменениях температуры реакционнной смеси с периодом 14 мин (рис. 19). Считалось, что в пределах каждого цикла концентрация компонентов квазистационарна. Для каждого полуцикпа нагревания и полуцикла охлаждения были рассчитаны кажущиеся значения Еает, при этом инерционность системы не принимали во внимание. Значения Еакт, вычисленные для полуциклов повышения температуры (ЕаетТ), и для полуциклов ее снижения (Еакг|) близки на этапе индукционного периода, когда скорость реакции растет очень медленно. Как только реакция переходит в стадию автоускорения, Еакт:Г увеличивается на несколько десятков ккал/моль, а Еа1стЛ столь же резко уменьшается. В дальнейшем значения ЕаетТ уменьшаются в ходе реакции по экспоненциальной функции (коэффициент корреляции г = 0,995), а значения Е т подчиняются более сложной закономерности. Две кривые пересекаются, когда скорость реакции достигает максимального значения. Именно в точке их пересечения Еакт1. и ЕтЛ равны друг другу, и это единственный момент после начала развития процесса, когда экспериментальные данные описываются классической зависимостью Аррениуса. Таким образом, кажущиеся значения Еакг не являются постоянными, а закономерно меняются в ходе процесса. Разность между двумя Еакт (Еакт1. - ЕактД) определяет потенциал системы (или величину гистерезиса) в каждый момент времени, т.е. способность сопротивляться на внешнее изменение температуры. Так, потенциал положителен на стадии автоускорения (рис. 17а,б) и отрицателен при переходе на стадию, когда скорость реакции снижается (рис. 186). Аналогичные закономерности были получены при использовании других аминокислот (глутамата, глицина и апанина).

имп/мин (1)

Е (Ккал/моль (2,3)

О 100 200 300 400 500 600

Время, мин

Рис.19. Кинетика ХЛ в реакционной смеси при периодических колебаниях температуры от 35° до 36° С (1, левая ось ординат, логариф-^^нмкишиасштаб)ги изменение в ходе реакциизмпирических^зна^ чений Еокт(правая ось ординат, логарифмический масштаб), рассчитанных для полуцикпов повышения температуры: Еак1Т (2), и для полуциклов снижения температуры: Еает I (3).

Термин "энергия активации химической реакции*, как правило, используют в двух значениях: как энергию, которую необходимо придать молекуле для преодоления ею энергетического барьера на пути превращения в продукт, или как энергию, которой должна обладать молекула, чтобы претерпеть химическое превращение. Для реакций с термическим способом активации эти два смысла можно считать равнозначными. Однако для исследованной здесь реакции термин *Еает" не может быть истолкован в первом смысле. В частности, продолжение роста скорости реакции в течение некоторого времени после начала охлаждения смеси ("отрицательное значение Еакт", рис.17) свидетельствует, что входе реакции высвобождается внутренняя энергия реагентов, которая используется для преодоления энергетического барьера. При этом рассматриваемая реакция носит нетермический характер - саморазогревания реакционной смеси в ходе процесса не наблюдается. Энергия, освобождающаяся в элементарных химических актах, не рассеивается в тепловую, а используется в следующих этапах реакции. Следует отметить, что циклический процесс изменения температуры реакционной смеси не приводит к циклическим же изменениям параметров протекающего в этой смеси процесса. Этот факт, а также постоянное изменение значений Еакт., показывают необратимость процесса в каждый данный момент времени.

* * *

Таким образом, в результате исследования реакции, протекающих в водных растворах а-аммнокислот (в различных экспериментах были использованы Gly, Asn, Glu, Asp, Ala, Lys, Val, Leu, Gin) и H202 были обнаружены следующие макрокинетические закономерности: индукционный период; фаза автоускорения, описываемая экспоненциальной функцией; критические условия; зависимость скорости реакции от соотношения объем/поверхность реакционного сосуда; активирующее влияние Fe2* в наномолярных концентрациях на инициацию реакции; существенное отклонение от температурного закона Аррениуса.

Принимая во внимание все перечисленные особенности, можно предложить гипотетическую схему реакции, в основе которой лежит механизм вырожденной разветвленной цепной реакции (рис. 20). В соответствии с данной схемой инициация процесса осуществляется реактивными продуктами распада перекиси водорода. Атаке подвергается а-С атом аминокислоты с отрывом водорода. Дальнейшие превращения протекают через образование соответ-

ствующего пероксирадикала и пероксида аминокислоты, что является наиболее вероятным путем окисления по литературным данным. Предполагается, что генерирование триплетных электронно-возбужденных продуктов реакции осуществляется в реакции дис-мутации пероксирадикалов, протекающей через образование тет-роксида и сопровождающейся по,следующим дезаминированием. Реакция диспропорционирования описана для разнообразных органических пероксидных радикалов, наример, радикалов липидов и является высокоэкзотермичным процессом (ЮОккал/моль).

В качестве этапов продолжения цепи можно предложить два варианта: 1) посредством взаимодействия триплетного электрон-новозбужденного карбонила с аминокислотой, в результате чего образуется соответствующий радикал аминокислоты. Данный путь продолжения цепи должен конкурировать с процессом переноса энергии электронного возбуждения на люминофор, о чем свидетельствует ингибирование развития реакции при увеличении концентрации люминофоров. 2) второй путь продолжения цепи может реали-зовываться через отрыв водорода от аминокислоты непосредственно пероксирадикапом аминокислоты.

В качестве этапов вырожденного разветвления цепей можно предложить схему распада органических пероксидов по Н.М.Эмануэлю и предположить, что разложение молекул пероксидов аминокислот на радикалы осуществляется в соответствии с данной схемой. С разложением пероксида аминокислоты на радикалы должна конкурировать реакция образования перекиси водорода и соответствующей кетокислоты, возможность протекания которой была продемонстрирована по литературным данным.

В соответствии сданной схемой продолжительность индукционного периода реакции будет определяться как скоростью зарождения цепей реакции, так и соотношением обрыва цепей к их вырожденным разветвлениям. Скорость зарождения цепей определяется разложением незначительного количества перекиси водорода, и в конечном итоге зависит от концентрации ионов с переменной валентностью, например, ^^ГНгГобрыв цепей влияет соотношение объем/поверхность реакционного сосуда, следствием чего является эффект торможения реакции, проводимой в маленьком объеме и с большой поверхностью. При низких концентрациях амино-

Тч;н3+-С-С00-

н

[Н202+Ре2+ ]

Продолжение цепи

кн3+-с-соо- «-Н

■* .0(Ж н

С-СОО—►

МН3+-С-С00--[-С-О-О-О-О-Щ-► (>С=0)"+НК0Н+02+2КН4+

1 1 I

00. I

Люм—(Л юм)"—► Люм + Ну 11=0 .

ЯН-

Ш3+-С-С00-

н

н

МНч+-С-С00-

оон

н2о2

у, н20

* ш2+=с-соо——► о=с-соо-+ мн4+ н

н

яо. яо. яо.

+ + +

•ОН ЯОО» я.

Разветвление цепи

Рис.20. Упрощенная гипотетическая схема реакции.

кислоты (ниже критической) реакция протекает в стационарном режиме, когда обрыв цепей преобладает над вырожденными разветвлениями.

Данная гипотетическая схема позволяет объяснить закономерности, характерные для начальных этапов процесса. Вопрос о том, почему процесс имеет столь низкую глубину окисления и тормозится задолго до исчерпания субстрата остается пока открытым. Выяснение этого вопроса, а также установление элементарных стадий реакции требуют дальнейших исследований.

ВЫВОДЫ

1. С использованием люминофоров, для которых определен диапазон оптимальных концентраций, изучены макрокинетические закономерности хемилюминесценции в водных растворах аминокислот и перекиси водорода. Показано, чтохемилюминесцен-ция сопровождает процесс окисления аминокислоты.

2. Идентифицирован один из основных продуктов реакции.

3. Предложена гипотетическая схема реакции.

4. Показано, что при циклических изменениях температуры выявляется гистерезисноподобная зависимость интенсивности хемилюминесценции от температуры. Характер гистерезиса меняется в зависимости от стадии реакции.

Основные результаты работы изложены в публикациях:

1.Воейков В.П., Баскаков И.В. Использование жидкостного сцинтил-ляционного счетчика для анализа люминесценции. Н Докл.Акад.На-ук, 1994, Т.334, №2, с.234т236

2.Voeikov V.L., Baskakov I.V. Amino acid oxidation in water solutions is a highly ordered branched chain reaction: analysis of luminescence kinetics, in Biophotonics, eds. LV.Beloussov & F.APopp, Moscow, Bi-oinform Service, 1995 pp.139-155

3.Baskakov I.V., Voeikov V.L. Application of liquid scintillation counters of radioactivityfor measurementofultraweakjuminescerice provides additional information on underlying physico-chemical processes, in Biophotonics, eds. LV.Beloussov & F.APopp, Moscow, Bioinform Service, 1995 pp.447-456

4.ВоейковВ.Л., Баскаков И.В. Изучение кинетики хемилюминесценции в водных растворах аминокислот в присутствии перекиси водорода и бромистого этидия// Биофизка, 1995, Т.40, вып.6, с.1150-1157

5.Баскаков И.В., Воейков В.Л. Температурная зависимость хемилю-минесценции в водных растворах аспартата в присутствии перекиси водорода и бромистого этидия. Биофизика. 1995, Т.40, вып.6. с.1141-1149

6.Воейков В.Л., Баскаков И.В., Кафкапиас К., Налетов В.И. Сверхслабое УФ-облучение или перекись водорода инициируют цепную реакцию дезаминирования глицина в водных растворах. Биоорганическая химия. 1996, Т.22. №1 с.40-48

7.Баскаков И.В., Воейков В.Л. В растворах аминокислот при УФ-об-лучении образуется субстанция с сорбционными свойствами, характерными для полимеров, и проявляющая активность глицин-де-заминазы. Биоорганическая химия. 1996, Т.22. №2

8.Воейков В.Л., Баскаков И.В., Кафкапиас К., Налетов В.И. Инициация УФ-светом сверх-низкой интенсивности и перекисью водорода вырожденно-разветвленной цепной реакции в водных растворах аминокислот. Тезисы 2 Международного симрозиума 'Механизмы действия сверхмапых доз", Москва, 1995, с126-127.