Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизм трансляционной активации РНК потексвирусов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Механизм трансляционной активации РНК потексвирусов"

г-

На правах рукописи

АРХИПЕНКО Марина Владимировна

МЕХАНИЗМ ТРАНСЛЯЦИОННОЙ АКТИВАЦИИ РНК ПОТЕКСВИРУСОВ.

03.00.06 - Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научные руководители:

академик РАН, доктор биологических наук,

профессор Иосиф Григорьевич Атабеков

доктор биологических наук,

профессор Нина Павловна Родионова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Евгений Николаевич Доброе

член-корр. РАСХН, доктор биологических наук,

профессор Сергей Кириакович Завриев

Ведущая организация- Институт физиологии растений

им. К.А. Тимирязева РАН

Защита состоится 8 июня 2005 г. в 10°° часов на заседании Диссертационного совета Д.501.001.76 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, ауд.536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан апреля 2005 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук:

Н О. Калинина

if^kST-

Актуальность проблемы.

Транспорт вирусной инфекции в зараженном растении является одной из наиболее интенсивно изучаемых проблем современной фитовирусологии. Процесс межклеточной транслокации вирусного генома представляет собой частный случай общей физиологической функции транспорта макромолекул в растениях

В момент заражения растения вирусом только небольшое количество клеток оказывается инфицированными. Для развития инфекции необходимо перемещение вируса от зараженных клеток к здоровым. Ранее считалось, что межклеточный транспорт вирусов -процесс пассивный, теперь совершенно очевидно, что в нем играют важнейшую роль специфические вирусные транспортные белки (ТБ). Они обеспечивают как внутриклеточный транспорт вирусного генома от места репликации к плазмодесмам, так и его межклеточный транспорт из зараженной клетки в соседние здоровые..

Объектом нашего исследования являлся X вирус картофеля (ХВК) - типовой представитель рода Potexvirus, содержащий геномную одноцепочечную «плюс» РНК.

Предложены две модели транспорта потексвирусов из клетки в клетку через плазмодесмы: а) перемещение генома в составе вириона (Chapman et al., 1992; Oparka et al., 1996;.Santa Cruz et a/., 1998), либо 6) транспорт генома вируса в составе рибонуклеопротеида, содержащего РНК, белок оболочки (БО) и транспортный белок 1 (ТБ1) (Lough et al, 1998, 2000) В составе транспортной формы РНК должна исключаться из процессов трансляции/репликации и становиться вновь доступной для рибосом при проникновении в здоровую клетку

Ранее в нашей лаборатории было показано, что РНК ХВК, в отличие от РНК вируса табачной мозаики (ВТМ, Tobamovirus), не способна транслироваться in vitro в составе вирусных частиц, но может быть трансляционно активирована двумя разными способами: (¡) в результате фосфорилирования белка оболочки ХВК in situ или (ii) в результате взаимодействия вируса с транспортным белком 1 (ТБ1) (Atabekov et al., 2000, 2001).

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С. Петербург '

Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы было дальнейшее изучение механизмов конверсии в транслируемую форму вирусной РНК в составе нетранслируемых вирионов ХВК. В ' процессе работы решались следующие задачи:

1 Исследование условий конверсии вирионной РНК ХВК в транслируемую форму при взаимодействии транспортного белка 1 (ТБ1) ХВК с вирусной частицей.

2 Изучение условий образования и структуры комплекса ТБ1-ХВК с помощью электронной и атомно-силовой микроскопии.

3. Исследование роли 5'-концевой области в сборке in vitro тройных комплексов (РНК-БО-ТБ1 ХВК) и изучение их способности к трансляционной активации.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые показано, что РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК становится доступной для рибосом не путем котрансляционного раздевания (характерного для ряда фитовирусов), а в результате быстрой и кооперативной разборки нуклеокапсида, индуцируемой рибосомами на начальном этапе трансляции РНК ХВК.

Передача индуцированного транспортным белком сигнала линейной дестабилизации вдоль полярно ориентированного спирального нуклеокапсида, приводящего к кооперативной трансляционной разборке частиц ХВК, представляет собой неизвестный до сих пор способ регуляции трансляции вирусных РНК.

Методами иммуноэлектронной (ИЭМ) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) обнаружено, что РНК-белковое взаимодействие не является определяющим фактором в формировании комплекса ТБ1-ХВК. Значительную роль в этом процессе играют белок-белковые взаимодействия. Образование этого комплекса сопровождается конверсией вирионов ХВК в транслируемую форму и является процессом обратимым и АТФ-независимым.

Показано, что в условиях реконструкции in vitro тройных комплексов РНК-БО-ТБ1 образуются промежуточные «хвостатые» частицы, содержащие спирально упакованные субъединицы на 5'-конце

РНК ХВК; в составе «хвостатых» частиц молекулы ТБ1 ХВК селективно взаимодействуют с субъединицами БО.

Результаты работы могут быть использованы в практике научных исследований в области молекулярной биологии и вирусологии Материалы работы используются при чтении курсов лекций на Биологическом факультете МГУ им М.В.Ломоносова.

i

Апробация работы.

Материалы диссертации долкладывались и обсуждались на XI международном конгрессе «Molecular Plant-Microbe Interactions» (Санкт-Петербург, 2003).; XII Международном вирусологическом конгрессе (Париж, 2002); XIII конгрессе Федерации европейских обществ физиологов растений (Греция, 2002), конференции "Использование достижений современной биотехнологической науки при разработке технологий в агрономии, зоотехнии и ветеринарии" (Брянск, 2002); Международном симпозиуме «Сигнальные системы растительной клетки» (Москва, 2001)

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ.

Структура работы.

Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературу».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

X вирус картофеля (ХВК) относится к группе потексвирусов. i Вирионы ХВК представляют собой гибкие нитевидные частицы длиной

515 нм и диаметром 13.5 нм. Его геном представлен одноцепочечной «плюс» РНК длиной 6345 нуклеотидов (Skryabin et al, 1988) РНК ХВК ' кодирует пять белков: белок массой 165К - вирусная репликаза,

транслируется непосредственно с геномной РНК; три транспортных белка (ТБ1, ТБ2, ТБЗ - продукты «тройного блока генов») и белок оболочки транслируются с субгеномных РНК (Morozov et al., 1991).

Для межклеточного транспорта ХВК необходимы все три транспортных белка, а также белок оболочки (БО) вируса

Наиболее изученным является первый продукт ТБГ массой 25К (ТБ1) ТБ1 способен увеличивать пропускную способность плазмодесм и транспортироваться через них даже в отсутствие других вирусспецифических белков (Angelí et al, 1996; Lough et al, 1998; Yang et al, 2000); содержит последовательности, характерные для хеликаз (Gorbalenya et al, 1988); кроме того 25К обладает активностью Мд2+-зависимой НТФазы, РНК хеликазы и слабой РНК-связывающей активностью (Kalinina et al., 1996, 2001; 2002); N-концевой участок является патогенной детерминантой, узнаваемой растительными факторами и индуцирующей гиперчувствительный ответ в растении-хозяине (Malcuit et al., 1999); а также 25К является супрессором ответа растения на вирусную инфекцию в виде помттранскрипционного умолкания генов (Voinnet et al., 2000)

Основываясь на данных по активации трансляции РНК в комплексе ТБ1-ХВК, мы предположили, что ТБ1, связываясь с одним из концов вириона, возможно сожержащим 5'- конец геномной РНК, индуцирует конформационные изменения (ремодулирует вирусную частицу) в терминальных субъединицах белка оболочки (БО). Вследствие этого РНК становится доступной для рибосом.

I. Взаимодействие транспортного белка ТБ1 с вирионами ХВК является обратимым.

60-минутная инкубация частиц ХВК с транспортным белком ТБ1 (в молярном соотношение РНК ХВК:ТБ1 1:100) в бесклеточной белоксинтезирующей системе (ББС) из Экстракта зародышей пшеницы (ЭЗП) переводит РНК в составе вирионов из нетранслируемой в транслируемую форму (Рис.1 А, дорожки 2, 3 соответственно)

Возникает вопрос: образует ли ТБ1 устойчивый комплекс с вирионами и обратимы ли изменения, вносимые им в структуру ХВК?

Обратимость ТБ1 -зависимой трансляционной активации ХВК была исследована в экспериментах по диссоциации ТБ1-ХВК комплексов в присутствии 0 5% ДСН (додецилсульфат- натрия) и их восстановлению после добавления свежей порции ТБ1.

Препараты ХВК и комплексы ХВК-ТБ1, сформированные при молярном соотношении РНК ХВКТБ1 1-100, центрифугировали (100 000д 2,5 часа) через 30% раствор сахарозы в присутствии 0,5% ДСН и без него (контрольные образцы). Осадки суспендировали и равные аликвоты проб анализировали электрофорезом в ДСН-ПААГ, методом Вестерн-блота и трансляцией в ЭЗП.

1 2 3 4 5 6 7 8

, ? Jvi

i "

Щ * л* ¿Дом»

'

(А) Радиоавтограф (8-20% ДСН-ПААГ) продуктов трансляции в ЭЗП.

1 - РНК ХВК (контроль), 2 - ХВК, 3.- ХВК - ТБ1, 4 -. ХВ(С(0 5% ДСН), 5 - ХВК - ТБ1 (0 5% ДСН), 6 - ХВК (0.5% ДСН) + ТБ1, 7 - ХВК - ТБ1 (0 5% ДСН) + ТБ1; 8.- проба без РНК Пробы 2, 3, 4, 5 центрифугировали 100,000 g 2 5 ч, 4 и 5 - в присутствии 0.5% ДСН Соотношение ТБ1ХВК100 1

Осажденный материал после растворения транслировали в ЭЗП.

Пробы 6 и 7 к пробам 4 и 5 перед началом трансляции добавили ТБ1 в соотношении ХВК • ТБ1 1 100

БО ХВК

В

ТБ1

(В). ' Анализ осажденного материала электрофорезом в ДСН-ПААГ (8-20%)

1. ХВК; 2. ХВК (0.5% ДСН); 3. ХВК - ТБ1, 4. ХВК -ТБ1 (0.5% ДСН)

Вирусные препараты ХВК (пробы 1, 2) и ХВК, инкубированный с ТБ1 (1-100) (пробы 3, 4) центрифугировали 100,000 д25ч; 2 и 4 - в присутствии 0 5% ДСН Осаеденный материал после растворения анализировали в ДСН-ПААГ Гель окрашен Кумасси 6250. Каждая проба содержала 1 мкгХВК

1 2

(С). Иммуноблот с поликлональными антителами к ТБ1.

1. ХВК; 2 ХВК (0 5% ДСН); 3 ХВК - ТБ1; 4 ХВК -ТБ1 (0 5% ДСН); 5. - ТБ1 (контроль) Вирусные препараты ХВК (пробы 1, 2) и ХВК, инкубированный с ТБ1 (1 100) (пробы 3, 4) центрифугировали 100,000 д25ч;2и4-в присутствии 0 5% ДСН. Осажденный материал после растворения анализировали в ДСН-ПААГ Иммуноблот с поликлональными антителами к ТБ1 Каждая проба содержала 1 мкг ХВК,

Рис. 1. Взаимодействие транспортного белка ТБ1 с вирионами ХВК является

обратимым

Прежде всего мы убедились, что присутствие 0.5% ДСН не привело к диссоциации вирусных частиц и не мешает осаждению вируса (Рис 1 В, дорожки 1,2) В то же время, обработка ДСН комплексов ТБ1-ХВК приводила к диссоциации ТБ1 из комплекса (Рис 1 В, дорожки 3,4) Эти данные были подтверждены иммуноблот-анапизом

Иммуноблот с поликлональными антителами к ТБ1 ХВК (Рис 1 С) продемонстрировал, что в случае осаждения необработанного 0 5% ДСН комплекса ТБ-ХВК в осадке действительно присутствует ТБ1 ХВК (Рис 1 С, дорожка 3). Обработка ДСН приводит к диссоциации ТБ1 из комплекса, и в осадке не удавалось обнаружить ТБ1 (Рис 1 С, дорожка 4).

Далее образцы были проанализированы в ЭЗП. Как видно из Рис 1 А (дорожки 2, 4) обработка ХВК 0,5% ДСН не влияла на трансляционные свойства РНК' в составе осажденного вируса РНК не транслировалась в ЭЗП В составе необработанного 0.5% ДСН комплекса ТБ1-ХВК РНК успешно транслировалась (Рис 1 А дорожка 3) В комплексе ТБ1-ХВК, осажденного после обработки 0,5% ДСН, трансляция прекращалась, по-видимому, из-за диссоциации комплекса (Рис 1 С, дорожки 3, 4). При повторном добавлении к этой нетранслируемой пробе свежей порции ТБ1 ХВК в соотношении 100.1, РНК в составе вириона начинала транслироваться вновь (Рис 1 А, дорожка 7) Исходя из полученных данных, можнопредполагать, что конформационные изменения, вносимые ТБ1 при образовании комплекса с вирионом, являются обратимыми

II. Для связывания ТБ1 с ХВК не нужна интактная вирусная РНК.

1 Характеристика частиц ХВК, обработанных смесью РНКаз (ХВКдвгрРНК) и их комплексов с ТБ1.

Ранее с помощью ИЭМ нами было показано, что молекулы ТБ1 селективно взаимодействуют с одним из концов вирусной частицы, предположительно соответствующим 5'-концу РНК Однако роль РНК в этом процессе была неясна.

2,300-10,OOOg

14,000 - 16,000g

2 3 4 1 1T 2 2T 3 3T 4 4T 5 5T 6 6T 7 7T

(а). Характеристика препаратов РНК, выделенных из нативных и

обработанных смесью РНКаз препаратов.

1.2-ВТМ; 3,4-ХВК.

1.3- РНК, выделенная из нативного вируса;

2,4 - РНК, выделенная из вируса, обработанного РНКазами

(b). Электронная микроскопия частиц ХВК, обработанных смесью РНКаз и их комплексов с ТБ1.

1, 2- электронная микроскопия; 3, 4 - иммуноэлектронная микроскопия, диаметр частиц коллоидного золота -10 нм.

1 - нативный ХВК; 2 - ХВКлегрРНК; 3 - комплекс ТБ1-ХВК; 4 - комплекс ТБ1-хвкдегррнк разМерметки-100нм.

(c). Центрифугирование и триптический анализ хВКдвфРНК и комплекса ТБ1-ХВКдетрР

Пробы, содержащие ХВКдефРНК и комплекс ТБ1- ХВКдегрРНК подвергли дифференциальному центрифугированию в течение 10 минут. После чего к пробам добавляли трипсин (обозначен как «Т») и анализировали в ДСН-ПААГ. Комплекс ТБ1- XBKAwpPHK анализировали при 2300а (дорожки 1-1т), 6000д (дорожки 2-2т), 10000д (дорожки 4-4T), 14000д (дорожки 5-51) и при 16000д (дорожки 6-6т);

пробы с хвкдвгр анализировали при б000д (дорожки 3-3') и при 16000д (дорожки 7-7т).

Каждая проба содержала 20 мкг ХВК.

Рис. 2. Характеристика частиц ХВК и ХВК, обработанного смесью РНКаз (ХВКдегрРНк) и их комплексов с ТБ1.

Мы попытались решить эту задачу путем деградации РНК в составе вирусной частицы после их обработки смесью РНКаз: РНКазы А и РНКазы Т1 Обычно инкапсидированная РНК вирусов растений защищена от действия нуклеаз В соответствии с этим, взятая нами в качестве контроля РНК, выделенная из предварительно обработанного аналогичной смесью РНКаз препарата ВТМ, оставалась интактной (Рис 2 а, дорожка 2) В отличие от РНК ВТМ, РНК ХВК в составе вириона оказалась чувствительной к обработке смесью РНКаз в условиях эксперимента (Рис 2 а, дорожка 4): нам не удалось выделить полноразмерную РНК из препаратов ХВК, обработанных РНКазами (ХВКдвфРНК).

Электрофорез в 12% ПААГ (данные не приводятся) показал, что РНК, присутствующая в составе обработанного РНКазами ХВК, находится в виде фрагментов, размер которых не превышал 5-6 нуклеотидов.

Тем не менее, с помощью электронной микроскопии мы показали, что деградация РНК не приводит к разборке вирусной белковой спирали Более того, сравнительный анализ интактных вирусных частиц не выявил морфологических отличий между нативным ХВК и ХВКдегррнк (Рис.2 Ь, 1, 2).

Метод иммуноэлектронной микроскопии позволил обнаружить, что ТБ1 способен избирательно связываться с одним из концов ХВКлвгрРНК, так же как и с нативным вирусом (Рис 2 Ь, 3,4). Исходя из полученных данных, можно сделать следующий вывод- субъединицы белковой спирали после обработки вириона РНКазами, по-видимому, ориентированы так же, как и в нативной вирусной частице, и ТБ1 связывается с оболочкой вирусной частицы независимо от наличия интактной вирусной РНК

Далее мы показали, что при аналитическом центрифугировании нативного ХВК и ХВКявгрРНК коэффицент седиментации хВКдеп,рнк (S2o ш) составлял 157 - 168S, что было близко по своему значению к нативному ХВК (S2o.w около 140S).

В отличие от ХВКдегрРНК примерно 90% комплекса ТБ1-ХВКдефРНК при аналитическом центрифугировании диссоциирует с образованием белковых субъединиц с коэффициентом седиментации 2.8S, что соответствует мономерам молекул белка оболочки (Kaftanova et al.,

1975) Нативный ХВК в комплексе с ТБ1 не подвергался разборке в аналогичных условиях. Таким образом, потеря интактных молекул РНК ХВК в ХВКявфРНК сопровождается, по-видимому, уменьшением стабильности таких частиц по сравнению с нативным ХВК.

Этот вывод был подтвержден далее" еще одним экспериментом по влиянию центробежных сил при центрифугировании на разборку комплексов ТБ1-ХВКАвфРНК Результаты эксперимента представлены на Рис. 2 с.

хвкдегррнк и комплекс уБ1 - ХВК центрифугировали при различных ускорениях, после чего к пробам добавляли трипсин и анализировали в ДСН-ПААГ.

Предложенный нами для выявления разборки белковой спирали вирусных частиц «трипсиновый» тест позволяет четко выявить различия между белком оболочки в свободном состоянии и находящимся в составе белковой спирали вируса. БО в составе вирусной частицы относительно устойчив к действию трипсина известно, что в результате ограниченного гидролиза трипсином отщепляется лишь N-концевой пептид длиной 19-24 аминокислотных остатка (в зависимости от изолята) и полноразмерная форма БО-Ps переходит в укороченную форму БО-Ptd. (Ps - от slow, по результатам электрофоретического анализа; Ptd - от trypsin degradation) (Koenig et al, 1978) Обработка трипсином не собранных в белковую спираль отдельных субъединиц БО приводит к образованию коротких пептидов, которые нельзя обнаружить при электрофорезе в ДСН-ПААГ в наших • условиях. Таким образом, используя обработку трипсином можно получить четкий ответ- находится ли БО в виде отдельных субъединиц или в составе вирусных частиц

По результатам этого теста центрифугирование комплекса ТБ1-хвкдвгррнк с ускорением от 2300д до ЮОО'Од не приводит к разборке белковой спирали (Рис 2 е., дорожки 1-1т, 2-2т, 4-4т) Однако увеличение ускорения до 14-16000д сопровождалось диссоциацией белковой спирали ХВКдефРНК на трипсин-чувствительные субъединицы (Рис 2 с, дорожки 5-5т, 6-6т) В отличие от комплекса ТБ1-ХВКдегрРНК, нативный ХВК не диссоциирует на отдельные белковые субъединицы ни при ускорении 6000 д, ни при ускорении 16000д.

Вероятно, центробежные силы, возникающие при центрифугировании, явились толчком (триггером) для перехода

комплекса ТБ1-ХВКдвфРНК из метастабильного состояния к разборке белковой спирали частицы на субъединицы, что подтвердили данные, полученные методом атомно-силовой микроскопии (АСМ).

2. Изучение методом атомно-силовой микроскопии разборки ХВК, индуцируемой транспортным белком.

АСМ обладает высокой разрешающей способностью и позволяет исследовать механические свойства макромолекул, а также проводить измерения вирусных частиц и вирусных нуклеопротеидных комплексов

Методом АСМ были проанализированы комплексы ТБ1-ХВК в различных молярных соотношениях, а так же в различных средах - в воздушной и жидкой. Результаты представлены на Рис.3

Комплексы формировали при молярном соотношении ТБ1-ХВКот 1:1 до 100:1. Мы не обнаружили морфологических изменений в комплексах ни при исследовании в жидкой, ни в воздушной средах, если они были сформированы при низком молярном соотношении (1 1 или 101) (Рис 3 а, Ь) Значительные изменения в структуре комплекса наблюдались при анализе в воздушной среде комплексов ТБ1-ХВК, если они были сформированы в молярном соотношении 25'1 и 1001 (Рис 3 с, d)

Структуры, показанные на Рис 3 (с, d), которые можно назвать «бусы на нитке», возможно, представляют собой продукты деградации частиц ХВК, опосредованные взаимодействием ТБ1 с вирусом Скорее всего, «бусы» - группы субъединиц белка оболочки, разделенные участками РНК Деградация была строго ТБ1-зависимая, так как мы не смогли обнаружить признаков разборки вирусной частицы в отсутствии ТБ1.

Ю

Рис.3. ACM комплексов ХВК-ТБ1.

Вирусные препараты инкубировали с ТБ1 в следующих молярных

соотношениях:

а.1:1; Ь. 1:10; с. 1:25; d.1:100.

Образцы высушивали на воздухе.

Частота колебаний консоли 300-350 кГц.

Важно отметить, что длина частиц «бусы на нитке» не отличалась от длины нативйого препарата ХВК (Рис 4 а, Ь) Данные, приведенные на Рис 4, позволяют предположить, что отделение субъединиц белка

и

оболочки от частиц ХВК происходит после адсорбции и фиксации на поверхности субстрата.

Рис.4. Распределение длины частиц для нативного ХВК (а) и комплексов ТБ1-ХВК, сформированных в молярном соотношении 100:1 (Ь).

Число частиц, измеренных для каждой гистограммы 290.

С помощью АСМ мы обнаружили морфологическое сходство между нативными частицами ХВК и ХВК с деградированной РНК (Рис 5 а), что согласовалось с результатами, полученными методом ЭМ. Однако, несмотря на морфологическую целостность частиц ХВКдефРНК, деградация вирионной РНК привела к значительной дестабилизации структуры. При анализе комплекса ТБ1- ХВКлирРНК АСМ мы обнаружили вместо ХВК-подобных частиц (Рис. 5 а) структуры, представленные на Рис 5 Ь. По-видимому, вирусная частица с деградированной РНК при взаимодействии с ТБ1 диссоциирует с образованием белковых субъединиц. Интересно, что этот результат был получен как в воздушной, так и в водной средах.

Глобулярные частицы на Рис 5 Ь, могут представлять собой мономеры белка оболочки вируса и его агрегаты Измерение высоты и, следовательно, диаметра этих структур показало их неоднородность: высота изменялась от 3.5 до 20.0 нм. Возможно, частицы с меньшим значением (3.5-4.5 нм) представляют собой мономеры белка оболочки, а с большим - агрегаты белковых субъединиц

По-видимому, взаимодействие ТБ1 с ХВК или хВКАвфРНК приводит к линейной дестабилизации вирусной частицы. Хотя вирусные частицы и не подвергались полной разборке в результате взаимодействия ТБ1 с ХВК (в отличие от комплекса ТБ1-ХВКдефРНК), мы могли наблюдать структурные изменения, вносимые транспортным белком в виде «разрыхления» вирусной частицы («бусы на нитке»). Эти различия, возможно, связаны с наличием неповрежденной РНК в вирусных частицах, т.е., с РНК-белковыми взаимодействиями. В любом случае, взаимодействие транспортного белка с вирусной частицей приводит к конформационным изменениям, которые передаются с одного конца частицы по всей длине белковой спирали.

Рис.5. АСМ частиц ХВК, обработанных смесью РНКаз и продуктов диссоциации в результате взаимодействия XBKAerpf>HK с транспортным белком.

(a). ХВК, обработанный смесью РНКаз

Очищенный вирусный препарат (1 мкг) инкубировали 25 минут при комнатной температуре с РНКазой А (0 25 мкг) и РНКазой Т1 (2 единицы)

(b). Диссоциация на белковые субъединицы хВК>вгрР после инкубации с ТБ1 (молярное соотношение ТБ1 • хвКдефРНК 100:1).

Размер метки 500 нм.

III. Особенности трансляционной разборки ХВК.

Как уже говорилось, взаимодействие ТБ1 с ХВК в условиях ЭЗП является обратимым. Неясно, на какой стадии происходит диссоциация комплекса, и какие факторы принимают в этом участие

В следующих наших экспериментах мы попытались выяснить, на каком этапе трансляции РНК становится доступной для рибосом

1. ТБ1-зависимая разборка ХВК на стадии инициации и начальных этапах транслокации трансляции.

Как уже говорилось, «трипсиновый» тест позволяет четко выявлять различие между белком оболочки в свободном состоянии или находящимся в составе белковой спирали вирусной частицы Мы использовали этот тест для анализа относительной эффективности разборки вирусной частицы в процессе трансляции.

После инкубации в бесклеточной белоксинтезирующей системе нативного ХВК в течение 60 минут и дальнейшей обработки инкубационных проб трипсином, мы наблюдали лишь переход белка оболочки из полноразмерной формы Ps в процессированную Ptd-форму (Рис 6 А, дорожки 1, 2). Аналогичную картийу наблюдали также при добавлении в ББС ХВКдефРН,< частиц (Рис 6 В, дорожки, 1, 2) Таким образом, по результатам «трипсинового» теста при инкубации в ББС нетранслируемых частиц (ХВК и ХВКдв,рРНК) не происходит разборки белковой спирали Совершенно другие результаты были получены с транслируемыми формами ХВК: полная разборка БО ХВК обнаружена на ранних стадиях трансляции РНК в составе ТБ1-ХВК комплексов (Рис. 6 А, дорожки 3-4; Рис. 6 С, дорожки 7-8). БО ХВК быстро переходил в чувствительную к трипсину форму после 10 минут инкубации (и даже после 2-3 минут). Мы предположили, что быстрая и, возможно, кооперативная разборка белковой оболочки вируса происходит на ранних этапах трансляции РНК в комплексе ТБ1-ХВК. В контрольном опыте было показано, что после трех минут трансляции свободной РНК ХВК в ДСН-ПААГ не выявляются Б^-меченные продукты трансляции.

В отличие от этого в случае трансляции РНК в составе фосфорилированног in situ ХВК-Р в ЭЗП в течение десяти минут, БО при

обработке трипсином остается в виде белковой спирали (Ps-форма переходит в Ptd-форму) (Рис б А, дорожки 7, 8)

Мы сравнили кинетику синтеза белков, направляемых in vitro свободной РНК, РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК и РНК в составе предварительно фосфорилированного ХВК-Р

Скорость трансляции свободной РНК и РНК в составе комплекса ТБ1-ХВК была сходной (данные не приводятся) С другой стороны наблюдалась задержка синтеза белков в случае ХВК-Р по сравнению с изолированной РНК и комплексом ХВК-ТБ1

Эти данные позволили предположить существование различий в разборке вирусных частиц в ходе трансляции РНК в составе фосфорилированного вируса по сравнению с комплексом транспортного белка с ХВК.

В следующей серии экспериментов мы предприняли попытку выяснить, какой этап трансляции необходим для индукции разборки вирионов ХВК в составе ТБ1-ХВК комплекса.

Известно, что отсутствие инициаторной тРНК"®7, связанной с метионином, ингибирует инициацию трансляции на стадии образования тройного комплекса (Levin et al., 1973; Hunter et al., 1977). В согласии с этим, после инкубации комплекса ТБ1-ХВК и нативного вируса в ЭЗП без метионина, БО остается в виде белковой спирали - то есть, в отсутствие инициации трансляции разборка ХВК не происходит (Рис 6 В, дорожки 5, 6,9,10).

Далее мы использовали ингибитор инициации трансляции -фторид натрия.

Фторид натрия не ингибирует образования тройного комплекса и позволяет 40S субъединице рибосомы связываться с 5'-концом РНК, но предотвращает формирование стабильного 80S инициаторного комплекса.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12

— БО-Ps

— БО-Ptd

1.-2. ХВК инкубировали 60 мин; 3.-4 ХВК + ТБ1 инкубировали 10 мин; 5. - 6. ХВК + ТБ1 инкубировали 60 минут; 7. - 8. ХВК-Р инкубировали 10 мин; 9. -10. ХВК-Р инкубировали 60 минут; 11. -12 Проба без ХВК (ЭЗП)

В

БО-Ps БО-Ptd

1.-2. ХВК, обработанный РНКазой (ХВКдеф ,рнк), 3. - 4. ХВКдегр РНК + ТБ1; 5.-6 ХВК + ТБ1 в отсутствие метионина, 7.-8. ХВК + ТБ1; 9. -10. ХВК в отсутствие метионина, 11. - 12. Проба без ХВК (ЭЗП), Пробы инкубировали 60 минут

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 121314

БО-Ps БО-Ptd

I.-2. ХВК; 3.-4 БО ХВК, 5. - 6. ХВК-Р; 7.-8 ХВК + ТБ1, 9. - 10. ХВК-Р,

II. - 12.ХВК + ТБ1,13. -14.Проба без ХВК.

Все пробы инкубировали в ЭЗП в течение 10 мин Пробы 9 -12 перед добавлением матрицы инкубировали 2 мин в присутствии 24тМ №Р

1 2 3 4 5 6

БО-Ps БО-Ptd

1.-6 ХВК + ТБ1 + циклогексимид ; 1. - 2 циклогексимид добавлен одновременно с ХВК 3.-4 циклогексимид добавлен через Юмин после начала трансляции; 5. - 6. циклогексимид добавлен в ЭЗП перед добавлением матрицы. Все пробы инкубировали 10 минут.

Рис. 6. Разборка ХВК происходит на начальном этапе элонгации трансляции ТБ1-ХВК комплекса. Анализ БО при обработке трипсином. Пробы (1 мкгХВК или БО ХВК) инкубировали в ЭЗП.

В пробах 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения на ПААГ. К пробам 2, 4, 6, 8,10,12,14 добавляли трипсин (6 нг) и дополнительно инкубировали 2 часа при +37°С; реакцию останавливали добавлением буфера для нанесения на ПААГ Гель окрашен Кумасси G-250 Конечная концентрация циклогексимида 1 тМ,

Добавление фторида натрия в трансляционную смесь при анализе нативного ХВК и комплекса ТБ1-ХВК полностью блокировало их трансляционную разборку (Рис 6 С., дорожки 11, 12). Можно сделать вывод, что ингибирование инициации трансляции произошло на этапе формирования 48S инициаторного комплекса. Соответственно возникает вопрос: необходима ли только стадия инициации трансляции для разборки ХВК или в этом процессе важен и этап элонгации?

Ингибитором элонгации полипептидной цепи на стадии транслокации является циклогексимид (ЦГ)- Мы использовали этот ингибитор в коцентрации 1тМ. Циклогексимид при добавлении в ЭЗП должен был блокировать 80S инициаторный комплекс на вирусной РНК

Как следует из Рис. 6 D, присутствие ЦГ не предотвращает разборку ТБ1-ХВК комплекса, если ЦГ был добавлен через 10 минут после начала трансляции в ЭЗП или практически одновременно с комплексом ТБ1-ХВК (Рис 6 D, дорожки 1-4) Однако при добавлении ЦГ в ЭЗП перед матрицей, дальнейшая инкубация в системе не приводила к разборке белковой спирали в составе комплекса ТБ1-ХВК (Рис 6 D. дорожки 5, 6). Скорее всего, добавление ЦГ практически одновременно («мертвое» время 30 секунд) с матрицей допускает прохождение первых актов транслокации при трансляции РНК. На основании полученных данных можно сделать следующий вывод: инициация и начальные этапы элонгации трансляции необходимы для индукции процесса быстрой разборки вирусной белковой спирали.

Быструю и, возможно, кооперативную разборку белка оболочки в комплексе ТБ1-ХВК, индуцируемую рибосомами после инициации трансляции, мы показали также при фракционирование в градиенте концентрации сахарозы комплексов ТБ1-ХВК, проинкубированных в ЭЗП в течение 2-3 минут.

БО ХВК был обнаружен Вестерн-блотом в верхней фракции градиента сахарозы при инкубации в ЭЗП комплекса ТБ1-ХВК, при этом в придонной фракции вирусные частицы обнаружить не удалось Нативный ХВК выявляется только в придонных фракциях градиента сахарозы (данные не приводятся).

Для прямой детекции ТБ1-зависимого освобождения РНК ХВК в ЭЗП использовали метод обратной транскрипции с последующей амплификацией (RT-PCR) Из Рис. 7 видно, что З'-проксимальная

область БО доступна для ВТ в свободной РНК (дорожка 2) и недоступна

в нативном ХВК (дорожка 3) В случае добавления ЦГ в ЭЗП перед комплексом ТБ1-ХВК, З'-концевые фрагменты РНК ХВК не выявляются среди продуктов ЯТ-РСЯ (дорожка 5) Однако добавление ЦГ в ЭЗП после матрицы не предотвращает разборку комплекса ТБ1-ХВК З'-конец РНК становится доступным для ЯТ (дорожка 6) Свободный З'-конец РНК ХВК не обнаруживается среди продуктов ЯТ-РСЯ после инкубации ХВК-Р в ЭЗП (дорожка 4).

1 2 3 4 5 6 М

Рис.7. З'проксимальная область РНК ХВК выявляется RT-PCR при ТБ1-зависимой разборке ХВК в ЭЗП.

1 проба без ХВК, 2 РНК ХВК, 3 ХВК, 4 ХВК-Р, 5-6 ХВК-ТБ1, М - маркеры молекулярного веса (1Kb Plus DNA Ladder)

Пробы 1-6 инкубировали в ЭЗП, к 1-4, 6 ЦГ добавляли через 3 минуты после начала реакции; 5 ЦГ добавляли за 30 секунд до добавления матрицы Все пробы инкубировали в ЭЗП в течение 3 минут

В качестве праймера для RT был использован олиго d(T)i2 is комплементарный к З'-полиаденилированному району РНК ХВК, кДНК амплифицировали (ПЦР) с использованием

позитивных и негативных праймеров, комплементарных с 5646-5665 и 6362-6347 геномной РНК ХВК, соответственно.

Продукты амплификации разделяли в 1% агарозном геле и окрашивали бромидом этидия.

IV. Исследование свойств тройного комплекса реконструированного in vitro из РНК, белка оболочки и транспортного белка ХВК.

Для выяснения роли РНК-белковых взаимодействий в процессе связывания транспортного белка с вирусной частицей мы попытались получить in vitro реконструированный тройной комплекс РНК-ТБ1-БО ХВК. Результаты таких экспериментов могли бы внести свой вклад в

изучение проблемы транспорта вируса по зараженному растению, так как такие комплексы предположительно являются транспортной формой

хвк.

В связи с этим мы поставили задачу исследовать условия сборки in vitro тройных комплексов и изучить их способность к трансляционной активации.

Инкубируя изолированные из очищенных вирионов ВО и РНК в различных молярных соотношениях, мы получили реконструированные РНП-частицы и проанализировали их методом ЭМ. Как видно из Рисунка 8, частицы представляют собой структуры с одним неодетым «хвостом» РНК и белковой «головкой», локализованной, предположительно, на 5'-конце молекулы РНК.

\

Рис.8. ЭМ реконструированных in vitro частиц ХВК.

Молярное соотношение РНК ХВКБО ХВК 1.700 Реконструкция проводилась в течение 1 часа при комнатной температуре. Для освобождения от не связавшегося белка препарат два>еды центрифугировали при 40 т об./мин 2 часа Напыление платиной под углом порядка 7° Бар - 250 нм.

Можно было бы предположить, что, если сборка начинается с 5'-конца, то при частичном одевании белком оболочки РНК ХВК в реконструированных частицах ее трансляция ингибируется. В связи с

этим в серии дальнейших экспериментов мы изучили способность к трансляции РНК в составе «однохвостых» частиц ХВК (Рис 9).

В качестве контрольных проб использовали следующие три образца, в соответствии с нашими прежними результатами- (i) инкапсидированная РНК ХВК не транслировалась in vitro (Рис 9, дорожка 1); но (ii) активировалась в составе вирусной частицы после добавления ТБ1 (Рис. 9, дорожка 2); (ш) ТБ1 не ингибировап трансляцию свободной РНК ХВК (Рис. 9, дорожки 3,4).

1 23456789 10

165К

Рис. 9. Влияние ТБ1 на трансляцию РНК в составе нативных и реконструированных вирусных частиц.

1 ХВК (РНК в составе вирионов), 2. Комплекс ХВК-ТБ1 в молярном соотношении 1.100, 3 РНК ХВК, 4. Комплекс РНК ХВК-ТБ1 в молярном соотношении 1 100; 5 Реконструированные вирусные'частицы: РНК ХВК-БО ХВК в молярном соотношении 1 700, 6 к частицам, как описывали в (5), добавляли ТБ1 в молярном соотношении 1-100 (РНК:ТБ1), 7. Реконструированные вирусные частицы- РНК ХВК-БО ХВК в молярном соотношении 12100, 8 к частицам, как описывали в (7), добавляли ТБ1 в молярном соотношении 1-100 (РНКТБ1), 9 К РНК ХВК, инкубированной как в (4), добавлен БО в молярном соотношении 1 700, 10, К РНК ХВК, инкубированной как в (4), добавлен БО в молярном соотношении 1 2100 Радиоавтограмма 8-20% ПААГ Концентрация РНК в ЭЗП составляла 40 мкг/мл

Стрелкой указано положение вирусспецифического продукта - РНК-полимеразы (165К)

Из Рис. 9 видно, что при инкубации РНК с ВО в молярных соотношениях 1 700 способность к трансляции РНК значительно падала (Рис 9, дорожка 5) РНК полностью теряла способность транслироваться после инкубации с БО в молярном соотношении 12100 (для полного одевания вирусной РНК необходимо соотношение РНКБО 1:1500) (Рис 9, дорожка 7) Однако эффективность трансляции реконструированных частиц полностью восстанавливалась при добавлении к ним ТБ1 (молярное соотношение РНК:ТБ1 1Ю0) (Рис 9, дорожки 5-6, 7-8)

Надо заметить, что в экспериментах, где вирусную РНК преинкубировали с ТБ1 (Рис 9, дорожка 4), а затем в инкубационную смесь добавляли БО, трансляция несколько ингибировалась (Рис 9, дорожка 9, 10). Это наблюдение может быть объяснено следующим предположением- хотя преинкубация РНК с ТБ1 не препятствует трансляции РНК, эффективность сборки транслируемых тройных комплексов (ТБ1-РНК-БО) в этих условиях изменяется.

Дальнейшим доказательством участия 5'-конца РНК ХВК в инициации сборки вирусных РНП послужили опыты по «аресту» трансляции.

Для «ареста» трансляции был взят олигодезоксирибонуклеотид (5'-dGGTTTGGTTGTGTTG-3'), комплементарный 5'-концевой нетранслируемой области РНК ХВК (с 22 по 36 нуклеотид и частично - с 2 по 12 нуклеотид).

Как видно из Рис 10 В (дорожка 2), трансляция нативной РНК ХВК полностью блокируется после ее предварител'ьной инкубации с олигодезоксирибонуклеотидом, так же как и трансляция РНК, выделенной из реконструированных вирусных частиц, обработанных микрококковой РНКазой (МН) (Рис 10 В, дорожка 5).'

Для получения фрагментов РНК ХВК, защищенных белком оболочки, мы обработали реконструированные вирусные частицы МН, в условиях, когда инкапсидированная часть РНК былй не чувствительна к действию нуклеазы, после чего частицы подвергли фенольной депротеинизации Полученные таким образом фрагменты РНК ХВК, защищенные от действия МН, анализировали в агарозном геле

Как видно из Рисунка 10 А, РНК ХВК, выделенная из реконструированных «одно-хвостых» вирусных частиц, собранных при соотношении РНК ХВК БО ХВК 1 700, разделяется в 1% агарозном геле

на три полосы, соответствующие 400-500, 700-800.и 2000 нуклеотидам. (Рисунок 10 А, дорожка 3).

Трансляция в ЭЗП фрагментов РНК ХВК, защищенных от действия МН, сопровождалась появлением гетерогенного набора полипептидов (Рис.10 В, дорожка 4). Интересно отметить, что в этом наборе отсутствовал белок с молекулярной массой 165К - продукт вирусной репликазы, что свидетельствует о том, что длинные 5'-концевые фрагменты РНК ХВК, соответствующие полному гену репликазы, отсутствуют в таких препаратах

Еще одно доказательство участия 5'-конца РНК ХВК в инициации сборки вирусной частицы было получено при использовании метода обратной транскрипции с последующей амплификацией продуктов (RT-PCR). На Рис 10 С (дорожки 1, 2) показано, что в случае реконструкции при молярном соотношении РНКБО 1:350 среди продуктов RT-PCR могут быть выявлены только 5'-концевые фрагменты РНК ХВК (Рис 10 С, дорожка 2) З'-концевые фрагменты не обнаруживались (Рис 10 С, дорожка 1) Подобно этому, при увеличении молярного соотношения до 1 700 и 1 2100 (Рис 10 С, дорожки 3-6) также преобладающая часть продуктов являлась 5'-концевыми (Рис 10 С, дорожки 4, 6). Лишь незначительное количество продуктов амплификации соответствует 3'-концевому домену РНК ХВК (Рис 10 С, дорожки 3, 5) На Рисунке 10 С дорожки 7-12 представлены контрольными образцами

Все вместе взятое говорит в пользу того, что 5'-концевые фрагменты вирусной РНК избирательно одеваются БО в реконструированных вирусных частицах.

Полученные результаты позволяют утверждать, что связывание ТБ1 с одним из концов частицы ХВК, содержащим 5' конец РНК, вызывает изменения в терминальных белковых субъединицах, которые передаются от одного конца частицы к другому вдоль всей белковой спирали, приводя к ремодулированию нуклеокапсида ХВК.

Передача индуцированного транспортным белком сигнала линейной дестабилизации вдоль полярно ориентированного спирального наклеокапсида, приводящего к кооперативной трансляционной разборке частиц ХВК, является неизвестным до сих пор способом регуляции трансляции вирусных РНК.

А. Характеристика препаратов РНК, выделенных из обработанных микрококковой нуклеазой вирусных частиц.

1 РНК, выделенная из нативного вируса, 2. РНК ХВК, обработанная МН; 3. РНК, выделенная из реконструированных чатиц, обработанных МН;4 РНКВМК (маркер): арабскими буквами обозначеньг РНК1+2 ВМК (3234 нуклеотидов и 2868 нуклеотидов -соответственно), 3 -РНК 3 ВМК-2114 нуклеотидов , 4 -РНК 4 ВМК-876 нуклеотидов

B. Арест трансляции РНК в составе реконструированных вирусных частиц.

1 РНК ХВК; 2. РНК ХВК н-олигонуклеотид; 3. РНК ХВК, обработанная МН; 4. РНК, выделенна из реконструированных частиц, обработанных МН (молярное соотношение РНК ХВК:БО ХВК 1:700); 5. к частицам, как в (4), добавлен олигонуклеотид.

Пробы 2 и 5 перед трансляцией инкубировали с комплементарным к 5'-концу РНК ХВК олигодезоксирибонуклеотидом 5'-dGGTTTGGTTGTGTTG-3' при 4°С, 12-14 часов, а затем добавляли в ЭЗП.

Радиоавтограмма (8-20% ДСН-ПААГ) продуктов трансляции РНК ХВК Концентрация РНК в ЭЗП составляла 49 мкг/мкл Стрелкой указано положение вирусспецифического продукта - РНК-полимеразы.

C. RT-PCR анализ 5'-концево области реконструированных вирусных частиц, обработанных микрококковой нуклеазой.

м. маркеры молекулярного веса (Lamda DNA EcoRI+Hindlll, 1 мкг); 1-6. РНК выделена из обработанных МН реконструированных частиц в молярном соотношении 1 350 (13), 1:700 (3-4). 1:2100 (5-6). Для анализа использовали позитивные и негативные праймеры с 21-40 и 981-950 нуклеотиды к 5'-концевой области (3, 5, 7, 9, 11, 13) и 5646-5665 нуклеотиды к З'-концевой области (2, 4, 6, 8, 10, 12); 7-8,- негативные контрольные образцы РНК ХВК, обработанные МН; 9-10. РНК, изолированная из ХВК, обработаного МН; 11-12. позитивный контроль с РНК, выделенной из нативного ХВК. Стрелками указано положение ДНК маркеров.

Продукты амплификации разделяли в 1% агарозном геле и окрашивали бромидом этидия.

Рис. 10. 5' -концевая область РНК ХВК защищена белком оболочки.

Выводы.

1 После обработки смесью РНКаз получили XBKAefpPHK частицы, не содержащие интактную РНК и морфологически не отличающиеся от нативного ХВК.

2 Показано, что для образования комплекса ТБ1-ХВК не нужна интактная РНК Молекулы ТБ1 селективно взаимодействуют с субъединицами БО, расположенными на 5'-конце РНК, что приводит к линейной дестабилизации белковой спирали в комплексах ТБ1-ХВК и ТБ1-ХВКлефРНК.

3 Для разборки дестабилизированной белковой спирали в комплекса требуются дополнительные факторы:

а) частицы ХВК быстро и кооперативно разбираются на начальных этапах трансляции РНК в комплексах ТБ1-ХВК;

б) разборка белковой спирали ТБ1-ХВКАегрРНК происходит при центрифугировании и в условиях АСМ.

4 Реконструированные in vitro из БО и РНК ХВК не полностью одетые белком оболочки РНП-частицы трансляционно активируются при связывании ТБ1. Сборка частиц инициируется с 5'-конца РНК ХВК.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

Статьи:

1. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Rodionova N P., Kozlovsky S V., Arkhipenko M.V., Atabekov J.G. AFM study of Potato virus X disassembly induced by movement protein. // J. Mol. Biol., 2003, 332, № 2, p. 321-325.

2. Rodionova N.P., Karpova OV„ Kozlovsky SV„ Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Atabekov J G. Linear remodeling of helical virus by movement protein binding II J. Mol Biol, 2003 , 333, №3, p 565-72

3. Козловский С.В , Карпова О В., Архипенко М В., Заякина О В.,. Родионова Н.П , академик Атабеков И Г. Влияние N-концевой области белка оболочки Х-вируса картофеля на структуру вирусных частиц.//ДАН, 2003, 391, №1.

4. Карпова О В., Козловский С В., Архипенко М В , Заякина О.В., Решетникова В.Г, Родионова Н.П., академик Атабеков И Г. Сравнительная характеристика протеинкиназ, фосфорилирующих in vitro транспортный белок ВТМ. II ДАН, 2002, 386, № 6.

5 Atabekov JG., Rodionova NP, Karpova O.V, Kozlovsky SV., Novikov VK., and Arkhipenko M.V. Translational activation of f encapsidated potato* virus X RNA by coat protein phosphorylation. //

Virology, 2001, 286, 466-474. ^ 6 Карпова O B., Козловский С В , Архипенко М.В., Родионова Н П.,

' академик Атабеков И Г Комплексы РНК ВТМ с транспортным

белком гордеивируса инфекционны в растениях, восприимчивых к обоим вирусам. ДАН, 1999, 368, № 3, 406-409.

7 Rodionova N. Karpova О Kozlovsky S Zayakina О. Arkhipenko M Kiselyova О., Yaminsky I Atabekov J Translational activation of potato virus X RNA by binding of movement to one end of the virion. // Proceedings of the -11th International Congress on Molecular Plant-Microbe Interaction, 2003, 77-80

Тезисы:

1 Rodionova N. Karpova O. Kozlovsky S Zayakina O. Arkhipenko M Kiselyova О Yaminsky I Atabekov J Translational activation of potato virus X RNA by binding of movement to one end of the virion II Abstracts of 11й International Congress on Molecular Plant-Microbe Interactions, St.-Petersburg, Russia, 18-26 July 2003, OSY025, p 36

2 Заякина O B., Родионова Н.П., Карпова О В., Козловский С В , Архипенко М В., Атабеков И Г Два способа трансляционной активации РНК в составе частиц Х-вируса картофеля // Материалы конференции "Использование достижений

\ современной биотехнологической науки при разработке

технологий в агрономии, зоотехники и ветеринарии", Брянск, 3-5 декабря 2002 г., 16-17 4 3 Zayakina О V., Karpova O.V, Arkhipenko M.V , Kozlovsky S V ,

Rodionova N.P., and Atabekov J G. The role of plant protein kinases in translational activation of potato virus X RNA. // Abstracts of 13-Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, Hersonissos, Crete, Greece, 2-6 Septemper2002, P474, p. 703.

4 Kozlovsky S.V., Rodionova N P., Karpova O V, Archipenko M V, and Atabekov J.G Two ways of encapsidated potato virus X RNA translational activation. //Abstracts of XIIa International Congress of Virology, Paris, France, 27 July - 1 August, 2002, 112-V-907, p 305

5 Kozlovsky S V., Karpova O V, Arkhipenko M V, Rodionova N.P , Atabekov J G Coordinations of protein kinase and protein phosphatase activities in nicotiana glutinosa leaves infected by potato virus X. // Abstracts of International Symposium "Signaling Systems of Plant Cells", Moscow, Russia, 5-7 June, 2001, p. 28-29

6 Rodionova N P., Karpova O V, Kozlovsky S V., Archipenko M V, Poljakov V Yu., and Atabekov J G. The movement protein TGBpl of potato virus X converses virion RNA from nontranslatable into a translatable form // Abstracts of EMBO Workshop "Plant Virus Invasion and Host Defence", Kolymbari, Crete, Greece, 28 May -1 June, 2000, p. 70

Подписано в печать 21.04.2005 Объем 2.0 печ.л. Тираж 100 экз. Заказ № 72 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119992, г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. 102

РНБ Русский фонд

2005-4 45457

79 МАи 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Архипенко, Марина Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СТРОЕНИЕ ПЛАЗМОДЕСМ

ТРАНСПОРТ ВИРУСОВ В РАСТЕНИЯХ

Ближний транспорт

Дальний транспорт

ВИРУСЫ, КОДИРУЮЩИЕ ТРОЙНОЙ БЛОК 22 ГЕНОВ (ТБГ)

Организация генома вирусов семейства 23 Tubiviridae

Организация генома вирусов семейства 24 Potexviridae

БЕЛКИ ТРОЙНОГО БЛОКА ГЕНОВ

БЕЛКИ ТБ

Структурная организация ТБ

Биохимические свойства ТБ

Функциональные свойства ТБ

Внутриклеточная локалтзация

БЕЛКИ ТБ2 и ТБЗ

Структурная организация ТБ2 и ТБЗ

Внутриклеточная локализация ТБ2 и ТБЗ

Функциональные свойства

ТРАНСПОРТ ТГБ - СОДЕРЖАЩИХ ВИРУСОВ

Роль белка оболочки в межклеточном транспорте

Транспортная форма потексвирусов

Предполагаемый механизм транспорта ТБГ- 51 содержащих вирусов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Заражение растений ХВК

Выделение препарата Х-вируса картофеля

Обработка препаратов ХВК трипсином

Экспрессия рекомбинантных белков

Хроматографическая очистка (Гис)^- 57 рекомбинантных белков на Ni2+-нитрилотриацетатной агарозе

Трансляция в бесклеточной белоксинтезирующей ^ системе из экстракта зародышей пшеницы

Выделение белка оболочки ХВК

Электрофоретический анализ белков в 58 денатурирующем полиакриламидном геле

Иммуноблот-анализ

Выделение препаратов различных фракций из гомогената листьев N.tabacum и N.glutinosa

1. Получение препарата фракции клеточных 60 стенок

2. Получение препарата растворимой 61 (цитоплазматической) фракции

Фосфорилирование in vitro

Выделение РНК из вирусных препаратов ХВК

Электрофорез РНК в агарозном геле

Электрофорез РНК в ПААГ

Иммуноэлектронная микроскопия комплексов 64 ХВК-ТБ1 ХВК

Атомно-силовая микроскопия

Получение вРНП

РЕЗУЛЬТАТЫ

I. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ТРАНСПОРТНОГО БЕЛКА

ТБ1 С ВИРИОНАМИ ХВК ЯВЛЯЕТСЯ ОБРАТИМЫМ

II. ДЛЯ СВЯЗЫВАНИЯ ТБ1 СХВК НЕ НУЖНА

ИНТАКТНАЯ ВИРУСНАЯ РНК

1. Характеристика частиц ХВК, обработанных смесью РНКаз (ХВКдегрРНК) и их 69 комплексов с ТБ1.

2. Изучение методом атомно-силовой микроскопии разборки ХВК, индуцируемой транспортным белком III. ОСОБЕННОСТИ ТРАНСЛЯЦИОННОЙ РАЗБОРКИ ХВК

1. Кинетика трансляционной активации 79 РНК в составе комплекса ХВК-ТБ1 и фосфорилированного ХВК.

2. ТБ1-зависимая разборка ХВК на стадии инициации и начальных этапах транслокации трансляции.

3. Фракционирование в градиенте концентрации сахарозы комплексов ТБ1-ХВК и ХВК-Р, проинкубированных в ЭЗП

4. RT-PCR-анализ 3'-концевой области РНК ХВК

IV. ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ ТРОЙНОГО КОМПЛЕКСА РЕКОНСТРУИРОВАННОГО IN VITRO ИЗ РНК, БЕЛКА ОБОЛОЧКИ И ТРАНСПОРТНОГО БЕЛКА ХВК

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизм трансляционной активации РНК потексвирусов"

Транспорт вирусной инфекции в зараженном растении в настоящее время является одной из наиболее интенсивно изучаемых проблем современной фитовирусологии. Исследование молекулярных механизмов данного процесса, представляющего собой частный случай общей физиологической функции транспорта макромолекул в растениях, имеет не только важное теоретическое значение, но и обеспечивает фундаментальные основы для разработки эффективных методов борьбы с вирусными агентами.В момент заражения растения вирусом только небольшое количество клеток оказывается инфицированными. Для развития инфекции необходимо перемещение вируса от зараженных клеток к здоровым. Ранее считалось, что межклеточный транспорт вирусов процесс пассивный, теперь совершенно очевидно, что в нем играют важнейшую роль специфические вирусные транспортные белки (ТБ).Они обеспечивают как внутриклеточный транспорт вирусного генома от места репликации к плазмодесмам, так и его межклеточный транспорт из зараженной клетки в соседние здоровые. Вирусная РНК перемещается из зараженной в здоровые клетки в составе нуклеопротеидной структуры, являющейся транспортной формой.Предполагается, что во время транспорта РНК исключается из процессов трансляции и репликации, а после проникновения в здоровую клетку становится доступной для рибосом и, соответственно, - для продолжения развития инфекции.На примере транспортной формы ВТМ было показано, что РНК в комплексе с транспортным белком недоступна для рибосом, но фосфорилирование ТБ ВТМ делает трансляцию возможной. Известно, что трансляция РНК ВТМ происходит в результате котрансляционного "раздевания" ВТМ рибосомами (Wilson and Shaw, 1987).Объектом нашего исследования являлся X вирус картофеля (ХВК) - типичный представитель рода Potexvirus, содержащий геномную одноцепочечную «плюс» РНК. Предложены две модели транспорта потексвирусов из клетки в клетку через плазмодесмы: либо перемещение генома в составе вириона (Chapman et al, 1992; Oparka et al, 1996; Santa Cruz et al, 1998), либо транспорт генома вируса в виде рибонуклеопротеида, содержащего РНК, белок оболочки (БО) и транспортный белок 1 (ТБ1) (Lough et al, 1998,2000) Ранее в нашей лаборатории было показано, что РНК ХВК, в отличие от РНК ВТМ, не способна транслироваться in vitro в составе вирусных частиц, но может быть трансляционно активирована двумя разными способами: (i) в результате фосфорилирования белка оболочки ХВК (Atabekov et al., 2000, 2001) или (ii) в результате взаимодействия вируса с транспортным белком 1 (ТБ1).Настоящая работа посвящена дальнейшему изучению механизмов трансляционной активации РНК

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Архипенко, Марина Владимировна

выводы.

1. После обработки смесью РНКаз получили хвКдегрРНК частицы, не содержащие интактную РНК и морфологически не отличающиеся от нативного ХВК.

2. Показано, что для образования комплекса ТБ1-ХВК не нужна интактная РНК. Молекулы ТБ1 селективно взаимодействуют с субъединицами БО, расположенными на 5'-конце РНК, что приводит к линейной дестабилизации белковой спирали в комплексе ТБ1-ХВК и ТБ1- ХВКдегрРНК

3. Для разборки дестабилизированной белковой спирали в комплексе требуются дополнительные факторы: а) частицы ХВК быстро и кооперативно разбираются на начальных этапах трансляции РНК в комплексах ТБ 1 -ХВК. б) разборка белковой спирали ТБ1-ХВКдегрРНК происходит при центрифугировании и в условиях АСМ.

4. Реконструированные in vitro из БО и РНК ХВК не полностью одетые белком оболочки РНП-частицы трансляционно активируются при связывании ТБ1. Сборка частиц инициируется с 5'-конца РНК ХВК.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Архипенко, Марина Владимировна, Москва

1. Новиков, В.К., Кимаев, В.З., Атабеков, И.Г. (1971). Реконструкция нуклеопротеида вируса X картофеля. Доклады Академии наук СССР. 204, (5), 1259-1262.

2. Тальянский, М.Э. (1984). Молекулярно-биологические основы взаимодействия между вирусами растений. Докторская диссертация.

3. Эзау, К. Анатомия семенных растений. М., Мир, 1980.

4. AbouHaidar, M.G. and Erickson, J.W. (1985). Structure and in vitro assembly of papaya mosaic virus. In Molecular Plant Virology, Vol.1 85-121, CRC Press, Boca Raton, FL.

5. Atabekov, I. G., Rodionova, N. P., Karpova, О. V., Kozlovsky, S. V., Poljakov, V. Yu. (2000). The movement protein triggered in situ conversion of potato virus X virion RNA from a nontranslatable into a translatable form. Virology, 271, 259-263.

6. Atabekov, J.G., Rodionova, N.P., Karpova, O.V., Kozlovsky, S.V., Novikov, V.K., Arkhipenko, M.V. (2001). Translational activation of encapsidated potato virus X RNA by coat protein phosphorylation. Virology, 286, 466-474

7. Bancroft, J.B., Rouleau, M., Jonson, R., Prins, L., Mackie G.A. (1991). The entire nucleotide sequence of foxtail mosaic virus RNA. Jornal of General Virology, 72(9), 2173-2181.

8. Baratova, L.A., Grebenshchikov, N.I., Shishkov, A.V., Kashirin, I.A., Radavsky, J.I., Jarvekulg, L., Saarma, M. (1992). J.Gen. Virol., 1Ъ, 229-235.

9. Batten, J.S., Yoshinari, S. and Hemenway, C. (2003). Potato virus X: a model system for virus replication, movement and gene expression. Molecular Plant Pathology, 4(2), 125-131.

10. Beck, D.L., Guilford, P.J., Voot, D.M., Andersen, M.T. and Forster, R.L.S. (1991). Triple gene block proteins of white clover mosaic potexvirus are required for transport. Virology, 183(2), 695-702

11. Bleykasten, C., Gilmer, D., Guilley, H., Richards, K.E and Jonard, G. (1996). Beet necrotic yellow vein virus 42 kDa triple gene block protein binds nucleic acid in vitro. Jornal of General Virology, 77, 889897.

12. Brakke, M.k., Ball, E.M., Langenberg, W.G. (1988). A non capsid protein associated with unencapsidated vims RNA in barley infected with barley stripe mosaic vims. Journal of General Virology, 69, 481491.

13. Brisco, MJ., Hull, R., Wilson, TMA. (1985). Southern bean mosaic vims-specific proteins are synthesized in an in vitro system supplemented with intact, treated virions. Virology. 148., 392-398.

14. Brisco, MJ., Hull, R., Wilson, TMA. (1986). Swelling of isometric and of bacilliform plant vims nucleocapsids is required for vims-specific protein synthesis in vitro. Virology, 148

15. Brisco, MJ, Haniff, C, Hull, R, Wilson, TMA, Sattelle, DB. (1986b). The kinetics of swelling of southern bean mosaic vims: a study using photon corrlation spectroscopy. Virology, 148

16. Carrington JC, Kasschau KD, Mahajan SK, Schaad MC. (1996). Cell-to-Cell and Long-Distance Transport of Vimses in Plants. Plant Cell, 8(10):1669-1681.

17. Chapman, S, Hills, G, Watts, J, Baulcombe, D. (1992). Mutational analysis of the coat protein gene of potato vims X: effects on virion morphology and viral pathogenicity. Virology, 191, 223-230.

18. Chen, M.H, Sheng, J, Hind, G, Handa, A.K, Citovsky, V. (2000). Interaction between the tobacco mosaic vims movement protein andhost cell pectin methylesterases is required for viral cell-to-cell movement. EMBО Journal, 19, 913-920.

19. Citovsky, V., Knorr, D., Schuster, G. And Zambryski, P. (1990). The p30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell, 60, 637-647.

20. Citovsky, V. Probing plasmodesmal transport with plant viruses. (1993). Plant Physiol., 102, 1071-1076.

21. Citovsky, V., Zambryski, P. (2000). Systemic transport of RNA in plants. Trends Plant Sci., 5(2), 52-54.

22. Davenport, G.F. and Baulcombe, D.C. (1997). Mutation of the GKS motif of the RNA-dependent RNA polymerase from potato virus X disables or eliminates vims replication. Jornal of General Virology, 78, 1247-1251.

23. Davies, C., Hills, J. and Baulcombe, D. C. (1993). Sub-cellular localization of the 25-kDa protein encoded in the triple gene block of potato virus X. Virology, 197, 166-175.

24. Deom CM, Lapidot M, Beachy RN. (1992). Plant virus movement proteins. Cell., 69(2):221-224/

25. Ding, В., Haudenshield, J.S., Hull, R.J., Wolf, S., Beachy, R.N., Lucas, W.J. (1992). Secondary plasmodesmata are specific of localization of the tobacco mosaic virus movement protein in transgenic tobacco plants. Plant Cell, 4, 915-938.

26. Ding, В., Li, Q., Nguyen, L., Palukaitis, P., Lucas, W.J. (1995). Cucumber mosaic virus 3a protein potentiates cell-to-cell trafficking of CMV RNA in tobacco plants. Virology, 207, 345-353.

27. Ding Biao (1998). Intercellular protein trafficking plasmodesmata. Plant Molecular Biology, 38, 279-310.

28. Dobrov, E.N. and Atabekov, J.G. (1989). Reconstitution of plant viruses. In Plant Viruses (Mandahar, C.L., ed), Vol. 1, .173-205, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL

29. Dolja, V.V., Haldeman-Cahill, R., Montgomery, A.E., Vandenbosch, K.A., Carrington, J.C. (1995). Capsid protein determinants involved in cell-to-cell and long distance movement of tobacco etch potyvirus. Virology, 206, 1007-1016

30. Dorokhov IuL, Miroshnichenko NA, Aleksandrova NM, Atabekov IG. (1984). Analysis of polypeptides of virus-specific informosomes induced by tobacco mosaic vims and potato virus X. Mol Biol, 18(4):1001-1010.

31. Dorokhov IuL, Aleksandrova NM, Miroshnichenko NA, Rupasov VV, Atabekov IG. (1984). Virus-specific informosomes in tobacco cells infected with tobacco mosaic virus. Mol Biol, 18(1):83-91.

32. Donald, R.G.K., Lawrence, D.M. and Jackson, A.O. (1997). The barley stripe mosaic virus 58-kilodalton B-protein is a multifunctional RNA binding protein. (1997). Jornal of Virology, 1538-1546.

33. Erhard, M.,Stussi-Garaud, C., Guilley, H., Richards, K.E., Jonard, G., Bouzoubaa, S. (1999). The first triple gene block protein of peanut clump virus localizes to the plasmodesmata during virus infection. Virology, 264, 220-229.

34. Erickson, J.W., Bancroft, J.B. (1978). The kinetics of papaya mosic virus assembly. Virology, 90(1), 47-53.

35. Forster, R.L.S., Bevan, M.W., Harbison, S.-A., Gardner, R.C. (1988). The complete nucleotide sequence of the potexvirus of white clover mosaic virus. Nucleic Acids Res. 16, 291-303.

36. Forster, R.L.S., Beck, D.L., Guilford, P.J., Voot, D.M., Van Dolleweerd, C.J., Andersen, M.T. (1992). The coat protein of white clover mosaic potexvirus has a role in facilitating cell-to-cell transport in plants. Virology. 191,480-484.

37. Fraenkel-Conrat, H., Singer, В., Tsugita, A. (1961). Purification of viral RNA by means of bentonit. Virology, 14:54-8.

38. Gal-On A, Kaplan I, Roossinck MJ, Palukaitis P. (1994). The kinetics of infection of zucchini squash by cucumber mosaic virus indicate a function for RNA 1 in virus movement. Virology, 205(l):280-289.

39. Geering, A.W.D. and Thomas, J.E. (1999). Characterisation of a virus from Australia that is closely related to papaya mosaic potexvirus. Archives of Virology, 144, 577-592

40. Gilmer, D., Bouzoubaa, S., Hein, A., Guilley, H., Richards, K. and Lonard, G. (1992). Efficient cell-to-cell movement of beet necrotic yellow vein virus requires 3' proximal genes located on RNA 2. Virology, 189(1), 40-47.

41. Goodman RM. (1975). Reconstitution of potato vims X in vitro. I. Properties of the dissociated protein structural subunits. Virology, 68(2):287-98

42. Goodman RM, Home RW, Hobart JM. (1975). Reconstruction of potato virus X in vitro. II. Characterization of the reconstituted product. Virology, 68(2):299-308.

43. Goodman, R.M. (1977). Reconstitution of potato vims X in vitro. III. Evidence for a role for hydrophobic interactions. Virology 76, 72- 78.

44. Gorbalenya, A.E., Koonin, E.V., Donchenko, A.P. and Blinov, V.M.1989). Two related superfamilies of putative helicases involved in replication, recombinatiobn, repair and expression of DNA and RNA genomes. Nucleic Acids Res 17, 4713-4730.

45. Gorbalenya, A.E. and Koonin, E.V. (1993). Helikases: amino acid sequence comparisons and structure-function relationships. Curr Opin Struct Biol 3,419-429.

46. Heinlein M and Epel B. (2004) Macromolecular transport and signaling through plasmodesmata. International Review of Cytology, 235, 93-?

47. Herzog, E., Hemmer, O., Hauser, S., Meyer, G., Bouzoubaa, S., Fritsch, C. (1998). Identification of genes involved in replication and movement of peanut clump virus. Virology. 248(2). 312-322.

48. Hiscox, JA and Ball LA. (1997). Cotranslational disassembly of Flock House Virus in a cell-free system. Journal of Virology, 71(10) 79747977.

49. Hunter, B.G., Heaton, L.A., Bracker, C.E. and Jackson A.O. (1986). Structural comparsion of poa semilatent virus and barlye stripe mosaic virus. Phytopathology, 76, 322-326.

50. Hunter, A.R, Jackson, R.J. and Hunt, T (1997). The role of complexes between the 40S ribosomal submit and Met-tRNAfMet in initiation of protein synthesis in the wheat-germ system. Eur. J. Biochem., 75, 159170.

51. Jackson, A.O. Hunter, B.G. and Gustafson, G.D. (1989). Hordeiviruses relationships and genome organization. Annual Review Phytopathology, 27, 95-121

52. Jelkmann, W, Maiss, E, Martin, R.R. (1992). The nucleotide sequence and genome organization of strawberry mild yellow edge-associated potexvirus. Jornal of General Virology, 73(2), 475-479.

53. Kaftanova, A.S, Kiselev, N.A, Novikov, V.K. and Atabekov, J.G. (1975). Structire of products of protein reassembly and reconstruction of potato virus X. Virology, 65, 283-287.

54. Kalinina, N.O., Fedorkin, O.N, Samuilova, O.V, Maiss, E, Korpela, T, Morozov, S.Yu, Atabekov, J.G. (1996). Expression and biochemical analyses of the recombinant potato virus X 25K movement protein. FEBSLetters, 397, 75-78.

55. Kalinina NO, Rakitina DV, Solovyev AG, Schiemann J, Morozov SY. RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first gene of the triple gene block. (2002). Virology, 296(2), 321-9.

56. Karpova, O.V., Ivanov, K.I., Rodionova, N.P., Dorokhov, Yu.L., Atabekov, J.G. (1997). Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. Virology, 230, 11-21

57. Karpova OV, Rodionova NP, Ivanov KI, Kozlovsky SV, Dorokhov YL, Atabekov JG. (1999). Phosphorylation of tobacco mosaic virus movement protein abolishes its translation repressing ability. Virology, 261(l):20-24.

58. Kasteel DT, Wellink J, Goldbach RW, van Lent JW. (1997). Isolation and characterization of tubular structures of cowpea mosaic virus. J Gen Virol., (Pt 12):3167-3170.

59. Kasteel DT, van der Wei NN, Jansen KA, Goldbach RW, van Lent JW. (1997). Tubule-forming capacity of the movement proteins of alfalfa mosaic virus and brome mosaic virus. J Gen Virol., (Pt 8):2089-2093.

60. Kiseleva, O.I., Yaminsky, I.V., Karpova, O.V., Rodionova, N.P., Kozlovsky, S.V., Arkhipenko, M.V. and Atabekov, J.G. (2003). AFM study of potato virus X disassembly induced by movement protein. J. Mol. Biol., 332, 321-325.

61. Koenig, R., Stegemann, M.E., Francksen, H., and Paul, H.L. (1970). Protein subunits in potato virus X group. Determination of the molecular weights by polyacrylamide electrophoresis. Biochemica et Biophysica Acta, 207, 184-189.

62. Koening, R, Commandeur U., Loss, S, Beier, C., Kaufmann, A., Lesemann, D.E. (1997a). Beet soil-borne virus RNA 2: similarities anddissimilarities to the coat protein gene-carrying RNAs of other furoviruses. Jornal of General Virology. 78(2), 469-477.

63. Koening, R., Loss, S. (1997b). Beet soil-borne virus RNA 1: genetic analysis enabled by a starting sequence generated with primers to hyghly conserved helicase-encoding domains. Jornal of General Virology, 78(12;, 3161-3165.

64. Koening, R., Pleij, C.W., Beier, C., Commandeur, U. (1998). Genome properties of beet virus Q, a new furo-like virus from sugarbeet, determined from unpurified virus. Jornal of General Virology. 79(8), 2027-2036.

65. Koonin, E.V., and Dolja, V.V. (1993). Evolution and taxonomy of positiv-strand RNA viruses: implication of comparative analysis of amino acid sequences. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 28(5), 375-430.

66. Kozak M. (1979). Migration of 40 S ribosomal subunits on messenger RNA when initiation is perturbed by lowering magnesium or adding drugs. J Biol Chem, 254(11):4731-4378.

67. Kozak, M. (1989). Context effects and inefficient initiatio at non-AUG codons in eucaryotic cell-free translation systems. Molecular and Cellular Biology, 9, 5073-5080.

68. Kozak M. (1999). Initiation of translation in prokaryotes and eukaryotes. Gene, 234(2): 187-208.

69. Krishnamurthy K, Mitra R, Payton ME, Verchot-Lubicz J. (2002). Cell-to-cell movement of the PVX 12K, 8K, or coat proteins maydepend on the host, leaf developmental stage, and the PVX 25K protein. Virology, 300(2):269-281.

70. Kwon SJ, Park MR, Kim KW, Plante CA, Hemenway CL, Kim KH. (2005). cis-Acting sequences required for coat protein binding and in vitro assembly of Potato virus X. Virology, 334(l):83-97.

71. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structufal protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 211, 680-685.

72. Lawrence, D.M., Rozanov, M.N and Hilman, B.I. (1995). Autocatalytic processing of the 223-kDa protein of blueberry scorch carlavirus by a papain-like proteinase. Virology. 207(1). 127-135.

73. Lawrence, D.M. and Jackson, A.O. (2001). Interaction of the TGB1 protein during cell-to cell movement Barley stripe mosaic virus. Journal of Virology, 75(18), 8712-8723.

74. Li, O., Palukaitis, P. (1996). Comparison of the nucleic acid- and NTP-binding properties of the movement protein of cucumber mosaic cucumovirus and tobacco mosaic tobamovirus. Virology, 216, 71-79.

75. Lok, S. And AbouHaidar, M.G. (1986). The nucleotide sequence of the 5' end of Papaya Mosaic Virus RNA: site of in vitro assembly initiation. Virology, 153, 289-296.

76. Lough TJ, Emerson SJ, Lucas WJ, Forster RL. (2001). Trans-complementation of long-distance movement of White clover mosaic virus triple gene block (TGB) mutants: phloem-associated movement of TGBpl. Virology, 288(l):18-28.

77. Lucas, W., Ding, В., Van der Schoot, C. (1993). Plasmodesmata and the supracellulas nature of plants. New Phytol., 125, 435-476.

78. Lucas, W.J. and Gilbertson, R.L. (1994). Plasmodesmata in relation to viral movement within leaf tissues. Annual Review of phytopathlogy, 32,387-411.

79. Lucas, W., Bousche-Pillon, S., Jackson, D.P., Nguyen, L., Baker, L., Ding, В., Hake, S. (1995). Selective trafficking of KNOTTED 1 homeodomain protein and its mRNA through plasmodesmata. Science, 270, 1980-1983.

80. Martelli, G.P., Jelkmann, W. (1998). Foveavirus, a new plant virus genus. Archives of Virology, 143, 1245-1249.

81. Mas P, Beachy RN. (1999). Replication of tobacco mosaic virus on endoplasmic reticulum and role of the cytoskeleton and virus movement protein in intracellular distribution of viral RNA. J Cell Biol, 147(5):945-958.

82. McLean, В., Zupan, J., Zambryski, P. (1995). Tobacco mosaic virus movement protein associates with cyto skeleton in tobacco cells. Plant Cell, 7,2101-2114.

83. Morozov, S.Yu., Lukasheva, L.I., Chernov, B.K., Skryabin, K.G. and Atabekov, J.G. (1987). Nucleotide sequence of the open reading frames adjacent to the coat protein cistron in potato virus X genome. FEBS Letters, 213, 438-442.

84. Morozov, S.Y., Dolia, V.V., Atabekov, I.G. (1989). Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA-containing plant viruses. J. Mol. Evol., 29, 52-62.

85. Morozov, S.Y., Solovyev, A.G., Kalinina, N.O., Fedorkin, O.N., Samuilova, O.V., Schiemann, J., Atabekov, J.G. (1999). Evidence for two nonoverlapping functional domains in the potato virus X 25K movement protein. Virology, 260, 55-63.