Взаимосвязь положения в ядре и функциональной регуляции генов и трансгенов в интерфазных ядрах Drosophila Melanogaster и культивируемых клеток млекопитающих

Федорова, Елена Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимосвязь положения в ядре и функциональной регуляции генов и трансгенов в интерфазных ядрах Drosophila Melanogaster и культивируемых клеток млекопитающих
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Взаимосвязь положения в ядре и функциональной регуляции генов и трансгенов в интерфазных ядрах Drosophila Melanogaster и культивируемых клеток млекопитающих"

На правах рукописи

ФЕДОРОВА Елена Михайловна

ВЗАИМОСВЯЗЬ ПОЛОЖЕНИЯ В ЯДРЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РЕГУЛЯЦИИ ГЕНОВ И ТРАНСГЕНОВ В ИНТЕРФАЗНЫХ ЯДРАХ ОИОЗОРНИА МЕкАЫОвАВТЕН И КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03 00 15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1Ю3446Э57

Санкт-Петербург 2008

003446957

Работа выполнена в Биоцентре Университета Людвига Максимилиана (Мюнхен, Германия)

Научные руководители доктор Даниэле Цинк (PD Dr Daniele Zink)

Университет Людвига Максимилиана Мюнхен, Германия

доктор биологических наук Александр Викентьевич Родионов кафедра цитологии и гистологии Санкт-Петербургского государственного университета

Официальные оппоненты доктор биологических наук

доцент Татьяна Владимировна Кузнецова Институт акушерства и гинекологии им Д О Отта РАМН, Санкт-Петербург

доктор биологических наук

Евгений Львович Паткин

Институт экспериментальной медицины РАМН,

Санкт-Петербург

Ведущая организация Институт молекулярной биологии

им В А Энгельгардта РАН

Защита состоится Jб» ОкТл^^л^ 2008 года в HL часов на заседании Диссертационного совета Д 212 232 12по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу 199034 Санкт-Петербург, Университетская наб, 7/9, Санкт-Петербургский государственный университет, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1

С диссертацией можно ознакомиться в центральной библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета

Автореферат разослан «ö9 » 2008 г

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Л А Мамон

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Результаты многих исследований указывают на связь локализации генов в интерфазном ядре с их транскрипционной активностью Ядерная периферия и гетерохроматин считаются репрессивными доменами, а внутренняя область ядра - районом активной транскрипции Ассоциация неактивных генов с гетерохроматином была выявлена у Drosophila (Csink, Henikoff, 1996, Dernburg et al, 1996) и млекопитающих (Brown et al, 1997, Francastel et al , 1999) Репрессия генов на периферии ядра была обнаружена у дрожжей (Andrulis et al, 1998, Cockell, Gasser, 1999) и некоторых многоклеточных эукариот (Kosak et al, 2002, Zink et al, 2004, Pickersgill et al, 2006) Однако полученные недавно результаты показывают, что у дрожжей активные гены также могут занимать периферическое положение в ядре (Casolari et al, 2004, Casolari et al, 2005, Taddei et al, 2006) Отметим, что механизмы взаимодействия хроматина с белками ядерной ламины и ядерных поровых комплексов m vivo, а также механизм участия этих белков в репрессии генов у млекопитающих пока неясны Представляется интересным исследовать, могут литранскрипционно активные гены находиться на периферии ядра в ассоциации с ядерными поровыми комплексами (nuclear pore complex, NPC) у высших эукариот, таких как насекомые и млекопитающие

Поддержание стабильно активного или репрессивного состояния многих генов у Drosophila и млекопитающих осуществляется при участии белков двух антагонистических групп Polycomb (PcG) и trithorax (trxG) (Ringrose, Paro, 2007) Белки PcG и trxG осуществляют свои функции путем связывания с регуляторными последовательностями, называемыми Polycomb/Trithorax-group Response Elements (PREs/TREs, или PRE-элементами) Ряд фактов позволяет предполагать, что положение PRE-элементов в интерфазном ядре и, в частности, их эктопическая конъюгация могут играть важную роль в регуляции их функции (Bantignies et al, 2003, Grimaud et al, 2006, Vazquez et al, 2006), однако этот вопрос требует дальнейшего исследования

Цели и задачи исследования Целью исследования было изучение взаимосвязи между функциональным статусом генов и трансгенов и ихлокализацией в интерфазныхядраxDrosophila melanogaster и культивируемых клеток млекопитающих Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи

1 Провести сравнительный анализ ядерной локализации генов и трансгенов Drosophila в неактивном и активном состояниях

2 Изучить пространственное распределение Рс-связывающих сайтов и возможность их физического взаимодействия в интерфазных ядрах клеток личиночных тканей Drosophila

3 Сравнить расположение активного и неактивного трансгена LV-PGK в ядрахфибробластов трансгенных свиней

4 Выяснить, влияет ли отсутствие белка Трг на ядерную локализацию неактивного гена CFTR человека

Основные положения, выносимые на защиту

1 Периферия хромоцентра политенных хромосом Drosophila имеет сложную мозаичную организацию, где одновременно представлены несколько фокусов сателлита (AAGAG)n, ди- и триметилированный по лизину 4 гистон НЗ, активная форма РНК-полимеразы II и активные PRE-элементы

2 Неактивные гены Abd-B, sd и Ubx, а также Fab-7-содержащие трансгены локализуются у Drosophila на периферии интерфазного ядра

3 Транскрипционно активные Fab-7-содержэщие трансгены часто локализуются на периферии хромоцентра

4 Эндогенная и трансгенная копии Fab-7 элемента располагаются независимо в ядрах клеток пяти личиночных тканей

5 Трансген LV-PGK в зависимости от функционального состояния имеет разное положение в ядрах фибробластов трансгенных свиней Sus scrofa scrofa

6 Отсутствие ассоциированного с ядерным поровым комплексом белка Трг, вызванное РНК-интерференцией, приводит к изменению локализации неактивного гена CFTR в интерфазном ядре культивируемых клеток линии HeLa Научная новизна работы Впервые показано, что в интерфазных ядрах Drosophila на периферии хромоцентра одновременно представлены сателлитный повтор (AAGAG)n, ди- и триметилированный по лизину 4 гистон НЗ, активная форма РНК-полимеразы II и активные PRE-элементы Впервые проанализировано положение относительно ядерной ламины и хромоцентра генов Abd-B, sd и Ubx, а также Fab-7-содержащих трансгенов Drosophila в разных состояниях активности Впервые показано, что активные Fab-7-содержэщие трансгены могут быть ассоциированы с периферией хромоцентра С помощью конфокальной микроскопии изучено взаимное расположение эндогенной и трансгенной копий Fab-7 элемента в ядрах клеток пяти личиночных тканей разных линий мух и показана их независимая локализация в ядре Взаимосвязь между активностью и положением в ядре была также установлена для трансгена LV-PGK в ядрах фибробластов трансгенных свиней Sus scrofa scrofa Впервые с помощью РНК-интерференции показано, что белок Трг, ассоциированный с NPC, необходим для локализации неактивного гена CFTR человека на периферии ядра Теоретическое и практическое значение работы Выявленная сложная архитектура периферии хромоцентра важна для понимания функциональной организации интерфазного ядра Примененные в данной работе методы изучения локализации генов в трехмерном пространстве ядра и распределения Рс-связывающих сайтов, основанные на данных конфокальной микроскопииспоследующим компьютерным анализом, могутбыть использованы в аналогичных экспериментах на других объектах Участие ассоциированного с NPC белка Трг в периферической локализации неактивного гена CFTR человека в сочетании с результатами других исследований позволяет предположить существование консервативного механизма взаимодействия периферических белков с хроматином Результаты, представленные в диссертационной работе, могут быть включены в план учебных курсов «Организация интерфазного ядра», «Организация хромосомы эукариот», «Эволюция геномов и кариотипов» и других, читаемых на кафедре генетики и селекции и кафедре цитологии и гистологии СПбГУ Апробация работы Результаты работы были дважды представлены в виде устных докладов на международных научных конференциях Transregio 5 (Heidelberg 2005, Munich 2006), а также в виде постеров на международных конференциях Young Scientists Meeting of the German Society for Cell Biology (Jena, Germany, 2003), Meeting of the German Society for Cell Biology (Berlin, Germany, 2004), Transregio 5 meeting (Heidelberg, Germany, 2004), Workshop on Nuclear Organization meeting (Elmau, Germany, 2004), Transregio 5 meeting (Munich, Germany, 2004), The UK Chromatin Meeting (York, England, 2005)

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 177 страницах машинописного текста и состоит из Введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», выводов и списка цитируемой литературы (256 источник) Иллюстрационный материал представлен 53 рисунками и 7 таблицами

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Линии мух Drosophila melanogaster Мухи содержались на стандартной среде при 18°С, для некоторых экспериментов при 29°С Тепловой шок проводили в течение 45 мин при 37°С В качестве мух дикого типа использовали линию Oregon-R Трансгенная линия, экспрессирующая Pc-GFP (интеграция в район 45F), описана в (Dietzel et al, 1999) Линии FLW-1, fLW-1 и FLFW-1 (Cavalli, Paro, 1998) являются производными линий 5F24 25,2, 5F3 22,4 и 24F6 (Zink, Paro, 1995)

Культивируемые клетки свиньи и человека Первичные фибробласты трансгенных свиней, а также фибробласты, инфицированные трансгеном LV-PGK in vitro, быпи предоставлены Prof Alexander Pfeifer, Munich, Germany Клетки линии HeLa были любезно предоставлены Dr Volker

Cordes, Heidelberg, Germany

Антитела, пробы ДНК и олигонуклеотиды В работе были использованы первые антитела к бета-галактозидазе (Molecular Probes, USA), диметилированному по лизину 4 гистону НЗ, триметилированному по лизину 4 гистону НЗ, диметилированному по лизину 9 гистону НЗ (Biomol, Germany ), ламину Drosophila Dm0 (любезно предоставлены Prof H Saumweber, Berlin, Germany), Polycomb (Dr Leonie Ringrose, Vienna, Austna ), фосфорилированному по серину 2 С-концевому домену РНК-полимеразы II (Prof Dirk Eick и Prof Е Kremmer, Munich, Germany), Tpr (Dr Volker Cordes, Heidelberg, Germany) Вторичные антитела и авидин, меченые FITC, СуЗ и Су5 - Dianova (Germany) Дополнительно были использованы флуоресцентно меченые антитела FITC-конъюгированные sheep anti-digoxigenin (Roche, Germany) и Alexa-488- конъюгированные rabbit anti-GFP (Molecular Probes, USA) В работе использованы 25 ДНК-зондов, в частности пробы для Abd-B и Ubx (Dr Donna Arndt-Jovin, Goettingen, Germany), пробы для sd и Fab-7 (Prof Renato Paro, Basel, Switzerland), полноразмерная проба LV-PGK (Prof Alexander Pfeifer, Munich, Germany), проба для 5'-конца гена CFTR (Dr Andreas Englmann, Munich, Germany) и другие HMMyHoFISH на Kc клетках Drosophila производили как описано в (Brown, 2002) Препарирование и иммуноокрашивание тканей Drosophila Во всех случаях были использованы ткани личинок третьего возраста У мух линий FLW-1, fLW-1 и FLFW-1 использовали только ткани личинок-самок, чтобы избежать эффекта дозовой компенсации Ткани были препарированы в PBS /01% плуроника и фиксированы в течение 20 мин буфером А (60 мМ KCl, 15 мМ NaCI, 0 5 мМ спермидина, 0 15 мМ спермина, 2 мМ EDTA, 0 5 мМ EGTA, 15 мМ PIPES, pH 7 4), содержащим 4% формальдегида / 0 2% плуроника Затем ткани были инкубированы в 5% BSA/PBT 5 мин, промыты РВТ 2x5 мин и последовательно блокированы 5% BSA/PBT (30 мин ), инкубированы с первичными антителами (1 5 ч, 37°С), промыты РВТ 3x5 мин, окрашены вторичными антителами (1 ч, 37°С), промыты РВТ 3x5 мин и окрашены DAPI (40 мг/мл) в течение 5 мин

HMMyHoFISH на тканях Drosophila Пробы осаждали с 10 мкг (уникальные пробы) или 1 5 мкг (повтор (AAGAG)n) фрагментированной Cot-1 ДНК человека и 100 мкг (уникальные пробы) или 25 мкг (повтор (AAGAG)n) тРНК дрожжей, после чего они были растворены в гибридизационной смеси и денатурированы втечение 10 мин на кипящей водяной бане FISH проводили следующим образом ткани были фиксированы и отмыты как при иммуноокрашивании Затем они были инкубированы в РВТ, содержащем 500 мкг/мл РНКазы А, в течение 3 ч при t комн и отмыты РВТ (2x10 мин ) Ткани были пост-фиксированы 1xPBS, содержащим 4% формальдегида (20 мин ) и инкубированы в 5% BSA/PBT (3x10 мин ) Затем они были постепенно перенесены в гибридизационную смесь (50 мл формамида, 20 мл 2х SSC, 30 мл 0 167 M натрий-фосфатного буфера pH 7 0, 100 мкп Tween 20) путем увеличения ее соотношения с PBS от 40% до 100 % (15 мин каждый шаг) Денатурация тканей происходила в 100% гибридизационной смеси в течение 15 мин при 83°С, после чего к ним была добавлена денатурированная проба ДНК Гибридизация проходила в течение ночи при 37°С, затем ткани отмывали в смесях 50% формамида, 2х SSC, 0 1% Triton Х-100, 0 3% CHAPS при 45°С и при 37°С, 40% формамида, 0 1х SSC, 0 1% Triton Х-100, 0 3% CHAPS при 37°С и 20% формамида/PBS (10 мин каждый шаг) Затем ткани дважды промывали PBS Далее в случае флуоресцентно меченых проб ткани окрашивали DAPI и заключали для микроскопии Детекцию проб, меченых биотином или дигоксигенином, производили флуоресцентно мечеными антителами к дигоксигенину или авидином Иммуноокрашивание проводили как описано выше до или после FISH в зависимости от окрашиваемых белков Если оно проходило до FISH, ткани дополнительно фиксировали 1xPBS / 4% формальдегида

FISH на ядрах фибробластов свиней Первичные фибробласты трансгенных свиней культивировали в среде DMEM с добавлением 15% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота После гипотонической обработки (60 мМ KCl в течение 18 мин при 37°С) клетки фиксировали метанолом / уксусной кислотой (3 1) по стандартному протоколу Препараты помещали на 3 мин в 70%, 90% и 100% этанол, затем помещали в нагретый до

75°С денатурирующий раствор (70 мл формамида, 30 мл 2xSSC, pH 7 0) на 3 мин , после чего снова проводили через батарею спиртов и позволяли высохнуть на воздухе Полноразмерную пробу LV-PGK осаждали с 150 мкг ДНК спермы лосося и 20 мкг фрагментированной Cot-1 ДНК человека, после чего растворяли ее в гибридизационной смеси, денатурировали 7 мин при 75°С и инкубировали 20-30 мин при 42°С Добавляли денатурированную пробу ДНК и гибридизовали в течение ночи при 37°С Затем отмывали в 2xSSC (42°) 2x5 мин, в 0 1xSSC (60°С) 3x5 мин и инкубировали в 3%BSA/PBT при 37°С в течение 40 мин Инкубировали с СуЗ-мечеными антителами к дигоксигенину в течение 45 мин при 37°С, отмывали 3x5 мин 2xSSC, содержащим 0 2% Tween 20, и окрашивали DAPI 5 мин

РНК-интерференция Клетки линии HeLa культивировали в среде DMEM с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота Трансфекцию siRNA производили с использованием RNAiFect Kit (Quiagen, Germany) по протоколу производителя Клетки анализировали спустя 96 ч после трансфекции

HMMyHoFISH на клетках человека с пробой CF1 проводили как описано в (Zink et al, 2004) Полуколичественная RT-PCR была любезно проведена Dr Nicolas Sadoni (Munich, Germany) как описано в (Zink et al, 2004)

Микроскопия и анализ изображений Ядра клеток Drosophila и человека сканировали с помощью конфокальных микроскопов Zeiss LSM 410 или Leica SP2 AOBS с 63х, NA 1 4 oil immersion объективом Размер воксела был 100x100x250 нм (x,y,z) Сборка 3D изображений и измерения расстояний между двумя FISH-сигналами, между сигналом и ламиной или гетерохроматином производили с помощью программ ImageJ 1 34 (Rasband, 1997-2006), Metamorph 4 0/4 6 (Universal Imaging, Downinton, USA) или LCS-Lite 2 5 (Leica Microsystems, Heidelberg, Germany) 2D изображения ядер фибробластов трансгенных свиней были получены с использованием CCD-камеры (МюгоМах, Princeton Instruments Monmouth, USA), установленной на эпифлуоресцентном микроскопе Axiovert 135 TV, Zeiss Размер пикселя был 100x100 нм Двухмерный послойный анализ распределения FISH-сигналов проводили с помощью программы Adobe Photoshop 7 0 и макроса, созданного Dr Nicolas Sadoni (Универститет Людвига-Максимилиана, Мюнхен), как описано в (Zink et al, 2004) Измерения расстояний между FISH-сигналом и ближайшим хромоцентром производили в программе ImageJ 1 34

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1 Пространственная организация хромоцентра в ядрах Drosophila melanogaster

Одной из главных задач данной работы было выявление потенциальной ассоциации генов и трансгенов в определенных функциональных состояниях с хромоцентром, поэтому мы провели исследование трехмерной организации хромоцентра и его периферии в интерфазных ядрах клеток различных личиночных тканей Drosophila, а также клеток линии Кс

В первой серии экспериментов мы использовали сателлитный повтор (AAGAG)n в качестве маркера альфа-гетерохроматина и антитела к димНЗКЭ для визуализации хромоцентра в целом ДимНЗКЭ-позитивный хроматин занимал до 20% объема ядра и обычно образовывал один большой хромоцентр (реже 2-3), что согласуется сданными других исследователей (Hochstrasser et al, 1986) Мы ожидали, что повтор (AAGAG)n будет недореплицирован и будет располагаться внутри димНЗКЭ-положительного хромоцентра Однако результаты наших экспериментов показали, что этот сателлит образует несколько фокусов на периферии или за пределами хромоцентра (рис 1 А-С) Это не соответствует нашему первоначальному предположению о том, что (AAGAG)n в интерфазных политенных ядрах входит в состав альфа-гетерохроматина - небольшой плотной структуры в сердцевине хромоцентра, однако согласуется с данными, полученными на эмбриональных ядрах, где этот сателлит также образовывал несколько небольших фокусов (Dernburg et al, 1996) Такую же картину мы и Janssen с соавт наблюдали в ядрах клеток Кс (Janssen et al, 2000)

Мы также обнаружили, что фокусы (ААСАС)п димНЗКЭ-негативны. Опираясь на I модель формирования альфа- и бета-гетерохроматина политенных хромосом, предложенную 1 Коряковым и соавт. (Когуакоу е! а1., 1996), мы предполагаем, что участки гетерохроматина, содержащие (ААОАС)п, «выпетлены» так, что они экспонированы на поверхность димНЗКЭ-. позитивного хромоцентра в нескольких местах и таким образом исторгнуты из него (рис. 2.). На данный момент неясно, является ли отсутствие димНЗКЭ на сателлите (ААОАС)п причиной или следствием его локализации вне димНЗКЭ-позитивного хроматина.

/ \ I

Рисунок 1. Индивидуальные оптические срезы ядер клеток мальпигиевых сосудов (А, Е-*!), средней кишки (В) и серия последовательных срезов ядра Кс клетки (С). (А-С) Гетерохроматин (красный), повтор (АА0А6)„ (зеленый), ядерная ламина (синий) (в Кс клетках цитоплазма также имела высокий уровень фонового окрашивания). ■ Стрелками на (С) указаны небольшие фокусы (ААСАв)п, не контактирующие с хромоцентром. Масштаб: 10 мкм. р Н, ^ - увеличенные секции, выделенные на Е, в, I соответственно. Гетерохроматин (синий), [^АР113ег2 (красный) на (Е-и). (Е, Р) ДимНЗК4 (зеленый, указан большой размерной стрелкой на (Р)), РМАРПЗегг (маленькие размерные стрелки), ядрышко указано оранжевой звездочкой, (в, Н) ТримНЗК4 (зеленый), хромоцентр дополнительно обозначен белой звездочкой. Сайты колокализации тримНЗК4 и ГМАРИЗегг (желтый) на периферии хромоцентра показаны размерными стрелками. (I, и) Рс (зеленый). Большими размерными стрелками на (и) указаны сайты КЫАРНЗег2 в ассоциации с сайтами связывания Рс на периферии хромоцентра. Маленькая размерная стрелка указывает на такую ассоциацию в другом участке нуклеоплазмы. Масштаб: 5 мкм.

Во второй серии экспериментов в ядрах клеток личиночных тканей был визуализирован хромоцентр (димНЗКЭ) и различные эухроматиновые маркеры, такие как димНЗК4, тримНЗК4, РМАРПБег2 и Рс (рис. 1 Е^). Ни один из них не был выявлен внутри хромоцентра, но все они присутствовали на его периферии (рис. 1 ТримНЗК4, в отличие от димНЗК4, в большинстве случаев был колокализован с РМАРИЭег2, причем не только на поверхности хромоцентра, но и в остальном объеме ядра (рис. 1 в, Н). Эти результаты свидетельствуют о том, что в личиночных тканях ОговорЬ/'/а димНЗК4 является маркером молчащих, а тримНЗК4 - активных генов. Аналогичные результаты получены ранее при исследовании клеток дрожжей

(Santos-Rosa et al., 2002). Мы также обнаружили Рс-связывающие сайты на поверхности хромоцентра, при этом большинство из них были ассоциированы с RNAPIISer2, в отличие от сайтов связывания Рс на периферии ядра.

Локализация транскрибируемых сайтов на поверхности хромоцентра была неожиданной, поскольку до сих пор считалось, что каку Drosophila, так и у млекопитающих с гетерохроматином ассоциированы только молчащие локусы (Csink, Henikoff, 1996; Dernburg et al., 1996; Brown et al., 1997; Csink, Henikoff, 1998; Schubeler et al., 2000; Zink et al., 2004). Однако y Drosophila есть множество так называемых гетерохроматиновых генов, которые не только локализованы в гетерохроматине, но и нуждаются в гетерохроматиновом окружении для нормальной экспрессии (Gatti, Pimpinelli, 1992; Weiler, Wakimoto, 1995; Yasuhara, Wakimoto, 2006). Можно предположить, что гетерохроматиновые гены в транскрипционно активном состоянии занимают положение на поверхности хромоцентра, что предоставило бы им необходимое гетерохроматиновое окружение и в то же время обеспечило бы доступ к ним компонентов аппарата транскрипции. Это предположение подтверждается данными, полученными при исследовании Л5 трансгена мыши (Lundgren et al., 2000).

Выявленная нами сложная мозаичная организация периферии хромоцентра схематично показана на рис.2.

Рисунок 2. Модель Зй организации альфа- и бета-гетерохроматина в хромоцентре поли-тенных хромосом в интерфазном ядре

Огояор/?//а me^эnogasfe/-(модифицировано и

дополнено из Когуакоу и соавт., 1996).

ДимНЗКЭ

тримНЗК4

RNAPIISer2

ДИМНЗК4

(AAGAG)n

(голубой), (синий), (красный), (желтый), (светло-

зеленый), Рс-связывающие сайты (темно-зеленый), неактивный Fab-7 элемент (оранжевый).

2.1. Локализация неактивных генов и ГаЬ-7-содержащих трансгенов в ядрах клеток личиночных тканей ОгоэорЬИа

В ядрах клеток эпидермиса и мальпигиевых сосудов личинок WT, FLW-1, fLW-1 и FLFW-1 было проанализировано расположение генов Abd-B, sd и Ubx, а также Fab-7-содержэщих трансгенов 5F24.5F3 и 24F6 (Cavalli, Paro, 1998; Zink, Paro, 1995). Для этого на Зй-конфокальных изображениях ядер были измерены расстояния между FISH-сигналами соответствующего гена/ трансгена и ядерной ламиной или хромоцентром. Измерения показали, что все исследованные гены и трансгены в неактивном состоянии не ассоциированы с гетерохроматином и занимают периферическое положение (рис. 3). Периферическая локализация неактивных элементов согласуется с ранее опубликованными данными (Andrulis et al., 1998; Zink et al., 2004), однако она не опосредована ламином Dm0 (Pickersgill et al., 2006). Соседние гены Abd-B (район 89 Е4-5) и Ubx (район 89 D6-9) имели независимую локализацию, что согласуется с данными, полученным для CFTP. локуса человека (Zink et al.. 2004). Индивидуальное расположение всех генов и трансгенов в ядре зависело от их хромосомной локализации, типа ткани и линии мух.

FLFW-1 AbdB-ламина

□ эпидермис N=30

■ мальп. сосуды N=30

J .

2 4 6 8 10 12 14 16 мкм

FLW-1 Ubx-ламина

□ эпидермис N=51 ■ мальп. сосуды N=55

ai 60

100

и U

FLFW-1 AbdB-хромоцентр

□ эпидермис N=30 ■ мальп. сосуды N=30

kiw

10 12 14 16

FLW-1 Ubx-хромоцентр

□ эпидермис N=51 ■ мальп. сосуды N=55

i ,

J Плшп... _

6 8 10 12 14 16 мкм

0 2 4 6 8 10 12 14 16 мкм

100

6Ü

FLW-1 sd-ламина

□ эпидермис N=65

■ мальп. сосуды N=65:

[к

10 12 14 16

100

о 60

FLW-1 sd-хромоцентр

□ эпидермис N=64

□ мальп. сосуды N=65

Рисунок 3. Локализация в ядре неактивных генов Abd-B, scfn Ubx (А,В) индивидуальные оптические срезы ядер клеток мальпигиевых сосудов. FISH-сигнал (красный), димНЗКЭ (зеленый), ламина (синяя). (А) Abd-B, личинка FLFW-1. (В) Ubx, личинка WT. Масштаб: 5 мкм. (С ,D) Результаты измерения расстояний между центрами массы FISH сигнала генов и ближайшим участком ламины (С) или хромоцентра (D) в ядрах клеток эпидермиса и мальпигиевых сосудов. По оси X - расстояния (мкм), по оси Y - процент ядер с соответствующим расстоянием. N - число проанализированных ядер для каждой ткани.

2.2. Активация транскрипции ?аЪ-7-содержащих трансгенов и их локализация в

ядре

Использованные в нашей работе трансгены 5Р24, 5РЗ и 24Р6 были активированы с помощью теплового шока наэмбриональной (стабильная активация)или личиночной (временная активация) стадиях развития. Измерения расстояний на Зй-конфокальных изображениях ядер показали, что у мух линий Р1_\ЛМ и Л_\Л/-1, у которых трансген интегрирован в локус 13Р, активация транскрипции трансгенов приводила к незначительному их сдвигу в сторону центра ядра (данные не показаны), в то время как у мух Р1_Р\ЛМ, имеющих трансген в локусе 61С9, его активация приводила к усилению ассоциации с ламиной. Ассоциация активных локусов с периферией ядра была до сих пор найдена только у дрожжей, но не у многоклеточных эукариот (РэИм е! а\., 2002; Сазо1ап е1 а1., 2004; Сазо1ап е( а1„ 2005; Тас1с1е1 е1 а1„ 2006).

Удивительно, что активация трансгенов в большинстве случаев приводила к увеличению частоты их ассоциации с периферией хромоцентра (ассоциацией считалось расстояние 0-2 пикселя между Р1ЭН-сигналом и поверхностью хромоцентра) (рис. 4). Этот эффект был особенно выражен в случае стабильной активации трансгена 5Р24: частота таких ассоциаций составила 40% в ядрах клеток эпидермиса и 48% в ядрах клеток мальпигиевых сосудов (Табл. 1). В двух других трансгенных линиях мух этот эффект также был более заметен в ядрах клеток мальпигиевых сосудов (Табл. 1). Следует отметить, что Р13Н-сигналы трансгенов в случае ассоциации были детектированы на периферии хромоцентра, но не внутри его. Это согласуется с результатами, описанными выше. До сих пор ассоциации активных локусов с гетерохроматином не были известны. Мы предполагаем, что специфическая организация пространства ядра на периферии хромоцентра может поддерживать активное состояние трансгенных РКЕ-элементов.

Рисунок 4. Индивидуальные оптические срезы ядер клеток мальпигиевых сосудов. FISH-сигнал гена sd (красный), хромоцентр (зеленый), ядерная ламина (синяя). (А) Ядро клетки контрольной личинки (без теплового шока). (В) Ядро клетки личинки после эмбрионального теплового шока. Масштаб: 10 мкм.

2.3. Пространственные взаимоотношения между эндогенным и трансгенным Fab-7 элементами

Мы проанализировали пространственные взаимоотношения между эндогенной и трансгенной копиями Fab-7 в ядрах клеток эпидермиса, мальпигиевых сосудов, средней кишки, жирового тела и мозга личинок-самок линий 5F24 25,2 и FLW-1 с помощью конфокальной микроскопии высокого разрешения. Положение эндогенной копии Fab-7 было выявлено с помощью пробы Abd-B, а положение трансгенной копии с помощью пробы sd. Во всех проанализированных тканях нами не было зарегистрировано ни одного случая конъюгации эндогенной и трансгенной копий Fab-7 элемента (рис. 5 А, В, Табл. 2). Эти результаты противоречат опубликованным ранее данным о том, что у мух линии 5F24 25,2 копии Fab-7 конъюгированы в 23% ядер эмбрионов и 43% ядер клеток имагинальных дисков крыла (Bantignies et al., 2003; Grimaud et al., 2006).

Поскольку конъюгация копий Fab-7 была описана для случая усиленной Рс-зависимой репрессии у мух 5F24 25,2 (т.е. при содержании их при 29°С) (Bantignies et al., 2003), мы также повторили эксперименты в этих условиях. Однако и в этом случае конъюгация копий

Таблица 1. Частоты ассоциаций трансгенных Fab-7 элементов с периферией

хромоцентра

Ткань Число ядер % ассоциаций

\/\/Т эпидермис 30 13.3

\Л/Т мальп. сосуды 64 15.6

Р1_\Л/-1 контр, эпидермис 62 9.7

Р1_\Л/-1 контр, мальп. сосуды 61 9.8

Р1_\АМ НБЕ эпидермис 50 40

Р1_\Л/-1 НЭЕ мальп. сосуды 50 48

Р!_У\/-1 НБЬ эпидермис 34 26.5

Р1_У\/-1 Н31- мальп. сосуды 47 12.8

fLW-1 контр, эпидермис 45 2.2

А.\ЛМ контр, мальп. сосуды 51 13.7

А_\Л/-1 НБЕ эпидермис 49 8.2

fLW-1 НЗЕ мальп. сосуды 45 11.1

fLW-1 НЭЬ эпидермис 48 4.2

й.\Л/-1 НБЬ мальп. сосуды 46 21.7

Р1.Р\Л/-1 контр, эпидермис 29 10.3

FLFW-1 контр, мальп. сосуды 32 0

Р1_Р\Л/-1 НЭЕ эпидермис 42 9.5

Р1_Р\Л/-1 НЭЕ мальп. сосуды 37 5.4

FLFW-1 НЭЬ эпидермис 48 10.4

FLFW-1 ИБЬ мальп. сосуды 39 15.4

Измерения были проведены при неактивном (контр.), стабильно (НвЕ) и временно (НЭЬ) активном состояниях трансгенов в ядрах клеток эпидермиса и мальпигиевых сосудов личинок третьего возраста. В тканях личинок \Л/Т были проанализированы частоты ассоциаций всС с хромоцентром.

Рисунок 5. Индивидуальные оптические срезы ядер клеток эпидермиса. Р13Н-сигналы генов АЬЬ-В (зеленый) и эс! (красный), ламина (синий). (А) Ядро клетки личинки Р1_\Л/-1, выращенной при 18°С. (В, С) Ядра клеток личинок 5Р24 25,2, выращенных при 18°С и 29°С, соответственно. Масштаб: 10 мкм.

' Fab-7 элемента отсутствовала (рис.5, С, Табл. 2). По техническим причинам нами не были i проанализированы ядра клеток имагинальных дисков крыла.

Чтобы проверить,влияетлихромосомнаялокализациятрансгенанаегопространственные отношения с эндогенным Fab-7 элементом, мы проанализировали ядра клеток эпидермиса и мальпигиевых сосудов личинок FLFW-1, где трансген интегрирован в локус 61С9 (Cavalli, Paro, 1998) Обе копии Fab-7 были выявлены с помощью пробы Fab-7, эндогенная копия была маркирована с помощью пробы Abd-B В этом случае эндогенная и трансгенная копии Fab-7 элемента также имели независимое расположение (Табл 2)

Таблица 2 Расстояния между эндогенной и трансгенной копиями Fab-7 элемента

Линия мух Ткань Число ядер Конъюгация, % Мин расст, мкм

FLW-1 мозг 40 0 1 1

эпидермис 93 0 07

жировое тело 40 0 1 6

ср кишка 45 0 27

мальп сосуды 45 0 1 0

эпидермис 49 0 1 7

5F24 25,2 18°С жировое тело 51 0 47

ср кишка 42 0 37

мальп сосуды 56 0 28

5F24 25,2 29°С эпидермис 90 0 38

жировое тело 40 0 25

ср кишка 56 0 26

мальп сосуды 67 0 42

FLFW-1 эпидермис 120 0 06

мальп сосуды 108 0 06

3 Локализация в ядре трансгена LV-PGK у трансгенных свиней зависит от его транскрипционной активности и сайта интеграции

Эксперименты, проведенные нами на трансгенных мухах Drosophila melanogaster, показали, что активация транскрипции трансгенов приводила к изменению их локализации в ядре Поэтому мы решили проанализировать эту взаимосвязь у млекопитающих Мы использовали фибробласты трансгенных свиней Sus sc rafa sc rafa, созданных в лаборатории Prof Pfeifer, которые несут лентивирусный трансген LV-PGK (Follenzi et al, 2000, Hofmann et al, 2003) Были использованы несколько линий клеток с различным уровнем экспрессии и сайтами интеграции трансгена (все линии имели только один интегрант) SFF 9338 с высоким уровнем экспрессии трансгена, SFF 9206 с варьирующей экспрессией, SFF 9193 с низким уровнем экспрессии и неэкспрессирующие линии SFF 9192 и 9196 (Hofmann et al, 2006) Трансгены были визуализированы с помощью FISH с пробой LV-PGK, и для каждой линии клеток был проведен 2D послойный анализ распределения FISH-сигналов Анализ показал, что в неэкспрессирующих клетках 9192 и 9196 трансген был локализован на периферии, а в экспрессирующих клетках 9338 и 9206 он находился в более внутренних областях ядра (рис 6) Это соответствует как результатам, полученным нами при исследовании политенных ядер Drosophila (см выше), так и данным других исследований (Tumbar, Belmont, 2001, Kosak et al, 2002, Dietzel et al, 2004, Zink et al, 2004)

У Drosophila активация транскрипции трансгенов 5F24 и 5F3 приводила к их смещению в сторону центра ядра, в то время как ассоциация трансгена 24F6 с ламиной после активации только усиливалась (см выше) Было неясно, в чем причина этих различий - в сайтах хромосомной локализации трансгенов или в их строении Клетки свиней, несущие один и тот же трансген, дали нам возможность более подробно рассмотреть этот вопрос Мы активировали трансген LV-PGK с помощью 5-азацитидина с целью выяснить, приведет ли это к изменению его локализации в ядре По техническим причинам для этих экспериментов были доступны только клетки линий 9206 (варьирующая экспрессия) и 9193 (низкий уровень экспрессии)

В обоих случаях обработка 5-азацитидином привела к сильному повышению уровня активности трансгена, но его ядерная локализация не изменилась (данные не показаны). Это может объясняться тем, что в клетках этих линий трансген и до активации находился в транскрипционно пермиссивных областях.

Так как на материале доступных линий клеток не удалось проанализировать роль сайта интеграции, мы применили другой метод. Культура фибробластов WT была инфицирована ретровирусом LV-PGK in vitro, после чего клетки с высоким уровнем экспрессии были культивированы отдельно. Ядерная локализация трансгена была 'исследована в клетках с одним интегрантом. 2D послойный анализ распределения FISH-I сигналов показал, что трансгены в основном располагались во внутренних областях ядра (данные не показаны). Это согласуется с другими результатами данной работы.

9338 сильная экспрессия

9193 слабая экспрессия

г-зо

! □ N=32

П _

1 2 3 слой 4 5

9206 варьирующая экспрессия

| □ N=90

п I—I

9192 нет экспрессии

г 2? 20

9196 нет экспрессии

Рисунок 6. Локализация трансгена LV-PGK в ядрах фибробластов трансгенных свиней. Изображения ядер были разделены на 5 концентрических слоев, и было подсчитано количество сигналов в каждом слое. Слои указаны на оси X: 1 соответствует наружному слою и 5 - центральному. По оси Y показан % ядер, имеющих FISH сигналы в соответствующем слое. N - число проанализированных ядер.

4. Белок Трг, ассоциированный с комплексами ядерных пор, принимает участие в периферической локализации неактивных генов в клетках человека

Данные, полученные на материале ОговорЫ/а и клеток свиней, позволяют предположить наличие консервативных механизмов позиционирования неактивных генов на периферии ядра. Результаты других работ показывают, что ламин ОгоэорЬИа От0 непосредственно

взаимодействует с большим количеством неактивных генов, которые локализуются на периферии ядра в клетках Кс (Pickersgill et al, 2006) На материале клеток человека линий НЕК-293, SH-EP N14 и Calu3 было показано, что белки ламин А/С, LAP20 и эмерин необходимы для локализации неактивного гена CFTR на периферии ядра (Zmk et al, 2004, Englmann, 2005) Данные, полученные на клетках дрожжей, указывают на участие NPC в позиционировании хроматина было показано, что гены физически связываются с NPC (Galy et al, 2000, Ishn et al, 2002)

Чтобы проверить, участвует ли NPC в организации интерфазного ядра у млекопитающих, мы изучили роль NPC-ассоциированного белка Tpr (Cordes et al, 1997, Krull et al, 2004) в позиционировании неактивного гена CFTR человека Tpr был выбран для анализа, поскольку его относят к сайтам заякоривания леринуклеарного хроматина (Cordes et al, 1997) Известно, что его дрожжевые гомологи М1р1 и Mlp2 прямо участвуют в периферическом расположении неактивных генов (Galy et al, 2000) Используя РНК-интерференцию, мы провели посттранскрипционную инактивацию Tpr в клетках HeLa и проанализировали положение гена CFTR (выявленного с помощью FISH с пробой CF1) в присутствии и в отсутствие продукта гена TPR Эффективность инактивации Tpr проверяли с помощью иммуноокрашивания специфическими антителами и с помощью Western-блоттинга Эффективность трансфекции составила -75% (данные не показаны) Ядра контрольных и RNAi-обработанных клеток сканировали с помощью конфокальной микроскопии Положение CFTR анализировали с помощью измерения расстояний между FISH-сигналом и границей ядра

Клетки HeLa являются трисомиками по хромосоме 7, на которой расположен ген CFTR, поэтому в каждом ядре было выявлено от 1 до 3 сигналов (рис 7) Измерения расстояний производили индивидуально для каждого сигнала Результаты измерений показали, что в контрольных (нетрансфицированных) клетках более 60% FISH-сигналов находились на расстоянии менее 0 2 мкм от границы ядра, а среднее расстояние составило 0 31 мкм (рис 7), что соответствует полученным ранее данным (Englmann, 2005) В отсутствие Tpr только ~20% сигналов находились в пределах 0 6 мкм от границы ядра, а среднее расстояние составило 0 97 мкм (рис 7) Похожий эффект наблюдался при пост-транскрипционной инактивации белков ламин А/С, LAP2P и эмерин среднее расстояние между CFTR и границей ядра увеличивалось с 0 28 до 0 8 мкм (Englmann, 2005) Контрольная трансфекция клеток HeLa неспецифической FITC-меченой siRNA не привела к изменению положения CFTR В совокупности эти результаты показывают, что периферическое расположение неактивного гена CFTR зависит от множественных взаимодействий с периферийными белками ядра, в частности, с ламинами, эмерином и белками ядерных поровых комплексов

Чтобы проверить, не приводит ли перемещение в транскрипционно пермиссивные внутренние районы ядра к активации CFTR, была проведена полуколичественная RT-PCR В качестве контроля использовали |3-актин Клетки Calu-З, где CFTR активно экспрессируется (Zink et al, 2004), были использованы в качестве положительного контроля Было показано, что CFTR неактивен как в контрольных, так и в RNAi-обработанных клетках HeLa (данные не показаны), то есть перемещение CFTR во внутренние области ядра в отсутствие Tpr не приводит к его транскрипционной активации

Таким образом, NPC-ассоциированный белок Tpr, наряду с другими белками (Englmann, 2005), вероятно, участвует в заякоривании неактивных генов на периферии ядра У Drosophila такую роль играет ламин Dm0 (Pickersgill et al, 2006) Поскольку y Drosophila также описан гомолог белка Tpr (белок Вх34), находящийся на периферии ядра и по биохимическим свойствам схожий с Tpr млекопитающих (Zimowska et al, 1997), можно предположить, что этот белок и у Drosophila принимает участие в периферической локализации неактивных генов Учитывая данные о роли белков NPC и гомологов Tpr в заякоривании неактивных генов на ядерной оболочке у дрожжей (Galy et al, 2000), мы предполагаем, что участие ламинов, равно как и компонентов NPC и вспомогательных белков, в организации хроматина является консервативным механизмом, определяющим организацию хроматина в интерфазном ядре эукариот от дрожжей до млекопитающих

CFTR-периферия в клетках HeLa

¥ i от

■ контроль, N=125 □ RNAi, N=130

■Л П П П п

Л , Г , 1 ,1 , ■ 1 . ■ . . ■ . . , П . п . — , —

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6

MKM

Клетки Расстояние CFTR-периферия ядра, мкм

среднее максимальное

Контроль 0.31 2.5

0.97 2.55

I Рисунок 7. Локализация CFTR в ядре в присутствии и в отсутствие Трг. Показаны индивидуальные оптические срезы контрольных (А) и обработанных RNAi (В) ядер HeLa. FISH-сигнал CFTR (красный) 'дополнительно указан размерными стрелками, Трг (зеленый на А). В обработанных RNAi клетках граница ядра видна из-за неспецифического связывания СуЗ-меченых антител к дигоксигенину. (С) Результаты измерения расстояний между сигналами CFTR и границей ядра показаны на диаграмме. По оси X - расстояние в микронах. По оси Y - % FISH-сигналов, находящихся на соответствующем расстоянии от границы ядра. N - число FISH сигналов, проанализированных в контрольных (синий) и обработанных I RNAi (розовый) клетках. Средняя и максимальная дистанции между CFTR и границей ядра в обоих ти-|Пах клеток показаны в таблице под диаграммой.

выводы

1 Периферия хромоцентра политенных ядер Drosophila теет сложную мозаичную структуру В интерфазных ядрах Drosophila на периферии хромоцентра одновременно представлены сателлитный повтор (AAGAG)n, ди- и триметилированный по лизину 4 гистон НЗ, активная форма РНК-полимеразы II и активные PRE-элементы

2 Неактивные гены Abd-B, sd и Ubx и Fab-7-содержэщие трансгены у Drosophila melanogaster занимают периферическое расположение в ядре и не ассоциированы с хромоцентром

3 Транскрипционная активация Fab-7-содержэщих трансгенов приводит к изменению их локализации относительно ядерной ламины и увеличению частоты их ассоциации с хромоцентром (до 50%)

4 С помощью конфокальной микроскопии изучено взаимное расположение эндогенной и трансгенной копий Fab-7 элемента в ядрах клеток пяти личиночных тканей разных линий мух и показана их независимая локализация в ядре

5 На материале фибробластов трансгенных свиней Susscrofa scrofa показано, что положение трансгена LV-PGK в ядре изменяется при активации его транскрипции

6 С помощью РНК-интерференции показано, что белок Трг, ассоциированный с NPC, необходим для локализации неактивного гена CFTR человека на периферии ядра

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Rybakina Е , Paro R , Dahlsveen I, Becker Р, Zink D Analysis of the relationships between functional states of the Drosophila melanogaster Fab-7 element and its nuclear position // European Journal of Cell Biology 2004 Vol 83 Suppl 54 P 63

2 Rybakina E , Dahlsveen I , Becker P, Paro R , Zink D How does the nuclear architecture contribute to the functional regulation of the Polycomb response element Fab-7 ? // Book of Abstracts ofthe UK Chromatin Meeting 2005 P15

3 Rybakina, E Nuclear positioning and functional regulation of endogenous genes and transgenes in the fruit fly Drosophila melanogaster and in mammalian cells Dissertation, 2006 LMU Munchen Fakultatfur Biologie, 176 pp

4 Fedorova E , Sadoni N , Dahlsveen I К , Koch J , Kremmer E , Eick D , Paro R , Zink D The nuclear organization of Polycomb/Trithorax group response elements in larval tissues of Drosophila melanogaster II Chromosome Research 2008 VoM6 №4 P 649-673

5 Fedorova E M and Rodionov A V Towards understanding the mechanisms of epigenetic regulation Part 1 An evolutional insight into PcG-mediated gene repression // Экологическая Генетика 2008 T 6 № 1 С 12-19

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

димНЗК4 гистон НЗ, диметилированный по лизину 4

димНЗКЭ гистон НЗ, диметилированный по лизину 9

тримНЗК4 гистон НЗ, триметилированный по лизину 4

HSE тепловой шок на эмбриональной стадии развития

HSL тепловой шок на личиночной стадии развития

NPC ядерный поровый комплекс

Рс Polycomb

RNAPIlSer2 РНК-полимераза II, фосфорилированная по серину 2 (активная форма)

RNAi РНК интерференция

siRNA small interfering RNA

WT дикий тип

Подписано в печать 11 08 2008г Формат 64x84/16 Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ЗАО "КопиСервис" Печать ризографическая Заказ №1/0811 П л 1 0 Уч -изд л 1 0 Тираж 100 экз

ЗАО "КопиСервис" Адрес 197376, Санкт-Петербург, ул Проф Попова, д 3 тел (812)327 50 98

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федорова, Елена Михайловна

Введение

Список сокращений

1. Обзор литературы

1.1. Модификации гистонов, характерные для эухроматина и гетерохроматина

1.2. Регуляция транскрипционной активности белками PcG

1.3. Взаимодействия между PRE-элементами у Drosophila

1.4. Архитектура ядра и регуляция работы генов

2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.1.1. Химикалии, культуральные среды и добавки

2.1.2. Ферменты

2.1.3. Нуклеотиды, нуклеиновые кислоты и векторы

2.1.4. Антитела и конъюгаты

2.1.5. Красители и маркеры

2.1.6. Киты

2.1.7. Буферы и растворы

2.1.8. Микроскопы

2.1.9. Программы для обработки изображений

2.1.10. Линии мух Drosophila melanogaster

2.1.10.1. Мухи дикого типа

2.1.10.2. Трансгенные мухи

2.1.10.2.1. Трансгенные конструкции 5F3, 5F24 и 24F

2.1.10.2.2. Трансгенные линии мух

2.1.11. Линии клеток

2.1.11.1. Клетки Drosophila

2.1.11.2. Клетки человека

2.1.11.3. Клетки свиньи

2.1.11.3.1. Клетки свиней дикого типа (WT)

2.1.11.3.2. Клетки трансгенных свиней, имеющие лентивирусную конструкцию LV-PGK

2.1.11.3.3. Линии клеток трансгенных свиней

2.2. Методы 46 2.2.1. Клетки млекопитающих

2.2.1.1. Культура клеток млекопитающих in vitro

2.2.1.2. Посев клеток на покровные стекла

2.2.1.3. Фиксация клеток метанолом и уксусной кислотой

2.2.1.4. Фиксация клеток формальдегидом

2.2.1.5. Иммуноокрашивание клеток, фиксированных формальдегидом

2.2.1.6. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH)

2.2.1.6.1. Мечение проб

2.2.1.6.2. Ферментативная деградация ПЦР-меченых проб

2.2.1.6.3. Осаждение проб ДНК

2.2.1.6.4. Денатурация и гибридизация

2.2.1.6.5. Детекция

2.2.1.7. РНК-интерференция

2.2.1.8. Экспрессия CFTR в клетках HeLa

2.2.2. Клетки и ткани Drosophila melanogaster

2.2.2.1. Культура клеток Drosophila

2.2.2.2. Содержание мух Drosophila

2.2.2.3. Препарирование личиночных тканей Drosophila

2.2.2.4. Фиксация клеток формальдегидом

2.2.2.5. Иммуноокрашивание фиксированных формальдегидом клеток Кс

2.2.2.6. Иммуноокрашивание тканей Drosophila

2.2.2.7. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH)

2.2.2.7.1. Подготовка проб

2.2.2.7.2. Мечение проб

2.2.2.7.3. Эффективность мечения и специфичность проб

2.2.2.7.4. Осаждение проб

2.2.2.7.5. FISH на политенных хромосомах

2.2.2.7.6. FISH на тканях личинок

2.2.2.7.7. HMMyHoFISH на фрагментах тканей

2.2.2.7.7.1. ПротоколА

2.2.2.7.7.2. Протокол В

2.2.3. Анализ изображений

2.2.3.1. Анализ изображений ядер, фиксированных метанолом уксусной кислотой

2.2.3.2. Анализ изображений ядер, фиксированных формальдегидом

2.2.3.2.1. Измерение расстояний между двумя генами

2.2.3.2.2. Измерение расстояний между геном и ядерной ламиной хромоцентром

2.2.3.2.3. Коррекция расстояний

2.2.3.3. Анализ трехмерной организации фокусов белка Polycomb 69 3. Результаты 72 3.1. Локализация генов и трансгенов в интерфазных ядрах клеток личиночных тканей Drosophila melanogaster

3.1.1. Пространственная организация хроматина в ядрах Drosophila

3.1.2. Локализация генов и трансгенных конструкций в интерфазном ядре Drosophila

3.1.2.1. Неактивные гены

3.1.2.1.1. Abdominal-B (Abd-B)

3.1.2.1.2. Scalloped (sd)

3.1.2.1.3. Ultrabithorax (Ubx)

3.1.2.2. Локализация Fab-7-содержэщих трансгенов в ядре в разных состояниях активности 3.1.2.2.1. Локализация трансгена 5F24 в ядрах личинок Drosophila линии Р1\Л/

3.1.2.2.2. Локализация трансгена 5РЗ в ядрах личинок линии А-\Л/

3.1.2.2.3. Локализация трансгена 24Р6 в ядрах личинок линии Р1Р\Л/

3.1.2.3. Положение в ядре других PRE-элементов в их активном и неактивном состояниях

3.1.3. Существует ли физическое взаимодействие между гомологичными PRE-элементами?

3.1.3.1. Локализация эндогенной и трансгенной копий Fab-7 элемента относительно друг друга в ядрах клеток различных тканей личинок FLW

3.1.3.2. Эндогенная и трансгенная копии Fab-7 в ядрах личинок линии 5F24 25,2: влияет ли температура развития мух на предполагаемые взаимодействия?

3.1.3.3. Важна ли хромосомная локализация трансгенной копии Fab-7? Измерения расстояний между эндогенным и трансгенным Fab-7 элементами в ядрах клеток различных тканей личинок FLFW

3.1.4. Пространственное распределение белка Polycomb в интерфазных ядрах клеток различных личиночных тканей

3.1.4.1. Ассоциация эндогенных Pc-GFP-связывающих сайтов с активной формой RNAPIIser2 на поверхности хромоцентра

3.2. Локализация активных vs неактивных трансгенов LV-PGK в ядрах фибробластов трансгенных свиней (Sus scrofa scrofa)

3.2.1. Иммортализованные клетки

3.2.2. Первичные культуры клеток

3.2.3. Активация трансгена LV-PGK с помощью 5-азацитидина

3.2.4. Локализация активного трансгена LV-PGK в инфицированных клетках WT

3.3. Роль белка Трг в локализации гена CFTR в ядрах клеток HeLa

3.3.1. Влияние пост-транскрипционной инактивации белка Трг на локализацию CFTR в ядрах клеток HeLa

3.3.2. Отсутствие Трг приводит к перемещению CFTR, не вызывая его транскрипционной активации

4. Обсуждение

4.1. Локализация PRE-элемента Fab-7 в ядрах Drosophila melanogaster 4.1.1. Организация хромоцентра в ядрах различных типов клеток

Drosophila melanogaster 4.1.2. Пространственная организация эухроматиновых модификаций гистонов в интерфазных ядрах личиночных тканей Drosophila melanogaster

4.1.3. Расположение активных сайтов на поверхности хромоцентра

4.1.4. Локализация неактивных генов в ядрах личиночных тканей

Drosophila

4.1.5. Положение активных и неактивных Fab-7-содержэщих трансгенов в ядрах клеток личиночных тканей Drosophila

4.1.6. Есть ли физический контакт между гомологичными PRE-элементами в ядрах клеток личиночных тканей Drosophila?

4.1.6.1. Политенные vs обычные хромосомы, тип ткани и взаимодействия эндогенных и трансгенных Fab-7 элементов

4.1.6.2. Влияют ли положение на хромосоме и температура на взаимное расположение копий PRE-элемента Fab-7 в ядре?

4.1.7. Трехмерная ядерная организация Рс-связывающих сайтов у Drosophila: трудности интерпретации

4.2. Сайт интеграции и транскрипционная активность определяют ядерную локализацию трансгенов LV-PGK в клетках свиней

4.3. Белок Трг, ассоциированный с комплексами ядерных пор, принимает участие в периферической локализации неактивных генов в клетках человека

Выводы

Благодарности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимосвязь положения в ядре и функциональной регуляции генов и трансгенов в интерфазных ядрах Drosophila Melanogaster и культивируемых клеток млекопитающих"

Актуальность проблемы

Результаты многих исследований указывают на связь локализации генов в интерфазном ядре с их транскрипционной активностью. Ядерная периферия и гетерохроматин традиционно считаются репрессивными доменами, а внутренняя область ядра - районом активной транскрипции. Ассоциация неактивных генов с гетерохроматином была выявлена у Drosophila (Csink, Henikoff, 1996; Dernburg et al., 1996) и млекопитающих (Brown et al., 1997; Francastel et al., 1999). Репрессия генов на периферии ядра была обнаружена у дрожжей (Andrulis et al., 1998; Cockell, Gasser, 1999) и некоторых многоклеточных эукариот (Kosak et al., 2002; Zink et al., 2004; Pickersgill et al., 2006). Однако полученные недавно результаты показывают, что у дрожжей активные гены также могут занимать периферическое положение в ядре (Casolari et al., 2004; Casolari et al., 2005; Taddei et al., 2006). Отметим, что механизмы взаимодействия хроматина с белками ядерной ламины и ядерных поровых комплексов in vivo, а также механизм участия этих белков в репрессии генов у млекопитающих пока неясны. Представляется интересным исследовать, могут ли транскрипционно активные гены находиться на периферии ядра в ассоциации с ядерными поровыми комплексами (nuclear pore complex, NPC) у высших эукариот, таких как насекомые и млекопитающие.

Поддержание стабильно активного или репрессивного состояния многих генов у Drosophila и млекопитающих осуществляется при участии белков двух антагонистических групп: Polycomb (PcG) и trithorax (trxG) (Ringrose, Paro, 2007). Белки PcG и trxG осуществляют свои функции путем связывания с регуляторными последовательностями, называемыми Polycomb/Trithorax-group Response Elements (PREs/TREs, или PRE-элементами). Ряд фактов позволяет предполагать, что положение PRE-элементов в интерфазном ядре и, в частности, их эктопическая конъюгация могут играть важную роль в регуляции их функции (Bantignies et al., 2003; Grimaud et al., 2006; Vazquez et al., 2006), однако этот вопрос требует дальнейшего исследования.

Цели и задачи исследования

Целью исследования было изучение взаимосвязи между функциональным статусом генов и трансгенов и их локализацией в интерфазных ядрах Drosophila melanogaster и культивируемых клеток млекопитающих. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ ядерной локализации генов и трансгенов

Drosophila в неактивном и активном состояниях.

2. Изучить пространственное распределение Рс-связывающих сайтов и возможность их физического взаимодействия в интерфазных ядрах клеток личиночных тканей Drosophila.

3. Сравнить расположение активного и неактивного трансгена LV-PGK в ядрах фибробластов трансгенных свиней.

4. Выяснить, влияет ли отсутствие белка Трг на локализацию в ядре неактивного гена CFTR человека.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Периферия хромоцентра политенных хромосом Drosophila имеет сложную мозаичную организацию, где одновременно представлены несколько фокусов сателлита (AAGAG)n, ди- и триметилированный по лизину 4 гистон НЗ, активная форма РНК-полимеразы II и активные PRE-элементы .

2. Неактивные гены Abd-B, sd и Ubx, а также Fab-7-содержэщие трансгены локализуются у Drosophila на периферии интерфазного ядра.

3. Транскрипционно активные Fab-7-содержэщие трансгены часто локализуются на периферии хромоцентра.

4. Эндогенная и трансгенная копии Fab-7 элемента располагаются независимо в ядрах клеток пяти личиночных тканей.

5. Трансген LV-PGK в зависимости от функционального состояния имеет разное положение в ядрах фибробластов трансгенных свиней Sus scrofa scrofa.

6. Отсутствие ассоциированного с ядерным поровым комплексом белка Трг, вызванное РНК-интерференцией, приводит к изменению локализации неактивного гена CFTR в интерфазном ядре культивируемых клеток линии HeLa.

Научная новизна работы

Впервые показано, что в интерфазных ядрах Drosophila на периферии хромоцентра одновременно представлены сателлитный повтор (AAGAG)n, ди- и триметилированный по лизину 4 гистон НЗ, активная форма РНК-полимеразы II и активные PRE-элементы. Впервые проанализировано положение относительно ядерной ламины и хромоцентра генов Abd-B, sd и Ubx, а также Fab-7-содержэщих трансгенов Drosophila в разных состояниях активности. Впервые показано, что активные Fab-7-содержэщие трансгены могут быть ассоциированы с периферией хромоцентра. С помощью конфокальной микроскопии изучено взаимное расположение эндогенной и трансгенной копий Fab-7 элемента в ядрах клеток пяти личиночных тканей разных линий мух и показана их независимая локализация в ядре. Взаимосвязь между активностью и положением в ядре была также установлена для трансгена LV-PGK в ядрах фибробластов трансгенных свиней Sus scrofa scrofa. Впервые с помощью РНК-интерференции показано, что белок Трг, ассоциированный с NPC, необходим для локализации неактивного гена CFTR человека на периферии ядра.

Теоретическое и практическое значение работы

Выявленная сложная архитектура периферии хромоцентра важна для понимания функциональной организации интерфазного ядра. Примененные в данной работе методы изучения локализации генов в трехмерном пространстве ядра и распределения Рс-связывающих сайтов, основанные на данных конфокальной микроскопии с последующим компьютерным анализом, могут быть использованы в аналогичных экспериментах на других объектах. Участие ассоциированного с NPC белка Трг в периферической локализации неактивного гена CFTR человека в сочетании с результатами других исследований позволяет предположить существование консервативного механизма взаимодействия периферических белков с хроматином. Результаты, представленные в диссертационной работе, могут быть включены в план учебных курсов «Организация интерфазного ядра», «Организация хромосомы эукариот», «Эволюция геномов и кариотипов» и других, читаемых на кафедре генетики и селекции и кафедре цитологии и гистологии СПбГУ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Rybakina Е., Раго R., Dahlsveen I, Becker Р., Zink D. 2004. Analysis of the relationships between functional states of the Drosophila melanogaster Fab-7 element and its nuclear position // European Journal of Cell Biology. Vol. 83. Suppl. 54. P. 63.

2. Rybakina E., Dahlsveen I., Becker P., Paro R., Zink D. 2005. How does the nuclear architecture contribute to the functional regulation of the Polycomb response element Fab-7 ? // Book of Abstracts of the UK Chromatin Meeting. P.15.

3. Rybakina, E. 2006. Nuclear positioning and functional regulation of endogenous genes and transgenes in the fruit fly Drosophila melanogaster and in mammalian cells. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie, 176 pp.

4. Fedorova E., Sadoni N., Dahlsveen I.K., Koch J., Kremmer E., Eick D., Paro R., Zink D. 2008. The nuclear organization of Polycomb/Trithorax group response elements in larval tissues of Drosophila melanogaster II Chromosome Research. Vol.16. № 4. P. 649673.

5. Fedorova E.M. and Rodionov A.V. 2008. Towards understanding the mechanisms of epigenetic regulation: Part 1. An evolutional insight into PcG-mediated gene repression // Экологическая Генетика. Т. 6. № 1. С. 12-19.

6. Fedorova Е. and Zink D. 2008. Nuclear architecture and gene regulation // BBA - Molecular Cell Research, doi: 10.1016/j.bbamcr.200807.018

Работа выполнена в Биоцентре Университета Людвига Максимилиана (Ludwig-Maximilians-Universität), Мюнхен, Германия под руководством Dr. Daniele Zink при финансовой поддержке гранта немецкого научно-исследовательского общества (Deutsche Forschungsgemeinschaft) SFB/Transregio 5.

Список сокращений

3D трехмерный димНЗК4 гистон НЗ, диметилированный по лизину 4 димНЗКЭ гистон НЗ, диметилированный по лизину 9 тримНЗК4 гистон НЗ, триметилированный по лизину 4 п.н. пара нуклеотидов т.п.н. тысяча пар нуклеотидов

Abd-B Abdominal-B

ANTP-C Antennapedia complex

5-azaC 5-азацитидин

ВХ-С Bithorax complex

CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator

ChIP Chromatin immunoprecipitation dH20 дистиллированная вода

DRB 5,6-dichlorobenzimidazole riboside

Fab-7 Frontoabdominal-7

GFP green fluorescent protein

HP1 heterochromatin protein 1

HSE тепловой шок на эмбриональной стадии развития

HSL тепловой шок на личиночной стадии развития eGFP enhanced green fluorescent protein

Pc Polycomb

PcG Polycomb group

PRE Polycomb Response Element

RNAi RNA interference

RNAPIISer2 РНК-полимераза II, фосфорилированная no Ser 2

NPC nuclear pore complex sd scalloped t KOMH комнатная температура

Tpr translocated promoter region trxG trithorax group

TSA trichostatin A

Ubx Ultrabithorax

WT дикий тип

1. Обзор литературы

В 1928 году Гейц (Heitz, 1928) обнаружил, что в клеточных ядрах при окрашивании препаратов карминовым красным выявляются два типа хроматина: интенсивно окрашенные участки, которые оставались конденсированными в течение всего клеточного цикла, и хроматин, который в интерфазе был деконденсирован, а в профазе митоза относительно слабо окрашен. Первый тип хроматина он назвал гетерохроматином, а второй - эухроматином. В настоящее время под гетерохроматином понимается фракция хроматина, которая остается высококонденсированной в течение всего клеточного цикла, содержит относительно немного генов, поздно реплицируется в S-фазе, содержит гиперметилированную ДНК и гипоацетилированные гистоны и может подавлять транскрипционную активность генов, оказавшихся по соседству в результате перестроек хромосом (Weiler, Wakimoto, 1995; Elgin, 1996; Elgin, Grewal, 2003; Zhimulev, Belyaeva, 2003). Напротив, эухроматин рано реплицируется, деконденсирован, содержит основную массу генов, имеет гиперацетилированные гистоны и чувствителен к перевариванию нуклеазами (Dillon, Festenstein, 2002; Grewal, Elgin, 2002; Gaszner, Felsenfeld, 2006). Более детальное рассмотрение структурных и функциональных особенностей эу- и гетерохроматина, их пространственная организация в клеточном ядре и влияние на экспрессию генов представлено ниже.

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Федорова, Елена Михайловна

Выводы

1. Периферия хромоцентра политенных ядер Drosophila имеет сложную мозаичную структуру. В' интерфазных ядрах Drosophila на периферии хромоцентра одновременно представлены сателлитный повтор (AAGAG)n, ди- и триметилированный по лизину 4 гистон НЗ, активная форма РНК-полимеразы II и активные PRE-элементы.

2. Неактивные гены Abd-B, sd и Ubx и Fab-7-содержэщие трансгены у Drosophila melanogaster занимают периферическое расположение в ядре и не ассоциированы с хромоцентром.

3. Транскрипционная активация Fab-7-содержэщих трансгенов приводит к изменению их локализации относительно ядерной ламины и увеличению частоты их ассоциации с хромоцентром (до 50%).

4. С помощью конфокальной микроскопии изучено взаимное расположение эндогенной и трансгенной копий Fab-7 элемента в ядрах клеток пяти личиночных тканей разных линий мух и показана их независимая локализация в ядре.

5. На материале фибробластов трансгенных свиней Sus scrofa scrofa показано, что положение трансгена LV-PGK в ядре изменяется при активации его транскрипции.

6. С помощью РНК-интерференции показано, что белок Трг, ассоциированный с NPC, необходим для локализации неактивного гена CFTR человека на периферии ядра.

Б л а го д а р н ости

В первую очередь хочу выразить благодарность кафедре генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета (в лице ее профессорско-преподавательского состава), где мною были получены обширные и глубокие знания по специальности. Объем и уровень этих знаний произвели сильное впечатление на моего научного руководителя Dr. Daniele Zink и моих коллег по лаборатории в Университете Мюнхена и позволили мне легко освоить новые экспериментальные методики и выполнить исследования, результаты которых представлены в данной работе. Кроме этого, хочу отдельно поблагодарить д.б.н. Т.В. Кузнецову и д.б.н. И.Е. Воробцову, моих научных руководителей бакалаврской и магистерской квалификационных работ, которые способствовали приобретению мною опыта экспериментальной работы, оформления и представления результатов исследований.

Выражаю глубочайшую благодарность и признательность Dr. Daniele Zink, предоставившей мне возможность выполнения исследований в лаборатории Универститета Мюнхена, взаимодействия и совместной работы с другими исследовательскими коллективами и представления полученных результатов на различных конференциях. Dr. Daniele Zink и коллеги по лаборатории оказали мне неоценимую помощь в освоении новых методик работы и в обсуждении и оформлении результатов исследований, завершившихся написанием диссертации на английсом языке, защитой ее в Университете Мюнхена и получением степени Doctor Rerum Naturalium (доктор естественных наук).

Приношу отдельную благодарность д.б.н. A.B. Родионову, д.б.н. Т.В. Кузнецовой и к.б.н. C.B. Мыльникову за огромную помощь, оказанную мне при адаптации перевода англоязычного варианта диссертации к стандартам терминологии и оформления, принятым в нашей стране.

Моему научному руководителю д.б.н. A.B. Родионову хочу выразить особую благодарность и признательность за год плодотворной совместной работы и неоценимую помощь на всех этапах работы над данной диссертацией. В итоге была переосмыслена часть полученных результатов, появился новый раздел в главе «Обсуждение», и диссертация стала в целом намного более гармоничной и последовательной.

Отдельную благодарность хочу выразить к.б.н. C.B. Мыльникову за советы, консультации, организационную и моральную поддержку и дружеское участие.

Выражаю благодарность д.б.н. С.Н. Новикову за предоставленную возможность совмещать должностные обязанности и работу над данной диссертацией, за всемерную поддержку, понимание и помощь.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федорова, Елена Михайловна, Санкт-Петербург

1. Жимулев, И. Ф. 1993. Гетерохроматин и эффект положения гена // Наука, Новосибирск. 490 с.

2. Ahmad, K., and S. Henikoff. 2001. Centromeres are specialized replication domains in heterochromatin // J Cell Biol. V. 153: P. 101-10.

3. Ahmad, K., and S. Henikoff. 2002. Histone H3 variants specify modes of chromatin assembly // Proc Natl Acad Sci U S A. V. 99 Suppl 4: P. 16477-84.

4. Akhtar, A., and P.B. Becker. 2000. Activation of transcription through histone H4 acetylation by MOF, an acetyltransferase essential for dosage compensation in Drosophila II Mol Cell. V. 5: P. 367-75.

5. Akhtar, A., D. Zink, and P.B. Becker. 2000. Chromodomains are protein-RNA interaction modules // Nature. V. 407: P. 405-9.

6. Alkema, M.J., M. Bronk, E. Verhoeven, A. Otte, L.J. van 't Veer, A. Berns, and M. van Lohuizen. 1997. Identification of Bmi1-interacting proteins as constituents of a multimeric mammalian polycomb complex // Genes Dev. V. 11: P. 226-40.

7. Allfrey, V.G., R. Faulkner, and A.E. Mirsky. 1964. Acetylation And Methylation Of Histones And Their Possible Role In The Regulation Of Rna Synthesis // Proc Natl Acad Sci U S A. V. 51: P. 786-94.

8. Andrulis, E.D., A.M. Neiman, D.C. Zappulla, and R. Sternglanz. 1998. Perinuclear localization of chromatin facilitates transcriptional silencing // Nature. V. 394: P. 592-5.

9. Appels, R., and A.J. Hilliker. 1982. The cytogenetic boundaries of the rDNA region within heterochromatin in the X chromosome of Drosophila melanogaster and their relation to male meiotic pairing sites // Genet Res. V. 39: P. 149-56.

10. Aravin, A.A., M. Lagos-Quintana, A. Yalcin, M. Zavolan, D. Marks, B. Snyder, T. Gaasterland, J. Meyer, and T. Tuschl. 2003. The small RNA profile during Drosophila melanogaster development // Dev Cell. V. 5: P. 337-50.

11. Arlucea, J., R. Andrade, R. Alonso, and J. Arechaga. 1998. The nuclear basket of the nuclear pore complex is part of a higher-order filamentous network that is related to chromatin // J Struct Biol. V. 124: P. 51-8.

12. Ashburner, M. 1989. Drosophila: A laboratory handbook // Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY.

13. Bannister, A.J., P. Zegerman, J.F. Partridge, E.A. Miska, J.O. Thomas, R.C. Allshire, and T. Kouzarides. 2001. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain 11 Nature. V. 410: P. 120-4.

14. Bantignies, F., C. Grimaud, S. Lavrov, M. Gabut, and G. Cavalli. 2003. Inheritance of Polycomb-dependent chromosomal interactions in Drosophila II Genes Dev. V. 17: P. 2406-20.

15. Beisel, C., A. Imhof, J. Greene, E. Kremmer, and F. Sauer. 2002. Histone methylation by the Drosophila epigenetic transcriptional regulator Ash1 Nature.V. 419: P. 857-62.

16. Bell, A.C., A.G. West, and G. Felsenfeld. 2001. Insulators and boundaries: versatile regulatory elements in the eukaryotic // Science. V. 291: P. 447-50.

17. Bender, W., and D.P. Fitzgerald. 2002. Transcription activates repressed domains in the Drosophila bithorax complex // Development. V. 129: P. 4923-30.

18. Bienz, M., and J. Muller. 1995. Transcriptional silencing of homeotic genes in Drosophila. II Bioessays. V. 17: P. 775-84.

19. Bodoor, K„ S. Shaikh, D. Salina, W.H. Raharjo, R. Bastos, M. Lohka, and B. Burke. 1999. Sequential recruitment of NPC proteins to the nuclear periphery at the end of mitosis // J Cell Sci. V. 112: P. 2253-64.

20. Boivin, A., and J.M. Dura. 1998. In vivo chromatin accessibility correlates with gene silencing in Drosophila II Genetics. V. 150: P. 1539-49.

21. Boyle, S., S. Gilchrist, J.M. Bridger, N.L. Mahy, J.A. Ellis, and W.A. Bickmore. 2001. The spatial organization of human chromosomes within the nuclei of normal and emerin-mutant cells// Hum Mol Genet. V. 10: P. 211-9.

22. Braunstein, M., R.E. Sobel, C.D. Allis, B.M. Turner, and J.R. Broach. 1996. Efficient transcriptional silencing in Saccharomyces cerevisiae requires a heterochromatin histone acetylation pattern // Mol Cell Biol. V. 16: P. 4349-56.

23. Breiling, A., E. Bonte, S. Ferrari, P.B. Becker, and R. Paro. 1999. The Drosophila polycomb protein interacts with nucleosomal core particles In vitro via its repression domain. // Mol Cell Biol. V. 19: P. 8451-60.

24. Brown, J.L., D. Mucci, M. Whiteley, M.L. Dirksen, and J.A. Kassis. 1998. The Drosophila Polycomb group gene pleiohomeotic encodes a DNA binding protein with homology to the transcription factor YY1 // Mol Cell. V. 1: P. 1057-64.

25. Brown, K. 2002. Visualizing nuclear proteins together with transcribed and inactive genes in structurally preserved cells // Methods. V. 26: P. 10-8.

26. Brown, K.E., S. Amoils, J.M. Horn, V.J. Buckle, D.R. Higgs, M. Merkenschlager, and A.G. Fisher. 2001. Expression of alpha- and beta-globin genes occurs within different nuclear domains in haemopoietic cells // Nat Cell Biol. V. 3: P. 602-6.

27. Brown, K.E., J. Baxter, D. Graf, M. Merkenschlager, and A.G. Fisher. 1999. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division // Mol Cell. V. 3: P. 207-17.

28. Brown, K.E., S.S. Guest, S.T. Smale, K. Hahm, M. Merkenschlager, and A.G. Fisher. 1997. Association of transcriptionally silent genes with Ikaros complexes at centromeric heterochromatin // Cell. V. 91: P. 845-54.

29. Brownell, J.E., J. Zhou, T. Ranalli, R. Kobayashi, D.G. Edmondson, S.Y. Roth, and C.D. Allis. 1996. Tetrahymena histone acetyltransferase A: a homolog to yeast Gcn5p linking histone acetylation to gene activation // Cell. V. 84: P. 843-51.

30. Buchenau, P., J. Hodgson, H. Strutt, and D.J. Arndt-Jovin. 1998. The distribution of polycomb-group proteins during cell division and development in Drosophila embryos: impact on models for silencing // J Cell Biol. V. 141: P. 469-81.

31. Busturia, A., and M. Bienz. 1993. Silencers in abdominal-B, a homeotic Drosophila gene //Embo J. V. 12: P. 1415-25.

32. Busturia, A., C.D. Wightman, and S. Sakonju. 1997. A silencer is required for maintenance of transcriptional repression throughout Drosophila development// Development. V. 124: P. 4343-50.

33. Byrd, K.N., and A. Shearn. 2003. ASH1, a Drosophila trithorax group protein, is requiredfor methylation of lysine 4 residues on histone H3 // Proc Natl Acad Sci USA. V. 100: P. 11535-40.

34. Campbell, S.D., A. Duttaroy, A.L. Katzen, and A. Chovnick. 1991. Cloning and characterization of the scalloped region of Drosophila melanogaster // Genetics. V. 127: P. 367-80.

35. Opinion in Genetics & Development. V. 9:1 P. 99-205. Cordes, V.C., S. Reidenbach, A. Kohler, N. Stuurman, R. van Driel, and W.W. Franke.1993. Intranuclear filaments containing a nuclear pore complex protein //J Cell Biol. V. 123: P. 1333-44.

36. Csink, A.K., and S. Henikoff. 1996. Genetic modification of heterochromatic associationand nuclear organization in Drosophila II Nature. V. 381: P. 529-31.

37. Csink, A.K., and S. Henikoff. 1998. Large-scale chromosomal movements during interphase progression in Drosophila IIJ Cell Biol. V. 143: P. 13-22.

38. Czermin, B., R. Melfi, D. McCabe, V. Seitz, A. Imhof, and V. Pirrotta. 2002. Drosophila enhancer of Zeste/ESC complexes have a histone H3 methyltransferase activity that marks chromosomal Polycomb sites // Cell. V. 111: P. 185-96.

39. Daigle, N., J. Beaudouin, L. Hartnell, G. Imreh, E. Hallberg, J. Lippincott-Schwartz, and J. Ellenberg. 2001. Nuclear pore complexes form immobile networks and have a very low turnover in live mammalian cells // J Cell Biol. V. 154: P. 71-84.

40. Dernburg, A.E, K.W. Broman, J.C. Fung, W.F. Marshall, J. Philips, D.A. Agard, and J.W. Sedat. 1996. Perturbation of nuclear architecture by long-distance chromosome interactions // Cell. V. 85: P. 745-59.

41. Devlin, R.H., B. Bingham, and B.T. Wakimoto. 1990a. The organization and expression of the light gene, a heterochromatic gene of Drosophila melanogaster II Genetics. V. 125: P. 129-40.

42. Devlin, R.H., D.G. Holm, K.R. Morin, and B.M. Honda. 1990b. Identifying a single-copy DNA sequence associated with the expression of a heterochromatic gene, the light locus of Drosophila melanogaster II Genome. V. 33: P. 405-15.

43. Dietzel, S., H. Niemann, B. Bruckner, C. Maurange, and R. Paro. 1999. The nuclear distribution of Polycomb during Drosophila melanogaster development shown with a GFP fusion protein // Chromosoma. V. 108: P. 83-94.

44. Dillon, N., and R. Festenstein. 2002. Unravelling heterochromatin: competition between positive and negative factors regulates accessibility //Trends Genet. V. 18: P. 2528.

45. Ebert, A., G. Schotta, S. Lein, S. Kubicek, V. Krauss, T. Jenuwein, and G. Reuter. 2004. Su(var) genes regulate the balance between euchromatin and heterochromatin in Drosophila II Genes Dev. V. 18: P. 2973-83.

46. Elbashir, S.M., J. Harborth, W. Lendeckel, A. Yalcin, K. Weber, and T. Tuschl. 2001a. Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells // Nature. V. 411: P. 494-8.

47. Elbashir, S.M., J. Harborth, K. Weber, and T. Tuschl. 2002. Analysis of gene function in somatic mammalian cells using small interfering RNAs // Methods. V. 26: P. 199213.

48. Elbashir, S.M., W. Lendeckel, and T. Tuschl. 2001b. RNA interference is mediated by 21-and 22-nucleotide RNAs // Genes Dev. V. 15: P. 188-200.

49. Elgin, S.C. 1996. Heterochromatin and gene regulation in Drosophila H Curr Opin Genet Dev. V. 6: P. 193-202.

50. Elgin, S.C., and S.I. Grewal. 2003. Heterochromatin: silence is golden // Curr Biol. V. 13:1. P. R895-8.

51. Englmanri, A. 2005a. Functional regulation and spatial organization of the human CFTR region // FASEB Summer Research Conference, Saxtons River, Vermont, USA. Presentation.

52. Englmann, A. 2005b. Kernpositionierung und funktionelle Regulation von Genen der humanen CFTR-Region auf Chromosom 7 // In Fakultät für Biologie LMU München, München. 161 pp.

53. Fauvarque, M.O., and J.M. Dura. 1993. polyhomeotic regulatory sequences induce developmental regulator-dependent variegation and targeted P-element insertions in Drosophila // Genes Dev. V. 7: P. 1508-20.

54. Felsenfeld, G. 1996. Chromatin unfolds // Cell. V. 86: P. 13-19.

55. Ficz, G., R. Heintzmann, and D.J. Arndt-Jovin. 2005. Polycomb group protein complexes exchange rapidly in living Drosophila II Development. V. 132: P. 3963-76.

56. Fischle, W„ Y. Wang, S.A. Jacobs, Y. Kim, C.D. Allis, and S. Khorasanizadeh. 2003. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains// Genes Dev. V. 17:1 P. 870-81.

57. Fletcher, T.M., and J.C. Hansen. 1995. Core histone tail domains mediate oligonucleosome folding and nucleosomal DNA organization through distinct molecular mechanisms // J Biol Chem. V. 270: P. 25359-62.

58. Follenzi, A., L.E. Ailles, S. Bakovic, M. Geuna, and L. Naldini. 2000. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences // Nat Genet. V. 25: P. 217-22.

59. Francastel, C., M.C. Walters, M. Groudine, and D.I. Martin. 1999. A functional enhancer suppresses silencing of a transgene and prevents its localization close to centrometric heterochromatin // Cell. V. 99: P. 259-69.

60. Francis, N.J., and R.E. Kingston. 2001. Mechanisms of transcriptional memory// Nat Rev Mol Cell Biol. V. 2: P. 409-21.

61. Franke, A., M. DeCamillis, D. Zink, N. Cheng, H.W. Brock, and R. Paro. 1992. Polycomb and polyhomeotic are constituents of a multimeric protein complex in chromatin of Drosophila melanogaster // Embo J. V. 11: P. 2941-50.

62. Gall, J.G., E.H. Cohen, and M.L. Polan. 1971. Reptitive DNA sequences in Drosophila II Chromosoma. V. 33: P. 319-44.

63. Galy, V., J.C. Olivo-Marín, H. Scherthan, V. Doye, N. Rascalou, and U. Nehrbass. 2000. Nuclear pore complexes in the organization of silent telomeric chromatin // Nature. V. 403: P. 108-12.

64. Gaszner, M., and G. Felsenfeld. 2006. Insulators: exploiting transcriptional and epigenetic mechanisms // Nat Rev Genet. V. 7: P. 703-13.

65. Gatti, M., and S. Pimpinelli. 1992. Functional elements in Drosophila melanogaster heterochromatin //Annu Rev Genet. V. 26: P. 239-75.

66. Gemkow, M.J., P.J. Verveer, and D.J. Arndt-Jovin. 1998. Homologous association of the Bithorax-Complex during embryogenesis: consequences for transvection in Drosophila melanogaster II Development. V. 125: P. 4541-52.

67. Gerasimova, T.I., K. Byrd, and V.G. Corces. 2000. A chromatin insulator determines the nuclear localization of DNA// Mol Cell. V. 6: P. 1025-35.

68. Gerasimova, T.I.,andV.G. Corces. 1996. Boundary and insulator elements in chromosomes // Curr Opin Genet Dev. V. 6: P. 185-92.

69. Goldberg, M., A. Harel, M. Brandeis, T. Rechsteiner, T.J. Richmond, A.M. Weiss, and Y. Gruenbaum. 1999. The tail domain of lamin DmO binds histones H2A and H2B // Proc Natl Acad Sci U S A. V. 96: P. 2852-7.

70. Goldman, R.D., Y. Gruenbaum, R.D. Moir, D.K. Shumaker, and T.R Spann. 2002. Nuclear lamins: building blocks of nuclear architecture // Genes Dev. V. 16: P. 533-47.

71. Grant, P.A., A. Eberharter, S. John, R.G. Cook, B.M. Turner, and J.L. Workman. 1999. Expanded lysine acetylation specificity of Gcn5 in native complexes // J Biol Chem. V. 274: P. 5895-900.

72. Grewal, S.I., and S.C. Elgin. 2002. Heterochromatin: new possibilities for the inheritance of structure // Curr Opin Genet Dev. V. 12: P. 178-87.

73. Grimaud, C., F. Bantignies, M. Pal-Bhadra, P. Ghana, U. Bhadra, and G. Cavalli. 2006. RNAi components are required for nuclear clustering of Polycomb group response elements // Cell. V. 124: P. 957-71.

74. Gyurkovics, H., J. Gausz, J. Kummer, and F. Karch. 1990. A new homeotic mutation in the Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation // Embo J. V. 9: P. 2579-85.

75. Hagstrom, K., M. Muller, and P. Schedl. 1996. Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex // Genes Dev. V. 10: P. 3202-15.

76. Hall, I.M., G.D. Shankaranarayana, K. Noma, N. Ayoub, A. Cohen, and S.I. Grewal. 2002. Establishment and maintenance of a heterochromatin domain // Science. V. 297: P. 2232-7.

77. Hase, M.E., and V.C. Cordes. 2003. Direct interaction with nup153 mediates binding of Tpr to the periphery of the nuclear pore complex // Mol Biol Cell. V. 14: P. 1923-40.

78. Hebbes, T.R., A.W. Thorne, and C. Crane-Robinson. 1988. A direct link between core histone acetylation and transcriptionally active chromatin // Embo J. V. 7: P. 1395402.

79. Heitz, E. 1928. Das Heterochromatin der Moose //1. Jahrb. Wiss. Botanik. V. 69: P. 762818.

80. Henikoff, S. 1997. Nuclear organization and gene expression: homologous pairing and long-range interactions // Curr Opin Cell Biol. V. 9: P. 388-95.

81. Hochstrasser, M., D. Mathog, Y. Gruenbaum, H. Saumweber, and J.W. Sedat. 1986. Spatial organization of chromosomes in the salivary gland nuclei of Drosophila melanogaster IIJ Cell Biol. V. 102: P. 112-23.

82. Hochstrasser, M., and J. W. Sedat. 1987a. Three-dimensional organization of Drosophila melanogaster interphase nuclei. I. Tissue-specific aspects of polytene nuclear architecture // J Cell Biol. V. 104:1455-70.

83. Hochstrasser, M., and J. W. Sedat. 1987b. Three-dimensional organization of Drosophila melanogaster interphase nuclei. II. Chromosome spatial organization and gene regulation //J Cell Biol. V. 104: P. 1471-83.

84. Hofmann, A., B. Kessler, S. Ewerling, A. Kabermann, G. Brem, E. Wolf, and A. Pfeifer. 2006. Epigenetic regulation of lentiviral transgene vectors in a large animal model // Mol Ther. V. 13: P. 59-66.

85. Hofmann, A., B. Kessler, S. Ewerling, M. Weppert, B. Vogg, H. Ludwig, M. Stojkovic, M. Boelhauve, G. Brem, E. Wolf, and A. Pfeifer. 2003. Efficient transgenesis in farm animals by lentiviral vectors // EMBO Rep. V. 4: P. 1054-60.

86. Janssen, S., T. Durussel, and U.K. Laemmli. 2000. Chromatin opening of DNA satellites by targeted sequence-specific drugs // Mol Cell. V. 6: P. 999-1011.

87. Jenuwein, T. 2001. Re-SET-ting heterochromatin by histone methyltransferases//Trends Cell Biol. V. 11: P. 266-73.

88. Jenuwein, T„ and C.D. Allis. 2001. Translating the histone code. Science. V. 293: P. 107480.

89. Jenuwein, T., G. Laible, R. Dorn, and G. Reuter. 1998. SET domain proteins modulate chromatin domains in eu- and heterochromatin. Cell Mol Life Sci. V. 54: P. 80-93.

90. Kal, A. J., T. Mahmoudi, N.B. Zak, and C.P. Verrijzer. 2000. The Drosophila brahma complex is an essential coactivator for the trithorax group protein zeste. Genes Dev. V. 14: P. 1058-71.

91. Kassis, J.A. 1994. Unusual properties of regulatory DNA from the Drosophila engrailed gene: three "pairing-sensitive" sites within a 1.6-kb region // Genetics. V. 136: P. 1025-38.

92. Kassis, J.A. 2002. Pairing-sensitive silencing, polycomb group response elements, and transposon homing in Drosophila //Adv Genet. V. 46: P. 421-38.

93. Kassis, J.A., E.P. VanSickle, and S.M. Sensabaugh. 1991. A fragment of engrailed regulatory DNA can mediate transvection of the white gene in Drosophila II Genetics. V. 128: P. 751-61.

94. Kaufmann, B.P. 1938. Nucleolus-organizing regions in salivary gland chromosomes of Drosophila melanogaster II Cell and Tissue Research. V. 28: P. 1-11.

95. Keller, P.J., F. Pampaloni, and E.H. Stelzer. 2006. Life sciences require the third dimension // Curr Opin Cell Biol. V. 18: P. 117-24.

96. Kenninson, J.A. 2000. Preparation and Analysis of Polytene Chromosomes // In Drosophilaprotocols. W. Sullivan, Ashburner, M., Hawley, S.R., editor. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. P. 111-118.

97. Kim, S.H., P.G. McQueen, M.K Lichtman, E.M. Shevach, L.A. Parada, and T. Misteli. 2004. Spatial genome organization during T-cell differentiation // Cytogenet Genome Res. V. 105: P. 292-301.

98. Koonin, E.V., S. Zhou, and J.C. Lucchesi. 1995. The chromo superfamily: new members, duplication of the chromo domain and possible role in delivering transcription regulators to chromatin // Nucleic Acids Res. V. 23: P. 4229-33.

99. Kornberg, R.D. 1974. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA// Science. V. 184: P. 868-71.

100. Koryakov, D.E., A.A. Alekseyenko, and I.F. Zhimulev. 1999. Dynamic organization of the beta-heterochromatin in the Drosophila melanogaster polytene X chromosome // Mol Gen Genet. V. 260: P. 503-9.

101. Koryakov, D.E., E.S. Belyaeva, A.A. Alekseyenko, and I.F Zhimulev. 1996. Alpha and beta heterochromatin in polytene chromosome 2 of Drosophila melanogaster II Chromosoma. V. 105: P. 310-9.

102. Kosak, S.T., and M. Groudine. 2004. Gene order and dynamic domains // Science. V. 306: P. 644-7.

103. Kosak, S.T., J.A. Skok, KL. Medina, R. Riblet, M.M. Le Beau, A.G. Fisher, and H. Singh. 2002. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development//Science. V. 296: P. 158-62.

104. Kouzarides, T. 2002. Histone methylation in transcriptional control // Curr Opin Genet Dev. V. 12: P. 198-209.

105. Krull, S., J. Thyberg, B. Bjorkroth, H.R. Rackwitz, and V.C. Cordes. 2004. Nucleoporins as components of the nuclear pore complex core structure and Tpr as the architectural element of the nuclear basket // Mol Biol Cell. V. 15: P. 4261-77.

106. Kuo, M.H., J.E. Brownell, R.E. Sobel, T.A. Ranalli, R.G. Cook, D.G. Edmondson, S.Y. Roth, and C.D. Allis. 1996. Transcription-linked acetylation by Gcn5p of histones H3 and H4 at specific lysines // Nature. V. 383: P. 269-72.

107. Kuo, M.H., J. Zhou, P. Jambeck, M.E. Churchill, and C.D. Allis. 1998. Histone acetyltransferase activity of yeast Gcn5p is required for the activation of target genes in vivo II Genes Dev. V. 12: P. 627-39.

108. Messmer, S., A. Franke, and R. Paro. 1992. Analysis of the functional role of the Polycomb chromo domain in Drosophiia meianogaster II Genes Dev. V. 6: P. 1241-54.

109. Mihaly, J., I. Hogga, S. Barges, M. Galloni, R.K. Mishra, K. Hagstrom, M. Muller, P. Schedl, L. Sipos, J. Gausz, H. Gyurkovics, and F. Karch. 1998. Chromatin domain boundaries in the Bithorax complex// Cell Mol Life Sci. V. 54: P. 60-70.

110. Misteli, T. 2004. Spatial positioning; a new dimension in genome function // Cell. V. 119: P. 153-6.

111. Misteli, T. 2005. Concepts in nuclear architecture // Bioessays. V. 27: P. 477-487.

112. Muller, J., C.M. Hart, N.J. Francis, M.L. Vargas, A. Sengupta, B. Wild, E.L. Miller, M.B. O'Connor, R.E. Kingston, and J.A. Simon. 2002. Histone methyltransferase activity of a Drosophiia Polycomb group repressor complex // Cell. V. 111: P. 197-208.

113. Muller, J., and J.A. Kassis. 2006. Polycomb response elements and targeting of Polycombgroup proteins in Drosophila II Curr Opin Genet Dev. V. 16: P. 476-484.

114. Muller, M., K. Hagstrom, H. Gyurkovics, V. Pirrotta, and P. Schedl. 1999. The mcp element from the Drosophila melanogaster bithorax complex mediates long-distance regulatory interactions // Genetics. V. 153: P. 1333-56.

115. Myers, F.A., D.R. Evans, A.L. Clayton, A.W. Thorne, and C. Crane-Robinson. 2001. Targeted and extended acetylation of histones H4 and H3 at active and inactive genes in chicken embryo erythrocytes // J Biol Chem. V. 276: P. 20197-205.

116. Ng, J., C.M. Hart, K. Morgan, and J.A. Simon. 2000. A Drosophila ESC-E(Z) protein complex is distinct from other polycomb group complexes and contains covalently modified ESC // Mol Cell Biol. V. 20: P. 3069-78.

117. Noma, K., C.D. Allis, and S.I. Grewal. 2001. Transitions in distinct histone H3 methylation patterns at the heterochromatin domain boundaries // Science. V. 293: P. 1150-5.

118. Orlando, V. 2003. Polycomb, epigenomes, and control of cell identity. Cell. 112:599-606.

119. Orlando, V., E.P. Jane, V. Chinwalla, P.J. Harte, and R. Paro. 1998. Binding of trithorax and Polycomb proteins to the bithorax complex: dynamic changes during early Drosophila embryogenesis // Embo J. V. 17: P. 5141-50.

120. Orlando, V., and R. Paro. 1993. Mapping Polycomb-repressed domains in the bithorax complex using in vivo formaldehyde cross-linked chromatin // Cell. V. 75: P. 118798.

121. Orlando, V., and R. Paro. 1995. Chromatin multiprotein complexes involved in the maintenance of transcription patterns // Curr Opin Genet Dev. V. 5: P. 174-9.

122. Pal-Bhadra, M., B.A. Leibovitch, S.G. Gandhi, M. Rao, U. Bhadra, J.A. Birchler, and S.C. Elgin. 2004. Heterochromatic silencing and HP1 localization in Drosophila are dependent on the RNAi machinery // Science. V. 303: P. 669-72.

123. Papoulas, O., S.J. Beek, S.L. Moseley, C.M. McCallum, M. Sarte, A. Shearn, and J.W. Tamkun. 1998. The Drosophila trithorax group proteins BRM, ASH1 and ASH2 are subunits of distinct protein complexes // Development. V. 125: P. 3955-66.

124. Papp, B., and J. Muller. 2006. Histone trimethylation and the maintenance of transcriptional ON and OFF states by trxG and PcG proteins // Genes Dev. V. 20: P. 2041-54.

125. Parekh, B.S., and T. Maniatis. 1999. Virus infection leads to localized hyperacetylation of histones H3 and H4 at the IFN-beta promoter// Mol Cell. V. 3: P. 125-9.

126. Paro, R., and D.S. Hogness. 1991. The Polycomb protein shares a homologous domain with a heterochromatin-associated protein of Drosophila II Proc Natl Acad Sci USA. V. 88:2 P. 63-7.

127. Patience, C., W.M. Switzer, Y. Takeuchi, D.J. Griffiths, M.E. Goward, W. Heneine, J.P. Stoye, and R.A. Weiss. 2001. Multiple groups of novel retroviral genomes in pigs and related species // J Virol. V. 75: P. 2771-5.

128. Peng, J.C., and G.H. Karpen. 2007. H3K9 methylation and RNA interference regulate nucleolar organization and repeated DNA stability// Nat Cell Biol. V. 9: P. 25-35.

129. Peters, A.H., J.E. Mermoud, D. O'Carroll, M. Pagani, D. Schweizer, N. Brockdorff, and T. Jenuwein. 2002. Histone H3 lysine 9 methylation is an epigenetic imprint of facultative heterochromatin // Nat. Genet. V. 30: P. 77-80.

130. Petruk, S., Y. Sedkov, S. Smith, S. Tillib, V. Kraevski, T. Nakamura, E. Canaani, C.M. Croce, and A. Mazo. 2001. Trithorax and dCBP acting in a complex to maintain expression of a homeotic gene // Science. V. 294: P. 1331-4.

131. Pickersgill, H., B. Kalverda, E. de Wit, W. Talhout, M. Fornerod, and B. van Steensel. 2006. Characterization of the Drosophila melanogaster genome at the nuclear lamina // Nat Genet. V. 38: P. 1005-14.

132. Pirrotta, V. 1995. Chromatin complexes regulating gene expression in Drosophila II Curr Opin Genet Dev. V. 5:4 P. 66-72.

133. Pirrotta, V. 1998. Polycombing the genome: PcG, trxG, and chromatin silencing // Cell. V. 93: P. 333-6.

134. Pirrotta, V. 1999. Transvection and chromosomal trans-interaction effects // Biochim Biophys Acta. V. 1424: P. M1-8.

135. Platero, J.S., A.K. Csink, A. Quintanilla, and S. Henikoff. 1998. Changes in chromosomal localization of heterochromatin-binding proteins during the cell cycle in Drosophila IIJ Cell Biol. V. 140: P. 1297-306.

136. Platero, J.S., T. Hartnett, and J.C. Elssenberg. 1995. Functional analysis of the chromo domain of HP1 // Embo J. V. 14: P. 3977-86.

137. Ragoczy, T., M.A. Bender, A. Telling, R. Byron, and M. Groudine. 2006. The locus control region is required for association of the murine beta-globin locus with engaged transcription factories during erythroid maturation // Genes Dev. V. 20: P. 1447-57.

138. Rastelli, L., C.S. Chan, and V. Pirrotta. 1993. Related chromosome binding sites for zeste, suppressors of zeste and Polycomb group proteins in Drosophila and their dependence on Enhancer of zeste function // Embo J. V. 12: P. 1513-22.

139. Reuter, G., and P. Spierer. 1992. Position effect variegation and chromatin proteins // Bioessays. V. 14: P. 605-12.

140. Ringrose, L., and R. Paro. 2004. Epigenetic regulation of cellular memory by the Polycomb and Trithorax group proteins //Annu Rev Genet. V. 38: P. 413-43.

141. Ringrose, L, and R. Paro. 2007. Polycomb/Trithorax response elements and epigenetic memory of cell identity // Development. V. 134: P. 223-32.

142. Ringrose, L., M. Rehmsmeier, J.M. Dura, and R. Paro. 2003. Genome-wide prediction of Polycomb/Trithorax response elements in Drosophila melanogaster // Dev Cell. V. 5: P. 759-71.

143. Rundlett, S.E., A.A. Carmen, R. Kobayashi, S. Bavykin, B.M. Turner, and M. Grunstein.1996. HDA1 and RPD3 are members of distinct yeast histone deacetylase complexes that regulate silencing and transcription // Proc Natl Acad Sci USA. V. 93: P. 14503-8.

144. Santos-Rosa, H., R. Schneider, A.J. Bannister, J. Sherriff, B.E. Bernstein, N.C. Emre, S.L. Schreiber, J. Melior, and T. Kouzarides. 2002. Active genes are tri-methylated at K4 of histone H3 // Nature. V. 419: P. 407-11.

145. Saurin, A.J., Z. Shao, H. Erdjument-Bromage, R Tempst, and R.E. Kingston. 2001. A Drosophila Polycomb group complex includes Zeste and dTAFII proteins // Nature. V. 412: P. 655-60.

146. Saurin, A.J., C. Shieis, J. Williamson, D.P. Satijn, A.P. Otte, D. Sheer, and P.S. Freemont. 1998. The human polycomb group complex associates with pericentromeric heterochromatin to form a novel nuclear domain // J Cell Biol. V. 142: P. 887-98.

147. Schneider, R., A.J. Bannister, F.A. Myers, A.W. Thorne, C. Crane-Robinson, and T. Kouzarides. 2004. Histone H3 lysine 4 methylation patterns in higher eukaryotic genes // Nat Cell Biol. V. 6: P. 73-7.

148. Schotta, G., A. Ebert, V. Krauss, A. Fischer, J. Hoffmann, S. Rea, T. Jenuwein, R. Dorn, and G. Reuter. 2002. Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing // EMBO J. V. 21: P. 1121-31.

149. Schotta, G., A. Ebert, and G. Reuter. 2003. SU(VAR)3-9 is a conserved key function in heterochromatic gene silencing // Genetica. V. 117: P. 149-58.

150. Schotta, G., M. Lachner, K. Sarma, A. Ebert, R. Sengupta, G. Reuter, D. Reinberg, and T. Jenuwein. 2004. A silencing pathway to induce H3-K9 and H4-K20 trimethylation at constitutive heterochromatin // Genes Dev. V. 18: P. 1251-62.

151. Schroder, A.R., P. Shinn, H. Chen, C. Berry, J.R. Ecker, and F. Bushman. 2002. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots // Cell. V. 110: P. 521-9.

152. Segura-Totten, M., and KL. Wilson. 2004. BAF: roles in chromatin, nuclear structure and retrovirus integration //Trends Cell Biol. V. 14: P. 261-6.

153. Selig, S., K. Okumura, D.C. Ward, andH. Cedar. 1992. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization // Embo J. V. 11: P. 1217-25.

154. Shao, Z., F. Raible, R. Mollaaghababa, J.R. Guyon, C.T. Wu, W. Bender, and R.E. Kingston. 1999. Stabilization of chromatin structure by PRC1, a Polycomb complex // Cell. V. 98: P. 37-46.

155. Sigrist, C.J., and V. Pirrotta. 1997. Chromatin insulator elements block the silencing of a target gene by the Drosophila polycomb response element (PRE) but allow trans interactions between PREs on different chromosomes // Genetics. V. 147: P. 20921.

156. Simon, J., A. Chiang, W. Bender, M.J. Shimell, and M. O'Connor. 1993. Elements of the Drosophila bithorax complex that mediate repression by Polycomb group products //Dev Biol. V. 158: P. 131-44.

157. Simon, J.A., and J.W. Tamkun. 2002. Programming off and on states in chromatin: mechanisms of Polycomb and trithorax group complexes // Curr Opin Genet Dev.1. V. 12: P. 210-8.

158. Skok, J.A., K.E. Brown, V. Azuara, M.L. Caparros, J. Baxter, K. Takacs, N. Dillon, D. Gray, R.P. Perry, M. Merkenschlager, and A.G. Fisher. 2001. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes // Nat Immunol. V. 2: P. 84854.

159. Srivastava, A., A.J. Simmonds, A. Garg, L. Fossheim, S.D. Campbell, and J.B. Bell. 2004. Molecular and functional analysis of scalloped recessive lethal alleles in Drosophila melanogaster//Genetics. V. 166: P. 1833-43.

160. Strahl, B.D., and C.D. Allis. 2000. The language of covalent histone modifications // Nature. V. 403: P. 41-5.

161. Strahl, B.D., R. Ohba, R.G. Cook, and C.D. Allis. 1999. Methylation of histone H3 at lysine 4 is highly conserved and correlates with transcriptionally active nuclei in Tetrahymena // Proc Natl Acad Sci U S A. V. 96: P. 14967-72.

162. Strutt, H., G. Cavalli, and R. Paro. 1997. Co-localization of Polycomb protein and GAGA factor on regulatory elements responsible for the maintenance of homeotic gene expression // Embo J. V. 16: P. 3621-32.

163. Strutt, H., and R. Paro. 1997. The polycomb group protein complex of Drosophila melanogaster has different compositions at different target genes // Mol Cell Biol. V. 17: P. 6773-83.

164. Sukegawa, J., and G. Blobel. 1993. A nuclear pore complex protein that contains zinc finger motifs, binds DNA, and faces the nucleoplasm // Cell. V. 72: P. 29-38.

165. Sullivan, B., and G. Karpen. 2001. Centromere identity in Drosophila is not determined in vivo by replication timing // J Cell Biol. V. 154: P. 683-90.

166. Sun, F.L., M.H. Cuaycong, and S.C. Elgin. 2001. Long-range nucleosome ordering is associated with gene silencing in Drosophila melanogaster pericentric heterochromatin // Mol Cell Biol. V. 21: P. 2867-79.

167. Taddei, A., G. Van Houwe, F. Hediger, V. Kalck, F. Cubizolles, H. Schober, and S.M. Gasser. 2006. Nuclear pore association confers optimal expression levels for an inducible yeast gene // Nature. V. 441: P. 774-8.

168. Thakar, R., andA.K. Csink. 2005. Changing chromatin dynamics and nuclear organization during differentiation in Drosophila larval tissue // J Cell Sci. V. 118: P. 951-60.

169. Thorne, A.W., D. Kmiciek, K. Mitchelson, P. Sautiere, and C. Crane-Robinson. 1990. Patterns of histone acetylation // Eur J Biochem. V. 193: P. 701-13.

170. Tumbar, T., andA.S. Belmont. 2001. Interphase movements of a DNA chromosome region modulated by VP16 transcriptional activator// Nat Cell Biol. V. 3: P. 134-9.

171. Turner, B.M. 2000. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays. V. 22: P. 83645.

172. Turner, B.M., A.J. Birley, and J. Lavender. 1992. Histone H4 isoforms acetylated at specific lysine residues define individual chromosomes and chromatin domains in Drosophila polytene nuclei // Cell. V. 69: P. 375-84.

173. Vazquez, J., M. Muller, V. Pirrotta, and J.W. Sedat. 2006. The Mcp element mediates stable long-range chromosome-chromosome interactions in Drosophila // Mol Biol Cell. V. 17: P. 2158-65.

174. Verdel, A., S. Jia, S. Gerber, T. Sugiyama, S. Gygi, S.I. Grewal, and D. Moazed. 2004. RNAi-mediated targeting of heterochromatin by the RITS complex // Science. V. 303: P. 672-6.

175. Vlcek, S., T. Dechat, and R. Foisner. 2001. Nuclear envelope and nuclear matrix: interactions and dynamics // Cell Mol Life Sci. V. 58: P. 1758-65.

176. Volpe, T.A., C. Kidner, I.M. Hall, G. Teng, S.I. Grewal, and R.A. Martienssen. 2002. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi // Science. V. 297: P. 1833-7.

177. Wallrath, L.L., and S.C. Elgin. 1995. Position effect variegation in Drosophila is associated with an altered chromatin structure //Genes Dev. V. 9: P. 1263-77.

178. Wang, L., J.L. Brown, R. Cao, Y. Zhang, J.A. Kassis, and R.S. Jones. 2004. Hierarchical recruitment of polycomb group silencing complexes // Mol Cell. V. 14: P. 637-46.

179. Weiler, K.S., andB.T. Wakimoto. 1995. Heterochromatin and gene expression in Drosophila //Annu Rev Genet. V. 29: P. 577-605.

180. West, A.G., M. Gaszner, and G. Felsenfeld. 2002. Insulators: many functions, many mechanisms // Genes Dev. V. 16: P. 271-88.

181. Wu, R.S., H.T. Panusz, C.L. Hatch, and W.M. Bonner. 1986. Histones and their modifications // CRC Crit Rev Biochem. V. 20: P. 201-63.

182. Yasuhara, J.C., and B.T. Wakimoto. 2006. Oxymoron no more: the expanding world of heterochromatic genes // Trends Genet. V. 22: P. 330-8.

183. Yasuhara, J.C., and B.T. Wakimoto. 2008. Molecular landscape of modified histones in Drosophila heterochromatic genes and euchromatin-heterochromatin transition zones // PLoS Genet. V. 4:e16.

184. Zhang, J., F. Xu, T. Hashimshony, I. Keshet, and H. Cedar. 2002. Establishment of transcriptional competence in early and late S phase // Nature. V. 420: P. 198-202.

185. Zhang, P., andA.C. Spradling. 1995. The Drosophila salivary gland chromocenter contains highly polytenized subdomains of mitotic heterochromatin // Genetics. 139:659-70.

186. Zhimulev, I.F. 1998. Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation //Adv Genet. V. 37: P. 1-566.

187. Zhimulev, I.F., and E.S. Belyaeva. 2003. Intercalary heterochromatin and genetic silencing // Bioessays. V. 25: P. 1040-51.

188. Zimowska, G., J.P. Aris, and M.R. Paddy. 1997. A Drosophila Tpr protein homolog is localized both in the extrachromosomal channel network and to nuclear pore complexes // J Cell Sci. V. 110: P. 927-44.

189. Zink, B., and R. Paro. 1989. In vivo binding pattern of a trans-regulator of homoeotic genes in Drosophila melanogaster // Nature. V. 337: P. 468-71.

190. Zink, D. 2006. The temporal program of DNA replication: new insights into old questions // Chromosoma. V. 115: P. 273-87.

Информация о работе

Федорова, Елена Михайловна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
ВАК 03.00.15

Диссертация

Взаимосвязь положения в ядре и функциональной регуляции генов и трансгенов в интерфазных ядрах Drosophila Melanogaster и культивируемых клеток млекопитающих - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы