Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение структуры транспортного вирусного рибонуклеопротеида X вируса картофеля и способов трансляционной активации РНК в его составе
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Изучение структуры транспортного вирусного рибонуклеопротеида X вируса картофеля и способов трансляционной активации РНК в его составе"
На правах рукописи
НИКИТИН Николай Александрович
ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ТРАНСПОРТНОГО ВИРУСНОГО РИБОНУКЛЕОПРОТЕИДА X ВИРУСА КАРТОФЕЛЯ И СПОСОБОВ ТРАНСЛЯЦИОННОЙ АКТИВАЦИИ РНК В ЕГО СОСТАВЕ
03 00 06-Вирусология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
1 6 О ИТ 2008
Москва 2008
003448788
Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М В Ломоносова
Научные руководители:
академик РАН, доктор биологических наук, профессор
Атабеков Иосиф Григорьевич
доктор биологических наук Карпова Ольга Вячеславовна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Защита состоится 31 октября 2008 г в 10°° часов на заседании совета Д 501 001 76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени MB Ломоносова по адресу 119992, Москва, Ленинские Горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени АН Белозерского, ауд 536
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета MfV имени M В Ломоносова
Автореферат разослан "ЪО" сентября 2008 года.
доктор химических наук
Соловьев Андрей Геннадьевич Филиппова Ирина Юрьевна
Ведущая организация Институт биологии гена РАН
Ученый секретарь диссертации кандидат биологических наук
Крашенинников И А
Актуальность проблемы.
Транспорт вирусной инфекции в зараженном растении является одной из наиболее интенсивно изучаемых проблем современной фитовирусологии
В момент заражения растения вирусом только небольшое количество клеток оказывается инфицированными Для развития инфекции необходимо перемещение вируса от зараженных клеток в здоровые Межклеточный транспорт фитовирусов является активным процессом, происходит через плазмодесмы и для него необходимы кодируемые вирусом транспортные белки (ТБ) (Atabekov & Dorokhov, 1984, Atabekov & Taliansky, 1990)
Объект нашего исследования - X вирус картофеля (ХВК) - типичный представитель рода Potexvirus семейства Flexivmdae, содержащий геномную одноцепочечную «плюс» РНК
В литературе были предложены две модели транспортной формы при межклеточной транслокации генома потексвирусов нативные вирионы (Oparka et al, 1996, Santa Cruz et al, 1998) или комплексы невирионного типа, состоящие из вирусной РНК, белка оболочки (БО) и транспортного белка (ТБ1) (Lough et al, 1998, 2000) При изучении транспортной формы вируса Lough et al (1998) инкубировали вирусную РНК с БО и ТБ1 и использовали смесь для микроиньекций Однако структура таких комплексов, используемых в опытах, изучена не была
Независимо от структуры транспортной формы, вирусная РНК в ее составе должна исключается из процессов репликации и трансляции и вновь становится доступной для рибосом в процессе развития инфекции
Ранее в нашей лаборатории было показано, что в отличие от ряда вирусов, РНК ХВК в составе вириона недоступна для рибосом Но она становится доступной в результате 1) фосфорилирования N- концевого полипептида БО вируса in situ протеинкиназами серинового типа или 2) при взаимодействи ХВК с ТБ1 (Atabekov et al, 2000, 2001, Rodionova etal, 2003,)
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы было изучение структуры рибонуклеопротеидов, собранных in vitro из РНК, БО и ТБ1 (возможной транспортной формы потексвирусов), а также выяснение возможности трансляционной активации РНК ХВК в составе тройных комплексов РНК-БО-ТБ1 В процессе работы решались следующие задачи
1 Анализ условий образования, порядка сборки и структуры рибонуклеопротеидных комплексов РНК-БО-ТБ1 ХВК
2 Изучение возможности подавления трансляции РНК в составе вирусного рибонукпеопротеида (вРНП) и перехода во вновь транслируемую форму путем фосфорилирования БО в составе вРНП или при образовании комплекса ВРНП-ТБ1
3 Исследование роли N-концевого полипептида БО ХВК при подавлении и активации трансляции инкапсидированной РНК в составе вРНП
Научная новизна и практическая ценность работы.
Показано, что при наличии в растворе ТБ1, РНК и БО ХВК, независимо от молярного соотношения и последовательности добавления компонентов, прежде всего образуется вРНП комплекс, состоящий из РНК и БО, имеющий спиральную «головку», идентичную по своей структуре белковой спирали вирионов ХВК и «хвост» - РНК, свободную от БО («однохвостые» частицы) И только затем ТБ1 взаимодействует с частично реконструированным вирусом, присоединяясь к концу спиральной «головки» «однохвостых» частиц, соответствующему 5'-концу РНК
В результате проведенных экспериментов при инкубации РНК, БО и ТБ1 ХВК рибонуклеопротеидов невирионной природы обнаружено не было
Показано, что РНК в составе вРНП, так же как и в составе вириона может исключаться из процесса трансляции, и вновь трансляционно активироваться путем фосфорилирования БО в составе вРНП или при взаимодействии вРНП с ТБ1
Вероятно, две модели транспортной формы не противоречат друг другу РНК ХВК может транспортироваться в виде частично (вРНП - «однохвостые» частицы) или полностью одетого вириона
Показана роль N-концевого полипептида БО ХВК как регулятора трансляции РНК в составе вРНП
Результаты работы могут быть использованы в практике научных исследований в области молекулярной биологии и вирусологии Материалы работы используются при чтении курсов лекций на Биологическом факультете МГУ имени М В Ломоносова
Апробация работы.
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на Международной конференции «Ломоносов» (Москва, 2005, 2007), 30-м конгрессе Федерации европейского биохимического общества (Будапешт, 2005), Международной школе-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия» (Москва,
2005), Заседании общества «In Vitro Biology» (Миннеаполис, 2006), 32-м конгрессе Федерации европейского биохимического общества (Венна, 2007), 10-м Симпозиуме по эпидемиологии вирусов растений (Хайдарабад, 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008)
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ
Структура работы
Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы»
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
X вирус картофеля (ХВК) относится к группе потексвирусов Вирионы ХВК представляют собой гибкие нитевидные частицы со спиральной структурой длиной 515 нм и диаметром 13 5 нм Его геном представлен одноцепочечной «плюс» РНК длиной 6345 нуклеотидов (Skryabin et а/, 1988) Вирион ХВК содержит около 1300 идентичных субъединиц белка оболочки, упакованных в виде спирали, между оборотами которой заключена вирусная РНК (Tollin & Wilson, 1998), 8 9 белковых субъединиц образуют оборот первичной спирали, пять нуклеотидов ассоциированы с каждой субъединицей БО РНК ХВК кодирует пять белков белок массой 165К -вирусная репликаза, транслируется непосредственно с геномной РНК, три транспортных белка (ТБ1, ТБ2, ТБЗ - продукты «тройного блока генов») и белок оболочки транслируются с субгеномных РНК (Morozov et al, 1991) Для межклеточного транспорта ХВК необходимы все три транспортных белка, а также белок оболочки (БО) вируса
Ранее в нашей лаборатории было показано, что в отличие от ряда вирусов, РНК ХВК в составе вириона недоступна для рибосом Но она становится доступной в результате 1) фосфорилирования N- концевого полипептида БО в составе вирусной частицы in situ протеинкиназами серинового типа 2) при взаимодействи ХВК с ТБ1 (Atabekov et al, 2000,2001, Rodionova et al, 2003)
По мнению ряда авторов, роль транспортной формы потексвирусов выполняют нативные вирионы (Oparka et а/, 1996, Santa Cruz et al, 1998) или комплексы невирионного типа, состоящие из вирусной РНК, белка оболочки (БО) и транспортного белка (ТБ1) (Lough et al, 1998, 2000) Lough с соавторами (Lough et
al, 1998) инкубировали вирусную РНК с БО и ТБ1 и использовали смесь для микроиньекций Предварительные исследования позволили нам усомниться в выводах авторов о невирионной природе транспортной формы, тем более что они не изучали структуру частиц, участвующих в межклеточном транспорте
Независимо от структуры транспортной формы, логично предположить, что 1) вирусная РНК, предназначенная для межклеточной транслокации в составе транспортной формы, исключается из процессов репликации и трансляции, и 2) активация трансляции РНК в транспортной форме осуществляется в процессе развития инфекции при перемещении из зараженной в здоровую клетку
Целью нашего исследования было изучение структуры комплексов, собранных т vitro из РНК ХВК, БО и ТБ1, условий сборки вРНП, а также выяснение возможности трансляционной активации РНК ХВК в составе вирусного рибонуклеопротеида, реконструированного in vitro, путем фосфорилирования БО в составе вРНП и взаимодействием вРНП с ТБ1
1 В отсутствие РНК ХВК БО и ТБ1 образуют нерастворимый комплекс
Чтобы изучить структуру, условия и последовательность сборки комплексов РНК-БО-ТБ1 мы изучили возможность взаимодействия каждой отдельной пары компонентов (БО-ТБ1, РНК-ТБ1, РНК-БО)
Инкубация БО и ТБ1 в отсутствие РНК приводит к образованию крупных нерастворимых комплексов, которые выпадают в осадок при центрифугировании при ЮОООхд Анализ инкубационной смеси БО-ТБ1 методом атомно-силовой микроскопии показал, что в поле зрения можно увидеть крупные нерегулярные агрегаты, в то время как препарат БО в отсутствие ТБ1 представляет собой частицы диаметром 3-4 нм, что соответствует моно- и димерам БО ХВК Белковый состав нерастворимых комплексов, полученных при разных молярных соотношениях БО-ТБ1 был исследован методом Вестерн-блот анализа (рис 1) Для этого БО и ТБ1 инкубировали в присутствии и в отсутствие РНК, пробы центрифугировали, осадки ресуспендировали в буфере для нанесения по Лемли и анализировали в полиакриламидном геле При центрифугировании чистых препаратов БО и ТБ1 осадки не образовывались Как видно из рис 1 (дорожки 5-8), полученные комплексы содержат оба белка, т е в отсутствие РНК, инкубация БО с ТБ1 приводит к образованию нерастворимого комплекса БО-ТБ1
1 2 3 4 5 6 7 8
а
б
Рис. 1. Вестерн-блот анализ нерастворимых комплексов БО-ТБ1 ХВК, полученных при различных соотношениях БО-ТБ1.
1. БО ХВК (5 мкг), 2. ТБ1 ХВК (0,7мкг), 3. РНК и БО преинкубировали 10 мин. при 20°С при молярном соотношении 1:700 и затем добавлен ТБ1 (мол. соотн. 1:100) и инкуб. 1 час при 20°С, 4. РНК и ТБ1 преинкубировали 10 мин. при 20°С в молярном соотношении 1:100 и затем добавлен БО (мол. соотн. РНК:БО 1:700) и инкуб. 1 час при 20°С, 5-8. БО и ТБ1 инкубировали 10 мин. при 20°С без РНК. К 5 мкг БО ХВК добавляли 0,7 мкг (5), 0,35 мкг (6), 0,18 мкг (7) и 0,10 мкг (8) ТБ1.
Использовали кроличьи антитела к БО (а) и ТБ1 (б) и вторичные антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена (Sigma), реакцию визуализировали системой ECL (Amersham Biosciences).
Однако, если сначала проинкубировать БО с РНК и затем добавить к смеси ТБ1, нерастворимые комплексы БО-ТБ1 обнаружить практически невозможно, (рис. 1., дор. 3), либо в случае, если сначала проинкубировать РНК с ТБ1, а затем добавить БО (рис. 1, дор. 4). В присутствии РНК ХВК БО и ТБ1 не образуют нерегулярных агрегатов, а формируют растворимые комплексы.
Частицы, представленные на рис. 2(a) и З(а-с) были собраны при инкубации РНК с ТБ1 и БО. Независимо от последовательности добавления РНК, БО и ТБ1: РНК—>ТБ1—>БО или РНК->БО->ТБ1, при анализе инкубационной смеси с помощью электронного (ЭМ) и атомно-силового микроскопа (АСМ) наблюдали образование частиц - вирусных рибонуклеопротеидов, которые имели «головку» и «хвост» («однохвостые частицы» - STP (single taile particles). Препараты также содержали свободную РНК, видимую при анализе методом атомно-силовой микроскопии.
Если на сетки с нанесенным материалом напыляли платину, РНК имела вид вытянутых нитей (рис. Зс).
В случае, когда препарат вРНП перед нанесением обрабатывали микрококковой нуклеазой «хвосты» исчезали, свидедельствуя о том,что эти структуры соответствуют участкам РНК, свободным от БО.
Высота «головок», определённая при анализе методом АСМ, независимо от длины, соответствует нативной вирусной частице ХВК (13,5 нм). С помощью трансмиссионной электронной микроскопии при негативном контрастировании образцов было показано, что образованные частицы имеют спиральную структуру, аналогичную вирусной (рис. 3 Г,Д).
Рис. 2. (а) Атомно-силовая микроскопия собранных in vitro вРНП.
РНК ХВК и ТБ1 были преинкубированы 10 мин. при 20°С при мол. соотношении РНК:ТБ1 1:100, затем добавляли БО (в соотношении РНК:БО 1:700) и инкубировали в течение 1 часа при 20°С. Высота «головок» вРНП 13,5 нм независимо от их длинны. Стрелками указаны «хвосты» РНК.
(б) Гистограмма распределения длинны «головок» вРНП.
Нерастворимые комплексы БО-ТБ1 не были визуально обнаружены в этих экспериментах. Е этой связи возник вопрос, не является ли образование нерастворимого комплекса ТБ1-БО и взаимодействие РНК-БО конкурирующими процессами, Для этого, РНК была преинкубирована в присутствии избытка ТБ1 (молярное соотношение РНК:ТБ1 1: 2000) и затем к инкубационной смеси был добавлен БО в молярном соотношении РНК:БО 1:700. Анализ образцов под электронным микроскопом показал, что в присутствии РНК, сборка вРНП происходит даже при избытке ТБ1 и нерастворимые агломераты не были обнаружены.
Преинкубирование РНК и ТБ1 в молярных соотношениях РНК:ТБ1 от 1:100 до 1:2000 не влияет на количественный выход вРНП при последующем добавлении БО в молярном соотношении РНК:БО (1:700). Далее, вРНП были получены путем преинкубирования РНК и БО при различных молярных соотношениях, и затем к смеси добавляли ТБ1. Кроме того, возможность сборки была изучена в серии экспериментов, когда вирусная РНК смешивалась с БО или ТБ1 и затем второй белок добавляли без преинкубирования: (а) БО ХВК был добавлен к РНК и затем сразу был добавлен ТБ1 или, иначе, (б) сначала к РНК добавляли ТБ1 и сразу после этого добавлен БО. Во всех описанных экспериментах в образованных вРНП не было обнаружено никаких структурных различий. Следовательно, образование вРНП происходит быстро и не зависит от последовательности добавлении компонентов и времени предварительной инкубации РНК с БО и ТБ1.
Рис. 3. Анализ вРНП методами электронной и атомно-силовой микросокпии.
А. Негативное контрастирование с 2% уранил ацетатом и напыление платиной под
углом 7° последовательно; Б. Атомно-силовая микроскопия; В. Напыление
платиной под углом 7°, Г.,Д. Сравнение электронных микрофотографий нативных
вирионов ХВК (Г) и вРНП (Д).
Стрелками показаны «хвосты» РНК в составе вРНП.
Соотношение РНК.БО 1:700. Размер шкалы 50 нм.
С помощью атомно-силового микроскопа мы показали, что при молярном соотношении РНКТБ1 от 1 100 до 1 2000 комплексы РНКТБ1 не были обнаружены Ранее связывание ТБ1-РНК не было обнаружено при анализе комплексов на двойных различно заряженных нитроцеллюлозных мембранах (Karpova ef al, 1997) Известно, что некоторые транспортные белки вирусов растений действуют как эффективные супрессоры трансляции Однако, ТБ1 ХВК не ингибирует in vitro трансляцию вирусной РНК (Karpova ef al, 1997) и обладает низкой РНК-связывающей активностью (Kalinina ef а/, 1996, Morozov ef а/, 1999) С помощью атомно-силового микроскопа мы не смогли обнаружить комплексы РНК ХВК и ТБ1, тогда как комплексы, образованные в тех же условиях ТБ ВТМ и РНК были легко выявлены и изучены (Kiselyova ef а/, 2001) Основываясь на этих данных, можно утверждать, что ТБ1 не связывается с РНК ХВК
2. Исследование методом АСМ частиц вРНП, образованных при различных молярных соотношениях «РНК: БО»
На рисунке 4 представлены частицы (вРНП), полученные при инкубации РНК и БО ХВК в различных молярных соотношениях в отсутствии ТБ1 При отношении РНК БО 1 700 были обнаружены частицы вРНП, т е структуры с «неодетым хвостом» РНК и белковыми «головками», различающиеся по длине Кроме того, препараты содержали свободные, не связанные с БО, молекулы РНК
На рис 4Б показаны вРНП, полученные при соотношении РНКБО 1 20, те существенно более низком, чем в нативных вирионах (1 1300) Отличительной чертой частиц, полученных при низком соотношении РНК БО и показанных на рис 4Б, является малая высота «головок», варьирующая в интервале от 3 до 7 нм Такие структуры содержат не более 2-3 молекул БО, высота которых, по данным АСМ, составляет 3-4 нм
Таким образом, вРНП, состоящие из РНК и БО ХВК, внешне идентичны комплексам вРНП, состоящим из РНК, БО и ТБ1 (рис 2, 3), т е состоят из «головки» и «хвоста» - свободной РНК
На рисунке 6 представлены гистограммы распределения частиц вРНП, собранных при разных молярных соотношениях РНК БО (Г, Д) Как видно из рисунка, увеличение соотношения РНК БО от 1 700 к 1 2000 приводит к увеличению размеров частиц вРНП (головок «однохвостых» частиц)
SO 100 150 200 ISO 300 350
Panicle length, nm
to 100 ISO 100 350 300 350
Particle length, nm
Рис. 4. Анализ комплексов вРНП, сформированных in vitro из РНК и БО ХВК.
A, Б. Анализ методом атомно-силовой микроскопии комплексов вРНП при молярном соотношении РНК:БО 1:700 (А) и 1:20 (Б). Стрелками указана РНК.
B, Г. Гистограммы распределения длины частиц вРНП, собранных при молярном соотношении РНК:БО 1:700 (Г) и 1:2000 (Д).
Высота «головок», независимо от их длины, соответствовала диаметру вирионов ХВК (13.5 нм). Спиральная структура палочковидных «головок», представленных на рис. 6А, не могла быть выявлена с помощью АСМ, но была видна на электронных микрофотографиях с негативным контрастированием. В контрольных опытах при анализе методами атомно-силовой и электронной микроскопии было показано, что «хвосты» исчезапи в результате обработки частиц РНКазой перед нанесением на подложку.
Дополнительным доказательством идентичности спиральной структуры белковой оболочки вириона и «головки» однохвостых частиц послужил «трипсиновый тест», разработанный в нашей лаборатории (Rodionova etal., 2003). Его суть заключается в следующем: «трипсиновый тест» позволяет четко выявить различия между белком оболочки ХВК в свободном состоянии и находящимся в
составе белковой спирали вируса. БО в составе вирусной частицы относительно устойчив к действию трипсина: известно, что в результате ограниченного гидролиза трипсином отщепляется лишь N-концевой пептид длинной 19-24 аминокислотных остатка (в зависимости от изолята вируса) и полномеразная форма БО-Ps переходит в укороченную форму БО-Ptd (Ps - от slow, по результатам электрофоретического анализа; Ptd - от trypsin degradation) (Koenig et al., 1978). Обработка трипсином не собранных в белковую спираль препаратов субъединиц БО приводит к образованию коротких пептидов, которые нельзя обнаружить при электрофорезе в ДСН-ПААГ в стандартных условиях. Таким образом, используя обработку трипсином можно получить четкий ответ: находится ли БО в виде отдельных субъединиц или в составе белковой спирали оболочки вируса.
1 2 3 4 5 6
Рис. 5. Обработка трипсином БО в составе вРНП.
1. вРНП (1:700), 2. вРНП, обработанные трипсином, 3. ХВК, 4. ХВК, обработанный трипсином, 5. БО, 6. БО. обработанный трипсином.
Электрофоретическ/й анализ в 8-20% ДСН-ПААГ. Гель окрашен Кумасси Р-250.
В нашей работы был использован Русский штамм ХВК. Переход Рэ-формы БО ХВК (Русский штамм) в Ptd-фopмy сопровождается удалением 19 Ы-концевых аминокислот (ЭкгуаЫп е? а/., 1988), включая 8 остатков треонина и 4 остатка серина.
Чтобы узнать, идентична ли структура БО в составе вРНП БО в составе вириона, мы собирали вРНП при молярном соотношении РНК:БО 1:700, обрабатывали трипсином и анализировали продукты с помощью электрофореза в ДСН-ПААГ. Как видно из рисунка 5, при обработке вРНП трипсином появляется полоса (рис. 5, дор. 2), соответствующая положению БО, обработанному трипсином в составе вирионов (рис. 5, дор. 4). Интенсивность полосы, соответствующей БО, обработанному трипсином в составе вРНП, ниже интенсивности исходного препарата, до обработки трипсином (БО в составе вРНП) (рис. 5, дор.1), что говорит о том, что не весь БО, присутствующий в препарате вРНП находится в составе белковой спирали «головки» вРНП, т.е. не весь БО участвует в сборке вРНП. При обработке трипсином свободного БО (рис. 5, дор. 6) визуализировать в геле продукты гидролиза не удается, т.к. обработка
несобранных в белковую спираль отдельных субъединиц БО приводит к деградации вирусного белка с образованием коротких пептидов
Эти результаты подтверждают, что БО в составе вРНП, также как и в составе вирионов, имеет спиральную структуру
Образование нерастворимых комплексов ТБ1-БО не происходит в присутствии РНК Видимо, БО эффективно взаимодействует с РНК с образованием растворимых вРНП В этом случае, нерастворимые комплексы ТБ1-БО не обнаруживаются, даже при избытке ТБ1 Сборка вРНП происходила даже когда вирусная РНК смешивалась с БО или ТБ1 и затем второй белок добавляли без преинкубирования Иными словами, присутствие ТБ1 не мешает сборке вРНП Таким образом, происходит конкуренция РНК и ТБ1 за БО, в которой выигрывает РНК, т е сборка вРНП не ингибируется в присутствии ТБ1 В любом случае образуются частицы вРНП, имеющие спиральные белковые «головки» различной длины, расположенные на одном конце молекулы РНК
3 ТБ1 связывается с одним из концов вРНП
Для визуализации местоположения ТБ1 в вРНП, собранных из РНК, БО и ТБ1, использовали метод имунно-электронной микроскопии Были проведены 2 вида экспериментов
Рис. 6 Визуализация положения ТБ1 в частицах * - » ' вРНП методом имунно-электронной
' •• микроскопии
* • 'Л' 'г v ' ' * • < * 1 Размер частиц золота 10 нм Бар50нм
. • ' " ч-/, .
'-"')
■ -1
,JL <
В первом случае вРНП, собранные при молярном соотношении РНК БО 1 700, инкубировали на медных сетках для ЭМ, покрытых формваровой пленкой, затем на сетки наносили каплю с ТБ1 (молярное соотношение 1 100) и добавляли кроличью поликлональную антисыворотку к ТБ1 Во втором случае РНК, БО и ТБ1 инкубировали в растворе, затем инкубационную смесь наносили на сетки и добавляли кроличью поликлональную
антасыво^отку кТБ1
После инкубации комплексы, полученные в обоих случаях, отмывали от несвязанных антител и держали с протеином G, конъюгированным с частицами коллоидного золота После инкубации сетку промывали и напыляли платиной Независимо от способа формирования комплексов на сетке или в растворе, были получены идентичные результаты Как видно из рисунка 6, молекулы ТБ1 находятся на одном конце спиральной белковой «головки» «хвостатых» частиц В контрольной смеси без ТБ1, связывание со вторичными антителами полностью отсутствует То же наблюдалось в контрольной смеси в отсутствие антител к ТБ1 Таким образом, ТБ1 связывается селективно с концом «головки» белковой спирали частиц вРНП
Можно предположить, что в смеси РНК, БО и ТБ1 сначала проходит быстрая сборка «однохвостых» РНК-БО частиц со спиральной «головкой», расположенной на одном конце РНК, и только после этого молекулы ТБ1 связываются с торцом спиральной «головки» вРНП
4 Сборка вРНП начинается с S'-конца РНК ХВК
На следующем этапе работы мы попытались выяснить какой район РНК ХВК взаимодействует с БО и образует «головки» однохвостых частиц вРНП собирали, инкубируя вирусную РНК и БО в отсутствие ТБ1 Чтобы получить фрагменты РНК, покрытые БО в вРНП, препараты обрабатывали микрококковой нуклеазой (МН) в условиях, когда одетая часть РНК в вРНП была защищена от воздействия нуклеазы После обработки МН, РНК, защищенная от воздействия нуклеазы, была выделена методом фенопьной депротеинизации Выделенная РНК представляла собой набор фрагментов от 500 до 5500 нт (рис 7) Каждый фрагмент вируса был выделен из агарозного геля отдельно с использованием тРНК в качестве соосадителя Для того чтобы показать, что выделенные фрагменты являются 5'-концевыми был использован метод обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией (ПЦР) Для обратной транскрипции использовали олигодезоксирибонуклеотид, соответсвующий области 981-950 нт РНК ХВК Для амплификации 5'-концевого района РНК ХВК методом ПЦР была использованы позитивные и негативные праймеры, соответствующие 21-40 и 981-950 нт РНК ХВК Все фрагменты РНК ХВК, выделенные после обработки вРНП микрококковой нуклеазой имели продукт амплификации, соответствующий 5'-концевой области РНК ХВК Это свидетельствует о том, что РНК в составе вРНП, защищенная БО от воздействия микрококковой нуклеазы, представляет собой 5'-концевые фрагменты генома ХВК
Рис. 7. Препараты РНК ХВК, выделенные из вРНП, обработанных микрококковой нуклеазой.
1. Набор фрагментов РНК, выделенных из вРНП (1:700), обработанных микрококковой нуклеазой, 2-9. Индивидуальные фрагменты РНК различной длины, выделенные из (1), Ю.тРНК (контроль). В скобках обозначены молярные отношения РНК : БО при сборке вРНП. Стрелками указаны положение маркеров и тРНК. Агароза, 1%, окрашено бромидом этцдия.
Еще одним подтверждением того, что сборка «однохвостых» частиц из РНК и БО начинается с 5'-конца РНК ХВК явились эксперименты по аресту сборки вРНП в присутствии олигодезоксирибонуклеотида 5'-сЮОТТТООИетСТге-3', комплементарного 5'-концевой нетранслируемой области РНК ХВК (с 22 по 36 нуклеотид и частично - с 2 по 12 нукпеотид). РНК перед добавлением БО инкубировали с олигодезоксирибонукпеотидом 5 минут при 56°С в Н20. К смеси добавляли буфер и БО и продолжали инкубацию в обычных условиях сборки вРНП. Как видно из рисунка 8 присутствие олигодезоксирибонуклеотида, блокировало сборку вРНП (дор. 2). Это свидетельствует о том, что 5'-концевая область вирусной РНК избирательно связывается с БО при сборке вРНП.
1234 56789 10
Рис. 8. Арест сборки вРНП в присутствии олигодезоксирибонуклеотида, комплементароного 5'-концу РНК ХВК.
1. РНК ХВК, 2. РНК+олигодезоксирибонуклеотид :БО (РНК:БО 1:700), 3. вРНП (РНК:БО 1:700). Олигодезоксирибонукпеотид б'-сЮСТТТССТТСТСТТО-З', комплементарный 5'-концевой области РНК ХВК. Агароза, 1%, окрашено бромидом этидия.
вРНП
Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод, что сборка вРНП, собранных из РНК и БО начинается с 5'-конца РНК ХВК. По всей видимости, быстрая сборка вРНП происходит из-за высокого сродства БО и 5'-концевого района РНК. То есть, вероятно, для сборки вРНП необходимы первые 36 нт с 5'-конца РНК ХВК.
5. Трансляционная активация РНК ХВК в составе вРНП
На предыдущем работы, нами было показано, что
1) РНК ХВК не образует комплексы с ТБ1, которые можно идентифицировать методами АСМ или электронной микроскопией
2) ТБ1 с БО ХВК, в отсутствии РНК ХВК образуют нерастворимые нерегулярные агрегаты
3) При наличии в растворе ТБ1, РНК и БО ХВК, независимо от молярного соотношения компонентов, прежде всего образуется вРНП комплекс, состоящий из РНК и БО, имеющий спиральную структуру, аналогичную структуре вирусной частицы И только затем ТБ1 взаимодействует с частично реконструированным вирусом, присоединяясь к концу спиральной «головки» хвостатых частиц
На следующем этапе была изучена возможность трансляционной активации РНК в составе вРНП путем фосфорилирования и взаимодействия с ТБ1
Ранее в нашей лаборатории было показано, что РНК в составе вирионов ХВК недоступна для рибосом, но может быть трансляционно активирована путем фосфорилирования БО в составе вируса, либо при связывании вирусной частицы с ТБ1 (Atabekov et al, 2000, 2001) Можно предположить, что даже частичное связывание РНК ХВК с БО в вРНП препятствует её трансляции и репликации в случае, если 5'-концевая область РНК покрыта БО В следующих экспериментах мы изучали способность РНК транслироваться в составе вРНП (рис 9) Трансляцию РНК в составе вРНП оценивали в бесклеточной белоксинтезирующей системе из экстракта зародышей пшеницы (ЭЗП)
В контрольных экспериментах, было показано, что РНК ХВК не транслируется в составе нативного ХВК (рис 9, дор 1), но активируется после фосфорилирования вирионного БО т situ или добавления ТБ1 (рис 9, дор 2 и 3 соответственно)
В условиях образования вРНП БО эффективно подавляет трансляцию РНК ХВК (рис 9, дор 5, 6) Полное ингибирование достигается при молярном соотношении РНК БО 1 2000 Уменьшение количества БО сопровождается появлением свободной РНК, выявляемой методом АСМ в препаратах вРНП, сформированных при молярном соотношении РНК БО 1 700 (рис 2а) и методом торможения в геле По-видимому, именно не вовлеченная в сборку вРНП «свободная» РНК определяет синтез небольшого количества вирус-специфических белков в присутствии БО (рис 9, дор 5)
Как можно видеть на рисунке 8 (дор 10) при добавлении ТБ1 к вРНП, состоящему из БО и РНК ХВК происходит активация трансляции инкапсидированной
РНК. РНК в составе вРНП транслируется с той же эффективностью что и такое же количество свободной РНК.
1 2345 6789 10
Рис. 9 Трансляционная активация РНКХВК в составе вРНП.
Дорожки 1—4 (контроли): 1 - нативный ХВК; 2 ХВК, фосфорилированный in situ; 3 - ХВК + ТБ1; 4 - РНК ХВК. Дорожки 5—9 (вРНП): 5 - вРНП (1:700); 6 - вРНП (1:2000); 7 - вРНП (1:700), фосфорилированный in situ; 8 - вРНП (1:2000), фосфорилированный in situ; 9 - вРНП (1:2000), но БО фосфорилирован до сборки комплекса; 10- вРНП (1:700) + ТБ1. Фосфорилирование проводили с помощью протеинкиназы С (ПК-С). В скобках обозначены молярные отношения РНК: БО при сборке вРНП. Концентрация РНК в экстракте зародышей пшеницы составляла 40 мкг/мл. Стрелкой показано положение вирус-специфического продукта - РНК-полимеразы (165 кДа).
Радиоаэтограмма продуктов трансляции РНК ХВК после разделения электрофорезом в 8— 20%-ном ДСН-ПААГ.
Возможность активации трансляции РНК ХВК в составе частиц вРНП путем фосфорилирования БО проверяли в двух типах опытов: 1) фосфорилирование БО проводили in situ в составе преформированного вРНП (рис. 9, дор. 7, 8); или 2) сборку вРНП осуществляли с использованием, предварительно фосфорилированного препарата БО (рис. 9, дор. 9). В обоих вариантах фосфорилирование БО приводит к активации трансляции РНК, сопоставимой с эффективностью трансляции свободной РНК ХВК (рис. 9, дор. 4). Интересно, что по данным электронной микроскопии фосфорилирование БО не влияет на его способность формировать вРНП при инкубации с РНК. Из рисунка 9 (дор. 8, 9) следует, что, в отличие от нативного, фосфорилированный БО ХВК не является репрессором трансляции.
Фосфорилирование БО не препятствует процессу сборки вРНП, однако это не исключает возможность ослабления взаимодействий между субъединицами при сборке фосфорилированного БО, открывающего возможность «котрансляционной» разборки ХВК. Активация трансляции вРНП фосфорилированием БО может
являться результатом изменения конформации и, возможно, упаковки субъединиц БО в составе вРНП
Таким образом, РНК в составе вРНП, состоящего из БО и РНК, может исключаться из процесса трансляции и, так же как вирион ХВК, может вновь становиться доступной для рибосом после образования комплексов с ТБ1 или фосфорилирования БО в составе вРНП
6. Трансляционная активация РНК ХВК в составе вРНП,собранного из РНК и БО-Ptd
Известно, что при выделении препаратов ХВК из растительных экстрактов происходит частичная деградация белка оболочки /л situ с отщеплением N-концевого фрагмента и образованием из полноразмерной формы Ps процессированных форм Pi и Pf (Koenig et al, 1978) При обработке вируса трипсином N-концевой полипептид отщепляется и образуется Ptd (trypsin degradation) форма БО (БО-Ptd), близкая по электрофоретической подвижности к форме Pf Переход Ps-формы БО ХВК (русский штамм) в Ptd-форму сопровождается удалением 19 N-концевых аминокислот (Skryabin etat, 1988)
Как упоминалось выше, N-концевая часть белка оболочки ХВК обогащена остатками серина и треонина, являющимися потенциальными сайтами фосфорилирования, необходимыми для трансляционной активации РНК в составе вириона (Atabekov et al, 2001) Кроме того, известно, что она экспонирована на поверхности вирусных частиц и может быть доступна для протеинкиназ (Baratova et al, 1992)
Из препарата XBK-Ptd нами был получен БО-Ptd, который, по сути, является делеционным мутантом БО, у которого удален N-концевой полипептид, содержащий сайты фосфорилирования, необходимые для трансляционной активации
Ранее в нашей лаборатории было показано, что РНК в составе ХВК с укороченным белком оболочки (БО XBK-Ptd) не способны транслироваться in vitro, то есть протеолиз БО не является способом трансляционной активации вирионной РНК В то же время такие препараты начинали транслироваться после взаимодействия с ТБ1 ХВК, следовательно, обработка трипсином не сказывалась на целостности РНК и не нарушала участков БО, ответственных за взаимодействие с ТБ1 (Atabekob eia/,2001)
Прежде всего, нами было проверена способность РНК ХВК транслироваться в составе вРНП, полученного при инкубации РНК с БО-Ptd (вРНП-Ptd) Как было показано, предварительно фосфорилированный БО ХВК образует с РНК ХВК вРНП
способный направлять синтез вирусных белков без дополнительной активации (рис. 9, дор. 9). Однако, как видно из рисунка 10, на котором представлен элекгрофоретический анализ продуктов трансляции РНК в составе вРНП, содержащего БО ХВК-Р1с1, РНК в составе подобных вРНП не способна направлять синтез вирусных белков (рис. 10, дор. 2), как и РНК ХВК в составе вирионов.
Рис. 10. Трансляционная активация РНК ХВК в составе вРНП, собранных из РНК и БО ХВК-Р1с1.
1. вРНГШс! (1:700); 2. вРНГтс! (1:2000); 3. вРНП-Р1й (1:700), фосфорилированный; 4. вРНП-Р(с! (1:2000), фосфорилированный;
5. вРНП^ (1:700) + ТБ1; 6. вРНП-Ис! (1:2000) + ТБ1.
Радиоавтограф 8-20% ДСН-ПААГ продуктов трансляции РНК ХВК.
Далее мы попытались выяснить, как влияет на трансляционные свойства вРНП-Ptd фосфорилирование и образование комплекса вРНП с ТБ1.
Результаты трансляции вРНП-Ptd, фосфорилированного ПКС, представлены на рисунке 10 (дор. 3, 4). Оказалось, что, как и в случае XBK-Ptd, в отличие от нативного вируса, РНК в составе вРНП-Ptd в результате фосфорилирования ПКС не приобретает способности транслироваться, так как необходимые для активации сайты фосфорилирования удалены.
В то же время ТБ1 при инкубации в молярном отношении 100:1 с вРНП-Ptd в трансляционной системе способен переводить РНК в составе вРНП-Ptd в транслируемую форму (рис. 10, дор. 6), также как и в составе нативного ХВК, что подтверждает данные нашей лаборатории о том, что в трансляционной активации путем фосфорилирования или взаимодействия с ТБ1 участвуют разные домены БО ХВК.
Таким образом, удаление N-концевого пептида БО подавляет эффект трансляционной активации путем фосфорилирования БО, но сохраняет активность БО как трансляционного репрессора.
7. БО мутантного ХВК-БТ, содержащего нефосфорилируемый N-кoнeц утрачивает способность подавлять трансляцию РНК в составе вРНП
Описанные результаты позволили предположить, что присутствие фосфорилируемых серина и треонина в Ы-концевом пептиде БО ХВК обеспечивает трансляционную активацию РНК ХВК в составе вРНП и нативного ХВК. Для дальнейшего изучения этого вопроса ранее в нашей лаборатории был сконструирован мутант ХВК-8Т. Все остатки серина и треонина в составе Ы-концевого пептида БО ХВК-БТ были замещены на нефосфорилируемые аминокислотные остатки - глицин и аланин соответственно. Предполагалось, что невозможность фосфорилирования Ы-концевого пептида БО ХВК-ЭТ проявится с одной стороны, в снижении инфекционности вируса-мутанта, а с другой - в невозможности активации трансляции РНК с помощью фосфорилирования БО в составе вирионов ХВК-ЭТ. Однако оказалось, что в отличие от вирионов ХВК дикого типа, РНК ХВК-БТ эффективно транслируется в составе вирионов. Более того, способность к трансляции РНК в составе вирионов ХВК-8Т-Р1с( (ХВК-ЗТ, обработанные трипсином), сохраняется и после удаления Ы-концевого пептида БО
Рис. 11. Трансляционные свойства мутанта ХВК-ЗТ: активация трансляции РНК ХВК нефосфорилируемым БО в составе «смешанных» вРНП.
1 - РНК ХВК; 2 - вРНП ХВК (1:2000) «РНК + БО дикого типа»; 3 - вирионы ХВК-ЭТ; 4 -«смешанный» вРНП «РНК ХВК + БО ХВК-ЭТ» (1:2000); 5 - РНК ХВК-ЭТ; 6 - «смешанный» вРНП «РНК ХВК-БТ + БО ХВК» (1:2000); 7 -вРНП-ЭТ (1:2000) «РНК + БО ХВК-ЭТ». Концентрация РНК в экстракте зародышей пшеницы составляла 40 мкг/мл. Стрелкой показано положение вирус-специфического продукта - РНК-полимеразы (165 кДа).
(Козловский и др., 2003).
1 2 3 4 5 6 7
Мы изучили возможность сборки вРНП, собранных из РНК и БО-ST, содержащего нефосфорилируемый N-конец. Подобный вРНП способен эффективно собираться in vitro, а наличие олигодезоксиоибонуклеотида, комплементарного 5'-концу РНК ХВК, также как и в случае с вРНП, собранных из РНК и нативного БО, также подавляет сборку. Под электронным микроскопом частицы вРНП, собранные из РНК XBK-ST и БО XBK-ST не отличались от вРНП, собранных из РНК и БО ХВК.
Для подтверждения ключевой роли N-концевого участка БО ХВК в изменении трансляционных свойств вирионной РНК, были собраны /л vitro «гомологичные» (БО и РНК из XBK-ST) и «смешанные» формы вРНП («БО ХВК-ST + РНК ХВК дикого типа» и «РНК XBK-ST + БО дикого типа») Как видно из рисунка 11, в отличие от БО ХВК дикого типа, БО мутанта XBK-ST не является релрессором трансляции (рис 11,дор 4,7) Этот эффект проявляется также при взаимодействии БО XBK-ST с РНК дикого типа (рис 11, дор 4) С другой стороны, БО дикого типа проявляет свойства трансляционного репрессора независимо от происхождения РНК (рис 11, дор 2,6) Вероятно, аминокислотные замены в N-концевом пептиде БО-ST привели к некоторым изменениям в структуре белковых субъединиц и их упаковки в составе вРНП В результате 5'-концевая область РНК вРНП-ST и вирионов XBK-ST стала доступной для рибосом независимо от фосфорилирования БО XBK-ST, утратившего свойства трансляционного репрессора
Таким образом, в результате проведенных экспериментов при инкубации РНК, БО и ТБ1 ХВК рибонуклеопротеидов невирионной природы обнаружено не было С помощью атомно-силовой и электронной микроскопии были обнаружены вРНП, которые были названы «однохвостые» частицы (STP - single taile particles) вРНП имели спиральную «головку», идентичную по своей структуре белковой спирали вириона и «хвост» - свободную от БО РНК РНК в составе вРНП, так же как и в составе вириона может исключаться из процесса трансляции, а после перехода в соседнюю клетку вновь трансляционно активироваться путем фосфорилирования БО в составе вРНП или при взаимодействии вРНП с ТБ1
Показано, что две модели транспортной формы не противоречат друг другу Следовательно, РНК ХВК может транспортироваться в виде вириона частично (вРНП) или полностью одетого В любом случае, ТБ1 образует комплекс с вирионом или вРНП, присоединяясь к торцу частицы, соответствующему 5'-концу РНК Продемонстрирована ключевая роль N-концевого полипептида БО ХВК как регулятора трансляции РНК в составе вРНП
выводы
1 Показано, что при инкубации РНК, БО и ТБ1 ХВК in vitro формируются вирусные рибонуклеопротеиды (вРНП), 5'-конец РНК которых инкапсидирован БО в виде «головки» со структурой белковой спирали вирионов ХВК, а 3'- конец свободен («однохвостые» частицы)
2 При инкубации РНК, БО и ТБ1 ХВК m vitro не обнаружено структур невирионной природы
3 Показано, что РНК ХВК в составе вРНП, образованного при различных молярных соотношениях РНК и БО, не способна транслироваться m vitro, но трансляционно активируется при фосфорилировании БО в составе вРНП или образовании комплекса вРНП с ТБ1
4 Предположительно транспортной формой потексвирусов может являться вирион или вирусная РНК частично одетая белком оболочки («однохвостые» частицы)
5 Показана ключевая роль N-концевого участка БО в регуляции трансляции РНК в составе вирусного рибонуклеопротеида
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1 Никитин НА (2005) Трансляционная активация РНК X вируса картофеля в составе вирусного рибонуклеопротеида Сборник студенческих работ «Биотехнология - охране окружающей среды» под редакцией А П Садчикова и С В Котелевцева, Москва, стр 351-354
2 Карпова О В , Архипенко M В , Заякина О В , Никитин НА, Киселева О И , Козловский С В , Родионова H П , Атабеков И Г (2006) Регуляция трансляции РНК в комплексах с белком оболочки Х-вируса картофеля ключевая роль N-концевого пептида белка Молекулярная биология 40(4), стр 703-710
3 Zayakina Olga, Arkhtpenko Manna, Kozlovsky Stanislav, Nikitin Nikolai, Smirnov Alexander, Susi Petri, Rodionova Nina, Karpova Olga and Atabekov Joseph (2008) Mutagenic analysis of Potato Virus X movement protein (TGBpl) and the coat protein (CP) in vitro TGBp1-CP binding and viral RNA translation activation Molecular Plant Pathology 9(1), 37-44
4 Никитин HA (2005) Трансляционная активация РНК X вируса в составе рибонуклеопротеида картофеля фосфорилированием белка оболочки и взаимодействием с транспортным белком 1 (ТБ1) Тезисы докладов XII Международной конференции «Ломоносов - 2005», Москва, стр 159
20
5 Karpova О V, Arkhipenko M V, Zayakina О V, Nikitin N A, Rodionova N P and Atabekov J G (2005) Protein-protein and RNA-protein interaction in the assembly in vitro complexes from potato virus X RNA, coat and movement proteins Abstracts of 30th FEBS Congress, Budapest, Hungary, 125
6 Никитин H.A (2005) Трансляционная активация РНК X вируса картофеля в составе вирусного рибонуклеопротеида Тезисы докладов международной школы-конференции молодых ученых «Системная биология и биоинженерия», Москва, стр 111-112
7 Nikitin N А, Karpova О V, Zayakina О V, Arkhipenko М А, Rodionova N Р , and Atabekov J G (2006) In Vitro Assembly of Triple Complexes from Potato Virus X RNA, Coat Protein and the 25-kDa Movement Protein Abstracts of The 2006 In Vitro Biology Meeting, Minneapolis, Minnesota, 48
8 Никитин HA (2007) Изучение нового высокопатогенного штамма X вируса картофеля Тезисы докладов международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2007», секция «Биология», Москва, стр 9
9 Zayakina О , Arkhipenko М , Nikitin N , Rodionova N , Karpova О , Atabekov J (2007) The Key Role of Potato Virus X Coat Protein C-Terminal Region in Encapsidated RNA Translational Activation Abstracts of 32nd FEBS Congress, Vienna, Austria, 129
10 Arkhipenko MV, Nikitin NA, Smirnov AA, Novikov VK, Rodionova NP, Karpova О V and Atabekov J G (2007) The new highly pathogenic strain of Potato virus X Abstract to The 10th International Plant Virus Epidemiology symposium, Hyderabad, India, 106
11 Никитин H A, Архипенко M В, Мухамеджанова A A, Родионова H П , Карпова О В, Атабеков И Г (2008) Применение спиральных вирусов растений для создания наноконтейнеров Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, Россия, стр 295
Подписано в печать 24 09 2008 г
Печать трафаретная
Заказ № 842 Тираж 100 экз
Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш, 36 (499) 788-78-56 www autoreferat ru
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Никитин, Николай Александрович
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. СБОКА ПОТЕКСВИРУСОВ in vitro.
2. ДИССОЦИАЦИЯ ВИРИОНОВ ХВК
2.1. Влияние концентрации солей на диссоциацию вирионов.
2.2. Влияние температуры и детергентов на стабильность и диссоциацию вирионов ХВК.
2.3. Линейная дестабилизация и разборка вирионов ХВК при взаимодействии с ТБ1 ХВК.
2.4. Дестабилизация и разборка ХВК при фосфорилировании БО в составе вириона.
3. ТРАНСПОРТНЫЕ ФОРМЫ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ.
3.1 Транспортные формы потексвирусов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
РЕЗУЛЬТАТЫ.
1. Изучение структуры вРНП, собранного in vitro из РНК ХВК, БО и ТБ1.
1.1 В отсутствие РНК ХВК БО и ТБ1 образуют нерастворимый комплекс
1.2 Исследование методом АСМ частиц вРНП, образованных при различных молярных соотношениях «РНК : БО».
1.3 ТБ1 связывается с одним из концов вРНП.
1.4 Анализ вРНП методом торможения в геле.
1.5 Сборка вРНП начинается с 5-конца РНК ХВК.
2. Изучение трансляционной активации РНК в составе вРНП.
2.1 Фосфорилирование БО в составе ХВК.
2.2 Трансляционная активация РНК ХВК в составе вРНП.
2.3 Трансляционная активация РНК ХВК в составе вРНП,собранного из РНК и БО-Ptd.
2.4 БО мутантного ХВК, содержащего нефосфорилируемый N-конец утрачивает способность подавлять трансляцию
РНК в составе вРНП.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
ВЫВОДЫ.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структуры транспортного вирусного рибонуклеопротеида X вируса картофеля и способов трансляционной активации РНК в его составе"
Транспорт вирусной инфекции в зараженном растении является одной из наиболее интенсивно изучаемых проблем современной фитовирусологии.
В момент заражения растения вирусом только небольшое количество клеток оказывается инфицированными. Для развития инфекции необходимо перемещение вируса от зараженных клеток в здоровые. Межклеточный транспорт фитовирусов является активным процессом, происходит через плазмодесмы и для него необходимы кодируемые вирусом транспортные белки (ТБ) (Atabekov & Dorokhov, 1984; Atabekov & Taliansky, 1990).
Объект нашего исследования - X вирус картофеля (ХВК) - типичный представитель рода Potexvirus семейства Flexiviridae, содержащий геномную одноцепочечную «плюс» РНК.
В литературе были предложены две модели транспортной формы при межклеточной транслокации генома потексвирусов: нативные вирионы (Oparka et al., 1996; Santa Cruz et al., 1998) или комплексы невирионного типа, состоящие из вирусной РНК, белка оболочки (БО) и транспортного белка (ТБ1) (Lough et al., 1998; 2000). При изучении транспортной формы вируса Lough et al. (1998) инкубировали вирусную РНК с БО и ТБ1 и использовали смесь для микроинъекций. Однако структура таких комплексов изучена не была.
Независимо от структуры транспортной формы, вирусная РНК в ее составе должна исключается из процессов репликации и трансляции и вновь становится доступной для рибосом в процессе развития инфекции.
Ранее в нашей лаборатории было показано, что в отличие от ряда вирусов, РНК ХВК в составе вириона недоступна для рибосом. Но она становится доступной в результате: 1) фосфорилирования N- концевого полипептида БО вируса in situ протеинкиназами серинового типа или 2) при взаимодействи ХВК с ТБ1 (Atabekov et al., 2000; 2001; Rodionova et al., 2003;).
В связи с этим, целью настоящей работы было изучение структуры рибонуклеопротеидов, собранных in vitro из РНК, БО и ТБ1 ХВК (возможной транспортной формы потексвирусов), а также выяснение возможности трансляционной активации РНК ХВК в составе тройных комплексов РНК-БО-ТБ1.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Вирусы рода Potexvirus семейства Flexviridae представляют собой нитевидные вирионы длиной 470-580 нм и шириной около 13 нм с однонитевой позитивной геномной РНК размером от 5,8 до 7,0 х 106 (Atabekov, 1995). Геномная РНК содержит на 5'-конце кэп-структуру, на 3'-конце - поли- А-последовательность и, как правило, 5 открытых рамок считывания (ОРС). 5'-проксимальный ген кодирует вирусную репликазу массой 165 кДа, транслирующуюся непосредственно с геномной РНК; три транспортных белка (ТБ1, ТБ2, ТБЗ - продукты «тройного блока генов») и белок оболочки транслируются с субгеномных РНК (Morozov et al., 1991). ОРС 5 на 3'-конце генома кодирует белок оболочки размером от 18 до 27 кДа.
Типовым представителем рода Potexvirus является X вирус картофеля (ХВК). Вирионы ХВК представляют собой гибкие нитевидные частицы длиной 515 нм и диаметром 13.5 нм. Вирион ХВК содержит около 1300 идентичных субъединиц белка оболочки (БО), упакованных в виде спирали, между оборотами которых заключена вирусная РНК (Tollin and Wilson, 1998). 8.9 субъединиц БО (каждая субъединица состоит из 236 аминокислотных остатков) приходится на один шаг спирали длиной 3,4 нм (Varma et al., 1968; Parker et al., 2002). Его геном представлен одноцепочечной «плюс» РНК длиной 6435 нуклеотидов (Skryabin et al., 1988). РНК ХВК кодирует пять белков: вирусную репликазу массой 165 кДа, три транспортных белка (ТБ1, ТБ2, ТБЗ массами 25 кДа, 12 кДа и 8 - кДа, соответсвенно) и БО массой 25 кДа (Morozov et al., 1991).
Для межклеточного транспорта ХВК необходимы все три транспортных белка (Morozov et al., 1991), а также БО (Chapman et al.,. 1992). Наиболее изученным является продукт первой ОРС ТБГ с молекулярной массой 25К (ТБ1). ТБ1 способен увеличивать пропускную способность плазмодесм (Lough et al., 2000); содержит последовательности, характерные для хеликаз (Gorbalenya et al., 1988); кроме того 25К обладает активностью ]\^2+-зависимой НТФазы и слабой РНК-связывающей активностью (Kalinina et al., 1996, 2002). Также ТБ1 является супрессором посттранскрипционного умолкания генов в растениях (Voinnet et al., 2000).
1. Сборка потексвирусов in vitro
Вирусы обладают уникальной способностью к самосборке in vitro. ХВК является первым нитевидным вирусом растений реконструированным in vitro из РНК и БО (Новиков и др., 1972; Goodman et al., 1975; Kaftanova et al., 1975; Dobrov and Atabekov, 1989; Goodman, 1977). Реконструкция вирусных частиц была наиболее эффективной при рН от 6,5 до 7,0 от 20 до 25°С и низкой ионной силе инкубационного буфера (0,01 М). В этих условиях выход реконструированных частиц составлял 40-60%. При повышении ионной силы при добавлении в инкубационную смесь NaCl или КС1 до концентрации 0,1 М сборка не происходила. По данным электронной микроскопии, полученные реконструированные частицы отличались от нативного вируса более рыхлой структурой и меньшей длиной частиц по сравнению с вирионами ХВК (Новиков и др., 1972). Однако в работе Kaftanova с соавторами (1975) не были обнаружены различия в структуре вириона и вирусного рибонуклеопротеида (вРНП), реконструированного из РНК и БО ХВК. Инфекционность таких частиц была ниже нативного ХВК (Dobrov and Atabekov., 1989).
Схожие результаты были получены Goodman с соавторами (Goodman et al., 1975, 1976, 1977), который использовал штамм XnR ХВК. Goodman с соавторами показал, что наиболее эффективно реконструкция идет при более низких рН (6,0 — 6,2), а в течение первых минут реконструкции мутность раствора увеличивается более чем на 50% (OD3i0)
Goodman et al., 1975). Было обнаружено, что, несмотря на то, что 0,1 М NaCl ингибирует сборку ХВК (Новиков и др., 1972), сборка не ингибировалась при добавлении в инкубационную смесь цвиттер-ионного буфера (например, бицин или морфолин) до конечной концентрации 0,2 М (Goodman et al., 1975).
Для другого потексвируса, вируса мозаики папайи (ВМП), обнаружено, что наиболее эффективно реконструкция происходит при рН 8.0, 25°С и низкой ионной силе. Эффективность образования реконструированных частиц в этих условиях достигала 90%, но инфекционность была низкой (всего несколько процентов) (Erickson and Bancroft, 1978), как и в случае реконструированных частиц ХВК. Показано, о что на первом этапе сборки ВМП формируются короткие (около 500А) частицы, независимо от температуры (от 1°С до 25°С), но элонгация происходит только при 25°С. При 1°С (или 25°С, но с небольшим количеством белка) образуются только короткие частицы. Фрагменты РНК, выделенные из этих частиц, имели длину около 200 нуютеотидов с 5'-конца. Определен нуклеотидный набор этих фрагментов. Было обнаружено, что эти фрагменты РНК богаты аденином (42% против 33% в тотальной РНК) и бедны гуанином (16 против 22%, соответственно) (Abou-Haidar and Bancroft, 1978).
Основные результаты по реконструкции потексвирусов были получены несколько десятилетий назад. С тех пор изменились методы получения чистых препаратов, компонентов вируса, не содержащих примеси клеточных ферментов. Недавние эксперименты показали, что в случае, если в инкубационную смесь добавляли ингибитор РНКаз, уровень специфической инфекционности на растениях Chenopodium amaranticor, зараженных реконструированным ХВК, собранным в 10 мм Трис-HCl, рН 7.0-7.5, был сопоставим с нативным ХВК (Atabekov et al., 2007).
При сборке ХВК, согласно Новикову с соавторами и Kaftanova с соавторами (Новиков и др., 1972; Kaftanova et al., 1975), БО ХВК присутствует в растворе в виде смеси небольших от 2S до 5S и 10-12S агрегатов, а согласно Goodman с соавторами - в форме 2.3S мономерных субъединиц (Goodman et al., 1975).
Было предпринято несколько попыток полимеризации БО ХВК в отсутствие РНК in vitro. Однако, обнаружить полимеры БО со спиральной структурой, идентичной структуре вириона и сопоставимых с ними по размерам не удалось (Новиков и др., 1972; Kaftanova et al., 1975; Goodman et al., 1975). Тем не менее, частичная полимеризация БО ХВК оказалась возможной при добавлении фосфатного буфера в инкубационную смесь, содержащую диализованный белок, до конечной концентрации 0,2 М (рН 7,0 -7,5) и выдерживании раствора в течение 24 ч при 4-20 °С. Образование одно- и двухслойных белковых дисков можно наблюдать методом электронной микроскопии (Kaftanova et al., 1975). Диаметр дисков и диаметр центрального канала был аналогичен интактным частицам ХВК и составлял около 4 нм. При дальнейшей инкубации раствора, содержащего БО в фосфатном буфере, диски начинали агрегировать в стопки, состоящие из 14-16 дисков. Показано, что образование стопок дисков предпочтительнее коротких спиральных структур (Kaftanova et al., 1975). Для ВМП было показано, что белок оболочки ВМП может реполимеризоваться в длинные вирусоподобные спиральные частицы в отсутствие РНК (Erickson et al. 1976; Tremblay et al. 2006). Вероятно, белки оболочки разных потексвирусов обладают разными свойствами: одни способны к эффективной полимеризации в отсутствии РНК, а другие нет.
На рисунке 1 показано изменение степени полимеризации БО ВМП в зависимости от рН и температуры. Показано, что в различных условиях может быть обнаружен БО в форме стопки дисков с коэффициентом седиментации 14S, представляющие собой результат полимеризации 18 субъединиц БО ВМП, из которых- формируются два витка вирусной спирали (Erickson et al., 1983). При значениях рН от 4,5 до 6,5 весь белок находится в этой форме. При низких и высоких значениях рН, независимо от температуры, обнаруживаются мономеры или димеры БО ВМП с коэффициентами седиментации 2-3S. При рН 4,0 и температуре выше 5°С в растворе, содержащем БО ВМП, формируются нитевидные палочковидные частицы со спиральной структурой и с коэффициентами седиментации от 100-120S и 230-250S. Другие промежуточные формы БО с коэффициентами седиментации от 14S до 25S можно наблюдать между значениями рН от 6,5 до 9,5 (Erickson et al., 1976, 1981).
3456789 10
РН
Рис. 1. Влияние температуры и рН на полимеризацию белка оболочки ВМП (Erickson et al., 1981 ).
Показана зависимость образования полимеров БО ВМП с различным коэффициентом седиментации от концентрации БО ВМП в растворе. При 0,1 мг/мл БО ВМП находится в форме 2-3S (мономеры и димеры), при 0,25 мг/мл появляются 14S агрегаты, и при концентрации более чем 1 мг/мл они преобразуются в агрегаты 27-3OS (Erickson et al., 1976, 1978). Впоследствии было показано, что 14S агрегаты соответствуют двухслойным дискам (18 субъединиц белка) или двойному обороту спирали (Erickson et al,, 1981, 1983), Переход из одной формы БО ВМП в другую при изменении концентрации происходит быстро. Мономеры и/или небольшие агрегаты БО ВМП, вероятно, используются в течение элонгации, а форма белка, использующаяся для инициации сборки, пока остается неизвестной.
Показана возможность полимеризации рекомбинантного БО ВМП, экспрессируемого в E.coli, содержащего на С-конце гистидины (Tremblay et al., 2006). Полимеры БО ВМП обладают высокой иммуногенностью и с успехом используются в качестве платформы, несущей гетерологичные эпитопы, с целью получения специфических антител (Denis et al., 2007). Получить мономеры рекомбинантного белка возможно только в случае делеции с N-конца 26 аминокислотных остатков, в результате чего БО ВМП теряет способность полимеризоваться и связывать РНК in vitro (Lecours et al., 2006).
Известно, что N-концевая часть белка оболочки ХВК экспонирована на поверхности вирусных частиц (Baratova et al., 1992) и участвует в образовании высоко иммуногенной антигенной детеминанты (Koenig and Torrance, 1986; Sober et al., 1988), тогда как С-конец БО скрыт внутри вирусной частицы.
Показано, что частицы ХВК формируют вокруг себя гидратную оболочку из связанных молекул воды. Этому способствует высокое содержание окси-аминокислот в расположенном на поверхности вириона N-конце БО и присутствие в нем остатков Сахаров (Baratova et al., 2004). Известно, что присутствие воды в непосредственной близости от поверхности белков существенно для их сворачивания, стабильности, узнавания и активности (Gerken et al., 1989). Вероятно, подобные взаимодействия имеют большое значение для формирования правильной структуры вириона.
Важным вопросом является локализация участка инициации сборки потексвирусов. Детально этот вопрос изучен на примере сборки ВМП. Показано, что первые 138 нуклеотидов на 5'-конце РНК ВМП содержат участок инициации сборки (Lok and AbouHaidar, 1986). Первые 40 нуклеотидов РНК ВМП богаты аденозином, бедны уридином, и содержат 8 следующих друг за другом повторяющихся пентамеров (GCAAA). Эти 8 пентамеров возможно взаимодействуют с субъединицами БО, расположенных на поверхности двухслойных дисков. Также как и в случае ВМП, 5'-концевая последовательность ХВК состоит из С/А-богатых участков и содержит следующие блоки: GAAAAA, АААСС, САССАА, АСАССАА, СААСА, ССААА (Skryabin et al, 1988). Вполне вероятно, что именно этот участок является участком инициации сборки вирусных частиц ХВК. Районы РНК, богатые аденином и цитозином не имеют вторичной структуры, что, вероятно, способствует взаимодействию БО с РНК и сборке дисков БО в спиральную структуру (Erickson et al., 1978; Abouhaidar and Bancroft, 1979; Abouhaidar and Bancroft, 1980; Erickson and Bancroft, 1980; Sit et al, 1994).
В 1996 году было высказано предположение, что 5'-район РНК ХВК участвует в координации вирусной сборки, транспорте и репликации (Kim and Hemenway, 1996). Kwon с соавторами (2005) обнаружили, что в ходе сборки ХВК вирусный БО специфично распознает район, расположенный в 5'-концевом stem-loop 1 (SL1) регионе (51-84 нт) РНК ХВК. Кроме того, регуляторные элементы, необходимые для связывания РНК с БО были локализованы в области 1-107 нт РНК ХВК (Lough et al, 2006). Было показано, что частицы, полученные при сборке полноразмерных транскриптов ХВК, синтезированных in vitro, короче частиц, собранных из вирусной РНК. Авторы предполагают, что есть еще неизвестные факторы, которые могут ограничивать восстановление полной длины частиц (Kwon et al, 2005).
Имеются данные, что в вирион потексвирусов вируса мозаики нарцисса и вируса мозаики бамбука помимо геномной РНК могут упаковываться субгеномные РНК (Annamalai and Rao, 2006; Cjoi and Rao, 2000; Lee et al, 1998; Short and Davies, 1983).
Для потексвирусов показана возможность реконструкции БО с гетерологичными РНК. В случае ВМП, при ионной силе 1=0,01 и рН 8,0,
БО ВМП формирует вирусоподобные, палочковидные частицы только с гомологичной РНК (РНК ВМП), РНК близкородственного вируса мозаики желтого клевера (ВМЖК), полиаденином и полицитозином. С РНК вируса табачной мозаики (ВТМ) и вируса мозаики костра (ВМК), а также с полиуридином и полигуанином, БО ВМП с большой скоростью формирует в этих условиях тонкие, чувствительные к РНКазам, частицы, которые авторы называют «растянутыми частицами» (Erickson et al., 1978). При более низких рН (6,0 - 7,5) БО ВМП формирует (с гомологичными и гетерологичными РНК) частицы другого, третьего типа, с таким же диаметром как у ВМП, но большим количеством изломов («kinked particles») (Erickson and Bancroft, 1978; Erickson et al., 1978). Авторы предполагают, что формирование подобных частиц является результатом множественной инициации. Другими словами, при рН<7,5 специфичность инициации сборки ВМП на 5'-конце теряется (Erickson et al., 1978). Показана возможность сборки БО ВМП с ДНК. Подобная сборка была осуществлена в условиях неспецифической сборки, т.е при рН 6,0 (Abouhaidar and Bancroft, 1979; Erickson and Bancroft, 1980).
Для ХВК показано, что в растворах с низкой ионной силой (0,0001-0,001 М трис-HCl), рН 6,8-7,3, при комнатной температуре, инкубация БО ХВК с гетерологичными вирусными РНК (ВТМ, ВМК) приводила к образованию палочковидных нуклеопротеидных частиц. Такие частицы характеризовались типичным для спиральных вирусных нуклеопротеидов спектром поглощения в УФ-свете, имели коэффициенты седиментации в интервале 55-63S (у нативного вируса 110S) и в иммунологическом отношении были сходны с нативным вирусным нуклеопротеидом и отличались от низкомолекулярного белка ХВК. Выход нуклеопротеида в этих условиях составил приблизительно 20-30% и резко снижался при повышении ионной силы (при добавлении хлористого натрия или фосфатного буфера) в инкубационной смеси. При изучении полученных препаратов в электронном микроскопе обнаруживали большое количество палочковидных частиц, различающихся по длине и имеющих диаметр, сходный с диаметром нативного вируса. Все полученные препараты нуклеопротеидов, содержащих БО ХВК и гетерологичные РНК, не обладали инфекционностью (Новиков и др., 1972).
Bancroft с соавторами (1979) изучали сборку другого потексвируса - вируса мозаики желтого клевера (ВМЖК). Было обнаружено, что процесс сборки ВМЖК очень похож на сборку ВМП и ХВК. При ионной силе 1=0,01 и рН 7,5 БО ВМЖК формировал нормальные палочковидные частицы не только с гомологичными РНК, но также с РНК ВМП и РНК сферического вируса мозаики костра (ВМК). Как в случае с ВМП, реконструкция ВМЖК ингибируется при низких температурах и инфекционность реконструированого вируса низка (не более нескольких процентов).
Показано, что скорость элонгации гомологичной сборки строго зависит от концентрации БО. При весовом соотношении РНК:БО 1:20 сборка проходит за 20 минут, а при соотношении 1:80 она занимает всего 5 минут. Но даже при соотношении РНК:БО 1:20 мутность раствора повышается примерно на 40% на первых минутах реакции. Неспецифичная сборка с множественной инициацией (при рН<7,5) происходит еще быстрее. (Erickson and Bancroft, 1978). Аналогичные результаты были получены при исследовании скорости элонгации при гомологичной реконструкции ХВК in vitro (Новиков и др., 1972).
Abou-Haidar с соавторами (1979) показали, что при реконструкции ВМП, в присутствие солей Na+ и Mg2+, происходило ингибирование сборки. Сборку нельзя было обнаружить при добавлении 0,06М NaCl или 0,001М MgC^ в инкубационную смесь, содержащую БО ВМП при рН 8.0. При этом, добавление солей существенно стабилизировало вторичную структуру РНК ВМП. С другой стороны, при добавлении катионов в концентрации, необходимой для ингибирования, не происходило изменение структуры субъединиц БО ВМП или их способности реполимеризоваться в отсутствие РНК. В случае ХВК, цвиттерионный буфер (бицин в концентрации 0.2М) не ингибировал сборку (Goodman, 1977). Исходя из этих данных, было предложено, что эффект ингибирования сборки потексвирусов in vitro катионами обусловлен стабилизацией вторичной структуры РНК (Abou-Haidar et al., 1979).
Показано, что БО потексвирусов обладает способностью плавить вторичную структуру РНК. Было высказано предположение, что активность плавления белками определялась их способностью неспецифически связывать РНК вдоль всей ее длины (Erickson and Bancroft, 1980). В результате такого связывания могут образовываться тонкие вытянутые частицы. Авторы предположили, что быстрое формирование вытянутых частиц в результате электростатического «налипания» БО ВМП к РНК является отдельным этапом сборки и предложили схему сборки потексвирусов, состоящую из трех стадий.
Первым этапом этого процесса является быстрое неспецифическое связывание БО со всей молекулой РНК, что приводит к плавлению РНК и формированию тонких длинных частиц. На втором этапе происходит инициация сборки, то есть формирование правильного палочковидного участка в районе 5'-конца РНК. Третьим этапом сборки, согласно этой модели, является элонгация, которая проявляется как волнообразная спиральная перестройка субъединиц БО в комплексе РНК-БО, начиная с 5'-конца РНК. Спиральная перестройка одного сегмента комплекса вызвана спиральной структурой предшествующего (5') сегмента. Такая модель сборки исключает использование больших белковых полимеров во время элонгации. Быстрое повышение мутности от 40 до 50% в конечном объеме, наблюдаемое при сборке ХВК и ВМП, в этом случае, соответствует первой стадии сборки, то есть формированию неспецифических растянутых комплексов РНК-БО.
Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Никитин, Николай Александрович
выводы
1. Показано, что при инкубации РНК, БО и ТБ1 ХВК in vitro формируются вирусные рибонуклеопротеиды (вРНП), 5'-конец РНК которых инкапсидирован БО в виде «головки» со структурой белковой спирали ХВК, а 3'- конец свободен («однохвостые» частицы).
2. При инкубации РНК, БО и ТБ1 ХВК in vitro не обнаружено структур невирионной природы.
3. Показано, что РНК ХВК в составе вРНП, образованного при различных молярных соотношениях РНК и БО, не способна транслироваться in vitro, но трансляционно активируется при фосфорилировании БО в составе вРНП или образовании комплекса вРНП с ТБ1.
4. Предположительно транспортной формой потексвирусов может являться вирион или вирусная РНК частично одетая белком оболочки («однохвостые» частицы).
5. Показана ключевая роль N-концевого участка БО в регуляции трансляции РНК в составе вирусного рибонуклеопротеида.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никитин, Николай Александрович, Москва
1. Карпова О.В., Козловский С.В., Архипенко М.В., Заякина О.В., Решетникова В.Г., Родионова Н.П., академик Атабеков И.Г. (2002) Сравнительная характеристика протеинкиназ, фосфорилирующих in vitro транспортный белок ВТМ. Докл. Акад. Наук 386(6), 825-827.
2. Козловский С.В., Карпова О.В., Архипенко М.В., Заякина О.В., Родионова Н.П., академик Атабеков И.Г. (2003) Влияние N-концевой области белка оболочки X вируса картофеля на структуру вирусных частиц. Доклады Академии Наук 391(1), стр. 1-3.
3. Новиков В.К., Кимаев В.З., Атабеков И.Г. (1971). Реконструкция нуклеопротеида вируса X картофеля. Доклады Академии наук СССР. 204, (5), 1259-1262.
4. AbouHaidar М. and Bancroft J.B. (1978) The initiation of papaya mosaic virus assembly. Virology, 90, 54-59.
5. Abouhaidar M. and Bancroft J.B. (1979) Sequential encapsidation of heterologous RNAs with papaya mosaic virus protein. Virology 93(1), 253-258.
6. AbouHaidar M., Erickson J.W. and Bancroft J.B. (1979) The inhibition of papaya mosaic virus assembly related to the effect of cations on its RNA. Viology 98,116-120.
7. Abouhaidar M.G. and Bancroft J.B. (1980) The polarity of assembly of papaya mosaic-virus and tobacco mosaicvirus RNAs with PMV-protein under conditions of nonspecificity. Virology 107, 202-207.
8. AbouHaidar M.G. and Erickson J.W. (1985). Structure and in vitro assembly of papaya mosaic virus. In Molecular Plant Virology, Vol.1 85121, CRC Press, Boca Raton, FL.
9. Annamalai P., and Rao A.L. (2006) Delivery and Expression of functional viral RNA genomes in planta by agroinfiltration, Curr Pro toe Microbiol. 16(B), 2.
10. Andreev I.A, Kim S.H., Kalinina N.O., Rakitina D.V., Fitzgerald A.G., Palukaitis P. and Taliansky M.E. (2004) Molecular interactions between a plant virus movement protein and RNA: force spectroscopy investigation. J. Mol. Biol. 339, 1041-1047.
11. Angell S.M., Davies C. and Baulcombe D.C. (1996) Cell-to-cell movement of potato virus X is associated with a change in the size exclusion limit of plasmodesmata in trichome cells of Nicotiana clevelandii. Virology 215, 197—201.
12. Atabekov J.G., Dorokhov Yu.L. (1984) Plant virus-specific transport function and resistance of plants to viruses. Adv Virus Res 29: 313-364.
13. Atabekov I. G., Rodionova N. P., Karpova О. V., Kozlovsky S. V., Poljakov V. Yu. (2000) The movement protein triggered in situ conversion of potato virus X virion RNA from a nontranslatable into a translatable form. Virology, 271, 259-263.
14. Atabekov J.G., Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Novikov, V.K., Arkhipenko M.V. (2001) Translational activation of encapsidated potato virus X RNA by coat protein phosphorylation. Virology, 286, 466474.
15. Atabekov J., Dobrov E., Karpova O. And Rodionova N. (2007) Potato virus X: structure, disassembly and reconstitution. Molecular Plant Patalogy 8(5 ), 667-675.
16. Bancroft J.B., AbouHaidar M. and Erickson J.W. (1979) The assembly of clover yellow mosaic virus and its protein. Virology 98, 12 1-130.
17. Baratova L.A., Grebenshchikov N.I., Shishkov A.V., Kashirin I.A., Radavsky J.I., Jarvekulg L., Saarma M. (1992) J.Gen. Virol., 73, 229-235.
18. Batten J.S., Yoshinari S. and Hemenway C. (2003) Potato virus X: a model system for virus replication, movement and gene expression. Molecular Plant Pathology 4(2), 125-131.
19. Beck D.L., Guilford P.J., Voot D.M., Andersen M.T. and Forster R.L.S. (1991) Triple gene block proteins of white clover mosaic potexvirus are required for transport. Virology 183(2), 695-702
20. Brakke M.K., Ball E.M., Langenberg W.G. (1988) A non capsid protein associated with unencapsidated virus RNA in barley infected with barley stripe mosaic virus. Journal of General Virology 69, 481-491.
21. Brisco M.J., Hull R., Wilson T.M. (1985) Southern bean mosaic virus-specific proteins are synthesized in an in vitro system supplemented with intact, treated virions. Virology 143(2), 392-398.
22. Brisco M.J., Hull R., Wilson T.M.A. (1986a) Swelling of isometric and of bacilliform plant virus nucleocapsids is required for virus-specific protein synthesis in vitro. Virology, 148.
23. Brisco M.J., Haniff C., Hull R., Wilson T.M.A., Sattelle D.B. (1986b) The kinetics of swelling of southern bean mosaic virus: a study using photon corrlation spectroscopy. Virology, 148.
24. Carrington J.C., Kasschau K.D., Mahajan S.K., Schaad M.C. (1996) Cell-to-Cell and Long-Distance Transport of Viruses in Plants. Plant Cell 8(10), 1669-1681.
25. Chapman S., Hills G., Watts J., Baulcombe D. (1992) Mutational analysis of the coat protein gene of potato virus X: effects on virion morphology and viral pathogenicity. Virology 191, 223-230.
26. Choi Y.G., Rao A.L. (2000) Packaging of tobacco mosaic virus subgenomic RNAs by brome mosaic virus coat protein exhibits RNA controlled polymorphism. Virology 275, 249-257.
27. Citovsky V., Knorr D., Schuster G. and Zambryski P. (1990) The p30 movement protein of tobacco mosaic virus is a single-strand nucleic acid binding protein. Cell 60, 637-647.
28. Citovsky Vitaly, Wong Mei Lie, Shaw Andrea L., Venkataram Prasad B. V. and Zambryski Patricia (1992) Visualization and Characterization of Tobacco Mosaic Virus Movement Protein Binding to Single-Stranded Nucleic Acids. The Plant Cell 4, 397-411.
29. Citovsky V. (1993) Probing plasmodesmal transport with plant viruses. Plant Physiol. 102,1071-1076.
30. Denis J, Majeau N, Acosta-Ramirez E, Savard C, Bedard MC, Simard S. (2007) Immunogenicity of papaya mosaic virus-like particles fused to a hepatitis С virus epitope: evidence for the critical function of multimerization. Virology 363(1), 59-68.
31. Ding В., Li Q., Nguyen L., Palukaitis P., Lucas W.J. (1995) Cucumber mosaic virus 3a protein potentiates cell-to-cell trafficking of CMV RNA in tobacco plants. Virology 207, 345-353.
32. Dobrov E.N. and Atabekov J.G. (1989) Reconstitution of plant viruses. In Plant Viruses (Mandahar, C.L., ed) 1, 173-205, CRC Press, Inc. Boca Raton, FL.
33. Donald R.G.K., Lawrence D.M. and Jackson A.O. (1997) The barley stripe mosaic virus 58-kilodalton B-protein is a multifunctional RNA binding protein. Jornal of Virology, 1538-1546.
34. Dawson W.O., Bubrick P., and Grantham G.L. (1988) Modifications of the tobacco mosaic virus coat protein gene affecting replication, movement and symptomatology. Phytopathology 78, 783-789.
35. Erhard M.,Stussi-Garaud C., Guilley H., Richards K.E., Jonard G., Bouzoubaa S. (1999) The first triple gene block protein of peanut clump virus localizes to the plasmodesmata during virus infection. Virology 264, 220-229.
36. Erickson J.W., Bancroft J.B. and Home R.W. (1976) The assembly of papaya mosaic virus protein. Virology 72, 514-517.
37. Erickson J.W. and Bancroft J.B. (1978a) The self-assembly of papaya mosaic virus. Virology 90, 36-46.
38. Erickson J.W., Bancroft J.B. (1978b) The kinetics of papaya mosic virus assembly. Virology 90(1), 47-53.
39. Erickson J. W. and Bancroft J. B. (1980) The assembly of papaya mosaic virus coat protein with DNA. Prog Clin Biol Res 40, 293-300.
40. Erickson J.W., Bancroft J.B. and Stillman M.J. (1981) Circular dichroism studies of papaya mosaic virus coat protein and its polymers. J Mol Biol 147, 337-349.
41. Erickson J.W., Hallett F.R. and Bancroft J.B. (1983) Subassembly Aggregates of papaya mosaic-virus protein. Virology 129, 207—211.
42. Finney J.L., Gellatly B.J., Golton I.C., Goodfellow J. (1980) Solvent effects and polar interactions in the structural stability and dynamics of globular proteins. Biophys. J. 32,17—33.
43. Forster R.L.S., Beck D.L., Guilford P.J., Voot D.M., Van Dolleweerd C.J., Andersen M.T. (1992) The coat protein of white clover mosaic potexvirus has a role in facilitating cell-to-cell transport in plants. Virology 191, 480484.
44. Fraenkel-Conrat H., Singer В., Tsugita A. (1961) Purification of viral RNA by means of bentonit. Virology 14, 54-58.
45. Gerken T.A., Butenhof K.J., Shogren R. (1989) Effects of glycosylation on the conformation and dynamics of O-linked glycoproteins: carbon-13 NMR studies of ovine submaxillary mucin. Biochemistry 28(13), 5536— 5543.
46. Goodman RM. (1975) Reconstitution of potato virus X in vitro. I. Properties of the dissociated protein structural subunits. Virology 68(2), 287-298
47. Goodman R.M., Home R.W., Hobart J.M. (1975) Reconstruction of potato virus X in vitro. II. Characterization of the reconstituted product. Virology 68(2), 299-308.
48. Goodman R.M., McDonald J.G., Home R.W., Bancroft J.B. (1976) Assembly of flexuous plant viruses and their proteins. Philos. Trans. R. Soc. (London) B276(943), 173.
49. Goodman R.M. (1977) Reconstitution of potato virus X in vitro. III. Evidence for a role for hydrophobic interactions. Virology 76, 72- 78.
50. Gorbalenya A.E. and Koonin E.V. (1993) Helikases: amino acid sequence comparisons and structure-function relationships. Curr Opin Struct Biol 3, 419-429.
51. Herzog E., Hemmer O., Hauser S., Meyer G., Bouzoubaa S., Fritsch C. (1998) Identification of genes involved in replication and movement of peanut clump virus. Virology 248(2). 312-322.
52. Ivanov K.I., Puustinen P., Merits A., Saarma M., and Makinen K. (2001) Phosphorylation down-regulates the RNA binding function of the coat protein of potato virus A. J. Biol. Chem. 276,13530-13540.
53. Kaftanova A.S., Kiselev N.A., Novikov V.K. and Atabekov J.G. (1975) Structire of products of protein reassembly and reconstruction of potato virus X. Virology 65, 283-287.
54. Kalinina N.O., Fedorkin O.N., Samuilova O.V., Maiss E., Korpela Т., Morozov S.Yu., Atabekov J.G. (1996) Expression and biochemical analyses of the recombinant potato virus X 25K movement protein. FEBS Letters 397, 75-78.
55. Kalinina N.O., Rakitina D.V., Solovyev A.G., Schiemann J., Morozov S.Y. (2002) RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first gene of the triple gene block. Virology 296(2), 321329.
56. Karpova O.V., Ivanov K.I., Rodionova N.P., Dorokhov Yu.L., Atabekov J.G. (1997) Nontranslatability and dissimilar behavior in plants and protoplasts of viral RNA and movement protein complexes formed in vitro. Virology 230,11-21.
57. Karpova O.V., Rodionova N.P., Ivanov K.I., Kozlovsky S.V., Dorokhov Y.L., Atabekov J.G. (1999) Phosphorylation of tobacco mosaic virus movement protein abolishes its translation repressing ability. Virology 261(l):20-24.
58. Kim., K.-H. and Hemenway C. (1996) The 5 nontranslated region of potato virus X RNA affects both genomic and subgenomic RNA synthesis. J. Virol. 70, 5533-5540.
59. Kiselyova O.I., Yaminsky I.V., Karger E.M., Frolova O., Dorokhov Yu.L., and Atabekov J.G. (2001) Visualization by atomic force microscopy of tobacco mosaic virus movement protein-RNA complexes formed in vitro. J. Gen. Virol. 82, 1503-1508.
60. Kiseleva O.I., Yaminsky I.V., Karpova O.V., Rodionova N.P., Kozlovsky S.V., Arkhipenko M.V. and Atabekov J.G. (2003) AFM study of potato virus X disassembly induced by movement protein. J. Mol. Biol. 332, 321325.
61. Koenig R., Stegemann M.E., Francksen H., and Paul H.L. (1970) Protein subunits in potato virus X group. Determination of the molecular weightsby polyacrylamide electrophoresis. Biochemica et Biophysica Acta 207, 184-189.
62. Koenig R., Nremain J.H. and Shepard J.F. (1978) In situ degradation of the protein chain of potato virus X at the N- and C-termini. J. Gen. Virol. 38, 329-337.
63. Koenig R. and Torrance L. (1986) Antigenic analysis of potato virus X by means of monoclonal antibodies. J. Gen. Virol. 67, 2145-2151.
64. Kwon S.J., Park M.R., Kim K.W., Plante C.A., Hemenway C.L., Kim K.H. (2005) cis-Acting sequences required for coat protein binding and in vitro assembly of Potato virus X. Virology 334(1), 83-97.
65. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structufal protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 277, 680-685.
66. Lecours K., Tremblay M.H., Gagne M.E., Gagne S.M. and Leclerc D. (2006) Purification and biochemical characterization of a monomeric form of papaya mosaic potexvirus coat protein. Protein Expr Purif47, 273-280.
67. Lee Y.S., Lin B.Y., Hsu Y.H., Chang B.Y. and Lin N.S. (1998) Subgenomic RNAs of bamboo mosaic potexvirus-V isolate are packaged into virions. J Gen Virol 79,1825-1832.
68. Lok S. And AbouHaidar M.G. (1986) The nucleotide sequence of the 5' end of Papaya Mosaic Virus RNA: site of in vitro assembly initiation. Virology 153, 289-296.
69. Lough T.J., Lee R.H., Emerson S.J., Forster R.L.S. and Lucas W.J. (2006) Functional analysis of the 5 untranslated region of potexvirus RNA reveals a role in viral replication and cell-to-cell movement. Virology, 351, 455465.
70. McGeachy K.D. and Barker H. (2000) Potato mop-top virus RNA can move long distance in the absence of coat protein: evidence from resistant, transgenic plants. Mol. Plant Microbe Interact. 13, 125-128.
71. Morozov S.Y., Dolia V.V., Atabekov I.G. (1989) Probable reassortment of genomic elements among elongated RNA-containing plant viruses. J. Mol. Evol. 29, 52-62.
72. Morozov S.Yu., Miroshnichenko N.A., Zelenina D.A., Fedorkin O.N., Solovyev A.G., Lukasheva L. I., Karasev A.V., Dolja V.V. and Atabekov J.G. (1991) Expression strategy of the potato virys X triple gene block. Jornal of General Virology 12, 2039-2043.
73. Morozov S.Yu., Solovyev A.G., Kalinina N.O., Fedorkin O.N., Samuilova O.V., Schiemann J., and Atabekov J.G. (1999) Evidence for Two Nonoverlapping Functional Domains in the Potato Virus X 25K Movement Protein. Virology 260, 55-63.
74. Morozov S.Y., and Solovyev A.G., (2003) Triple gene blok: modular design of a multifunctional machine for plant virus movement. Jornal of General Virology 84,1351-1366.
75. Nicolaisen M., Nielsen S.L. (2001) Analysis of the triple gene block and coat protein sequences of two strains of Kalanchoe latent carlavirus. Virus Genes. 22(3), 265-270.
76. Oparka K.J., Roberts A.G., Roberts I.M., Prior D.A.M., Santa Cruz S. (1996) Viral coat protein is targeted to, but does not gate, plasmodesmata during cell-to-cell movement of potato virus X. Plant Journal 10, SOS-SB.
77. Orlov V.N., Kust S.V., Kalmykov P.V., Krivosheev V.P., Dobrov E.N., Drachev V.A. (1998) A comparative differential scanning calorimetric study of tobacco mosaic virus and of its coat protein ts mutant. FEBS Lett. 433, 307-311.
78. Osman T.A., Hayes R.J., and Buck K.W. (1992) Cooperative binding of the red clover necrotic mosaic virus movement protein to single-stranded nucleic acids. J. Gen. Virol. 73, 223-227.
79. Palukaitis P. and Garcia-Arenal F. (2003) Cucumoviruses. Adv. Virus Res. 62, 241-323.
80. Parker L., Kendall A. and Stubbs G. (2002) Surface features of potato virus X from fiber diffraction. Virology 300, 291-295.
81. Petty I.T.D., and Jackson A.O. (1990) Mutational analysis of barley stripe mosaic virus RNA p. Virology 179, 712-718.
82. Richard K.E. and Tamada T. (1992) Mapping functions on the multiparite genome of beet necrotic yellow vein virus. Annual Review Phytopathology. 30, 291-313.
83. Privalov P.L., Gill S.J. (1988) Stability of protein structure and hydrophobic interaction. Adv. Protein Chem. 39, 191-234.
84. Rodionova N.P., Karpova O.V., Kozlovsky S.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V. and Atabekov J.G. (2003) Linear remodeling of helical virus by movement protein binding. J. Mol. Biol. 333, 565-572.
85. Rouleau M., Smith R.J., Bancroft J. В., and Mackie G.A. (1995) Subcellular Immunolocalization of the Coat Protein of Two Potexviruses in Infected Chenopodium quinoa. Virology 214, 314-318.
86. Santa Cruz S., Roberts A.G., Prior D.A.M., Chapman S., Oparka K.J. (1998) Cell-to-cell and phloem-mediated transport of potato virus X: the role of virions. PlantCel, 10, 495-510.
87. Short M.N. and Davies J.W. (1983) Narcissus mosaic virus: a potexvirus with an encapsidated subgenomic messenger RNA for coat protein. Biosci Rep 3, 837-846.
88. Sit T.L., Leclerc D. and AbouHaidar M.G. (1994) A minimal 5-sequence for in vitro initiation of papaya mosaic potexvirus assembly. Virology 199, 238-242.
89. Skryabin K.G., Morozov S.Yu., Kraev A.S., Rozanov M.N., Chernov B.K., Lukasheva L.I. and Atabekov J.G. (1988) Conserved and variable elements in RNA genomes of potexviruses. FEBS Lett. 240, 33-40.
90. Sober J., Jarvekulg L., Toots I., Rodavsky J., Villems R., and Saarma M. (1988) Antigenic characterization of potato virus X with monoclonal antibodies. J. Gen. Virol. 69, 1799-1807.
91. Solovyev A.G., Savenkov E.I., Grdzelishvili V.Z., Morozov S.Yu., Lesemann D.E., Maiss E., Casper, Atabekov J.G. (1996) Movement of a barley stripe mosaic virus chimera with a tobacco mosaic virus movement protein. Virology 217, 435-441.
92. Taliansky M, Torrance L, Kalinina NO. (2008) Role of plant virus movement proteins. Methods Mol Biol. 451, 33-54.
93. Tollin P. and Wilson H.R. (1988) Particle structure. In: The Filamentous Plant Viruses in the Plant Viruses 4 (Milne, R.C., ed.), 51-83.
94. Tremaine J.H., Agrawal H.O. (1972) Limited proteolysis of potato virus X by trypsin and plant proteases. Virology 49(3):735-744.
95. Varma A., Gibbs A.J., Woods R.D. and Finch J.T. (1968) Some observations on the structure of the filamentous particles of several plantviruses. J. Gen. Virol. 2, 107-114.
96. Verchot-Lubicz J. (2005) A new cell-to-cell transport model for Potexviruses. Mol. Plant—Microbe Interact. 18, 283-290.
97. Voinnet O, Lederer C, Baulcombe DC. (2000) A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103(1):157-167.
98. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. (2004). The Ins and Outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Critical Reviews in Plant Sciences 23(3), 195-250.
99. Wilson T.M.A. (1984) Cotranslation disassembly of tobacco mosaic virus in vitro. Virology 137, 255-265.
100. Wilson T.M.A, Watkins P.A.C. (1985) Influence of exogenous viral coat protein on the cotranslational disassembly of tobacco mosaic virus (TMV) particles in vitro. Virology, 149.
101. Wilson M. A., Shaw J. G. (1987) Cotranslational disassembly of filamentous plant virus nucleocapsids in vitro and in vivo. In Positive Strand RNA Viruses, Alan R. Liss, Inc., 159-181.
102. Wolf S., Deom C.M., Beachy R.N., Lucas W.L. (1989) Movement protein of tobacco mosaic virus modifies plasmodesmatal size exclusion limit. Science 246, 337-339.
103. Yang Y., Ding В., Baulcombe D.C., Verchot J. (2000) Cell-to-cell movement of the 25K protein of potato virus X is regulated by three other viral proteins. Molecular Plant-Microbe Interactions 13 (b), 599-605.
104. Zhu D.M., Evans R.K. (2006) Molecular mechanism and thermodynamics study of plasmid DNA and cationic surfactants interactions. Langmuir. 22, 3735-3743.
-
Никитин, Николай Александрович
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2008
-
ВАК 03.00.06
- Влияние структуры 5`-конца РНК на образование вирусных рибонуклеопротеидов с участием белка оболочки потексвирусов in vitro
- Трансляционная активация генома некоторых фитовирусов в составе вириона или вирусного транспортного рибонуклеопротеида
- Механизм трансляционной активации РНК потексвирусов
- Контроль трансляции РНК нуклеопротеидных комплексов, участвующих в межклеточной транслокации вирусного генома
- Локализация транспортного белка гордеивируса в ядрышке и его взаимодействие с белками ядрышка и телец Кахаля
