Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие транспортного белка 1 и белка оболочки при трансляционной активации потексвирусов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие транспортного белка 1 и белка оболочки при трансляционной активации потексвирусов"

На правах рукописи

003448787

СМИРНОВ Александр Алексеевич

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРАНСПОРТНОГО БЕЛКА 1 И БЕЛКА ОБОЛОЧКИ ПРИ ТРАНСЛЯЦИОННОЙ АКТИВАЦИИ ПОТЕКСВИРУСОВ

03 00.06 - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

1 6 ОПТ 2008

003448787

Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова

Научные руководители1

академик РАН, доктор биологических наук, профессор

Атабеков Иосиф Григорьевич

доктор биологических наук

Карпова Ольга Вячеславовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Добров Евгений Николаевич

кандидат биологических наук

Эльдаров Михаил Анатольевич

Ведущая организация: Институт биологии гена РАН

Защита состоится 31 октября в II00 часов на заседании совета Д501 001 76 то защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М В Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А Н Белозерского, ауд 536

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М В Ломоносова

Автореферат разослан «30» сентября 2008 года

л

Ученый секретарь диссертациош

кандидат биологических наук

Крашенинников И А

Актуальность проблемы

Изучение молекулярных механизмов распространения вирусной инфекции в растении является одним из важнейших вопросов современной фитовирусологии Исследование транспорта вирусного генома служит основой для понимания принципов взаимодействия вирусов с зараженной клеткой

Межклеточный транспорт вирусной инфекции представляет собой передвижение вирусного генетического материала из зараженной в соседнюю, здоровую клетку через плазмодесмы

Объектом нашего исследования являлся X вирус картофеля (ХВК) - типовой представитель рода Potexvirus, содержащий геномную одноцепочечную плюс РНК

До недавнего времени в литературе были описаны две основные модели ближнего транспорта потексвирусов Согласно первой, вирусная РНК транспортируется в соседнюю клетку в составе вириона (Chapman et al, 1992, Oparka et al, 1996), а согласно второй - в составе рибонуклеопротеида невирионной природы, образованного РНК, белком оболочки (БО) и первым транспортным белком (ТБ1) (Lough el al, 1998, 2000) В нашей лаборатории показано, что при инкубации РНК ХВК с БО, в присутствии и в отсутствии ТБ1, т vitro образуется вирусный рибонуклеопротеид (вРНП), названный «однохвостой частицей» (single tailed particle - STP) и представляющий собой неполностью собранный вирион (Karpova et al, 2006) РНК ХВК, находящаяся в составе вирусной частицы или вРНП, недоступна для трансляции т vitro Связывание ТБ1 ХВК с вирусной частицей или вРНП активирует трансляцию инкапсидированной РНК (Atabekov et al, 2000, Karpova et al, 2006) Мы предполагаем, что РНК ХВК транспортируется в соседнюю клетку в составе комплексов ТБ1 с вРНП или вирионом ХВК

Настоящая работа посвящена локализации участков молекул БО и ТБ1, участвующих во взаимодействии ТБ1 с вРНП и вирусной частицей ХВК, приводящему к активации трансляции инкапсидированной РНК

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы была локализация участков БО и ТБ1 ХВК, обеспечивающих связывание ТБ1 с вРНП или вирусной частицей и активацию трансляции инкапсидированной РНК

В ходе работы решали следующие основные задачи

1) Получение рекомбинантного БО ХВК, способного связывать РНК ХВК с образованием вРНП

2) Получение панели делеционных мутантов БО Изучение их способности связывать РНК ХВК с образованием вРНП

3) Поиск участка БО необходимого для связывания ТБ1 ХВК с торцевыми субъединицами БО вРНП

4) Анализ влияния делеций различных участков ТБ1 на его способность связываться с вирусной частицей и активировать трансляцию инкапсидированной РНК

Научная новизна работы

Впервые показано, что 18 С-концевых аминокислотных остатков БО не требуются для связывания вирусной РНК и образования вРНП Делеция более чем 18 С-концевых аминокислотных остатков БО бчокирует его способность связывать РНК ХВК

Локализован участок БО необходимый для взаимодействия ТБ1 с вРНП Обнаружено, что участок ТБ1 ХВК, обеспечивающий его взаимодействие с вирусной частицей, находится между 112 и 173 аминокислотными остатками ТБ1

Показано, что связывание ТБ1 ХВК с вирусной частицей необходимо, но не достаточно для активации трансляции инкапсидированной РНК

Обнаружено, что N-концевой пептид, состоящий из шести остатков гистидина, блокирует способность БО образовывать вирусный рибонуклеопротеид т vitro Удаление N-концевых остатков гистидина, с применением искусственно введенного сайта протеиназы Ха, восстанавливает способность БО связывать вирусную РНК с образованием вРНП

В последовательности БО ХВК обнаружен неканонический С-проксимальный сайт гидролиза протеазы Ха

Практическая ценность работы

Результаты работы могут быть использованы в практике научных исследований в области молекулярной биологии и вирусологии Материалы работы используются при чтении курсов лекций на Биологическом факультете МГУ им MB Ломоносова

Апробация работы

Основные результаты работы докладывались и обсуждались на Международной школе конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Звенигород 2005), четвертом московском международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (2007), 10м Международном Симпозиуме по Эпидемиологии Растительных Вирусов (Хайдарабад, Индия 2007) Структура работы

Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы»

Содержание работы

X вирус картофеля (ХВК) - типовой представитель рода Potexvirus - вирусов с (+)РНК геномом длинной около 6,4x103 нуклеотидов Длина вирусной частицы составляет примерно 515 нм, при диаметре 13,5 нм Вирион ХВК содержит около 1300 идентичных субъединиц белка оболочки (БО), упакованных в виде спирали, между оборотами которой заключена вирусная РНК Вероятной транспортной формой ХВК может быть вирион или вирусный рибонуклеопротеид (вРНП), состоящий из «головки» (одетый БО 5' конец РНК), имеющей структуру спирально упакованного капсида вириона, и «хвоста» - свободная 3' концевая часть РНК Такие частицы были названы однохвостыми (single tailed particle - STP) и представляли собой неполностью собранный вирион (Karpova et al, 2006) В нашей лаборатории показано, что в отличие от многих других растительных вирусов, вирионная РНК ХВК недоступна для трансляции m vitro, но фосфоршшрование БО в составе частицы

ХВК, или связывание с ней транспортного белка 1 (ТБ1), активирует трансляцию инкапсидированной РНК (Atabekov et al, 2000, Atabekov et al, 2001) Аналогичные результаты были получены для «однохвостых» частиц, РНК в их составе исключалась из процесса трансляции и могла быть вновь активирована путем фосфорилирования БО в составе вРНП или при образовании комплекса ТБ1-вРНП ХВК (Karpova et al, 2006) Было показано, что ТБ1 связывается с торцом вириона или головки вРНП (в котором упакован 5' конец РНК) (Karpova et al, 2006)

Полученные данные (Rodionova et al, 2003, Karpova et al, 2006, Karpova et al, 1997, Kahmna et al, 1996) позволяли полагать, что ТБ1 связывается с вРНП или вирусной частицей за счет взаимодействия с терминальными субъединицами полярной спирали БО Задачей данной работы была локализация участков ТБ1 и БО, обеспечивающих взаимодействие ТБ1 с вРНП и активацию трансляции инкапсидированной РНК

I Локализация участка БО, вовлеченного в связывание ТБ1 с вРНП

Ранее в нашей лаборатории было показано, что экспонированный на поверхность вириона ХВК N-конец белка оболочки (19 N-концевых аминокислотных остатков) не требуется для связывания ТБ1 с вирусной частицей (Atabekov et al, 2001) Мы предположили, что участок БО, обеспечивающий взаимодействие ТБ1 с вРНП, находится в С-концевой части белка Для поиска этого участка была изучена способность ТБ1 связываться с различными С-концевыми делеционными мутантами БО в составе вРНП, образованных при инкубации вир>сной РНК с БО ХВК

1 Получение рекомбинантных БО и его С-концевых делеционных мутантов

С целью локализации участка БО, ответственного за взаимодействие с ТБ1, был сконструирован рекомбинантный БО, на N-конце которого находился пептид из шести остатков гистидина, - р(Н)6БО, а также ряд делеционных мутантов БО, с С-конца которых были удалены 5, 10, 15 и 20 аминокислот, соответственно р(Н)бБОА5, р(Н)6БОДЮ, р(Н)6БОД15, р(Н)6БОД20

Вопреки нашим ожиданиям, р(Н)6БО при инкубации с вирусной РНК не был способен образовывать вРНП, в отличие от нативного БО (нБО), который образовывал частицы различной длинны со структурой идентичной структуре вириона (Рис 1А) р(Н)6БО при инкубации с РНК формировал неструктурированные агрегаты (Рис 1Б), то есть был непригоден для дальнейших исследований по самосборке Эти результаты были подтверждены методом торможения в геле Как видно на рисунке 2 (дорожка 4) р(Н)бБО связывает вирусную РНК с образованием крупных агрегатов, не способных войти в гель, подвижность которых значительно отличается от вРНП образованных нБО (Рис 2 дорожка 2) Известно, что присоединение пептида, состоящего из шести остатков гистидина, может быть причиной изменения свойств рекомбинантного белка (Yang et al, 2002, Votchitseva et al, 2006) Мы предположили, что и в нашем случае причиной неспособности р(Н)6БО связывать вирусную РНК с образованием вРНП является (Н)6-пептид, присоединенный к его N-концу Соответственно, нашей следующей задачей стало получение рекомбинантного БО, лишенного (Н)6-пептида. Были получены рекомбинантные БО, на N-конце которых между гистидиновым пептидом и началом последовательности БО был введен сайт разрезания протеазой Ха IEGR p(H)6IEGR-БО (полноразмерный БО), и его делеционные мутанты p(H)6IEGR-EOA5, p(H)6IEGR-БОДЮ, p(H)6IEGR-BOA15, p(H)6IEGR-EOAl7, p(H)6IEGR-EOA18, p(H)6IEGR-BOA19, p(H)üIEGR-BOД20 (с С-конца которых были удалены 5, 10, 15, 17, 18, 19, 20 аминокислотных остатков, соответственно) (Рис 3)

Рис. 1. Электронные микрофотографии вРНП, собранных in vitro из РНК ХВК и А) нативного БО ХВК; Б) р(Н)бБО; В) p(H)JEGRBO; Г) рБО; Д) рБОДЮ;Е) рБОЛ18

РНК ХВК инкубировали с БО в молярном соотношении РНК:БО, равном 1:700, после чего наносили на сетку для электронной микроскопии. Образцы окрашены 2 % уранил ацетатом. Масштабная полоса 100 нм.

Рис. 2. Изучение РНК-связывающих свойств БО ХВК и его мутантов методом задержки в геле.

1) РНК ХВК; 2) РНК ХВК инкубировали с нативным БО ХВК; 3) РНК ХВК инкубировали с рБО; 4) РНК ХВК инкубировали с (Н)5БО; 5) РНК ХВК инкубировали с (Н)61ЕС!КБО; 6) РНК ХВК инкубировали с рБОЛЮ.

РНК ХВК инкубировали с БО ХВК (в молярном соотношении РНК:БО равном 1:700) 20 мин. при 25°С. Затем продукты реакции фракционировали методом электрофореза в 1 % агарозном геле (неденатурирующие условия). Гель окрашен бромистым этидием.

Обработка рекомбинантных белков протеазой фактором Ха приводила к удалению 1^-концевого (Н)6-пептида. Следует отметить, что при гидролизе р(Н)61ЕСЯ-БО, р(К)61Е0К-Ь045, р(Н)61ЕОК-БОАЮ, р(Н>,1ЕОК-К()Л15, р(Н),ДЕОК-БОЛ17, р(Н)61ЕОЯ-БОД18 образовывались продукты одного размера. А при гидролизе р(Н)61Е011-Б0Л19 и р(Н)61ЕСЯ-БОА20 - более легкие продукты (Рис. 3). Это позволило сделать вывод о наличии в последовательности БО дополнительного сайта гидролиза протеазой Ха, располагающегося после остатка аргинина-219 в последовательности А^УТН219®*221 (Рис. 3). Для инактивации дополнительного сайта протеолиза остаток аргинина-219 был замещён аланином (нейтральная аминокислота) или ппотамином (наиболее близкая к аргинину по структуре). Поскольку мы не могли исключить возможности того, что разрезание происходит одновременно после остатка аргинина-219 и аргинина-221, были заменены сразу обе эти аминокислоты. Таким образом, были получены рекомбинантный БО и его С-концевые делеционные мутанты, несущие следующие аминокислотные замены: р(Н)61ЕОК-БО0 и р(Н)61ЕО!?.- БОДЮО - остатки аргинина в последовательности

Мутанты ВО ХВК до п(фоята (Н)4Ш<Ж AVTRGR.

1>®)6Г£0'К-Б0 j>ffl)6iEGR-BOiS 1>Р0^Е(Ж-БОД10

ptH)6IEGR-BOA17

р{Щ5т<ж-Е<Ш8

|.(Н)Й1ЕСЖ-БОЛ10

¡М)6тои-1юл2о

I){H)6XEGR-EOQ

¡>(Н)Й1ЕОК-ВОД100| ра©«1ШВ.-50Д10А|

QGQ

ООО

И

ЛОЛ

Иоск пирултя щпгеячоП X»

Фактор X»

QG О

¡»ВОД IS

1>ВОД19 рЕОД2О

рБО

QOQ

AGA

pBQAlOQ рВОДЮА

Рис. 3. Полученные в работе рекомбинантные БО ХВК и его мутанты до и после разрезания протеазой Ха. Вертикальная линия показывает позицию в неканоническом сайте протеолиза AVTRGR, в которую протеаза Ха вносит разрыв. В торичный сайт протеолиза расположен между 215 и 222 аминокислотным остатком БО считая от N-конца (21 и 16 от С-конца соответственно). Обработка рекомбинантных БО и его мутантов содержащих неканонический сайг протеолиза фактором Ха приводила к удалению N-концевого (H)6IEGR пептида и С-концевых фрагментов различного размера, в результате разрезания образовывался рБОД18. Мутанты, не содержащие вторичного сайга протеолиза, p(H)6lEGR-BOA19, p(H)6IEGR-BOA20 в результате разрезания протеазой Ха давали рБОД19 и рБОД20 соответственно. p(H)6IEGR-BOQ, p(H)6IEGR-BOAlOQ, p(H)6IEGR-БОЛША, у которых вторичный сайт протеолиза был инактивирован за счет аминокислотных замен, при обработке протеазой Ха, давали рБО, рБОДЮО, рБОДЮА соответственно.

219-F.GR.-221 были заменены на остатки глютамина-219-С)СС)-221, р(Н)61ЕОК-БОДЮА - остатки аргинина в последовательности 219-ИОК-221 были заменены на остатки аланина - 219-АОА-221 (Рис 3) Анализ электрофоретической подвижности продуктов гидролиза этих белков фактором Ха, свидетельствовал о том, что протеаза удаляет И-концевой (Н)6-пептид, но не затрагивает последовательность БО (Рис 3) Следовательно, внесенные нами аминокислотные замены действительно инактивировали дополнительный сайт протеолиза в последовательности БО Все дальнейшие эксперименты были проведены как с р(Н)61ЕОК.-БОАЮА, так и с р(Н)61ЕОЯ-БОД10<3 Вне зависимости от того, какой мутант использовали, полученные результаты были идентичны Поэтому в дальнейшем изложении мы не будем вносить обозначения использованных мутантов Таким образом, после гидролиза протеазой Ха нами были получены рекомбинантный полноразмерный БО-рБО и его мутанты-рБОДЮ, рБОД18, рБОД19, рБОД20 (с С-конца, которых были делетированы 10, 18, 19, 20 аминокислотных остатков, соответственно), лишенные (Н)6-псптида

2 Изучение способности рБО и его С-концевых делеционных мутантов образовывать вРНП

Полученные нами рБО, рБОДЮ, рБОД18, рБОД19, рБОД20 икубировали с вирусной РНК в молярном соотношении РНК БО равном 1 700, после чего образец исследовали методом электронной микроскопии Из результатов, представленных на рисунке 1 следует, что белки рБО (Рис 1Г), рБОДЮ (Рис 1Д), рБОД18 (Рис 1Е) образуют РНП, структура которых не отличается от вРНП, образованных нБО (Рис 1А)

Для подтверждения полученных результатов мы использовали метод смещения в геле, нБО или рБО инкубировали с вирусной РНК при молярном соотношении 1 700, после чего смесь анализировали методом электрофореза в неденатурирующем агарозном геле Результаты этого эксперимента, представленные на рисунке 2, показывают, что инкубация рБО с РНК (дорожка 3), как и в случае нБО (дорожка 2) приводит к значительному уменьшению полосы, соответствующей свободной РНК ХВК При этом появляются более тяжелые полосы, представляющие

собой, очевидно, РНП комплексы из БО и РНК ХВК Аналогичные результаты быта получены для рБОДЮ и рБОД18

Таким образом, представленные данные позволяют заключить, что полученные нами рБО, рБОДЮ, рБОД18 связывают вирусную РНК в РНП, имеющую структуру идентичную вРНП, образованным нативныч БО Собранные из этих рекомбинантных белков вРНП были использованы в дальнейших исследованиях

Методом электронной микроскопии была исследована инкубационная смесь, содержащая РНК ХВК и рБОД19 или рБОД20 Следует отметить, что при использовании таких препаратов не наблюдалось образования вРНП и крупных бесформенных агломератов, упомянутых выше, формируемых при инкубации вирусной РНК с р(Н)6БО Это позволило заключить, что рБОД19, рБОД20 не способны связывать РНК На рисунке 2 (дорожка 6) представлены результаты анализа продуктов инкубации рБОЛ20 с вирусной РНК На этой дорожке выявляется единственная полоса, соответствующая свободной РЖ ХВК при отсутствии более тяжелых продуктов, представляющих собой комплекс рБОД20 с РНК Таким образом, в этом образце вся РНК осталась свободной, что позволяет сделать вывод о том, что С-детеционный мутант рБОД20 не способен связывать РНК ХВК Таким образом, делеция более чем 18 С-концевых аминокислот БО блокирует его РНК-связывающие свойства

Еще одной функциональной характеристикой вРНП, важной для дальнейших исследований, является недоступность для трансляции инкапсидированной РНК Соответственно, необходимо было проверить, доступна ли РНК, в составе вРНП, образованных нашими рекомбинантными белками, для трансляции Вирусную РНК инкубировали с рБО и его мутантами После этого добавляли в бесклеточную трансляционную систему из экстракта зародышей пшеницы, содержащую Б35 меченный метионин Из результатов, представленных на рисунке 4 (дорожка 2) следует, что взаимодействие РНК ХВК с нБО в вРНП, резко ингибирует трансляцию Минорный уровень трансляции объясняется наличием в препарате некоторого количества свободной РНК, не связанной с БО (Кагроуа е1 а!, 2006) Белки рБО (дорожка 6), рБОДЮ или рБОД1& (дорожка 9) также связывали вирусную РНК и ингибировали ее трансляцию, с такой же эффективностью как и нБО Результаты,

полученные в трансляционных тестах с рБОЛЮ или рБОД18, были полностью идентичны.

Таким образом, полученные результаты позволяют, заключить, что вирусная РНК, связанная в вРНП рБО, рБОДЮ, рБОД18, недоступна для трансляции. Это подтверждает структурную и функциональную идентичность вРНП, образованных нБО и его рекомбинантными гомологами. Результаты, представленные на рисунке 4 (дорожка 12), указывают на неспособность рБОЛ19 подавлять трансляцию РНК. Аналогичные результаты были получены для рБОД20. Это еще раз подтверждает, что делеция более чем 18-ти С-концевых аминокислот БО нарушает его РНК-связываюшие свойства.

1 2 3 4 5 6 7 8 Э 10 11 12

Рис. 4. Радиоавтограф (8-20 % ДСН-ПААГ) Б35 меченных продуктов трансляции РНК ХВК в ЭЗП.

1) РНК ХВК; 2) вРНП, состоящие из РНК ХВК и нативного БО ХВК; 3) к вРНП, собранным как в 2, добавлен ТБ1 ХВК; 4) вРНП, собранные как в 2, фосфорилированы ПКС (протеинкиназа С); 5) РНК ХВК инкубировали с р(Н)6БО; 6) вРНП, состоящие из РНК ХВК и рБО; 7) к вРНП, собранным как в 6, добавлен ТБ1; 8) вРНП, собранные как в б, фосфорилированы ПКС; 9) вРНП, состоящие из РНК ХВК и рБОДЮ/рБОД18; 10) к вРНП, собранным как в 9, добавлен ТБ1; 11) вРНП, собранные как в 9, фосфорилированы ПКС; 12) РНК ХВК инкубировали с рБОД19. Стрелкой указано положение вирус-специфического продукта РНК-полимеразы (165К). РНК ХВК инкубировали с БО в молярном соотношении РНК:БО 1:700 (где указанно, после этого добавляли ТБ1 (в молярном соотношении РНК:ТБ1 1:100)), после чего добавляли в бесклеточную белоксинтезирующую систему из экстракта зародышей пшеницы (ЭЗП). Продукты трансляции анализировали методом электрофореза в ДСН-ПААГ.

3. Поиск области БО, вовлеченной в связывание ТБ1 с вРНП

Следующим шагом было выявление участка БО, взаимодействующего с ТБ1, при формировании комплекса с вРНП В работе использовались вРНП, образованные вирусной РНК, и рБО, рБОДЮ, или рБОД18 Свидетельством связывания ТБ1 с вРНП является активация трансляции инкапсидированной РНК Это свойство ТБ1 было использовано, для проверки его способности связываться с исследуемыми вРНП

рБО и его делеционные мутанты инкубировали с вирусной РНК, после чего добавляли ТБ1 в молярном соотношении РНК ТБ1 1 100, которое обеспечивает эффективную активацию ТБ1 трансляции инкапсидированной РНК( А1аЬекоу е! а1, 2000) Полученный образец добавляли в бесклеточную белок-синтезирующую систему Результаты этого эксперимента представлены на рисунке 4 (дорожки 3, 7, 10) Данный эксперимент показал, что ТБ1 активирует трансляцию РНК, находящейся в составе вРНП, образованных нБО (дорожка 3) или рБО (дорожка 7) Однако, добавление ТБ1 к вРНП, образованным БО Д10 или БО Д18 (Рис 4 , дорожка 10), не активировало трансляцию инкапсидированной РНК Возможны два объяснения этого эффекта

1 Активация трансляции РНК, инкапсидированной БОДЮ или БОА18, невозможна То есть, ТБ1 связывается с этими вРНП, но не активирует трансляцию инкапсидированной РНК

2 Второе объяснение состоит в том, что ТБ1 не способен связаться с вРНП, образованными БОДЮ или БОД18

Выше отмечалось, что инкапсидированная РНК вРНП ХВК может быть трансляционно активирована не только путем образования комплекса ТБ1-вРНП, но и при фосфорилировании БО в составе вРНП Как видно из рисунка 4, фосфорилирование вРНП, образованных нБО (дорожка 4), рБО (дорожка 8), рБОДЮ/рБОД18 (дорожка 11), вызывает активацию трансляции инкапсидированной РНК Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что РНК в составе вРНП, образованных БОДЮ или БОД18, может быть трансляционно активирована

Как уже было сказано выше, ТБ1 связывается с вРНП, скорее всего, за счет взаимодействия с БО (КосЬопоуа е/ а1,2003, Кагроуа е! а1,2006, КаИшпа а а1, 1996)

12

Таким образом, если ТБ1 действительно не связывается с вРНП, образованными рБОДЮ и рБОД18, то причиной этого скорее всего является его неспособность взаимодействовать с этими мутантами БО Для проверки способности ТБ1 взаимодействовать с рБОДЮ и рБОД18 мы использовали метод Фар-вестерн-блот (результаты представлены на рисунке 5) Для этого нБО, рБО, рБОДЮ разделяли методом электрофореза в ДСН-ПААГ, после чего переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали ее с ТБ1 Положение на мембране белков, с которыми связался ТБ1, определяли с помощью поликлональных антител к ТБ1 Результаты этого эксперимента свидетельствуют о том, что ТБ1 связывается с нБО и рБО (дорожки 1, 2) Отсутствие потосы на дорожке 3 говорит о том, что ТБ1 не связывается с рБОДЮ Аналогичный результат был получен для рБОД18

Итак, ТБ1 не способен взаимодействовать с рБОДЮ, рБОД18 Исходя из полученных результатов, мы можем предположить, что ТБ1 не связывается с вРНП, образованным рБОДЮ, рБОД18, и именно поэтому не активирует трансляцию инкапсидированной РНК Этот результат хорошо согласуется с данными, свидетельствующими о том, что при образовании комплексов «ТБ1-вирион» или «ТБ!-вРНП» и при трансляционной активации инкапсидированной РНК основную роль играют белок-белковые, а не РНК-белковые взаимодействия (Rodionova et а!, 2003) Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что среда 10 С-концевых аминокислот БО находится участок, необходимый для взаимодействия с ТБ1, и как следствие этого - для связывания ТБ1 с вРНП

Рис 5 Изучение взаимодействия ТБ1 и БО ХВК методом Фар-вестерн-бтота 1) Натнвный БО, 2) рБО, 3) рБОДЮ

БО ХВК и его мутанты (1мкг) разделяли на ДСН-ПААГ 8-20 %, после чего переносили на нитроцеллюлозную мембрану, которую затем инкубировали с ТБ1 (5 мкг/мл) Положение на мембране белков, с которыми связался ТБ1, определяли с помощью поликлональных антител против ТБ1 и вторичных антител, коньюгированкых с переоксидазой хрена (Sigma) Визуализировали с помощью ECL системы (Amersham Biosciences)

II. Локализация участка ТБ1, ответственного за взаимодействие с вирусной частицей и активацию трансляции инкапсидированной РНК

В ряде работ (Kalmina et al, 1996, 2002) продемонстрирована АТФазная и хеликазная активность ТБ1 ХВК т vitro Анализ аминокислотной последовательности ТБ1 показывает, что белок содержит семь мотивов, характерных для хеликаз суперсемейсгва 1

Делетируя различные участки полипептидной цепи ТБ1, суммарно включающие в себя почти всю его последовательность, мы надеялись локализовать участок этого белка, ответственный за взаимодействие с вирусной частицей и трансляционную активацию инкапсидированной РНК Для этого, нами были получены рекомбинантные ТБ1 и панель его делеционных мутантов (Рис 6)

1 мутант №2 - делетированы аминокислоты с 1-67 и с 173-226,

2 мутант №11 - делетированы аминокислоты cl 12-226,

3 мутант №6 - делетированы аминокислоты с 1-90 и с 203-226,

4 мутант №15 - делетированы аминокислоты с 1-103,

5 мутант №32 - делетированы аминокислоты с 1-67,

6 мутант №45 - делетированы аминокислоты с 203-226,

7 мутант №23 - в этом мутанте заменена аминокислота, предположительно входящая в активный центр НТФазного домена (34-GKS-36 заменено на 34-GKN-36) (Рис 6)

TBI №2 №11 №6 .N•15 №32 .N•45 №23

1 I la

b e:

1_I

■rap

SI 104 112 ii iii IV

II ill: 12

IT!

172 202 220

V __ VI. 225

10« IV

ИШЯЯ!

v vi 226

шмииви

VI_226

II III IV

ЗЕЭЕЯВ

v гог Ш

vi_226

А. Б. В.

+ + +

+ + -

- - -

+ -

+ ! + 1 -

+ i + i -

+ + -

+ + +

I Мотивы КОНКрвашвНЫе среди щ м.кончевой (Н) пептта хеликаз суперсеыенетва 1

Рис. 6. Схема использованных в работе делеционных мутантов ТБ1 и их свойства:

A. Связывание ТБ1 и его мутантов с вирионом ХВК (ИЭМ - иммуноэлектронная микроскопия)

Е. Связывание ТБ1 и его мутантов с вирионом ХВК (Фар-Вестерн-блот)

B. Активация трансляции инкапсидированной РНК ХВК

1. Локализация участка ТБ1, ответственного за взаимодействие с вирусной частицей

Для локализации участка ТБ1, ответственного за взаимодействие с вирионом, мы изучали методом иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ) способность полученных мутантов ТБ1 связываться с частицей ХВК. Комплексы ТБ1 с вирионами ХВК визуализировали с помощью антител к ТБ I и вторичных антител, конъюгированных с частицами коллоидного золота. Полученные результаты представлены на рисунке 7. Частицы коллоидного золота (помечены стрелками) указывают на положение ТБ1. В контрольных экспериментах, в отсутствие ТБ1, конъюгированные с коллоидным золотом вторичные антитела не связывались с

- - ■■ . •• • - Б 1 Ъг

■■ - ■ . ' а 1 1 1 в — F • ——

■ - ---- ■ -т. -- -■ =-. ■ л ; (У •> *

in 11 г - ■ВННЯв

Рис. 7. Иммуноэлектронная микроскопия комплекса ТБ1 и его мутантов с вирусными частицами ХВК.

А) ТБ1; Б) мутант ТБ1 №2; В) мутант ТБ1 №23; Г) мутант ТБ1 №45; Д) мутант ТБ1 №11; Е) мутант ТБ1 №6; Ж) мутант ТБ1 №32; 3) мутант ТБ1 №15 И) контроль без ТБ1. Детекция связанного с частицей ХВК ТБ1 (показан стрелками) осуществлялась с помощью антител против ТБ1 и вторичных антител, коньюгированных с частицами коллоидного золота диаметром 10 нм. Масштабная линейка 100 нм.

вирионами ХВК (Рис 7 И) Полученные результаты, свидетельствуют о том, что потноразмерный рекомбинантный ТБ1 (ТБ1) (Рис 7А), мутанты ТБ1 К»2 (Рис 7Б), №23 (Рис 7В), №45 (Рис 7Г), №6 (Рис 7Е), №32 (Рис 7Ж), №15 (Рис 73) способны связываться с вирусной частицей Причем, все эти мутанты демонстрируют характерное для ТБ1 связывание с одним концом вириона Это свидетельствует о том, что мутации не нарушили характерного для полноразмерного ТБ1 механизма связывания с вирусной частицей Однако, как стедует из рисунка 7 Д, мутант ТБ1 №11 потерял способность связываться с вирионом ХВК

Полученные результаты были подтверждены методом Фар-Вестерн-бтот Рекомбинантный ТБ1 и его мутанты разделяли методом электрофореза в ДДС-ПААГ, после чего переносили на нитроцеллюлозную мембрану Далее полученную мембрану инк)бировали с частицами ХВК Положение на мембране мутантов ТБ1, с которыми связывались частицы ХВК, определяли с помощью антител специфичными к вириону ХВК Результаты этого эксперимента показывают, что ТБ1,мутанты ТБ1 №2, №6, №15, №23, №32, №45 связываются с частицей ХВК, а м>тант № 11 утратил эту способность Таким образом, результаты, полученные с помощью методов Фар-вестерн-блот и иммуноэлектронной микроскопии полностью совпадают (Рис 6)

Анализ расположения делеций в исследуемых мутантах показывает, что именно деления участка с 112 по 172 аминокислотный остаюк приводит к неспособности мутанта ТБ1 №11 связываться с частицей ХВК Такой вывод был сделан, поскольку все остальные участки белковой цепи, отсутствующие у мутанта №11, были также делетированы у какого-нибудь из других мутантов, и это не нарушало способности ТБ1 связываться с вирусной частицей (Рис 6) При этом мутанты Xs2 и №6, у которых было делетировано больше половины последовательности ТБ1, но участок с 112 по 172 аминокислотный остаток остался не тронутым, сохраняли способность связываться с вирусной частицей

Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод, что участок ТБ1, необходимый для связывания с вирусной частицей ХВК, находится между 112 и 172 аминокислотными остатками

2 Локализация участка ТБ1, ответственного за активацию трансляции инкапсидированной РНК

Целью нашей дальнейшей работы было изучение способности ТБ1 активировать трансляцию инкапсидированной РНК В работах Atabekov et al, 2000, Rodionova et al, 2003, Karpova et al, 2006, было показано, что ТБ1 связывается с одним из торцов вирусной частицы (или торцом «головки» вРНП) и активирует трансляцию инкапсидированной РНК

Возникает вопрос, достаточно ли связывания ТБ1 с вирусной частицей для активации трансляции инкапсидированной РЫК1? Или этот процесс требует какой-то дополнительной активности ТБР

Для ответа на этот вопрос нами была исследована способность полученных мутантов ТБ1 активировать трансляцию инкапсидированной РНК Частицы ХВК инкубировали с ТБ1 и его мутантами, после чего добавляли в бесклеточную трансляционную систему Результаты этого эксперимента показывают, что инкубация частицы ХВК с ТБ1 или мутантом ТБ1 №23 активирует трансляцию инкапсидированной РНК, тогда как мутанты ТБ1 №2, №11, №6, №15, №32, №45 не способны активировать трансляцию инкапсидированной РНК (Рис 6)

Следует подчеркнуть, что мутанты ТБ1 №2, №6, №15, №32, №45 сохраняли способность связываться с вирусной частицей, но утрачивали способность активировать трансляцию инкапсидированной РНК (Рис 6)

Таким образом, мы можем сделать вывод, что связывание ТБ1 с вирусной частицей необходимо, но не достаточно, для активации трансляции инкапсидированной РНК

Данные, представленные на рисунке 6 свидетельствуют о том, что делении различных участков полипептидной цепи, суммарно включающие в себя почти всю последовательность ТБ1, нарушают его способность активировать трансляцию инкапсидированной РНК Этот результат позволяет предположить, что реализация функции активации трансляции требует сохранения строго определенной конформации ТБ1

3 Влияние фосфорнлирования на способность ТБ1 активировать трансляцию инкапсндированной РНК

Если активирование транстяции инкапсндированной РНК ХВК при образовании комплекса ТБ1-ХВК или ТБЬвРНП требует целостности конформации ТБ1, то различные модификации, изменяющие укладку его полипептидной цепи, должны блокировать эту способность Известно, что фосфорилирование может изменять конформацию бечка (Atabekov et al, 2001) Мы фосфорилировали ТБ1 с помощью протеинкиназы С (ПКС) Влияние фосфорнлирования на конформацию ТБ1 оценивали по изменению эффективности преципитации ТБ1-Р (ТБ1, фосфорилированный ПКС) по сравнению с ТБ1 специфичными к ТБ1 почиклональными антителами Из результатов, представченных на рисунке 8 А следует, что ТБ1-специфичные антитела гораздо эффективнее преципитнровали ТБ1 (дорожка 2), чем ТБ1-Р (дорожка 3) Таким образом полученные данные позволяют предположить, что фосфорилирование действительно значительно изменяет антигенные свойства и конформацию ТБ1

На следующем этапе работы мы изучали способность ТБ1-Р активировать трансляцию инкапсндированной РНК Частицы ХВК инкубировали с ТБ1 или ТБ1-Р, после чего добавляли в бесклеточную белоксинтезирующую систему Из результатов, представленных на рисунке 8 Б счед>ет, что ТБ1 активирует трансляцию инкапсндированной РНК, а ТБ1-Р теряет эту способность Таким образом, полученные в эксперименте данные свидетельствуют о том, что способность ТБ1 активировать трансляцию инкапсндированной РНК чувствительна к изменению его конформации Это согласуется с предположением о том, что для активации трансляции инкапсндированной РНК необходима целостность конформации ТБ1

1 2 3 4

^ШргЩК!

Б.

12 3

Рис 8. Изучение влияния фосфорилирования на свойства ТБ1 ХВК.

А) Иммунопреципитация интактного или in situ фосфорилированного ПКС ТБ1 (ТБ1-Р) поликлональными антителами к ТБ1. Преципитированный белок анализировали с помощью электофореза в ДСН-ПААГ. Окрашен Кумасси R-250.

1) ТБ1 (контроль); 2) преципитированный ТБ1; 3) преципитированный ТБ1-Р; 4) - контроль ТБ1 преципитированный гетероспецифичными

антителами к ВТМ.

Б) Радиоавтограф (8-20 % ДСН-ПААГ) Замеченных продуктов трансляции РНК ХВК в составе вирусной частицы в ЭЗП. 1) ХВК; 2) ХВК+ТБ1; 3) ХВК+ТБ1-Р Частицы ХВК инкубировали с ТБ1 или ТБ1-Р (в молярном соотношении ХВК:ТБ1 равном 1:100), после чего добавляли в бесклеточную белоксинтезирующую систему из экстракта зародышей пшеницы (ЭЗП). Продукты трансляции анализировали методом

электрофореза в ДСН-ПААГ.

На последнем этапе работы мы изучали возможность восстановления способности активации трансляции инкапсидированной РНК в опытах по комплементации разными делеционными мутантами ТБ1. Для этого частицы ХВК инкубировали с двумя различными мутантами ТБ1, после чего добавляли в бесклеточную трансляционную систему. Пары мутантов подбирали таким образом, чтобы суммарно в них присутствовала вся последовательность ТБ1. Инкубация вириона ХВК с парами мутантов ТБ1: №11+№32; №11+№15; №15+№45 не активировала трансляцию инкапсидированной РНК. Таким образом, можно сделать вывод, что различные мутанты ТБ1 не комплементируют нарушенные участки друг друга в процессе активации трансляции инкапсидированной РНК. Полученные результаты позволяют предположить. что для активации трансляции

инкапсидированной РНК требуется целостность полипептидной цепи и, соответственно, конформации ТБ1

В работе КаЬшпа е! а!, 2002 авторы выдвигают гипотезу, что почти вся полипептидная цепь ТБ1 принимает участие в образовании доменов 1А и 2А, характерных для хеликаз счнерссмейства 1 Таким образом, можно предположить, что для активации трансляции инкапсидированной РНК необходима целостность доменов 1А и 2А ТБ1 На данном этапе исследований нельзя сделать вывод, нужна ли хеликазная активность ТБ1 для активации трансляции инкапсидированной РНК Вполне вероятно, что ТБ1 активирует трансляцию инкапсидированной РНК за счет какого-то другого механизма, требующего дальнейших исследований

Выводы

1.18 С-концевых аминокислотных остатков белка оболочки (БО) не требуются для связывания вирусной РНК и образования вирусного рибонуклеопротеида (вРНП) Деления более чем 18 С-концевых аминокислотных остатков БО блокирует его способность связывать РНК ХВК

2 10 С-концевых аминокислотных остатков БО критически необходимы для связывания транспортного белка 1 (ТБ1) с вРНП

3. Участок транспортного белка 1 (ТБ1) ХВК, обеспечивающий его взаимодействие с торцевыми субъединицами спирально упакованного БО вириона, находится между 112 и 173 аминокислотным остатком ТБ1

4 Связывание ТБ1 ХВК с вирусной частицей необходимо, но недостаточно для активации трансляции инкапсидированной РНК

5. Рекомбинантный БО ХВК с шестью остатками гистидина на N-конце не способен образовывать вирусный рибонуклеопротеид in vitro Удаление остатков гистидина полностью восстанавливает способность БО связывать вирусную РНК с образованием вРНП

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Zayakina О , Arkhipenko М , Kozlovsky S , Nikitm N , Smimov А , Susi Р , Rodionova N, Karpova О and Atabekov J (2008) Mutagenic analysis of Potato Virus X movement protein (TGBpl) and the coat protein (CP) m vitro TGBpl-CP binding and viral RNA translation activation Molecular Plant Pathology 9(1), 37-44

2 Arkhipenko M V, Nikitin N A , Smirnov A A, Novikov V К , Rodionova N P, Karpova OV and Atabekov J G (2007) The new highly pathogenic strain of Potato virus X Abstract to the 10th International Plant Virus Epidemiology symposium, Hyderabad, India, 106

3 Смирнов A A (2007) Разработка новой технологии продукции в растении целевого белка Материалы Четвертого московского международного конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, стр 139

4 Смирнов А А (2005) Изучение взаимодействия транспортного белка вируса табачной мозаики с РНК в растении Nicotiana benlhamiana Материалы международной шкоты-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», Звенигород, стр 117-118

Подписано в печать 29 09 2008 г

Печать трафаретная

Заказ № 846 Тираж 100 экз

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнов, Александр Алексеевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Структура вирусной частицы и ее конформационные перестройки.

1.1. Структура БО, входящего в состав вириона ХВК.

1.2. Гликозилирование БОХВК.

1.3. Активация трансляции инкапсидированной РНК.

1.3.1 Активация трансляции инкапсидированной РНК при фосфорилировании БОХВК.

1.3.2 Активация ТБ1 трансляции инкапсидированной РНК.

1.4. Разборка вирусной частицы ХВК.

1.5. Структура транспортной формы ХВК.

2. Функции транспортного белка 1.

2.1. Свойства ТБ1 in vitro.

2.1.1 РНК-связывающая активность ТБ1.

2.1.2 Хеликазная активность ТБ1.

2.1.3. Взаимодействие ТБ1 с вирусной частицей.

2.2. функ1 (ии тб 1 in vivo.

2.2.1. Роль ТБ1 в обеспечении межклеточного транспорта вируса.

2.2.2. ТБ1 - ингибитор умолкания генов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Получение РНП комплексов.

2. Анализ вРНП методом торможения в геле.

3. Гидролиз рекомбинантных белков протеазой фактором Ха.

4. полимеразная цепная реакция (ПЦР).

5. Рестрикция.

6. Лигирование ДНК.

7. выделение плазмидной ДНК.

8. конструирование плазмид.

8.1. Получение конструкций, содерэ/сащих гены мутантов ТБ1.

8.2. Получение конструкций, содержащих гены БО и его делеционных мутантов.

9. Трансформация клеток Е. coli штамма Ml5.

10. Экспрессия рекомбинантных белков.

11. хроматографическая очистка (гис)б-рекомбинантных белков ha nl2+-нитрилотриацетатной агарозе.

12. электрофоретический анализ белков в денатурирующем полиакриламидном геле.

13. выделение препарата х-вируса картофеля.

14. выделение белка оболочки хвк.

15. выделение РНК из вирусных препаратов.

16. фосфорилирование in vitro.

17. трансляция in vitro в экстракте зародышей пшеницы.

18. иммуноэлектронн ая микроскопия.

19. электронная микроскопия.

20. фар-вестерн-блот.

21. имунопреципитация.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Локализация участка БО, вовлеченного в связывание ТБ1 с вРНП.

1. Получение рекомбинантных БО и его С-концевых делеционных мутантов.

2. Получениерекомбинантного БО, лишенного шести гистидинового пептида.

3. Изучение способности рБО и его С-концевых делеционных мутантов образовывать вРНП

4. Поиск области БО, обеспечивающей связывание ТБ1 с вРНП.

II. Локализация участка ТБ1, ответственного за взаимодействие с вирусной частицей и активацию трансляции инкапсидир0ванн0й РНК.

1. Локализация участка ТБ1, ответственного за взаимодействие с вирусной частицей.

2. Локализация участка ТБ1, ответственного за активацию трансляции инкапсидированной РНК.

3. Влияние фосфорилирования на способность ТБ1 активировать трансляцию инкапсидированной РНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие транспортного белка 1 и белка оболочки при трансляционной активации потексвирусов"

Изучение молекулярных механизмов распространения вирусной инфекции в растении является одним из важнейших вопросов современной фитовирусологии. Исследование транспорта вирусного генома служит основой для понимания принципов взаимодействия вирусов с зараженной клеткой.

Межклеточный транспорт вирусной инфекции представляет собой передвижение вирусного генетического материала из зараженной в соседнюю, здоровую клетку через плазмодесмы.

Объектом нашего исследования являлся X вирус картофеля (ХВК) -типовой представитель рода Potexvirus, содержащий геномную одноцепочечную плюс РНК.

До недавнего времени в литературе были описаны две основные модели ближнего транспорта потексвирусов. Согласно первой, вирусная РНК транспортируется в соседнюю клетку в составе вириона (Chapman et al., 1992; Oparka et al., 1996), а согласно второй - в составе рибонуклеопротеида невирионной природы, образованного РНК, белком оболочки (БО) и первым транспортным белком (ТБ1) (Lough et al., 1998, 2000). В нашей лаборатории показано, что при инкубации РНК ХВК с БО, в присутствии и в отсутствии ТБ1, in vitro образуется вирусный рибонуклеопротеид (вРНП), названный «однохвостой частицей» (single tailed particle - STP) и представляющий собой неполностью собранный вирион (Karpova et al., 2006). РНК ХВК, находящаяся в составе вирусной частицы или вРНП, недоступна для трансляции in vitro. Связывание ТБ1 ХВК с вирусной частицей или вРНП активирует трансляцию инкапсидированной РНК (Atabekov et al., 2000, Karpova et al., 2006). Мы предполагаем, что РНК ХВК транспортируется в соседнюю клетку в составе комплексов ТБ1 с вРНП или вирионом ХВК.

Настоящая работа посвящена локализации участков молекул БО и ТБ1, участвующих во взаимодействии ТБ1 с вРНП и вирусной частицей ХВК, приводящему к активации трансляции инкапсидированной РНК.

Обзор литературы

Х-вирус картофеля (ХВК) - типовой представитель рода Potexvirus, относящегося к семейству Flexiviridae. Геномная РНК ХВК длинной 6345 пуклеотидов, содержащая «кэп» структуру на 5' конце и поли А последовательность на 3' конце, кодирует пять белков. Репликаза (165 К) транслируется непосредственно с геномной РНК, а три транспортных белка (ТБ1, ТБ2, ТБЗ - продукты «тройного блока генов») и белок оболочки (БО) с субгеномых РНК.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Смирнов, Александр Алексеевич

Выводы

1. 18 С-концевых аминокислотных остатков белка оболочки (БО) не требуются для связывания вирусной РНК и образования вирусного рибонуклеопротеида (вРНП). Деления более чем 18 С-концевых аминокислотных остатков БО блокирует его способность связывать РНК ХВК.

2. 10 С-концевых аминокислотных остатков БО критически необходимы для связывания транспортного белка 1 (ТБ1) с вРНП.

3. Участок транспортного белка 1 (ТБ1) ХВК, обеспечивающий его взаимодействие с торцевыми субъединицами спирально упакованного БО вириона, находится между 112 и 173 аминокислотным остатком ТБ1.

4. Связывание ТБ1 ХВК с вирусной частицей необходимо, но недостаточно для активации трансляции инкапсидированной РНК.

5. Рекомбинантный БО ХВК с шестью остатками гистидина на N-конце не способен образовывать вирусный рибонуклеопротеид in vitro. Удаление остатков гистидина полностью восстанавливает способность БО связывать вирусную РНК с образованием вРНП.

Заключение

Имеющиеся на сегодняшний день данные позволяют утверждать, что ТБ1 связывается с вРНП, скорее всего, за счет взаимодействия с БО. Полученные в этой работе результаты позволяют сделать вывод, что ТБ1 не связывается с вРНП, образованным вирусной РНК и БО, у которого делегированы десять С-концевых аминокислотных остатков.

В чем причина такого эффекта? Существует два возможных объяснения:

1) ТБ1 связывается с вРНП за счет взаимодействия с какими-то из десяти С- концевых аминокислотных остатков БО;

2) ТБ1 не взаимодействует с С-концевыми аминокислотными остатками БО. Однако делеция десяти С-концевых аминокислотных остатков приводит к изменению структуры БО, делающему недоступным участок, с которым взаимодействовал ТБ1 при связывании с вРНП.

Какое из этих объяснений соответствует действительности? В работе Baratova et al. (1992) получены результаты, свидетельствующие о том, что С-конец большинства молекул БО, образующих вирусную частицу, находится в глубине ее структуры, что ставит под сомнение наше предположение о взаимодействии данного участка БО с ТБ1. Однако, необходимо отметить, что метод тритиевой планиграфии, использованный в работе Baratova et al. (1992), дает усредненную картину для всех БО вирусной частицы. Таким образом, данные, полученные с помощью этого метода, позволяют, нам сделать заключение о том, какие аминокислотные остатки находятся на поверхности вирусной частицы у большинства входящих в её состав субъединиц БО. У молекул БО, образующих торцы вирусной частицы (первый виток спирали с каждого конца), во внешнюю среду экспонировано больше аминокислотных остатков, чем у остальных субъединиц БО.

Первый виток спирали вирусной частицы образован 8,9 молекул БО с каждого конца (это 0,6 % от общего числа субъединиц БО, образующих вирион ХВК). Таким образом, исследование поверхности вирусной частицы методом тритиевой планиграфии не дает представления о том, какие аминокислотные остатки субъединиц БО, образующих торцы вирусной частицы, экспонированы во внешнюю среду.

При этом, как показано в работах Atabekov et al. (2000), Rodionova et al. (2003), Karpova et al. (2006), ТБ1 связывается с торцом головки вРНП или вирусной частицы, т.е., возможно, именно с теми молекулами БО, информации о которых, не дают исследования вирусной частицы методом тритиевой планиграфии, проведенные в работе Baratova et al. (1992).

Таким образом, мы можем предположить, что у молекул БО, образующих торец головки вРНП или вирусной частицы, в котором упакован 5' конец вирусной РНК, десять С-концевых аминокислотных остатков экспонированы на поверхность и доступны для взаимодействия с ТБ1. Однако, необходимо отметить, что мы не имеем экспериментальных фактов для подтверждения этой гипотезы.

С другой стороны, авторы работы Nemykh et al., (2008) выдвигают гипотезу, что при связывании с вирусной частицей ТБ1 взаимодействует с участками, лежащими между 35-38 и 136-144 аминокислотными остатками БО. Анализируя предложенную в этой статье модель третичной структуры БО, находящегося в составе вирусной частицы, мы видим, что делеция десяти С-концевых аминокислот может нарушать структуру БО таким образом, что участки 35-38 и 136-144 аминокислотных остатков станут недоступными для взаимодействия с ТБ1.

Итак, полученные данные позволяют нам сделать вывод, что ТБ1 не связывается с вРНП, образованным вирусной РНК и БО, с С-конца которого делетированы десять аминокислотных остатков. Имеющиеся на сегодняшний день данные не позволяют нам сделать вывод о причинах такого эффекта.

На втором этапе работы, нашей задачей была локализация участка ТБ1, ответственного за связывание с вРНП и активацию трансляции инкапсидированной РНК.

Как было показано в работе Gorbalenya and Koonin (1993), ТБ1 ХВК содержит семь консервативных мотивов, характерных для хеликаз суперсемейства 1,2. На данный момент изучена структура нескольких белков, входящих в эти семейства (Caruthers and McKay, 2002). Сравнение структур этих белков позволило выявить ряд общих черт. Так, все хеликазные мотивы каждого из этих белков входили в состав двух доменов: 1А, 2А. Большая часть структуры этих доменов, а также локализация хеликазных мотивов в соответствующих доменах, была идентична у всех изученных хеликаз суперсемейства 1,2 (Caruthers and McKay, 2002).

Таким образом, вероятно, описанные элементы структуры характерны для всех белков содержащих семь консервативных хеликазных мотивов, т.е. соответственно, и для ТБ1 ХВК. Тогда, исходя из расположения в последовательности ТБ1 хеликазных мотивов, можно предположить, что почти вся полипептидная цепь ТБ1 участвует в образовании доменов 1А, 2А, характерных для хеликаз суперсемейства 1 (Kalinina et ai, 2002).

Полученные в этой работе результаты позволяют предположить, что для активации трансляции инкапсидированной РНК требуется целостность конформации ТБ1. Таким образом, можно предположить, что для активации трансляции инкапсидированной РНК необходима целостность доменов 1А и 2А ТБ1. На данном этапе исследований нельзя сделать вывод, нужна ли хеликазная активность ТБ1 для активации трансляции инкапсидированной РНК. Вполне вероятно, что ТБ1 активирует трансляцию инкапсидированной РНК за счет какого-то другого механизма, требующего дальнейших исследований.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнов, Александр Алексеевич, Москва

1. Angell S.M., Davies C., Baulcombe D.C. (1996) Cell-to-cell movement of potato virus X is associated with a change in the size-exclusion limit of plasmodesmata in trichome cells of Nicotiana clevelandii. Virology. 216 (1), 197-201.

2. Atabekov J., Dobrov E., Karpova O., Rodionova N. (2007) Potato virus X: structure, disassembly and reconstitution. Mol. plant pathology. 8 (5), 667675.

3. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V. Poljakov V.Y. (2000) The movement protein-triggered in situ conversion of potato virus X virion RNA from a nontranslatable into a translatable form. Virology. 271 (2), 259-263.

4. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Novikov V.K., Arkhipenko M.V. (2001) Translational activation of encapsidated potato virus X RNA by coat protein phosphorylation. Virology. 286 (2), 466-474.

5. Baratova L.A., Grebenshchikov N.I., Shishkov A.V, Kashirin I.A., Radavsky J.L., Ja'rveku'lg L., Saarma M. (1992) The topography of the surface of potato virus X: tritium planigraphy and immunological analysis. J. Gen. Virol. 73 (2), 229-235.

6. Bayne E.H., Rakitina D.V., Morozov S.Y., Baulcombe D.C. (2005) Cell-to-cell movement of potato potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing. Plant J. 44 (3), 471-482.

7. Beck D.L., Guilford P.J., Voot D.M., Andersen M.T., Forster R.L. (1991) Triple gene block proteins of white clover mosaic potexvirus are required for transport. Virology. 183 (2), 695-702.

8. Blanch E.W., Robinson D.J., Hecht L., Syme C.D., Nielsen K., Barron L.D. (2002) Solution structures of potato virus X and narcissus mosaic virus from Raman optical activity. J. Gen. Virol. 83 (1), 241-246.

9. Bleykasten C., Gilmer D., Guilley H., Richards K.E., Jonard G. (1996) Beet necrotic yellow vein virus 42 kDa triple gene block protein binds nucleic acid in vitro. J. Gen. Virol. 77 (5), 889-897.

10. Bouzoubaa S., Ziegler V., Beck D., Guilley H., Richards K. Jonard G. (1986) Nucleotide sequence of beet necrotic yellow vein virus RNA-2. J. Gen. Virol. 67, 1689-1700.

11. Carrington J.C, Kasschau K.D., Mahajan S.K., Schaad M.C. (1996) Cell-to-cell and long-distance transport of viruses in plants. Plant Cell. 8 (10), 1669-1681.

12. Caruthers J.M., McKay D.B. (2002) Helicase structure and mechanism. Curr. Opin. Struct. Biol. 12, 123-133.

13. Chapman S., Hills G., Watts J., Baulcombe D. (1992) Mutational analysis of the coat protein gene of potato virus X: effects on virion morphology and viral pathogenicity. Virology. 191 (1), 223-230.

14. Cowan G.H., Lioliopoulou F., Ziegler A., Torrance L. (2002) Subcellular localisation, protein interactions, and RNA binding of potato mop-top virus triple gene block proteins. Virology. 298 (1), 106-115.

15. Donald R.G., Lawrence D.M., Jackson A.O. (1997) The barley stripe mosaic virus 58-kilodalton bb protein is a multifunctional RNA binding protein. J. Virol. 71 (2), 1538-1546.

16. Dunoyer P., Himber C., Voinnet O. (2005) DICER-LIKE 4 is required for RNA interference and produces the 21-nucleotide small interfering RNA component of the plant cell-to-cell silencing signal. Nat. Genet. 37 (12), 1356-1360.

17. Falconi M., Brunelli M., Pesce A., Ferrario M., Bolognesi M., Desideri A.2003) Static and dynamic water molecules in Cu,Zn superoxide dismutase. Proteins. 51 (4), 607-615.

18. Fedorkin O., Solovyev A., Yelina N., Zamyatnin A.Jr, Zinovkin R. and Makinen K., Schiemann J. and Morozov Yu (2001) Cell-to-cell movement of potato virus X involves distinct functions of the coat protein. J. Gen. Virol. 82 (2), 449-458.

19. Forster R.L., Beck D.L., Guilford P.J., Voot D.M., Van Dolleweerd C.J., Andersen M.T. (1992) The coat protein of white clover mosaic potexvirus has a role in facilitating cell-to-cell transport in plants. Virology. 191 (1), 480-484.

20. Forster R.L., Bevan M.W., Harbison S.A., Gardner R.C. (1988) The complete nucleotide sequence of the potexvirus white clover mosaic virus. Nucleic Acids Res. 16 (1), 291-303.

21. Fraenkel-Conrat H., Singer B., Tsugita A. (1961) Purification of viral RNA by means of bentonit. Virology. 14, 54-8.

22. Ghoshroy S., Lartey R., Sheng J., Citovsky V. (1997) Transport of proteins and nucleic acids through plasmodesmata. Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol Biol. 48, 27-49.

23. Gilmer D., Bouzoubaa S., Hehn A., Guilley H., Richards K., Jonard G. (1992) Efficient cell-to-cell movement of beet necrotic yellow vein virus requires 39 proximal genes located on RNA 2. Virology. 189 (1), 40-47.

24. Gorbalenya A.E., Koonin E.V. (1993) Helicases: amino acid sequence comparisons and structure-function relationships. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 419-429.

25. Haywood V., Kragler F., Lucas, W.J. (2002) Plasmodesmata: pathways for protein and ribonucleoprotein signaling. Plant Cell. 14, 303-325.

26. He M., Jin L., Austen B. (1993) Specificity of factor Xa in the cleavage of fusion proteins. J. Protein Chem. 12 (1), 1-5.

27. Heinlein M. (2002) Plasmodesmata: dynamic regulation and role in macromolecular cell-to-cell signaling. Curr Opin Plant Biol 5 (6), 1-10.

28. Herzog E., Hemmer O., Hauser S., Meyer G., Bouzoubaa S., Fritsch C. (1998) Identification of genes involved in replication and movement of peanut clump virus. Virology. 248 (2), 312-322.

29. Homer R.B., Goodman R.M. (1975) Circular dichroism and fluorescence studies on potato virus X and its structural components. Biochim. Biophys. Acta. 378 (2), 296-304.

30. Huisman M.J., Linthorst H.J., Bol J.F., Cornelissen J.C. (1988) The complete nucleotide sequence of potato virus X and its homologies at the amino acid level with various plus-stranded RNA viruses. J. Gen. Virol. 69 (8), 1789-1798.

31. Kadare G., Haenni A.L. (1997) Virus-encoded RNA helicases. J. Virol. 71 (4), 2583-2590.

32. Kalinina N.O., Fedorkin O.N., Samuilova O.V., Maiss E., Korpela T., Morozov S.Yu., Atabekov J.G. (1996) Expression and biochemical analyses of the recombinant potato virus X 25K movement protein. FEBS Lett. 397(1), 75-78.

33. Kalinina N.O., Rakitina D.V., Solovyev A.G., Schiemann J., Morozov S.Yu. (2002) RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first gene of the triple gene block. Virology. 296 (2), 321329.

34. Karpova O.V., Ivanov K.I., Rodionova N.P., Dorokhov Yu.L., Atabekov J.G. (1997) Nontranslatability and dissimilar behavior in plants andprotoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. Virology. 230(1), 11-21.

35. Karpova O.V., Rodionova N.P., Ivanov K.I., Kozlovsky S.V., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G. (1999) Phosphorylation of tobacco mosaic virus movement protein abolishes its translation repressing ability. Virology. 261 (1), 20-24.

36. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Rodionova N.P., Kozlovsky S.V., Arkhipenko M.V., Atabekov J.G. (2003) AFM study of potato virus X disassembly induced by movement protein. J. Mol. Biol. 332 (2), 321325.

37. Koenig R., Torrance L. (1986) Antigenic analysis of potato virus X by means of monoclonal antibodies. J. Gen. Virol. 67, 2145-2151.

38. Koenig R., Tremaine J.H., Shepard J.F. (1978) In situ degradation of the protein chain of potato virus X at the N- and C-termini. J. Gen. Virol. 38, 329-337.

39. Kragler F., Monzer J., Shash K., Xoconostle-Cazares B., Lucas W.J. (1998) Cell-to-cell transport of proteins: requirement for unfolding and characterization of binding to a putative plasmodesmal receptor. Plant J. 15, 367-381.

40. Kwon S.J., Kim K.H. (2006) The SL1 stem-loop structure at the 59-end of potato virus X RNA is required for efficient binding to host proteins and for viral infectivity. Mol. Cells. 21, 63-75.

41. Kwon S.J., Park M.R., Kim K.W., Plante C.A., Hemenway C.L., Kim K.H. (2005) cis-Acting sequences required for coat protein binding and in vitro assembly of Potato virus X. Virology. 334 (1), 83-97.

42. LaemmIi (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 277 (5259), 680-685.

43. Lakatos L., Szittya G., Silhavy D., Burgyan J. (2004) Molecular mechanism of RNA silencing suppression mediated by pl9 protein of tombusviruses. EMBO J. 23 (4), 876-884.

44. Lazarowitz S.G., Beachy R.N. (1999) Viral movement proteins as probes for intracellular and intercellular trafficking in plants. Plant Cell. 11 (4), 535-548.

45. Lucas W.J. (1999) Plasmodesmata and the cell-to-cell transport of proteins and nucleoprotein complexes. J. Exp. Bot. 50, 979-987.

46. Malcuit I., Marano M.R., Kavanagh T.A., De Jong W., Forsyth A., Baulcombe D.C. (1999) The 25-kDa movement protein of PVX elicits Nb-mediated hypersensitive cell death in potato. Mol. Plant- Microbe Interact. 12, 536-543.

47. McGeachy K.D., Barker H. (2000) Potato mop-top virus RNA can moveilong distance in the absence of coat protein: evidence from resistant, transgenic plants. Mol Plant-Microbe Interact. 13 (1), 125-128.

48. Merai Z., Kerenyi Z., Kertesz S., Magna M., Lakatos L., Silhavy D. (2006). Double-stranded RNA binding may be a general plant RNA viral strategy to suppress RNA silencing. J. Virol. 80 (12), 5747-5756.

49. Modena N., Mr odenal A., Zelada A.M., Conte F., Mentaberry. A. (2008) Phosphorylation of the TGBp 1 movement protein of Potato virus X by a Nicotiana tabacum CK2-like activity. Virus Res. 137 (1), 16-23.

50. Morozov S.Yu., Dolja V.V., Atabekov J.G. (1989) Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA-containing plant viruses. J. Mol. Evol. 29 (1), 52-62.

51. Morozov S.Yu., Lukasheva L.I., Chernov B.K., Skryabin K.G., Atabekov J.G. (1987) Nucleotide sequence of the open reading frames adjacent to the coat protein cistron in potato virus X genome. FEBS Lett. 213, 438-442.

52. Morozov S.Yu., Solovyev A.G. (1999) Genome organization in RNA viruses. In Molecular Biology of Plant Viruses, Boston/Dordrecht/London/Kluwer. 47-98.

53. Morozov S.Yu., Solovyev A.G. (2003) Triple gene block: modular design of a multifunctional machine for plant virus movement J. Gener. Virol., 84 (6), 1351-1366.

54. Oparka K.J., Roberts A.G., Roberts I.M., Prior D.A.M., Santa Cruz S. (1996) Viral coat protein is targeted to, but does not gate, plasmodesmata during cell-to-cell movement of potato virus X. Plant J. 10, 805-813.

55. Parker L., Kendall A., Stubbs G. (2002) Surface features of potato virus X from fiber diffraction. Virology 300 (2), 291-295.

56. Petty I.T., French R., Jones R.W., Jackson A.O. (1990) Identification of barley stripe mosaic virus genes involved in viral RNA replication and systemic movement. EMBO J. 9 (11), 3453-3457.

57. Petty I.T., Jackson A.O. (1990) Mutational analysis of barley stripe mosaic virus RNA. Virology. 179 (2), 712-718.

58. Qu F, Ye X, Hou G., Sato S., Clemente T.E., Morris T.J. (2005) RDR6 has a broad-spectrum but temperature-dependent antiviral defense role in Nicotiana benthamiana. J. Virol. 79 (24), 15209-15217.

59. Roberts A.G., Oparka K.J. (2003) Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant Cell Environ. 26, 103-124.

60. Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Atabekov J. G. (2003) Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. J. Mol. Biol. 333 (3), 565-572.

61. Rouleau M., Smith R.J., Bancroft J.B., Mackie G.A. (1994) Purification, properties, and subcellular localization of foxtail mosaic potexvirus 26-kDa protein. Virology. 204 (1), 254-265.

62. Rupasov V.V., Morozov S.Yu., Kanyuka K.V., Zavriev S.K. (1989) Partial nucleotide sequence of potato virus M RNA shows similarities to potexviruses in gene arrangement and the encoded amino acid sequences. J. Gen. Virol. 70(7), 1861-1869.

63. Santa Cruz S., Roberts A.G., Prior D.A., Chapman S., Oparka K.J. (1998) Cell-to-cell and phloem-mediated transport of potato virus X. The role of virions. Plant Cell. 10 (4), 495-510.

64. Shanmugam G., Polavarapu P.L., Kendall A., Stubbs G. (2005) Structures of plant viruses from vibrational circular dichroism. J. Gen. Virol. 86 (8), 2371-2377.

65. Shaw J.G. (1999) Tobacco mosaic virus and the study of early events in virus infections. Phil. Trans. R. Soc. Lond. 354 (1383), 603-611

66. Skryabin K.G., Morozov S.Yu., Kraev A.S., Rozanov M.N., Chernov B.K., Lukasheva L.I., Atabekov J.G. (1988) Conserved and variable elements in RNA genomes of potexviruses. FEBS Lett. 240 (1-2), 33-40.

67. Sober J.P., Jarvekulg L., Toots I., Radavsky J., Villeins R., Saarma M. (1988) Antigenic characterization of potato virus X with monoclonal antibodies. Journal of General Virology. 69, 1799-1807.

68. Solovyev A.G., Savenkov E.I., Grdzelishvili V.Z., Kalinina N.O., Morozov S.Yu., Schiemann J., Atabekov J.G. (1999) Movement of hordeivirus hybrids with exchanges in the triple gene block. Virology. 253 (2), 278287.

69. Soultanas P., Wigley D.B. (2001) Unwinding the 'Gordian knot' ofhelicase action. Trends Biochem. Sci. 26 (1), 47-54.

70. Tozzini A.C., Ek B., Palva E.T., Hopp H.E. (1994) Potato virus X coat protein: a glycoprotein. Virology. 202 (2), 651-658.

71. Tremaine J.H., Agrawal H.O. (1972) Limited proteolysis of potato virus X by trypsin and plant proteases. Virology. 49 (3), 735-744.

72. Tzfira T., Rhee Y., Chen M.H., Kunik T., Citovsky V. (2000) Nucleic acid transport in plant-microbe interactions: the molecules that walk through the walls. Annu. Rev. Microbiol. 54, 187-219.

73. Verchot-Lubicz J. (2005) A new cell-to-cell transport model for potexviruses. Mol. Plant Microbe Interact. 18 (4), 283-290.

74. Verchot-Lubicz J., Ye C.-M., Bamunusinghe D. (2007) Molecular biology of potexviruses: recent advances. J. Gen. Virol., 88 (6), 1643-1655

75. Voinnet O., Lederer C., Baulcombe D.C. (2000) A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103 (1), 157-167.

76. Votchitseva Yu.A., Efremenko E.N., Aliev T.K., Varfolomeyev S.D. (2006) Properties of Hexahistidine -Tagged Organophosphate Hydrolase. Biochemistry (Moscow). 71 (2), 167-172.

77. Waigmann E., Chen M.H., Bachmaier R., Ghoshroy S., Citovsky V. (2000) Regulation of plasmodesmal transport by phosphorylation of tobacco mosaic virus cell-to-cell movement protein. EMBO J. 19 (18), 4875-4884.

78. Wilson T.M.A. (1984) Cotranslational disassembly of tobacco mosaic virus in vitro. Virology. 137 (2), 255-265

79. Xie Q., Guo H.S. (2006) Systemic antiviral'silencing in plants. Virus Res. 118(1-2), 1-6.

80. Yang S.J., Park N.H., Lee T.H., Cha J. (2002) Expression, purification and characterization of a recombinant levan fructotransferase. Biotechnol. Appl. Biochem. 35 (3), 199-203.

81. Yang Y., Ding B., Baulcombe D.C., Verchot J. (2000) Cell-to-cell movement of the 25K protein of potato virus X is regulated by three other viral proteins. Mol. Plant-Microbe Interact. 13 (6), 599-605.

82. Yu B., Chapman E.J., Yang Z., Carrington J.C., Chen X. (2006) Transgenically expressed viral RNA silencing suppressors interfere with microRNA methylation in Arabidopsis. FEBS Lett. 580 (13), 3117-3120.

83. Zaitseva J., Zhang H., Binnie B.A., Hermodson M. (1996) The proteins encoded by the rbs operon of Escherichia coli: II. Use of chimericprotein constructs to isolate and characterize RbsC. Protein Sci. 5 (6), ^1100-1107.

84. Zho F., Tranter G.E., Issacs N.W., Hecht L., Barron L.D. (2006) Delineation of protein structure classes from multivariate analysis of protein Raman optical activity data. J. Mol. Biol. 363 (1), 19-26.