Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Закономерности экспрессии нох-генов в процессе регенерации многощетинкового червя Alitta Virens (Polychaeta, Annelida)

ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Закономерности экспрессии нох-генов в процессе регенерации многощетинкового червя Alitta Virens (Polychaeta, Annelida)"

На правах рукописи

НОВИКОВА 7

Елена Львовна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭКСПРЕССИИ НОХ-ГЕНОВ В ПРОЦЕССЕ РЕГЕНЕРАЦИИ МНОГОЩЕТИНКОВОГО ЧЕРВЯ ALITTA VIRENS (POLYCHAETA, ANNELIDA)

03.03.05 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание степени кандидата биологических наук

b ФЬВ 2014

Санкт-Петербург 2014

005544842

005544842

Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете лаборатории экспериментальной эмбриологии кафедры эмбриологии Биолого-почвенного факультета

доктор биологических наук профессор

Дондуа Арчил Карпезович Санкт-Петербургский государственный университет

доктор биологических наук, профессор

Исаева Валерия Васильевна Институт проблем экологии и эволюция им. А.Н. Северцова РАН

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Петухова Ольга Александровна Институт цитологии РАН

Ведущее учреждение: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова Российской Академии Наук

Защита состоится 2014 г. в /<= часов на заседании совета

Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, биолого-почвенный факультет

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М. Горького СПбГУ Автореферат разослан 2014 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук

Л. А. Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Одним из важнейших свойств живых организмов является их способность к регенерации, то есть к восстановлению утраченных или поврежденных частей тела. Для изучения процессов регенерации существует множество модельных объектов, включающих представителей самых разных групп животных: кишечнополостные (гидра), лланарии, полихеты, насекомые (сверчок, таракан), и позвоночные (рыбы, хвостатые и бесхвостые амфибии, млекопитающие) (Иванов, 1912; Mito et al., 2002; Bryant et al., 2002; Thummel et al., 2007; Han et al., 2008; Gierer et al., 2012). Эти модельные животные обладают очень вариабельными регенерационными способностями. Например, среди лофотрохозойных животных некоторые планарии восстанавливают тело из маленького кусочка (Egger et al., 2007), полихеты способны отращивать передний и задний конец тела (Воронцова, 1949), а пиявки, принадлежащие как и полихеты к типу Annelida, могут отращивать только аксоны нейронов при повреждении нервной системы (Nicholls, Hernandez, 1989). Среди позвоночных хвостатые амфибии и до определенной стадии развития бесхвостые могут восстановить новую конечность и хвост, а млекопитающие способны только к физиологической регенерации и репарации внутренних органов (Awgulewitsch, 2003; Brun et al., 2004; Morgan, Whiting, 2008).

Расширение круга модельных объектов необходимо для понимания механизмов регенерации, их общности и различий у разных животных. С этой точки зрения полихеты (тип Annelida, Lophotrochozoa) являются крайне интересной группой животных, так как ее представители обладают широкими и разнообразными регенерационными возможностями. Множество работ, описывающих морфологические особенности регенерации полихет, появилось в прошлом столетии (Иванов, 1912; Berrill, 1928; Sayles, 1932; Berrill, 1952). Практически все полихеты способны к репаративной регенерации по типу эпиморфоза с образованием бластемы в месте повреждения, из которой формируются недостающие части тела. При этом некоторые полихеты могут отращивать и задние и передние структуры. К ним относятся многие сидячие гетерономно сегментированные черви. Другие же представители этого класса не способны к передней регенерации вовсе и восстанавливают только задний отдел тела после повреждения (Короткова, 1997). Для некоторых полихет успешность и полнота прохождения восстановительного процесса зависит, например, от уровня повреждения, для большинства же червей характерна регенерация строго определенного числа сегментов при передней регенерации. При этом остальные недостающие сегменты возникают из старых сегментов тела путем метаморфоза (Berrill, Mees, 1936).

П.П. Иванов, посвятивший ряд работ подробному изучению морфологических и гистологических аспектов регенерации Annelida, считал регенерацию аннелид, в частности полихет, уникальным и интереснейшим явлением. В отличие от других животных, восстанавливающих после ампутации именно ту часть тела, которая была утрачена, полихеты в большинстве своем вне зависимости от количества отрезанных спереди и сзади сегментов всегда восстанавливают спереди строго определенное для каждого вида количество сегментов, соответствующее числу ларвальных. Сзади же всегда регенерируют пигидиальные структуры и зона роста, которые также имеются на стадии сегментированной личинки (Иванов, 1912). Этот своеобразный спо

регенерации предполагает высокую степень регенеративных способностей, а также возможность быстрой перестройки позиционной информации, преобразования границ и пропорций тела после утраты его части. Появление молекулярных методов исследований в биологии позволяет изучать механизмы, лежащие в основе этих своеобразных черт регенерации попихет.

Прекрасными кандидатами на роль проводников позиционной информации могут быть Нох-гены. Это кластерные гены, которые кодируют ключевые для эмбриогенеза транскрипционные факторы, вовлеченные во множество морфогенетических процессов (Akam, 1998). Считается, что основная их функция состоит в эмбриональной регионализации и спецификации передне-задней оси тела билатеральных животных в соответствии с правилами временной и пространственной коллинеарности (Castelli-Gair, 1998). В то же время, показана постэмбриональная экспрессия Нох-генов и установлено их участие во многих процессах, идущих в дефинитивном теле некоторых животных, в том числе и в процессах регенерации у представителей разных эволюционных ветвей.

В лаборатории экспериментальной эмбриологии Биологического института СПбГУ была описана экспрессия одиннадцати Нох-генов в онтогенезе морской эррантной полихеты Alitta virens (ранее Nereis virens, Nereididae, Annelida, Lophotrochozoa) (Kulakova et al., 2007). Нереидные полихеты в своем индивидуальном развитии проходят стадии сферической личинки трохофоры, сегментированной личинки нектохеты и стадию постларвального роста. В ходе развития нектохеты Нох-гены обнаруживают канонический коллинеарный паттерн экспрессии в сегментированной эктодерме. Однако в ходе формирования многосегментного дефинитивного тела червя эти гены имеют иной способ разметки морфогенетической территории. В теле ювенильного червя Нох-гены формируют разнонаправленные градиенты, домены их экспрессии перекрываются и не имеют устойчивых передних границ в постларвальных сегментах (Bakalenko et al, 2013). На основании этих данных возникло предположение, что Нох-гены у растущего червя не вовлечены в спецификацию морфологически сходных сегментов тела. Вероятнее всего, они участвуют в создании и поддержании позиционных координат в гомономно сегментированном теле животного, определяя позицию каждого из сегментов относительно терминальных структур - головы и пигидия. Если эта гипотеза верна, картина экспрессии Нох-генов должен подвергнуться реорганизации после позиционного сбоя, который происходит после ампутации части тела. Мы полагаем, что исследование экспрессии Нох-генов во время регенерации A. virens поможет проверить гипотезу об их роли в создании постларвального тела червя, расширит наше понимание механизмов регенерации представителей класса Polychaeta и, вероятно, позволит сделать некоторые обобщения, касающиеся роли Нох-генов в процессах регенерации разных животных.

Цель работы: изучить пространственную и временную организацию экспрессии Нох-генов при регенерации задней части тела полихеты АШа virens.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать условия эксперимента, которые позволили бы максимально точно описать динамику экспрессии Нох-генов в процессе регенерации A.virens.

2. Проанализировать динамику экспрессии Нох-генов при регенерации этой полихеты методом гибридизации in situ на целых животных.

3. Проверить гипотезу о градиентной экспрессии Нох-генов как факторе создания и поддержания позиционной информации в постларвальном теле A. virens

4. Оценить наличие коллинеарной экспрессии Нох-генов в ходе регенерации A. virens.

5. Исследовать участие антисмысловых транскриптов Нох-генов в процессах регенерации A. virens.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активность Нох-генов является важным фактором нормальной регенерации полихеты A. virens.

2. Время активации Нох-генов в процессе регенерации A. virens не коррелирует с их предполагаемым порядком расположения в геноме.

3. Динамика экспрессии Нох-генов в ходе регенерации A.virens свидетельствует в поддержку гипотезе об их роли в создании и поддержании позиционной информации в постларвальном теле червя.

4. В ходе регенерации A.virens антисмысловые транскрипты Нох-генов обнаруживают закономерные изменения картины распределения.

Научная новизна работы

Многие представители эволюционной ветви Lophotrochozoa, в частности полихеты, остаются малоизученными как в плане экспрессии Нох-генов, так и в отношении молекулярных механизмов процессов регенерации. В данной работе впервые продемонстрирована динамика экспрессии всего комплекса Нох-генов в ходе регенерации представителя группы Lophotrochozoa - полихеты A. virens. Ген Nvi-Post1 был исключен из анализа, так как в ларвальном и постларвальном развитии полихеты он обнаруживает тканеспецифичную экспрессию в клетках щетинконосных мешков. Впервые были получены данные о перестройке картин экспрессии Нох-генов при изменении длины животного после ампутации части его тела. Установлено, что реорганизация картин экспрессии происходит до морфологических проявлений регенерационных процессов. Впервые получены данные об участии длинных некодирующих РНК в процессе регенерации билатеральных животных.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты диссертации вносят вклад в понимание возможной функции Нох-генов в развитии гомономно сегментированного тела полихеты A.virens. Полученные данные расширяют наше понимание стратегий использования Нох-генов в дефинитивном организме в разных ветвях билатеральных животных. Данные о ранней скоординированной работе Нох-генов в процессе регенерации отчасти объясняют хорошие регенерационные потенции A.virens и других животных, демонстрирующих сходный с Alitta характер экспрессии Нох-генов в дефинитивном теле. Участие антисмысловых транскриптов предлагает возможный механизм, лежащий в основе быстрой реорганизации картин экспрессии Нох-генов. Полученные результаты могут

использоваться в материалах лекционных курсов по эволюции, генетике и биологии развития.

Личный вклад автора

Все экспериментальные процедуры, опубликованные в статьях, сбор и подготовка материала, планирование экспериментов были выполнены автором самостоятельно или совместно с научным коллективом лаборатории экспериментальной эмбриологии, главным образом, м.н.с. Бакаленко Н.И. и с.н.с., к.б.н. Кулаковой М.А., что нашло отражение в публикациях. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с научным коллективом лаборатории (соавторы), при поддержке руководителя работы д.б.н., профессора Дондуа А.К.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 24 печатных работы, из них 6 - статьи, 2 -материалы конференции, опубликованные в рецензируемых журналах. Основные положения работы доложены и обсуждены на международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (С-Петербург, 2004), конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2005), международной научной конференции "Каспар Фридрих Вольф и современная биология развития" (Санкт-Петербург, 2009), XII научной сессии морской биологической станции СПбГУ (Санкт-Петербург, 2011), всероссийской конференции «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии» ПИН РАН (Москва, 2011) 13-ом конгрессе Европейского сообщества эволюционной биологии (Тюбинген, Германия, 2011), международной конференции «Progress In Understanding The Origins of Biodiversity», (Ювяскюля, Финляндия, 2012), конференции европейского сообщества EvoDevo (Лиссабон, Португалия, 2012) и всероссийской конференции с международным участием «Эмбриональное развитие, морфогенез и эволюция» (Санкт-Петербург, Россия, 2013).

Объём и структура диссертации

Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, постановку задачи, описание материалов и методов, результаты исследования, их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы, включающий 168 наименований. Материалы диссертации изложены на 149 страницах машинописного текста и проиллюстрированы 77 рисунками и 2 таблицами.

Работа поддержана фантами РФФИ (06-04-49654-а) и РФФИ (09-04-01322-а).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Культивирование животных. Половозрелые особи A.virens были собраны в губе Чупа, Белое море, в окрестностях Морской биологической станции зоологического института РАН «Картеш». Культуру ювенильных особей содержали в лаборатории экспериментальной эмбриологии (Старый Петергоф) при следующих условиях: температура 18°С, соленость 23 °/оо, искусственная морская вода (Red Sea salt).

2. Условия постановки эксперимента по регенерации. Ювенильных червей длиной 20-30 сегментов разрезали примерно посередине тела на две части с помощью

бритвы под бинокуляром. Перед операцией червей анестезировали, помещая их на 5 минут в морскую воду со следами гвоздичного масла (Sigma). Передние и задние части инкубировали раздельно в индивидуальных чашках Петри. Регенерирующих червей фиксировали 4% PFA на 1.75xPBS в следующие временные точки: 0 ч, 4 ч, 10 ч, 18 ч, 1, 2, 3 и 7 дней после ампутации (чпа/дпа). Точка 0 чпа использовалась нами в качестве контроля проницаемости РНК-зонда в ткани взрослого червя.

3. Получение матрицы для синтеза зондов и синтез DIG-меченого РНК-зонда. Матрицы для синтеза зондов были получены с помощью полимеразно-цепной реакции (ПЦР) на амплификаторе Mastercycler personal (Eppendorf). Качество прохождения ПЦР проверяли с помощью гельэлектрофореза. Дигоксигенин-меченые РНК-зонды синтезировали по протоколу Roche. Инкубацию производили при 37'С в течение ночи. Полученные РНК-зонды проходили очистку с использованием RNeasy MinElute Cleanup Kit (QIAGEN) по протоколу фирмы производителя. Зонды хранили в гибридизационном буфере при -20°С. Антисмысловые зонды использовались для выявления смысловых транскриптов. Смысловыми зондами обнаруживались антисмысловые транскрипты.

4. Гибридизация in situ на тотальных препаратах (WMISH). WMISH выполнялась по протоколу, описанному ранее (Irvine et al., 1999) с некоторыми модификациями. Для улучшения проницаемости зонда червей обрабатывали коллагеназой (Sigma) в течение 3-5 мин и инкубировали в SDS/Tween буфере 30 мин. Обработку Протеиназой К (Sigma) производили в течение 8-10 мин. Температура предгибридизации и гибридизации составляла 65°С. Температура отмывок от зонда -67°С. Инкубацию с антителами Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments from sheep (Roche) (1:2000) производили в течение ночи при температуре +4°С. Для локализации сайтов посадки антител использовали хромогенный субстрат BM-purple (Roche). В одном опыте использовалось 8-10 червей, каждый эксперимент повторялся не менее трех раз.

5. Получение и обработка изображений. Результаты анализировали на микроскопе DMRXA (Leica), оснащенном цифровой камерой Leica DC500. Перед микроскопическим анализом червей заключали в гвоздичное масло. Оптические срезы были собраны в стопки (стекинг) с помощью программы Helicon Focus. Коррекция яркости, контрастности, цветового баланса и финальная подготовка изображений осуществлялась в программе Adobe Photoshop CS5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Нох-гены в регенерации Alitta virens и особенности их экспрессии.

В данной работе мы описали динамику экспрессии 10 Нох-генов в ходе регенерации задней части тела полихеты Alitta virens на разных стадиях этого процесса. На основании полученных нами данных Нох-гены можно разделить на четыре группы по характеру динамики их экспрессии.

1.1. Гены раннего ответа. В первую группу мы включили гены Nvi-Lox5, Nvi-Lox2 и Nvi-Post2. Главной особенностью этой группы генов является то, что в ходе регенерации реорганизация картин экспрессии происходит очень рано, уже через 4 часа после ампутации (Рисунки 1, 2, 3). Это событие происходит задолго до начала пролиферации, которая у Alitta virens отмечается примерно с 24 чпа, и иных морфологических проявлений регенерации. Самый задний ген Nvi-Post2 активируется de novo в дифференцированных клетках нервной системы сегмента, ближайшего к

месту разреза, что характерно для экспрессии данного гена в последних сегментах при нормальном постларвальном росте (Bakalenko et al., 2013) (Рисунок 3, с, к). Транскрипция генов Nvi-Lox5 и Nvi-Lox2 также усиливается в нервном ганглии последнего сегмента тела (Рисунок 1, с, к; рис. 2, с, к). Через некоторое время экспрессия Nvi-Lox5, Nvi-Lox2 и Nvi-Post2 распространяется на нервные ганглии других сегментов тела, а также на мезодерму и энтодерму последнего сегмента тела (Post2) (Рисунок 3,1, т) и вентральную эктодерму ближайших к разрезу старых сегментов тела (Lox5 и Lox2) (Рисунок 1, I, т; рисунок 2, I, т). Интересно отметить, что с формированием терминальных структур (48 часов - 3 дня) интенсивность экспрессии генов Nvi-Lox2 и Nvi-Post2 в нервной системе несколько падает, но гены продолжают активно работать в пролиферирующих тканях зоны роста и пигидия (Рисунки 1,2,3, g, h, о. Р)-

1.2. Гены среднего ответа, экспрессирующиеся в нервной системе.

Перестройка картин экспрессии Nvi-Hox5 и Nvi-Hox7 происходит несколько позже по времени (10 и 18 чпа), но также до начала активной пролиферации. Транскрипты обоих генов перестают обнаруживаться в ближайших к разрезу сегментах, причем экспрессия Nvi-Hox5 исчезает сначала из вентральной эктодермы (10 чпа) (Рисунок 4, d, I), а затем из клеток нервной системы последнего сегмента тела (18 чпа) (Рисунок 4, е, т). Ген Nvi-Нох7 сохраняет экспрессию в нервных ганглиях, но перестаёт работать в покровном эпителии близлежащего к разрезу сегмента (18 чпа). Интересно отметить, что задняя граница экспрессии Nvi-Hox5 смещается кпереди до формирования новых сегментов. После активизации зоны роста и появления новых сегментов, у места разреза вновь возникает транскрипция этого гена (Рисунок 4, i, q).

1.3. Гены среднего ответа, экспрессирующиеся в зоне роста. В эту группу мы объединили гены Nvi-Hox2 и Nvi-НохЗ. Оба гена не формируют градиенты экспрессии в постларвальном теле и активируются уже через 10 часов de novo в двух билатеральных доменах поверхностных, а также глубинных (для Нох2) клеток, примыкающих к линии разреза. С началом пролиферации (24 чпа) домены экспрессии постепенно расширяются и к моменту полного формирования терминальных структур (3 дпа) оба гена практически восстанавливают свой постларвальный характер экспрессии. К моменту активации обоих генов уже произошло становление новых границ тела за счет активации генов первой группы, и задний конец маркирован транскрипцией Nvi-Post2, Nvi-Lox5 и Nvi-Lox2. В связи с этим мы полагаем, что экспрессия генов третьей группы связана с формированием новой зоны роста.

1.4. Гены позднего ответа. В четвертую группу попали гены, экспрессия которых изменяется только с появлением новых структур, то есть после начала пролиферации (24 чпа) и органогенеза (48 чпа). Экспрессию переднего гена Nvi-Hox1 можно видеть через 3 дпа, в зачатках цирр нового пигидия (Рисунок 5, h, р). Позже (7 дней), его экспрессия начинается в ганглиях молодых сегментов. Срединный ген Lox4 аналогичным образом экспрессируется в нервных ганглиях молодых сегментов. Первые признаки его транскрипции de novo мы наблюдаем через 48 часов после операции. Срединный ген Nvi-Hox4 также не демонстрирует изменения характера экспрессии.

Рисунок 1. Экспрессия Ш-1ох5 в постларвальном развитии (а) (из Вака1епко е! а1„ 2013) и регенерации (Ь-д). Головной конец вверху на всех фотографиях. Все фотографии выполнены с вентральной стороны, (а) Экспрессия Ш-1ох5 в ювенильном черве во время нормального роста. Экспрессия образует задне-передний градиент и охватывает зону роста (Вака1епко е( а1., 2013). Экспрессия Ш-1ох5 0 чпа (Ь, й, 4 чпа (с, к), 10 чпа (а, I), 18 чпа (е, т), 24 чпа п), 48 чпа (д, о), 3 дпа (Ь, р) и 7 дпа (¡, д). Черные наконечники стрелок указывают формирующиеся №//-/_ох5-негативные пигидиальные лопасти (о). Увеличение 20х (ан), увеличение 40х (¡-д).

Рисунок 2. Экспрессия N№¿0x2 в постларвальном развитии (а) (из Вака1епко й ак, 2013) и регенерации (Ь-д). Головной конец вверху на всех фотографиях. Все фотографии выполнены с вентральной стороны, (а) Экспрессия Л/иЧ.ох2 в ювенильном черве во время нормального роста. Экспрессия образует задне-передний градиент и охватывает зону роста (Вака1епко е! а!., 2013). Экспрессия Ш-0 чпа (Ь, ¡), 4 чпа (с, к), 10 чпа (с), I), 18 чпа (е, т), 24 чпа п), 48 чпа (д, о), 3 дпа (И, р) и 7 дпа (¡, д). Красными стрелками указаны домены эспрессии в основании параподий (I). Увеличение 20х (ач), увеличение 40х (]-д).

. .мр. ~ " ь ягОипа -Ш- Л. ф ^ ж : ж Г а чпа А ж 1' - . из:« 8 , 4» 411» Ь дпа Щ&щ* * 1 \ 7 дпа 11!

>» Я** 1 * к мшт ч" £ ■ ШЯ Ш 11 о ^

Рисунок 3. Экспрессия Ш-Ро«?2 в постларвальном развитии (а) (из Вака!епко й а1., 2013) и регенерации (Ь-д). Головной конец вверху на всех фотографиях. Все фотографии выполнены с вентральной стороны, (а) Экспрессия Л/и-РИ(2 в ювенильном черве во время нормального роста.

Экспрессия образует задне-передний градиент и охватывает зону роста (Bakalenko et al, 2013). Экспрессия Nvi-Post2 0 чпа (b, j), 4 чпа (с, к), 10 чпа (d, I), 18 чпа (е, т), 24 чпа (f, п), 48 чпа (д, о), 3 дпа (h, р) и 7 дпа (i, q). Черные стрелки указывают выпятившуюся ткань кишки (к). Увеличение 20х (a-i), увеличение 40х (j-q).

На всех стадиях регенерации сохраняется его экспрессия в ганглиях нервной системы и основаниях параподий. Экспрессия de novo возникает после

начала пролиферации (2-3 дня) в мезодермальных доменах в области формирующегося пигидия. Передние границы экспрессии Nvi-Hox1 и Nvi-Hox4 сохраняются на уровне ларвальных сегментов. В формирующейся зоне роста экспрессия всех трёх генов отсутствует.

Таким образом, большинство Нох-генов A.virens реагируют на повреждение задней части червя до начала пролиферативных и морфологических изменений в теле животного. Одним из самых ранних молекулярных событий при восстановлении задней части Alitta virens является активация генов, экспрессия которых характерна для заднего конца тела, в сегментах, ставших последними после ампутации (Nvi-Post2, Nv¡-Lox5, Nvi-Lox2). Гены второй группы также, по всей видимости, вносят вклад в раннюю разметку новых границ тела животного. Реорганизация картин их экспрессии происходит до начала пролиферации и явных морфологических проявлений регенерации. Гены позднего ответа реагируют на повреждение после начала пролиферации и формирования бластемы. На этом этапе уже обозначен новый задний конец тела червя и активно идут регенерационные процессы, а гены четвертой группы экспрессируются в постепенно восстанавливающихся органах и структурах.

1.5. Двухфазная экспрессия Нох-генов в регенерации A.virens. Анализируя картины экспрессии Нох-генов и сопоставляя динамику экспрессии генов с морфологическими процессами, мы пришли к выводу о существовании двух фаз процесса регенерации A. virens (Рисунок 6). В первую фазу (до 48 часов) происходит восстановление целостности и перемасштабирование тела в новых границах за счёт изменения характера экспрессии Нох-генов, которые, вероятно, выступают в роли носителей позиционной информации. Новый задний конец тела обозначается на молекулярном уровне за счет активации экспрессии генов Nvi-Post2, Nvi-Lox5 и Nvi-Lox2 и подавления экспрессии Nvi-Hox7 и Nvi-Hox5 в последнем сегменте тела. Важно то, что эта реорганизация происходит до начала формирования бластемы, в дифференцированных клетках прежнего тела. Вторая фаза экспрессии накладывается на первую и начинается с 24 чпа. На этом этапе бластема формируется за счет дедифференцировки и пролиферации клеток под раневым эпителием. Большинство Нох-генов интенсивно экспрессируются в тканях бластемы с начала ее формирования и продолжают активно работать в зачатках терминальных структур, морфологически различимых с 48 чпа.

1.6. Закономерности пространственной и временной активности Нох-генов в ходе регенерации A.virens. Во время перестройки картин экспрессии Нох-генов в ходе регенерации передние границы «ларвальных» генов (за исключением гена Nvi-Post2), остаются стабильными. Напротив, передние границы экспрессии генов срединной

группы смещаются в пределах пятого-восьмого сегмента, но никогда не распространяются на ларвальное тело. Эта особенность, вероятно, отражает различия эпигенетических настроек Нох-транскрипции в ларвальных и постларвальных сегментах. Ларвальные сегменты, в которых никогда не экспрессировался тот или иной Нох-ген (Kulakova et al., 2007), не могут инициировать его экспрессию de novo. Примечательно, что порядок активации или репрессии Нох-генов в области ампутации не соотносится с их предполагаемым порядком расположения на хромосоме.

1.7. Градиентная экспрессия Нох-генов задает позиционную информацию в теле A. virens. Характер экспрессии Нох-генов в ларвальном и постларвальном онтогенезе A.virens существенно различается. В ходе развития нектохеты многие из Нох-генов принимают участие в регионализации тела вторичной личинки в соответствии с правилами коллинеарности, как в эмбриогенезе других билатеральных животных (Kulakova et al., 2007). Напротив, в постларвальном теле Нох-гены экспрессируются в виде разнонаправленных, широко перекрывающихся градиентов, каждый из которых строго индивидуален (Bakalenko et al., 2013). Ювенильный A. virens растёт в длину за счёт формирования внешне одинаковых сегментов. Очевидно, что сложная система транскрипционных градиентов Нох-генов выглядит здесь избыточной, если мы приписываем этим генам традиционную функцию осевой спецификации. Было высказано предположение, что в данном случае Нох-гены могут определять не морфологические, а позиционные различия между сегментами относительно концов постоянно растущего тела, и формировать позиционную информацию в теле червя (Андреева и Кулакова, 2008). Данные о динамике экспрессии Нох-генов в ходе регенерации говорят в поддержку этой гипотезы. Действительно, для большинства исследованных генов мы наблюдаем быструю реорганизацию картин экспрессии в дифференцированных клетках еще до морфологических проявлений процессов регенерации. Картины экспрессии генов ранней и средней групп перестраиваются таким образом, что последние сегменты оперированного червя приобретают после ампутации Нох-код, характерный для заднего конца тела нормального животного.

Считается, что регенерация полихет представляет собой восстановление ларвальных структур. После формирования пигидия дальнейшее восстановление утерянных сегментов осуществляется за счет функционирование зоны роста и приравнивается к процессу постларвального роста (Иванов, 1912). A. virens восстанавливает терминальные структуры через 3 дня. Тем не менее, ни к этому моменту, ни даже через 7 дпа, когда уже появляются сегменты из зоны роста, еще не происходит восстановления градиентов экспрессии Нох-генов, которые претерпели реорганизацию в результате изменения размеров тела. Этот процесс восстановления происходит еще некоторое время, пока тело червя не вернется к пропорциям, которые оно имело до повреждения.

Таким образом, если рассматривать регенерацию как процесс восстановления целостности организма, то для полихеты A. virens этот процесс продолжается, по крайней мере, на молекулярном уровне и после восстановления терминальных структур: происходит реорганизация и восстановление градиентов экспрессии Нох-генов.

2. Сравнительная оценка регенеративных потенций и дефинитивной экспрессии Нох-генов у Bilateria.

Данные по дефинитивной экспрессии Нох-генов и их активности при осевой регенерации у Bilateria весьма ограничены. Интересно, что экспрессия Нох-генов в дефинитивном теле и ее изменение в ответ на повреждение были обнаружены у животных, обладающих высокими регенерационными способностями - у некоторых плоских червей (планарий), аннелид и низших позвоночных. Для планарии Dugesia japónica была показана персистирующая градиентная экспрессия трех Нох-генов DjAbd-Ва, Plox4-Dj и Plox5-Dj (Nogi, Watanabe, 2001; Orii, et. al., 1999). При задней регенерации происходит восстановление градиентов экспрессии этих генов с учетом новых пропорций тела. Авторы цитированных работ полагают, что Нох-гены активируются в дифференцированных клетках и передают информацию о позиционном нарушении стволовым клеткам - необластам.

При регенерации головного конца дождевого червя Penonyx excavatus была обнаружена активация трех ортологов Нох1 - Pex-lab01, Рех-1аЬ02 и Pex-Iab03 (Cho et al., 2009), причем экспрессия одного их генов - Рех-1аЬ03 - достигала максимума уже через 1 час после операции.

Перекрывающиеся домены экспрессии 5'НохС-генов были обнаружены в нервной системе взрослого тритона Pleurodeles waltl. При отрезании хвоста уровни экспрессии генов PwHoxc13, PwHoxc12, и PwHoxcIO возрастали соответственно в 20, 7 и 2 раз. Подобная персистирующая экспрессия Нох-генов в нервной системе взрослого животного, вероятно, обеспечивает создание позиционной информации, проводниками которой являются Нох-белки (Nicolas et al, 2003). В более ранних исследованиях была также обнаружена экспрессия Нох-генов в интактных конечностях и хвосте взрослых Urodella (Savard et al, 1988, Simon, Tabin, 1993). Вероятно, поддержание экспрессии Нох-генов в дефинитивных тканях определяет потенции хвостатых амфибий к регенерации (Savard et al, 1988; Simon, Tabin, 1993).

Напротив, для пиявок Helobdella sp. и Hirudo medicinalis достоверно показано отсутствие дефинитивной Нох-экспрессии. Транскрипция Нох-генов детектируется в ганглиях брюшной нервной цепочки на поздних стадиях развития животных и продолжается очень недолгое время (Kourakis, et al., 1997, Kourakis, Martindale, 2001). Известно, что пиявки не способны к осевой регенерации. Однако они могут заново отращивать аксоны и восстанавливать синаптические связи при микротравмах ганглиев, в уже сформированной нервной системе. Примечательно, что при этом активируются различные эмбриональные факторы, в том числе и Нох-ген - Lox2.

Высшие позвоночные экспрессируют Нох-гены во взрослом состоянии, но не способны к эпиморфной регенерации утраченных частей тела (Yokoyama, 2008). Тем не менее, у млекопитающих описана регенерация органов за счет стволовых клеток, присутствующих в данном типе ткани (Leucht et al., 2008; Mahdipour et al., 2011) и физиологическая регенерация (Awgulewitsch, 2003; Chung et al., 2009). Стволовые клетки - фибробласты, мезенхимные стволовые клетки - несут в себе Нох-код, полученный ими еще в период эмбриогенеза (Chang et al., 2002). Будучи раз установленным, этот Нох-код сохранятся на протяжении всей жизни. Он не может быть реорганизован при утрате части тела, поскольку стволовые клетки коммитированны на восстановление только определенных тканей и их позиция четко детерминирована за

счет Нох-кода (Chang et al., 2002; Leucht et al., 2008). Стойкость позиционной памяти, необходимая для правильной дифференцировки фибробластов и мезенхимных клеток в контексте их окружения, обеспечивает организму отлаженную физиологическую и органную регенерацию в ущерб регенерации эпиморфной. Для млекопитающих, с их большим разнообразием тканей и необходимостью поддерживать их гомеостаз и целостность, раннее коммитирование стволовых клеток при помощи Нох-кода оказалось более выгодным эволюционным приобретением, чем способность к реорганизации позиционных значений во взрослом теле.

Таким образом, сравнивая данные по дефинитивной экспрессии Нох-генов у представителей разных эволюционных ветвей, можно предположить, что у общего предка всех билатеральных уже существовала система создания и поддержания позиционной информации во взрослом теле за счет Нох-генов. Современные Bilateria по-разному используют этот регуляторный инструмент. Изученные представители Lophotrochozoa - полихеты и планарии - используют Нох-кластер для быстрой реорганизации позиционной информации, необходимой при восстановлении утраченных частей тела. Среди позвоночных есть группы, также способные к осевой регенерации (амфибии), но есть и млекопитающие, использующие Нох-зависимую систему позиционной памяти для поддержания тканевого гомеостаза.

3. Антисмысловые транскрипты Нох-генов в регенерации A.virens.

Быстрая реорганизация картин экспрессии Нох-генов в ходе регенерации требует скоординированной регуляции этого процесса. В ходе изучения постларвальной экспрессии Нох-генов у A.virens нами были обнаружены длинные некодирующие РНК (нкРНК), комплементарные мРНК Нох-генов (Bakalenko et al., 2013). В данной работе была изучена динамика транскрипции антисмысловых нкРНК генов Nvi-Hox5 (Рисунок 7) и Nvi-Hox7 при регенерации червя. Транскрипт Nvi-antiHox5 выявляется в ганглии последнего сегмента тела на сроке 4 чпа. К этому моменту экспрессия Nv¡-Hox5 еще не претерпела реорганизацию. Через несколько часов домен экспрессии Nvi-Hox5 смещается к головному концу, a Nvi-antiHox5 активируется на свободной территории (Рисунок 7 d, I). К 18-24 чпа области транскрипции нкРНК и мРНК перекрываются в 1-2 ганглиях в середине тела, после 48 чпа они становятся комплементарны. В случае Nvi-Нох7 наблюдается иная картина перекрывания областей транскрипции нкРНК и мРНК. На всех стадиях регенерации транскрипты выявляются в одних и тех же ганглиях, но, вероятно, в разных клетках.

Комплементарность областей транскрипции Nvi-Hox5 и Nvi-antiHox5 указывает на то, что более ранняя активация антисмысловой РНК обеспечивает быструю негативную регуляцию кодирующего транскрипта. Сходное явление было описано для транскриптов Ubx и antiUbx в развитии нескольких видов многоножек (Brena et al., 2006; Janssen, Budd, 2010). Предложенные авторами этой работы возможные механизмы негативной регуляции одного транскрипта другим должны осуществляться в ядре клетки. Однако мы наблюдаем выход обоих транскриптов в цитоплазму, где они и обнаруживаются методом WMISH. Остается невыясненным, почему нкРНК покидает ядро, и какой механизм возможной регуляции смыслового транскрипта антисмысловым при этом задействован. Кроме того, на некоторых стадиях регенерации наблюдается

перекрывание доменов транскрипции мРНК и нкРНК. Здесь регуляция может происходить на уровне трансляции за счет РНК-интерференции или другого, еще неизвестного механизма.

4. Регуляция регенерации через «организатор».

Градиентные картины экспрессии различных факторов в ходе регенерации подразумевают наличие некоего «организатора», который является источником сигналов для активации морфогенов. Зачастую в процессах регенерации таким организатором становится место контакта ранее неконтактировавших тканей (Kobayashi et al. 1999; Kato et al. 2001; Reddien, Sanchez Alvarado, 2004).

В нашей работе мы не проводили поиск потенциального «организатора», который мог бы инициировать раннюю активацию Нох-генов в нервной системе у места ампутации. Тем не менее, некоторые наши наблюдения указывают на то, что таким организатором может служить место контакта кишечного эпителия с покровами тела. Действительно, примерно через 0-4 часа после операции края раны плотно стягиваются в результате сокращения кольцевых мышц и кишка контактирует с эктодермой, предотвращая вытекание целомической жидкости (Старунов В., Лаврова О.Б., устное сообщение). Это происходит незадолго до активации самого «раннего» гена Nvi-Post2 в ганглии последнего перед разрезом сегмента тела и может играть роль в регуляции этого процесса.

В нашей лаборатории было показано, что через 4 часа после операции в месте разреза инициируется экспрессия РагаНох гена Nvi-Cad, которая позднее распространяется на значительную часть энтодермальной кишки, где ген не экспрессируется в норме (Kulakova et al., 2008). Вполне возможно, начало экспрессии Nvi-Cad в кишечной ткани как раз и является сигналом к перестройке картин экспрессии Нох-генов в тканях нервной системы.

5. Униполярная регенерация Alitta virens - догадки и предположения.

Несмотря на быструю реорганизацию экспрессии Нох-генов при повреждении тела и восстановление утраченной задней части, червь Alitta virens все же ограничен в своих регенерационных возможностях - он не способен восстанавливать головной конец, как это делают многие сидячие полихеты. Мы предприняли попытку найти объяснение этому явлению. Оказалось, что в кишечном эпителии в области разреза через 4 чпа активируется ген Nvi-Cad. Примерно в это же время в ганглии сегмента тела у линии разреза - «первого сегмента» - происходит активации гена Nvi-Post2. Аналогичные события происходят при задней регенерации, когда в сегменте тела, ставшим после ампутации последним, в энтодерме активируется ген Nvi-Cad, а в нервной системе - Nvi-Post2 (Рисунок 54, Рисунок 76). По всей видимости, сигнальные каскады, запускаемые образовавшимся «организатором», приводят к активации гена Nvi-Cad, который в свою очередь активирует ген Nvi-Post2. Nvi-Post2 в нормальном развитии экспрессируется в задней части червя и при регенерации его активация обозначает территорию тела как заднюю, что и препятствует развитию в этой области головы.

Что же препятствует развитию в этой области задних структур? Очевидно, для инициации этого сложного морфогенетического процесса требуется активность всей

системы Нох-генов, как это было показано нами выше. Более того расшифровка молекулярно-биологических аспектов регенерации Аннелид потребует детального изучения и других контролирующих морфогенез генетических систем, взаимодействующих с системой кластерных гомеобокссодержащих генов.

Рисунок 4. Экспрессия АМ-Нох5 в постларвальном развитии (а) (из Вака1епко е! а1„ 2013) и регенерации (Ь<|). Головной конец вверху на всех фотографиях. Все фотографии выполнены с вентральной стороны, (а) Экспрессия А/и-Нох5 в ювенильном черве во время нормального роста. Экспрессия имеет форму передне-заднего градиента и не распространяется на зону роста (Вака1епко е1 а1., 2013). Экспрессия А/и-Нох5 0 чпа (Ь, ¡), 4 чпа (с, к), 10 чпа (с1,1), 18 чпа (е, т), 24 чпа (1, п), 48 чпа (д, о), 3 дпа (И, р) и 7 дпа (¡, ц). Подавление транскрипции гена происходит через 10 чпа (с1, I). Увеличение 20х (ач), увеличение 40х (¡-д).

Рисунок 5. Экспрессия ШьНох1 в постларвальном развитии (а) (из Вака1епко е( а!„ 2013) и регенерации ((Ь-д). Головной конец вверху на всех фотографиях. Все фотографии выполнены с вентральной стороны, (а) Экспрессия №п-Нох1 в ювенильном черве во время нормального развития. Экспрессия обнаруживается в нервном ганглии первого ларвального сегмента, перистомиальных и анальных циррах. Экспрессия в зона роста отсутствует (Вака1епко е! а\„ 2013). Экспрессия АМ-Нох1 0 чпа (Ь, й, 4 чпа (с, к), 10 чпа (с1, I), 18 чпа (е, т), 24 чпа (Г, п), 48 чпа (д, о), 3 дпа (Ь, р) и 7 дпа (¡, д). Черными стрелками обозначена экспрессия в перистомиальных циррах. Красные стрелки указывают экспрессию в зачатках пигидия. Увеличение 20х (ач), увеличение 40х (]-д).

Phase 1

Oh

4h

10h

Hoxl

Hox2

НохЗ

Hox4

asHox7

Рисунок 6. Схематическое изображение экспрессии Нох-генов (разные цвета) и распределения антисмысловых транскриптов (клеточки) в области разреза на разных стадиях регенерации A. virens. Светло-голубым цветом отмечена зона перекрывания двух фаз экспрессии генов (24 чпа и 48 чпа). Высота цветных полос отражает визуальную разницу в интенсивности экспрессии генов.

Рисунок 7. Транскрипция Ш-апННох5 в постпарвапьном развитии (а) (из Вака1епко й а\„ 2013) и регенерации (И). Головной конец вверху на всех фотографиях. Все фотографии выполнены с вентральной стороны, (а) Распределение Ым-апННох5 в ювенильном черве во время нормального роста. Транскрипт распределяется в виде задне-переднего градиента и локализуется также в зоне роста (Вака1епко а а!., 2013). Транскрипция АЛя- ап«Нох5 0 чпа (Ь, й, 4 чпа (с, к), 10 чпа (<!, I), 18 чпа (е, т), 24 чпа (1, п), 48 чпа (д, о), 3 дпа (Ь, р) и 7 дпа (¡, я). Черные наконечники стрелок указывают группы крупных Ш-апШох5-положительных клеток под раневым эпителием (п). Красные наконечники стрелок маркируют формирующиеся пигидиальные лопасти, свободные от транскрипции (о). Белой звездочкой отмечено неспецифичное окрашивание в голове. Увеличение 20 х (а4), 40 х (¡-я).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы показали участие всего набора Нох-генов (кроме A/w-Яosf2) в задней регенерации полихеты АШа мгепз. Градиентные картины экспрессии ряда Нох-генов претерпевают быструю и слаженную реорганизацию, которая направлена на исправление глубоких нарушений позиционной информации. Эта реорганизация постепенно восстанавливает существовавшую до повреждения картину экспрессии Нох-генов, характерную для задней области тела червя. Реорганизация экспрессии Нох-генов происходит задолго до начала пролиферации и иных морфологических проявлений регенерационного процесса. Динамика экспрессии Нох-генов при задней регенерации Амгепв указывает на то, что гены этой группы могут быть вовлечены в создание, поддержание и восстановление позиционной памяти в многосегментном теле червя.

За счет изменения характера экспрессии ряда Нох-генов происходит обозначение нового заднего конца тела полихеты на молекулярном уровне. Тем не менее, мы не можем судить о том, насколько критичны эти события для самого процесса восстановления терминальных структур. Для понимания непосредственной роли Нох-генов в процессе задней регенерации необходимы эксперименты по фенотипическому нокауту и анализ регенерационных процессов в этих условиях.

Вопреки сложившемуся мнению о том, что задняя регенерация полихет ограничивается восстановлением терминальных структур, а дальнейшие события по восстановлению утраченных сегментов тела можно приравнять к постларвальному росту, мы считаем, что, по крайней мере, на молекулярном уровне регенерация Ау/лепв как процесс восстановления целостности и пропорций организма в этот момент не заканчивается. Это выражается в перестройке градиентов экспрессии Нох-генов в теле червя, которая продолжается и после 3 дпа, то есть после формирования пигидия и зоны роста.

В ходе работы был обнаружен возможный механизм регуляции слаженного и быстрого ответа Нох-генов на повреждение тела полихеты Ажепэ. Антисмысловые последовательности некоторых Нох-генов транскрибируются в пространственных доменах отчасти комплементарных доменам транскрипции белок-кодирующих РНК. Характер их распределения в ходе задней регенерации Амгепэ позволяет предположить существование механизма подавления смыслового транскрипта антисмысловым. Цитоплазматическая локализация нкРНК указывает на их возможное участие в подавлении трансляции мРНК, вероятно, через механизм РНК-интерференции. Офомный интерес представляют дальнейший поиск антисмысловых последовательностей и исследование динамики их транскрипции в развитии и регенерации Ажепэ. Мы надеемся, что это приведет к открытию единого механизма регуляции всего кластера Нох-генов.

Сравнивая дефинитивную экспрессию Нох-генов у представителей разных эволюционных ветвей, мы можем предположить, что у общего предка билатеральных животных уже существовала система создания и поддержания позиционной информации за счет Нох-генов во взрослом теле. Тем не менее, эти свойства Нох-генов были по-разному использованы в разных таксонах. Так, млекопитающие использовали систему позиционных маркеров для корректной дифференцировки стволовых клеток

вдоль передне-задней оси тела и тем самым приобрели способность поддерживать гомеостаз и физиологическую регенерацию. Хвостатые амфибии, планарии и полихеты использовали тот же принцип создания позиционной информации за счет Нох-генов, но они оказались способными (или сохранили уже имевшиеся возможности) к быстрой реорганизации этой информации в случае позиционного нарушения, что могло стать одной из причин выдающихся регенерационных способностей этих животных.

ВЫВОДЫ

1. Одним из самых ранних событий в ходе регенерации задней части тела A.virens является предопределение положения задних терминальных структур за счет активации экспрессии ряда Нох-генов, что, вероятно, необходимо для корректной регенерации.

2. Градиентная экспрессия Нох-генов претерпевает быструю и скоординированную реорганизацию на ранних стадиях регенерации A.virens, направленную на компенсацию позиционного нарушения. Это говорит в поддержку выдвинутой ранее гипотезы о том, что Нох-гены в постларвальном онтогенезе A.virens участвуют не в создании морфологического разнообразия сегментов, но в формировании, поддержании и восстановлении позиционной информации в гомономно сегментированнном теле червя.

3. Порядок активации Нох-генов в процессах регенерации не обнаруживает временной коллинеарности.

4. Динамика экспрессии Нох-генов A.virens указывает на двухфазный характер процесса регенерации полихеты: в первой фазе, до начала пролиферации, происходит быстрая реорганизация картин экспрессии Нох-генов в соответствии с новыми пропорциями тела, во второй фазе Нох-гены экспрессируются в вновь формирующихся частях тела.

5. После восстановления пигидия и зоны роста некоторое время продолжаются процессы восстановления целостности и пропорций тела, которые на молекулярном уровне сопровождаются реорганизацией градиентов экспрессии Нох-генов до того вида, который они имели в интактном теле червя.

6. Характер распределения антисмысловых транскриптов в ходе регенерации A.virens указывает на их возможное участие в процессах регуляции Нох-генов.

Список публикаций по теме диссертации Статьи и тезисы в журналах, рекомендованных ВАК.

1. Новикова ЕЛ., Бакаленко Н.И.,. Кулакова М.А, Елисеева Е.В., Костюченко Р.П., Андреева Т.Ф., Дондуа А.К. Нох-гены в ларвальном развитии нереид Nereis vi'rens и Platynereis dumeriliill Вестник СпбГУ. 2004. Серия 3. Выпуск 4. С. 109-115

2. Бакаленко Н.И., Новикова Е.Л., Елисеева Е.В. и Андреева Т.Ф. Нох-гены в развитии и эволюции билатеральных животных II Вестник СпбГУ. 2004. Серия 3. Выпуск 4. С. 116121

3. Новикова Е.Л., Кулакова М.А., Бакаленко Н.И., Елисеева Е.В. и Андреева Т.Ф. Экспрессия генов Нох-кластера в развитии полихеты Nereis virens в норме и при регенерации. Материалы международного симпозиума "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия", С-Петербург// Цитология. 2004. № 46 (10). С. 931-932

4. Новикова Е.Л., Андреева Т.Ф. "Анализ экспрессии Нох гена Nvi-Lox5 в ларвальном развитии полихеты Nereis virens." XIV Школа "Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии" II Онтогенез. Т. 36. №5.2005. С. 368-370

5. Kulakova, М., Bakalenko N., Novikova Е., Cook С. Е., Eliseeva Е., Steinmetz Р., Kostychenko R. Р., Dondua A., Arendt D., Akam М., Andreeva Т. Нох gene expression in larval development of the polychaetes Nereis virens and Platynereis dumerilii (Annelida, Lophotrochozoa) II Dev Genes Evol. 2007. V. 217. P. 39-54

6. Бакаленко Н.И., Новикова Е.Л., Кулакова M.A. Регуляторная эволюция, Нох-гены и личинки билатеральных животных // Известия РАН. Серия биологическая. 2012. №2. С. 249-256

7. Bakalenko NI, Novikova EL, Nesterenko AY and Kulakova MA. Нох gene expression during postlarval development of the polychaete Alitta virens II EvoDevo. 2013. V. 4:13

8. Novikova EL, Bakalenko Nl, Nesterenko AY and Kulakova MA. Expression of Hox genes during regeneration of nereid polychaete Alitta (Nereis) virens (Annelida, Lophotrochozoa) II EvoDevo. 2013. V. 4:14

Тезисы, опубликованные в материалах конференций.

1. Новикова Е.Л., Андреева Т.Ф. Анализ экспрессии гена Nvi-Hox5 в ларвальном развитии полихеты Nereis virens II V Научная Сессия Морской Биологической станции Санкт-Петербургского Государственного Университета. Тезисы докладов. Санкт-Петербург. 2004. С. 83-85

2. Андреева Т.Ф., Костюченко Р.П., Шурыгина Е.В., Кулакова М.А., Новикова Е.Л., Бакаленко Н.И., Корчагина Н.М. Кластер Нох-генов морской полихеты Nereis virens: генетический контроль становления плана строения тела II Сборник тезисов III Съезда генетиков и селекционеров России "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития". Москва. 2004. С. 380

3. Н.И. Бакаленко; Е.Л. Новикова; М.А.Кулакова; А.Ю. Нестеренко; Т.Ф. Андреева; Анализ экспрессии генов Нох кластера в ходе постериорной регенерации гомономно сегментированной полихеты Nereis virens (Annelida) II Биология Стволовых Клеток: фундаментальные аспекты. Тезисы докпадов. Москва. 2005. С. 14-15

4. Новикова Е.Л., Андреева Т.Ф. Анализ экспрессии Нох гена Nvi-Lox5 в ларвальном развитии полихеты Nereis virens II VI Научная Сессия Морской Биологической станции Санкт-Петербургского Государственного Университета. Тезисы докладов. Санкт-Петербург. 2005. С. 88-89

5. Novikova E.L.; Andreeva T.F.; Нох cluster genes in animal development //1 International School for Young Scientists "Embryology and biotechnology". Тезисы доклада. Санкт-Петербург. 2005. P. 47

6. Бакаленко Н.И., Кулакова М.А., Новикова Е.Л., Михайлова К.А., Нестеренко А.Ю., Андреева Т.Ф. Нох гены Nereis virens: генетический контроль становления передне-задней оси тела нектохеты и взрослого животного II VII научная сессия морской биологической станции Санкт-Петербургского Государственного Университета. Тезисы докладов. Санкт-Петербург. 2006. С. 92-93

7. Андреева Т.Ф., Кулакова М.А., Новикова Е.Л., Бакаленко Н.И. Нох-гены в индивидуальном развитии и эволюции животных II Проблемы эволюционной

морфологии животных. Тезисы международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.В. Иванова. Санкт-Петербург. 2006. С. 11-12

8. Korchagina N.M., Bakalenko N.I., Novikova E.L., Kulakova M.A., Akam M.E., Andreeva T.F. Characteristics of Hox-genes expression in the postlarval development of Nereis virens. Perspectives on the Evolution of Animal Form II Final session of Zoonet network. Budapest. 2008. Cambridge university press. Cambridge. 2008. P. 13

9. Новикова E. Л., Бакаленко H. И., Старунов В. В., Кулакова М. А.; Динамика экспрессии Нох-генов полихеты Nereis virens при каудальной регенерации II Сборник тезисов Международной научной конференции "Каспар Фридрих Вольф и современная биология развития". Санкт-Петербург. 2009. С. 50-52.

10. Состина Д.М., Новикова Е.Л., Кулакова М.А. Динамика каудальной регенерации у нереидных полихет при декапитации II XII научная сессия морской биологической станции Санкт-Петербургского Государственного Университета. Тезисы докладов. 2011. С. 81

11. Бакаленко Н.И., Новикова Е.Л. и Кулакова М.А. Экспрессия генов Нох кластера в постларвальном развитии и при регенерации Alitta (Nereis) virens и Platynereis dumerilii (Annelida, Polychaeta) II Всероссийская конференция «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии». ПИН РАН. 2011. Сборник тезисов. С. 7-9

12. Novikova Elena, Bakalenko Nadezhda and Kulakova Milana, Hox gene cluster in ontogenesis of Alitta (Nereis) virens and Platynereis dumerilii (Annelidae, Polychaete) II Symposium at the European Society for Evolutionary Biology (ESEB) meeting, Tuebingen, Germany. 2011. Abstract book. P. 958

13. Novikova E.L., Bakalenko N.I. and Kulakova M.A. Morphogenetic basis of polychaete body plan diversification II Progress In Understanding The Origins of Biodiversity, University of Jyvaskyla, Finland. 2012. Материалы конференции. С. 5

14. Bakalenko Nadezda, Novikova Elena, Kulakova Milana. Hox cluster in postlarval ontogenesis of nereid polychaetes II European Evo Devo Conference, Lisbon. 2012. Abstract book. P. 150

15. Novikova Elena, Bakalenko Nadezhda, Kulakova Milana. Expression dynamics of Hox cluster in regeneration of polychaete Alitta (Nereis) virens (Annelida, Lophotrochozoa) II European Evo Devo Conference, Lisbon. 2012. Abstract book. P. 215

16. Бакаленко Н.И., Новикова EJl., Кулакова М.А. Нох-гены и многоступенчатый онтогенез полихет II Эмбриональное развитие, морфогенез и эволюция, всероссийская конференция с международным участием. Санкт-Петербургю 2013. Тезисы докладов. С. 61

Подписано в печать 13.01.2014г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,1. Тираж 100 экз. Заказ № 3370.

Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_lema@niail.ru http://www.lemaprint.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новикова, Елена Львовна, Санкт-Петербург

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

Ö420'i 456493 НОВИКОВА Елена Львовна

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ЭКСПРЕССИИ НОХ-ГЕНОВ В ПРОЦЕССЕ РЕГЕНЕРАЦИИ МНОГОЩЕТИНКОВОГО ЧЕРВЯ ALITTA VIRENS (POLYCHAETA, ANNELIDA)

диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

03.03.05 - биология развития, эмбриология

научный руководитель д.б.н., профессор Дондуа Арчил Карпезович

Санкт-Петербург 2014

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВЕДЕНИЕ...........................................................................................................................................5

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...................................................................................................................9

2.1. Явление регенерации и история её изучения..............................................................................9

2.2. Типы регенерационных процессов..............................................................................................10

2.3. Регуляция регенерации.................................................................................................................12

2.3.1. Позиционная информация и модели регенерации..................................................................13

2.3.2. Роль нервной системы в регенерации.......................................................................................16

2.3.3. Молекулярная регуляция репаративной регенерации............................................................20

2.3.3.1. Группа Lophotrochozoa...........................................................................................................20

2.3.3.2. Группа Ecdysozoa....................................................................................................................23

2.3.3.3. Подтип Vertebrata, группа Deuterostomia..............................................................................23

2.3.4. Нох-гены - регуляторный фундамент эмбриогенеза и регенерации.....................................27

2.3.4.1. Нох-гены. Структурные и функциональные особенности..................................................27

2.3.4.2. Эпигенетическая регуляция Нох-генов и механизм создания «позиционной памяти»...31

2.3.4.3. Роль Нох-генов в регенерации представителей разных ветвей Bilateria...........................36

2.3.4.3.1. Подтип Vertebrata, группа Deuterostomia..........................................................................36

2.3.4.3.2. Группа Lophotrochozoa........................................................................................................44

2.3.5. AlUta virens. Жизненный цикл. Морфологическое строение.................................................47

2.3.6. Разнообразие типов регенерации полихет...............................................................................49

2.3.7. Ход регенерации полихет и клеточные источники.................................................................51

2.3.8. Стволовые клетки и клеточная миграция................................................................................53

2.3.9. Регенерация Alitla virens...........................................................................................................54

2.3.10. Нох-гены в онтогенезе A. virens..............................................................................................56

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.........................................................................................................61

3.1. Протокол опыта по регенерации полихеты Alitta virens...........................................................61

3.2. Метод гибридизации in situ с применением РНК-зонда............................................................61

3.3. Приготовление DIG-меченого РНК-зонда..................................................................................63

3.3.1. Получение рекомбинантных клонов, содержащих фрагменты Нох-генов Alitta virens

(Nereis virens) {Nvi-Hoxl, Nvi-Hox2, Nvi-НохЗ, Nvi-Hox4, Nvi-Hox5, Nvi-Lox5, Nvi-Hox7, Nvi-Lox4, Nvi-Lox2, Nvi-Post2)..............................................................................................................................63

3.3.2. Подготовка матрицы к синтезу.................................................................................................64

3.3.3. Синтез ОЮЗ-меченого РНК-зонда...........................................................................................65

3.3.4. Оценка концентрации и размера полученного РНК-зонда.....................................................65

3.4. Протокол гибридизация in situ на тотальных препаратах (Whole mount in situ hybridization, WMISH).................................................................................................................................................65

3.5. Анализ препаратов па уровне световой микроскопии...............................................................67

3.6. Обработка изображений................................................................................................................67

3.7. Адаптация метода WMISH для работы с регенерирующими червями Aliíta virens...............67

3.7.1. Обработка протеиназой К..........................................................................................................67

3.7.2. Обработка коллагеназой............................................................................................................68

3.7.3. Ингибирование эндогенных фосфатаз.....................................................................................68

3.7.4. Использование SDS/Twcen-буфера..........................................................................................68

3.7.5. Особенности состава гибридизационного буфера.................................................................68

3.7.6. Постфиксация в 4% PFA после развития цветной реакции...................................................68

3.8. Рабочие растворы и реагенты.......................................................................................................69

4. РЕЗУЛЬТАТЫ................................................................................................................................71

4.1. Экспрессия Nvi-Hoxl в регенерации Alitía virens.......................................................................71

4.2. Экспрессия Nvi-Hox2 в регенерации Aliíta virens.......................................................................72

4.3. Экспрессия Nvi-НохЗ в регенерации Alitía virens.......................................................................73

4.4. Экспрессия Nvi-Hox4 в регенерации Aliíta virens.......................................................................73

4.5. Экспрессия Nvi-Hox5 в регенерации Alitía virens.......................................................................74

4.6. Экспрессия Nvi-Lox5 в регенерации Aliíta virens........................................................................75

4.7. Экспрессия Nvi-Hox7 в регенерации Aliíta virens.......................................................................76

4.8. Экспрессия Nvi-Lox4 в регенерации Aliíía virens........................................................................77

4.9. Экспрессия Nvi-Lox2 в регенерации Aliíía virens........................................................................77

4.10. Экспрессия Nvi-Post2 в регенерации Aliíía virens.....................................................................78

4.11. Характер распределения Nvi-antiHox5 в регенерации Aliíía virens.........................................79

4.12. Характер распределения Nvi-antiHox7 в регенерации Aliíía virens.........................................80

5. ОБСУЖДЕНИЕ............................................................................................................................105

5.1. Экспрессия Нох-генов в ходе регенерации Aliíta virens..........................................................105

5.1.1. Гены раннего ответа.................................................................................................................105

5.1.2. Гены среднего ответа, экспрессирующиеся в нервной системе..........................................106

5.1.3. Гены среднего ответа, экспрессирующиеся в зоне роста.....................................................107

5.1.4. Гены позднего ответа...............................................................................................................107

5.2. Двухфазная экспрессия Нох-генов в ходе регенерации AMrens............................................109

5.3. Закономерности пространственной и временной активности Нох-генов в ходе регенерации A.virens.................................................................................................................................................111

5.4. Градиентная экспрессия Нох-генов задает позиционную информацию в теле A. virens.....115

5.5. Сравнительная оценка регенерационных потенций и дефинитивной экспрессии Нох-генов у Bilateria.................................................................................................................................................116

5.6. Вопросы регуляции.....................................................................................................................121

5.6.1. Антисмысловые транскрипты.................................................................................................121

5.6.2. Роль нервной системы в процессах регенерации А. virens...................................................129

5.6.3. Регуляция регенерации через «организатор»........................................................................130

5.7. Униполярная регенерация Alitta virens - догадки и предположения......................................131

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ............................................................................................................................133

7. ВЫВОДЫ......................................................................................................................................135

8. БЛАГОДАРНОСТИ....................................................................................................................136

9. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................137

10 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.........................................................................................................138

1. ВВЕДЕНИЕ

Одним из важнейших свойств живых организмов является их способность к регенерации, то есть к восстановлению утраченных или поврежденных частей тела. Для изучения процессов регенерации существует множество модельных объектов, включающих представителей самых разных групп животных: кишечнополостные (гидра), планарии, полихеты, насекомые (сверчок, таракан), и позвоночные (рыбы, хвостатые и бесхвостые амфибии, млекопитающие) (Иванов, 1912; Mito et al., 2002; Bryant et al., 2002; Thummel et al., 2007; Han et al., 2008; Gierer et al., 2012). Эти модельные животные обладают очень вариабельными регенерационными способностями. Например, среди лофотрохозойных животных некоторые планарии восстанавливают тело из маленького кусочка (Egger et al., 2007), полихеты способны отращивать передний и задний конец тела (Воронцова, 1949), а пиявки, принадлежащие, как и полихеты к типу Annelida, могут отращивать только аксоны нейронов при повреждении нервной системы (Nicholls, Hernandez, 1989). Среди позвоночных хвостатые амфибии и до определенной стадии развития бесхвостые могут восстановить новую конечность и хвост, а млекопитающие способны только к физиологической регенерации и репарации внутренних органов (Awgulewitsch, 2003; Brun et al., 2004; Morgan, Whiting, 2008).

Расширение круга модельных объектов необходимо для понимания механизмов регенерации, их общности и различий у разных животных. С этой точки зрения полихеты (тип Annelida, Lophotrochozoa) являются крайне интересной группой животных, так как ее представители обладают широкими и разнообразными регенерационными возможностями. Множество работ, описывающих морфологические особенности регенерации полихет, появилось в прошлом столетии (Иванов, 1912; Berrill, 1928; Sayles, 1932; Berrill, 1952). Практически все полихеты способны к репаративной регенерации по типу эпиморфоза с образованием бластемы в месте повреждения, из которой формируются недостающие части тела. При этом некоторые полихеты восстанавливают и задние и передние структуры. К ним относятся многие сидячие гетерономно сегментированные черви. Другие же представители этого класса не способны к передней регенерации и восстанавливают только задний отдел тела после повреждения (Короткова, 1997). Для некоторых полихет успешность и полнота прохождения восстановительного процесса зависит, например, от уровня ампутации, для большинства же червей характерна регенерация строго определенного числа сегментов при передней регенерации. При этом остальные недостающие сегменты возникают из старых сегментов тела путем метаморфоза (Berrill, Mees, 1936).

П.П. Иванов, посвятивший ряд работ подробному изучению морфологических и гистологических аспектов регенерации Annelida, считал регенерацию аннелид, в частности полихет, уникальным и интереснейшим явлением. В отличие от других животных, восстанавливающих после ампутации именно ту часть тела, которая была утрачена, полихеты в большинстве своем вне зависимости от количества отрезанных спереди и сзади сегментов всегда восстанавливают спереди строго определенное для каждого вида количество сегментов, соответствующее числу ларвальных. Сзади же всегда регенерируют пигндиальные структуры и зона роста, которые также имеются на стадии сегментированной личинки (Иванов, 1912). Этот своеобразный способ регенерации предполагает высокую степень регенеративных способностей, а также возможность быстрой перестройки позиционной информации, границ и пропорций тела после утраты его части. Появление молекулярных методов исследований в биологии позволяет изучать механизмы, лежащие в основе этих своеобразных черт регенерации полихет.

Прекрасными кандидатами на роль факторов, создающих позиционную информацию, могут быть Нох-гены. Эти кластерные гены, которые кодируют ключевые для эмбриогенеза транскрипционные факторы, вовлечены во множество морфогенетических процессов (Akam, 1998). Считается, что основная их функция состоит в эмбриональной регионализации и спецификации передне-задней оси тела билатеральных животных в соответствии с правилами временной и пространственной коллинеарности (Castelli-Gair, 1998). В то же время, показана постэмбриональная экспрессия Нох-генов и установлено их участие во многих процессах, идущих в дефинитивном теле некоторых животных, в том числе и в процессах регенерации у представителей разных эволюционных ветвей.

В лаборатории экспериментальной эмбриологии Биологического института СПбГУ была описана экспрессия одиннадцати Нох-генов в онтогенезе морской эррантной полихеты Alitta virens (ранее Nereis virens, Nereididae, Annelida, Lophotrochozoa) (de Rosa R., Grenier J.K., Andreeva T. et al., 1999; Kulakova et al., 2007). Нереидные полихеты в своем индивидуальном развитии проходят стадии сферической личинки трохофоры, сегментированной личинки нектохеты и стадию постларвалыюго роста. В ходе развития нектохеты Нох-гены обнаруживают каноническую коллинеарную картину экспрессии в сегментированной эктодерме. Однако в ходе формирования многосегментного дефинитивного тела червя эти гены имеют иной способ разметки морфогенетической территории. В теле ювеннльного червя Нох-гены формируют разнонаправленные градиенты, домены их экспрессии перекрываются и не имеют устойчивых передних границ в постларвальных сегментах (Bakalenko et al., 2013). На основании этих данных возникло предположение, что Нох-гены у растущего червя не вовлечены в спецификацию морфологически сходных сегментов тела. Вероятнее всего, они

участвуют в создании и поддержании позиционных координат в гомономно сегментированном теле животного, определяя позицию сегментов относительно терминальных структур - головы и пигидия. Если эта гипотеза верна, картина экспрессии Нох-генов должна подвергнуться реорганизации после позиционного сбоя, который происходит после ампутации части тела. Мы подробно исследовали закономерности экспрессии 10 Нох-генов A.virens на разных стадиях регенерации задней части тела червя методом гибридизации in situ на целых препаратах. Мы полагаем, что эти исследования помогут проверить гипотезу о роли Нох-генов в создании постларвального тела червя, расширят наше понимание механизмов регенерации представителей класса Polychaeta и, вероятно, позволят сделать некоторые обобщения, касающиеся роли Нох-генов в процессах регенерации разных животных.

Цель работы: изучить пространственную и временную организацию экспрессии Нох-генов при регенерации задней части тела полихеты A lit ta virens.

Были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать условия эксперимента, которые позволили бы максимально точно описать динамику экспрессии Нох-генов в процессе регенерации A.virens.

2. Проанализировать динамику экспрессии Нох-генов при регенерации этой полихеты методом гибридизации in situ на целых животных.

3. Проверить гипотезу о градиентной экспрессии Нох-генов как факторе создания и поддержания позиционной информации в постларвальном теле Л. virens.

4. Оценить наличие коллинеарной экспрессии Нох-генов в ходе регенерации A.virens.

5. Исследовать участие антисмысловых транскриптов Нох-генов в процессах регенерации A. virens.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активность Нох-генов является важным фактором нормальной регенерации полихеты A. virens.

2. Время активации Нох-генов в процессе регенерации A. virens не коррелирует с их предполагаемым порядком расположения в геноме.

3. Динамика экспрессии Нох-генов в ходе регенерации A.virens свидетельствует в поддержку гипотезы об их роли в создании и поддержании позиционной информации в постларвальном теле червя.

4. В ходе регенерации A.virens антисмысловые транскрипты Нох-генов обнаруживают закономерные изменения картины распределения.

По теме диссертации опубликовано 24 печатных работы, из них 6 - статьи. Основные положения работы доложены и обсуждены на международном симпозиуме «Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия» (С-Петербург, 2004), конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 2005), международной научной конференции "Каспар Фридрих Вольф и современная биология развития" (Санкт-Петербург, 2009), XII научной сессии морской биологической станции СПбГУ (Санкт-Петербург, 2011), всероссийской конференции «Морфогенез в индивидуальном и историческом развитии» ПИН РАН (Москва, 2011), 13-ом конгрессе Европейского сообщества эволюционной биологии (Тюбинген, Германия, 2011), международной конференции «Progress In Understanding The Origins of Biodiversity» (Ювясюоля, Финляндия, 2012), конференции европейского сообщества EvoDevo (Лиссабон, Португалия, 2012) и всероссийской конференции с международным участием «Эмбриональное развитие, морфогенез и эволюция» (Санкт-Петербург, Россия, 2013).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Явление регенерации и история её изучения

Процесс регенерации изучается уже много лет, но четкого определения этого явления до сих пор не существует (Короткова, 1997; Токин, 1959; Долматов, Машанов, 2007). Связано это, вероятно, с тем, что регенерация - процесс сложный, многогранный и происходящий на самых разных уровнях организации животных.

Регенерация возникает в ответ на повреждение организма и вызывает процесс развития утраченного или поврежденного органа или структуры. На этом основании Воронцова и Лиознер считали регенерацию «вторичным развитием» (Воронцова, Лиознср, 1957), а Короткова и Токин обозначали этот процесс широким понятием восстановительных морфогенезов (Короткова, Токин, 1979). Некоторые авторы придавали большое значение тому, что в ходе регенерации должна восстанавливаться исходная форма тела (Короткова, 1997).