Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ядрышкообразующая функция клеток в онтогенезе карповых рыб

ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Ядрышкообразующая функция клеток в онтогенезе карповых рыб"

"... о

АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ ИНСТИТУТ ГИДРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи

МАКАРОВА Татьяна Александровна

УДК 597.554.3-13

ЯДРЫШКООБРАЗУЮЩАЯ ФУНКЦИЯ КЛЕТОК В ОНТОГЕНЕЗЕ КАРПОВЫХ РЫБ

03.00.18 гидробиология 03.00.10 - ихтиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КШДЦ""

Киев - 1993

Работа выполнена б Институте гидробиологии АН Украины, г. Киев

Научные руководители:

академик АН Украины В.Д.Романенко;

хандидат биологических наук В.В.Архкпчук.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Г.Д.Бердшев;

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Ю. Д.Коновалов

Ведущая организация -

Институт биологии южных морей им. А.О.Ковалевского АН Украины, г.Севастополь

Защита состоится 1993 г. в_______часов

Г ~

на заседании специализированного совета Д 016.19.01 по защите диссертпцкп на соискание ученой степени кандидата биологически наук при Институте гидробиологии АН Украины (252210, г.Киев, нр.Героев Сталинграда, 12, Институт гидробиологии АНУ)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Института гидробиологии АН Украины

Автореферат разослан "___"_________ 1993 Г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

А.А.Протасов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Индустриальные масштабы хозяйственного разведения различных видов рыб требуют решения многих задач ихтиологии, связанных не только с вопросами воспроизводства и совершенствования технологии ведения аквакультуры, но и с проблемами изучения закономерностей и особенностей жизнедеятельности организма рыб. На современном этапе развития ихтиологии важную роль приобретают генетические методы, позволяющие объяснить глубинные процессы, происходящие в организме рыб, понять их механизмы. Одним из перспективных направлений являются цитогенетические исследования.

В отечественной и зарубежной литературе освещены вопросы, ввязанные с изучением структурных элементов генетического аппарата рыб, особенностями кариотипов и их эволюцией, значением и ролью разных типов хромосоных, генных и геномных мутаций, проблемами селекции рыб и другие (Викторовский, 1978; Никольский. 1980; Васильев, 1985; Кирпичников, 1987; Gold et al.. 1978; Ojima, 1982). Однако для решения многих практических задач, таких.как разработка теста, позволяющего определять оптимальную готовность санок к нересту. выяснение причин возникновения разнокачественности у рыб. выработка новых селекционных признаков для отбора производителей, целесообразно применение функциональных, а не структурных характеристик генома.

Одной из наиболее перспективных для изучения и эффективного использования может быть ядрышкообразующая функция клетки. Феноти-пическим проявлением активности ядрьшкообразующих локусов хромосои являются ядрышки. Известно, что количественные характеристика ядрышек отражают как число функционирующих рибосомит генов (Босток, Самнер, 1981), так и интенсивность синтеза РНК и белка в клетке я

ее общее метаболическое состояние (Ченцов, 1978; Челидзе, 1985). Все вышесказанное дает основание считать применение ядрышковых показателей перспективным методой оценки общего физиологического состояния организма.

До последнего времени изучение ядрышек у рыб ограничивалось только определением их количества в клетке и соответствия ядрышек числу ядрышкообразующих районов хромосом (Бирштеян, 1987; Gold, Amemiya, 1986). Более, детальные исследования (динамика количественных характеристик ядрышек в онтогенезе, тканеспецифичность яд-рьшшообразующей функции и ее особенности у разнокачественных особей, изменения ядрышковых показателей в нерестовый период и дру-

N

гие) у данного класса холоднокровных позвоночных вообще и в семействе карповых, в частности, не проводились.

Данная работа является частью комплексных исследований отдела * 1

экологической физиологии водных животных Института гидробиологии АН Украины по изучению физиологических основ культивирования гид-робионтов в регулируемых системах.

Цель работы. Диссертационная работа посвящена изучению закономерностей ядрышкообразующей Функции у карповых рыб на разных этапах онтогенеза, ее особенностей у разных видов рыб, динамики функционирования генов рРНК при изменениях физиологического состояния организма. . . . ' ■

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать взаимосвязь между интенсивностью белкового синтеза и ядрышковой активностью в клетках рыб. Показать возможность использования ядрышковых характеристик для оценки физиологического состояния организма.

2. Изучить особенности ядрышкообразующей функции в, разных

тканях и органах рыб.

3. Вшвить закономерности функционирования генов рРНК у карповых рыб на разных этапах онтогенеза (эмбриогенез, ювенильньш период, половозрелое состояние).

4. Изучить особенности функционирования генома у разнокачественного потомства карповых рыб.

5. Определить зависимость роста и массонакопления у рыб разного возраста от ядрышковои активности в их клетках.

6. Изучить ритмичность функциональной активности рибосомных генов у производителей карповых рыб в течение года.

7. Изучить изменения количественных характеристик ядрышек на протяжении нерестового цикла.

8. Определить степень наследственной изменчивости ядрышковых характеристик у карповых рыб.

Научная новизиа результатов исследований. Результаты, полученные при выполнении диссертационной работы имеют важное практическое и теоретическое значение.

1. Впервые проведены исследования закономерностей функционирования рибосомных генов у рыб в эмбриогенезе, в течение юве-нильного периода и в половозрелом состоянии.

2. Показана тканеспецифичность ядрдакообразующей функции.

3. Установлена ритмичность ядрышковых показателей у рыб.

4. Впервые изучены изменения ядрышковой активности в клетках рыб в течение нерестового цикла.

5. Выявлены особенности ядрышкообразующей функции у разнокачественного потомства карповых рыб.

6. Выяснен характер взаимосвязи ядрьшковых показателей и размерных характеристик рьб разного возраста.

7. Доказана наследуемость ядрышковых характеристик.

Практическая значимость исследования заключается в возможности применения ядрышкового теста для оценки различных метаболических процессов в организме рыб, например, для определения готовности самок к нересту. Ядрышцовые характеристики, в связи с высокой степенью их наследуемости, могут быть успешно применены для селекционного отбора. Наши исследования дают основание считать ядрышко-вые показатели ценным селекционным признаком. .

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

1. Всесоюзной конференции молодых ученых и специалистов "Оценка состояния, охрана и рациональное.использование биологических ресурсов водных экосистем в условиях антропогенного воздействия" (Ростов-на-Дону. 1990).

2. У Всесоюзной конференции по раннему онтогенезу рыб (Астрахань. 1991).

3. Научно-методической экологической конференции "Методы исследования и использования гидросистем" (Рига, 1991).

4. 6 Съезде Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Полтава, 1992).

По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методики исследования, 6 глав с описанием результатов собственных исследования и ях обсуждением, заключения и выводов, 9 таблиц, 24 рисунков и библиографического указателя, включающего 128 отечественных и 47 иностранных литератур ных источников. Работа изложена на 133 страницах машинописи.

- 5 -МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Эксперименты проводились в 1988-1992 года! на базе аква-коиплекса Института гидробиологии АН Украины (ЙГБ АН У), Запорожского нерестово-выростного хозяйства (НВХ) я рыбного хозяйства Пултовсхой РМС (Винницкая область).

Объектами исследований являлись несколько видов карповых рыб:. вуалехвост (Carasslus auratus auratus), серебряный карась (Caras-sius auratus glbello Bloch.), карп (Cyprtnus carpió L.). белыя (Hypophthalmlchthys molltrlx Val.) и пестрый толстолобы (Aristicti-thys nobllis Rich.), белый амур (Ctenopharyngodon ldella Val.).

8 зависимости от решаемой задачи материалом для исследований служили: развивающаяся икра карповых рыб на разных стадиях эмбриогенеза, генеративные и соматические ткани половозрелых саяок белого толстолоба и трехмесячных мальков карпа, ткани плавниковой iaa-мы разнокачественного потомства белого амура а производителей карпа, серебряного карася и вуалехвостов разных возрастных групп я при различных Физиологических состояниях. Использование для цито-генетическнх исследований тканей хвостового плавника позволяло изучать динамику ядрышковой активности на одной и той же особи в течение продолжительного времени без существенных стрессовых воздействия и повреждения ее жизненных и репродуктивных функций.

Во всех опытах получение половых продуктов и инкубация икры проводились в соответствии с общепринятой биотехникой разведепня карповых рыб (Мартышев, 1973: Козлов, Абрамович," 1980). Условия содеряания рыбы в течение экспериментов были оптимальны«!! для изучаемых видов. Стадии эмбриогенеза определялись по С.Г.Сопя? (1953) и Е.Н.Смирновой (1978).

Удельный вес наследственной изменчивости вычислялся по коэф-

2-302S

Фициентам регрессии и корреляции между количественными характеристиками ядрышек у саиок я их потомства (Кирпичников, 1987).

Показатели функциональной активности генов рРНХ в разных тканях и органах изучались с помощью методики окрашивания раствором азотнокислого серебра функционально активных структур рибосомнои ДНК.

Для проведения цитогенетнческого анализа пробы тканей рыб Фиксировались в двух сменах свежеприготовленной и охлажденной смеси этилового спирта и уксусной кислоты (3:1) по 30 минут каждая в объеме, в 50-100 раз превышающем объем фиксируемого материала.

Для анализа из каждой пробы брали по 10-15 икринок или кусо-

N

чек ткани. Механическая мацерация продолжалась 5-10 минут, химическая в 45%-ном растворе уксусной кислоты - 40-60 минут. Воздуш-носухие препараты окраиивали 50%-ным раствором AgN03 в термостате при 58-60 град, в течение 5-6 минут до получения коричневой окраски (Howell, Black, 1980; Dev. Tantravahi, 1982), докрашивали 2%-ннм раствором Гимза ("Merck", Darmstadt, ФРГ) в фосфатном буфере (p!f=6,8) а течение 1 минуты.

Число ядрышек подсчитывали в каждой пробе у 500-700 клеток с применением окуляров х16, объектива хЮО микроскопа "Ampllval" (ГДР) и измеряли диаметр ядрышек окуляр-микрометром MOB-xl-15 у 100 клеток при том же увеличении объектива. ' /

При проведении опытов для сравнения уровня ядрышковоя активности и содержания общего белка в тканях белок определяли методом нанесения гомогената на хромотографическую бумагу с последующим окрашиванием амидошварцеи (Bramhall et al., 1969).

Статистическую обработку результатов исследований и построение графиков производили на персональном компьютере "Amstrad" с

- 7 г

использованием соответствующих прикладных программ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Для изучения закономерностей ядрышкообразующей функции у карповых рыб на разных этапах онтогенеза использовались количественные характеристики ядрышек - их число в клетке и диаметр,. которые определяют суммарный показатель ядрышковой активности - размер ядрышек на клетку.

Полученные нами результаты исследования свидетельствуют о возможности использования ядрышковых характеристик для оценки общего физиологического состояния организма. Опыты с половозрелыми самками серебряного карася, находившимися на разных стадиях готовности к нересту и отличавшимися степенью зрелости гонад, показали взаимосвязь уровня ядрышковой активности в клетках е.- содержанием общего белка в тканях яичиика и плавника. У всей группы из 28 самок в четырех проведенных экспериментах коэффициент ранговой корреляции мекду этими величинами составлял +0,55 (Р< 0.01) в яичнике, и »0,43 (Р< 0,02) в тканях плавника. Ядрышковые характеристики взаимосвязаны также с целым рядом биохимичесхих показателей, оценивающих важнейшие метаболические процессы в организме рыб. Совместно с рядом авторов был проведен сравнительныя анализ ядрышко-, вой активности в клетках плавника и яичника производителей карпа, серебряного карася и основных показателей белкового, лппидного, энергетического обменов в печени, сыворотке крови, икре и мыяцах. который показал, что ядрьшшовыя критерий, основанный на определении числа и размера ядрышек в клетке, объективно отражает процессы, происходящие в организме рыб на биохимическом уровне.

Активность функционирования генов рибосомной РНК днфференци-

2*-зог»

рована в разных органах и тканях одного организма. Тканеспецифич-ность ядрышкообразуюшея функции изучалась на примере трехмесячных мальков карпа и производителей белого амура (рис. 1). При этом обнаружены четкие видовые различия как по числу, так и по размеру ядрышек. Например, у карпа наблюдаются клетки только с одним-двумя ядрышками, тогда как у белого толстолоба есть трех-пятиядрышковые клетки.

У всех мальков карпа самые мелкие ядрышки (12.5-15,4 условных единиц) обнаружены в клетках эпителия жабр, а -самые крупные - в мышечной ткани (21,3-27,2 у.е.); клетки чешуи занимают промежуточное положение (16,5-17,8 у.е.) (рис. 1). У взрослых особей белого толстолоба наибольшая ядрышковая активность (и по количеству и по размеру) отмечена в клетках яичника (средний размер ядрышек на клетку варьирует от 26,3 до 29,1 у.е.). наименьшая - также в жаберном эпителии (14.5-20.1 у.е.). Следует отметить значительные отличия по ядрышковым характеристикам между эмбрионами и тканями взрослых рыб. Степень геномной активности у зародышей существенно вше (в основном, за счет большего числа ядрышек), чем у взрослых рыб, и дифференцирована на разных стадиях эмбрионального развития.

Сравнение исследованных рыб между собой указываетпомимо ви-довьп, на четкие индивидуальные различия по ядрышковым показателям. Отдельные экземпляры характеризуются определенньм уровнем яд-рьшковой активности, значения которой варьируют в ограниченных пределах. Зто требует изучения динамики ядрыаковых характеристик у каждой отдельной особи. В то же время скоординироваиность всех обменных процессов в организме, по-видимому, приводит к взаимосвязанному изменению я'дрышковоя активности в клетках разных органов и тканев. Исследования «оказали, что ядрышковая активность в плавни-

Рис. 1. Особенности ядрышкообразующея функции в разных органах

и тканях карпа и белого толстолоба. Условные обозначения: Ср.ДЯ- ср.диаметр ядрызка. Ср.ДЯ/Кл- ср. размер ядрылек на клетку. М-миици, Ч-чеяуя. Ж-хабры. П-плавник. С-селезенка, Я-яичник. Э-эмбриональ.ткани.

1,0 • 1,3 2,0 2,5 3,0 3,5 Ср.Н^тлаз.

Рис. 2. Взаимосвязь среднего числа ялрызек в клетках плавника

(Ср.НЯплав.) и яичника 1Ср.)!Яяич.) у серебряного карася.

3-302в

ках карповых рыб объективно отражает активность генов рРНК в их яичниках (рис. 2}. Коэффициент корреляции между ядрышковыми показателями в тканях яичника и плавника у производителей серебряного карася равен «0,84 (Р< 0.01), у самок карпа - +0,61 (Р< 0,05). Для двух исследуемых величии (на примере серебряного карася) вычислено уравнение регрессии:

у = 0,47 + 0,64х , где х - число ядрышек в клетках плавника,

3 - число ядрьшек в клетках яичника. Следовательно, наши исследования показали тканеспецнфичность ядрышкообразующев функции у рыб. с одной стороны, и взаимосвязь уровня ядрышковой активности в разных тканях, в частности плавника и яичника, с другой. Это позволяет оценивать геномную активность рыб во тканям плавника без повреждения жизненных и репродуктивных функция организма и прослеживать ее динамику на примере одной и той же особк в течение длительного времени.

Ядрьшжовые характеристики в клетках карповых рьй обладают не только видовыми. индивидуальными и тканевыми различиями, но также изменяется на протяжении жизненного цикла.

В течение эмбрионального периода у трех видов карповых рыб (карп, белыа и пестрый толстолобы) наблюдается снижение активности генома от этапа гаструляции до стадии перед вылуплением (рис. 3>. Однако, у карпа и толстолобое наблюдаются различные механизмы изменения вдршжовоВ активности. Снижение функциональной активности генов рибосомнои РНК, выраженной в суммарном показателе среднего размера яярьиек на клетку, достигается у карпа за Счет : значитель-аого уменьшения диаметра ядрьиек при небольшом изменении их числа. У толстолобое, наоборот, уиеньиекне числа ядрдаек в эмбриогенезе было настолько сувественньи. что при наблюдаемом увеличении дна-

Ср.Ш

5,0

• 4,С 3,0

2,0

- И -Cp.il

13,0

14,0 12,0

10,0

Г

Ср.ДЯ/Кл 60

50

40 30

20

аз

¡13

03

Рис. л Изменение ср.числа ядрышек на клетку Ср.ЯЯ (А) си -та

со ля/Кл^тапСр-5Я (б) * с»-р«»«н» «рш« и клетку »г«п.»1и л <В| в эмбриогенезе карповых рьб. Условный обозначения: г. пв - стадии эмбриогенеза- гастртляпм я перед вылуплением;-----карп. ч^чкулята а

—--- белья толстолоб. — ----

пестрьа толстолоб.

Э*-Э02»

кетра ядрышек у всех изучаемых особей отмечено значительное понижение ядрызковоа активности (рис. 3).

У экбраонов с различными норфологическими аномалиями функциональная активность генов рРНК понижена по сравнению с нормально развивакз:к2ся зародышами. Интересно отметить, что у карпа уменьшение среднего размера ядрыиех на клетку осуществляется, главным образом, за счет уненьиения диаметра ядрышек при постоянном их числе. Тогда как у белого к пестрого толстолобое основной механизм изменения ядрьпковои активности у уродливых зародышей заключается в снижении среднего числа ядрыжек на клетку, при этом не обнаруживается достоверной разницы ыехду средними диаметрами ядрышек у аномальных п нормальных эмбрионов.

Закономерности ядрышкообразующеа функции у карповых рыб в ювеяильныз период изучались на примере двух групп белого амура -разнокачественного потомства с одинаковьм набором генов, полученных от однов санки и одного саица в возрасте 1-1,5 лет и разнокачественного потомства от другой пары производителей в возрасте 2-3 лет. На отрезке от 12- до 1б-тимесячного возраста у молоди белого амура сохраняется тенденция уменшения ядрышкавоа активности в процессе развития, обнаруженная у зародышей карповых рыб; В этом возрасте ядрыаковые характеристики тесно коррелируют с массой рыб. У годовиков существует прямо пропорциональная зависимости между весом особей и числом ядрышек в их клетках: коэффициент ранговой корреляции равен +0,65 (Р< 0,01). В 16-тимесячном возрасте данная взаимосвязь выражена слабее <В= +0,32, Р< 0,1). Следовательно, в начале онтогенеза разнокачественность потомства обусловлена уровнем функционирования генома, которое целиком направлено на обеспечение интенсивного соматического роста. По мере развития генерати-

вного обмена в организме рыб, начиная с двухлетнего возраста, взаимосвязь между размерными характеристиками особи и ядрышковыми показателями ее клеток исчезает. Коэффициенты корреляции меяду указанными величинами у двухлетних белых амуров - -0,05; в возрасте 2,5 года- +0,02; 3-х лет - -0,23.

У половозрелых особей карпа и белого амура изменения массы тела не зависят от-уровня ядрышковой активности, т.к. функционирование генома направлено, в основном, на нужды генеративного обмена. Наблюдавшиеся нами в течение 16 месяцев колебания размеров ядрышек у самок карпа имеют, в основном, отрицательную связь с весом тела. У разных рыб величины коэффициентов корреляции различаются от +0,04 до -0.69. У производителей белого амура обсуждаемая зависимость также носит слабоотрицательныя характер. Коэффициент корреляции меяду средними числами ядрышек у рыб и их массой на протяжении всего эксперимента равен -0,31 (хотя у отдельных особей он изменяется от +0,53 до -0,81). Такой характер взаимосвязи, по-видимому, объясняется низкой ядрышковой активностью при максимальном весе самок в период их оптимальной готовности к нересту.

Следует отметить, что динамика ядрышковых показателей на протяжении года у карпа и белого амура различна. У производителей амура за анализируемый период происходили существенные колебания в числе ядрышек с разницей наибольших и наименьших значения у каждой особи от 0.41 до 0,83. Кроме этого, отдельные экземпляры заметно отличались друг от друга по уровня ядрышковой активности - среднее число ядрышек варьирует от 2.09 до 3,03. В то ае время у карпа по-, казатели ядрыиковоя активности хотя и изменяются на протяжении года, но средние значения количества.и размера ядрышек за'весь период исследований на редкость схожи. Например, число ядрьиек на

клетку у отдельных особей колеблется в узких пределах (1 ,'44-1,52), такхе как и диаметр (15,2 - 15,8 у.е.).

Для производителей карповых рыб характерна ритмичность-ядрыш-кообразующей Функции на протяжении года. Наиболее часто в клетках карпа наблюдаются ежемесячные чередования роста и снижения ядрыш-ковой активности. Нередки случаи малой изменчивости ядрышковьл параметров, а также увеличения или уменьшения размеров ядрьшек в течение двух месяцев. Однонаправленные изменения количественных характеристик ядрышек на протяжении более длительных временных 0Тт резков отмечаются крайне редко. Необходимо отметить, что схожие по направленности и продолжительности колебания размера ядрышек на клетку в течение года характерны для самок, отнерестиввиися в одно, и то же время. Такая синхронность объясняется схожим Физиологическим, состоянием организмов этих рыб. В то же время индивидуальность эндогенных биологических ритмов (которые, по-видимому, обуславливают ритмичность всех процессов жизнедеятельности даже : в условиях постоянства внешней среды) приводит к значительным различиям в динамике ядрьшкообразующей функции у особей, отличающихся по Фязиог логическому состоянию.

Сходные закономерности выявлены при изменении , ядрыиковьп характеристик белого амура. Наиболее часто наблюдаются одно- и двухмесячные смены увеличения и понижения ядрышковой активности илв такие же по продолжительности периоды ее стабильности.- '

Опыты, проведенные для выявления более частых, например, еженедельных или ежедневных, колебаний активности рибосоиных генов, показали наличие у производителей карпа и белого амура суточной ритмичности ядрышкообразующеи функции. 1 всех изученных особей отмечено снижение ядрышковоя активности в вечернее время по сравне-

нию с утренним.

После неоднократного отбора проб на одном я том же хвостовом плавнике через несколько дноя отмечалась активация ядрьшсообразую-щей Функции. Дальнейшие эксперименты позволили связать этот факт с появлением регенерацнонных процессов. Повышение ядрышковои активности обнаруживается как в травмированной, так и неповрежденной частях плавника в течение первоя-второв недели опытов, после чего к концу четвертой недели она вновь возвраиается на исходный уровень, тем самьм не нарушая наблюдаемые нами картины ежемесячных колебаний.

При изучении динамики ядрышковои активности в нерестовый период пробы отбирались по единой схеме у всех самок на' следующих стадиях нерестового цикла:

1) перед нерестом ("покой");

2) стимуляция к нересту (после подсадки самцов - для вуалехвостов или после предварительной гипофизарной инъекции - для остальных видов рыб);

3) во время икрометания;

4) после нереста.

У самок, не отдавших икру, ядрышковые показатели анализировались в те же дни,что и у отнерестившихся особей.

В первом эксперименте с вуалехвостами, готовьии к нересту по внешним признакам, часть особей отметали икру (группа А), остальные - нет (группа В) (рис. 4). Анализ показал, что готовые и неготовые к икрометанию самки судественно различались по числу ядрыаек в клетках непосредственно перед проведением эксперимента. Особи из группы А имели низкое среднее число ядрыаек в клетке (показатели колебались около отметки 2.2). В группе В исследуема« величина бы

2,0 • I'

1_-1 .. ......... — ..... ..... » ( »

I 2 3 4 5

Рис. 4. Изменение ср.числа ядршек в клетках вуалехвостов Ср.ИЯ

на разных стадиях нерестового периода. Условные обозначения: 1-5 - стадии нерестового периода: перед

нерестом,стимуляция к нересту,во время икрометания,через 3 к 14 суток после нереста;

-- отнерестившаяся группа самок,

----- группа самок, не отдавшая икру.

М, г 40

30

20

II-

Г,б 1,8 2,0 2,2 2,4 2,5 2,8 Ср.Ш

Рнс.

5. Зависимость кассы (К) выметанной икры от среднего числа ядрыжск (Ср.ЯЯ». наблюдавшегося в клетках серебряного карася перед нерестом.

ла значительно вше (около 2,6) и оставалась на том же высоком уровне на всех последующих этапах исследования. У рыб из группы А, начиная со стадии "покоя", количество ядрышек в клетке постепенно увеличивалось, достигая максимума в момент икрометания. Через несколько суток анализируемый показатель существенно уменьшился, примерно до уровня, отмеченного перед нерестом, и через две недели вновь повысился. На заключительном этапе эксперимента обе группы самок имели приблизительно одинаковое высокое среднее число ядрышек на клетку (рис. 4).

У серебряного карася обнаружена четкая зависимость между средним числом ядрышек. Фиксируемом перед нерестом в клетках производителей, и массой отданной ими икры (рис. 5). Самки, у которых среднее количество ядрышек в клетках было 2,8 и выше, не выметали икру. У других особей с уменьшением показателя ядрышковой активности возрастала масса отданной икры. Коэффициенты ранговой корреляции между этими параметрами в трег проведенных экспериментах равнялись - -0,78, Р< 0,01; -0,90, Р< 0,01; -0.48, Р< 0,01.

Описанные выше результаты получили подтверждение в опытах с карпом, нерестившимся в производственных условиях. Анализ количества ядрышек в клетках карпа выявил незначительную изменчивость этого показателя: у всех особей на исследованных стадиях он колебался в узких пределах 1,4-1,6. В то же время существенно варьировал размер ядрышек. Крупные ядрышки наблюдались у карпа в состоянии "покоя" (рис. 6). Нерест самок стимулировался выгреванием в прудах-'теплицах" (в течение 5 суток - группа А и 13 суток - группа В) и гипофипарными" инъекциями. У производителей из группы А незначительно изменившийся после выгревания размер ялрдаек существенно уменьшался вследствик гипофизариоя инъекции. У особей из

Ср,ДЯ/Кл

Г 2 3 4 5

Рис. 6. Изменение среднего размера ядрышек (Ср.ДЯ/Кл) в клетках карпа на разных стадиях нерестового периода.

Условные обозначения: 1-5 - стадии нерестового периода: "покой", после выгревания. после гипофизарноя инъекции, во время

икрометания, после нереста;----—• - группа самок

выгревалась 5 суток, -- 13 суток.

Д2-Д1

Рис. 7. Изменение среднего диаметра ядрышек в клетках карпа во время нереста в зависимости от возраста самок.

Условные обозначения: Д1 и Д2 - средний диаметр ядрышек после гипофизарной инъекции (I) и во время икрометания (II): 1-6-кривые для самок весом - 3,0-4,Окг, 4,0-5,0кг. 5.06.0кг, 6.0-7,0кг. 7.0-8.Окг.и более 8.0кг соответственна.

группы В более длительное выдерживание в теплой воде приводило к значительному снижению ядршковоя активности, а последующее инъецирование на нее уже не влияло (рис. 6). Наблюдавшийся низкий уровень активности генов рРНК непосредственно перед икрометанием был характерен для отнерестившихся самок карпа и в других экспериментах, различавшихся условиями проведения.

Во время икрометания в клетках карпа по сравнению с предыдущим этапом (стимуляция к нересту) возможны и рост, я снижение, и сохранение размеров ядрышек. Наши исследования показали, что это связано с неоднородностью производителей - их вес варьировал от 3,0 до 9,5 кг. Сравнительный анализ выявил, что у "молодых" самок размер ядрышек в момент нереста возрастает, у "средневозрастных" он остается приблизительно на одном и том же уровне, а у "старых" самок - понижается. Разница между диаметрами ядрышек во время и перед ихрометанием тем больше, чем меньше масса рыб (рис. 7).

Таким образом, изменения ядрышкообразующей Функции в нерестовый период отражают Физиологические изменения, которые происходят в организме рыб. Подготовка к воспроизводству сопровождается у рыб повышенной функциональной активностью генов рРНК, что способствует росту и созреванию икры. Вероятно, такой высокий уровень ядрышко-вой активности поддерживается на всем протяжении созревания яйцеклеток в полости самок - от вымста предыдущей порции икры до готовности-производителя к следующему нересту. Замедление всех биосинтетических процессов перед икрометанием обуславливает минимальные уровень активности генома у оптимально готовых -к нересту самок. Снижение активности Функционирования генома до преднерестовых значений наблюдается у карповых рыб в течение одних-двух суток после вымета икры, что определяется критическим состоянием организма в

этот период.

Оценка состояния производителей по ядрышковому критерию может служить тестом при их отборе для искусственного воспроизводства.

Как уже отмечалось, суммарный показатель ядрышковой активности в клетке, средний размер ядрышек на клетку, определяется числом ядрышек и их диаметром. При этом для каждого вида рыб характерен свой механизм ее регуляции. У вуалехвостов, белого амура и толсто-

Лобов, имеющих клетки с несколькими ядрышками, данный механизм

* -

связан с изменением количества ядрышек. У карпа, у которого на протяжении всего жизненного цикла наблюдаются клетки с одним-двумя ядрышками, механизм регуляции ядрышковой активности реализуется

n

.посредством колебаний их диаметра.

Такой закономерный характер изменения ядрышкообразующей Функции у карповых рыб на протяжении всего онтогенеза ставит вопрос о

* I - .

наследственности ее морфологических показателей (число и размер ядрышек).

Наши исследования показали, что суммарный показатель ядрышковой активности у всех изученных видов рыб обладают высокой степенью наследуемости. Данная величина вычислялась по коэффициентам корреляции и регрессии у самок и их потомства (табл. 1). Ядрышко-вые характеристики самок определялись на разных стадиях нерестового цикла (при этом коэффициент наследуемости не претерпевал существенных изменений), а у потомства - в период эмбриогенеза на стадии гаструляции. Следует отметить, что у отдельных видов хорош наследуются те параметры ядрышковой активности, которые играют главную роль в ее регуляции (табл. 1). Все описанные выше исследования дают основание рассматривать количественные характеристики ядрышек как ценный селекционный признак.

Таблица 1.

Средние значения наследуемости количественных характеристик ядрышек у карповых рыб.

Вид

СтадияГ исследования самок (-

Регрессия "самка-потомство"

Корреляция 'самка-потомство" -1-1-

N

Д Я | Д Я/Кл | К | Д Я | Д Я/Кл

Карп Перед неростом После инъекции Икрометание После нереста

0,31 0,51 0,52

0,02 0,98 0,83

0,06' 0,92 0,79

0.38 0,58 0.«

0,64 0,67 0,64

0,01 0,90 0,73

0,14 0,84 0.76

0,41 0,78 0,53

Карась Перед нерестом 0,81 0,77 0,76 0,48 0,74 0,78

После инъекции 0,88 0.84 0,90 0,67 0,86 0,81

Икрометание 0.90 0,66 0.92 0,84 0,92 0,93

После нереста 0.63 0,67 0.93 0,45 0,93 0,89

Белый толстолоб Икрометание 0,77 0,28 . 0,71 " 0,78 0,31 0,87

Примечание: N - число ядрышек, Д Я - диаметр ядрышка. Д Я/Кл размер ядрышек на клетку.

выводы

.1. Активность функционирования рибосомньи генов закономерно изменяется в онтогенезе карповых рыб и обусловлена физиологическим состоянием их организма.

2. Выявлена положительная взаимосвязь между уровнем ядрышко-воп активности и содержанием белка в тканях риз. Ядрышковыя критерий объективно отражает основные метаболические процессы, происходящие в организме.

3. Изменения ядрышкообразующей функции обладают определенной вкдоспецифнчностыо. У карпа основной механизм регуляции ядрышковой активности связан с вариацией размера ядрышек, у растительноядных рыб и вуалехвостов - числа ядрышек на клетку.

4. У карповых рыб обнаружена тканевая специфичность ядрышкообразующей функции, а также взаимосвязь ее показателей в разных органах и тканях.

5. В ходе эмбриогенеза от этапа гаструляции до стадии перед вылуплением у карповых рыб наблюдается уменьшение показателей яд-рыиковоя активности.

6. У зародьшей рьй с врожденными морфологическими нарушениями функциональная активность генов рибосомной РНК понижена по сравнению с нормально развивающимися эмбрионами.

7. Разнокачественность особей белого анура в возрасте 1-1,5 лет связана с уровнем активности генома: существует прямая зависимость между числом ядрышек в клетке и размерами особей.

8. На стадий полового созревания и активации генеративного обмена зависимость между уровнем ядрышковой активности и массой рыб нивелируется.

9. У производителей карповых рыб в период созревания половых

продуктов (от вымота икры и до готовности к следующему икрометанию) наблюдается высокий уровень ядрииковоя активности, что связано с усилением генеративных процессов. Непосредственно перед нерестом наступает заметное снижение функционирования генома.

10. Для половозрелых особей характерна ритмичность ядрьшковых показателей в течение года и суток.

11, Суммарный показатель ядрышковои активности у карповых рыб - размер ядрышек на клетку - имеет высокую степень наследуемости н может учитываться при селекционной работе.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

1.Архипчук В.В., йухинскип В.Н.. Макарова Т.А. Особенности ядрышкообразующея функции в эмбриогенезе карповых рыб {! Дохл. АН УССР, сер. Биология. - 1989. - N9. - С.55-57.

2. Макарова Т.А. Особенности функционирования генома клетки у аномальных эмбрионов некоторых карповых рыб // Оценка состояния, охрана я рациональное использование биологических ресурсов водных, экосистем в условиях антропогенного воздействия: Тез. докл. Всесо-юз. конф. молодых ученых и специалистов, Ростов:на-Дону, 27-29 марта 1990 г. - Ростов-на-Дону, 1990. - С.

3. Архипчук В.В., Романенко В.Д., Макарова Т.А. Тканеспецифя-чность ядрышкообразующей Функции у рыб // Докл. АН УССР. сер. Биология. - 1990. - N5. - С.54-56.

4. Романенко В.Д., Архипчук В.В,. Киппис Л.С.. Крот Ю.Г., Макарова Т.А. Изменение числа и размера ядрышек у-харповых рыб в нерестовый период // Докл. АН СССР. - 1991. - 319, N4. - С.996-998.

5. Макарова Т.А., Архипчук В.В., Кипнйс Л.С., Драчух Л.Н. Особенности Функционирования генома карповых рыб в раннем онтоге-

— 24 -

незе // V Всесоиз. коиф. по раннему онтогенезу рыб: Тез. докл., Астрахань, 1-3 октября 1991. - М., 1991. - С.104.

6. Архипчук В.В., Кипнис Л.С., Макарова Т.А.. Драчук Л.Н. Высокочувствительный метод оценки Функциональной изменчивости геномов гидробионтов под воздействием экологических фахторов // Методы исслед. и использ. гидроэкосистем: Тез. докл. науч.-метод. эколо-гич. конф.. Рига. 1-4 октября 1991 г. - Рига: ЛУ; 1991. - С.6,

7. Патент 4939205/13 СССР, МКИ С12 N 15/01. Способ определения пороговых величин воздействии антропогенных Факторов на клетки организмов / В.Д. Романенко. В.В. Архипчук, Л.С. Кипнис, Ю. Г. Крот, Т.А. Макарова, А.И. Драган, И.В. Архипчук, Л.Н. Драчук П Открытия. Изобретения. - 1992. - С.

8. Архипчук В.В., Кипнис Л.С., Крот Ю.Г., Макарова Т.А., Драчук Л.Н. иитогенетическии метод определения готовности самок рыб к нересту II VI сьезд Укр. об-ва геиетиков и селекционеров: Тез. докл., Полтава, 3-6 марта 1992 г. - 4,1.- Киев, 1992. - С.142-143.

9. Романенко В.Д., Архипчук ВВ., Соломатина В.Д.. Малиновская М.В.. Макарова Т.А. Использование морфологических характеристик ядрышек для оценки метаболических процессов в организме рыб // Докл. АН. -1992. - 226. N3. - С.562-565.

10. Архипчук В.В.. Макарова Т.А. Ритмичность ядрышковов активности в клетках карповых рыб // Гидробиол. кури. - 1992. - 28., N6.- С.81-85.

11. Архипчук В.В., Макарова Т.А. Наследуемость количественных характеристик ядрышек у карповых рыб // Гидробиол. журн. - 1993. (в печати).

фддисано к печати 22.01.93. Формат 60x84 I/I6. Бумага тин. Офсетная печать. Усд.печ.л. 1,4. Гкр. 120 экз. Зак. 302в.

ШШ корпорация УхрНТИ, 252I7I, Кгев-171, ул. Горького, 180.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Макарова, Татьяна Александровна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Цитогенетические метод» в ихтиологии

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Глава 2. Материалы и методы исследовании

Глава 3. Ткансспецифичность ядрышкообразующеи функции и ее взаимосвязь с метаболическими процессами в организме рыб

3.1. Ядрышковая активность Ъ клетках разных тканей и органов карповых рыб

3.2. Связь ядрышковои активности с белковым обменом.

Глава 4. Особенности ядрышкообрпзуюшел Функции в ->мбрногенезо карповых рыб

4.]. ВидоспециФичность ядрышковои активности в >мб риогенезе рыб

4.2. Ядрышковая активность при Фенотипических аномо лиях развития

Глава 5. Особенности ядрышкообразующеи функции у разнокачественных особей карповых рыб на разных ста днях онтогенеза

5.1. Взаимосвязь ядрышковых характеристик г массой тела у разнокачественного потомства белого амура

5.2. Показатели ядрышковои .активности у половозрелых. рыб в связи с изменением их массы. ; ' - 1 . : . - 3 - ■ ■. . "v.", . '

Глава 6. Сезонные и суточные изменения ядрышковоп активности в клетках карповых рыб

6Л. Ритмичность ядрышковых характеристик к клетках карповых рыб в течение года .-.

6.2. Месячные и суточные изменения ядрышкообразующея

Функции .'.

Глава 7. Изменение числа и размера ядрышек у карповых щ рыб в нерестовый период .'.

Особенности ядрышкообразующей Функции у вуалехвостов во время нереста

7.2. Взаимосвязь уровня ядрышковоп активности с мае сой полученной икры у самок серебряного карася.

7.3. Динамика ядрышковых показателей у карпа в период искусственного воспроизводства

Глава 8. Наследуемость количественных характеристик ядрышек у карповых рыб

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ядрышкообразующая функция клеток в онтогенезе карповых рыб"

Актуальность проблемы. Индустриальные масштабы хозяйственного разведения различных видов рыб требуют решения многих задач ихтиологии, связанных не только с вопросами воспроизводства и совершенствования технологии ведения аквакультуры, но не проблемами изучения закономерностей и особенностей жизнедеятельности организма рыб. На современном этапе развития ихтиологии важную роль приобретают генетические методы, позволяющие объяснить глубинные процессы, происходящие в организме рыб, понять их механизмы. Одним из перспективных направлений являются цитогенетические исследования.

В отечественной и зарубежной литературе освещены вопросы, связанные с изучением "структурных элементов генетического аппарата рыб, особенностями кариотипов и их эволюцией, значением и ролыо разшлх типов хромосоных, генных и геномных мутаций, проблемами селекции рыб и другие [10, 23, 55, 98, 147, 160]. Однако для решения многих практических задач, таких как разработка теста, позволяющего определять оптимальную готовность самок к нересту, выяснение причин возникновения разнокачественности у рыб, выработка новых селекционных признаков для отбора производителей, целесообразно применение функциональных, а не структурных характеристик генома.

Одной из наиболее перспективных для изучения и эффективного использования может быть ядрышкообразующая Функция клетки. Феноти-пическим проявлением активности ядрышкообразующих локусов хромосом являются ядрышки. Известно,, что количественные характеристики ядрышек отражают как число Функционирующих рибосомных генов [16], так и интенсивность синтеза РНК и белка в клетке и ее общее метаболическое состояние [120, 121]. Все вышесказанное дает основание считать применение ядрышковых показателей перспективным методом оценки общего Физиологического состояния организма.

До последнего времени изучение ядрышек у рыб ограничивалось только определением их количества в клетке и соответствия ядрышек числу ядрышкообразующих районов хромосом [13,148]. Более детальные исследования (динамика количественных характеристик ядрьшек в онтогенезе, тканеспецифичность ядрышкообразующеп Функции и ее особенности у разнокачественных особей, изменения ядрышковых показателей в нерестовый период и другие) у данного класса холоднокровных позвоночных вообще^- и в семействе карповых^ в частности, не проводились.

Данная работа является частью комплексных исследований отдела экологической физиологии водных животных Института гидробиологии АН Украины по изучению Физиологических основ культивирования гид-робнонтов в ршлируен&х системах.

Цель работы; Диссертационная.работа посвящена изучению закономерностей ядрышкообразующеп Функции у карповых рыб на разных этапах онтогенеза, ее особенностей у разных видов рыб, динамики Функционирования генов рРНК при изменениях физиологического состояния организма. - :

В работе были поставлены следующий задачи: , 1. Исследовать взаимосвязь между интенсивностью белкового синтеза и ядрышковоп активностью в клетках рыб. Показать возможность использования ядрышковых характеристик для оценки физиологического состояния организма.

2. Изучить особенности ядрышкообразующеп функции в разных тканях и органах рыб.

3. Выявить закономерности функционирования генов рРНК у карповых рыб на разных этапах онтогенеза (эмбриогенез, ювеннльныя период, половозрелое состояние).

4. Изучить особенности функционирования генома у разнокачественного потомства карповых рыб.

5. Определить'зависимость роста и массонакопления у рыб разного возраста от ядрышковоп активности в их клетках.

6. Изучить ритмичность Функциональной активности рибосомных генов у производителей карповых рыб в течение года.

7. Изучить изменения количественных характеристик ядрышек на протяжении нерестового цикла, ¿:. .) • : ь , ;; . • ' ■,<.•-.

8. Определить степень наследственной изменчивости ядрышковых характеристик у карповых рыб, п - • •. • ,. >. ч ; < г

Научная новизна результатов исследовании. Результаты, полученные при выполнении диссертационной работы имеют важное практическое и теоретическое значение.

1. Впервые проведены исследования закономерностей функционирования рибосомных генов у рыб в эмбриогенезе, в течение юве-нильного периода и в половозрелом состоянии. 2. Показана тканеспецифичность ядрьпикообразунщеп Функции.

3. Установлена ритмичность ядрышковых ноказателеп у рыб.

4. Впервые изучены изменения ядрышковоп активности в клетках рыб в течение нерестового цикла.

5. Выявлены особенности ядрышкообразугощеп функции у разнокачественного потомства карповых рыб.

6. Выяснен характер взаимосвязи ядрышковых показателен и размерных характеристик рыб разного возраста.

7. Доказана наследуемость ядрьшковых характеристик.

Практическая значимость исследовании заключается в возможности применения ядрышкового теста для оценки различных метаболических процессов в организме рыб, например, для определения готовности самок к нересту. Ядрьшковые характеристики, в связи с высокой степенью их наследуемости, могут быть успешно применены для селекционного отбора. Наши исследования дают основание считать ядрышко-вые показатели ценным селекционным признаком.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на:

1. Всесоюзной конференции молодых ученых и специалистов "Оценка состояния, охрана и рациональное использование биологических ресурсов водных экосистем в условиях антропогенного воздействия" (Ростов-на-Дону, 1990). /

2. У Всесоюзной конференции по раннему онтогенезу рыб (Астрахань, 1991).

3. Научно-методической экологической конференции "Методы исследования и использования гидросистем" (Рига, 1991).

4. 6 Съезде Украинского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова (Полтава, 1992).

По теме диссертации опубликовано ^ работ.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методики исследований, 6 глав с описанием результатов собственных исследований и их обсуждением, заключения и выводов, 9 таблиц, рисунков и библиографического указателя, включающего отечественных и 47 иностранных литературных источников. Работа изложена на 1ЪО страницах машинопи