Взаимодействие p130 - белка семейства pRb, и β-катенина - передатчика сигналов Wnt, в ходе дифференцировки и трансформации мезенхимных стволовых клеток мыши

Петров, Николай Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие p130 - белка семейства pRb, и β-катенина - передатчика сигналов Wnt, в ходе дифференцировки и трансформации мезенхимных стволовых клеток мыши
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие p130 - белка семейства pRb, и β-катенина - передатчика сигналов Wnt, в ходе дифференцировки и трансформации мезенхимных стволовых клеток мыши"

На правах рукописи

005045272

ПЕТРОВ

Николай Сергеевич

Взаимодействие р130 - белка семейства рКЬ, и р-катенина - передатчика сигналов \Viit, в ходе дифференцировки и трансформации мезенхимных стволовых клеток мыши

03.03.04 — клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

3 1 тя 20(2

Санкт-Петербург 2012

005045272

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреиадсиии науки Институт цитологии Российской академии наук (Санкт-Петербург)

Научный руководитель: кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник Попов Борис Валентинович

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Поспелов Валерий Анатольевич

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии РАН

доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович Федеральное государственное бюджетное учреждение Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СЗО РАМН

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение

Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова Минздравсоцразвития России

Защита состоится «22» июня 2012 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4. Сайт института: http://www.cytspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru Факс института: (812)297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан « » мая 2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

о Е.В. Каминская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Исследование возможности замещения клеток и тканей различных органов является актуальной задачей современной клеточной биологии в связи с увеличением продолжительности жизни, возрастанием числа геронтологических заболеваний и необходимостью восстановления органов, утративших свои функции. Мезенхимные стволовые клетки (МСК), являющиеся одним из типов соматических стволовых клеток, привлекают к себе внимание как потенциальный ресурс для регенеративной терапии благодаря относительной простоте их получения и широкому дифференцировочному потенциалу. МСК in vivo могут превращаться в клетки не только исходного мезодермапыюго, но эктодермального и энтодермальиого происхождения. Свойство МСК приобретать необычный фенотип и несвойственные им в нормальных условиях функции - пластичность - не достаточно хорошо исследовано и является о&ьектом изучения научных лабораторий во всем мире.

В основе пластичности МСК лежит эпигенетическое репрограммирование и транедифференцировка МСК в клеточные линии, происходящие из различных зародышевых листков. В литературе описаны несколько моделей для изучения транедифференцировки МСК в клетки энтодермальиого происхождения различной тканевой специфичности. Однако к настоящему моменту не существует модели, предоставляющей возможность для анализа внутриклеточных событий в отдельных клетках в процессе энтодермальной транедифференцировки. Специализация СК опосредована взаимодействием молекул множества сигнальных путей. Среди них у зрелых животных ключевую роль играет сигнальный путь Wnt/p-катснин. Сигналы этого пути широко используются в закладке и формировании тканей и органов в процессе эмбрионального развития. В организме зрелого животного сигнальный путь Wnt/p-катенин играет ключевую роль в поддержании функций СК различных тканей, а конститутивное повышение его активности сопряжено с возникновением опухолей.

Функционирование сигнального пути Wnt/p-катенин осуществляется в контексте клеточного цикла, негативным регулятором которого является семейство продукта гена ретинобластомы (pRb). Члены семейства pRb осуществляют эффекторный контроль хода клеточного цикла путем взаимодействия с транскрипционными факторами семейства E2f. В свою очередь, белки E2f регулируют синтез и активность молекул, составляющих машину клеточного цикла. При планировании настоящей работы мы основывались на хорошо известных данных о том, что р130, член семейства pRb, взаимодействует с сигнальными молекулами других регуляторных путей в контрольных точках клеточного цикла. Взаимодействие р130 с Р-катснином - основным передатчиком в сигнальном пути Wnt/p-катепин, в точке R1 фазы G1 опосредовано Gsk3p, которая фосфорилирует как р130, так и Р-катенин. Изучение механизма такого взаимодействия и его функциональной роли может быть важным для понимания механизма пластичности МСК и моделирования их практического использования в регенеративной терапии заболеваний человека.

Цель и задачи исследования

Цель работы: исследовать взаимодействие Р-катенина - передатчика сигналов Wnt, и р130- члена семейства pRb, в ходе дифференцировки и трансформации мезенхимных стволовых клеток in vitro.

Задачи работы:

1. Изучить возможность индукции энтодермальной дифференцировки МСК путем их кокультивирования с клетками линии А-549, происходящими из эпителия легких, и изучить роль экспрессии гена WNT2 в клетках А-549 в механизме индукции такой дифференцировки.

2. Охарактеризовать состояние р130 и р-катенина в МСК в различных фазах клеточного цикла и при активации сигнального пути Wnt/p-катенин.

3. Изучить механизм формирования комплекса р130 с р-катенином, изменения состава комплекса в ходе клеточного цикла, при активации сигнального пути Wnt/p-катенин, а также его потенциальную роль в транскрипционной регуляции генов, содержащих в промоторах сайты связывания факторов семейства LEF/TCF.

4. Оценить пролиферативную, дифференцировочнуго, кпоногенную, адгезивную и туморогенную активность МСК, уровень ядерного р-катенина и транскрипционных факторов Tcf3,4 в процессе длительного пассирования МСК.

Основные положения, выносимые на защиту

1. МСК, кокультивированные с клетками линии А-549 в условиях разделения клеточно-непроницаемой мембраной, показывают активацию сигнального пути Wnt/p-катенин и экспрессию легочных эпителиальных маркеров; торможение экспрессии гена WNT2 в клетках А-549 с помощью малой интерферирующей РНК отменяет активацию р-катенина в кокультивируемых МСК; совместное культивирование с клетками А-549 можно рассматривать в качестве модели паракринной индукции эпителиальной дифференцировки МСК in vitro.

2. В асинхронно делящихся или синхронизировшшых в фазах G0/G1, S, и G2/M клеточного цикла МСК уровень и рисунок фосфорилирования Р-катенина и р130 существенно не изменяются; индукция сигнального пути Wnt/p-катенин ведет к активации р-катенина, р130 и E2f4, однако комплекс pl30/E2f4 не вызывает торможения деления МСК.

3. В МСК р-катенин, р130 и Gsk3p взаимодействуют между собой и формируют комплекс, включающий в свой состав факторы E2f4, Тсй,4, и проявляющий транскрипционную активность при экспрессии экзогенного Р-катенина и р130.

4. В ходе длительного культивирования МСК повышается их пролиферативная, снижается дифференцировочная и адгезивная активность, на 43-47-м пассаже клетки становятся туморогенными и образуют опухоли при введении сингенным животным; приобретение туморогенности при длительном культивировании МСК сопряжено с накоплением внутриядерного р-катенина и транскрипционных факторов Tcf3,4.

Научная новизна полученных результатов. Впервые показано, что при совместном культивировании с клетками линии А-549 в условиях разделения клеточно-непроницаемой мембраной в МСК активируется сигнальный путь Wnt/p-катенин и экспрессируются эпителиальные маркеры. Впервые установлено, что активация сигнального пути Wnt/p-катенин в кокультивируемых МСК может вызываться фактором Wnt2, секретируемым клетками А-549, поскольку торможение в них экспрессии гена WNT2 с помощью стабильной продукции малой интерферирующей РНК против мРНК WNT2 отменяет активацию р-катенина в МСК. Новым является то, что кокультивирование МСК и клеток линии А-549 в условиях их разделения клеточно-непроницаемой мембраной можно рассматривать в качестве модели паракринной индукции эпителиальной дифференцировки МСК. Впервые найдено, что уровень и рисунок фосфорилирования р130 в ходе клеточного цикла в МСК не изменяется в противоположность соматическим дифференцирующимся клеткам линии T98G. Проведенный нами анализ механизма этого феномена впервые позволил выяснить, что индукция в МСК канонического сигнального пути Wnt ведет к активации его основного передатчика - Р-катенина, а также члена семейства pRb, белка р130, и транскрипционного фактора Е2Г4, которые формируют комплекс pl30/E2f4. Этот комплекс поддерживает некоторые линии соматических дифференцирующихся клеток в состоянии покоя, но в МСК не проявляет супрессорной активности, что, возможно, связано с включением в его состав р-катенина. Мы показали, что в МСК Р-катенин и р130 физически взаимодействуют между собой, формируя с Gsk3p комплексы, включающие в свой состав различно фосфорилированные формы р130 и транскрипционные факторы семейства LEF/TCF - ТсО,4. Комплексы р130-0як3р-р-катснин-TcG,4 обладают транскрипционной активностью. Мы установили, что в ходе длительного культивирования значительно возрастает пролиферативная активность МСК, они утрачивают способность к дифференцировке и приобретают туморогенность, формируя опухоли при

подкожном или внутримышечном введении сингенным мышам-реципиентам. Новым в изучении механизма туморогенности является то, что ее возникновение в МСК связано с повышением уровня и накоплением в ядре клеток активных форм ß-катенина и транскрипционных факторов TcG,4.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы заключается в разработке новой модели паракринной индукции эпителиальной дифференцировкн МСК in vitro путем их совместном культивирования с клетками линии А-549 эпителиального происхождения в условиях разделения клеточно-непроницаемой мембраной. Важным результатом работы является получение новых доказательств взаимодействия в МСК сигнальных путей Wnt/ß-катенин и семейства гена ретинобластомы (pRb) путем формирования комплекса pl30-Gsk3ß-ß-KaTeHHH. Мы впервые обнаружили, что комплекс pl30-Gsk3ß-ß-катенин в МСК существует в разных фазах клеточного цикла и обладает транскрипционной активностью по отношению к генам, содержащим сайты связывания белков семейства LEF/TCF. Опухолевая трансформация МСК в ходе их длительного культивирования сочетается с повышением уровня, перераспределением ß-катенина внутри клетки и его конститутивной активацией. Практическое значение работы заключается в том, что она предоставляет возможность рассматривать комплекс pl30-Gsk3ß-ß-KaTeHHH в качестве мишени фармакологической коррекции при разработке подходов и методов регуляции поведения нормальных и опухолевых стволовых клеток в экспериментальных моделях регенеративной терапии и лечения злокачественных заболеваний. Полученные данные используются при чтении курса лекций «Введение в клеточную биологию стволовых клеток» на медицинском и биолого-почвенном факультетах Санкт-Петербургского государственного университета.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ (5 статей в рецензируемых научных журналах и 5 тезисов докладов на научных конференциях). Результаты диссертации представлены на II Съезде Всероссийского общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007); 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2008); Всероссийской научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009); II Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010), международной конференции «Stem Cells Update - From Basic Research to the Clinic» (Уппсала, Швеция, 2011).

Финансовая и некоммерческая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 06-0448439, 09-04-00595), Правительства Санкт-Петербурга (грант 2.6107-06.099). Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам ИНЦ РАН H.H. Никольскому, E.H. Толкуновой, А.Н. Томилину, В.А. Поспелову, В.В. Зенину, Г.И. Штейну, В.М. Михайлову; д-ру Чангу (LS Chang, Children's Hospital, Ohio State University, Columbus, США), д-ру Попову (N. Popov, University of Wurzburg, Germany), д-ру Прокопу (D. Prockop, Tulane University, Florida, США) за предоставленные клеточные линии, реактивы, конструкции и антитела (перечислены в разделе «Материалы и методы»), возможность использовать приборы и консультативную помощь в освоении методов.

Вклад автора. Автором лично проведены эксперименты, включающие культивирование клеток, анализ их пролиферативных, дифференцировочных, клоногенных и туморогенных свойств, иммунофлюоресцентное окрашивание, иммуноблотинг, иммунопреципитацию, трансфекцию клеток, люциферазный анализ, торможение экспрессии гена WNT2 методом интерференции РНК, и обработаны экспериментальные данные. Проточно-цитометрический анализ проведен В.В. Зениным и Ю.М. Розановым, TaqMan ПЦР выполнена в компании Applied BioSystems (Foster City, Калифорния, США). Материалы, вошедшие в

представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 168 ссылок. Работа изложена на 120 страницах машинописного текста и иллюстрирована 3 таблицами и 33 рисунками.

Материалы и методы исследований

Клеточные линии и культивирование клеток. Клеточные линии мышиных эмбриональных фибробластов СЗН10Т1/2 (10Т1/2), мышиных миобластов С2С12, немелкоклеточной карциномы легкого человека А-549, чешуйчатой клеточной карциномы Calu-3, глиобластомы человека T98G получены из Американской коллекции клеточных культур (АТСС). Клетки эмбриональной почки человека НЕК 293Т любезно предоставлены д-ром А.Н. Томилиным (Институт цитологии РАН). В работе использованы две линии МСК мыши: одна получена ранее в нашей лаборатории, другая любезно предоставлена д-ром Д. Прокопом (D. Prockop, Tulane University, Флорида, США). Все клетки культивировали в С02-инкубаторе в газовой смеси, содержащей 95 % воздуха и 5 % С02, при 37 °С и относительной влажности 100% в ростовой среде (PC) DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 25 мМ Hepes, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Для оценки моногенности МСК или клетки эксплантатов опухоли (КОЭ) высевали по 400 и 1000 клеток в 60 мм пластиковые чашки и культивировали в стандартной PC в течение 3 недель. Выросшие колонии окрашивали красителем генциан-фиолетовым и подсчитывали визуально. Пролиферативную активность оценивали по времени удвоения, для определения которого МСК помещали в три ячейки 24-луночного планшета в 0.5 мл PC по 4 х 104/лунку. Через 48 ч число клеток подсчитывали с трипановым синим, опыт повторяли 5-7 раз. Время удвоения (D) определяли по формуле: T>=\x\ogxßxo2, где t — время культивирования, Xf/Xo — число клеток в конце и начале эксперимента, соответственно. Оценку туморогенности проводили при трансплантации МСК 12-15-го или 43-47-го пассажей сингенным мышам-реципиентам. КОЭ получали в стерильных условиях путем измельчения кусочка ткани опухоли, полученной при подкожном введении МСК сингенным мышам. Ткань опухоли помещали в PC в 100 миллиметровую культуральную чашку на 72 ч. Мигрировавшие из ткани клетки отделяли от пластика раствором трипсина и культивировали в тех же условиях, что и МСК.

Разработка модели in vitro для изучения направленной дифференцировки МСК в клетки легочного эпителия. Для индукции дифференцировки МСК в энтодермалыгом направлении их совместном культивировали с клетками линии А-549. 1 * 105 клеток А-549 ресуспендировали в 1 мл PC и помещали в верхний отдел лунки 6-луночной пластины (Costar, США), отделенный от нижнего отдела покрытой коллагеном полунепроницаемой мембраной Transwell с размером пор 0.4 мкм (Corning, США) (Рис. 4). В нижний отдел той же лунки добавляли 3 мл PC и покровные стекла для микроскопии, а через 24 ч помещали 1 х 105 МСК. Через 72-96 ч от начала кокультивирования покровные стекла с распластанными клетками использовали для иммунофлюоресцентного анализа, а клетки на пластике — для анализа экспрессии мРНК и белков. Контрольные МСК культивировали без клеток линии А-549.

Для активации ß-катснина клетки инкубировали в течение 4 ч в PC, содержащей 10-20 мМ LiCL, ингибирующего Gsk3ß (Stambolic et al., 1996), а фосфорилированный ß-катенин определяли в них после добавления в PC на 30 мин ингибитора белковых фосфатаз — каликулина A (Sigma, США).

Трансфекция клеток. Клетки НЕК 293Т трансфицировали при помощи реактива 293Fectin™ Transfection Reagent (Invitrogen, Великобритания) согласно протоколу производителя. Через 48 ч после трансфекции клетки использовали для анализа экспрессии рекомбииатных белков. Клетки А-549 и МСК трансфицировали при помощи электропорации (X-cell Pulser, BioRad, США).

Метод люциферазного репортера для оценки транскрипционной активации генов, содержащих сайты связывания белков семейства LEF/TCF. Репортерные конструкции, содержащие в рсгуляторной области перед минимальным промотором c-Fos 7 сайтов связывания белков семейства LEF/TCF (TOPflash) и кодирующую последовательность гена люциферазы, соответствующую контрольную конструкцию с мутацией сайтов связывания LEF/TCF (FOPflash) (Korinek et al., 1997); экспрессионный вектор, кодирующий р-катенин с мутацией Ser33Ala; плазмиды, содержащие гены р130 и fî-галактозидазы, вводили в МСК или клетки 293Т в различных комбинациях, позволяющих выявить трансактивирующую роль Р-катенина и транссупреесирующую роль pi30. Активность люциферазы определяли по интенсивности свечения после добавления к клеточным экстрактам реактива Glo-lisis (Promcga, США). Для нормализации количества люциферазы в разных пробах использовали активность Р-галактозидазы.

Анализ экспрессии мРНК. Анализ экспрессии мРНК при помощи TaqMan ПЦР в реальном времени был выполнен в Applied BioSystems (Foster City, Калифорния, США). Для этого исследования готовили по 4 отдельные пробы контрольных МСК и МСК, кокультивированных с клетками А-549 в течение 72 ч. Была исследована экспрессия следующих мышиных генов: цитокератинов 5, S, 14, IS и 19; ZO-I (Zonula Occludens-I), pro-SP-c (сурфактант-ассоциированный белок С), НОХС4, CD45, CD31, актина, GAPDH.

Получение РНК, электрофорез РНК в денатурирующем геле и ее количественная оценка. РНК получали из осадков клеток, лизированных в гуанидинтиоцианатном буфере (Chomczynski, Sacchi 1987), пробы РНК подвергали электрофорезу в денатурирующем геле с формальдегидом. После электрофореза РНК в геле визуализировали по свечению полос 18S и 28S, окрашенных бромистым этидием. Выравнивание количества РНК в различных пробах производили после определения интенсивности полосы 28S на соответствующих дорожках с помощью программного продукта TotalLab Quant.

Синтез кДНК на матрице РНК и амплификация фрагментов генов с помощью ревертированпой полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР). Синтез кДНК проводили, используя тотальную РНК, праймер олиго-дТ18 и обратную транскриптазу; ПЦР-амплификацию выполняли на циклере PCR Script (Hybade, Великобритания) при температурном режиме, одинаковом для обеих пар праймеров к WNT2. Праймеры были синтезированы в компании «Бигль» (Россия, Санкт-Петербург) (Таблица 1).

Таблица 1

Последовательности праймеров для амплификации кДНК гена WNT2 и ингибирования его экспрессии

Ген Прямой праймер (5' -3"! Обратный праймер Г5' - 3'1 Размер

WNT2- 1 GCCCCTCTCGGTGGAA TCTGGCTC GCTGTGA TCCCTGTCCA GGGTGTT 279 п.о.

WNT2-2 СА TGGTGGTACA TGA G A GCTA С GCTGTGA TCCCTGTCCA GGGTGTT 209 п.о.

GAPDH G A GTCAA CGGA TTTGGTCGT TTGA TTTTGGA GGGA TCTCG 238 п.о.

WNT2-sil GCAAAGGAAAGGAAAGGAA 19 in

WNT2-si2 G A TCCAAA GAA G A TG GGAA 19 irr

WNT2-mK С A TA A GCTGA G A TA CTTCA 19 ht

Ингибирование экспрессии гена \VNT2 с помощью метода интерференции РНК.

Торможение экспрессии 1УШ"2 в клетках А-549 воспроизводили в соответствии с методом, описанным Брюммслькамп и др. (Вгитте1катр ^ а1., 2002), используя вектор рБиРЕЯ компании 01¡goEnginc (США). Этот вектор содержит промотор Н1, распознаваемый РНК-полимеразой III, и позволяет экспрессировать транскрипты б)11ЫА в форме последовательностей, которые вводят в вектор. 60-мерные олигонуклеотиды, содержащие последовательности размером 19 оснований, комплементарные мРНК \VNT2 (Таблица 1), вставленные дважды в обратной ориентации, последовательность-шпильку в середине олигонуклеотида, и липкие концы для лигирования в сайт BglП вектора на 5' конце и сайт

Xhol — на 3' конце кодирующей последовательности, были синтезированы в компании Sigma (Германия) и клонированы в векторе pSUPER.retro.puro. Клетки А-549 трансфицировали полученными векторами и подвергали пуромициновой селекции (1.5 мкг/мл, 3 сут). Для контроля эффективности трансфекции и селекции клетки были котрансфицированы вектором, зкспрессирующим Gip. Эффективность подавления экспрессии гена WNT2 в трансфицированных клетках А-549 оценивали при помощи ОТ-ПЦР. Полученные клетки использовали для кокультивирования с МСК.

Синхронизация клеток в различных фазах клеточного цикла и проточная цитометрия. МСК синхронизировали в фазе G0/G1, культивируя в течение 48 ч в PC, содержащей 0.15 % ФБС. Для синхронизации в фазе S МСК выращивали 24 ч в PC с 5 мМ тимидина с последующей их отмывкой и культивированием в течение 5 ч в нормальной PC. Для синхронизации в фазах G2/M использовали последовательную обработку клеток тимидином и нокодазолом и рестимуляцию нормальной PC (Петров и др., 2011). Клетки линии T98G синхронизировали при помощи культивирования в течение 72 ч в PC с 0.1 % ФБС и рестимуляции нормальной PC; в опытах использовали клетки, собранные через 0, 6, 12, 18, 24 и 30 ч после рестимуляции, как описано ранее (Popov et al., 2005). Для анализа распределения клеток по фазам клеточного цикла клетки окрашивали йодистым пропидием и анализировали на проточном цитометре АТС 1000 (Brucker, Germany).

Иммуноцитохимические методы. Клетки, выращенные на покровных стеклах, окрашивали на внутриклеточные белки специфическими антителами и конъюгированными с флюоресцентной меткой видоспецифическими антителами. Ядра клеток окрашивали DAPI. Препараты анализировали на конфокальных сканирующих микроскопах LSM 5 Pascal или Leica TCS SP5, используя лазеры с длиной волны 405, 488, 543 и 633 нм.

Электрофорез и иммуноблотинг. Разделение белков производили при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия по стандартному протоколу. Белки переносили из геля на мембрану PVDF (Amersham, США) при помощи полусухого электропереноса и выявляли первыми антигенспецифическими и вторыми видоспецифическими антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, методом хемишоминесценции.

Фракционирование клеточных экстрактов производили при помощи лизиса клеток в гипотоническом буфере, как описано ранее (Popov et al., 2005; Petrov et al., 2011).

Иммупопреципитация. Для преципитации белков клеточные осадки лизировали при 0 °С 30 мин в буферном растворе, содержащем 50 мМ Hepes pH 7.5, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2.5 мМ ЭГТА, 10 % глицерина, 0.1 % Твин-20 и ингибиторы протеаз и фосфатаз (Sigma, США) в разведении 1:100. Затем клетки подвергали обработке ультразвуком на соникаторе. Клеточные экстракты, содержащие 500 мкг общего белка, обрабатывали специфическими кроличьими антителами, антителами к иммуноглобулинам кролика и протеин-G сефарозой. Преципитаты отмывали, кипятили в буфере для нанесения на гель, центрифугировали для отделения от сефарозы и анализировали путем электрофореза в полиакриламидном геле.

Статистический анализ. Статистическая обработка результатов была проведена преимущественно с использованием средней арифметической величины, стандартного отклонения и критерия Стьюдента (при р=0.05), программы Microsoft® Office Exel 2003. Опыты с иммуноблотингом и иммунофлюоресцентным окрашиванием, результаты которых в соответствии с международной практикой не подвергали статистическому анализу, повторяли 3-5 раз. В некоторых случаях для количественной оценки и сравнения содержания белков в полосах на репликах электрофореграмм применяли программу TotalLab (www.totallab.com).

Результаты и обсуждение Характеристика первичной культуры МСК, полученной из костного мозга трансгенных мышей GFP. Полученные нами МСК (МСКс) и подобные клетки (МСКт), любезно предоставленные доктором Д. Прокопом (Dr. D. Prockop, Tulane University, США), были охарактеризованы по экспрессии in vitro тканеспецифических маркеров и способности к

дифференцировке в различные тканеспецифические клетки мезодермального происхождения (жировые, костные, мышечные). МСКс, подобно контрольным клеткам МСКт, продуцируют мезенхимальные маркеры СВ29, СБ44, С049£ СБ 105, Сф, актин и виментин, но не цитокератины или кроветворный маркер С045 (Рис. 1 и не показано). При культивировании в остеогенной, адипогенной или миогенной ростовой среде МСК накапливают кальциевые преципитаты, жировые вакуоли или десмин - тканеспецифические маркеры соответствующих линий. Полученные результаты показали, что клетки, выделенные нами из костного мозга трансгенных мышей, соответствуют критериям Международного общества по клеточной терапии, разработанным для характеристики МСК.

Пассаж МСК

Рисунок 1. Экспрессия Gip, клоногенные, адгезивные и дифференцировочные свойства МСК в ходе их пассирования в культуре. А - оценка экспрессии Gfp и Р-катенина в МСК в ходе их пассирования in vitro. Б - клоногенность МСК различных пассажей. В - адгезивные и дифференцировочные свойства МСК в ходе их культивирования. 1 — адгезивные свойства МСК, индуцированных к адипогенной дифференцировке, оценивали как способность распластываться на пластике на следующий день после добавления в культуру клеток дифференцировочной среды; 2-3 — МСК, индуцированные к адипогенной дифференцировке через 3 недели после начала опыта; 2 - фазово-контрастное изображение получено при суправитапьной съемке клеток на микроскопе Zeiss Axiovent 40; 3 - изображение получено после фиксации и окраски клеток красителем масляным красным. Об. 10х.

Характеристика свойств МСК в ходе их длительного пассирования в культуре. До 25-го пассажа МСК сохраняют параллельную осевую ориентацию и монослойный характер роста даже при предельном насыщении. МСК 43-47-го пассажей показывают значительно более высокую плотность насыщения, в условиях которой соседние клетки ориентированы хаотически по отношению друг к другу, что часто проявляется в перекрестном расположении и частичном наслоении соседних клеток друг на друга. Насыщающая плотность роста МСК от 9 к 16-му пассажу увеличивается в 2 раза, а к 52-му пассажу - в 10 раз (Рис. 2Б). Начиная с 43-го пассажа, МСК показывают значительное снижение экспрессии Gfp, тогда как уровень продукции общеклеточного р-катенина на поздних пассажах не изменяется (Рис. 1А). МСК поздних пассажей и КОЭ теряют экспрессию Gfp и способность к адипогенной

щш щ •■ I , / •, [rj. Л, . » ' А" " * • ' " »

Щ1 z* • ■ ■ .! . щ

./ /-У.Ж, УЖ

Пассаж МСК

Рисунок 2. Характеристика пролиферативной активности МСК и КОЕ в процессе пассирования в культуре. А -время удвоения МСК различных пассажей и клеток эксплантатов опухоли, полученной из МСК. Б -характеристика насыщающей плотности роста МСК и КОЭ. Вертикальные линии представляют стандартное отклонение.

дифференцировке (Рис. 1А, В). Уменьшение способности прикрепляться к пластиковой поверхности очевидно в МСК 52-го пассажа, индуцированных к адипогенной дифференцировке (Рис. 1В, 1). Клоногенная активность МСК различных пассажей составляет 5-7% и в ходе пассирования существенно не изменяется (Рис. 1Б). Скорость деления МСК увеличивается почти в три раза, при оценке с помощью времени удвоения, которое на 9-м пассаже составляет 54.4 ч и сокращается до 19.8 ч к 52-му пассажу (Рис. 2А). На 43-44-м пассаже МСК приобретают туморогенную активность. При подкожном, внутримышечном или внутривенном введении МСК 12-15-го пассажей нормальным сингенным мышам-самкам линии С57ВТ, не наблюдается возникновения опухолей, в тех же условиях у 40 % животных, которым подкожно или внутримышечно вводили МСК 43^7 пассажей, опухоли клеток возникают в течение 1-2 нед после инъекции клеток (Рис. ЗА, Б). При внутривенном введении МСК любых использованных нами пассажей макроскопически видимые опухоли не возникают даже при наблюдении в течение 3 мес после введения клеток.

Характеристика клеток эксплантатов опухоли (КОЭ), полученной из МСК. КОЭ по многим свойствам не отличаются от МСК поздних пассажей. Они не экспрессируют Оф, показывают снижение адгезивности и дифференцировочного потенциала. Клоногенная активность КОЭ снижена по сравнению с таковой МСК в 4-5 раз (Рис.1).

Рисунок 3. Оценка туморогенности МСК в ходе их культивирования путем введения клеток различных пассажей сингенным животным. А - внешний вид опухоли, возникшей при внутримышечном введении МСК 44-го пассажа сингенной мыши линии С57ВЬ. 5 х Ю5 МСК 44-го пассажа инъецировали в мышцу бедра, опухоль обнаружили через 1 нед после введения клеток, а через 8 нед она имела в диаметре 2 см и весила более 2 г. Б — частота возникновения опухолей при введении МСК ранних (12-15) и поздних (43-47) пассажей нормальным сингенным реципиентам. При подкожном и внутримышечном введении использовали 5 * Ю5 клеток в 50-100 мкл среды, при внутривенном введении - 5 х 106 клеток в 0.5 мл среды. МСК вводили 5 мышам каждой группы с последующим наблюдением до 3 мес

Разработка модели энтодермалыюй дифференцировки МСК в опытах in vitro. Для оценки способности МСК дифференцироваться в энтодермальном направлении их культивировали с клетками А-549 в условиях разделения клеточно-непроницаемой мембраной (Рис. 4). Клетки линии А-549 происходят из эпителия легких и секретируют повышенные количества белка Wnt2, который аутокринно поддерживает их пролиферацию. Соматический нокаут гена WNT2

Рисунок 4. Схема модели трансдифференцировки МСК в энтодермальном направлении.

IS I Ъ

■ Подкожное введение □ Внутримышечное введение в Внутривенное введение

■ Ш

приводит к остановке пролиферации и активации апоптоза в этих клетках (You et al., 2004). Поскольку Wnt2 секретируется во внешнюю среду, мы предположили, что при совместном культивировании клеток А-549 и МСК он может проникать через мембрану, связывать специфические рецепторы на поверхности МСК и активировать сигнальный путь Wnt/p-катенин. Кокультивирование вызывает в МСК экспрессию мРНК цитокератинов 5, 8, 14, 18, 19\ ZO-1, pro-SP-C. Результаты ОТ-ПЦР показывают, что экспрессия мРНК цитокератинов и ZO-1 увеличивается в 2 раза, a pro-SP-C (маркер альвеолярных эпителиальных клеток типа И) -в 2.3 раза (Рис. 5). Увеличение экспрессии цитокератинов подтверждается при иммунофлюоресцентной окраске МСК антителами к панцитокератину (не показано).

3 2,5

1,5 I 0.5 О

Рисунок 5. Кокультивирование с клетками А-549 вызывает в МСК экспрессию маркеров легочной эпителиальной дифференцировки. Результаты анализа экспрессии генов в МСК с помощью количественной ОТ-ПЦР, представлены среднее значение увеличения количества мРНК и стандартное отклонение.

4Г

Кокультивироваиие с клетками А-549 вызывает в МСК активацию р-катенииа.

Кокультивирование с клетками А-549 в течение 72 ч вызывает в МСК активацию р-катенина, которая при иммунофлюоресцентном окрашивании проявляется в повышении его цитоплазматического уровня и транслокации в ядро, подобно таковой при обработке клеток ионами лития (Рис. 6А, вЗ,4 и 63,4, соответственно). Обработка клеток А-549 температурным шоком существенно не влияет на их способность активировать р-катенин в кокультивируемых МСК (Рис. 6А, гЗ,4). В иммуноблотинге МСКс, полученные нами, и контрольные МСКт (Рис. 6Б, дорожки 5-8) также показывают увеличение количества р-кагенина в указанных выше условиях. Интересно, что повышение уровня Р-катенина в МСК при их кокультивировании или обработке ионами лития сопровождается увеличением его электрофоретической подвижности

1 2 3 4

■1 н й! В в

3 и а

•1 и <2 &

-а Рисунок 6 атт Кокультивирование

мскад

liCI AS49 AS49.

МСКГг)

1.КЛ AS4? AS49m

1J 1.9

1 1.4 2.1

•*— р-ютешш ■«— р-акпш

Огаоспслыыя IUIO пюгл. полос

клетками

А-549 вызывает в МСК активацию р-катенина. А -иммунофлюоресцентный анализ активации р-катенина в МСК, кокультивированных с клетками А-549 в течение 72 ч (а - без обработки, 6 - обработка 20 мМ 1ЛС1 в течение 24 ч, в - кокультивирование с необработанными клетками А-549, г - кокультивирование с клетками А-549, обработанными температурным шоком; 1-2 - без первых антител, 3-4 - окраска антителами к р-катенину). Б - оценка с помощью иммуноблотинга активации р-катенина в МСК после краткосрочного кокультивирования с клетками А-549. МСКс и МСКт кокультивировали с клетками А-549 в течение 96 ч. иС1 добавляли в среду в концентрации 20 мМ на 24 ч. А-549 - необработанные клетки, А549ш - клетки, подвергнутые температурному шоку.

- —

в 2 |£ 3 а С

Ё I-

■

Рисунок 7. Кокультивирование МСК с клетками А-549 или культивирование в среде, содержащей 1ЛС1, вызывает трансактивацию репортерной конструкции, содержащей сайты связывания белков ЬЕР/'ТСР. МСК, временно трансфицированные репортерными конструкциями ТОРАазЬ/РОРАазИ, культивировали в течение 4 ч в среде с 10 мМ иС1 или кокультивировапи с клетками А-549 в течение 72 ч.

(Рис. 6Б, дорожки 2-4 и 1, соответственно), что, вероятно, является важной характеристикой активации Р-катенина. Функциональным следствием индукции сигнального пути \Уп1/р-катенин как при обработке МСК ионами лития, так и при их кокультивировании с клетками линии А-549 является активация репортерной конструкции ТОРАавЬ, содержащей сайты связывания белков семейства ЪЕР/ТСР, взаимодействующих с Р-катенином (Рис. 7).

Оценка состояния р-катенина, р130 и Е2/4 в МСК с индуцированным сигнальным путем 1Уп1/р-катенин. Иммунофлюоресцентный анализ показывает, что в нормальных условиях МСК продуцируют небольшое количество ЕН4, который распределяется равномерно между

А Б - +ии +А549

Антитела Р-катенпн р!30 Е2Г4

Обработка - антитела 1 2 * © 3 4 1 2 Ф Ф 3 4 1 2 ш т 3 4

+ антитела 1 '2 # 01 щ 3 Л 1 2 1 * # Ч з «*> < 1 2 3 4

+ антитела + 1ЛС1 & > ^ I 1 V Т £ 1 2 £ 3 4 V* 3 4

+ антитела +А-549 1 2 Ф Ф> 1 2 3 4 г' щг 1 2 • * 5 г 4

I— р-катеннн Относительная

- опыт

- контроль

12 3 4

время культпвпровлннпя. сут

С1 43 . С1 40 в 41 1 Б 43 С2А1 16 Д С2/М 17

Рисунок 8. Индукция сигнального пути \Уп1/р-катенин в МСК ведет к активации р130 и Е2Г4. А-иммунофлюоресцентный анализ экспрессии р130, Р-катенина и Е2Г4 в МСК, кокультивированных с клетками линии А-549. 1 - ИАР1, 2 - специфические антитела, 3 - естественная зеленая флюоресценция, 4 -комбинированное изображение. Б - оценка с помощью иммуноблотинга активации р130 и Е2Г4 в МСК после индукции сигнального пути \¥п1/р-катенин. МСК кокультивировали в течение 96 ч с клетками А-549. ЫС1 добавляли в ростовую среду в концентрации 10 мМ на 4 ч. В — пролиферативная активность МСК, кокультивированных с клетками А-549. Данные представляют собой среднюю величину ± стандартное отклонение. Г. Цитометрическая характеристика МСК, кокультивированных с клетками А-549; к - контроль, э -эксперимент.

цитоплазмой и ядром, тогда как р130 локализуется преимущественно в ядре (Рис. 8А). Обработка хлористым литием или кокультивирование с клетками А-549 вызывает накопление ß-катенина, р130, E2f4 в цитоплазме и их транслокацию в ядро. При использовании иммуноблотинга мы также обнаружили повышение уровня и активацию всех трех названных белков (Рис. 8Б). Белки р130 и E2f4 в первичных культурах и некоторых линиях трансформированных клеток, например в клетках глиобластомы человека T98G, формируют комплекс, тормозящий транскрипцию множества генов, продукты которых необходимы для прогрессии клеточного цикла (Moberg et al., 1996; Popov et al., 2005). Проделанный нами анализ кривых роста показывает, что скорость деления МСК, кокультивированных с клетками А-549, не уменьшается (Рис. 8В). Цитометрическая оценка пролиферативного статуса кокультивированных МСК свидетельствует, что как в опыте, так и в контроле МСК находятся в стадии активной пролиферации (Рис. 8Г). На основании этих данных мы предположили, что в МСК комплекс pl30/E2f4 включает ß-катенин, что модифицирует его способность супрессировать активность генов, продукты которых необходимы для перехода G1/S и дальнейшего хода клеточного цикла. По данным литературы, дифференцировка одних клеток, например, миобластов и нейробластов, требует предварительной остановки их пролиферации, тогда как лимфоциты и МСК, приобретающие свойства гепатоцитов, активно делятся в ходе дифференцировки (Sprent et al., 2008; Herencia et al., 2011).

Синхронизация МСК в различных фазах клеточного цикла. Сравнительная характеристика уровня и рисунка фосфорилирования р130, E2f4 и ß-катенина в асинхронных и синхронизованных в различных фазах клеточного цикла МСК показала, что в этих клетках р130 присутствует во всех трех фосфорилированных формах в каждой фазе клеточного цикла (Рис. 9А). Наоборот, в гепатоцитах мыши и покоящихся клетках линии T98G (Рис. 9Б) р130 находится только в гипофосфорилированных формах, тогда как гиперфосфорилированная форма рЗ появляется в клетках T98G только в переходе G1/S, за чем следует снижение общего уровня р130. Подобным образом в МСК изменяется количество E2f4 и ß-катенина, которые показывают небольшие колебания уровня и рисунка фосфорилирования в ходе клеточного цикла (Рис. 9А) в противоположность мышиным гепатоцитам и клеткам линии T98G. В последних в состоянии покоя присутствуют гипофосфорилированные формы pi30 и гиперфосфорилированные формы E2f4. В противоположность МСК, в ходе клеточного цикла в клетках T98G E2f4 теряет свои активные гиперфосфорилированные формы (Рис. 9В).

Рисунок 9. Сравнительная

характеристика уровня и рисунка фосфорилирования р130, E2f4 и ß-катенина в синхронизированных и асинхронно растущих МСК с помощью иммуноблотинга. А - МСК, синхронизированные в фазах S и G2/M клеточного цикла с помощью тимидина и нокодазола; As - асинхронно делящиеся клетки; S, G2/M - клетки, синхронизированные, соответственно, в фазе S и G2/M; pi, р2, рЗ - формы р!30, отличающиеся по электрофоретической подвижности; Б-В - изменение уровня и рисунка фосфорилирования р130, E2f4 и ß-катснина в синхронизированных МСК и контрольных клетках линии T98G.

Полученные нами результаты свидетельствуют о существенных особенностях изменения уровня и активности р130, E2f4 и ß-катенина в МСК при индукции дифференцировки, связанной с активацией сигнального пути Wnt/ß-катенин, а также в ходе клеточного цикла. Эти

изменения отличаются от таковых в клетках линии T98G. Поскольку р 130 и Р-катенин являются субстратами одной и той же киназы Gsk3p, мы в последующих опытах проверяли гипотезу о том, что эти белки могут формировать комплекс, важный для регуляции функций МСК.

Оценка продукции и электрофоретической подвижности неактивного и активного (I-катенина до и после индукции в МСК сигнального пути Wnt/p-катенин. Для выявления соответствия между уровнем, электрофоретической подвижностью и рисунком фосфорилирования различных форм р-катенина мы использовали антитела, распознающие общеклеточный, неактивный - фосфорилированный по Ser33/37/Thr41, или активный -нефосфорилированный по Ser37/Thr41 Р-катенин. Известно, что антитела к активному белку распознают р-катенин, непосредственно передающий сигналы Wnt внутрь клетки (Staal et al., 2002). Клетки почки человека линии 293Т использовали в качестве положительного контроля продукции фосфо-Р-катенина в соответствии с рекомендацией производителя этих антител компании Cell Signaling, Inc. (США). Клетки обрабатывали ингибитором фосфатаз каликулином A (Sigma) для предотвращения дефосфорилирования р-катенина, т.к., по данным компании Cell Signaling, Inc., в нормальных условиях фосфорилированный по Ser33/37/Thr41 белок в большинстве клеточных линий не выявляется или выявляется в очень небольших количествах. Полученные нами результаты показывают, что нормальные асинхронно делящиеся МСК и клетки линии 293Т содержат едва определяемое количество

Антитела к Клеточная л

293Т MSC

ттттЯШ «ма -м* щ- Р-катенин Ф

Антитела к Р-катенину Ф р-катенннуТ р-катенннуА

Трансфекцня р-катеннн А р-катенин А р-катенннА

Обработка К - К К - К К - К

9 10 11 12

СЕ

- Ser33/37/41 фосфо-р-катенин

. АКТИВНЫ" (t-UT«BHB

Рисунок 10. Характеристика с помощью иммуноблотинга продукции и электрофоретической подвижности общеклеточного, фосфорилированного и активного Р-катенина. А - оценка продукции фосфо-Р-катенина в МСК и клетках линии 293Т. Асинхронно растущие МСК и клетки линии 293Т культивировали 30 мин в среде с каликулином, клеточные экстракты подвергали электрофорезу и иммуноблотингу для визуализации фосфо-Р-катенина. Б - оценка соответствия уровня и электрофоретической подвижности общеклегочного, фосфо- и активного р-катенина в клетках линии 293Т. Клетки линии 293Т, нетрансфицированные (дорожки 1-2, 5-6, 9-10) или трансфицированные плазмидой, экспрессирующей стабилизированный р-катенин с мутацией БегЗЗА1а (дорожки 3-4, 7-8, 11-12), были обработаны каликулином (К) и охарактеризованы по экспрессии фосфо- (Р-катенин Ф), общеклеточного (Р-катенин Т) и активного р-катенина (Р-катенин А); /' и /7, соответственно, кратковременная и длительная обработка электрофоретических реплик реагентом, активирующим хемилюминесценцию (ЕСЬ). В - схема соответствия между электрофоретической подвижностью общеклеточного, фосфо- и активного Р-катенина.

показали, что контрольные необработанные МСК продуцируют р-катенин, который выявляется при иммуноблотинге в форме мажорной и минорной полос, соответственно, с меньшей и большей электрофоретической подвижностью (Рис. 12, дорожка 1). При обработке МСК ионами лития антитела к общеклеточному р-катенину в иммуноблотинге выявляют увеличение количества общеклеточного и активного белка (Рис. 12, дорожка 2). При кокультивировании МСК с нормальными или трансфицированными вектором pSUPER с контрольным олигонуклеотидом клетками А-549 уровень общеклеточного р-катенина возрастает незначительно, но заметно увеличивается его электрофоретическая подвижность и количество активного белка (Рис. 12, дорожки 3-4, соответственно). Электрофоретическая подвижность активного Р-катенина соответствует нижней части мажорной полосы, в которой движется общеклеточный белок (Рис. 12, стрелка АВК).

Рисунок 12. Оценка экспрессии активной и общеклеточной фракции р-катенина в МСК, кокультивированных с клетками линии А-549 с различным уровнем продукции WNT2, путем иммуноблотинга. Клетки линии А-549 со стабильной экспрессией вектора pSUPER, содержащего комплементарную (sil, si2) или некомплементарную (siK) siPHK против мРНК гена WNT2, контрольные необработанные клетки линии А-549

кокультивировали с МСК 10-го пассажа в течение 72 ч. МСК, обработанные LÍC1, использовали в качестве положительного контроля. После кокультивирования экстракты МСК подвергали электрофорезу и иммуноблотингу, электрофоретические реплики окрашивали антителами к активной или общей фракции р-катенина. АВК - активный Р-катенин, ОВК - общий р-катенин, стрелкой «АВК» показано положение активного Р-катенина относительно общеклеточного белка при электрофорезе, остальные сокращения - те же, что и на Рис. 11.

Определение относительного содержания р-катенина на разных дорожках показало, что эта величина возрастает в МСК при обработке клеток ионами лития и кокультивировании с нормальными или трансфицированными контрольным вектором (siK) клетками линии А-549. Соотношение АВК/ОВК, по нашим представлениям, более объективно характеризует активацию р-катенина, чем уровень общеклеточного белка. Использование этого соотношения также показывает, что подавление экспрессии гена WNT2 в клетках А-549 отменяет активацию Р-катенина в кокультивированных МСК (Рис. 12). Наши данные свидетельствуют, что в основе механизма активации сигнального пути Wnt/p-катенин в МСК, кокультивированных с клетками А-549, лежит секреция последними фактора Wnt2, который паракринно вызывает в МСК активацию р-катенина. Результаты этого и предшествующих опытов показывают, что активация сигнального пути Wnt/p-катенин проявляется не столько в увеличении уровня общеклеточного белка, сколько в ускорении его электрофоретической подвижности, связанной с продукцией активного Р-катенина, электрофоретическая подвижность которого совпадает с таковой нижней части полосы общеклеточного белка. С другой стороны, уровень активного Р-катенина, выявляемого специфическими антителами к нефосфорилированному по остаткам Ser37/Thr41 белку, является наиболее убедительным показателем активации сигнального пути Wnt/p-катенин (Staal et al., 2002).

В МСКр130 и Р-катенин физически взаимодействуют между собой в комплексе с Gsk3p. В

преципитатах из экстрактов МСК, полученных с помощью антител к р 130, выявляется р-катенин (Рис. 13А). Антитела против E2f4 копреципитируют из экстрактов МСК не только р130, но и р-катенин (Рис. 13Б), а антитела к р-катенину - р130 (не показано). Физическое

А549 A549siK A549s¡l A549sil_Кокультиднрование

-_._-_-_Обработала

1.0 1ДЗ 1.:3 1,04 1,19 1J

1.0 5.0 6,4 5.4 1.4_0,6

-Общеклеточньш Р-катенин (ОВК)

Относительная плотность полос _ Активный Р-катенкн (.АВК)

Относительная плотность полос

Соотношение АВК/ОВК

LICl - + - + 12 3 4

S__Ai Gfl/Gl S

«-1 P1 J Е2Г4

* Р-ЮТСНИН

HC IgC

P-IKHH

Рисунок 13. р130 и Р-катенин физически взаимодействуют между собой в МСК. А — р-катенин конреципитируется антителами к р 130; НС — тяжелые цепи иммуноглобулинов кролика, ИП — иммунопреципитация; Б - р 130 и катенин копреципитируюгся вместе с ЕН4. ИП - иммунопреципитация, ИБ - иммуноблотинг.

ип р!м - - 4- + -Ш--Ш1-Е2И_

взаимодействие р130 с р-катенином и Е2{4 определяется в различных фазах клеточного цикла (Рис. 13Б). Известно, что в фазах С0/С1 р 130 фосфорилируется (г.чкз [). одной из основных мишеней которой является Р-катенин (ЬкоусЫск й а1., 2004). Преципитация с использованием антител к ОвкЗр подтверждает описанные выше результаты, свидетельствующие, что р130 и р-катенин входят в состав одного и того же комплекса, образование которого происходит с участием ввкЗр (Рис. 14А). Антитела к ОвкЗр копреципитируют как Р-катении, так и р130 (Рис. 14А). Комплекс р 130-СькЗ(1-(!-катенин формируется в асинхронных и синхронизированных в разных фазах клеточного цикла МСК, причем его характеристики в ходе клеточного цикла существенно не изменяются (Рис. 13Б). Характер фосфорилирования р130, преципитированного из экстрактов МСК в различных фазах клеточного цикла, подобен - эти преципитаты содержат как гипер-, так и гипофосфорилированные формы белка (Рис. 14Б), тогда как в контрольных клетках линии Т98С антитела к Е2Г4 копреципитируют из экстрактов покоящихся клеток только гипофосфорилированные формы р130 (результаты не показаны). Стимуляция ионами лития сопровождается повышением в МСК уровня р-катенина, что сочетается с увеличением количества р 130, его гипофосфорилированных форм, и выявляется в иммуноблотинге и иммунопреципитации (Рис. 14А, соответственно, дорожки 1-2 и 3-4). Повышение уровня и активация р130 в МСК отмечается также при другом способе индукции сигнального пути \УШ/р-катенин - кокультивировании МСК с клетками линии А-549 (Рис. 14Б). Структурные компоненты комплекса р130/1г2(4-0.чк3[!-р-катсиш1, выявляемые при преципитации различными антителами, существенно различаются. Антитела к р 130 преципитируют р2 и рЗ р130 (Рис. 13А), антитела к Е214 - р1 и рЗ (Рис. 13Б), антитела к Р-катенииу - р2 (результаты не показаны), а антитела к ОякЗр - все три формы белка (Рис. 14А, Б). Эти данные свидетельствуют о существовании в МСК различных комплексов, содержащих р130 и Р-катенин, которые могут играть различную функциональную роль.

Рисунок 14. р130, Gsk3p и р-катенин формируют комплекс в МСК. А-антитела к Gsk3p преципитируют р-катенин и р130 из экстрактов МСК. Б -оценка физического взаимодействия между Gsk3p, р130 и Р-катенином в МСК, кокультивированиых с клетками А-549. Экстракты МСК,

необработанных, обработанных ионами лития или кокультивированиых с клетками линии А-549,

выявляли в иммуноблотинге. ИП —

Оценка формирования комплекса pl30-Gsk3p-ft-KamenuH в ядерном и цитоплазматическом компартментах МСК. Определение р!30 и Р-катенина в экстрактах МСК из цитозоля и ядра показало, что эти белки локализуются преимущественно в ядерном компартменте клетки и находятся там в активных формах (Рис. 15А). Обработка МСК ионами лития способствует

ptw

р"

4™[i КШСИЯ*

tDiicie« (.чир

ИИ Gddjl --<■«■ ИИ

прецинитировали антителами к Gsk3p, а преципитированные белки иммунопреципитация, НС lgG - тяжелая цепь иммуноглобулинов G.

Рисунок 18. Иммунофлюоресцентный анализ экспрессии и локализации р-катенина в МСК разных пассажей и КОЭ при обработке клеток ионами лития. Экспоненциально растущие МСК культивировали в среде с 10 мМ ЦС1 и окрашивали антителами к Р-катенину. 1 - окраска ОАР1, 2 - естественная зеленая флюоресценция, 3 - Р-катенин, 4 - совмещенное изображение. Красную флюоресценцию выявляли вторыми антителами, конъюгированными с Су5® 633. Об. 100*.

пассирования уровень Р-катенина в ядерных экстрактах необработанных МСК значительно повышается. МСК 60-го пассажа реагируют на добавление 1ЛС1 в ростовую среду незначительным повышением уровня р-катенина во всех отделах клетки. КОЭ, как и МСК поздних пассажей, не экспрессируют Оф, а уровень р-катенина и его внутриклеточное распределение в ответ на обработку клеток ионами лития схожи с таковыми в МСК поздних пассажей (Рис. 18). В отличие от них в КОЭ не выявляется мембранный р-катенин и не наблюдается его перераспределение между разными компартментами при обработке ионами лития (Рис. 18). Полученные в настоящей работе результаты свидетельствуют о взаимодействии сигнальных путей \¥Щ/р-катенин и рШ) в регуляции деления, пролиферации и трансформации МСК. В нормальных условиях в МСК ранних пассажей сигнальный путь \Уп1/р-катенин может играть важную роль в сопряжении клеточного цикла и дифференцировки, как необходимого компонента механизма самоподцержания СК. В ходе длительного пассирования в МСК происходит увеличение уровня внутриядерного Р-катенина и его конститутивная активация, что может являться реакцией на стресс, например, повышенную оксигенацию в культуре, и способствует преодолению остановки клеточного цикла и клеточного старения. «Платой» за спасение от клеточного старения является иммортапизация и последующая трансформация МСК, в механизме возникновения которой важную роль может играть конститутивная транскрипционная активация генов-мишеней семейства ЬЕР/ТСБ, например гена с-МУС. Схематично взаимодействие сигнальных путей \Уш/р-катенин и рЯЬ в нормальных и трансформированных МСК можно представить в виде схемы на Рис. 19.

Рисунок 19. Сигнальные пути \VntZp-катенин и р!1Ь взаимодействуют в ходе клеточного цикла, что опосредовано образованием

комплекса рВО-Р-катенин-СзкЗр. В этом комплексе р 130 является потенциальным супрессором

мишеней Р-катенина, его активность направлена на остановку клеточного цикла и дифференцировку МСК. Действие р-катенина, напротив, активирует прогрессию клеточного цикла и при конститутивной активации способствует

возникновению туморогенности.

р-катенин СвкЗр р!30

\Л/п1/р-катенин

нв

Выводы

1. При кокультивировании с клетками линии А-549, происходящими из эпителия легких, в условиях разделения клеточно-непроницаемой мембраной в МСК активируется сигнальный путь Wnt/ß-катенин, что сопряжено с приобретением белками р130 и E2f4 активного состояния и экспрессией маркеров легочного эпителия; торможение в клетках А-549 экспрессии гена WNT2 с помощью метода интерференции РНК отменяет в кокультивируемых МСК активацию ß-катенина.

2. В МСК в ходе клеточного цикла не происходит существенных изменений уровня и рисунка фосфорилирования белков р130 и E2f4, которые в контрольных клетках линии T98G формируют супрсссорный комплекс, тормозящий выход из состояния покоя; диссоциация этого комплекса за счет фосфорилирования и деградации р130 является обязательным условием прогрессии клеточного цикла в клетках T98G, но не происходит в МСК.

3. В МСК ß-катенин, р130, Gsk3ß и Е2Г4 формируют в различных фазах клеточного цикла комплекс, состав которого в ядре и цитозоле различается и изменяется при активации сигнального пути Wnt/ß-катенин; в состав этого комплекса входят факторы ТсО,4, опосредующие его транскрипционную активность, что выявляется при экспрессии экзогенного ß-катенина или ß-катенина вместе с р 130.

4. В ходе длительного культивирования МСК происходит повышение скорости их пролиферации, понижаются дифференцировочная и адгезивная активность, на 43-47-м пассажах клетки образуют опухоли при введении сингенным животным. Приобретение туморогенности МСК в ходе их длительного пассирования сочетается с повышением уровня ядерного ß-катенина, транскрипционных факторов Tcf3,4 и снижением чувствительности клеток к действию ионов лития, что соответствует состоянию конститутивной активности сигнального пути Wnt/ß-катенин в МСК поздних пассажей и КОЭ.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Popov В.v., Serikov V.B., Petrov N.S., Izusova T.V., Gupta N., Matthay A. 2007. Lung epithelial cells induce epithelial differentiation in mouse mesenchymal bone marrow stem cells by paracrine mechanism. Tissue Engineering. 13(10): 2445-2450.

2. Гринчук T.M., Иванцов K.M., Алексеенко JI.JI., Кожухарова И.В., Зайчик A.M., Михайлов В.М., Петров Н.С., Попов Б.В. 2008. Характеристика культуры мезенхимных стволовых клеток мыши, экспрессирующих GFP. Цитология. 50(12): 1029-1034.

3. Попов Б.В., Петров Н.С., Михайлов В.М., Томилин А.Н., Алексеенко Л.Л., Гринчук Т.М., Зайчик A.M. 2009. Спонтанная трансформация и иммортализация мезенхимных стволовых клеток в культуре in vitro. Цитология. 51(2): 91-102.

4. Петров Н.С., Жидкова О.В., Зешш В.В., Попов Б.В. 2011. Негативный регулятор клеточного цикла - белок р130 и ß-катенин формируют комплекс в мезенхимных стволовых клетках. Цитология. 53(2): 107-115.

5. Petrov N., Zhidkova О., Serikov V., Zenin V., Popov В. 2012. Induction of Wnt/ß-catenin signaling in mouse mesenchymal stem cells is associated with activation of the pi 30 and E2f4 and formation of the pl30/Gsk3ß/ß-catenin complex. Stem Cells Dev. 21(4): 587-597.

6. Петров H.C., Злобина O.B., Сериков В.Б., Зайчик А.М., Комяков Б.К., Гулиев Б.Г., Алексеев М.Ю., Попов Б.В. 2007. Сравнительная характеристика изменений уровня и рисунка фосфорилирования ß-катенина, белка р130 и транскрипционного фактора E2F4 в мезенхимных стволовых клетках при их кокультивировании с клетками линии А-549. Тезисы докладов II Съезда Общества клеточной биологии совместно с Юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН. Цитология. 49(9): 782.

7. Попов Б.В., Гринчук Т.М., Иванцов K.M., Петров Н.С., Злобина О.В., Апексенко Л.Л., Скрипкина Н.С., Каминская Е.В, Кузоватов С.Н., Михайлов В.М. 2008. Опухолевая

трансформация мсзенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей C57BL/6, экспрессирующих белок GFP. Тсзисы 4-й Российской конфере1щии по фундаментальной онкологии. Вопросы онкологии. 54(2): 22.

8. Петров Н.С., Жидкова О.В., Сериков В.Б., Попов Б.В. 2009. р-катенин, р130 и E2F4 формируют функциональный комплекс в мсзенхимальных стволовых клетках. Материалы Всероссийской научной школы-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования». 48.

9. Петров Н.С., Жидкова О.В., Попов Б.В. 2010. р-катенин и GSK3P формируют в мезенхимных стволовых клетках комплексы, включающие различные формы р130. Тсзисы докладов и сообщений, представленные на II Конференцию молодых ученых Института цитологии РАН. Цитология. 52(6): 501-502.

10. Petrov N., Zhidkova О., Zenin V., Popov В. 2011. Induction of Wnt/p-catenin signaling in mouse mesenchymal stem cells is associated with activation of pi 30 and E2f4 and transformation of the pl30/Gsk3p/p-catenin complex. Abstracts of «Stem Cells Update - From Basic Research to the Clinic». 50.

Список цитируемой литературы Петров Н.С., Жидкова О.В., Зепин В.В., Розанов Ю.М., Попов Б.В. 2011. Негативный регулятор клеточного цикла — белок р130 и р-катенин формируют комплекс в мезенхимных стволовых клетках. Цитология. 53(2): 107-115.

Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. 2002. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296(5567): 550-553.

Chomczynski P., Sacchi N. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. AnalBiochem. 162(1): 156-159.

Herencia С., Rodríguez-Ariza A., Canalejo A., Naranjo A., Briceño F.J., López-Cillero P., De la Mata M., Muñoz-Castañeda J.R. 2011. Differential bone marrow hematopoietic stem cells mobilization in hepatectomized patients. J Gastrointest Surg. 15(8): 1459-1467.

Korinek V., Barker N., Morin P.J., van Wichen D., de Weger R., Kinzler K.W., Vogelstein В., Clevers H. 1997. Constitutive transcriptional activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/-colon carcinoma. Science. 275(5307): 1784-1787.

Litovchick L., Chestukhin A., DeCaprio J.A. 2004. Glycogen synthase kinase 3 phosphorylates RBL2/pl30 during quiescence. Mol Cell Biol. 24(20): 8970-8980.

Moberg K., Starz M.A., Lees J.A. 1996. E2F-4 switches &om pl30 to pl07 and pRB in response to cell cycle reentry. Mol Cell Biol. 16(4): 1436-1449.

Petrov N., Zhidkova O., Serikov V., Zenin V., Popov B. 2012. Induction of Wnt/p-catenin signaling in mouse mesenchymal stem cells is associated with activation of the pl30 and E2f4 and formation ofthe pl30/Gsk3p/p-catenin complex. Stem Cells Dev. 21(4): 587-597.

Popov В., Chang L.S., Serikov V. 2005. Cell cycle-related transformation ofthe E2F4-pl30 repressor complex. Biochem Biophys Res Commun. 336(3): 762-769.

Sprent J., Cho J.H., Boyman O., Surh C.D. 2008. T cell homeostasis. Immunol Cell Biol. 86(4): 312-319.

Staal F.J., Noort Mv.M., Strous G.J., Clevers H.C. 2002. Wnt signals are transmitted through N-tcrminally dephosphorylated bcta-catcnin. EMBO Rep. 3(1): 63-68.

StambolicV. RuelL., WoodgettJ.R. 1996. Lithium inhibits glycogen syntase kinase-3 activities and mimics Wingless signaling in intact cells. CurrBiol. 6(12): 1664-1668.

YouL., He В., XuZ., UematsuK., MazieresJ., Mikamil., RcguartN., Moody T.W., Kitajewsky J., McCormick F., Jablons D.M. 2004. Inhibition of Wnt-2-mediated signaling induces programmed cell death in non-small-cell lung cancer cells. Oncogene. 23(26): 61706174.

Подписано в печать 17.05.2012 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ 220

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Петров, Николай Сергеевич

Список сокращений

Введение

Актуальность проблемы Цель и задачи работы

Основные положения, выносимые на защиту Научная новизна полученных результатов Теоретическое и практическое значение работы Апробация работы

Финансовая и некоммерческая поддержка работы Структура и объем диссертации

1. Обзор литературы.

1.1.Мезенхимные стволовые клетки (МСК)

История получения Свойства

Маркерная специфичность Методы приготовления Пластичность

Дифференцировка в энтодермальном направлении в опытах т у/уо Туморогенность

1.2. Характеристика сигнального пути \¥п!/р-катенин

Роль сигнального пути Жп1/^-катенин в эмбриональном периоде и после рождения

Структура белков семейства

Передача сигналов \¥ш внутрь клетки

Функциональная роль мембранного Р-катенина

Механизм инактивации 0-катенина в отсутствие сигналов ]¥ш

Механизм действия транскрипционных факторов семейства ЬЕР/ТСР в отсутствие сигналов ]¥т

Активация зависимой от ЬЕР/ТСР и опосредованной Р-катенином транскрипции Роль сигналов ЖМ в формировании лёгочного эпителия в эмбриогенезе Роль сигнального пути ЖМ//3-катенин в регуляции пластичности МСК и их дифференцировки в лёгочный эпителий

Сигнальный путь Жш/^-катенин при карциноме легких и кишечника

1.3. Сигнальный путь семейства гена ретинобластомы (рШ>)

Члены семейства рЯЬ и их структурная организация Функциональная роль белков семейства рЯЬ

Взаимодействие «покетных» белков с транскрипционными факторами семейства Е2Р

Регуляция клеточного деления «покетными» белками осуществляется на транскрипционном уровне

Регуляция активности «покетных» белков путем фосфорилирования Специфическая роль р130 в регуляции клеточных функций Роль ОзкЗР в регуляции активности р130, потенциальное взаимодействие сигнальных путей рЯЬ и }¥п1/[¡-катенин

1.4. Роль сигнальных путей \Уп1/р-катенин и рИЬ в регуляции функций соматических стволовых клеток (ССК)

Концепция СК, определение и свойства различных типов СК Гипотеза механизма регуляции самоподдержания СК

Регуляция самоподдержания СК осуществляется в контексте клеточного цикла Роль сигнального пути Жп^-катенин в регуляции функций ССК Роль сигнального пути рЯЬ в регуляции функций ССК

Взаимодействие между сигнальными путями Ц^мф-катенин и рКЬ в регуляции функций ССК

2. Материалы и методы

Клеточные линии и культивирование клеток

Получение МСК из костного мозга трансгенных мышей, экспрессирующих зеленый флюоресцирующий белок (Gfp)

Определение пролиферативной и клоногенной активности МСК Оценка туморогенности МСК и получение клеток эксплантатов опухоли Индукция дифференцировки МСК в клетки различных мезодермальных линий Разработка модели in vitro дифференцировки МСК в клетки легочного эпителия Получение и очистка плазмидной ДНК Трансфекция клеток различных линий

Получение РНК, электрофорез РНК в денатурирующем геле и её количественная оценка

Синтез кДНК на матрице РНК и амплификация фрагментов генов с помощью ревертированной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) Ингибирование экспрессии гена WNT2 с помощью метода интерференции РНК Метод люциферазного репортера для оценки транскрипционной активации генов, содержащих сайты связывания белков семейства LEF/TCF Анализ экспрессии мРНК

Синхронизация клеток в различных фазах клеточного цикла и проточная цитометрия

Иммуноцитохимические методы Электрофорез и иммуноблотинг Фракционирование клеточных экстрактов Иммунопреципитация Статистический анализ

3. Результаты

3.1. Характеристика первичной культуры МСК костного мозга трансгенных мышей СЕР в ходе их длительного пассирования

Свойства МСК на первых пассажах

Изменение морфологических свойств в ходе длительного пассирования Дифференцировочная и клоногенная способность

3.2. Оценка пролиферативной и туморогенной активности МСК в ходе их длительного пассирования в культуре

Пролиферативная активность Туморогенная активность

Характеристика клеток эксплантатов опухоли (КОЭ), полученной из МСК

3.3. Разработка модели энтодермальной дифференцировки МСК в опытах in vitro

Использование метода кокулътивирования клеток для разработки модели энтодермальной дифференцировки МСК

Кокулътивирование с клетками А-549 вызывает в МСК экспрессию маркеров лёгочного эпителия

Кокулътивирование с клетками А-549 вызывает в МСК активацию р-катенина Ионы лития активируют р-катенин в МСК

Индукция сигнального пути Wnt/fi-катенин сопряжена с транскрипционной активацией репортёрной конструкции, содержащей сайты связывания транскрипционных факторов Lef/Tcf

3.4. Оценка уровня, рисунка фосфорилнрования и внутриклеточной локализации белков р130 и E2f4 в МСК с индуцированным сигнальным путем Wnt/p-катенин

Индукция сигнального пути Wnt/fi-катенин вызывает в МСК сочетанное повышение уровня и активацию р130 и Е2/4 Синхронизация МСК в различных фазах клеточного цикла Характеристика уровня и рисунка фосфорилирования р130, Е2/4 и Р-катенина в МСК в различных фазах клеточного цикла

Оценка уровня продукции и электрофоретической подвижности неактивного и активного Р-катенина до и после активации в МСК сигнального пути Wnt/(i-катенин

Изучение механизма активация сигнального пути Wnt/p-катенин в МСК при их кокультивировании с клетками линии А

3.5. В МСК р130 и Р-катенин физически взаимодействуют между собой в комплексе, в состав которого входит Gsk3f} р-катенин и р130 копреципитируются из экстрактов МСК при использовании антител к pi 30 и Е2/

Комплекс pi30-Е2/4-Р-катенин в МСК включает Gsk3P

Характеристика изменений комплекса р130-Р-катенин в ходе клеточного цикла Характеристика комплекса pi30-P-mmeHUH-Gsk3P при активации в МСК сигнального пути Wnt/p-катенин

Оценка формирования комплекса pi30-P-KamenuH-Gsk3p в ядерном и цитоплазматическом компартментах МСК

Двойная иммунофлюоресцентная окраска выявляет накопление активных форм Р-катенина, р130 и E2f4 в ядре МСК, обработанных LiCl

3.6. р130 регулирует транскрипцию генов, содержащих сайты связывания белков семейства LEF/TCF

Комплекс pi30-Gsk3р-р-катенин включает транскрипционные факторы Tcf3,4 Оценка транскрипционной активности р130 с помощью репортёрных , конструкций, содержащих сайты связывания белков Lef/Tcf

3.7. Уровень и активность р-катенина в ядерном компартменте МСК возрастает в ходе их длительного культивирования

Сравнительная оценка уровня и рисунка фосфорилирования Р-катенина и р130 в МСК в процессе их длительного культивирования in vitro Иммунофлюоресцентная оценка выявляет повышение уровня и активацию Р-катенина в МСК поздних пассажей

4. Обсуждение результатов

4.1. Фенотипическая характеристика МСК в ходе длительного

Изменение морфологических свойств МСК в npoifecce длительного пассирования in vitro

В прогрессе длительного культивирования МСК теряют способность к дифференцировке, активируют пролиферацию и приобретают туморогенные свойства

4.2. Индукция сигнального пути Wnt/p-катенин в МСК сопряжена с активацией белков р130 и E2f

Разработка модели энтодермальной дифференцировки МСК, роль сигнального пути Wnt/fi-катенин

Индукция сигнального пути Wnt/fi-катенин в МСК сопряжена с формированием активного состояния репрессорных белков р130 и Е2/4, но не вызывает торможения деления клеток

Характеристика функционального состояния fi-катенина с помощью антител к его активным и неактивным формам

Активация сигнального пути Wnt/fi-катенин в МСК при их кокультивировании с клетками линии А-549 связана с секрецией ими Wnt2 и его паракринным действием на МСК

4.3. р130, СэкЗр и р-катенин формируют в МСК функциональный комплекс

В МСК супрессор р!30/Е2/4 физически взаимодействует с у3-катенином и ОзкЗР Изменение взаимодействия белков в комплексер130-С$к3/3-/3-Катенин входе клеточного цикла и при активации в МСК сигнального пути Wnt/fi-кameнuн Комплексы р130-р-катенин-0зк3р формируются преимущественно в ядерном компартменте клетки

Комплекс р1 ЗО-ОзкЗрф-катенин включает в свой состав факторы Тс/3,4 и выявляет специфическую транскрипционную активность р130 Приобретение МСК туморогенности в ходе пассирования сочетается с активацией /3-катенина

4.4. В чем заключается регенеративный потенциал МСК и какова роль взаимодействия сигнальных путей pRb и Wnt/p-катенин в его формировании?

Пролиферативная активность МСК в ходе длительного пассирования in vitro Клоногенность

Индуцибельность к дифференцировке в клетки мезодермального происхождения Пластичность или способность к трансдифференцировке в клетки энтодермального происхождения Отсутствие туморогенной активности

5. Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие p130 - белка семейства pRb, и β-катенина - передатчика сигналов Wnt, в ходе дифференцировки и трансформации мезенхимных стволовых клеток мыши"

Актуальность проблемы. Исследование возможности замещения клеток и тканей различных органов является одной из актуальных задач современной клеточной биологии в связи с увеличением продолжительности жизни, возрастанием числа возрастных заболеваний и необходимостью восстановления поражённых органов. Многие исследования биологических источников для регенеративной терапии сфокусированы на соматических стволовых клетках (ССК), которые обладают уникальной способностью самообновляться и образовывать специализированные клетки различной тканевой специфичности.

Мезенхимные стволовые клетки (МСК), происходящие из мезодермы, являются одним из типов ССК и привлекают к себе внимание как потенциальный ресурс для регенеративной терапии благодаря относительной простоте их получения и широкому дифференцировочному потенциалу. МСК обладают свойством превращаться в клетки не только мезодермального, но эктодермального и энтодермального происхождения, в частности, в клетки альвеолярного эпителия. Феномен приобретения ССК необычного фенотипа и несвойственных им в нормальных условиях функций был назван пластичностью. Механизм пластичности не достаточно исследован и в настоящее время является объектом изучения исследовательских лабораторий во всем мире.

В основе пластичности МСК лежит их способность к эпигенетическому репрограммированию и трансдифференцировке в клеточные линии, происходящие из эктодермального и энтодермального зародышевых листков. В литературе описаны несколько моделей для изучения трансдифференцировки МСК в клетки энтодермального происхождения различной тканевой специфичности. Однако, эти модели не предоставляют возможности для анализа внутриклеточных событий в отдельных клетках в процессе их трансдифференцировки, вызванной внешними сигналами. Известно, что в основе дифференцировки стволовых клеток (СК) лежит взаимодействие молекул множества сигнальных путей. Среди других в регуляции функций ССК ключевую роль играет канонический сигнальный путь Wnt/p-катенин, который широко используется в закладке и формировании тканей и органов в процессе эмбрионального развития, включая образование энтодермальных тканей. В культуре клеток in vitro и в организме зрелого животного активность сигнального пути Wnt/p-катенин важна для поддержания функций СК различных линий, а конститутивное повышение активности этого пути часто связано с возникновением раковых СК.

Функционирование сигнального пути Wnt/p-катенин осуществляется в контексте клеточного цикла, убиквитарным негативным регулятором которого является семейство 7 продукта гена ретинобластомы (pRb). Члены семейства pRb осуществляют эффекторный контроль клеточного цикла путем взаимодействия с транскрипционными факторами семейства E2F. В свою очередь белки E2f регулируют синтез и активность молекул, составляющих машину клеточного цикла. При планировании настоящей работы мы основывались на хорошо известных данных о том, что члены семейства pRb взаимодействуют с сигнальными молекулами других регуляторных путей в контрольных точках клеточного цикла, наиболее важной из которых является точка R1 фазы G1. Взаимодействие сигнальных путей Wnt/p-катенин и pRb в точке R1 может быть опосредовано киназой Gsk3|3, которая фосфорилирует как р130 - член семейства pRb, так и Р-катенин - основной передатчик в сигнальном пути Wnt/p-катенин. Изучение механизма такого взаимодействия и его функциональной роли может быть важным для понимания механизма пластичности МСК и его моделирования при разработке новых методов регенеративной терапии заболеваний человека.

Цель и задачи работы.

Цель работы: исследовать взаимодействие р-катенина - передатчика сигналов Wnt, и р130 -члена семейства pRb, в ходе дифференцировки и трансформации мезенхимных стволовых клеток in vitro.

Задачи работы:

1. Изучить возможность индукции энтодермальной дифференцировки МСК путём их кокультивирования с клетками линии А-549, происходящими из эпителия лёгких, и изучить роль экспрессии гена WNT2 в клетках А-549 в механизме индукции такой дифференцировки.

2. Охарактеризовать состояние pi30 и р-катенина в МСК в различных фазах клеточного цикла и при активации сигнального пути Wnt/p-катенин.

3. Изучить механизм формирования комплекса р!30 с р-катенином, изменения состава комплекса в ходе клеточного цикла, при активации сигнального пути Wnt/p-катенин, а также его потенциальную роль в транскрипционной регуляции генов, содержащих в промоторах сайты связывания факторов семейства LEF/TCF.

4. Оценить пролиферативную, дифференцировочную, клоногенную, адгезивную и туморогенную активность МСК, уровень ядерного р-катенина и транскрипционных факторов Tcf3,4 в процессе длительного пассирования МСК.

Основные положения, выносимые на защиту

1. МСК, кокультивированные с клетками линии А-549 в условиях разделения клеточно-непроницаемой мембраной, показывают активацию сигнального пути Wnt/p-катенин и экспрессию легочных эпителиальных маркеров; торможение экспрессии гена WNT2 в клетках А-549 с помощью малой интерферирующей РНК отменяет активацию Р-катенина в кокультивируемых МСК; кокультивирование с клетками А-549 можно рассматривать в качестве модели паракринной индукции эпителиальной дифференцировки МСК in vitro.

2. В асинхронно делящихся или синхронизированных в фазах G0/G1, S, и G2/M клеточного цикла МСК уровень и рисунок фосфорилирования Р-катенина и pi30 существенно не изменяется; индукция сигнального пути Wnt/p-катенин ведет к активации Р-катенина, pi30 и E2f4, однако комплекс pl30/E2f4 не вызывает торможения деления МСК.

3. В МСК Р-катенин, р 130 и Gsk3p взаимодействуют между собой и формируют комплекс, включающий в свой состав факторы E2f4, Tcf3,4 и проявляющий транскрипционную активность при экспрессии экзогенного р-катенина и р 130.

Научная новизна полученных результатов. Впервые показано, что при совместном культивировании с клетками линии А-549 в условиях разделения клеточно-непроницаемой мембраной в МСК активируется сигнальный путь Wnt/p-катенин и экспрессируются эпителиальные маркеры. Впервые установлено, что активация сигнального пути Wnt/p-катенин в кокультивируемых МСК может вызываться фактором Wnt2, секретируемым клетками А-549, торможение в них экспрессии гена WNT2 с помощью стабильной продукции малой интерферирующей РНК против мРНК WNT2 отменяет активацию р-катенина в МСК. Новым является то, что кокультивирование МСК и клеток линии А-549 в условиях их разделения клеточно-непроницаемой мембраной можно рассматривать в качестве модели паракринной индукции эпителиальной дифференцировки МСК. Впервые найдено, что уровень и рисунок фосфорилирования р 130 в ходе клеточного цикла в МСК не изменяется в противоположность соматическим дифференцирующимся клеткам линии T98G. Проведенный нами анализ механизма этого феномена впервые позволил выяснить, что индукция в МСК канонического сигнального пути Wnt ведет к активации его основного передатчика - р-катенина, а также члена семейства pRb, белка р 130, и транскрипционного 9 фактора E2f4, которые формируют комплекс pl30/E2f4. Этот комплекс поддерживает некоторые линии соматических дифференцирующихся клеток в состоянии покоя, но в МСК не проявляет супрессорной активности, что, возможно, связано с включением в его состав р-катенина. Мы показали, что в МСК Р-катенин и р!30 физически взаимодействуют между собой, формируя с Gsk3P комплексы, включающие в свой состав различно фосфорилированные формы pi30 и транскрипционные факторы семейства LEF/TCF - Tcf3,4. Комплексы pl30-Gsk3P-P-KaTeHHH-Tcf3,4 обладают транскрипционной активностью. Мы установили, что в ходе длительного культивирования значительно возрастает пролиферативная активность МСК, они утрачивают способность к дифференцировке и приобретают туморогенность, формируя опухоли при подкожном или внутримышечном введении сингенным мышам-реципиентам. Новым в изучении механизма туморогенности является то, что ее возникновение в МСК сочетается с повышением уровня и накоплением в ядре клеток активных форм р-катенина и транскрипционных факторов Tcf3,4.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы заключается в разработке новой модели паракринной индукции эпителиальной дифференцировки МСК in vitro при их совместном культивировании с клетками линии А-549 эпителиального происхождения в условиях разделения клеточно-непроницаемой мембраной. Важным результатом работы является получение новых доказательств взаимодействия в МСК сигнальных путей Wnt/p-катенин и семейства гена ретинобластомы (pRb) путем формирования комплекса pl30-Gsk3P-P-KaTeHHH. Мы впервые обнаружили, что комплекс pl30-Gsk3p-p-KaTeHHH в МСК существует в разных фазах клеточного цикла и обладает транскрипционной активностью по отношению к генам, содержащим сайты связывания белков семейства LEF/TCF. Опухолевая трансформация МСК в ходе их длительного культивирования сочетается с повышением уровня, перераспределением Р-катенина внутри клетки и его конститутивной активацией. Практическое значение работы заключается в том, что она предоставляет возможность рассматривать комплекс р130-0зк3р-р-катенин в качестве мишени фармакологической коррекции при разработке подходов и методов регуляции поведения нормальных и опухолевых стволовых клеток в экспериментальных моделях регенеративной терапии и лечения злокачественных заболеваний. Полученные данные используются при чтении курса лекций «Введение в клеточную биологию стволовых клеток» на медицинском и биолого-почвенном факультетах Санкт-Петербургского государственного университета.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ (5 статей рецензируемых научных журналах и 5 тезисов докладов на научных конференциях). Результаты диссертации представлены на II Съезде Всероссийского общества клеточной биологии (Санкт-Петербург, 2007); 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2008); Всероссийской научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009); II Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010), международной конференции «Stem Cells Update - From Basic Research to the Clinic» (Уппсала, Швеция, 2011).

Финансовая и некоммерческая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 06-04-48439 и 0904-00595), Правительства Санкт-Петербурга (грант 2.6107-06.099). Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам ИНЦ РАН H.H. Никольскому, E.H. Толкуновой, А.Н. Томилину, В.А. Поспелову, В.В. Зенину, Г.И. Штейну, В.М. Михайлову; д-ру Чанг (LS Chang, Children's Hospital, Ohio State University, Columbus, США), д-ру Серикову (V. Serikov, Children's Hospital Research Institute, Oakland City, CA, США), д-ру Попову (N. Popov, University of Wurzburg, Германия), д-ру Прокопу (D. Prockop, Tulane University, Florida, США) за предоставленные клеточные линии, реактивы, конструкции и антитела (перечислены в разделе «Материалы и методы»), возможность использовать приборы и консультативную помощь в освоении методов.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Петров, Николай Сергеевич

5. Выводы.

1. При кокультивировании с клетками линии А-549, происходящими из эпителия легких, в условиях разделения клеточно-непроницаемой мембраной в МСК активируется сигнальный путь Wnt/p-кaтeнин, что сопряжено с приобретением белками р130 и ЕПА активного состояния и экспрессией маркеров лёгочного эпителия; торможение в клетках А-549 экспрессии гена ¡¥ЫТ2 с помощью метода интерференции РНК отменяет в кокультивируемых МСК активацию Р-катенина.

2. В МСК в ходе клеточного цикла не происходит существенных изменений уровня и рисунка фосфорилирования белков р130 и Е2£4, которые в контрольных клетках линии Т980 формируют супрессорный комплекс, тормозящий выход из состояния покоя; диссоциация этого комплекса за счет фосфорилирования и деградации р130 является обязательным условием прогрессии клеточного цикла в клетках Т980, но не происходит в МСК.

3. В МСК Р-катенин, р130, ОэкЗР и Е2Т4 формируют в различных фазах клеточного цикла комплекс, состав которого в ядре и цитозоле различается и изменяется при активации сигнального пути \Уп^Р-катенин; в состав этого комплекса входят факторы ТсО,4, опосредующие его транскрипционную активность, что выявляется при экспрессии экзогенного Р-катенина или Р-катенина вместе с р130.

4. В ходе длительного культивирования МСК происходит повышение скорости их пролиферации, понижаются дифференцировочная и адгезивная активность, на 43-47-м пассажах клетки образуют опухоли при введении сингенным животным. Приобретение туморогенности МСК в ходе их длительного пассирования сочетается с повышением уровня ядерного Р-катенина, транскрипционных факторов ТсО,4 и снижением чувствительности клеток к действию ионов лития, что соответствует состоянию конститутивной активности сигнального пути \¥п1/р-катенин в МСК поздних пассажей и КОЭ.

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Popov B.V., Serikov V.B., Petrov N.S., Izusova T.Y., Gupta N., Matthay A. 2007. Lung epithelial cells induce epithelial differentiation in mouse mesenchymal bone marrow stem cells by paracrine mechanism. Tissue Eng. 13(10): 2441-2450.

2. Гринчук T.M., Иванцов K.M., Алексеенко JT.Jl., Кожухарова И.В., Зайчик A.M., Михайлов В.М., Петров Н.С., Попов Б.В. 2008. Характеристика культуры мезенхимных стволовых клеток мыши, экспрессирующих GFP. Цитология. 50(12): 1029-1034.

4. Петров Н.С., Жидкова О.В., Зенин В.В., Попов Б.В. 2011. Негативный регулятор клеточного цикла - белок pi30 и Р-катенин формируют комплекс в мезенхимных стволовых клетках. Цитология. 53(2): 107-115.

5. Petrov N., Zhidkova О., Serikov V., Zenin V., Popov В. 2012. Induction of Wnt/p-catenin signaling in mouse mesenchymal stem cells is associated with activation of the pi30 and E2f4 and formation of the pl30/Gsk3p/p-catenin complex. Stem Cells Dev. 21(4): 587-597.

6. Петров H.C., Злобина O.B., Сериков В.Б., Зайчик A.M., Комяков Б.К., Гулиев Б.Г., Алексеев М.Ю., Попов Б.В. 2007. Сравнительная характеристика изменений уровня и рисунка фосфорилирования Р-катенина, белка р130 и транскрипционного фактора E2F4 в мезенхимных стволовых клетках при их кокультивировании с клетками линии А-549. Тезисы докладов II Съезда Общества клеточной биологии совместно с Юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН. Цитология. 49(9):782.

7. Попов Б.В., Гринчук Т.М., Иванцов К.М., Петров Н.С., Злобина О.В., Алексенко Л.Л., Скрипкина Н.С., Каминская Е.В, Кузоватов С.Н., Михайлов В.М. 2008. Опухолевая трансформация мезенхимальных стволовых клеток костного мозга мышей C57BL/6, экспрессирующих белок GFP. Тезисы 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии. Вопросы онкологии. 54(2): 22.

8. Петров Н.С., Жидкова О.В., Сериков В.Б., Попов Б.В. 2009. р-катенин, р130 и E2F4 формируют функциональный комплекс в мезенхимальных стволовых клетках. Материалы Всероссийской научной школы-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования». 48.

9. Петров Н.С., Жидкова О.В., Попов Б.В. 2010. Р-катенин и GSK3P формируют в мезенхимных стволовых клетках комплексы, включающие различные формы р130. Тезисы докладов и сообщений, представленные на II Конференцию молодых ученых Института цитологии РАН. Цитология. 52(6): 501-502.

10. Petrov N., Zhidkova О., Zenin V., Popov В. 2011. Induction of Wnt/p-catenin signaling in mouse mesenchymal stem cells is associated with activation of pi30 and E2f4 and transformation of the pl30/Gsk3p/p-catenin complex. Abstracts of «Stem Cells Update -From Basic Research to the Clinic». 50.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Петров, Николай Сергеевич, Санкт-Петербург

1. ГринчукТ.М., Иванцов К.М., Алексеенко Л.Л, Кожухарова И.В., Зайчик A.M., Михайлов В.М., Петров Н.С., Попов Б.В. 2008. Характеристика культуры мезенхимных стволовых клеток, экспрессирующих GFP. Цитология. 50(12): 1030-1035.

2. Попов Б.В. 2010. Введение в клеточную биологию стволовых клеток. Санкт-Петербург: СпецЛит. 319 с., ISBN 978-5-299-00430-4.

3. Попов Б.В., Watt S.M., Розанов Ю.М., Chang L-S. 2010. Мутация в области структурного кармана pRb вызывает повышение его сродства к E2F4, сопряженное с активацией мышечной дифференцировки. Молекулярная биология. 44(2): 323-334.

4. Попов Б.В., Петров Н.С., Михайлов В.М., Томилин А.Н., Алексеенко Л.Л., Гринчук Т.М., Зайчик A.M. 2009. Спонтанная трансформация и иммортализация мезенхимных стволовых клеток в культуре in vitro. Цитология. (51)2: 91-102.

5. Aberle Н., Bauer A., Stappert J., Kispert A., Kemler R. 1997. P-catenin is a target for the ubiquitin-proteosome pathway. EMBO J. 16(13): 3797-3804.

6. Abramova M.V., Zatulovskiy E.A., Svetlikova S.B., Kukushkin A.N., PospelovV.A. 2010. e2fl Gene is a new member of Wnt/beta-catenin/Tcf-regulated genes. Biochem Biophys Res Commun. 391(1): 142-146.

7. Arce L., Yokoyama N.N., Waterman M.L. 2006. Diversity of LEF/TCF action in development and disease. Oncogene. 25(57): 7492-7504.

8. Atcha F.A., Syed A., Wu В., Hoverter N.P., Yokoyama N.N., Ting J.H., Munguia J.E., Mangalam H.J., Marsh J.L., Waterman M.L. 2007. A unique DNA binding domain converts T-cell factors into strong Wnt effectors. Mol Cell Biol. 27(23): 8352-8363.

9. BejsovecA. 2000. Wnt signaling: An embarrassment of receptors. Current Biology. 10(24): 919-922.

10. Bianco P., Rimucci M., Grothos S., Robey P.G. 2001. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology and potential applications. Stem Cells. 19(3): 180-192.

11. Blobel G.A., Moll R., Franke W.W., Vogt-Moykopf I. 1984. Cytokeratins in normal lung and lung carcinomas. I. Adenocarcinomas, squamous cell carcinomas and cultured cell lines. Virchows Arch В Cell Pathol Incl Mol Pathol. 45(4): 407-429.

12. Bonner A.E., Lemon W.J., YouM. 2003. Gene expression signatures identify novel regulatory pathways during murine lung development: implication for lung development. J Med Genet. 40(6): 408-417.

13. Brummelkamp T.R., Bernards R., Agami R. 2002. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science. 296(5567): 550-553.

14. Burkhart D.L., Sage J. 2008. Cellular mechanisms of tumour suppression by the retinoblastoma gene. Nat Rev Cancer. 8(9): 671-682.

15. Calo E., Quintero-Estades J.A., Danielian P.S., Nedelcu S., Berman S.D., Lees J.A. 2010. Rb regulates fate choice and lineage commitment in vivo. Nature. 466(7310): 1110-1114.

16. Campisi J., d'Adda di Fagagna F. 2007. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat. Rev. Mol Cell Biol. 8(9): 729-740.

17. Capelluto D.G., Overduin M. 2005. Secondary structure, 1H, 13C and 15N resonance assignments and molecular interactions of the dishevelled DIX domain. J Biochem Mol Biol. 38(2): 243-247.

18. Choi H.H., Jong H.S., Hyun Song S„ You Kim Т., Kyeong Kim N. Bang Y.J. 2002. pl30 mediates TGF-beta-induced cell-cycle arrest in Rb mutant HT-3 cells. Gynecol Oncol. 86(2): 184-189.

19. Ciavarra G., Ho A.T., Cobrinik D., Zacksenhaus E. 2011. Critical role of the Rb family in myoblast survival and fusion. PLoS One. 6(3): el7682.

20. Clevers H. 2006. Wnt/beta-catenin signaling in development and disease. Cell. 127(3): 469480.

21. Cobrinik D. 2005. Pocket proteins and cell cycle control. Oncogene. 24(17): 2796-2809.

22. Dannenberg J.H., Schuijff L., Dekker M., van der Valk M., te Riele H. 2004. Tissue-specific tumor suppressor activity of retinoblastoma gene homologs pl07 and pl30. Genes Dev. 18(23): 2952-2962.

23. Dannenberg J.H., vanRossumA., Schuijff L., te Riele H. 2000. Ablation of the retinoblastoma gene family deregulates G(l) control causing immortalization and increased cell turnover under growth-restricting conditions. Genes Dev. 14(23): 3051-3064.

24. Di Leonardo A., Linke S.P., ClarkinK., Wahl G.M. 1994. DNA damage triggers a prolonged p53-dependent G1 arrest and long-term induction of Cipl in normal human fibroblasts. Genes Dev. 8(21): 2540-2551.

25. Doble B.W., Woodgett J.R 2003. GSK-3: tricks of the trade for a multi-tasking kinase. J Cell Sci. 116(7): 1175-1186.

26. DuPree E.L., Mazumder S., Almasan A. 2004. Genotoxic stress induces expression of E2F4, leading to its association with pl30 in prostate carcinoma cells. Cancer Res. 64(13): 43904393.

27. Dyson N. 1998. The regulation of E2F by pRB-family proteins. Genes Dev. 12(15): 22452262.

28. Etheridge S.L., Spencer G.J., Health D.J. 2004. Expression profiling and functional analysis of Wnt signaling mechanism in mesenchymal stem cells. Stem Cell. 22(5): 849-860.

29. Enshell-Seijffers D., Lindon C., Kashiwagi M., Morgan B.A. 2010. beta-catenin activity in the dermal papilla regulates morphogenesis and regeneration of hair. Dev Cell. 18(4): 633642.

30. Forbers S.J., Vig P., Poulsom R., Wright N.A., Alison M.R. 2002. Adult stem cell plasticity: new pathways of tissue regeneration become visible. Clinical Science. 103(4): 355-369.

31. Frame S., Cohen P. 2001. GSK3 takes centre stage more than 20 years after its discovery. BiochemJ. 359(Pt 1): 1-16.

32. Frescas D., Pagano M. 2008. Deregulated proteolysis by the F-box proteins SKP2 and beta-TrCP: tipping the scales of cancer. Nat Rev Cancer. 8(6): 438-449.

33. Friedenstein A.J., Petrakova K.V., Kurolesova A.I., Frolova G.P. 1968. Heterotopic of bone marrow. Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues. Transplantation. 6(2): 230-247.

34. Frolov M.V., Dyson N.J. 2004. Molecular mechanisms of E2F-dependent activation and pRB-mediated repression. J Cell Sci. 117(11): 2173-2181.

35. Fuchs E., Tumbar T., Guasch G. 2004. Socializing with the neighbors: stem cells and their niche. Cell. 116(6): 769-778.

36. Giacinti C., Giordano A. 2006. RB and cell cycle progression. Oncogene. 25(38): 5220-7.

37. Grana X., Garriga J., Mayol X. 1998. Role of the retinoblastoma protein family, pRB, pi 07 and pl30 in the negative control of cell growth. Oncogene. 17(25): 3365-3383

38. Gupta N., SuX., Popov B., LeeJ.W., SerikovV., MatthayM.A. 2007. Intrapulmonary delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves survival and attenuates endotoxin-induced acute lung injury in mice. J Immunol. 179(3): 1855-1863.

39. Habas R., Dawid I.B. 2005. Dishevelled and Wnt signaling: is the nucleus the final frontier? Journal of Biol. 4(1): 2.

40. Hannon G.J., Demetrick D., Beach D. 1993. Isolation of the Rb-related pi30 through its interaction with CDK2 and cyclins.Genes Dev. 7(12A): 2378-2391.

41. Hansen K., Farkas T., Lukas J., Holm K., Ronnstrand L., Bartek J. 2001. Phosphorylation-dependent and -independent functions of pi30 cooperate to evoke a sustained G1 block. EMBO J. 20(3): 422-432.

42. Hass R., Kasper C., Bohm S., Jacobs R. 2011. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9: 12.

43. Helin K., Holm K., Niebuhr A., Eiberg H., Tommerup N., Hougaard S., Poulsen H.S., Spang-Thomsen M., Norgaard P. 1997. Loss of the retinoblastoma protein-related pl30 protein in small cell lung carcinoma. Proc Nat Acad Sci USA. 94(13): 6933-6938.

44. Helledie T., Nurcombe V., Cool S.M. 2008. A simple and reliable electroporation method for human bone marrow mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 17(4): 837-848.

45. Helmbold H., Komm N., Deppert W., Bohn W. 2009. Rb2/pl30 is the dominating pocket protein in the p53-p21 DNA damage response pathway leading to senescence. Oncogene. 28(39): 3456-3467.

46. Herwig S., Strauss M. 1997. The retinoblastoma protein: a master regulator of cell cycle, differentiation and apoptosis. Eur J Biochem. 246(3): 581-601.

47. Herzog E.L. Chai L., Krause D.S. 2003. Plasticity of marrow-derived stem cells. Blood. 102(10): 3483-3493.

48. Heyflick L. 1965. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp Cell Res. 37: 614-636.

49. Hirabayashi Y., ItohY., TabataH., NakajimaK., AkiyamaT., MasuyamaN., GotohY. 2004. The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells. Development. 131(12): 2791-2801.

50. Hoppler S., Kavanagh C.L. 2007. Wnt signalling: variety at the core. J Cell Sci. 120(3): 385393.

51. Hosoyama T., Nishijo K., Prajapati S.I., Li G., Keller C.J. 2011. Rbl gene inactivation expands satellite cell and postnatal myoblast pools. Biol Chem. 286(22): 19556-19564.

52. HsuT.C., Billen D., LevanA. 1961. Mammalian chromosomes in vitro. XV. Patterns of transformation. J Natl Cancer Inst. 27: 515-541.

53. Hughes T.A., Brady H.J. 2005. E2F1 up-regulates the expression of the tumour suppressor axin2 both by activation of transcription and by mRNA stabilisation. Biochem Biophys Res Commun. 329(4): 1267-1274.

54. Hurford R.K., Cobrinik D., Lee M.H., Dyson N. 1997. pRB and pl07/pl30 are required for the regulated expression of different sets of E2F responsive genes. Genes Dev. 11(11): 1447-1463.

55. Kawano Y., Kypta R. 2004. Secreted antagonists of the Wnt signaling pathway. J Cell Biol. 116(13): 2627-2634.

56. Kiyono T., Foster S.A., Koop J.I., McDougall J.K., Galloway D.A., Klingelhutz A.J. 1998. Both Rb/pl6INK4a inactivation and telomerase activity are required to immortalize human epithelial cells. Nature. 396(6706): 84-88.

57. KléberM., SommerL. 2004. Wnt signaling and the regulation of stem cell function. Curr. Opin. Cell Biol. 16(6): 681-687.

58. Kong L.J., Chang J.T., Bild A.H., Nevins J.R. 2007. Compensation and specificity of function within the E2F family. Oncogene. 26(3): 321-327.

59. Korinek V., Barker N., Morin P.J., van Wichen D., de Weger R., Kinzler K.W., Vogelstein B., Clevers H. 1997. Constitutive transcriptional activation by a beta-catenin-Tcf complex in APC-/- colon carcinoma. Science. 275(5307): 1784-1787.

60. Labalette C, Renard C.A., NeuveutC., BuendiaM.A., Wei Y. 2004. Interaction and functional cooperation between the LIM protein FHL2, CBP/p300, and beta-catenin. Mol Cell Biol. 24(24): 10689-10702.

61. LeCouter J.E., Kablar B., Whyte P.F., Ying C., Rudnicki M.A. 1998. Strain-dependent embryonic lethality in mice lacking the retinoblastoma-related pi30 gene. Development. 125(23): 4669-4679.

62. Lee J.O., Russo A.A., Pavletich N.P. 1998. Structure of the retinoblastoma tumour-suppressor pocket domain bound to a peptide from HPV E7. Nature. 391(6670): 859-865.

63. Lee E., Salic A., Kirschner M.W. 2001. Physiological regulation of (beta)-catenin stability by Tcf3 and CKlepsilon. J Cell Biol. 154(5): 983-993.

64. Li F.Q., Mofunanya A., Harris K., Takemaru K. 2008. Chibby cooperates with 14-3-3 to regulate beta-catenin subcellular distribution and signaling activity. J Cell Biol. 181(7): 1141-1154.

65. Li Y., Graham C., Lacy S., Duncan A.M., Whyte P. 1993. The adenovirus ElA-associated 130-kD protein is encoded by a member of the retinoblastoma gene family and physically interacts with cyclins A and E. Genes Dev. 7(12A): 2366-2377.

66. Litovchick L., Florens L.A., Swanson S.K., Washburn M.P., DeCaprio J.A. 2011. DYRK1A protein kinase promotes quiescence and senescence through DREAM complex assembly. Genes Dev. 25(8): 801-813.

67. Litovchick L., Chestukhin A., DeCaprio J.A. 2004. Glycogen synthase kinase 3 phosphorylates RBL2/pl30 during quiescence. Mol Cell Biol. 24(20): 8970-8980.

68. Lloyd A.C. 2002. Limits to lifespan. Nat Cell Biol. 4(2): E25-E27.

69. Logan C.Y., Nusse R. 2004. The Wnt signaling pathway in Development and Disease. Ann Rev Cell Dev. Biol. 20: 781-810.

70. Lorz C., García-Escudero R., Segrelles C., Garín M.I., Ariza J.M., Santos M., Ruiz S., Lara M.F., Martínez-Cruz A.B., Costa C., Buitrago-Pérez A., Saiz-Ladera C., Dueñas M.,

71. Paramio J.M. 2010. A functional role of RB-dependent pathway in the control of quiescence in adult epidermal stem cells revealed by genomic profiling. Stem Cell Rev. 6(2): 162-177.

72. Lu J., Qian J., Izvolsky K.I., Cardoso W.V., 2004. Global analysis of genes differentially expressed in branching and non-branching regions of the mouse embryonic lung. Developmental Biology. 273(2): 418-435.

73. MacDonald B.T., Tamai K., HeX. 2009. Wnt/beta-catenin signaling: components, mechanisms, and diseases. Dev Cell. 17(1): 9-26.

74. MalbonC.C., Wang H., MoonR.T. 2001. Wnt signaling and heterotrimeric G-proteins: strange bedfellows or a classic romance? Biochem Biophys Res Commun. 287(3): 589-593.

75. Mayol X., Garriga J., Grana X. 1995. Cell cycle-dependent phosphorylation of the retinoblastoma-related protein pi30. Oncogene. 11(4): 801-808.

76. Mayol X., Grana X., Baldi A., Sang N. Hu Q., Giordano A. 1993. Cloning of a new member of the retinoblastoma gene family (pRb2) which binds to the El A transforming domain. Oncogene. 8(9): 2561-2566.

77. McConnell B.B., Starborg M., Brookes S., Peters G. 1998. Inhibitors of cyclin-dependent kinases induce features of replicative senescence in early passage human diploid fibroblasts. Curr Biol. 8(6): 351-354.

78. McDade S.S., Patel D., McCance D.J. 2011. p63 maintains keratinocyte proliferative capacity through regulation of Skp2-pl30 levels. J Cell Sci. 124(Pt 10): 1635-1643.

79. McEachern M.J., Blackburn E.H. 1996. Cap-prevented recombination between terminal telomeric repeat arrays (telomere CPR) maintains telomeres in Kluyveromyces lactis lacking telomerase. Genes Dev. 10(14): 1822-1834.

80. Meirelles L.S., Nardi N.B. 2003. Murine marrow-derived mesenchymal stem cell: isolation, in vitro expansion, and characterization. Br J Haematol. 123(4): 702-711.

81. Miller J.R. 2001. The Wnts. Genome Biol. 3(1): 1342-1356.

82. Moberg K., Starz M.A., Lees J.A. 1996. E2F-4 switches from pl30 to pl07 and pRB in response to cell cycle reentry. Mol Cell Biol. 16(4): 1436-1449.

83. Morrison S.J., Kimble J. 2006. Asymmetric and symmetric stem-cell divisions in development and cancer. Nature. 441(7097): 1068-1074.

84. Mosimann C., Hausmann G., Basler K. 2009. Beta-catenin hits chromatin: regulation of Wnt target gene activation. Nat Rev Mol Cell Biol. 10(4): 276-286.

85. Mucenski M.L., Wert S.E., Nation J.M., Loudy D.E., Huelsken J., Birchmeier W., Whitsett J. 2003. P-catenin is required for specification of proximal/distal cell fate during lung morphogenesis. J Biol Chem. 278(4): 40231-40238.

86. Nelson W.J., Nusse R. 2004. Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin pathways. Science. 303(5663):1483-1487.

87. Nguyen H., Rendl M., Fuchs E. 2006. Tcf3 governs stem cell features and represses cell fate determination in skin. Cell. 127(1): 171-183.

88. Nielsen S.J., Schneider R., Bauer U.M., Bannister A.J., Morrison A., O'Carroll D., Firestein R., Cleary M., Jenuwein T., Herrera R.E., Kouzarides T. 2001. Rb targets histone H3 methylation and HP1 to promoters. Nature. 412(6846): 561-565.

89. Nusse R. 2003. Wnts and Hedgehogs: lipid-modified proteins and similarities in signaling mechanisms at the cell surface. Development. 130(22): 5297-5305.

90. Okubo T., HoganB.L. 2004. Hyperactive Wnt signaling changes the developmental potential of embryonic lung endoderm. J Biol. 3(3): 1186-1198.

91. Paggi M.G., Giordano A. 2001. Who is the boss in the retinoblastoma family? The point of view of Rb2/pl30, the little brother. Cancer Res. 61(12): 4651-4654.

92. Parker D.S., Ni Y.Y., Chang J.L., Li J., Cadigan K.M. 2008. Wingless signaling induces widespread chromatin remodeling of target loci. Mol Cell Biol. 28(5): 1815-1828.

93. Parrinello S., Samper E., Krtolica A., Goldstein J., Melov S., Campisi J. 2003. Oxygen sensitivity severely limits the replicative lifespan of murine fibroblasts. Nat Cell Biol. 5(8): 741-747.

94. Peister A., Mellad J.A., Wang M., Tucker H.A., Prockop D.J. 2004. Stable transfection of MSCs by electroporation. Gene Ther. 11(2): 224-228.

95. Peters S., MixE., Bauer P., Weinelt S., Schubert B. 2004. Wnt-5a expression in the rat neuronal progenitor cell line ST 14A. Exp Brain Res. 158(2): 189-195.

96. Petrov N.S., Popov B.V. 2012. The functional role of P-catenin in MSC malignancy during the long term culture. Submit for Cancer Res.

97. Phinney D.G. 2007. Biochemical heterogeneity of mesenchymal stem cell populations: clues to their therapeutic efficacy. Cell Cycle. 6(23): 2884-2889.

98. Pietersen A.M., van Lohuizen M. 2008. Stem cell regulation by polycomb repressors: postponing commitment. Curr Opin. Cell Biol. 20(2): 201-207.

99. Pittenger M.F., Mackay A.M., Beck S.C., Jaiswal R.K., Douglas R., Mosca J.D., Moorman M.A., Simonetti D.W., Craig S., Marshak D.R. 1999. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284(5411): 143-147.

100. Plesca D., Crosby M.E., Gupta D., Almasan A. 2007. E2F4 function in G2: maintaining G2-arrest to prevent mitotic entry with damaged DNA. Cell Cycle. 6(10): 1147-1152.

101. Pongracz J.E., Stockley R.A. 2006. Wnt signalling in lung development and diseases. RespirRes. 7: 1465-1484.

102. Popov B., Chang L.S., Serikov V. 2005. Cell cycle-related transformation of the E2F4-pl30 repressor complex. Biochem Biophys Res Commun. 336(3): 762-769.

103. Popov B.V., Serikov V.B., Petrov N.S., IzusovaT.V., Gupta N. MatthayM.A. 2007. Lung epithelial cells induce endodermal differentiation in mouse mesenchymal bone marrow stem cells by paracrine mechanism. Tissue Eng. 13(10): 2441-2450.

104. Prockop D.J., Gregory C.A., Spees J.L. 2003. One strategy for cell and gene therapy: Harnessing the power of adult stem cells to repair tissues. Proc Natl Acad Sci USA. 100(Suppl 1): 11917-11923.

105. Prockop D.J. 1997. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science. 276(5309): 71-74.

106. Ray K.P., Farrow S., Daly M., Talabot F., Searle N. 1997. Induction of the E-selectin promoter by interleukin 1 and tumour necrosis factor alpha, and inhibition by glucocorticoids. Biochem J. 328(Pt 2): 707-715.

107. Ren B., Cam H., Takahashi Y., Volkert T., Terragni J., Young R.A., Dynlacht B.D. 2002. E2F integrates cell cycle progression with DNA repair, replication, and G(2)/M checkpoints. Genes Dev. 16(2): 245-256.

108. Reya T., Duncan A.W., Ailles L., Domen J., Scherer D.C., Willert K., Hintz L., Nusse R., Weissman I.L. 2003. A role for Wnt signalling in self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 423(6938): 409-414.

109. Rocha-Sanchez S.M., Scheetz L.R., Contreras M., Weston M.D., Korte M., McGee J., Walsh E.J. 2011. Mature mice lacking Rbl2/pl30 gene have supernumerary inner ear hair cells and supporting cells. J Neurosci. 31(24): 8883-8893.

110. Romanov S.R., Kozakiewicz B.K., Hoist C.R., Stampfer M.R., Haupt L.M., Tlsty T.D. 2001. Normal human mammary epithelial cells spontaneously escape senescence and acquire genomic changes. Nature. 409(6820): 633-637.

111. Rubin S.M., Gall A.L., Zheng N., Pavletich N.P. 2005. Structure of the Rb C-terminal domain bound to E2F1-DP1: a mechanism for phosphorylation-induced E2F release. Cell. 123(6): 1093-1106.

112. RubioD., Garcia-Castro J., Martin M.C., de la Fuente R., Cigudosa J.C., Lloyd A.C., Bernad A. 2005. Spontaneous human adult stem cell transformation. Cancer Res. 65(8): 3035-3039.

113. Ruiz S., Segrelles C., Santos M., Lara M.F., Paramio J.M. 2004. Functional link between retinoblastoma family of proteins and the Wnt signaling pathway in mouse epidermis. Dev Dyn. 230(3): 410-418.

114. Sakanaka C., Leong P., Xu L., Harrison D.S., Williams L.T. 1999. Casein kinase Is in th Wnt pathway: regulation of P-catenin function. Proc Natl Acad Sci USA. 96(22): 1254812552.

115. Sakanaka C. 2002. Phosphorilation and regulation of P-catenin by casein kinase Is. J Biochem. 132(5): 697-703.

116. Sandoval R., Pilkiriton M., Colamonici O.R. 2009. Deletion of the pl07/pl30-binding domain of Mipl30/LIN-9 bypasses the requirement for CDK4 activity for the dissociation of Mipl30/LIN-9 from pl07/pl30-E2F4 complex. Exp Cell Res. 315(17): 2914-2920.

117. Schaffer B.E., Park K.S., Yiu G., Conklin J.F., Lin C., Burkhart D.L., Karnezis A.N., Sweet-Cordero E.A., Sage J. 2010. Loss of pl30 accelerates tumor development in a mouse model for human small-cell lung carcinoma. Cancer Res. 70(10): 3877-3883.

118. Schwarze F., Meraner J., Lechner M., Loidl A., Stasyk T., Laich A., Loidl P. 2010. Cell cycle-dependent acetylation of Rb2/pl30 in NIH3T3 cells. Oncogene. 29(42): 5755-5760.

119. Serrano M., LinA.W., McCurrach M.E., Beach D., Lowe S.W. 1997. Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and pl6INK4a. Cell. 88(5): 593-602.

120. Sharif J., EndohM., Koseki H. 2011. Epigenetic memory meets G2/M: to remember or to forget? Dev Cell. 20(1): 5-6.

121. Shu S.N, Wei L., Wang J.H, Zhan Y.T., Chen H.S., Wang Y. 2004. Hepatic differentiation capability of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells. World J Gastroenterol. 10(19): 2818-2822.

122. ShuW., Jiang Y.Q., Lu'M.M., Morrisey E.E. 2002. Wnt7b regulates mesenchymal proliferation and vascular development in the lung. Development. 129(20): 4831-4842.

123. Sierra J., Yoshida T., Joazeiro C.A., Jones K.A. 2006. The APC tumor suppressor counteracts beta-catenin activation and H3K4 methylation at Wnt target genes. Genes Dev. 20(5): 586-600.

124. Sineva G.S., Pospelov V.A. 2010. Inhibition of GSK3beta enhances both adhesive and signalling activities of beta-catenin in mouse embryonic stem cells. Biol Cell. 102(10):549-560.

125. Smith E.J., Leone G., DeGregori J., Jakoi L., Nevins J.R. 1996. The accumulation of an E2F-pl30 transcriptional repressor distinguishes a GO cell state from a G1 cell state. Mol Cell Biol. 16(12): 6965-6976.

126. Sprent J., Cho J.H., Boyman O., Surh C.D. 2008. T cell homeostasis. Immunol Cell Biol. 86(4): 312-319.

127. Staal F.J., Noort Mv.M., Strous G.J., Clevers H.C. 2002. Wnt signals are transmitted through N-terminally dephosphorylated beta-catenin. EMBO Rep. 3(1): 63-68.

128. Stambolic V. Ruel L., Woodgett J.R. 1996. Litium inhibits glicogn syntase kinase-3 activiti and mimics Winglss signaling in intact cells. Curr Biol. 6(12): 1664-1668.

129. Street C.N., Sipione S., Helms L., BinetteT., Rajotte R.V., Bleackley R.C., KorbuttG.S. 2004. Stem cell-based approaches to solving the problem of tissue supply for islet transplantation in type 1 diabetes. Int J Biochem Cell Biol. 36(4): 667-683.

130. Tedesco D., Lukas J., Reed S.I. 2002. The pRb-related protein pi30 is regulated by phosphorylation-dependent proteolysis via the protein-ubiquitin ligase SCF(Skp2). Genes Dev. 16(22): 2946-2957.

131. Tian Q., Jin H., Cui Y., Guo C., Lu X. 2005. Regulation of Wnt gene expression. Develop Growth Differ. 47(5): 273-281.

132. Till J., McCulloch E.A. 1961. Direct measurement of the radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells. Radial Res. 14: 1419-1430.

133. Todaro G.J., Green H. 1963. Quantitative studies of the growth of mouse embryo cells in culture and their development into established lines. J Cell Biol. 17 : 299-313.

134. Trimarchi J.M., Lees J.A. 2002. Sibling rivalry in the E2F family. Nat Rev Mol Cell Biol. 3(1): 11-20.

135. UedaM., Gemmill R.M., West J., WinnR., SugitaM., TanakaN., UekiM., DrabkinH.A. 2001. Mutations of the beta- and gamma-catenin genes are uncommon in human lung, breast, kidney, cervical and ovarian carcinomas. Br J Cancer. 85(1): 64-68.

136. Venable M.E., Lee J.Y., Smyth M.J., Bielawska A., Obeid L.M. 1995. Role of ceramide in cellular senescence. J Biol Chem. 270(51): 30701-30708.

137. Verfaillie C.M., Pera M.F., Landsdorp P.M. 2002. Stem cells: hype and reality. Hematology. 2002(1): 369-396.

138. Weidenfeld J., Shu W., Zhang L., Millar S.E., Morrisey E.E. 2002. The WNT7b promoter is regulated by TTF-1, GATA6, and Foxa2 in lung epithelium. J Biol Chem. 277(23): 2106121070.

139. WillertK., Brown J.D., Danenberg E., Duncan A.W., Weissman I.L., ReyaT., Yates J.R., NusseR. 2003. Wnt proteins are lipid-modified and can act as stem cell growth factors. Nature. 423(6938): 448-452.

140. Willert K., Jones K.A. 2006. Wnt signaling: is the party in the nucleus? Genes Dev. 20(11): 1394-1404.

141. Wilson A., Laurenti E., Trumpp A. 2009. Balancing dormant and self-renewing hematopoietic stem cells. Curr Opin Genet Dev. 19(5): 461-468.

142. Woodbury D., Schwarz E.J., Prockop D.J., Black I.B. 2000. Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons. J Neurosci Res. 61(4): 364-370.

143. Wu Z., Rosen E.D., Brun R., Hauser S., Adelmant G., Troy A.E., McKeon C., Darlington

144. G.J., Spiegelman B.M. 1999. Cross-regulation of C/EBP alpha and PPAR gamma controls the transcriptional pathway of adipogenesis and insulin sensitivity. Mol Cell. 3(2): 151-8.

145. Yamada M., Kubo H., Kobayashi S., Ishizawa K., Numasaki M., Ueda S., Suzuki T., Sasaki

146. H. 2004. Bone marrow-derived progenitor cells are impotent for lung repair after lipopolysaccharide-induced lung injury. J Immunol. 172(2): 1266-1272.

Информация о работе

Петров, Николай Сергеевич
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Взаимодействие p130 - белка семейства pRb, и β-катенина - передатчика сигналов Wnt, в ходе дифференцировки и трансформации мезенхимных стволовых клеток мыши - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы