Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция осмолитами дегидрогеназ из организмов с разной галотолерантностью

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Регуляция осмолитами дегидрогеназ из организмов с разной галотолерантностью"



сс: Гч.

На правах рукописи

Сабурова Екатерина Андреевна

РЕГУЛЯЦИЯ ОСМОЛИТАМИ ДЕГИДРОГЕНАЗ ИЗ ОРГАНИЗМОВ С РАЗНОЙ ГАЛОТОЛЕРАНТНОСТЫО.

0.3 00 02 - биофизика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Пущино - 1997

Работа выполнена в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАЛ

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор Б.И. Курганов

Доктор биологических наук Ю.В.Балнокин

Доктор биологических наук, профессор Э.А.Бурштейн

Ведущая организация:

Институт биофизики клетки РАН, Пущино

/ч 30

Защита состоится 29 ОКТЯБРЯ 1997г. в ' ^ час. на заседании диссертационного совета Д 200.22.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142292 Пущино Московской обл. ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИТЭБ РАН Автореферат разослан <В<£//'??<рфЗт1т.

Ученый секретарь - -1

И/ПИ*! 11 I 4 I !

диссертационного совета г ДСА.Нелипович

Symposium "The physical-chemical basis of the organization and function of the biological systems", Tbilisi, 1996r.

Экспериментальные доказательства существования регуляции основными внутриклеточными осмолитами органической и неорганической природы активности определенного класса ферментов, дегидрогеназ. Обнаруженные сходства и различия в регуляции дегидрогеназ в ряду организмов с различной галоголерантностыо.

Предложенные новые кинетические механизмы ингибирования и активации ферментов ионами нейтральных солей, являющихся основными неорганическими осмолитами живых клеток, путем связывания их в специфических центрах фермента на разных стадиях образования промежуточных комплексов.

Разработка подхода для анализа механизмов влияния органических осмолитов на ферментативный катализ с участием дегидрогеназ с различными лимитирующими стадиями реакции.

Выявление зависимости между кинетическими свойствами ферментов галоголерантных организмов и направлением метаболических процессов в клетке во время осмотического шока, позволяющей оптимально использовать кофермент для синтеза глицерина в клетках D. salina, и максимально сохранить активность и стабильность дегидрогеназ у //. salinarium.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Лактатдегвдрогеназу (КФ. 1.1.1.27) (ЛДГ) из скелетных мышц свиньи (изоформу . М4) выделяли по методу (Jecsai, 1961), включающему фракционное высаливание и 4-кратную перекристаллизацию в растворе сульфата аммония. Дополнительную очистку проводили с помощью ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ сефадексом А-50 (Pharmacia, Польша). Препарат был гомогенным согласно алектрофоретическим данным.

Алкогольдегидрогеназу (АДГ) из печени лошади использовали фирмы «SIGMA». Карбоксиметилирование АДГ по остатку Cys46 проводили с помощью йодацетата в присутствии имвдазола (Reynolds et al., 1975).

В работе использовали штамм водоросли Dunaliella salina Teod. IPPAS D-209 из коллекции водорослей Института физиологии растений РАН. Водоросли CMamydomonas reinhardtii Pang, получены из коллекции водорослей Института почвоведения и фотосинтеза РАН, Пущино. Для выращивания культуры D.salina использовали метод Владимирова, Семенекко, [1962J, С. reinhardtii-метопом Ладыгина [1970].' Приготовление клеточного экстракта. Клетки водорослей, отмытые в 0.9% растворе NaCl, растирали в присутствии ингибиторов протеаз PMSF, 1мМ бензомедина, 5мМ аминокапроновой кислоты, а также 1 мМ ЭДТА, 5 мМ ДТГ, при температуре 0°С. Полученный бесклеточный гомогенат центрифугировали в течение 15мин при 25 тыс. об/мин. Активность ЛДГ в таком гомогенате уменьшалась вдвое в течение 2 часов при 0°С. Наши результаты по изучению тепловой стабильности ЛДГ показали, что

активность фермента можно сохранить в течение 3 недель, если с момента растирания клеток в раствор добавить 0.5 мМ NADH и хранить в 30% растворе глицерина при -9°С.

Электрофорез суммарных фракций растворимых белков из микроводорослей и частично очищенных фильтрацией через сефадекс G-25 проводили в нативных условиях в 7% ПААГ. Гель-электрофорез ПБК проводили по методике (Peter, Tomberg, 1987)

Галофильные бактерии Haiobacterium salinarium штамм 353 (Пущинский) выращены методом Чекулаевой и др., [1975], и взяты в логарифмической фазе роста. Для приготовления клеточного экстракта клетки Н. salinarium дважды промывали от культуральной среды 100 мМ трис-HCl буфером рН S.0, содержащим 4M NaCl и осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 5 тыс. об/мин. Отмытые клетки разбавляли буфером в соотношении 1:4 по объему и разрушали в гомогенизаторе растиранием с кварцевым песком в течении 20 мин при температуре 18°С. Далее в гомогенат добавляли ДНК-зу в количестве 1 мкг на мл раствора и инкубировали при 37°С в течение 2 часов для разрушения нуклеиновых кислот и уменьшения вязкости экстракта. Далее этот раствор центрифугировали 30 мин при 17 тыс. об/мин, после чего надосадочную жидкость еще раз центрифугировали при 30 тыс об/мин. Супернатант использовали в работе для изучения активности ферментов. Активность исследованных нами ферментов сохранялась до 95% в течение недели.

Грубую очистку ферментов из водорослей и бактерий осуществляли путем фракционирования высаливанием сульфатом аммония.

Кинетику реакции регистрировали по изменению оптической плотности в полосе поглощения NADH при 340 нм на спектрофотометре Specord М-40 (Карл Цейс, ГДР)

Кинетические параметры - максимальную скорость реакции и константу Михаэлиса, находили из зависимости 1/v от 1/[S] с помощью метода наименьших квадратов. Статистическую обработку полученных данных проводили на ЭВМ при использовании пакетов стандартах программ.

Измерения скорости инактивации ДГ при низких концентрациях соли. Раствор клеточного экстракта из Н. salinarium, содержащий 4 M NaCl в 0.1 M трис-HCl буфере, разбавляли тем же буфером до заданной концентрации соли и через определенные промежутки времени измеряли активность ДГ. Для этого из инкубационной смеси брали 100 мкл этого раствора и добавляли к 2 мл реакционен смеси, содержащей 10 мМ NADH, субстрат в 0.05 M трис-HCl буфере рН 8.5, содержащем 2 M КС1.

Спектры кругового дихроизма измеряли на спектрополяриметре "Jasco, J-40" (Япония). Спектры флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре "Hitachi 850."

Калориметрические измерения проводили на сканирующем адиабатическом дифференциальном микрокалоримстре ДАСМ-4 с объемом измерительной ячейки 0.50 мл. Оптимальная скорость прогрева растворов белков, при которой была выполнена основная часть измерений, составляла 1 К/мин. Высокая воспроизводимость базовой

линии позволяла определять парциальную теплоёмкость белка в растворе с концентрацией 1.0-3.0 мг/мл.

Ультрацентрифугирование проводили на аналитической ультрацентрифуге Bectanait Model Е при скорости ротора 50740 оборотов в минуту. (ЛДГ| -2 мг/мл , 0.05 М фосфатный буфер, рН 7, при 20°С.

ГЛАВА 2. ВЛИЯНИЕ НЕОРГАНИЧЕСКИХ ОСМОЛИТОВ (НЕЙТРАЛЬНЫХ СОЛЕЙ)

НА КАТАЛИТИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ. 2.1. НЕГАЛОФИЛЬНЫЕ ОРГАНИЗМЫ. Характер взаимодействий белков, в особенности ферментов, различных организмов с ионами нейтральных солей представляет интерес не только в плане изучения механизмов адаптации организмов к высоким концентрациям солей, но и для понимания динамики поведения белковой макромолекулы в растворах с низким химическим потенциалом. При больших концентрациях (порядка нескольких молей) ионы нейтральных солей приводят к изменениям стабильности белковых макромолекул, к диссоциации субъединичных белков. В то же время известно, что многие кинетические и термодинамические характеристики катализа чувствительны к изменениям в области низких концентраций •солей, при которых не обнаруживаются структурные изменения макромолекул. Такие взаимодействия происходят с высоким сродством и аналогичны специфичным фермент-субстратным взаимодействиям. Они не описываются в рамках электростатической теории Дебая-Хюккеля или теории растворимости Тенфорда (Tenford 1972|, поэтому необходимо было проведение исследований механизмов связывания некоторых анионов в специфических центрах ЛДГ и влияния его на кинетику, а также в выяснении, какие свойства анионов, определяют изменение кинетических параметров реакции.

В области рН 6.0-8.0 происходит резкое изменение в кинетике ЛДГ из мышцы свиньи: с повышением рН уменьшается сродство фермента к пирувату и снимается ингибировакие избытком пирувата (рис. 1). Значения Км по пирувату при разных рН, полученные из кривых Лайнуивера-Берка, приведены на рис, 3. Из этих кривых видно, что рКэфф. ионизующейся группы, от которой зависит сродство пирувата, равно 7,7. Vma> не зависит от рН. Влияние анионов на ферментативную активность ЛДГ исследовали в интервале рН 6.2-8.5 в области низких концентраций пирувата (ненасыщающих) и в области ингибирующих концентраций. На рис. 2 приведены зависимости начальной скорости реакции от концентрации пирувата в присутствии различных анионов нейтральных солей, в обратных координатах, для области низких концентраций пирувата (до 0.5 мМ). Для каждого из анионов получены аналогичные зависимости при нескольких концентрациях, на графике приведены типичные кривые для одного значения концентрации каждого аниона. Все исследуемые анионы ингибируют реакцию. Наиболее сильным ингибитором является ион CIO4", самым слабым - ион S042\ Максимальная скорость реакции не изменяется при добавлении анионов в реакционную смесь, наклоны кривых являются функцией концентрации анионов, что указывает на чисто конкурентный механизм для всех исследуемых анионов. На рис. 3 приведены

Рис. 1. Зависимость скорости восстановления пи-рувата от его концентрации при различных значениях рН (цифры у кривых). [ШН]=2,5-• 10-* Л; [ЛДГ] = =0,5 мкг1мл\ 0,1 М На-фосфатный буфер, 20"

Ю 15 20

Рис.2. Зависимость скорости реакции 'восстановления пирувата от концентрации пирувата (при неингибирующих) в присутствии разных анионов: 1 — без анионов; 2 - 1 М Б04 2", 3 - 0.6 М С1", 4 - 0.6 М N03-, 5 - 0.2 М I", 6 - 0,025 М С104-. [ЛДГ]=1 мкг/мл; [ЫА1)Н]=1.4 10"4М, 0.1 М Na-фocф. буфер, рН 6.2; 19°С.

Рис.3. Зависимость логарифма константы диссоциации К\ анионов С1" и Г от рН. Прерывистой линией показана зависимость логарифма Кк по пирувагу от рН .

зависимости константы ингибирования (диссоциации) Л] анионов от рН, вычисленные по уравнению для конкурентного ингибирования:

'(Х1/{[й|+Км(1+(1|/А'[)( в области низких концентраций пирувата (до 0.5 мМ) В области рН 6.8 — 8.0 наблюдаются изменения константы ингибирования, причем рК переходов для различных анионов совпадают между собой и близки к рК активной группы №195. Сродство анионов к участку связывания на ферменте падает по мере повышения рН и коррелирует с уменьшением доли ионизованного Н15195.

Из этих данных следует, что анионы непосредственно не взаимодействуют с • Н15195, а находятся в контакте с другой положительно заряженной группой, заряд которой не зависит от рН по крайней мере до 8.5. Мы считаем, что такой группой является гуанидиновая группа Аге 171. По данным рентгеноструктурного анализа эта группа участвует в связывании аниона — изоцитрата (АЪай-ХараЮго С. сХ. а1, 1987].

Произведена оценка влияния протонирования №5195 на величину энергии электростатического взаимодействия аниона СГ с тремя группами №$195, А^171, Лгй 109, расположенными в активном центре ЛДГ (расстояния между группами взяты из рентгеноструктурных данных). Изменение электростатической энергии связывания аниона с такой системой при протонировании Ш$195 составляет' ДЕЭл.~ 0.33 кТ. Поскольку свободная энергия связывания аниона с ферментом равна логарифму константы диссоциации аниона (по уравнейию Вант-Гоффа), а в нашем случае К\ — константа равновесия, ибо реакция протекает квазистационарно и ингибирование анионом обратимо, то можно видеть из табл.1, что для каждого из рассмотренных одновалентных анионов величина 1п[А!1(рН8.5)/А5(рН6.2)], вычисленная из экспериментально полученных значений констант, по порядку величины хорошо согласуется с этим значением.

Таблица 1. Значения энергии гидратации анионов Епщр, термохимического радиуса г и константы диссоциации аниона (из данных ферментативной кинетики для ЛДГ).

Анион г, А Егнлр, ккал/моль* К\ (рН 6.2)|М] К{ (рН 8.5) [М]

БО^" 2.30 -249 2 »1

Р" 1.33 -112 0.6+Д.05 1.55±0.2

С1- 1.81 - 79 0.4 ± 0.05 1.4+0.2

ГМОз" 1.89 - 69 0.185 ±0.015 0.35 ±0.05

I- 2.20 - 64 0.1 ± 0.01 0.22 +0.03

СЮ4- 2.36 - 50 0.05 ± 0.01 0.11 ±0.02

* - Крестов [1973]

При расположении анионов в ряд по эффективности влияния на кинетику ЛДГ оказывается, что этот ряд совпадает с хорошо известным рядом Гофмейстера (лиотропный ряд). Известно, тго лиотропный ряд определяется такими параметрами ионов, как энергия гидратации, валентность и радиус иона. Для выяснения ответа на вопрос о том, какие физико-химические свойства ионов определяют относительную

эффективность связывания, мы сопоставили константы диссоциации анионов с их зарядами, радиусом и энергией гидратации (табл. 1). Как видно из табл. 1, корреляция межу эффективностью связывания и термохимическими радиусами и зарядом не наблюдается, в то же время величина К\ коррелирует со значением энергии гидратации во всем исследуемом ряду анионов.

Связывание анионов в специфических центрах фермента происходит с высоким сродством (децимоли) по сравнению с влиянием их на растворимость аминокислотных остатков (несколько молей). Мы считаем, что связыванию предшествует дегидратация аниона, которая и определяет относительную эффективность связывания.

Полученные данные приводят к следующему заключению: 1) анионы нейтральных солей являются конкурентными ингибиторами ЛДГ по отношению к пирувату при низких концентрациях пирувата; 2) связывание анионов в активном центре зависит от ионизационного состояния функционального №195; 3) установлена корреляция между эффективностью анионос как ингибиторов ЛДГ и энергией гидратации этих анионов.

Влияние анионов на стационарную кинетику реакции в условиях субстратного

Рис. 4. Зависимость начальной скорости реакции восстановления пирувата V от концентрации аниона С Г при различных ингибирирующих концентрациях пирувата: 1—10, 2-15, 3-20, 4-30, 5-50 мМ. Условия реакции: 0.01 М Ыа-фосф. буфер, рН 6.0; [ЫАОН]: 1.4-10"4 М, (ЛДГ]: I мкг/мл, 20°С. б— Те же кривые в координатах:

{1б!(Утах^)А-УшЬ])1; ДО-».

в—Зависимость эффективных констант диссоциации К\ ^ анионов С1~ (I) и I" (2) от концентрации пирувата

В предыдущей главе были представлены данные по влиянию анионов солей на кинетику этой реакции в области низких концентраций пирувата, в этой главе приведены результаты кинетического исследования в области высоких концентраций пирувата. При концентрации пирувата выше 1 мМ активность ЛДГ падает (рис. 1) за счет образования необратимого тройного комплекса Е^АЛ-руг. [Курганов Б.И., 1972, Ои1йгешк1, 1975] При концентрации пирувата » ЛТм СГ активирует фермент, увеличивая скорость реакции почти в 4 раза (рис. 4)

Анализ кинетики снятия пируватного ингибирования анионами приводит к заключению, что этот эффект м жно объяснить конкуренцией аниона за субстрат-связываклций участок активного центра в непродуктивном ингибиторном комплексе'Е-NAD-pyг. Схематически это можно представить следующим образом:

ингиоиринания.

0,1 [С1'].М

>lc' , E "j4"1 - активный комплекс, 1 - ингибиторная

Epyr i^E I ~Ead. форма пирувата, A - анион,

k-4 E,nad - епродуктивный комплекс, E0()d -

t2 A'

аддуктный комплекс (необратимый).

: у \ Каталитическая реакция с константой скорости

£ - к\ - наиболее медленная стадия процесса.

При высоких концентрациях пирувата ((S1>>A"m,) анионы не способны вытеснить субстрат из активного комплекса, но могут вытеснять субстрат из тройного непродуктивного комплекса E-NAD-pyr. Вытеснение анионами пирувата из тройного непродуктивного комплекса приводит к эффективному уменьшению сродства к NAD и снятию пируватного ингибирования. Выражение для стационарной скорости реакции в условиях насыщения фермента NADH и пируватом исходя из этой схемы имеет вид:

=к\В0

И ] <к2к, + к2к, + (к.¡к, + к_2к_х + +- кгк, + №,*2 + к,к, )К4 V ] При определенных допущениях относительно констант скоростей это уравнение сводится к следующему:

'/^-1/Ктах 1 , ,' 1 Ктщ - 1 '

КА

где Ущщ и Утах скорости реакции при А=0 и А -»со соответсвенно.

Из приведенной схемы следует, что эффективная константа диссоциации АГд анионов (по конкуренции в тройном непродуктивном комплексе) зависит от концентрации ингибитора - пирувата, зависит от концентрации пирувата). Мы определили

истинное значение (АГа)ист для анионов С1" и I" , не зависящее от концентрации пирувата. Значение (Лд)Ист ДЛЯ С1- составляет 50 мМ, для I" - 27 мМ. Анион 1", так же как и С1~, снимает пируватное ингибирование, но с большим сродством к ферменту.

Эта схема применима и для объяснения снятия субстратного ингибирования при рН>8 (рис. 1), если рассматривать в качестве аниона ОН". Снятие ингибирования анионом ОН" происходит при смещении рН в щелочную область, при котором №$195 в активном центре фермента депротонируется.

Исследование влияния катионов нейтральных солей на каталитические характеристики ЛДГ. Исследовано влияние ряда солей, различающихся катионами, на каталитические характеристики ЛДГ, полученные методами стационарной кинетики. Для однозаряженных катионов вид катиона не влияет на Км по пирувату, Ушах не зависит от концентрации соли. Добавление двухзарядных катионов в реакционную смесь приводит к незначительным изменениям Ушах, но не изменяет сродства пирувата к ферменту. Исключением являются соли ртути и серебра. Эти катионы связываются с

БН-группами белка, что приводит к полной или частичной инактивации в зависимости от расположения БН-группы на белке.

В работе исследованы КД -спектры ЛДГ в области полос 280 нм (белок) и 350 нм (кофермент) и спектры люминесценции холофермента в области 350—450 нм в присутствии разных солей- При увеличении концентрации одновалентных ионов до 1М и Еи3+до 2.5 10~4 М КД-спектры ЛДГ не изменяются в полосе поглощения пептидных групп и ИАОН (наведенного Копон-эффекта).

Таблица 2. Влияние соли на значения (Хм)эфф по пирувату и Ушах для реакции дезаминирования пирувата, катализируемой ЛДГ из мышцы свиньи в присутствии разных катионов (хлориды соответсвующих металлов, для отдельных катионов

Вид катиона Концентрация соли (М1 (-Км)зфф по пирув. по сравнению с №01 Ушах по сравнению с №С1

N114"'" 2 не изменяет не изменяет

К+ 2 не изменяет не изменяет

Ыа+ 2 не изменяет

Си2+ 0.3 не изменяет уменьшает на 10-15%

М82+ 1 не изменяет уменьшает на 10-15%

Ре2+ 0.1 не изменяет уменьшает на 10-15%

гп2+ 0.1 не изменяет уменьшает на 10-15%

НЁ2+ и А8+ моль/моль БН-групп образуют связь с БН- группами белка, и полностью ингибируют.

Еи3+ (2.5 *10-4 М) уменьшает от 0.9М (без соли) до 0.5 М не изменяет

Изучение характеристических частот в электронно-колебательном (ЭК) спектре комплекса Еи3+с ЛДГ (580-700 нм) методом Золина В.Ф. и Кореневой Л.Г., [19801 показало, что европий, в отличие от ртути и серебра, не связывается с БН-группами, а предпочитает в своем окружении фосфатные или карбоксильные группы (из анализа относительной интенсивности люминесценции электронных переходов и их штарковской структуры). По кривым насыщения фермента европием, полученным по изменению интенсивности люминесценции КАЛН, константа диссоциации Еи+3 в комплексе с КАБН равна 1.8 -Ю"5 М, в комплексе с ЛДГ-МАОН она составляет 5-10~4М.

Из кинетических результатов следует, что европий является синергестическим активатором ЛДГ и не только не ингибирует фермент, но может являться регулятором его активности, приводя к увеличению сродства фермента к субстрату. И хотя биологическую значимость такой регуляции пока трудно оценить, но несомненная информативность такого комплекса ие исключает его возможного применения в лечебной диагностике, например, при использовании индуцированной или спонтанной хемилюминесценции тканей организма.

Приведенные результаты исследования влияния ионов нейтральных солей на катализ показывают, что пул ионов, создающий основной осмотический балланс клетки, специфическим или неспецифическим способом может участвовать в каталитических процессах, происходящих в цитоплазме интактных клеток.

2.2 ГАЛОФИЛЬНЫЕ ВОДОРОСЛИ. Увеличение концентрации глицерина в клетках экстремально галофильных водорослей D.salina в ответ на изменение концентрации соли во внешней среде сопровождается увеличением также и концентрации соли внутри клеток с последующим снижением ее до стационарного состояния (Ginzburg, 1986]. Хотя ионный гомеостаз, присущий этим одноклеточным организмам, обеспечивает низкий уровень концентрации соли в цитоплазме (0.15-0.2 М КС1), при релаксационных изменениях во время осмотического шока концентрация соли внутри клеток может подниматься до 0.5 М (Спекторов К.С., 1991). Отсутствие в литературе данных по каталитическим характеристикам цитоплазматических дегидрогеназ из этих водорослей обусловлено трудностью их выделения из-за нестабильности их в обычных условиях in vitro. Нашей задачей было найти условия работы с этими ферментами in vitro и получить каталитические константы при изменении концентрации соли, а также других внутриклеточных осмолитов.

На основе полученных нами кинетических данных выработаны условия выделения клеточного экстракта D. salina , позволяющие получить высокую активность фермента (ЛДГ) и сохранять его в течение недели без изменения активности. Были исследованы зависимости стационарной скорости реакции восстановления пирувата, катализируемой ЛДГ из галотолерантной водоросли D. salina и гликофильной С. reinhardtíi, от концентрации солей КС1 и NaCl. Кривые хорошо линеаризуются в координатах Лайнуивера-Берка вплоть до концентраций пирувата ЗОмМ. Ингибирование избытком субстрата (пирувата), присущее ферментам из млекопитающих, отсутствует у обоих водорослей. Добавление солей КС1 и NaCl в реакционный раствор приводит к ингибированию фермента по строго конкурентному механизму (с пируватом и NADH) для обеих водорослей: эффективные константы Михаэлиса увеличиваются с ростом концентрации соли для пирувата и NADH, VmM остается постоянной.

Кинетические исследования показали, что катионы нейтральных солей К+ и Na+ не отличаются по влиянию на ферментативную активность ЛДГ из обеих водорослей, ингибиторный эффект нейтральных солей вызван связыванием аниона СГ в активный центр ЛДГ. Анионы С|" конкурируют с пируватом и с NADH в реакционном центре ЛДГ, что приводит к ингибированию активности фермента, как в ЛДГ из мышцы свиньи (глава 2.1.). Величины Vmax и К\ для С1~, рассчитанные из кривых Лайнуивера-Берка, как функции концентрации соли, приведены на рис.5 и в таблице 3 соответственно.

Рис. 5. Зависимость Км по пирувату и Ушах для реакции восстановления пирувата, катализируемой ЛДГ из микроводорослей 2?. Шиш (А) и С. гетЬаг&и (Б) от концентрации соли №С1. Замена соли ЫаС1 на КС1 не изменяет результатов.

Значения констант диссоциации комплекса фермента с С1\

рассчитаные по уравнению величине: для фермента из Д.и/шл: значения К\ в 2 раза выше, чем из С. гс'шЬагёШ и в 2 - 3 раза выше, чем стационарная внутриклеточная концентрация соли.

Таблица 3. Значения константы диссоциации К\ комплекса С|" с ЛДГ из разных по галотолерантности организмов.

Полученный результат говорит о том , что каталитические параметры ЛДГ из 0.$аИпа менее чувствителъны к изменению концентрации соли, чем фермента из С.гс'тЬагйт и мышцы. По-видимому, большое , т.е. низкое сродство С1~ к активному центру ЛДГ (слабая конкуренция с субстратом) защищает клетки Р.хаНиа от больших изменений внутриклеточной концентрации соли при изменении внешних осмотических условий.

2.3. ГАЛОФИЛЬНЫЕ БАКТЕРИИ. К настоящему времени довольно подробно изучены основные метаболические процессы, обеспечивающие жизнедеятельность экстремально галофильных бактерий Н. Ыишшп. Однако отсутствуют данные по механизму влияния на ферментативный катализ солей, являющихся основным осмолитом и наибольшим (по весовому количеству) компонентом среды. Задачей настоящего исследования было изучить каталитические характеристики цитоплазматических ферментов в экстрактах клеток галофильных бактерий и влияние на них основного внутриклеточного осмолита - соли, и оценить значение соли в регуляции активности дегидрогеназ.

для конкурентного ингибирования, различаются по

Изучаемый объект К[, С1", по конкуренции с

пируватом КАОН

ЛзаИла (галофильн) 1.2+0.1 0.72+0.1

С.гетЬагЛ. (негалофильн.) 0.43±0.05 0.28±0.05

мышца свиньи 0.4±0.05 -

а л а н и к д е г и д р о ге н л за

глю там атдегидрогеназа

Рис.2.3.1. Зависимость активности АЛДГ, ГДГ и ЛДГ из И. БаИпапит от концентрации соли КС1и№С1. 30 мМ пирувата (А, С); ЮмМ а-кетоглютарата (Б); 0.25 мМ КАИН, 0.05М трис-НС! буфер, рН 8.5 для восстановительны;! реакций (ось слева);

10 мМ МАИ;

10 мМ аланина (А), 50 мМ глютамата (Б) и 100 мМ лактата (В) , 0.05 М трис-НС1 буфер, рН 9.5 для окислительных реакций (ось справа). Количество клеточного экстракта -50 мкл.

лактатдегидрогвназа

Зависимость стационарных скоростей прямой и обратной реакций, катализируемых АЛДГ, ГДГ и ЛДГ от концентраций соли (рис. 6) проявляет три особенности, характерные для ДГ из галофильных бактерий. Во-первых, активность всех трех ДГ максимальна в интервале концентраций соли 2-3 М. Во-вторых, при концентрации соли меньше 1.5 М скорость окислительных процессов (лакгата, аланина и глютамата) резко снижается, достигая нуля уже при 0.8 М соли (для ЛДГ это относится и к прямой реакции). В-третьих, скорость реакций выше в растворе KCl, чем NaCl, причем, если для прямой реакции различия в активности фермента в присутствии ионов Na+ и К+ составляют 25%, то для обратной реакции скорости различаются в несколько раз.

Влияние соли на реакцию восстановительного аминирования. Для того, чтобы понять, как зависят от концентрации и вида соли отдельные стадии реакции, были исследованы методом стационарной кинетики кривые насыщения АЛДГ, ЛДГ и ГДГ по субстратам и коферменту в растворах NaCl и KCl. (наиболее характерные из них даны на рис. 7). Значения Км и V^, полученные из этих кривых, даны в таблице 4. Как видно из табл. 4, сродство к каждому из субстратов реакции восстановительного аминирования (АГМ) не зависит от концентрации соли NaCl и KCl. Тот факт, что Ки по пирувату не зависит от концентрации соли , означает, что ион С1" не является конкурентным ингибитором даже при концентрации соли , равной 4 М. Пируват, имея отрицательный заряд, конкурирует 'с ионом С1" за связывание в активном центре ЛДГ из млекопитающих (глава 2.1). Отсутствие конкуренции иона С1" с а-кетокислотой за связывание в активном центре фермента является свойством, присущим всем изученным нами ДГ из галофильных бактерий Я! salinaiium.

Сродство NH)+ как субстрата также не зависит от концентрации KCl и NaCl (рис.7 Б). Это означает, что катионы Na+ и К+ не конкурируют с NH,»+ при связывании его в активном центре АЛДГ по крайней мере до концентраций 4 М.

Влияние соли на реакцию окислительного дезаминирования аланина. Для того, чтобы понять, какая стадия реакции ответственна за активацию ионом К+, мы изучили, как зависят величины V,nM и А'м по различным субстратам от концентрации соли.. Как видно из кривых зависимости начальной скорости реакции дезаминирования аланина, катализируемой АЛДГ, от концентраций аланина и NAD (рис.7 Д, Г), Vmax, а также и сродство к субстратам увеличиваются при замене соли NaCl на KCl (табл. 4).

Изучение КС1-акгивирующего эффекта в присутствии NaCl показывает, что ион Na+ является конкурентным по отношению к К+ (рис. 8). Эффективная константа диссоциации для К+, вычисленная из кривых зависимости V,^ от концентрации KCl, зависит от концентрации ионов Na+ в растворе: Значения Ко эфф равны 0.1, 0.4 и 0.6М в растворах с концентрациями NaCl 0.6, 1.6 и 4 М соответственно.

Из данных стационарной кинетики, полученных нами для трех ДГ следует, что характерными чертами ферментативной кинетики галофильных ферментов, которые отличают их от негалофильных аналогов, являются: 1) отсутствие субстратного ингибирования для восстановительных реакций, 2)наличие специфических центров

2 3

1/пируват, ImMI

1 / [NH4CI]. М"

1- 2М NaCI

2- 2М KCl

' 1/NADH х ID"«, [M-'l 1/INAD].mM-1

Рис. 7. Кривые насыщения АЛДГ из И. salmarium по субстратам: пирувату - A, NH4CI - Б, NADH -В, в реакции аминирования пирувата и по аланину - Г; и NAD

- Д , в реакции дезаминирования аланина при разных концентрациях соли. Кривые 2 и 3 на рис. Б измеряли при суммарной концентрации соли, равной 4M (по мере увеличения концентрации NH4CI концентрация NaCI и KCl уменьшали. Кривые насыщения для каждого из субстратов снимали в условиях насыщения другого субстрата, кроме NH4CI. [пируват]

- 30 мМ, [NADH]: - 0.2 мМ, (NH4CII - 0.15 М; 0.05 М трис-НС1

буфер, pH 8.5. Количество клеточного экстракта 50 мкл. [аланина] и [NAD]: 50 мМ и 10 мМ на рис. Г и Д соответственно.

1/аланин, мМ"'

связывания К+, приводящих к активации ДГ; 3) отсутствие конкурентного ингибирования анионами СГ. Для негалофильных ферментов ион С1~ является ингибитором, конкурентным с этими субстратами. Возможно, что низкое сродство СГ с активным центром галофильного фермента связано с большим отрицательным зарядом на поверхности фермента (галоф. МДГ имеет полный заряд -156 по сравнению с +16 для ЛДГ из акулы [Оут О. 1995]). Сродство отрицательно заряженных субстратов (Км) также на порядок величины ниже у галофильных ДГ (табл. 4.).

m l(Vmax-V)/ (V-Vmin)l

(КСЦ, М

Рис. 8. Зависимость максимальной скорости реакции восстановления пирувата Vum , катализируемой АЛДГ из Н. salinarium от концентрации KCl -А, (в логариф-мических координатах-Б), с разным содержанием NaCl в растворе: Кривая 1- 0.6 М ; 2- 1.6 М, 34 М.

Второй особенностью ферментативной кинетики дегвдрогеназ из галофильных бактерий является активация ферментов катионом К+. Активация калием происходит по разному механизму для трех ДГ: для ГДГ присоединение К+ увеличивает Vmax в два раза, но не изменяет Ам ДЛЯ субстратов и кофермента, для ЛДГ Vmax увеличивается в присутствии К+ более, чем в 15 раз. По данным Aitken D.M. and Brown A.D [1969], Eisenberg H. et al., [1992] 8 исследованных ими ферментов цитратного цикла из Halobacterium sali ruin um имеют активность в растворе KCl значительно выше, чем в NaCl, хотя кинетический механизм такой активации авторами не исследован.

Наши эксперименты по влиянию иона NH<i+ на скорость дезаминирования аланина, катализируемого АЛДГ, показывают, что NH4+ также увеличивает активность АЛДГ, однако механизм активации отличается от активации калием. Ион NH4+, в отличие от К+, не изменяет сродство аланина и NAD к ферменту, но увеличивает Уш;и в 10 раз. Причем сродство иона NH4+ к этому центру на порядок величины выше, чем сродство К+ (Ко ДЛЯ NH4+ равно 0.025 М, для К+ - 0.4 М).

Из величин Kd для NH4+ и К+ видно, что ферменты активируются этими катионами при концентрациях соли значительно ниже тех, при которых происходит гибель клеток. Гибель клеток Н. salinarium, по нашим данным, начинается при снижении NaCl во внешней среде ниже 2 М. Таким образом, все три ДГ могут работать в клетке во время осмотического шока с максимальной эффективностью.

Таблица Д. Влияние солей №С1 и КС1 на Угоах и Ки для субстратов прямой и обратной реакций, катализируемых дегндрогеназами из N. язИпапшп. За 100% принята активность фермента п 4М ЫаС1. АЛАНИНДЕГИДРОГЕНАЗА

Субстрат 4М №С1 4М КС1 0.1М NaCl

Ам (тМ| V % ¥ тах*'0 Ям [тМ] Км (шМ|

ЫАОН 0.071+ ±0.007 100 0.071± +0.007 120+10 0.071+ +0.007 110±

Пируват 0.83+ ±0.008 100 0.83+ ±0.008 120+10 0.83± ±0.008 115+

ын4сг" (1±0.1)* 103 - (1±0.1)* 103 - -

Алании 20± 0.9 100 2.9±1.2 §00±100 -

NAD 3.3+0.3 100 1.1±Л 800±100 -

ГЛЮТАМАТДЕГИДРОГЕНАЗА

Субстрат 4М N301 4М КС1 0.1М N301

Км [тМ] Км [шМ] Хм [тМ] Ушах

1ЧАОН 0.028± ±0.002 100 0.028± ±0.002 120+15 0.028+ ±0.002 -

а-кетоглютарат 2.5+ +0.2 100 2.5± ±0.2 120±15 2.5± ±0.2 -

N11401"' (0.41+0.1) * 103 - (0.41+0.1)* 103 - (0.41±0.1) * Ю3 -

NAD 0.41+0.03 100 0.41+0.03 200±26 - -

глютамат 16.6+ 0.9 100 16.6± 0.9 200±26 - -

ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗА

Субстрат 4М КаС1 4М КС1 0.1М N801

Км ¡тМ] УшмЛ Км [шМ] Ушах»^ Юл |тМ) ^таХ' %

ЫАБН 0.091+ ±0.007 100 0.098+ +0.015 110+20 - -

пируват 1.03± ±0.1 100 0.52+ ±0.07 115±20 - -

КАО 4.5+0.5 100 3.8+.0.5 1000±150 - -

лактэт 30± 5 100 22±2.5 1100+150 - -

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ОРГАНИЧЕСКИХ ОСМОЛИТОВ НА КАТАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТАРИСТИКИ ФЕРМЕНТОВ. 3.1. НЕГАЛОФИЛЬНЫЕ ОРГАНИЗМЫ. Присутствие органических осмолитов в клетке, таких, как глицерин и другие полиолы, изменяют физические параметры среды: вязкость, диэлектрическую проницаемость, коэффициент поверхностного натяжения. В настоящее время подробно изучены кинетические закономерности взаимодействия ферментов с субстратами и коферментами, влияния эффекторов (активаторов и ингибиторов), pH, температуры на катализ. Менее изучено влияние таких параметров среды, как вязкость и диэлектрическая проницаемость. Между тем, исследование воздействий указанных факторов на каталитические свойства ферментов могут иметь существенное значение для выяснения механизмов биокатализа, в частности, идентификации роли информационных переходов и электростатических эффектов в реализации каталитического акта. Например, известно, что при некоторых заболеваниях, сопровождающихся кристаллизацией гемоглобина, вязкость крови изменяется; при злокачественном перерождении клеток костного мозга, синтезирующих глобулины, концентрация глобулинов в плазме может повышаться в несколько раз и тогда вязкость плазмы увеличивается [К. Каро и др., 1981]

Некоторые авторы исследовали влияние физических факторов среды на ферментативную кинетику [Laidler, 1953; Savish, Werber, 1979; Хоштария, 1988), однако немногочисленность данных и расхождения в интерпретации приведенных в них результатов не позволяют определить общие закономерности влияния указанных факторов на процесс катализа.

Чтобы понять, какой из этих параметров оказывает доминирующее влияние на катализ, мы исследовали каталитические характеристики в присутствии различных органических растворителей, низкомолекулярных и полимерных.

ЛДГ катализирует обратимую реакцию восстановления пирувата в лактат. Стадией, лимитирующей скорость реакции, является процесс конформационной изомеризации фермента в тройном фермент-субстратном комплексе. Нами была исследована кинетика реакции восстановления пирувата в растворах, содержащих различные концентрации веществ, увеличивающих вязкость среды инкубации. Использовали растворы сахарозы (0-43%), глицерина (0-63% по весу), этиленгликоля (0-50% по весу), а также растворы полимеров: полиэтиленгликоля (10%), полиакриламида (16%), поливинилового спирта (1%). Вязкость используемых растворов изменялась от 1 до 10 сПа (сантипуаз). В этих условиях наблюдалось значительное (почти в 10 раз) снижение максимальной скорости реакции (рис. 9). Аналогичный эффект получен при исследовании кинетики обратной . реакции (окисление лакгата). Значения Abat и Км по пирувату, полученные из кривых рис.9, приведены на рис. 10 и в таблице 5.

2 3 S(mM)

Рис. 10. Зависимость начальной скорости восстанов-ления

пирувата у (ААэ4о/мин), катализируемого ЛДГ из мышцы свиньи, от концентрации пирувата (S) в растворах глицерина: 1 - контроль; 2 -17%; 3 - 25%, 4 - 33%, 5 - 41%, 6 - 48%, 7 - 55% - , 8 - 63% (по объему); 0.5 М KCl, вязкость 1+10.3 сПз

Обнаруженная нами зависимость константы скорости реакции °т вязкости среды может Быть описана с помощью теории Крамерса (Kramers 1940; Gavish., Weiber, 1979). В этой теории преодоление энергетического барьера реакции рассматривается как результат непрерывного действия на реагирующие молекулы случайных сил, возникающих в результате столкновений с молекулами среды. Ключевым фактором в теории Крамерса является вязкость среды, определяющая интенсивность хаотического движения молекул растворителя, а также роль трения и системе. Эта теория дает явную зависимость константы скорости реакции от вязкости.

А(Пд,Т) = (A/iu) exp(-Ea/RT), (1)

где Еа - энергия активации, Т - абсолютная температура., и R-универсальная газовая постоянная, А - предэкспоненциальный множитель. Пд- параметр, описывающий диссипацию энергии (внутреннее трение) в процессе активационного перехода, т.е. локальную вязкость в области реакционного центра. Величина г)д связана с вязкостью растворителя ri соотношением: г|д = rj "5. Для всех изученных нами белков значения 6 лежат в пределах 0.7-0.9. Следовательно, можно сделать вывод: растворы с одинаковой вязкостью оказывают аналогичное влияние на скорость реакций независимо от природы растворителя. Для полимеров этот коэффициент ниже (8=0.45) возможно потому, что макровязкость, измеряемая вискозиметром в растворе полимера, больше, чем значение микровязкости среды, окружающей полимерную цепь.

Для понимания роли физических параметров среды в ферментативном катализе исследовано влияние вязкости среды на различные стадии реакции восстановления пирувата: образование фермент-субстратного комплекса, конкурентное ингибирование ионами С1~ (при |S]<KM), снятие субстратного ингибирования ионами С1" (при [S]> Км). Эти исследования показали, что значения К\ и Ад для С1~ (см. глава 2.1) не отличаются для водной среды, для 40% раствора сахарозы и для 50% раствора глицерина.

Рис. 10. Зависимость константы скорости Abat от вязкости среды Г| в двойных лога-рифмических координатах. Восстановление пирувата (ЛДГ): 1-сахароза (044%); 2-сахароза (0-44%), 0.5 M KCl; 3-глицерин (0-63%); 4-глицерин (0-63%Л 0.5 M KCl; 5 -растворы спиртов: О-метанол ( 0%, 10%, 30% ) ; А- этанол (0%, 10%. 30%); + - этиленглиноль (0%,30%, 50%); 6-растворы полимеров: о - контроль; + -полиэтиленгликоль (М.в. 600, 10%), • поливи-ниловый

спирт (1%); * - поли-этилен-гликоль (М.в. 6000, 10%, 11%); х полиакриламиц (16%). Окисление лактата: 7 -; Окисление этанола (АДГ): 8 -сахароза (0-44%), 9 - то же, что (8), но модифицированная АДГ.

Исследования, проведенные методом кругового дихроизма показали полную идентичность спектров фермента в водном буфере и в 30%-ном растворе глицерина, следовательно, в этих условиях кет изменений содержания а-спиральной структуры в белке, а также изменений в окружении остатков триптофана. Более тонкие изменения структуры фермента, влияющие на процесс катализа, не могут быть исключены, но как показано выше, добавление сахарозы и глицерина не изменяет регуляторные свойства фермента - образование ингибиторных комплексов и ингибирование анионами.

Полученные нами данные трудно объяснить в рамках классической теории активированного комплекса (теории абсолютных скоростей реакций), которая разработана для реакций в газовой фазе и предполагает, что преодоление энергетического барьера реакции происходит эа счет энергии единичного акта столкновения реагирующих молекул. Полученная нами зависимость константы скорости реакции от вязкости среды, описываемая уравнением Крамерса, указывает на прямую связь между динамикой молекул растворителя и динамикой конформационных движений фермента в процессе катализа.

Эти выводы подтверждают данные, полученные для формиатдегидрогеназы

In к cet. (сек )

[Demchenko et al., 1991]. Поскольку реакции, катализируемые и ФДГ, и ЛДГ, включают перенос заряда (гидрид-иона), следовало проверить, не связано ли влияние добавляемых веществ с изменением диэлектрической постоянной среды. Для этого был исследован ряд растворителей, имеющих низкую диэлектрическую проницаемость - метанол, этанол, диоксан и др. (рис. 11). Полученные результаты не обнарухмли заметного влияния диэлектрической проницаемости на скорость реакции, катализируемой ЛДГ. Для реакции, катализируемой ФДГ, наблюдалось увеличение скорости реакции в водно-органических средах, в том числе и в присутствии сахарозы и глицерина. Мы считаем, что это различие связано . с природой лимитирующей стадии. Для формиатдегидрогеназной реакции скорость лимитируется процессом переноса гидрид-иона от формиага к NAD, (Тишков и др, 1990). Для реакции, катализируемой ЛДГ, в которой лимитирующей стадией является конформационная изомеризация тройного комплекса, было обнаружено снижение скорости реакции, коррелирующее с вязкостью среды.

Рис. 11. Зависимость максимальной скорости реакции восстановления пирувата, ацетальдепща и формиата, катализируемых ЛДГ, АДГ и ФДГ соответствен-

но, от диэлектрической постоянной среды е.

глицерин -во

метанол - rw этанол - ла диоксан -ФФф изопропанол - п третбуганол - 0 0 АДГ -серые символы; ЛДГ -черные; ФДГ - открытые символы

1.3 14 1.5 1.6 I1 18 1.9 20

1/Е *Ю:

Эти выводы подтверждены данными для АДГ. Прямым доказательством связи влияния вязкости с характером лимитирующей ставии реакции являются исследования фермента, способного изменять лимитирующую стадию. Именно таким ферментом является АДГ. Стадией, лимитирующей скорость алкогольдегидрогеназной реакции, является диссоциация кофермента, сопряженная с конформационным переходом в комплексе фермент-кофермент. Следовательно, можно было ожидать, что для алкогольдегидрогеназной реакции, как и для лактатдегидрогеказной, будет обнаружено влияние вязкости на константу скорости реакции к-_.м. Исследование реакции окисления этанола в присутствии различных концентраций сахарозы (0-44 % , вязкость 1-7.1 сПз), а также поливннилпирролидона (ПВП Х-15, 12%, вязкость 2.7 сПз), показывает (рис. 10), что константа скорости как прямой, так и обратной реакции является

formate-DH

га

lactate-DH

степенной функцией вязкости (как и в случае лактатдегидрогеназной реакции) и может быть описана уравнением (1) в рамках теории Крамерса. Параметр 5, найденный из наклона этой прямой, равен 0.98. Близкий результат получен также для обратной реакции -восстановления ацетальдегвда. Модифицированная йодацетамидом АДГ не проявляет зависимости Утж от вязкости (рис. 10, кривая 9).

Изменение константы Михаэлиса при увеличении концентрации сахарозы (до 44 %) и глицерина (до 63 %), а также в растворах моноспиртов и полимеров исследовано для ЛДГ и АДГ.

Таблица 5. Значения А'м по субстратам для реакций, катализируемых ДГ, в растворах, содержащих органические компоненты. Растворы приведены в порядке понижения диэлектрической проницаемости среды е.__

Растворитель CT дин/см п, сПз £ Км, мМ

ЛДГ пируват ФДГ* формиат АДГ ацетальдегид

вода 71.68 0.89 78 0.19+ 0.03 2.6±0.2 0.1S+0.02

глицерин 30% 69.9 2.16 70 0.1010.01 1.9±0.02 0.02+0.003

сахароза ,30% 73.85 3.4 70 0.10±0.01

этиленгликоль 30% 1.84 69.8 0.15+0.02 2.4±0.2

метанол 30% 37.6 (3%) 1.5 64.3 О.ЗОЮ.ОЗ 1.9+0.2

этанол 30% 37.4 2.08 58 0.18+0.02 1.6±0.2

глицерин 63% 67.3 13.0 58 0.03+0.03 0.5±0.03

диоксан 30% 1.6 52.6 0.2±0.02 1.1+0.15

* -данные Demcheiiko А.Р., Rusin O.I. Egorov A.M. Tishkov V.l., 1990. В табл.5 представлены некоторые физические параметры растворов и значения Км для субстратов 3-х ДГ в этих средах. Как видно из этой табл., в 63% растворе глицерина Км по пирувату и по лактату уменьшается в 5 раз, в растворе этанола и диоксана, имеющих самое низкое значение с, величина Кы для всех субстратов такая же, как в воде. Отсюда следует, что механизм снижения Кы не связан с изменением е среды, а является, по нашему мнению, следствием изменения химического потенциала, субстратов в этих растворах, вызванного изменением структуры воды в гидратной оболочке, связанной с субстратами jTimashefF, 1995).

В результате исследований были выявлены следующие закономерности: -влияние вязкости и диэлектрической проницаемости среды носит универсальный характер и зависит or стадии, лимитирующей скорость ферментативного процесса;

-если лимитирующая стадия ферментативной реакции связана с конформационными изменениями белка, на каталитические свойства фермента может влиять вязкость среды. Увеличение вязкости растворителя снижает скорость ферментативного процесса;

-если реакцию лимитирует стадия, не связанная с конформационными превращениями фермента, то зависимость кинетики реакции от вязкости отсутствует, однако возможно влияние диэлектрических свойств раствора.

Важно отметить, что эти закономерности позволяют предсказать поведение ферментов в водно-органических растворителях.

3.2. ЭКСТРЕМАЛЬНО ГАЛОФИЛЬНЫЕ ВОДОРОСЛИ. Данные по влиянию

органических растворителей на катализ, представленные в предыдущей главе, относятся

к ДГ негалофильных организмов с известной пространственной структурой.

Исследование . молекулярных механизмов взаимодействия осмолитов с

цитоплазматическимим белками пшотолерантных организмов, содержащих внутри

клетки около 4-5М глицерина до настоящего времени не проводилось.

Рис. 12. Зависимость максимальной скорости реакции восстановления пирувата (Чпах). катализируемой ЛДГ из разных по галотолерантности организмов, от вязкости среды (в двойных логарифмических координатах):

1- D. salina, 2- С. reinhardtii, 3- мышца свиньи 0.1 М Na-фосф. буфер, рН7.5, [пируват): 10 мМ; [NADH]: 0.25 мМ. 4 - то же, что (1), но [пируват]: 0.2 мМ

В этой главе представлено исследование влияния глицерина, основного осмолита клетки, на каталитические свойства , и в частности, на величину параметра 5 (из уравнения Крамерса) для ЛДГ из разных по галотолерантности микроводорослей. Методом стационарной кинетики были изучены каталитические характеристики ЛДГ из двух водорослей: гаяофильной D.salina и гликофильной C.reinlmrdtii в растворах с разной концентрацией глицерина. Анализ экспериментальных данных показал, что скорость реакции VmaI является степенной функцией вязкости среды (ti), также как и для мышечного фермента, и эта зависимость может быть описана уравнением Крамерса (рис. 12). Значения показателя степени при вязкости 5, полученные из этих кривых, приведены в таблице 6. Из таблицы видно, что ЛДГ из клеток, содержащих высокую концентрацию глицерина, имеет наименьшую величину 5 среди других организмов. Это указывает на то, что клетки D. salina более адаптированы к повышению его концентрации. Как известно, в ходе эволюции разнообразных бактерий, водорослей, растений и животных биохимическая адаптация происходит так, чтобы органические вещества, используемые клеткой для поддержания осмотического баланса, не нарушали функции макромолекул. Это положение подтверждается сравнением результатов, полученных при исследовании ферментов из организмов с разным внутриклеточным содержанием осмолитов. Наибольшее изменение имеет Кш мышечного фермента,

Таблица 6. Значения Ки по субстратам к параметра 8 из уравнения Крамерса для ЛДГ из разных по галотолерантности организмов.

Объект Глицерин (%, V/V) АГМ , [мМ] Ь

пируват NADH пируват 10 мМ пируват 0.2 мМ

D. salina 0 50 0.71±0.07 0.26+0.02 0.05Ю.005 0.03±0.003 0.42 ± 0.05 0.12 ±0.02

C.reinhaidtii 0 50 0.7±0.6 0.20±0.02 0.032±0.003 0.038+0.003 0.60 ± 0.05 | 0.43 ± 0.04

мышца свиньи 0 50 0:19±0.02 0.03±0.004 0.98 ±0.1 0.55 ± 0.05

наименьшее - из D. salina.. Слабо выраженная зависимость активности фермента от концентрации глицерина позволяет не нарушать процессов клеточного метаболизма в D. salina даже в условиях повышения концентрации глицерина до 4-5 М Сродство кофермента к ЛДГ из обоих водорослей почти не зависит от присутствия глицерина в растворе.

Анализ значений Ки по пирувату дня ЛДГ из разных организмов в растворе глицерина (табл. 6) показывает, что глицерин уменьшает сродство пирувата к ферменту для всех перечисленных организмов' на разную величину. Слабо выраженная зависимость Км и V,^ от концентрации глицерина позволяет ферменту из D. salina эффективно функционировать в широком диапазоне концентраций субстрата (пирувата) при изменяющихся концентрациях глицерина.

ГЛАВА 4. РН- РЕГУЛЯЦИЯ ФЕРМЕНТОВ ИЗ ГАЛОТОЛЕРАНТНЫХ ОРГАНИЗМОВ.

Одним из важных регуляторных механизмов изменения активности ферментов в клетке является изменение рН внутриклеточной среды. Многие стрессовые воздействия, такие как, изменение освещенности, солевого состава, аноксия, (кислородное голодание), вызывают изменение рН, которое в свою очередь является пусковым механизмом для переключения некоторых метаболических путей, приводящего к переходу клетки в новое метаболическое состояние. Для некоторых ферментов показано, что несмотря на небольшие отклонения рН в процессе функционирования клетки (порядка 0.2-0.4 ед.) этих изменений оказывается достаточно, тобы повлиять на состояние связанности ферментов на мембранах или в энзиматических компартментах [Курганов Б.И., 1979j. Кроме того, рН влияет на стерическую конфигурацию активного центра и, соответственно, гибкость данной конфигурации и определяет величину сродства фермента к субстратам. В частности , хорошо известен механизм а- статной регуляции [Хочачка и Сомеро, 1988], который работает так, что фермент сохраняет состояние полунасыщенности субстратом, несмотря на изменение условий в клетке. Многие ферменты работают в клетке в условиях полунасыщения. К таким ферментам относится ЛДГ. Известно наличие a-статной регуляции для ЛДГ у

млекопитающих и у большого класса рыб |Хочачка и Сомеро, 1988]. Мы исследовали вопрос о наличии а-статнай регуляции в галофильных организмах с разным типом осморегуляции и роль осмолитов в этом процессе.

На рис. 13 и 14 приведены значения Vmax и Кы для пирувата и NADH, полученные из кривых насыщения ЛДГ, в зависимости от рН среды для трех классов организмов, отличающихся по механизму осморегуляции.

Основные различия между этими величинами в негалофильных организмах (млекопитающие) и галофильных бактериях состоят в том, что V,MX у млекопитающих практически не изменяется в широком диапазоне рН, от 5.5 до 9, в то время как у бактерий наблюдается резкое уменьшение этой величины уже при рН<8. Аналогичная зависимость от рН получена нами также и для АЛДГ из этих бактерий. Согласно рентгеноструктурным данным [Dym О. 1995], гаюфильная МДГ имеет большой отрицательный заряд: -156 (по сравнению с +16 для ЛДГ из акулы) и большее число ионных кластеров. По всей видимости, уменьшение Vmax при снижении рН вызвано уменьшением отрицательного заряда на белке и разрушением ионных кластеров и, как следствие, разрушением структуры белка.

Зависимость Км по пирувату от рН также сильно отличается от мышечного фермента: Кы по пирувату у мышечного белка зависит от ионизации Hisl95 с рК ~7..5-7.7 (рис 4.2 кривая1), что имеет регуляторное значение для метаболизма в клетках мышцы свиньи. В галобактерях Кн по пирувату для ЛДГ практически не зависит от рН в области рН 6-9.5. Величина Кы по пирувату не зависит от рН также и для АЛДГ из этих же бактерий. Иными словами, а-сгатная регуляция активности ЛДГ и АЛДГ из галофильных бактерий Н salinarium не наблюдается.

Как видно из рис. 14, АГМ по пирувату для ЛДГ из D. satina практически не зависит от рН, но, в отличие от мышечного белка, от рН зависит А'м по NADH (кривая 5 на рис. 14) с тем же значением рК, как для Hisl95 в ЛДГ из мышцы. Это уникальное явление среди многих известных организмов. Такая зависимость ÁTM от рН не наблюдается ни в мышечном ЛДГ, ни в негалофильной водоросли С. rcinhardtii

В результате проведенного анализа можно сделать вывод о том, что у галотолерантной водоросли D. salina a-статная регуляция активности ЛДГ осуществляется путем изменения сродства фермента к NADH в области физиологических значений рН 7 - 8.5, а не пирувата, как у млекопитающих. Изучение аналогичных кривых насыщения в глицерине (до 63%) показало, что рН-зависимость этих величин, Vmax и Ки, такая же, как и в отсутствие глицерина, с той лишь разницей, что абсолютная величина и Км меньше в растворе глицерина (главе 3.2). Иными словами, рК групп активного центра ЛДГ, от которых зависит связывание субстрата, не зависит от присутствия глицерина (рК свободных аминокислот также не зависит от присутствия глицерина [Segur J.B., 1953]).

t

о о

X

со

га

4 5 6 7 в 9 10 11

рН

рН

Рис. 13 рН -зависимость скорости реакции восстановления пирувата, катализируемой ЛДГ из разных организмов. Условия реакции: 10 мМ пирувата, 0.2мМ NADH. 3 а 100% принята скорость реакции в максимуме кривой. Для ЛДГ из D. salina максимальная скорость слегка занижена для удобства сравнения.

Рис. 14. рН -зависимость Км по пирувату и NADH для ЛДГ из разных организмов. Км по пирувату для ЛДГ из мышцы свиньи -1, из D. salina -2, из С reinliaidtii -4, из Н. salinarium -6 (сдвинута на 10 ед. вверх); Км по NADH из D. salina -5, из Сreinliardtii-3.

40 60

80 100 120 140 160 Время, с

Vmax не зависит от рН для ЛДГ из D. salina в большом интервале значений рН вплоть до рН 8.5. При рН >8 эта величина падает, но за счет полной и необратимой денатурации белка (рис. 15) .

Рис. 15. Кривая продукт-время в реакции превращения пирувата в лактат, катализируемой ЛДГ из D. satina, при рН 7.5 (1) и при рН 8.9 (2). На врезке - производные кривых 1 и 2, построенные в логарифмических координатах.

Изучение зависимости константы скорости инактивации фермента от рН показывает, что изменение стабильности

фермента вызвано отщеплением кофермента при рН >8 (рис. 14, кривая 5). Анализ собственных и литературных данных по влиянию кофермента NADH на стабильность ЛДГ из различных организмов показывает, что ЛДГ из галотолерантной водоросли D. salina обладает уникальными особенностями, обусловленными, по-видимому, определенным типом осморегуляции клеток: 1) сродство NADH к ЛДГ уменьшается почти до нуля с величиной рК~7.7 для ионизующейся группы фермента, участвующей в связывании NADH, 2) отщепление NADH увеличивает скорость денатурации ЛДГ более, чем в 20 раз (по *„„.). Для всех известных гомологичных ферментов из других организмов такая зависимость от рН присуща связыванию пирувата, а не кофермента. Таким образом, а-статная регуляция осуществляется в клетках D. salina не через изменение сродства к пирувату, как в клетках млекопитающих и рыб, а через изменение сродства к коферменту.

Согласно данным Прониной и соавт. [1996], одноклеточные водоросли D. parva, D. salina и др. поддерживают в цитоплазме строго постоянное значение рН, равное 7.27.4, несмотря на значительные изменения условий внешней среды: концентрации углекислого газа, освещения, солености. Однако при резком изменении внешних условий значение внутриклеточного рН может на некоторое время меняться и далее снова релаксировать к своему стационарному уровню. Так освещение вызывает защелачивание клеток водорослей D. tcrtiolecta на 0.5 ед. рН, а солевой стресс защелачивает цитоплазму на 0.2 ед. рН как в темноте, так и на свету (Goyal and Gimmler, 1989). Согласно нашим кинетическим данным, защелачивание цитоплазмы клеток D. salina должно привести к снижению активности ЛДГ за счет уменьшения сродства к NADH. Отщепление кофермента сопровождается потерей стабильности фермента, т.е. перекрывается путь превращения пирувата в лактат. В главе 6 мы

детальнее остановимся на вопросе о значении этого процесса для основного метаболизма этих водорослей, связанного с синтезом глицерина - протектора при осмотическом шоке.

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ОСМОЛИТОВ НА СТАБИЛЬНОСТЬ ФЕРМЕНТОВ 5.1 ОРГАНИЧЕСКИЕ ОСМОЛИТЫ. Хорошо известно стабилизирующее действие глицерина на структуру глобулярных белков при низких температурах, но практически отсутствуют данные по изучению механизма взаимодействия поливалентных спиртов и Сахаров с белками в широком интервале температур. В настоящее время нет единого мнения о том, каков физико-химический механизм такой стабилизации. Задачей настоящего исследования было изучение механизма взаимодействия поливалентных спиртов и Сахаров с белками в связи с их осморетулирующими свойствами в широком интервале температур.

Зависимость скорости реакции восстановления пирувата от температуры (рис. 16) показывает, что Топт.- температура, при которой скорость реакции является максимальной, для ЛДГ из D.salina равна 32°С, из C.reinliardtii : 49-51°С, из мышцы свиньи: 58-61°С, из Н. saliiiariunr. 65°С., Существующая Корреляция МежДУ Топт* гомологичных ферментов и Троста организмов [Александров В.Я., 1985], плохо выполняется для экстремально галофильных организмов: фермент, функционирующий in vivo при 5 м глицерина (в D. salina) является значительно менее стабильным, чем его гомолог из негалофильной водоросли С. reinliardtii, выращенный при той же температуре. Величина Топт для ферментов из Н. salinaríum близка к величине для мышечного фермента, хотя Троста У них различается на 10°С.

Мы исследовали, как влияет глицерин на оба процесса: тепловую активацию катализа и температурную денатурацию. Добавление глицерина (50%) в реакционную смесь хотя уменьшало Vmax по степенному закону от вязкости, (см. главу 3.1), но почти не влияло на величину Тощ (Рис- 16).

Тепловая денатурация ЛДГ является необратимым процессом в условиях настоящего эксперимента для всех изученных организмов в глицериновом растворе и в воде. Для интервала температуры от 8°С до Tolrr зависимость активности ЛДГ от температуры была построена в координатах Аррениуса в присутствии глицерина и без него. Значения энергии активации, расчитанные из наклона этих кривых (табл. 7), не меняются в растворе глицерина для ЛДГ из галофильной водоросли D. salina, для С. reLnhardtii увеличивается на 7 кДж, для ЛДГ из мышцы свиньи на 12 кДж, что коррелирует с величиной 5 из уравнения Крамерса для этих белков. Таким образом, зависимость каталитической константы скорости реакции от температуры (учитывая температурную зависимость вязкости растворителя) указывает на прямую связь между динамикой молекул растворителя и динамикой конформационных движений фермента в процессе катализа.

«Плавление» фермента в отсутсвие глицерина, определенное методом дифференциальной сканирующей микрокалоримстрии (ДСМ), представлено одним

пиком с максимумом теплоемкости при 62° С (кривая -"контр", рис. 17). Кривая .-ыапления ЛДГ в присутствии глицерина состоит из двух пиков: низкотемпературного в с пл. 20-50°С и высокотемпературного с максимумом 62-63°С. По данным КД в области температур 10-50°С содержание а-спиральной структуры ЛДГ, а также окружение ароматических аминокислотных остатков, дающих вклад в значение эллиптичности в полосе поглощения 280 нм не изменяются. Эксперимент по ультрацентрифугированию показал, что ЛДГ не изменила молекулярного веса в растворе глицерина при 50°С. и следовательно, низкотемпературный пик на калориметрической кривой не связан с ас... щиацией молекул белка. Возможно, что предденатурационный переход связан с переориентацией четвертичной структуры ЛДГ. Второй пик на калориметрической кривой связан с необратимой тепловой денатурацией ЛДГ, включающей полное разрушение а-спиральной структуры и потерю ферментативной активности. Площадь его практически не зависит от концентрации глицерина

Таблица 7. Значения энергии активации реакции восстановления пирувата (Б]*) и энергии активации процесса денатурации ЛДГ (Е*г), полученные из температурной зависимости констант скоростей в растворах с разным содержанием глицерина (0.1 М

Вид организма Глице- E*i Е '2, |кДж/моль|' ^опт Т° С

рин, катализа, тепловая денатурация, с роста

% по об. кДж/моль Е*? Н-2 Е'2 (NADH-

(NADH) пируват)

D. satina 0 67 ± 6.0 67± 6 155±20 168+30 31 27

12 67 ± Ó.0 84± 8 31

50 67 ± 6.0 96± 10 32

Cli.remlmidtii 0 50 ± 5.0 218±20 231 ±25 243+30 50 27-30

12 55 ± 6.0 235±25 50

50 59 ± 6.0 275+30 51

мышца свиньи 0 38 ± 4.0 118+15 - - 59 37

12 42 ± 4.0 246±25 60

50 50 ± 5.0 294±30 61

Н. salinarium - 32 ± 4 163 ± 20 - - 65 45

Значение энергии активации процесса денатурации, полученное нами по уравнению, выведенному авторами [БапсЬег-Яиц .1. М а1., 1988) для одностадийного необратимого процесса денатурации белков, Еа=2. 7 • К - Тт2 • ДСр1™1 /С2, равно 172±20 кДж/моль (ДСрта* -значение теплоемкости в максимуме кривой). Это значение Еа , совпадает в пределах точности с аналогичной величиной, полученной нами по температурной зависимости константы скорости инактивации ЛДГ в водном растворе. Из этого следует, что денатурацию ЛДГ можно описать как одностадийный процесс с энергией активации, равной 172 кДж/моль и полным тепловым эффектом О, равным 1763 кДж/моль (эти величины зависят от рН раствора).

1 2 3 4

х° о

Рис.5.1.1. Температурная зависимость скорости восстановления пирувата, катализируемого ДДГ из D. salina (1, Г), С. reinhardtii (2, 2'), мышц свиньи (3, 3'). Н. salinarium (4). Кривая для ЛДГ из термофильной бактерии Termotoga maritima (5) приведена для сравнения [Hechi К. et al, 1989]. [NADH): 0.25 мМ; |пируват]: 10 мМ; 0.1М Na-фосф. буфер, pH 7.5 (кривые 1,2,3); 0.1М трис-HCl буфер - (4).

Рис5.1.2.Температурная зависимость парциальной теплоемкости ЛДГ в растворе с различной концентрацией глицерина. (ЛДГ]: 2мг/мл; 0.1М фосфатный буфер, рН7 . /-контроль, 2-5- 6, 12, 25, 50 % глицерина соответсвенно.

-4 -

-1 О

""•^у-^-о. D.salina

3 , -1 10 /Т,К

3.0 3Í1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Рис. 18. Зависимость логарифма константы скорости инактивации ЛДГ из микроводорослей D. salina и С. reinlmrdtii И из мышц свиньи от температуры; без глицерина -открытые символы, в присутствии 50% глицерина -заполненные символы.

32 'С

V/V„ D.salina

1.0,

0.S 0.6 0.40.2 0.0

4 6

minute

+NADH

"V/V, 1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0

52 С C.reinflardiil

+NADH pyruv

2 4 6 8 10 minute

Рис. 19. Влияние NADH и пирувдга на тепловую инактивацию ЛДГ из микроводорослей. 1 мл инкубационной смеси содержал 50 мкл клеточного экстракта, [пируват): 10 мМ, либо [ИАБН]: 0.25 мМ, 0.1 М фосф. буфер, рН 7.5;. Измерение активности см. "методы" Инактивацию тройного комплекса ЛДГ определяли по уменьшению стационарной скорости реакции восстановления пирувата в процессе ее измерения..

о

Из данных по температурной зависимости консгаты скорости инактивации фермента для разных по солетолерантности организмов (рис. 18) следует, что при t<50°C глицерин является стабилизатором ферментов к тепловой денатурации, а при t>50°C скорость инактивации ЛДГ в водных растворах глицерина увеличивается и глицерин является денатурирующим фактором. Значения энергии активации процесса денатурации, вычисленные из этих графиков, приведены в табл. 7. Значения разности между изменением свободной энергии, энтальпии и энтропии активации процесса денатурации в 50% растворе глицерина и без него, вычисленные по уравнению Д(ДО")= -RT[1ilí„h (50%глиц.) - Ыги„ (0%глиц.)) при температуре 27°С, приведены в табл. 8. Приведенные в табл. 8 термодинамические величины, а также оценка гидрофобности ЛДГ из мышцы свиньи по методу Bigelow, [1977] позволяют сделать вывод, что основной вклад в изменение стабильности ЛДГ при добавлении глицерина дают неполярные аминокислотные остатки (уменьшение растворимости неполярных групп в растворе глицерина по сравнению с водой). В пользу этого утверждения говорит тот факт, что небольшие положительные изменения Д(ДО') вызваны большим положительным изменением как энтальпийного, так и энтропийного членов. Этот результат является аргументом в пользу того, что ЛДГ из D. salina является среди них наименее гидрофобным белком. Данные пб влиянию солей на тепловую стабильность ЛДГ из D.salina (глава 5.2.) также служат подтверждением этого вывода.

Таблица 8. Разница между значениями термодинамических величин активации процесса денатурации ЛДГ из разных источников в 50% растворе глицерина и в отсутствии глицерина при 27°С.

Вид организма A(4G*) кДж/моль Д(ДН') кДж/моль ¿(AS*) Дж/моль, град.

D. salina +1.494 +30 + 95.02

Ch.reinhardtii +3.486 +60 +188.38

мышца свиньи +7.470 + 175 +558.43

разрыв гидрофобной пары -СН2- +1.1* - -

разрыв ионной пары алкилтриметиламмониумкарбоксилатов -12..2*

* данные [Back J.F. , OakenfuU D., Smith В., 1979]

Из данных по тепловой стабильности ЛДГ, также как из кинетических результатов, можно сделать вывод, что одно из проявлений адаптационного механизма клетки состоит в минимизации влияния глицерина на термодинамические функции фермента путем уменьшения гидрофобности белка.

5.2. ВЛИЯНИЕ СОЛЕИ. Еще в 70-годы изучение стабильности глобулярных белков в растворах различных солей показало, что Тдш. белка зависит от положения соли в ряду Гофмейстера, что объяснялось зависимостью растворимости аминокислотных остатков в этом ряду солей. В дальнейшем появились представления о

специфических участках связывания не только для субстратов и их аналогов, но и ионов нейтральных солей. Связывание ионов солей в этих участках происходит при значительно более низких концентрациях (мили- и децимолярных для С1") , чем в экспериментах по высаливанию (несколько молей), хотя эффективность влияния на стабильность белка также следует положению иона в ряду Гофмейстера. Строгое физическое объяснение такому эффекту в настоящее время отсутствует, хотя некоторую систематику экспериментальных данных можно уже провести. В этой работе мы исследовали, как стабильность ферментов экстремально галофильных организмов зависит от концентрации соли и каким механизмом взаимодействия можно объяснить это влияние. Данные приводятся в сравнении с влиянием солей на стабильность негалофильных ферментов с известной структурой.

На рис. 20 показано влияние ионов фосфата на стабильность ЛДГ из мышцы свиньи. Инактивация при низких концентрациях соли всех изученных нами ДГ -процесс необратимый. Для расчета истинной константы скорости инактивации фермента мы пользовались схемой, согласно которой фермент денатурирует только в форме Е, не связанной с ионами соли: К

Е + пЬ = Е1П (2)

Ео.

где Е-свободный фермент, [Е1_т,] - комплекс фермента с п молекулами соли. Используя определенные соотношения между константами, а также условие сохранения вещества: Е=Ео + Е + [ЕЬп], выражение для скорости образования денатурированной формы фермента имеет вид:

=(*»,)«* Г. = у.

а1 К + V

где К =--- - константа диссоциации комплекса. аУ„ - скорость реакции в

[£Х„ ]

нулевой момент времени, пропорциональная концентрации фермента Е0. Таким образом, можно найти величины К и кш из экстраполяции кривых ¿У /Уо,

зависимости ——||->о от ть. к краиним значениям Ь.

Из кривых рис. 20 А получены значения (кт )Эфф при разных концентрациях фосфата и представлены в логарифмических координатах на рис. 20 Б. Из данных рис. 20 Б. получено: кш =0.1 мин"1 , К= 0.005М2 и п=1.9+0.2. Получена зависимость (ЛУэфф от рН в 0.1 М растворе фосфата (рис. 20 С). Середина перехода на этой зависимости совпадает с величиной рК функционального №$195 в активном центре ЛДГ. Из этой зависимости следует, что фосфат стабилизирует только кислую конформацию фермента. Из экспериментов по ферментативной активности следует, что фосфат не связывается в

активном центре при концентрациях вплоть до 1 М. По рентгеноструктурным данным [Abad-Zapatero С. et al, I987J ЛДГ имеет 2 центра, связывающих анион -активный и межсубъединичный. При увеличении рН от 7 до 8 анион уходит из межсубъединичного центра. Принимая во внимание эти данные, результаты по ферментатавному катализу и стабильности фермента позволяют предположить, что 1 молекула фосфата связывается в межсубъединичном центре ЛДГ (две на тетрамер), что необходимо для стабилизации четвертичной структуры при низких концентрациях соли Моновалентные анионы не заменяют фосфат в этом центре. (Стабилизация ионом Mg2+ только кислой конформации показана для изоцитратдегидрогеназы из Cephalosporíum acremonium, имеющей, как ЛДГ, функциональный гистидин с рК 7.5 (Olano J., 1995]). Приведенные результаты показывают наличие специфических центров связывания ионов, влияющих на стабильность ферментов, но не влияющих на катализ.

На рис. 21 приведены наиболее характерные кривые зависимости константы скорости инактивации ферментов из разных по солеустойчивости организмов от концентрации соли. Денатурация ДГ из Н. salinaríum (это относится к АЛДГ, ЛДГ, и ГДГ), вызванная уменьшением концентрации NaCl и КС1, следует той же схеме 2, что и мышечная ЛДГ при снижении концентрации фосфата. Различие состоит в том, что ДГ-зы из галобактерии денатурируют при 23°С при концентрации NaCl ниже 1.5 М, а мышечный фермент при 62°С при концентрации фосфагга ниже 0.05 М.. Расчет кинетических кривых инактивации АЛДГ из Н. salinaríum (апофермент) при низких концентрациях соли КС1 и NaCl по уравнению 5.2.1 дает значения кш =7.3 мин"1 , А= 0.02М4 и п=4. Из этих результатов следует, что при концентрации соли 0.56М активность фермента уменьшается вдвое и не зависит от того, какая соль содержится в растворе - КС1 или NaCl. При увеличении концентрации NaCl и КС1 до нескольких молей стабильность ЛДГ из Н. salinaríum увеличивается (кривые 5,6 на рис. 21), при этом инактивация уже не описывается одной экспонентой, а представляет сумму двух процессов, отличающихся по на два порядка Из кинетических данных следует, что быстрая стадия инактивации имеет электростатическую природу (проявляется при низких концентрациях соли и не зависит от вида соли). Наличие медленной стадии обусловлено дополнительной стабилизацией фермента за счет эффекта высаливания. Изучение связывания иона NH4+ с АЛДГ из Н. salinaríum по (^ин)эфф показывает, что стабильность АЛДГ, увеличивается на порядок при присоединении одного иона NH4+ с константой диссоциации Ки —0.025 М.. Это свидетельствует о существовании специфического для NH4+ центра связывания, влияющего и на активность (рис. 6) и на стабильность АЛДГ.

Соли NaCl и КО оказывают наименьшее влияние на стабильность ЛДГ из мышцы свиньи по сравнению с этим ферментом из других организмов (кривая 3, 4 рис. 21). Значение (Лгин)эфф не изменяется при добавлении 1 М NaCl или КС1 в 0.1 М Na-фосф. буфер в интервале Т 55-62°С.

1п[рГ)08.]

1п/С|

-6 -5

О.....

-з

о......о

рН 8

■■■в-

рН 7

т

о ■1

I- "2

3

I- -4 -5 - -6 ^ -7

1 - 0.04М Ма-рЬоэ. рН7

2 - О

3 - О,

4 - О,

5 - О.

6 - О

7 - О.

ОЗМ - " -02 М -"• 01М - " -005М

04М - " - рН8 005М -"-рНВ

В

Д а340 /т'п *Ю21=0 12

Д0-~~/тт*10

^ 14

- 7

рН

Рис. 20. Влияние фосфата на тепловую стабильность ЛДГ из мышцы свиньи. (А) - Зависимость скорости восстановления пирувата от времени. рН 7 - (1-5); рН 8 - (6, 7). Ионную силу поддерживали постоянной раствором КС1; 55°С; [ЛДП: 0.1 мг/мл.

(Б) - Значения кт , вычисленные из кривых рис.А, построены как функция концентрации фосфата в логарифмических координатах. (С) - Зависимость константы скорости тепловой денатурации ЛДГ по данным ферментативной активности (1) и кругового дихроизма (2) при 222нм; [ЛДГ]; 0.04 мг/мл; 0.1 М Иа-фосфатн. буфер, рН 7.

Рис.21. Зависимость константы скорости тепловой инактивации (^эфф ЛДГ из D. salina -1,2 на пять единиц приподнята); и из мышцы свиньи -3;4, АЛДГ из Н. salinaríum -5,6 от концентрации NaCl и KCl. (апофермент).

ЛДГ из D. salina (23°С) и мышцы свиньи (62°С) 0.1М фосф. буфер, рН7.5, для АЛДГ из Я. salinaríum (23°С) -0.05 М трис-HCl буфер, pH 8.5.

Для ЛДГ из галофильной водоросли D. salina (Хтин)эфф увеличивается с ростом концентрации соли и зависит от вида соли. Интервал концентрации соли и характер зависимости (^ин)эфф °т вида соли показывают, что зависимость (^ин)эфф от концентрации соли определяется доминирующим вкладом полярных групп белка, растворимость которых растет с повышением концентрации соли. Этот результат находится в соответствии с данными по аминокислотному составу отдельных белков и суммарной белковой фракции гомогената водорослей D. salina. По этим данным белки D. salina имеют низкое отношение содержания неполярных групп к полярным по сравнению с белками млекопитающих [Ginzburg М., 1987]. Низкое относительное количество неполярных групп в ЛДГ из D. salina подтверждают данные по стабильности в органических растворителях (глав.5.1.).

Таким образом, уменьшение стабильности ЛДГ из D. salina с ростом концентрации соли происходит в результате неспецифического взаимодействия солей с белковой макромолекулой, зависящего от хаотропности ионов соли, в основе которого лежит изменение растворимости аминокислотных остатков. Хотя в активном центре ЛДГ имеется специфический участок связывания аниона СГ, связывание которого в этом центре приводит к полному ингибированию фермента, но связывание в этом центре не влияет на стабильность фермента так же, как дня мышечной ЛДГ.

ГЛАВА 6. ОБСУЖДЕНИЕ Кинетические данные, полученные нами для дегидрогеназ из галофильных организмов можно суммировать в виде обобщенной схемы, представленной на рис. 22. Из этой схемы видно, что ферменты можно разделить на галофильные и негалофильные по их каталитическим характеристикам (ранее это разделение было введено [Lainy 1981] на осове стабильности ферментов к изменению концентрации соли. Отсутствие конкуренции иона С1" с субстратами (кето-кислотами), активация ионом К+ окислительных процессов путем увеличения в несколько раз сродства к субстратам и

коферменту, влияние солей на каталитическую стадию (Kcat)- те свойства, которые отличают галофильные ферменты от гомологичных им негалофильных.

Как видно из этих результатов, негалофильными являются ферменты как негалофильных организмов (млекопитающие, рыбы, негалофильные бактерии), так и экстремально галотолерантных (микроводоросли D. salina). Иными словами, если эюгремально галотолерантный организм имеет основной внутриклеточный осмолит органической природы, т.е. содержание соли внутри клетки низкое, то соответсвующие ферменты имеют каталитические характерстики в общих чертах такие же (по влиянию на них солей), как и ферменты из.негалофильных организмов. Конечно эти ферменты отличаются большей адаптивностью к высоким концентрациям органических осмолитов, чем ферменты из негалофильных организмов.

Осмолиты органической природы, так же, как и соль, влияют на разные стадии катализа, но уменьшение активности фермента путем снижения сопровождается не уменьшением стабильности белковой структуры, как в случае денатурантов, а увеличением ее. Это относится и к другим органическим осмолитам - сорбитолу, сахарозе и т.д.. Все они вызывают ингибиторный эффект путем увеличения микровязкости раствора. Полимеры с большим молекулярным весом (>1000), изменяющие макровязкость раствора, менее эффективно влияют на катализ (глава З.1.).

Тот факт, что связывание ионов нейтральных солей в специфических участках на ферменте, влияющее на катализ, имеет регуляторное значение, продемонстрировано на рис. 23. На этом рис. приведены оптимальные условия функционирования рассмотренных нами ферментов, полученные из кинетических данных, (приведено для ЛДГ, другие исследованные нами ферменты подчиняются этой закономерности), диапазон выживания ¡слетки и допустимый интервал концентрации соли внутри клетки. Из этих данных видно, что ингибиторные концентрации соли находятся в пределах допустимых внутриклеточных концентраций соли. Для мышечного ЛДГ К\ =0.1-0.4 М для С1", концентрация анионов внутри клетки (до 0.2 М), для фермента из D. salina К\ =0.7 М, концентрация КС1 внутри клетки до 0.5 М и т.д.) Это говорит о том, что связывание ионов нейтральных солей в специфических центрах на ферменте, вызывающих ингибирование или активацию, может иметь для клетки регуляторное значение.

Метаболизм в экстремально галофильных организмах, и бактерий, и водорослей, направлен на выживание в концентрированнных растворах солей, однако адаптационные механизмы у них разные. Так глицерин-синтезирующие клетки D. salina способны жить практически при любой концентраци соли, от 0.1 до 5 М. Клетки бактерий разрушаются уже при концентрациях соли во внешней среде 1.5 М и ниже. Как видно из рис. 23, каталитические свойства ферментов галофильных организмов отражают свойства клеток по отношению к изменению концентрации соли1, ферменты разрушаются при тех же концентрациях соли, что и клетки, и имеют оптимальную активность в диапазоне внутриклеточных концентраций соли.

Рис. 22

ОБОБЩЕННАЯ СХЕМА РЕГУЛЯЦИИ ОСМОЛИТАМИ ДЕГИДРОГЕНАЗ ИЗ ОРГАНИЗМОВ С РАЗНОЙ ГАЛОТОЛЕРАНТНОСТЬЮ.

не специфическое влияние

млекопит.

млекопит.

экстр, галоф водоросли

экстр.галоф. водоросли

мало влияют

,ЫАОН

активируют

К

Т] мало ингиби- влияют руют

активируют

I

E+NADH^ENADH+S^E^AD^EГD-ENAD+P^E+NAD

с* ж*

А

Р

¿^АО

экстр.галоф. бактерии

".'.'Я''.".':

• • те .

,С1 СГ-.. К+,Ка+,С1"

•..конкурента, конкурента. не не ингибитор ингибитор влияют влияют

ие влияют

С1"

.' .не влияет

С1

не влияет

_ К+,Ка+,С1" при с<1М инактив

К+ активирует

>

К Ч О о

к+ активирует

■V : -V- -V

специфическое неспецифическая специфическая ингибирование регуляция активация

-о. сэ

Рис. 23. Схематичное изображение зависимости активности ДГ (типичная для разных ДГ) из организмов, различных по галото-лерантности от концентрации соли. Стрелкой указано значение концентрации соли, при которой ДГ заингибирована на 50% (Aj для СГ) или активирована - (К\) для К+).

Жизнеспособность клеток зависит от процессов, эволюционно выработанных организмом,

проходящих в клетке в ответ на изменения внешних условий среды, 0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 например, во время осмотического N„ CIВ окружающей среде М шока Наши результать1 показывают,

щщщд. что ускорение синтеза глицерина в

Диапаюн концентрации KCI внутри клетки МНЯТ

Область существовмия оргентмов hM¡M клетках D. salina можно достичь

перекрыв другой путь расходования NADH -превращение пирувата в лактат. На рис. 24 приведен метаболический путь превращения глицерина в клетках галотолерантной водоросли D. salina. При гиперосмотическом шоке клетки D. salina синтезируют глицерин из полисахаридов по гликолитическому пути вплоть до диоксиацетонфосфата, который затем разветвляется на собственно гликолиз и путь превращения глицерина (диоксиацетонфосфат- это метаболит, общий для цикла гликолиза и цикла превращения глицерина). Восстановление диоксиацетонфосфата требует кофермента NADH. Таким образом при гиперосмотическом шоке клетка испытывает дефицит NADH. "Перекрытию" последней стадии гликолиза способствуют каталитические свойства ЛДГ, которые получены нами из данных ферментативной кинетики: а) уменьшение сродства NADH к ЛДГ при увеличении рН от 7.5 до 8.0 (при осмотическом шоке происходит защелачиваниие внутриклеточной среды; б) уменьшения стабильности ЛДГ при отщеплении кофермента, вызванного уменьшением его концентрации. При высокой стационарной концентрации глицерина клетка вновь нуждается в источнике энергии в виде АТФ, поставляемой полным циклом гликолиза при участии ЛДГ. Глицерин, как мы видели (глав3.2), мало влияет на катализ ЛДГ из этой водорости, но стабилизирует его к тепловой денатурации в стационарных условиях.

Клетки галобактерий Н salinarium сохраняют целостность в более узком диапазоне концентрации соли, чем водоросли (рис.23). Из приведенных данных по влиянию анионов и катионов нейтральных солей на катализ и стабильность ферментов

H. salinaríum видно, какое значение эти взаимодействия могут иметь для процессов выживания бактерий при осмотическом шоке, либо других стрессовых воздействиях.

Рис. 24. Метаболический путь превращения глицерина в клетках D. salina. Затемненным кругом показана часть пути гликолиза, которая «перекрывается» во время гиперосмотического шока, чтобы освободить NADH для синтеза глицерина.

Адаптационный механизм клеток галобактерий Н salinaríum к осмотическому шоку состоит (по данным [Скулачев В.П., 1989]) в использовании клетками Н. salinaríum Na+/K+ -градиентов, образуемых ими между внутренней и внешней средой клетки при избытке энергии, для движения спустя более чем 8 ч после прекращения освещения и исчерпания О2. Емкость Na+/K+ буфера прямо пропорциональна концентрации соли в среде обитания бактерий [Brown I.I. et al 1983]. Это означает, что при стрессовых условиях клетка тратит Na+/K+- градиент и концентрация К+ может значительно падать.

Полученные нами результаты по активации ионами К+ и NH4+ окислительных реакций при концентрациях катионов, значительно ниже клеточных, создает условия для максимального функционирования этих ферментов как в стационарном режиме, так и во время осмотического шока. Таким образом, в нашей работе мы показали некоторые из адаптационных механизмов, которые вырабатывались клеткой в процессе эволюции в ответ на изменение солености во внешней среде (табл. 9). Это, с одной стороны, изменение сродства к субстратам и неорганическим ионам -осмолитам, и с другой стороны, изменение конформационной гибкости, которая проявляется в активационных параметрах катализа и влияния на них органических и неорганических осмолитов.

Таблица 9. Характеристики ферментов, меняющиеся в ответ на изменения внутриклеточной среды в процессе ■ адаптации.:

клетка С (соли) рн Л Т°С

ЛЬ для ионовН 1)Лм по субстр. 1) 8 из уравн. 1)Топт>

фермент и коферм. Крамерса 2)(Е2*)денатур.

2)Á¿at 2) (Ei* )эфф

3)Ма катализа

[ ПОЛИСАХАРИДЫ | ^SS^

_J [кдл]

гаюкоза-6-фосфат | [калыин NA

I ДИОКСИАЦЕТОнаОСФАТ);

JfhlAD

гликолиз

л

I

[ глицерофосфат |

I ~ )

[гдицерии]—'

ЦИКЛ СИНТЕЗА ГЛИЦЕРИНА

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Полученные результаты показывают, что отдельные ферменты, как и интактные клетки галотолерантных организмов обладают целым рядом уникальных свойств в

отношении стабильности к высоким концентрациям солей. Из-за очень широкой области условий, при которых они стабильны и активны, изученные ДГ из экстремально галофильных организмов могут служить моделью в исследовании стабилизации белков, зависящей от состава растворителя. Рассматривая традиционно белок как конфигурацию, состоящую из двух частей - консервативного активного центра и части структуры, которая может адаптироваться к различному окружению, удалось обнаружить, что процесс адаптации организмов к увеличению солености окружающей среды затрагивает и активный центр. Изучение влияния осмолитов на стабильность ДГ показывает, каким критериям должна удовлетворять переферийная часть фермента, чтобы обеспечить протекание каталитических реакций при высокой концентрации солей и органических осмолитов. Глицерин занимает особое место среди органических полиоксисоединений, которые служат осмолитами в клетках живых организмов Наличие глицерина известно не только у галотолерантных водорослей. Глицерин служит "антифризом" в клетках насекомых, обеспечивая им устойчивость к замерзанию. Наши данные показывают, что стабильность белков, в частности ферментов, значительно возрастает в присутствии глицерина именно при низких температурах. Возможно, основной вклад в стабилизацию белка в растворах изученных нами осмолитов создается благодаря эффекту предпочтительной гидратации. При этом катализ сохраняет высокую эффективность (по величине кил/А"м), не смотря на то, что обе константы уменьшаются в несколько раз. Учитывая универсальность основных метаболических путей, проведенное исследование свойств различных ферментов центрального метаболизма позволяет понять наиболее интимные биохимические механизмы адаптации живых организмов к внешним условиям. Более того, сравнительное изучение различных фенотипов в пределах одной области (т.е. экстремальный галофилизм и термофилизм, в добавлении к мезофилизму) полезно для понимания структурной основы экстремальной стабильности белков.

ВЫВОДЫ.

Показано участие внутриклеточных осмолитов .- ионов нейтральных солей и полиолов, в ферментативных реакциях, катализируемых дегидрогеназами из организмов с разным типом осморегуляции и выявлены механизмы влияния их на кинетику ферментативных процессов и стабильность ферментов.

1. Для дегидрогеназ из животных клеток, субстратом которых являются кето-кислоты, показано, что анионы нейтральных солей являются ингибиторами реакции, конкурентными с кето-кислотой за связывание их в активном центре. В условиях субстратного ингибирования эти анионы могут быть активаторами реакции, связываясь с промежуточными комплексами. Суммарный эффект зависит от соотношения констант скоростей равновесных процессов. Предложены кинетические модели, описывающие указанные процессы.

2. Эффективность влияния однозарядных анионов и катионов на скорость ферментативной реакции, катализируемой лактатдегидрогеназой из различных тканей

клеток животных, зависит от расположения ионов в ряду Гофмейстера и связано с величиной энергии гидратации аниона: чем ниже энергия гидратации, тем выше сродство аниона к фермениу. Эффект не зависит от вида катиона в исследованном ряду. Двухзарядные катионы и анионы почти не влияют на катализ, приводя лишь к 10%-ному уменьшению для ЛДГ. Трехзарядный катион европия имеет высокое сродство к активному центру и активирует фермент, увеличивая сродство субстратов к ферменту.

3. Особенности кинетического поведения галофильных бактериальных ферментов определяются катион-связывающими центрами: связывание катиона К+ в этом центре активирует фермент, увеличивая сродство субстратов к ферменту и/ или скорость каталитической стадии. Анионы не конкурируют с отрицательно заряженными субстратами этих ферментов (в отличие от негалофильных организмов) .

4. Ионная регуляция ферментов из экстремально галофильных водорослей близка по кинетическому проявлению к регуляции ферментов млекопитающих (негадофильные организмы): специфическое связывание анионов в активном центре и конкуренция с субстратом. Роль клеточного осмолита - глицерина, . сводится к "демпфированию" влияния соли. Глицерин и сахароза при физиологических концентрациях увеличивают сродство субстратов к ЛДГ и уменьшают скорость каталитической стадии. Результатом является слабая зависимость скорости катализа от концентрации глицерина.

5. Влияние полиолов на ферментативный катализ происходит через изменение вязкости среды, причем вязкость среды изменяет только те стадии катализа, которые сопровождаются конформационными изменениями белка, при условии, что эта стадия лимитирует скорость реакции. Полученные, результаты позволяют предсказать, какая ферментативная реакция будет зависеть от вязкости среды, а какая будет чувствительна к изменению диэлектрической проницаемости среды.

6. Показано, что изменение рН среды в физиологическом диапазоне изменяет активности ферментов, создавая условия для регуляции, но по разным кинетическим механизмам: у млекопитающих - изменяя сродство субстрата к ферменту; у фермента галофильной водоросли - измененяя сродство кофермента и изменяя при этом стабильность фермента; для галобактерий основные изменения происходят на каталитической стадии (сродство к субстратам не изменяется).

7. Экспериментально показано существование трех механизмов стабилизации дегидрогеназ ионами нейтральных солей, наиболее ярко проявляющихся при исследовании стабильности ферментов из галофильных бактерий, а) Для диапазона концентраций солей (0-0.5 М) определяющей является нейтрализация большого отрицательного заряда (-156 для малатдегидргеназы) макромолекулы фермента ионами солей, б) В этом же диапазоне концентраций обнаружены катионсвязывающие центры (для К+, 1МН4+) на ферментах, создающие условия для стабилизации тройных комплексов ферментов (с коферментом и субстратом) В области высоких концентраций соли (1-5 М) ферменты дополнительно стабилизируются солями за счет эффекта

высаливания (в галобактериях) и дестабилизируются в результате доминирующего влияния процесса всаливания (в галофильных водорослях) .

8. Глицерин (осмолит органической природы) увеличивает температурную стабильность дегидрогеназ при низкой температуре (до 50°С), при более высокой температуре глицерин является денатуратом. В ряду исследованных организмов наименьшее влияние глицерин оказывает на стабильность лактатдегидрогеназы из галофильной водоросли, указывая на его роль в адаптационном механизме при осмотическом шоке.

9. Установлена зависимость между кинетическими свойствами ферментов галотолерантных организмов и направлением метаболических процессов в клетке во время осмотического шока, позволяющая оптимально использовать кофермент для синтеза глицерина в клетках D. salina, и сохранить максимальную активность и стабильность дегидрогеназ у Н. salinarium.

10. Выявлены конкретные молекулярные адаптационные механизмы, эволюционно сформированные, на уровне каталитических характеристик ферментов и параметров, характеризующих стабильность ферментов галотолерантных организмов, позволяющие ферментам эффективно функционировать при высокой концентрации осмолитов.

Список публикаций.

1.Маркович Д.С., Сабурова Е.А. «Протеолитическая стабильность и регуляция структуры и функции белков» в сб. «Биология и научно-технический прогресс». Пущино 1971. С. 45.

2.Сухомудренко А. Г., Сабурова Е.А. "Метод анализа конформаций в биополимерах", Биофизика, 1974. Т.2(3). С. 522-523.

3. Сабурова Е.К., Маркович Д.С. Волькенштейн М.В. "Спектральные исследования" медленных конформационных изменений в ГАФД, индуцируемых красителем", тез. Конференции по спектроскощш-бйополимеров в растворе, Харьков, 1974г. С. 18.

4. Сабурова Е.К., Маркович Д.С., Волькенштейн М.В. "Влияние анионов на конфор-мационные и функциональные свойства лактатдегидрогеназы", Тез.З Всесоюзного симпозиума "Межмолек. взаимод. и конформации молекул"., Пущино, 1976г, С. 28

5. Крапивинский Г.Б., Сабурова Е.А., Маркович Д.С., Волькенштейн М.В.. "Исследование активных центров дегидрогеназ с помощью ковалентных флуоресцентных меток." 3 Всес. симпозиум "Активные центры ферментов: Структура и функции", Пущино, 1976. С.33-34.

6. Сабурова Е. А., Маркович Д. С., Гольдштейн Б. Н.. "Исследование роли функциональных групп активного центра ЛДГ в механизме субстратного ингибирования." 3 Всесоюз. симпоз. "Активные центры ферментов:", Пущино, 1976г. С.37.

7. Е. А. Сабурова, Д. С. Маркович, Б. Н. Гольдштейп. "Исследование рн-зависимоста структурных и функциональных свойств лактатдегидрогеназы (М4). О косвенной кооперативное™ в лактатдегидрогеназе". Мол. Биол. 1977. Том 11. Вып. 2 .С. 332-344.

8. Е. А,Сабурова, Д. С. Маркович, "Влияние анионов на ингибирование лактатдегидрогеназы пируватом» Мол. Биол. 1978. Том 12. С. 737-746.

9 Сабурова Е.А., Елфимова Л.И., Ягодина Л.О, Волькенштейн М. В., «Физико-

химические механизмы связывания анионов с ферментами и влияние анионов на функциональные свойства ферментов». Тез. 5 Всесоюзн снмп. по химии и физике белков и пептвдов», Баку, 1980г. С. 120.

10. Гольдштеин Б. Н., Сабурова Е.А., Волькенштеин М.В., «Регулирование двухсубстратной реакции аналогом субстрата, исследованной методом графов». Мол. Биол. 1981. Том 15. Вып. 1. С. 132-138.

11. Сабурова Е. А., Б. Н. Гольдштеин, JI. И. Елфимова, М. В. Волькенштеин. "Нелинейное неконкурентное ингибирование лактатдегадрогеназы анионами карбоновых кислот (аналогами субстрата)". Мол. биол. 1982. Вып. 6 . С. 1173-П82.

12. Ягодина Л. 0., Сабурова Е. А., Волькенштеин. М. В., «Многостздийность субстратного ингибирования ЛДГ», Тез 1 Всесоюзного Биофизического Съезда, Москва. 1982г. Т.1. С. 139.

13. Елфимова Л.И., Сабурова Е.А., Волькенштеин. М. В. «Взаимодействие анионов карбоновых кислот (аналогов субстрата) с ЛДГ.» Тез 1 Всесоюзного Биофизического Съезда, Москва. 1982. T.I. С.139.

М.Сабурова Е.А., Маркович Д.С., Волькенштеин М.В. «Механизм регуляции активности ферментов анионами». Тез 1 Всесоюз. Биофизич. Съезда, Москва. 1982. Т.1. С. 150. 15. Ягодина Л. 0., Сабурова Е. А., "Бифазность реакции ферментативного восстановления пирувата в условиях ингибирования", Мол. Биол. 1984. Т.18. С. 653-658. 16.Чекулаева Л.Н., . Елфимова Л.И., Сабурова Е.А., Ягодина Л.О., Маркович Д.С., Волькенштеин М. В., «Сравнительное исследование механизмов регуляции некоторых ключевых ферментов галофильных бактерий и млекопитающих». Тез. 8 Объедин. Симпозиум биохимич. Обществ СССР-ГДР «Проблемы совр. биохим.» Рига. 1985. С. 151.

17. Сабурова Е.А., . Елфимова Л.И., Ягодина Л.О., Маркович Д.С., Чекулаева Л.Н., Волькенштейн. М. В. «Механизм стабилизации структуры ферментов из галофильных бактерий по отношению к высоким концентрациям солей». ,Тез. 5 Всесоюз. симп. по конф. измен, биопол. в расгв.» Тбилиси. 1985. С. 48.

18. Сабурова Е.А., . Маркович Д.С., Елфимова Л.И., Чекулаева Л.Н., Волькенштейн. М. В., «Сравнительное исследование молекулярных механизмов адаптации млекопитающих и экстремально галофильных бактерий к изменению солевой среды». Тез. 9 Совещ. по эволюционной физиологии., Ленинград, 1986. Стр.245.

19. Ягодина Л.О., Сабурова Е.А., Маркович Д.С., Волькенштейн. М. В., «Исследование специфического связывания анионов нейтральных солей лакгатдегидрогеназой по данным ферментативной кинетики.» ДАН, 1986 Т. 288. С. 491-494.

20. Demchenko А.Р., Kamenchuk O.I., Saburova Е.А. "The Influence of Solvent Dynamics of Lactate dehydrogenase Kinetics». Thes. Symp. Chem. Phys. of Enzyme Catalysis,Tallin 1987. P.76.

21. Сабурова E.A., . Елфимова Л.И., Чекулаева Л.Н. в сб. «Химия и физика биологически активных соединений». Н. 1988г. С.21-22.

22. Сабурова Е. А., 0. И. Каменчук, А. П. Демченко, "Динамический аспект кинетики реакции, катализируемой лактатдегидрогеназой". Мол. Биол. 1988. Т. 22. С. 718-725.

23. .Demchenko А.Р., Rusyn O.I., Saburova Е.А. "Kinetics of the lactate dehydrogenase reaction in high viscosity media", Biochim. Biophys. Acta 1989. V. 998. P. 196-203.

24.Сабурова E.A., Ягодина Л.О. "Кинетические исследования субстратного ингибирования лактатдегадрогеназы анионами и pH." Биохимия. 1990. Т.55. С.1819-1825.

25. Сабурова Е.А. Коренева Л.Г., Волькенштейн М.В. "Структурные и функциональные особенности комплекса лактатдегидрогеназы с европием". ДАН. 1991. Т. 316. С.1000-1003.

26. Сабурова Е.А., Симонова Н.Б., Пронина H.A., Фалькович Т.Н., Семененко В.Е. "Влияние вязкости на функциональные свойства лактатдегидрогеназы из Dunaliella

salina", ДАН, 1992. T.325 . C.1259-1264.

27. Симонова Н.Б., Сабурова Е.А., Трошина О.Ю., Семененко В.Е. "Влияние вязкости на функциональные свойства лактатдегидрогеназы из одноклеточной зеленой водоросли Clilaiiiidoiiionas reinhardtii." ДАН.1993. Т.332. C.378-3S 1. 2S. Сабурова Е.А., Симонова Н.Б., Пронина Н.А., Фалькович Т.Н., Семененко В.Е. "Исследование молекулярных механизмов адаптации экстремально галофильных микроводорослей при изменении солевой среды", тезисы, II 1-й Съезд Всероссийского общества физиологов растений, 1993г., Санкт-Петербург, С.722.

29. Симонова Н.Б. и Сабурова Е.А. "Лзктатдегидрогеназа из DunaliellaH Clamidonioiias. Сравнительное исследование. Функция и стабильность." Тез. конфер. "Биосинтез ферментов микроорганизмами". Москва, 1993г., С.99.

30. Сабурова Е.А., Етфимова Л.И., Чекулаева Л.Н, "Атаниндегидрогеназа из Halobacterium Salinarium. Активация продуктом". Тез. конфер. "Биосинтез ферментов микроорганизмами". Москва, 1993г.. С.25,

31. Симонова Н.Б, Сабурова Н.Б., Фалькович Т.Н., Семененко В.Е. "Кинетика и стабильность лактатдегидрогеназы из двух видов водорослей, живущих в среде с разным содержанием соли: Dunaliella и Chlamydomoms. РН-зависимость." ДАН. 1994. Т. 334. С. 116-119.

32. Симонова Н.Б., Сабурова Е.А., Пронина Н.А., Фалькович Т.Н., Семененнко В.Е. "Лактатдегидрогеназа из микроводорослей: галофильной Dunaliella и негапофильной Chlamydomonas. Функция и стабильность."Прикл. биохим. и микробиол.1996. Т.32. С.604-608.

33. Симонова Н.Б., Е.А.Сабурова, Г.Ширшикова Л.И Етфимова Н.А.Пронина, Т.Н. Фалькович, В.Е.Семененко. "Тештовая стабильность лактатдегидрогеназы из галофильной водоросли Dunaliella salina и негалофильной Clamydomonas reinhardtii в водных растворах глицерина."ДАН. 1995. Т. 345. С. 549-554.

34. Saburova Е.А , Simonova N.B.,. Elfimova L.I., Pronina N.A., Falkovich T.N., Seinenenko В.Е. "Poliol-protein interactions. Stabilization of lactate dehydrogenase from halophilic alga Dunaliella salina by glycerol." Symposium "Physical-chemical basis of plant physiology" Penza. 1996. P.38.

35. Е.А.Сабурова, Л.И Елфимова, Н.А.Пронина, Т.Н.Фалькович, В.Е.Семененко. "Регуляторная роль осмолитов в ферментативном катализе микроводорослей." Тез. конф. " Эколого-физиологические исследования водорослей".Борок. 1996. С. 166.

36. Л.И Елфимова, Е.А.Сабурова, Н.А.Пронина, Т.Н.Фалькович, В.Е.Семененко. "Регуляторное значение стабилизации лактатдегидрогеназы коферментом" Тез. конф. "Эколого-физиологические исследования водорослей". Борок. 1996. С. 136.

37. Сабурова Е.А. , Хечинашвшш Н.Н. и Елфимова Л.И. "Полиол-белковые взаимодействия. Микрокалориметрические исследования денатурации лактатдегидрогеназы". Молек. биол. 1996. Т. 30. С. 1219-1228.

38. Saburova Е.А , Simonova N.B.,. Elfimova L.I., Pronina N.A., Falkovich T.N., Semenenko B.E. "Stabilization of lactate dehydrogenase from pig muscle by glycerol." Intern. Symp. "The physical-chemical basis of the organization and function of the biological systems". Tbilisi. 1996. P.74-75.

39 Елфимова Л.И., Сабурова Е.А., Чекулаева Л.Н., Нуриева Р.И. "Дегидрогеназы из экстремально галофильных бактерий Halobacterium salinarium." Прикл. биохимия и микробиол. 1997г. принято к печати.

40 Елфимова Л.И., Сабурова Е.А., Чекулаева Л.Н.,"Активация аммонием галофильной аланиндегидрогеназы из Halobacterium salinarium". Микробиология, 1997г. принято к печати.