Адгезионная и транскрипционная функции β-катенина в самообновлении эмбриональных стволовых клеток мыши

Синева, Галина Сергеевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Адгезионная и транскрипционная функции β-катенина в самообновлении эмбриональных стволовых клеток мыши
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Адгезионная и транскрипционная функции β-катенина в самообновлении эмбриональных стволовых клеток мыши"

На правах рукописи

СИНЕВА Галина Сергеевна

АДГЕЗИОННАЯ И ТРАНСКРИПЦИОННАЯ ФУНКЦИИ Р-КАТЕНИНА В САМООБНОВЛЕНИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК МЫШИ

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

~ 7 № 2С,2

Санкт-Петербург 2012

005045311

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ дифференцировки клеток Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии РАН,

Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Поспелов Валерий Анатольевич Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: Корнилова Елена Сергеевна

доктор биологических наук, профессор Институт цитологии РАН

Гордеева Ольга Федоровна

кандидат биологических наук Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Ведущая организация: Федеральное государственное

бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Защита состоится «22» июня 2012 года в 12 часов

на заседании диссертационного совета Д.002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4 Сайт института: Yvwvv.cvtspb.rssi.ru

Адрес электронной почты института: cellbio@mail.cvtspb.rssi.ru Факс института: (812) 297-35-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН Автореферат разослан «/у^» мая 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, •

кандидат биологических наук ^ Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) представляют собой объект активно развивающейся области клеточной биологии. ЭСК интересны тем, что, с одной стороны, обладают шнорипотснтностыо, т.е. способностью дифференцироваться в клеточные производные всех трех зародышевых листков; с другой стороны, они обладают свойством самообновления, т.е. активно пролпфериругот в недифференцированном состоянии п при этом сохраняют плюрипотентпость (Smith, 2001). Эти принципиальные особенности делают ЭСК привлекательной и доступной моделью для исследования молекулярных механизмов раннего эмбрионального развития, пролиферации, дифференцировки. Благодаря способности дифференцироваться н образовывать все типы клеток взрослого организма ЭСК человека являются перспективным инструментом для клеточной терапии. Способность ЭСК мыши включаться в бластоцнсту и формировать ткани химерного зародыша, в том числе половые клетки, используется для получения нокаутпых мышей и исследования функций генов in vivo. Получение индуцированных плюрппотентиых стволовых (иГ1С) клеток продемонстрировало, что возможен и обратный переход из дифференцированного состояния в плюрипотентное, иными словами, возможно рспрограммированис соматических клеток в плюрипотентные (Takahashi, Yamanaka, 2006). Изучение механизмов, регулирующих процессы самообновления, дифференцировки и репрограммирования, имеет важное фундаментальное значение. Кроме того, понимание этих механизмов необходимо в будущем для безопасного применения ЭСК и других плюрипотентных клеток в клинике.

Самообновление ЭСК обеспечивается координированной работой набора транскрипционных факторов и сигнальных путей, активность которых направлена на подавление дифференцировки и поддержание высокого пролиферативного потенциала клеток (Do, Scholer, 2009). Известно, что для самообновляющихся ЭСК мыши (мЭСК) необходима активация LIF/STAT3- и ВМР4/8тас1-сигнальных каскадов (Smith et al., 1988; Ying et al., 2003). Среди факторов, которые позитивно регулируют процессы самообновления ЭСК, получение новых линий ЭСК и репрограммирование соматических клеток мыши и человека, значительную роль играет активация Wnt-сигнального пути или ингибирование его негативного регулятора, кпназы GSK3 (Marson et al., 2008; Umehara et al., 2007; Wray et al., 2011). Центральным эффектором Wnt пути является белок ß-катенин, который в отсутствие сигнала от Wnt фосфорилирустся кпназон GSK3, что маркирует его для протеасомной деградации. Активация канонического Wnt каскада приводит к подавлению активности GSK3, стабилизации ß-катснина, его транспорту в ядро и активации совместно с факторами семейства ТсГтранскришши Wnt-зависимых генов. К Р-катенин/ТсГ-зависимым генам относятся некоторые ключевые регуляторы дифференцировки, гены, отвечающие за эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и регуляцию клеточного цикла (Klaus,

Birchmeier, 2008). Кроме того, ß-катенин выполняет в клетке важную адгезионную функцию, участвуя в формировании межклеточных контактов совместно с мембранными белками семейства кадгеринов и обеспечивая их связывание с актиновым цитоскелетом (Nelson, Nüsse, 2004).

Ингибиторы GSK3 способствуют становлению и поддержанию плюрипотентности, и их положительное влияние на самообновление в значительной степени опосредовано ß-катенином (Wray et al., 2011). Известно также, что инактивация GSK3 наиболее эффективно способствует поддержанию плюрипотентности в сочетании с применением ингибиторов MEK/ERK каскада, тогда как само по себе ипгибирование GSK3 не полностью препятствует запуску дифференцировки в мЭСК (Ying et al., 2008). Остается не вполне понятным, с какими именно функциями ß-катешша (или других мишеней GSK3) связан положительный эффект ингибиторов GSK3 в ЭСК и как модулируют его другие сигнальные пути, обслуживающие самообновление, в частности, MEK/ERK путь.

Таким образом, непосредственные эффекты инактивации GSK3 в контексте поддержания самообновления и плюрипотентности ЭСК не вполне изучены. Информация о механизмах воздействия ингибиторов этой киназы поможет глубже понять феномен плюрипотентности, а в перспективе — пользоваться этими знаниями для применения ЭСК и иПС клеток в трансплантологии.

Цели н задачи исследования

Целью данной работы было выяснить функциональный статус ß-катенина и его роль в самообновлении и ранней дифференцировке ЭСК мыши (мЭСК). Были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать уровень экспрессии ß-катенина, а также уровень ß-катешш-зависимой транскрипции генов-мишеней в недифференцированных и дифференцированных мЭСК;

2. Изучить изменения транскрипционной и адгезионной функций ß-катенина в норме и при обработке мЭСК ингибиторами GSK3;

3. Исследовать влияние ингибиторов GSK3 на пролиферацию, выживаемость и экспрессию маркеров недифференцированного состояния мЭСК;

4. Выяснить, в какой степени MEK/ERK-сигнальный путь модулирует уровень экспрессии ß-катенииа и его адгезионные и сигнальные функции в мЭСК.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Ипгибирование активности киназы GSK3 в недифференцированных мЭСК приводит к накоплению Е-кадгернн-связанного ß-катенина и усилению межклеточной адгезии.

2. В недифференцированных мЭСК трансактиваторная активность ß-катенина низка, но она заметно возрастает при действии ингибиторов GSK3. При этом не усиливается транскрипция генов-мишеней Wnt-сигналыюго пути, регулирующих клеточный цикл (циклин Dl, c'2ß, с-тус), и слабо активируется экспрессия генов-маркеров

эпителиально-мезенхимального перехода (snail и, в одной из клеточных линий -виментина).

Активность Р-катенин/ТсС-комплексов возрастает при дифференцировке мЭСК, что сопровождается значительным усилением экспрессии генов-мишеней Wnt, регулирующих ЭМП {snail, виментина) и мезодермальную дифференцировку (T/Brachyury); ингибиторы GSK3 ослабляют экспрессию этих генов при индукции дифференцировки в монослое.

Инактивация MEK/ERK-сигналыюго каскада модулирует действие ингибиторов GSK3 в мЭСК, дополнительно усиливая степень связывания Р-катенина с Е-кадгерином и подавляя экспрессию Р-катенин/ТсГ-зависимого регулятора мезодермальпой дифференцировки T/Brachyury.

Научная новизна работы

Впервые показано, что инактивация GSK3 в недифференцированных мЭСК приводит к накоплению как «адгезионного» (Е-кадгерин-связапного или способного к такому связыванию), так и «сигнального» (способного участвовать в транскрипции) пулов Р-катенина. Показано также, что усиление Р-катенин/ТсГ-зависимой транскрипции при ингибировании GSK3 в мЭСК на самом деле не приводит к активации транскрипции значительной части генов-мишеней Wnt-сигнального пути. Более того, экспрессия с-тус была подавлена в условиях инактивации GSK3, что опровергает предположение о том, что активация транскрипции этого фактора опосредует эффекты ингибиторов GSK3 в ЭСК. Впервые отмечено, что при инактивации GSK3 происходит подавление экспрессии другого фактора, связанного с регуляцией плюрипотентности - rest/nrsf (REl-silencing transcription factor/neuron-restrictive silencer factor).

Положительное влияние на самообновление сочетания ингибиторов GSK3 и MEK/ERK-сигналыюго каскада стало известно относительно недавно (Ying et al., 2008), и данных о том, как эти сигнальные пути дополняют друг друга, немного. В настоящей работе мы впервые показали, что ингибитор МЕК1/2 модулирует действие ингибиторов GSK3 на функции р-катенина в мЭСК, а именно, дополнительно усиливает его связывание с Е-кадгерином и снижает его транскрипционную активность по отношению к маркеру дифференцировки T/Brachyury.

Личный вклад автора

Все экспериментальные процедуры, описанные в работе, были проведены автором лично. Анализ подготовленных автором проб на проточном цитофлуориметре осуществлял Н.Д. Аксенов. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научным руководителем.

Научно-практическое значение работы

Проведенное исследование вносит вклад в понимание функций Р-катенина в мЭСК и баланса сигнальных путей при самообновлении этих клеток. На полученные данные можно опираться при дальнейшем исследовании механизмов поддержания

плюрипотентности и интеграции сигнальных путей с транскрипционным аппаратом мЭСК. Полученные результаты могут использоваться в материалах курсов по внутриклеточной сигнализации.

Апробация работы

Данные, представленные в настоящей работе, опубликованы в 1 статье в международном журнале Biology of the Cell. Основные положения доложены и обсуждены на 6 международных и Российских конференциях: школе-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 2008 г.), международной конференции 6th ISSCR (International Society for Stem Cell Research) Annual Meeting 2008 (Филадельфия, США, 2008 г.), VII Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток" (Звенигород, 2009 г.), международной конференции "Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine" (Санкт-Петербург, 2009 г.), II Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010 г.), международной конференции «EMBO Meeting 2010» (Барселона, Испания, 2010 г.).

Объем и структура диссертации Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 147 названий. Материалы диссертации изложены на 106 страницах машинописного текста, она содержит 3 схемы и 22 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Культивирование клеток. Работу проводили на двух линиях мЭСК, IOUD2 и E14TV2, любезно предоставленных P. Savatier (Лион, Франция) и A. Smith (Кембридж, Великобритания). Клетки культивировали при 37 °С в 5 % С02 на пластиковых чашках Петри (Corning), покрытых 0.2 %-ным раствором желатина (Sigma), в среде DMEM/F12 (Биолот) с 0.1 мМ 2-меркаптоэтанола, 0.1 мМ заменимых аминокислот и 1 мМ пирувата (Gibco), содержащей, соответственно для IOUD2 и E14TV2: 10 или 15% сыворотки (Hyclone), 50 ед/мл фактора LIF (Sigma) или эквивалент 1000 ед/мл очищенного рекомбинантного LIF, экспрессированного с конструкции pGEX-2T-hLIF (конструкция любезно предоставлена А.Н. Томилиным, Институт цитологии РАН). Для инактивации GSK3 использовали ингибиторы ВЮ-Acetoxime (GSK-3 Inhibitor X, Calbiochem) или CHIR99021 (Axon), для инактивации МЕК1/2 - ингибитор PD0325901 (Axon). Дифференцировку клеток IOUD2 проводили в течение 6 сут, рассевали клетки в среде без LIF, в плотности 2000 клеток/см2. Со второго по пятый день включительно добавляли в среду ретиноевую кислоту в концентрации 1 мкМ (All-trans retinoic acid, Sigma). Общий вид клеточных колоний исследовали под световым микроскопом (Zeiss Axiovert) в фазовом контрасте.

МТТ-тест и кривые роста. Оценку жизнеспособности клеток для построения кривых роста производили колориметрическим методом с использованием метилтиазолилдифенил-тетразолиум бромида (МТТ) (Sigma). Клетки инкубировали в

растворе МТТ (0.5 мг/мл в PBS) 1 ч при 37 °С в атмосфере 5 % С02. Образовавшийся осадок формазана растворяли в ДМСО (Sigma). Оптическую плотность измеряли при длине волны 570 нм против раствора МТТ с ДМСО на спектрофотометре Multiskan EX (Thermo Electron).

Временная трансфекция и анализ люциферазной активности. Плазмиды TopFlash или FopFlash котрансфецировали в мЭСК с плазмидой, кодирующей ген люциферазы Renilla. Временную трансфекцию проводили с помощью липофектамина 2000 (Invitrogen), в среде OPTIMEM (Invitrogen). Спустя 48 ч последовательно определяли активность люциферазы Firefly (экспрессирующейся с TopFlash и FopFlash) и Renilla в клеточных экстрактах с помощью набора для двойного люциферазного анализа (Е1910, Promega), на люминометре TD-20 (Turner Design). Активность Firefly нормализовали относительно активности Renilla. Среднее и его стандартную ошибку подсчитывали для двух независимых повторений.

Проточная цитофлуориметрия на содержание ДНК. Клетки промывали и снимали с чашек раствором Версена (Биолот), содержащим 0.03 % эмбриональной сыворотки, пермеабилизовали в 0.01 %-ном растворе сапонина (Sigma) 30 мин при комнатной температуре, затем добавляли РНКазу А (100 мкг/мл) и иодид пропидия (40 мкг/мл), и инкубировали 15 мин при 37 °С. Пробы анализировали на проточном цитофлуориметре АТС300 (Brucker). Полученные результаты обрабатывали с помощью программы Modfit.

Анализ активности каспаз in vitro. Клетки лизировали в буфере, содержащем 50 мМ HEPES (ICN) рН7.4, 0.1% CHAPS (Sigma), 0.5% IGEPAL-100 (ICN), 5 мМ DTT (Sigma), 30 мин при 4 °C. В реакционную смесь (40 мМ HEPES pH 7.4, 0.1 % CHAPS, 1 мМ DTT и 40 мкМ флуорогенного субстрата AcDEVD-AMC, Sigma) добавляли 40 мкг белка из лизатов, инкубировали 1 ч при 37 °С. Для подтверждения специфической активации каспаз применялся ингибитор каспаз ZVAD (50 мкМ, Biomol). Флуоресценцию измеряли на флуориметре (Туроверов и др., 1998) в лаборатории структурной динамики, стабильности и фолдинга белков Института цитологии РАН. Подсчет среднего и его стандартной ошибки производили по трем независимым повторениям.

Иммунофлуоресценция. Клетки фиксировали в 4%-ном параформальдегиде на PB S 10 мин, обрабатывали 0.5 %-ным раствором Triton-X-100 в PBS 25 мин, инкубировали с 5 %-ным раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS 1 ч. Далее окрашивали препараты антителами к Е-кадгерину (#4065, Cell SignalingTechnology) или(и) ß-катенину (sc-7963, Santa Cruz Biotechnology). В качестве вторых антител использовали Fab-фрагменты козьих антител к иммуноглобулинам мыши или кролика, конъюгированные с флуорохромами Alexa Fluor®-488 и Alexa Fluor®-568 (Invitrogen). Окраску ядер производили DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindoIe) или Topro-3 (Invitrogen). Препараты исследовали на конфокальных микроскопах Leica TCS SL и Leica TCS SP5.

Экстракция тотального белка в денатурирующих условиях н Вестерн блоттипг. Для экстракции тотального белка использовали буфер на основе PBS,

содержащий 1 % NP-40, 0.5 % дезоксихолата натрия, 0.1 % SDS и ингибиторы протеаз (CompIeteTM protease inhibitor cocktail, Roche) и фосфатаз (1 мМ ортованадата натрия, 5 мМ EGT А, 10 мМ NaF). Количество белка в пробах измеряли по методу Брэдфорд. С 25-40 мкг белка проводили форез в ПААГ в денатурирующих условиях, переносили белки на нитроцеллюлозную мембрану (Amersham) и окрашивали антителами к ß-катенину, Е-кадгерину (см. раздел Иммунофлуоресценция), фосфотирозину (9411, Cell Signaling Technology), Oct3/4 (sc-5279, Santa Cruz Biotechnology) или GAPDH (глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, Abeam), следуя протоколам производителя. В качестве вторых антител использовали козьи антитела против иммуноглобулинов кролика и мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена (Pierce), и визуализировали бэнды методом усиленной хемилюминесценции (ECL, Amersham). Для ре-блоттинга мембрану инкубировали в буфере, содержащем 62.5 мМ Tris/HCl, pH 6.8, 2 % SDS и 100 мМ 2-меркаптоэтанола (Sigma), 30 мин при 56 'С.

Экстракция белка для иммунопреципитации и осаждения GST-E-кадгерином. Экстракцию белков для иммунопреципитации проводили в буфере, содержащем 10 мМ Tris/HCl (pH 7.4), 150 мМ NaCl, 0.5 % Igepal, 1 % Triton X-100, 50 мМ NaF и ингибиторы протеаз и фосфатаз, 30 мин при 4 °С. Лизаты для осаждения (pull-down) GST-E-кадгерином готовили, используя 50 мМ Tris-HCl (pH 7.4), содержащий 1 % NP-40, 150 мМ NaCl и ингибиторы протеаз и фосфатаз, в течение 20 мин при 4 °С. Иммунопреципитацию проводили с 400-600 мкг белка/мкг антител к ß-катенину или Е-кадгерину, 18 ч при 4° С. Для осаждения GST-E-кадгерином 600 мкг белка из каждой пробы инкубировали 1.5 ч при комнатной температуре с цитоплазматическим доменом Е-кадгерина человека, слитым с GST (глутатион-S-трансферазой) и осажденным на глутатион-сефарозе (любезно предоставлен Г.Ф. Решетниковой, Институт цитологии РАН). После осаждения сефарозных шариков центрифугированием надосадок собирали и проводили из него иммунопреципитацию антителами против ß-катенина. Образовавшиеся комплексы осаждали на шариках протеин А-сефарозы и анализировали электрофорезом в ПААГ с последующим иммуноблоттингом.

Экстракция РНК и ОТ-ПЦР. Тотальную РНК выделяли в TRIzol® (Invitrogen) согласно протоколу производителя. Обратную транскрипцию проводили, используя ревертазу MMLV (Moloney-murine leukaemia virus), следуя инструкциям производителя (Fermentas), со случайными гексапраймерами (Promega), в реакцию брали 2 мкг РНК.

Количественная ОТ-ПЦР проводилась с помощью набора для ПЦР в реальном времени с красителем SYBR Green и референспым красителем ROX (Синтол), на приборе 7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) в лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН. Параметры реакции задавали в соответствии с рекомендациями Синтол. Были подобраны и использованы следующие праймеры: N-кадгерин-Р, ААСС ill CCCTG AG АТАС AGC; N-кадгерин-R, CCATTGATGTCCACTGCATG; Е-кадгерин-F, GGAGGAGAACGGTGGTCAAA; Е-кадгерин-R, GCCACATCATTTCGAGTCAC; snail-F, ACCCACACTGGTGAGAAGCC;

snail-R, TTGTGGAGCAAGGACATGCG; виментин-F,

TCAGCTCACCAACGACAAGGC; виментин-R, AGGGTGCTTTCGGCTTCCTCTC; axin2-F, CAGTCAGCAGAGGGACAG; axin2-R, AAGTAGGTGACAACCAGCTC; oct-3/4-F, CAAGTTGGCGTGGAGACT; oct-3/4-R, TTCATGTCCTGGGACTCCTC; nanog-F, GATGCAAGAACTCTCCTCCA; nanog-R, CAATGGATGCTGGGATACTC; c-myc-F, TTCTCTCCTTCCTCGGACTC; c-myc-R, GTTTGCCTCTTCTCCACAG; циклин Dl-F, TGCACAGACCTTTGTGGC; циклин Dl-R, TCTGGAAAGAAAGTGCGTTG; e2fl-F, ATCTGACCACCAAACGCTTC; e2fl-R, GCTGCCTAGCCACTGGATATG; gapdh-F, TGTGTCCGTCGTGGATCTGA; gapdh-R, TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG. Уровень экспрессии генов нормализовали относительно gapdh. Для каждой экспериментальной точки проводили 3 технических повторения, для которых рассчитывали стандартную ошибку среднего. Результаты повторяли в независимых экспериментах с использованием обычной ПЦР.

Для обычной ПЦР использовали Taq-полимерэзу (Fermentas), следовали предлагаемому производителем протоколу. Концентрация MgCl2 в реакционном буфере составляла 1.2 мМ, температура отжига 58 °С. Использовали следующие праймеры: tcO-F, CATCACATGCACCCGCTGAC; tcB-R,

GGGTAAGGATGCCGGAAACC; tcf4-F, TGTTCTCCGGAACCACGCAG; tcf4-R, TCTCATCGCCCTCGTCATCG; bcl9-2-F, CCCAGCACCAGAATGTGAACC; bcl9-2-R, CAATGGGCTTGTCGTCCTCC; T/Brachyury-F, TGACCAAGAACGGCAGGAGG; T/Brachyury-R, TGGGTCTCGGGAAAGCAGTG; rest/nrsf-F,

ACGTACACGACGGTCAGCGAGT; rest/nrsf-R, ACGGGCGTTCTCCTGTGTGAGTT. Праймеры для остальных генов использовались те же, что для количественной ПЦР.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Общая характеристика активности р-катенииа и экспрессия его коактиваторов в недифференцированных мЭСК и при дифференцировке.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что для недифференцированных мЭСК характерна примембранная локализация Р-катенина и отсутствие его в ядрах клеток (Чуйкин и др., 2006). В соответствии с этим наблюдением, в мЭСК двух исследованных нами линий, Ю1ГО2 и Е14ТУ2, р-катснин обнаруживается преимущественно при мембранах клеток, где он ко-локализуется с Е-кадгерином; при этом он практически отсутствует в ядре и слабо выявляется в цитоплазме (Рис. 1).

Рис. 1. р-катенмн ко-локализуется с Е-кадгерином при мембране и отсутствует в ядрах недифференцированных мЭСК.

Иммунофлуоресцентное окрашивание мЭСК линии Е14ТУ2 на р-катенин (зеленый), Е-кадгерин (красный) и ДНК (ОАР1, синий). Масштабная линейка - 20 мкм.

ti -3-; >v * ъ Й

Р-катенин Е-кадгерин совмещение +DAPI

Перераспределение р-катенина в клетке и его появление в ядре происходило при дифференцировке, индуцированной ретиноевой кислотой (РК) в монослое клеток (Рис. 7В). В соответствии с этими данными, в недифференцированных мЭСК наблюдался низкий уровень экспрессии ядерных партнеров р-катенина, факторов Гс/З и гс/4 и Ьс19-2, по сравнению с дифференцированными клетками (Рис. 2Б). Р-катенин образует комплексы с факторами семейства ТсР/ЬеГ на промоторах \\'п1-регулируемых генов, отменяя опосредованную ими репрессию транскрипции. Продукт гена Ъс19-2 работает как ко-активатор р-катенина и способен также усиливать импорт Р-катенина в ядро (ВгетЬеск й а1., 2004). Кроме того, при индуцированной РК дифференцировке увеличивается общее содержание Р-катенина в клетке на уровне как белка, так и мРНК (Рис. 2А и Б).

Чтобы оценить транскрипционную активность р-катенина в недифференцированных мЭСК, мы использовали репортерную конструкцию, несущую ген люциферазы под контролем ТсГ-связывающих элементов (ТорБ^вИ). Негативным контролем служила аналогичная плазмида с мутированными (нефункциональными) сайтами связывания Тс£ (БорБ1аз11). Данные анализа активности люциферазы в клеточных лизатах после временной трансфекции в мЭСК вышеописанных конструкций свидетельствуют о том, что в недифференцированных мЭСК р-катенин/Тс!-зависимая транскрипция низка, но она возрастает при дифференцировке (рис. 2В).

Таким образом, в недифференцированных мЭСК экспрессия регулирующих Р-катенин факторов не благоприятствует его ядерной локализации и сигнальной функции, а при дифференцировке происходят изменения, облегчающие транспорт р-катенина в ядро и активацию транскрипции.

контроль РК

Рис. 2. Транскрипционная активность р-катенина и экспрессия его ядерных партнеров низка в недифференцированных мЭСК и повышается при дифференцировке.

А - Вестерн-блот лизатов клеток линии Ю1ГО2, окраска на р-катенин. Б - ОТ-ПЦР на указанные гены - ко-активаторы р-катенина, gapdh — контроль нагрузки. В - Результаты анализа люциферазной активности после временной трансфекции в мЭСК линии Ю1ГО2 репортерной р-катенин/Тс1-1л1с конструкции ТорР1авЬ или ее нефункционального аналога РорР1айЬ. Указаны стандартные ошибки среднего.

2. Уровень экспрессии, локализация и транскрипционная активность Р-катенина при инактивации ввКЗ в недифференцированных мЭСК.

Итак, в недифференцированных мЭСК, культивируемых в присутствии сыворотки и фактора ЫР, транскрипционная активность Р-катенина незначительна. Известно, что для выполнения адгезионной функции на ранних этапах развития и в мЭСК его может заменять плакоглобин (ЬуаБИепко е1 а1., 2011). Строго говоря, Р-катенин не является абсолютно необходимым для поддержания самообновления и плюрипотентности, однако инактивация его негативного регулятора, киназы 08КЗ, имеет выраженное положительное действие на самообновление. 08КЗ имеет множество других мишеней, но эти эффекты по крайней мере частично опосредованы Р-катенином, так как не проявляются в полной мере в клетках, лишенных Р-катенина (\Vray е1 а1., 2011). Мы пытались выяснить, какие изменения функциональной активности Р-катенина происходят при инактивации ОБКЗ и могут быть важны для самообновления мЭСК.

Для того, чтобы инактивировать С8КЗ, мы использовали ингибиторы ВЮ-Асеи>х1те и СНШ.99021. Эти ингибиторы блокируют АТФ-связывающие карманы обеих взаимозаменяющих друг друга изоформ киназы 08КЗ (а и Р), подавляя их киназную активность, но СНЖ99021 (далее СНШ.) отличается от ВЮ-АсеЬхте (далее ВЮ) большей специфичностью действия.

Обработка мЭСК линии ЮиБ2 ВЮ в концентрации 2.5 мкМ повышала белковый уровень Р-катенина до 3.6 раз. При обработке СНГО. этот эффект также наблюдался, но был выражен слабее (Рис. ЗА).

А Б

^ ^ ■ ТорНавЬ ■ РорПавЬ

| х 12 -.........................................................................—

сГ сГ 11 ю I

® X 8 Щ

Р-катенин | 3" б Р

^ 1| I ** Р. 1х В

Рис. 3. При инактивации С8КЗ в мЭСК р-катенин накапливается, и возрастает Р-катенин/ТсГ-зависиман транскрипция. А - Вестерн-блот клеточных лизатов, окраска на Р-катенин. Приведены относительные значения содержания Р-катенина в лизатах, нормализованные относительно содержания ОАРЕ)Н, Б - результаты анализа люциферазной активности после временной трансфекции в мЭСК репортеров ТорЫаяЬ или РорИаэЬ. Указаны стандартные ошибки среднего по двум повторениям. Обработка мЭСК линии Ю1Ю2 ингибиторами в указанных концентрациях производилась в течение 2 сут.

При этом примембранная локализация Р-катенина и Е-кадгерина сохранялась, но происходило частичное перераспределение Р-катенина в цитоплазму и ядро клетки, как видно на Рис. 4.

А Б

к- ; ■ ' .. " С (УСУ 'С контроль

' 1 'Л- ш шМ * «Г' • ^Щ^В1 — ВЮ 2.5 мкМ

1 • ' * <л ^ -■А ! '. ■>;_ " -

1111 ¡Я! 1 Р-катенин СНИЧ 5 мкМ

Р-катенин совмещение * иАН

Рис. 4. р-катенин частично перераспределяется в ядро при действии ингибиторов ввКЗ в мЭСК. Иммунофлуоресцентное окрашивание мЭСК линии ЮТЛ>2 на р-катенин (зеленый), Е-кадгерин (красный) и ДНК (ОАР1, синий). Обработка мЭСК ингибиторами в указанных концентрациях проводилась в течение 2 сут. Масштабная линейка - 15 мкм (А) и 10 мкм (Б).

Мы оценили, сопровождается ли ядерная транслокация р-катенина активацией Р-катенин/ТсГ-зависимой транскрипции, с помощью временной трансфекции в клетки конструкции ТорР1азЬ. При обработке мЭСК обеих линий ингибиторами 08КЗ Р-катенин/Тс1-зависимая транскрипция возрастает (Рис. ЗБ). Как и при анализе накопления Р-катенина, активация репортера ТорРквЬ при действии СНШ. была ниже, чем при действии ВЮ.

Таким образом, инактивация ОБКЗ в недифференцированных мЭСК, с одной стороны, приводит к ядерной локализации Р-катенина и усилению зависимой от него транскрипции, с другой стороны - к сохранению примембранной ко-локализации Р-катенина и Е-кадгерина. Транскрипционная и адгезионная активности р-катенина обычно носят антагонистический характер, поэтому мы более детально исследовали каждую из этих активностей, чтобы понять, какая из них имеет большее функциональное значение при инактивации ОБКЗ в мЭСК.

3. Влияние инактивации GSK3 на р-катенин-зависимую адгезию в недифференцированных мЭСК.

Чтобы определить функциональный статус накапливающегося при действии ВЮ Р-катенина и оценить его способность связывать Е-кадгерин, мы провели осаждение (pull-down) Р-катенина из клеточных лизатов, полученных в неденатурирующих условиях, цитоплазматическим доменом Е-кадгерина, слитого с GST (глутатион-S-трансферазой, далее - GST-E-кадгерин) и предварительно инкубированного с глутатион-сефарозой. Результат Вестерн блотгинга комплексов, осажденных таким образом на глутатион-сефарозу, представлен на Рис. 5Б_1. Супернатант после осаждения комплексов также собирали и проводили из него иммунопреципитацию антителами против Р-катенина, чтобы выявить не связавшийся с GST-E-кадгерином Р-катенин. Результаты Вестерн блотгинга этого пула Р-катенина представлены на Рис. 5Б_2. Также проводилась прямая иммунопреципитация Р-катенина из тотальных лизатов мЭСК (Рис. 5Б_3). Видно, что при действии ВЮ накапливаются оба пула Р-катенина, которые мы условно назвали «адгезионным» (способный связываться с Е-кадгерином, 1) и «сигнальным» (не способный к такому связыванию, 2). Мы также исследовали степень тирозинового фосфорилирования Р-катенина в обоих пулах, так как известно, что взаимодействие Е-кадгерина с р-катенином регулируется фосфорилированием последнего по нескольким тирозиновым остаткам (Lilien, Balsamo, 2005). Эта модификация препятствует связыванию Р-катенина с компонентами адгезионного комплекса, но благоприятствует его транспорту в ядро. В соответствии с этим, в «адгезионном» пуле Р-катенина фосфорилирование по тирозину не выявлялось, но фосфо-Р-катенин присутствовал в «сигнальном» пуле.

анти-фосфо-тирозин р-катенин

анти-(3-катенин

• 2 » • > ►

1 2 3

Рис. 5. При действии ВЮ в мЭСК накапливаются «адгезионный» и «сигнальный» пулы Р-катенина. Результаты осаждения (pull-down) GST-E-кадгерином из клеточных лизатов после обработки мЭСК линии IOUD2 ВЮ в течение 2 суток. А - Вестерн-блот, окраска на фосфо-тирозин; Б - реблот после А, окраска на Р-катенин. 1 - осажденные на глутатион-сефарозу комплексы после инкубации лизата с GST-E-кадгерином, 2 - иммунопреципитация из надосадка (после осаждения на глутатион-сефарозу) антителами против Р-катенина;

3 - иммунопреципитация тотального лизата антителами против Р-катенина.

Степень фосфорилирования ß-катенина по тирозину при действии BIO увеличивалась пропорционально накоплению этого белка в клетке (Рис. 5).

Таким образом, при действии BIO в мЭСК накапливается, с одной стороны, свободный не фосфорилированный по тирозину ß-катенин, способный связывать цитоплазматический домен Е-кадгерина, с другой стороны — фосфорилированный по тирозину ß-катенин, не способный к такому связыванию, но, по-видимому, имеющий ядерную локализацию и участвующий в активации транскрипции (см. рис. 4 и ЗБ). «Адгезионный» пул, очевидно, вносит вклад в усиление межклеточной адгезии. Чтобы оценить реальную степень вовлечения ß-катенина в Е-кадгерин-содержащие комплексы, мы провели иммунопреципитацию лизатов клеток линии IOUD2 антителами против ß-катенина и показали, что инактивация GSK3 обоими ингибиторами приводит к повышенному связыванию ß-катенина с Е-кадгерином. На рис. 6А представлены результаты Вестерн блоттинга таких преципитатов, окрашенные на Е-кадгерин. Реципрокные иммунопреципитация и Вестерн блоттинг подтвердили этот результат (Рис. 6Б). Важно отметить, что общее содержание Е-кадгерина существенно не изменялось под действием ингибиторов (Рис. 6В).

Известно, что ß-катенин выполняет регуляторную функцию в сборке Е-кадгерин-опосредованных контактов, и связывание его с Е-кадгерином может

ИП: ß-катенин

% °р % \ 4J4,

Е-кадгерин

ИП: Е-кадгерин

ß-катенин

мв* Е-кадгерин 1 1 0.7 0.9

GAPDH

ЧЛо % %

% Чэ % %

ч %%

контроль

BIO 2.5 мкМ

CHIR2.5 мкМ

CHIR 5 мкМ

i ''t '-llf ЙР1

к. J - Ж

Рис. 6. Инактивация СйКЗ сопровождается повышенным связыванием р-катенина с Е-кадгерином и усилением межклеточной адгезии. А, Б — Вестерн блот клеточных лизатов после иммунопреципитации антителами к Р-катенину (А) или Е-кадгерину (Б). В — Вестерн блот тотальных лизатов, окраска на Е-кадгерин и ОАРОН. Приведены относительные значения содержания Е-кадгерина, нормализованные относительно уровня САРРН. Г - Общий вид колоний мЭСК, фазовый контраст. Обработка мЭСК линии Ю1ДО2 ингибиторами в указа концентрациях проводилась в течение 2 суг.

защищать последний от деградации и способствовать его транспорту к мембране клетки (Chen et al., 1999; Daugherty, Gottardi, 2007). Вероятно, усиление связывания ß-катенина и Е-кадгерина отвечает за характерное изменение фенотипа колоний мЭСК после обработки ингибиторами GSK3. В присутствии LIF и сыворотки мЭСК обеих линий растут довольно компактными группами округлой или неправильной формы, с клетками, «разбегающимися» от более плотного центра колонии (Рис. 6Г, контроль). При действии ингибиторов GSK3 колонии становились компактными и многослойными и приобретали более цельную и правильную форму и гладкие края (Рис. 6Г). Таким образом, можно заключить, что функциональное значение возрастания адгезионной активности ß-катенина при инактивации GSK3 заключается в усилении адгезии клеток внутри колоний недифференцированных мЭСК.

4. Регуляция маркеров ЭМП при инактивации GS КЗ в недифференцированных мЭСК и при дифференцировке.

Транскрипционная и. адгезионная активности ß-катенина зачастую носят разнонаправленный характер. В частности, некоторые гены-мишени Wnt-сигнального пути являются положительными регуляторами (Snail) или маркерами (виментин) эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), в то время как сохранение Е-кадгерин-связанного ß-катенина препятствует ЭМП (Gilles et al., 2003). Чтобы оценить, приводит ли повышенная ß-KaTeHHH/Tcf-зависимая транскрипция в мЭСК к запуску генов-регуляторов ЭМП, мы исследовали уровень мРНК некоторых из них с помощью ОТ-ПЦР в реальном времени. В качестве положительного контроля использовались мЭСК, индуцированные к дифференцировке ретиноевой кислотой в монослое клеток, поскольку было показано, что такая дифференцировка сопровождается запуском ЭМП (Чуйкин, 2006). Мы также исследовали, как присутствие BIO влияет на запуск ЭМП при индукции дифференцировки. В опыт были включены следующие точки: контрольные недифференцированные мЭСК линии IOUD2 («контроль»), мЭСК, культивировавшиеся в присутствии BIO 5 сут («BIO»), дифференцированные клетки («PK», см. Материалы и методы) и клетки, дифференцированные в присутствии BIO («РК+ВЮ»). Экспрессия snail и виментина, а также другого (Wnt-независимого) положительного регулятора ЭМП, N-кадгерина, существенно повышалась при дифференцировке (примерно в 5, 15 и 55 раз соответственно) (Рис. 7А, ср. «контроль» и «PK»), В недифференцированных клетках, обработанных BIO, уровень мРНК snail и N-кадгерина также повышался, хотя не так сильно, как при дифференцировке (в 2 и 5 раз соответственно). Напротив, уровень мРНК виментина снижался, а Е-кадгерина повышался в этих условиях (Рис. 7А, ср. «контроль» и «BIO»). Таким образом, не все гены-мишени Wnt, отвечающие за запуск ЭМП, активируются в ответ на BIO-зависимые накопление и повышенную транскрипционную активность ß-катенина в недифференцированных мЭСК. Кроме того, фенотип клеточных колоний свидетельствует о том, что ЭМП не происходит в большинстве клеток, несмотря на запуск экспрессии snail и N-кадгерина.

Более того, мы обнаружили, что обработка дифференцирующихся мЭСК линии IOUD2 ингибитором BIO в определенной степени ослабляет запуск экспрессии

положительных регуляторов ЭМП и усиливает экспрессию Е-кадгерина (Рис. 7 А, ср. PK» и «РК+ВЮ»). В соответствии с этим, в мЭСК, дифференцирующихся в присутствии BIO, значительная часть ß-катенина сохранялась в области протяженных межклеточных контактов, в то время как дифференцировка в обычных условиях приводила к существенной потере ß-катенина из примембранных участков клеток и его уходу в цитоплазму и ядро, а также к утрате клетками тесных контактов друг с другом (Рис. 7В). В клетках E14TV2, культивируемых 6 сут в отсутствие LIF, обработка ингибитором GSK3 также приводила к снижению экспрессии вимептипа и snail по сравнению с контролем (Рис. 12В, ср. «контроль» и «CHIR») и сохранению компактной морфологии колоний мЭСК. «Мезенхимальный» фенотип можно было наблюдать только у небольшой части клеток в популяции после обработки BIO, как в клетках линии E14TV2 и IOUD2, так и в ЭСК человека, и они характеризовались более выраженной ядерной локализацией ß-катенина. Возможно, именно эти популяции обуславливают усиление экспрессии snail, N-кадгерина и виментина. В целом, эти данные позволяют предполагать, что при инактивации GSK3 в мЭСК в большинстве клеток адгезионная функция ß-катенина преобладает над транскрипционной, по крайней мере, в случае маркеров ЭМП.

Следует отметить, что ядерная локализация ß-катенина также усиливалась при индуцированной PK дифференцировке мЭСК, и особенно при дифференцировке в присутствии BIO (Рис. 7В, «РК+ВЮ»), что сопровождалось активацией ß-катенин/ТсГ-зависимой транскрипции на репортере TopFlash (Рис. 7Б). Таким образом, снижение экспрессии маркеров ЭМП при инактивации GSK3 обусловлено не подавлением ß-KaTeHHH/Tcf-зависимой транскрипции в целом, а какими-то дополнительными факторами. Это также не было связано с подавлением дифференцировки, так как уровень мРНК nanog и oct3/4 снижался еще значительнее при действии BIO (Рис. 7А, «РК+ВЮ»).

5. Влияние ингибиторов GS КЗ на выживаемость, пролиферацию и экспрессию регуляторов клеточного цикла в мЭСК.

Мы обратили внимание, что BIO снижает скорость прироста клеточной популяции (Рис. 8А). Этот эффект мог быть вызван усилением гибели клеток, задержкой или остановкой клеток в клеточном цикле. Мы оценили уровень апоптотической гибели с помощью анализа активности каспазы 3 в клеточных лизатах. Как видно на рис. 8Б, BIO не усиливал активность каспазы в течение первых 18 ч обработки даже в концентрации 5 мкМ. Положительным контролем в данном случае служили мЭСК, обработанные ингибитором PI3 киназы LY294002, который вызывает апоптоз в этих клетках. Данные проточной цитофлуориметрии показали, что обработка BIO приводит к накоплению мЭСК в Gl фазе клеточного цикла и соответствующему снижению доли клеток, находящихся в фазе синтеза ДНК (Рис. 8В). Однако влияние на клеточный цикл не удалось воспроизвести с использованием более специфичного ингибитора GSK3: CHIR вызывал стабильное, но очень слабое накопление клеток в Gl фазе (Рис. 8В). Эти различия, возможно, объясняются тем, что BIO в высоких концентрациях частично ингибирует циклин-зависимые киназы.

oct3/4

nanog

II,

■ TopFlash □ FopFlash

BIO+PK

Е-кадзерин

.il II

N-кадаерин

вииентин

Ы Ii

snail

Рис. 7. Инактивация GSK3 модулирует экспрессию генов-маркеров ЭМП в недифференцированных мЭСК и при запуске дифференцировки. А - Относительная экспрессия мРНК в контрольных (контроль) и дифференцированных (PK) мЭСК IOUD2 и в мЭСК, обработанных BIO в концентрации 2.5 мкМ (BIO). Результаты получены с помощью количественной ОТ-ПЦР, значения нормализованы относительно экспрессии gapdh. Указаны ошибки среднего по трем техническим повторениям. Б - Результаты анализа люциферазной активности после временной трансфекции в клетки репортеров TopFlash или FopFlash. В - Иммунофлуоресцентное окрашивание мЭСК на ß-катенин (зеленый) и ДНК (ТоРгоЗ, синий псевдоцвет). Масштабная линейка - 8 мкм.

Показано, что ингибиторы GSK3 могут подавлять экспрессию некоторых регуляторов клеточного цикла, таких, как циклин А, циклин Е, cdc25c, e2fl (Sun et al., 2007). С другой стороны, ß-катенин регулирует Tcf-зависимую транскрипцию e2fl, циклина D1 и с-ту с (Abramova et al., 2010). Мы проверили, как изменяется уровень мРНК этих факторов при инактивации GSK3 в мЭСК. Оказалось, что BIO не вызывает существенных изменений в экспрессии циклина D1 и e2fl. Однако и BIO, и, в меньшей степени, CHIR снижали содержание мРНК с-тус (Рис. 9А). Возможно, этот факт отвечает за наблюдаемое накопление мЭСК в Gl фазе, так как с-тус вносит вклад в экспрессию циклина Е и cdc25a и регуляцию G1/S перехода в мЭСК.

6. Влияние инактивации GSK3 на экспрессию фактора REST в мЭСК.

Белок REST/NRSF (RE1-silencing transcription factor/neuron-restrictive silencer factor) представляет собой репрессор транскрипции, одна из функций которого заключается в подавлении экспрессии нейральных факторов в тканях за пределами нервной системы (Gopalakrishnan, 2009). Было также показано участие REST в самообновлении (Singh et al., 2008) и дифференцировке мЭСК в направлении примитивной энтодермы (Yamada et al., 2010). В экзоне la гена rest/nrsf обнаружен сайт связывания для факторов Tcf, и показано, что активация Wnt-сигнального пути позитивно регулирует его транскрипцию (Nishihara et al., 2003). Мы исследовали, находится ли транскрипция фактора REST под контролем со стороны ингибиторов GSK3 в мЭСК. В недифференцированных мЭСК экспрессия этого фактора была высока и снижалась в различных индуцирующих дифференцировку условиях, в частности при культивировании мЭСК в бессывороточной среде N2B27 (без L1F), способствующей дифференцировке в нейральные производные (Рис. 9Б). ВЮ и CHIR

контроль

G1:19.38% S: 67.33 %

1 2 время, сутки

BIO 2.5 рМ

G1:30.46% S: 51.01 %

CHIR 5 рМ

G1: 24.36% S: 62.68 %

Рис. 8. Снижение ингибитором BIO прироста клеточной популяции вызвано накоплением клеток в Gl фазе, но не запуском апоптоза. А - Кривые роста контрольных и обработанных BIO мЭСК линии IOUD2, построенные с помощью МТТ-эссея. Указаны стандартные ошибки среднего по 6 повторениям. Б — Результаты анализа активности каспазы 3 in vitro при обработке мЭСК BIO (5 мкМ) или LY294002 (LY, 40 мкМ) в качестве положительного контроля. Негативный контроль - каспазная активность при добавлении в реакцию ингибитора ZVAD. В — Распределение мЭСК по фазам клеточного цикла, полученное методом проточной цитофлуориметрии. Обработка мЭСК ингибиторами в указанных концентрациях проводилась в течение 2 сут.

в наших экспериментах снижали уровень мРНК ге^/ига/ во всех условиях. Однако инактивация йЗКЗ не способствовала, а, напротив, подавляла нейральную дифференцировку на ее ранних этапах, судя по отсутствию экспрессии в обработанных клетках нейрального маркера лох/.

циклин D1

0,6 о

Г 1

еЯ1

н 1 1 :

1.S

с -туе

л ///

яЬ

axin?

rest/nrsf

soxl

gapdh

6 су г

сР о:

Рис. 9. Инактивация GSK3 подавляет экспрессию генов с-тус и rest/nrsf в мЭСК. А - Результаты количественной ОТ-ПЦР на гены-регуляторы клеточного цикла в мЭСК линии IOUD2, обработанных ингибиторами GSK3 в указанных концентрациях в течение 2 сут. Значения нормализованы относительно экспрессии gapdh. Указаны ошибки среднего по трем повторениям. Б - Результаты ОТ-ПЦР на продукт гена rest/nrsf в мЭСК линии E14TV2, обработанных 2.5 мкМ BIO или 2.5 мкМ CHIR в обозначенных условиях. «Контроль» - недифференцированные мЭСК, «N2B27» - мЭСК, культивированные в среде без сыворотки и LIF, поддерживающей нейральную дифференцировку. Уровень экспрессии gapdh использовался как внутренний контроль.

7. Модуляция уровня экспрессии и активности ß-катенина ингибитором MEK/ERK каскада.

Известно, что ингибиторы GSK3 эффективно поддерживают самообновление мЭСК только в сочетании с другими факторами. Инактивация только киназы GSK3 не способна предотвращать дифференцировку (Ying et al., 2008). В частности, оказалось, что совместное действие CHIR и ингибитора МЕК1/2 PD0325901 обеспечивает стабильное самообновление, эффективно ингибирует дифференцировку и способствует репрограммированию (Silva et al., 2008). Мы предположили, что PD0325901 (далее PD) модулирует какие-то эффекты инактивации GSK3, значимые для самообновления. Чтобы прояснить этот вопрос, мы исследовали, влияет ли инактивация МЕК1/2 на экспрессию и активность ß-катенина в мЭСК линии E14TV2.

Оказалось, что PD в концентрации 1 мкМ приводит к увеличению содержания ß-катенина на уровне белка. Совместное действие PD и BIO имело аддитивный эффект (Рис. 10А). Регуляция уровня ß-катенина происходила на посттранскрипционном уровне, так как экспрессия мРНК ß-катенина не изменялась при воздействии PD (Рис. 10Б). Как свидетельствуют данные иммунофлуоресценции, в сочетании с BIO или CHIR ингибитор МЕК1/2 не препятствовал появлению

Рис. 10. Ингибитор МЕК1/2 вызывает накопление р-катенина на уровне белка и не препятствует его ядерной локализации. А - Вестерн блот клеточных лизатов после обработки мЭСК линии Е14ТУ2 ингибитором МЕК1/2 Р00325901 (РО), СН1Я (СН), или двумя ингибиторами (СН+РБ) в течение 2 сут. Б - ОТ-ПЦР на мРНК р-катенина в мЭСК, обработанных указанными ингибиторами в течение 2 сут; gapdh использован в качестве внутреннего контроля. В - Иммунофлуоресцентное окрашивание мЭСК, обработанных указанными ингибиторами в течение 2 сут, на р-катенин (зеленый) и ДНК (ОАР1, синий). Масштабная линейка - 25 мкм.

<е /

<е

^ -Р о -9 -г >Р о -Р .£> <г Ф # <г Ф

контроль

ВЮ

Е-кадгерин

ИП: р-кагенин тотальный лизапг

РР

ВЮ+РО

г,?"

ß-катенина в ядре, однако при обработке только PD не наблюдалось перераспределения ß-катенина в цитоплазму и ядро, и он сохранялся при мембране, очевидно, участвуя в межклеточной адгезии (Рис. 10В).

Действительно, иммунопреципитация выявила повышенную степень связывания ß-катенина с Е-кадгерином при обработке клеток PD в течение 2 сут (Рис. IIA). При совместном действии PD и BIO эффект был более выражен, чем в присутствии только BIO. Общий уровень Е-кадгерина не менялся (Рис.11 А). Интересно, что PD, как и ингибиторы GSK3, приводил к уплотнению колоний клеток, однако при этом сохранялась их монослойность, и клетки формировали более протяженные пласты (Рис. 11 Б). Таким образом, один из эффектов инактивации MEK/ERK заключается в усилении взаимодействия ß-катенина с Е-кадгерином.

Как уже было отмечено, инактивация МЕК1/2 принципиально не отменяла ВЮ-и CHIR-зависимый транспорт ß-катенина в ядро, и его ядерная локализация наблюдалась в мЭСК, обработанных двумя ингибиторами. В соответствии с данными по локализации, ко-активаторная функция ß-катенина на конструкции TopFlash под действием PD не изменялась в контрольных клетках, но дополнительно возрастала в клетках, обработанных ингибиторами GSK3 (Рис. 12А). Когда же мы подробнее исследовали экспрессию некоторых Р-катенин/ТсГ-зависимых генов в этих условиях с помощью ОТ-ПЦР, оказалось, что PD в разной степени модулирует их транскрипцию. В частности, уровень мРНК axin2, snail и вимептипа в обрабатываемых BIO мЭСК не изменялся или слабо возрастал в присутствии ингибитора МЕК1/2, тогда как экспрессия раннего маркера мезодермы, T/Brachyuty, подавлялась (Рис. 12Б, ср. «BIO» и «BIO+PD»), Мы проверили, справедлива ли такая модуляция транскрипции для клеток, культивируемых в отсутствие LIF, но в присутствии CHIR и PD, в течение 6 сут в концентрациях, которые были заявлены как оптимальные для поддержания самообновления (Ying et al., 2008) (Рис. 12В). При удалении LIF из среды экспрессия всех перечисленных выше мишеней ß-катенина усиливалась. PD в значительной степени отменял запуск экспрессии этих генов, однако, как ни парадоксально, присутствие CHIR в среде без LIF имело такой же эффект. Присутствие PD в дополнение к CHIR не изменяло или незначительно снижало уровень мРНК рассматриваемых генов (Рис. 12В, «CHIR» и «CHIR+PD»), Экспрессия T/Brachyury в присутствии PD была подавлена во всех условиях. Таким образом, ингибитор MEK/ERK может отменять про-дифференцировочные эффекты инактивации GSK3 в мЭСК за счет подавления транскрипции этого мезодермапьного регулятора.

Рис. 11. Инактивация МЕК1/2 в мЭСК сопровождается накоплением Е-кадгерин-связанного ß-катенина и усилением межклеточной адгезии. А - Вестерн блот клеточных лизатов после иммунопреципитации антителами против ß-катенина (ИП: ß-катенин) и тотальных клеточных лизатов (тотальный лизат). Окрашивание антителами к Е-кадгерину, ß-катенину и ß-тубулину как контролю нагрузки. Б - общий вид колоний мЭСК, фазовый контраст. Обработка мЭСК линии E14TV2 ингибиторами (BIO 2.5 мкМ, PD 1 мкМ) проводилась в течение 2 сут.

\ L

I TopFiash В fopFlash

Б /

f sO л -Ç>

^ <$• <r

4 / #

^ CJ 4 C?

s -

2 1

1 ОД О Ш ........ 1 е....

& # <p <0 „N

-LI F 6 сут

+UF2 сут

Рис. 12. Ингибитор МЕК1/2 модулирует р-катенин/ТсГ-зависимую транскрипцию при инактивации GSK3. А — Результаты анализа люциферазной активности после временной трансфекции в мЭСК линии E14TV2 TopFiash или FopFlash. Обработка ингибиторами производилась в течение 2 сут. Указаны стандартные ошибки среднего по двум повторениям. Б, В - Данные ОТ-ПЦР на гены-мишени р-катенина/Tcf и gapdh в качестве внутреннего контроля. мЭСК обрабатывали ингибиторами (BIO 2.5 мкМ, PD 1 мкМ, CHIR 3 мкМ) в указанных условиях. T/Bra - T/Brachyury.

Известно, что в промоторе гена nanog имеется сайт связывания с фактором Tcß, и в недифференцированных мЭСК Tcß связан с ним, в некоторой степени подавляя экспрессию nanog (Yi et al., 2008). Таким образом, этот регулятор плюрипотентности также является мишенью Wnt/ß-катенин-сигнального пути. В соответствии с этим, мРНК этого фактора накапливалась при ингибировании GSK3 в недифференцированных мЭСК (Рис. 12Б). Инактивация МЕК.1/2 усиливала этот эффект. Необходимо отметить, что PD сам по себе вызывал более сильное накопление мРНК nanog, чем BIO или CHIR (Рис. 12Б). Однако в отсутствие LIF CHER, несколько эффективнее поддерживал транскрипцию этого фактора, чем PD или даже сочетание обоих ингибиторов, и она сохранялась на таком же или даже более высоком уровне, чем в контроле в присутствии LIF (Рис. 12В).

Заключение

Итак, согласно полученным в работе данным, в недифференцированных мЭСК ß-катенин в основном выполняет адгезионную функцию, а инактивация киназы GSK3 приводит к накоплению и активации ß-катенина в его обоих функциональных состояниях: как участника и регулятора Е-кадгерин-опосредоваиной межклеточной адгезии и как ко-активатора транскрипции Wnt/ß-катенин-зависимых генов. Мы показали, что связывание ß-катенина и Е-кадгерина усиливается при обработке мЭСК ингибиторами GSK3; еще более эта тенденция выражена при совместной инактивации GSK3 и МЕК1/2, то есть в условиях, эффективно поддерживающих самообновление мЭСК. Вероятно, привлечение ß-катенина в Е-кадгерин содержащие комплексы обуславливает более плотное контактирование клеток друг с другом

внутри колоний недифференцированных мЭСК, наблюдающееся при воздействии ингибиторами GSK3 и МЕК1/2.

Несмотря на то, что Р-катеиин/ТсГ-зависимая транскрипция с репортерной конструкции TopFIash усиливалась при инактивации GSK3 в недифференцированных мЭСК, мы наблюдали накопление мРНК лишь некоторых из исследованных генов-мишеней Р-катенина в этих условиях. Транскрипция axin2, известной мишени Р-катенина/Tcf и отрицательного регулятора Wnt-сигаального пути, запускалась при инактивации GSK3 во всех условиях. Слабая активация экспрессии snail и T/Brachyury наблюдалась в обеих линиях мЭСК, а виментина - только в клетках линии E14TV2. Уровень мРНК регуляторов клеточного цикла циклила D1 и e2fl не повышался, а с-тус и фактора rest/nrsf - снижался при инактивации GSK3. То, что транскрипция этих генов не активируется, может быть связано с особым состоянием хроматина в мЭСК (Niwa, 2007), а также с балансом ко-активаторов и ко-репрессоров, взаимодействующих с ß-катенином. Такое предположение подтверждается тем, что в недифференцированных мЭСК наблюдается относительно низкий уровень экспрессии ядерных партнеров ß-катенина. Интересно также, что многие гены-мишени Р-катенина (T/Brachyury, snail, виментин) при удалении LIF из среды культивирования активировались значительно сильнее, чем в тех же клетках в присутствии CHIR или BIO. Вероятно, ингибиторы GSK3 каким-то образом поддерживают непермиссивное для Р-катенин-зависимой транскрипции состояние, характерное для самообновляющихся мЭСК, даже на ранних этапах дифференцировки. Эта проблема требует дополнительных исследований, на основе же наших данных можно заключить, что в условиях, поддерживающих самообновление, а также на ранних этапах дифференцировки, адгезионная функция Р-катенина доминирует над транскрипциошюй, и накопление ß-катенина в этих условиях приводит к усилению Е-кадгерин-опосредованной межклеточной адгезии, но лишь избирательной транскрипции генов-мишеней Wnt-сигнального пути.

Выводы

1. В недифференцированных мЭСК ß-катенин локализуется преимущественно примембранно, образуя комплексы с Е-кадгерином; трансактиваторная функция Р-катенина очень низка. При индукции дифференцировки в монослое клеток увеличивается содержание ß-катенина в ядре, возрастает экспрессия транскрипционных партнеров Р-катенина и его трансактиваторная способность, что приводит к значительной активации транскрипции Р-катенин/ТсГ-зависимых генов-маркеров ЭМП (snail, виментин) и мезодермальной дифференцировки (T/Brachyury).

2. Ингибирование киназы GSK3 в недифференцированных мЭСК вызывает значительное усиление трансактиваторной способности Р-катенина, что однако не сопровождается существенным увеличением экспрессии Р-катенин/ТсГ-зависимых генов, регулирующих ЭМП. Более того, ингибирование GSK3 в клетках, индуцированных к дифференцировке, ослабляет экспрессию генов-маркеров ЭМП и приводит к сохранению более тесных адгезионных контактов между клетками.

3. Инактивация киназы GSK3 в недифференцированных мЭСК сопровождается накоплением Е-кадгерин-связанного пула р-катенина и образованием дополнительных межклеточных контактов, т.е. усиливает адгезионную функцию р-катенина.

4. GSK3 ингибитор ВЮ, но не CHIR99021, вызывает снижение скорости прироста популяции мЭСК за счет накопления клеток в G1 фазе клеточного цикла. При этом оба ингибитора подавляют экспрессию с-тус, но не изменяют степень экспрессии других Wnt-зависимых генов - регуляторов клеточного цикла е2/1 и циклипа D1.

5. Ингибирование MEK/ERK сигнального каскада приводит к накоплению Р-катенина, но транскрипция самого гена не активируется. MEK/ERK ингибиторы модулируют действие ингибиторов GSK3: дополнительно усиливается степень связывания р-катенина с Е-кадгерином и подавляется экспрессия р-катенин/Tcf-зависимого гена T/Brachyury - регулятора мезодермальной дифференцировки, что ослабляет про-дифференцировочные эффекты инактивации GSK3.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Sineva G.S., Pospelov V.A. Inhibition of GSK3P enhances both adhesive and signalling activities of p-catenin in mouse embryonic stem cells// Biology of the Cell. 2010. V. 102. P. 549-560.

2. Синева Г.С., Лянгузова M.C., Поспелов B.A. Транскрипционная активность Р-катенина низка в пролиферирующих эмбриональных стволовых клетках мыши и повышается при дифференцировке // Материалы школы-конференция для молодых ученых «Методы культивирования клеток». Санкт-Петербург, 6-10 октября 2008 г. Цитология. 2008. Т.50. №9. С. 821-822.

3. Sineva G., Lianguzova М., Pospelov V. Beta-catenin transcriptional activity is low in proliferating mouse embryonic stem cells and increases upon differentiation// Материалы 6th ISSCR (International Society for Stem Cell Research) Annual Meeting 2008, Филадельфия, США, 11-14 июня 2008 г. Abstract book. P. 410.

4. Синева Г.С., Поспелов B.A. Инактивация киназы GSK3P в эмбриональных стволовых клетках мыши приводит к замедлению их пролиферации и усилению межклеточной адгезии// Материалы VII Международной конференции "Молекулярная генетика соматических клеток", Звенигород, 22-25 октября 2009 г. Программа и тезисы. С. 81.

5. Sineva G.S., Pospelov V.A. Inhibition of GSK3P enhances E-cadherin/p-catenin-mediated intercellular adhesion in mouse embryonic stem cell// Материалы международной конференции "Modern Microscopy Techniques in Biology and Medicine", Санкт-Петербург, 9-10 ноября 2009 г. Program book. P. 27.

6. Синева Г.С., Поспелов B.A. Инактивация киназы GSK3P усиливает адгезионную и транскрипционную активность р-катенина в эмбриональных стволовых клетках мыши// Материалы II Конференции молодых ученых Института цитологии РАН, Санкт-Петербург, 15-16 февраля 2010 г., Цитология. 2010. Т. 52. №6. С. 505-506.

7. Sineva G.S., Pospelov V.A. Inhibition of GSK.3P enhances both adhesive and signalling activities of P-catenin in mouse embryonic stem cells // Материалы международной конференции EMBO Meeting 2010, 4-7 сентября 2010 r. Abstracts P 189.

Список цитированной литературы.

Чуйкин И. А., Лянгузова М. С., Поспелов В. А. Бета-катении не локализуется в ядре недифференцированных эмбриональных стволовых клегок мыши // Доклады Академии наук. 2006. Т. 41. №1. С. 1-4. Туроверов К.К., Бикташев А.Г., Дорофеюк А.В., Кузнецова И.М. Комплекс аппаратных и программных средств для измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе// Цитология. 1998. Т.40. № 8/9. С. 806-817. Abramova M.V., Zatulovskiy Е.А., Svetlikova S.B., Kukushkin A.N. and Pospelov V.A. e2fl gene is a new member of Wnt/p-catenin/Tcf-regulated genes //Biochem Biophys Res Commun 2010 V. 391. №1. P. 142-146.

Brembeck F.H., Schwarz-Romond Т., Bakkers J., Wilhelm S., Hammerschmidt M. and Birchmeier W. Essential role of BCL9-2 in the switch between beta-catenin's adhesive and transcriptional functions //Genes Dev. 2004. V. 18. № 18. P. 2225-2230. Chen Y.T., Stewart D.B. and Nelson W.J. Coupling assembly of the E-cadherin/beta-catenin complex to efficient endoplasmic reticulum exit and basal-lateral membrane targeting of E-cadherin in polarized MDCK cells //J Cell Biol. 1999. V. 144. № 4. P. 687-699. Daugherty R.L. and Gottardi C.J. Phospho-regulation of Beta-calenin adhesion and signaling

functions //Physiology (Bethesda). 2007. V. 22. № p. 303-309. Do J.T. and Scholer H.R. Regulatory circuits underlying pluripotency and reprogramming //Trends

Pharmacol Sci. 2009. V. 30. № 6. P. 296-302. Gilles C., Polette M., Mestdagt M„ Nawrocki-Raby В., Ruggeri P., Birembaut P. and Foidart J.M. Transactivation of vimentin by beta-catenin in human breast cancer cells //Cancer Res 2003 V 63. № 10. P. 2658-2664.

Gopalakrishnan V. REST and the RESTIess: in stem cells and beyond //Future Neurol 2009 V 4 №3. P. 317-329. ' '

KJaus A. and Birchmeier W. Wnt signalling and its impact on development and cancer //Nat Rev

Cancer. 2008. V. 8. № 5. P. 387-398. Lilien J. and Balsamo J. The regulation of cadherin-mediated adhesion by tyrosine phosphorylation/dephosphorylation of beta-catenin //Curr Opin Cell Biol. 2005 V 17 № 5 P 459-465.

Lyashenko N., Winter ML, Migliorini D., Biechele Т., Moon R.T. and Hartmann C. Differential requirement for the dual functions of beta-catenin in embryonic stem cell self-renewal and germ layer formation//Nat Cell Biol. 2011. V. 13. № 7. P. 753-761. Marson A., Foreman R., Chevalier В., Bilodeau S., Kahn M., Young R.A. and Jaenisch R. Wnt signaling promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency //Cell Stem Cell 2008 V 3 №2. P. 132-135.

Nelson W.J. and Nusse R. Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin pathways //Science

2004. V. 303. № 5663. P. 1483-1487. Nishihara S., Tsuda L. and Ogura T. The canonical Wnt pathway directly regulates NRSF/REST

expression in chick spinal cord //Biochem Biophys Res Commun. 2003. V. 311. № 1. P. 55-63. Niwa II. Open conformation chromatin and pluripotency /'/Genes Dev. 2007 V 21 №21 P ">671-2676.

Silva J., Barrandon O., Nichols J., Kawaguchi J., Theunissen T.W. and Smith A. Promotion of reprogramming to ground state pluripotency by signal inhibition //I'LoS Biol. 2008. V. 6 № 10 P e253.

Singh S.K., Kagalwala M.N., Parker-Thornburg J., Adams H. and Majumder S. REST maintains self-renewal and pluripotency of embryonic stem cells //Nature. 2008. V. 453. № 7192. P. 223227.

Smith A.G. Embryo-derived stem cells: of mice and men //Annu Rev Cell Dev Biol. 2001. V. 17. № P. 435-462.

Smith A.G., Heath J.K., Donaldson D.D., Wong G.Ci., Moreau J., Stahl M. and Rogers D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides //Nature. 1988. V. 336. № 6200. P. 688-690.

Sun A., Shanmugam I., Song J., Terranova P.F., Thrasher J.B. and Li B. Lithium suppresses ccll proliferation by interrupting E2F-DNA interaction and subsequently reducing S-phase gene expression in prostate cancer//Prostate. 2007. V. 67. № 9. P. 976-988.

Takahashi K. and Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors //Cell. 2006. V. 126. № 4. P. 663-676.

Umehara II., Kimura T„ Ohtsuka S„ Nakamura T„ Kitajima K„ Ikawa M., Okabe M., Niwa II. and Nakano T. Efficient derivation of embryonic stem cells by inhibition of glycogen synthase kinase-3 //Stem Cells. 2007. V. 25. № 11. P. 2705-2711.

Wray J., Kalkan T., Gomez-Lopez S., Eckardt D., Cook A., Kcraler R. and Smith A. Inhibition of glycogen synthase kinasc-3 alleviates TcD repression of the pluripotency network and increases embryonic stem cell resistance to differentiation //Nat Cell Biol. 2011. V. 13. № 7. P. 838-845.

Yamada Y., Aoki H., Kunisada T. and Hara A. Rest promotes the early differentiation of mouse ESCs but is not required for their maintenance //Cell Stem Cell. 2010. V. 6. № 1. P. 10-15.

Yi F., Pcrcira L. and Merrill B.J. TcB functions as a steady-state limiter of transcriptional programs of mouse embryonic stem cell self-renewal //Stem Cells. 2008. V. 26. № 8. P. 1951-1960.

Ying Q.L., Nichols J., Chambers I. and Smith A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3 //Cell. 2003. V. 115. № 3. P. 281-292.

Ying Q.L., Wray J., Nichols J., Batlle-Morera L., Doble B., Woodgett J., Cohen P. and Smith A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal //Nature. 2008. V. 453. № 7194. P. 519-523.

Автор выряжает искреннюю благодарность

научному руководителю В. А. Поспелову, М.С. Лянгузовой, И. А. Чуйкину и сотрудникам лаборатории молекулярных основ дифферощировкн клеток за всестороннюю поддержку при Подготовке представленной работы, а также Н.Д. Аксенову, Г.Ф. Решетниковой, И.М. Кузнецовой и К.К. Туроверову, A.B. Кропотову, А.Н. Томилину и сотрудникам лаборатории молекулярной биологии стволовых клеток за помощь и цепные советы при осуществлении работы.

Подписано в печать 16.05.2012 Формат 60x90/16 Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ 224

Отпечатано в типографии «Адмирал» 199178, Санкт-Петербург, В.О., 7-я линия, д. 84 А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Синева, Галина Сергеевна

Список используемых сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Эмбриональные стволовые клетки: регуляция самообновления и плюрипотентности.

1.1 Происхождение и свойства ЭСК.

1.2 Транскрипционные факторы, регулирующие плюрипотентность и самообновление ЭСК.

1.3 Сигнальные пути, регулирующие самообновление и плюрипотентность ЭСК.

1.4 Особенности регуляции клеточного цикла ЭСК мыши.

1.5 Индукция дифференцировки ЭСК.

2. Адгезионная и транскрипционная функции р-катенина.

2.1. Р-катенин и его роль в каноническом Wnt-сигнальном каскаде и межклеточной адгезии.

2.2. Функции р-катенина в эмбриогенезе, клеточной пролиферации и дифференцировке.

2.3. Роль Р-катенина и его партнеров в регуляции плюрипотентности, самообновления и дифференцировки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Культивирование клеток.

МТТ-тест и кривые роста.

Временная трансфекция и анализ люциферазной активности.

Проточная цитофлуориметрия на содержание ДНК.

Анализ активности каспаз in vitro.

Иммунофлуоресценция.

Экстракция тотального белка в денатурирующих условиях и Вестерн блоттинг 46 Экстракция белка для иммунопреципитации и осаждения GST-E-кадгерином

Экстракция РНК и ОТ-ПЦР.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

Общая характеристика активности Р-катенина и экспрессия его коактиваторов в недифференцированных мЭСК и при дифференцировке.

Уровень экспрессии, локализация и транскрипционная активность р-катенина при инактивации GSK3 в недифференцированных мЭСК.

Влияние инактивации GSK3 на Р-катенин-зависимую адгезию в недифференцированных мЭСК.

Регуляция маркеров ЭМП при инактивации GSK3 в недифференцированных мЭСК и при дифференцировке.

Влияние ингибиторов GSK3 на выживаемость, пролиферацию и экспрессию регуляторов клеточного цикла в мЭСК.

Влияние инактивации GSK3 на экспрессию фактора REST в мЭСК.

Модуляция экспрессии и активности Р-катенина ингибитором MEK/ERK каскада.

ОБСУЖДЕНИЕ.

Активность Р-катенина в недифференцированных мЭСК и при дифференцировке

Адгезионный пул Р-катенина и межклеточная адгезия.

Сигнальный пул р-катенина и избирательная активация транскрипции.

Модуляция экспрессии и активности Р-катенина ингибитором МЕК/ЕЮС каскада.

Влияние ингибиторов вЭКЗ на выживание и пролиферацию мЭСК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Адгезионная и транскрипционная функции β-катенина в самообновлении эмбриональных стволовых клеток мыши"

Актуальность проблемы

Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) представляют собой объект активно развивающейся области клеточной биологии. ЭСК интересны тем, что, с одной стороны, обладают плюрипотентностью, т.е. способностью дифференцироваться в клеточные производные всех трех зародышевых листков; с другой стороны, они обладают свойством самообновления, т.е. активно пролиферируют в недифференцированном состоянии и при этом сохраняют плюрипотентность (Smith, 2001). Эти принципиальные особенности делают ЭСК привлекательной и доступной моделью для исследования молекулярных механизмов раннего эмбрионального развития, пролиферации, дифференцировки. Благодаря способности дифференцироваться и образовывать все типы клеток взрослого организма ЭСК человека являются перспективным инструментом для клеточной терапии. Способность ЭСК мыши включаться в бластоцисту и формировать ткани химерного зародыша, в том числе половые клетки, используется для получения нокаутных мышей и исследования функций генов in vivo. Получение в 2006 году индуцированных плюрипотентных стволовых (иПС) клеток продемонстрировало, что возможен и обратный переход из дифференцированного состояния в плюрипотентное, иными словами, возможно репрограммирование соматических клеток в плюрипотентные (Takahashi, Yamanaka, 2006). Изучение механизмов, регулирующих процессы самообновления, дифференцировки и репрограммирования, имеет важное фундаментальное значение. Кроме того, знание механизмов, регулирующих эти процессы, необходимо в будущем для безопасного применения ЭСК и других плюрипотентных клеток в клинике.

Самообновление ЭСК обеспечивается координированной работой набора транскрипционных факторов и сигнальных путей, активность которых направлена на подавление дифференцировки и поддержание высокого пролиферативного потенциала клеток (Do, Scholer, 2009). Известно, что для самообновляющихся ЭСК мыши необходима активация LIF/STAT3 и ВМР4/8шаё-сигнальных каскадов (Smith et al., 1988; Ying et al., 2003). Среди факторов, которые позитивно регулируют процессы самообновления ЭСК, получение новых линий ЭСК и репрограммирование соматических клеток мыши и человека, значительную роль играет активация Wnt-сигнального пути или ингибирование его негативного регулятора, киназы GSK3 (Marson et al., 2008; Umehara et al., 2007; Wray et al., 2011). Центральным эффектором Wnt пути является белок ß-катенин, который в отсутствие сигнала от Wnt фосфорилируется киназой GSK3, что маркирует его для протеасомной деградации. Активация канонического Wnt каскада приводит к подавлению активности GSK3, стабилизации ß-катенина, его транспорту в ядро и активации совместно с факторами семейства Tcf транскрипции Wnt-зависимых генов. К р-катенин/ТсГ-зависимым генам относятся некоторые ключевые регуляторы дифференцировки, гены, отвечающие за эпителиально-мезенхимальный переход и регуляцию клеточного цикла (Klaus, Birchmeier, 2008). Кроме того, ß-катенин выполняет в клетке важную адгезионную функцию, а именно, совместно с мембранными белками семейства кадгеринов участвует в формировании межклеточных контактов и обеспечивает их связывание с актиновым цитоскелетом (Nelson, Nüsse, 2004).

Ингибиторы GSK3 способствуют становлению и поддержанию плюрипотентности, и их положительное влияние на самообновление в значительной степени опосредованы ß-катенином (Wray et al., 2011). Известно также, что инактивация GSK3 наиболее эффективно способствует поддержанию плюрипотентности в сочетании с применением ингибиторов MEK/ERK каскада, в то время, как само по себе ингибирование GSK3 не полностью препятствует запуску дифференцировки в мЭСК (Ying et al., 2008). Остается не вполне понятным, с какими именно функциями ß-катенина (или других мишеней GSK3) связан положительный эффект ингибиторов GSK3 в ЭСК и как модулируют его другие сигнальные пути, обслуживающие самообновление, в частности, MEK/ERK путь.

Цели и задачи исследования

Целью данной работы было выяснить функциональный статус Р-катенина и его роль в самообновлении и ранней дифференцировке ЭСК мыши (мЭСК). Были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать уровень экспрессии р-катенина, а также уровень Р-катенин-зависимой транскрипции генов-мишеней в недифференцированных и дифференцированных мЭСК;

2. Изучить изменения транскрипционной и адгезионной функций Р-катенина в норме и при обработке мЭСК ингибиторами вБКЗ;

3. Исследовать влияние ингибиторов в8КЗ на пролиферацию, выживаемость и экспрессию маркеров недифференцированного состояния мЭСК;

4. Выяснить, в какой степени МЕК/ЕЮС-сигнальный путь модулирует уровень экспрессии р-катенина и его адгезионные и сигнальные функции в мЭСК.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Синева, Галина Сергеевна

выводы

1. В недифференцированных мЭСК Р-катенин локализуется преимущественно примембранно, образуя комплексы с Е-кадгерином; трансактиваторная функция р-катенина очень низка. При индукции дифференцировки в монослое клеток увеличивается содержание Р-катенина в ядре, возрастает экспрессия транскрипционных партнеров р-катенина и его трансактиваторная способность, что приводит к значительной активации транскрипции р-катенин/Тс^зависимых генов-маркеров ЭМП {snail, вгшентин) и мезодермальной дифференцировки (T/Brachyury).

2. Ингибирование киназы GSK3 в недифференцированных мЭСК вызывает значительное усиление трансактиваторной способности Р-катенина, что не сопровождается существенным увеличением экспрессии р-катенин/Tcf-зависимых генов, регулирующих ЭМП. Более того, ингибирование GSK3 в клетках, индуцированных к дифференцировке, ослабляет экспрессию генов-маркеров ЭМП и приводит к сохранению более тесных адгезионных контактов между клетками.

3. Инактивация киназы GSK3 в недифференцированных мЭСК сопровождается накоплением Е-кадгерин-связанного пула Р-катенина и образованием дополнительных межклеточных контактов, т.е. усиливает адгезионную функцию р-катенина.

5. Ингибирование MEK/ERK сигнального каскада приводит к накоплению р-катенина, но транскрипция самого гена не активируется. MEK/ERK ингибиторы модулируют действие ингибиторов GSK3: дополнительно усиливается степень связывания Р-катенина с Е-кадгерином и подавляется экспрессия Р-катенин/Тс^зависимого гена T/Brachyury - регулятора мезодермальной дифференцировки, что ослабляет про-дифференцировочные эффекты инактивации GSK3.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Sineva G.S., Pospelov V.A. Inhibition of GSK3(3 enhances both adhesive and signalling activities of p-catenin in mouse embryonic stem cells // Biology of the Cell. 2010. V. 102. P. 549-560.

2. Синева Г.С., Лянгузова M.C., Поспелов B.A. Транскрипционная активность р-катенина низка в пролиферирующих эмбриональных стволовых клетках мыши и повышается при дифференцировке // Материалы школы-конференции для молодых ученых «Методы культивирования клеток». Санкт-Петербург, 6-10 октября 2008 г. Цитология. 2008. Т.50. №9. С. 821-822.

5. Sineva G.S., Pospelov V.A. Inhibition of GSK3P enhances E-cadherin/p-catenin-mediated intercellular adhesion in mouse embryonic stem cell // Материалы международной конференции "Modern Microscopy techniques in Biology and Medicine", Санкт-Петербург, 9-10 ноября 2009 г. Program book. P. 27.

6. Синева Г.С., Поспелов B.A. Инактивация киназы GSK3P усиливает адгезионную и транскрипционную активность р-катенина в эмбриональных стволовых клетках мыши // Материалы II Конференции молодых ученых Института Цитологии РАН, Санкт-Петербург, 15-16 февраля 2010 г. Цитология. 2010. Т. 52. №6. С. 505-506.

7. Sineva G.S., Pospelov V.A. Inhibition of GSK3P enhances both adhesive and signalling activities of P-catenin in mouse embryonic stem cells // Материалы международной конференции EMBO Meeting 2010, 4-7 сентября 2010 г. Abstracts. P. 189.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Итак, согласно полученным в работе данным, в недифференцированных мЭСК Р-катенин в основном выполняет адгезионную функцию, а инактивация киназы GSK3 приводит к накоплению и активации р-катенина в его обоих функциональных состояниях - как участника и регулятора Е-кадгерин-опосредованной межклеточной адгезии и как ко-активатора транскрипции Wnt/p-катенин-зависимых генов. Мы показали, что связывание Р-катенина и Е-кадгерина усиливается при обработке мЭСК ингибиторами GSK3; еще более эта тенденция выражена при совместной инактивации GSK3 и МЕК1/2, то есть в условиях, эффективно поддерживающих самообновление мЭСК. Вероятно, привлечение Р-катенина в Е-кадгерин содержащие комплексы обуславливает более плотное контактирование клеток друг с другом внутри колоний недифференцированных мЭСК, наблюдающееся при воздействии ингибиторами GSK3 и МЕК1/2.

Несмотря на то, что р-катенин/Тс£зависимая транскрипция на репортерной конструкции TopFlash усиливалась при инактивации GSK3 как в недифференцированных мЭСК, так и при запуске дифференцировки, мы наблюдали накопление мРНК лишь некоторых из исследованных генов-мишеней Р-катенина в этих условиях. Транскрипция Axin2, повсеместной мишени Р-катенина/Tcf и отрицательного регулятора Wnt-сигнального пути, запускалась при инактивации GSK3 во всех условиях. Слабая активация экспрессии snail и T/Brachyury наблюдалась в обеих линиях недифференцированных мЭСК, а вьшентина - только в клетках линии E14TV2. Уровень мРНК генов-регуляторов клеточного цикла циклима D1 и e2fl не повышался, а с-тус и фактора rest/nrsf снижался при инактивации GSK3. То, что транскрипция этих генов не активируется, может быть связано с особым состоянием хроматина в мЭСК (Niwa, 2007b), а также с балансом ко-активаторов и ко-репрессоров, взаимодействующих с р-катенином. Такое предположение подтверждается тем, что в недифференцированных мЭСК уровень экспрессии ядерных партнеров Р-катенина довольно низок. Интересно также, что многие гены-мишени р-катенина (T/Brachyury, snail, виментин) при удалении LIF из среды культивирования активировались значительно сильнее, чем в тех же клетках в присутствии СНШ. Вероятно, ингибиторы в8КЗ каким-то образом поддерживают непермиссивное для Р-катенин-зависимой транскрипции состояние, характерное для самообновляющихся мЭСК, даже на ранних этапах дифференцировки. Эта проблема требует дополнительных исследований; на основе же наших данных мы можем заключить, что в условиях, поддерживающих самообновление, а также на ранних этапах дифференцировки, адгезионная функция р-катенина доминирует над транскрипционной, и накопление Р-катенина в этих условиях приводит к усилению Е-кадгерин-опосредованной межклеточной адгезии, но лишь избирательной транскрипции генов-мишеней \УЩ-сигнального пути.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Синева, Галина Сергеевна, Санкт-Петербург

1. Лянгузова М. С., Чуйкин И. А., Нордхайм А., Поспелов В. А. Фармакологические ингибиторы Р13-киназы вортманнин и LY294002 оказывают различное влияние на пролиферацию эмбриональных стволовых клеток мыши //Цитология. 2006. Т. 48. № 7. С. 560-577.

2. Малашичева А. Б., Кислякова Т. В., Саватье П., Поспелов В.А. Эмбриональные стволовые клетки не останавливаются в клеточном цикле при действии повреждающих факторов //Цитология. 2002. Т. 44. № 7. С. 643-648.

3. Туроверов К.К., Бикташев А.Г., Дорофеюк A.B., Кузнецова И.М. Комплекс аппаратных и программных средствдля измерения спектральных, поляризационных и кинетических характеристик флуоресценции в растворе// Цитология. 1998. Т.40. № 8/9. С. 806-817.

4. Чуйкин И. А., Лянгузова М. С., Поспелов В. А. Бета-катенин не локализуется в ядре недифференцированных эмбриональных стволовых клеток мыши // Доклады Академии Наук. 2006. Т. 41. №1. С. 1-4.

5. Чуйкин И. Л., Лянгузова М. С., Поспелов В. А. Сигнальные пути, определяющие пролифератпвную активность эмбриональных стволовых клеток мыли //Цитология. 2007. Т.49. № 5. С. 370-384.

6. Abramova M.V., Zatulovskiy Е.А., Svetlikova S.B., Kukushkin A.N. and Pospelov V.A. e2fl gene is a new member of Wnt/ß-catenin/Tcf-regulated genes //Biochem Biophys Res Commun. 2010. V. 391. № 1. P. 142-146.

7. Aladjem M.I., Spike B.T., Rodewald L.W., Hope T.J., Klemm M., Jaenisch R. and Wahl G.M. ES cells do not activate p53-dependent stress responses and undergo p53-independent apoptosis in response to DNA damage //Curr Biol. 1998. V. 8. № 3. P. 145-155.

8. Anton R., Kestler H.A. and Kuhl M. Beta-catenin signaling contributes to sternness and regulates early differentiation in murine embryonic stem cells //FEBS Lett. 2007. V. 581. № 27. P. 5247-5254.

9. Ballas N., Grunseich C., Lu D.D., Speh J.C. and Mandel G. REST and its corepressors mediate plasticity of neuronal gene chromatin throughout neurogenesis //Cell. 2005. V. 121. № 4. P. 645-657.

10. Biswas P., Canosa S., Schoenfeld D., Schoenfeld J., Li P., Cheas L.C., Zhang J., Cordova A., Sumpio B. and Madri J.A. PECAM-1 affects GSK-3beta-mediated beta-catenin phosphorylation and degradation //Am J Pathol. 2006. V. 169. № l.P. 314-324.

11. Boiani M. and Scholer H.R. Regulatory networks in embryo-derived pluripotent stem cells //Nat Rev Mol Cell Biol. 2005. V. 6. № 11. P. 872-884.

12. Brembeck F.H., Schwarz-Romond T., Bakkers J., Wilhelm S., Hammerschmidt M. and Birchmeier W. Essential role of BCL9-2 in the switch between beta-catenin's adhesive and transcriptional functions //Genes Dev. 2004. V. 18. № 18. P. 22252230.

13. Brumbaugh J., Hou Z., Russell J.D., Howden S.E., Yu P., Ledvina A.R., Coon J.J. and Thomson J.A. Phosphorylation regulates human OCT4 //Proc Natl Acad Sci U S A. 2012. V.№ P.

14. Bryant D.M. and Stow J.L. The ins and outs of E-cadherin trafficking //Trends Cell Biol. 2004. V. 14. № 8. P. 427-434.

15. Burdon T., Smith A. and Savatier P. Signalling, cell cycle and pluripotency in embryonic stem cells //Trends Cell Biol. 2002. V. 12. № 9. P. 432-438.

16. Burdon T., Stracey C., Chambers I., Nichols J. and Smith A. Suppression of SHP-2 and ERK signalling promotes self-renewal of mouse embryonic stem cells //Dev Biol. 1999. V. 210. № 1. P. 30-43.

17. Cartwright P., McLean C., Sheppard A., Rivett D., Jones K. and Dalton S. LIF/STAT3 controls ES cell self-renewal and pluripotency by a Myc-dependent mechanism //Development. 2005. V. 132. № 5. P. 885-896.

18. Chambers I. and Smith A. Self-renewal of teratocarcinoma and embryonic stem cells //Oncogene. 2004. V. 23. № 43. P. 7150-7160.

19. Cong F. and Varmus H. Nuclear-cytoplasmic shuttling of Axin regulates subcellular localization of beta-catenin //Proc Natl Acad Sci USA. 2004. V. 101. № 9. P. 2882-2887.

20. Cowling V.H. and Cole M.D. HATs off to capping: a new mechanism for Myc //Cell Cycle. 2007. V. 6. № 8. P. 907-909.

21. Dang S.M., Gerecht-Nir S., Chen J., Itskovitz-Eldor J. and Zandstra P.W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture //Stem Cells. 2004. V. 22. № 3. P. 275-282.

22. Daugherty R.L. and Gottardi C.J. Phospho-regulation of Beta-catenin adhesion and signaling functions //Physiology (Bethesda). 2007. V. 22. № P. 303-309.

23. De Miguel M.P., Fuentes-Julián S. and Alcaina Y. Pluripotent stem cells: origin, maintenance and induction //Stem Cell Rev. 2010. V. 6. № 4. P. 633-649.

24. Do J.T. and Scholer H.R. Regulatory circuits underlying pluripotency and reprogramming //Trends Pharmacol Sci. 2009. V. 30. № 6. P. 296-302.

25. Doble B.W., Patel S., Wood G.A., Kockeritz L.K. and Woodgett J.R. Functional redundancy of GSK-3alpha and GSK-3beta in Wnt/beta-catenin signaling shown by using an allelic series of embryonic stem cell lines //Dev Cell. 2007. V. 12. № 6. P. 957-971.

26. Dravid G., Ye Z., Hammond H., Chen G., Pyle A., Donovan P., Yu X. and Cheng L. Defining the role of Wnt/beta-catenin signaling in the survival, proliferation, and self-renewal of human embryonic stem cells //Stem Cells. 2005. V. 23. № 10. P. 1489-1501.

27. Dutta D., Ray S., Home P., Larson M., Wolfe M.W. and Paul S. Self-renewal versus lineage commitment of embryonic stem cells: protein kinase C signaling shifts the balance //Stem Cells. 2011. V. 29. № 4. P. 618-628.

28. Easwaran V., Pishvaian M., Salimuddin and Byers S. Cross-regulation of beta-catenin-LEF/TCF and retinoid signaling pathways //Curr Biol. 1999. V. 9. № 23. P. 1415-1418.

29. Evans M.J. and Kaufman M.H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos //Nature. 1981. V. 292. № 5819. P. 154-156.

30. Evans P.M., Chen X., Zhang W. and Liu C. KLF4 interacts with beta-catenin/TCF4 and blocks p300/CBP recruitment by beta-catenin //Mol Cell Biol. 2010. V. 30. № 2. P. 372-381.

31. Feng G.S. Shp2-mediated molecular signaling in control of embryonic stem cell self-renewal and differentiation //Cell Res. 2007. V. 17. № 1. P. 37-41.

32. Gilles C., Polette M., Mestdagt M., Nawrocki-Raby B., Ruggeri P., Birembaut P. and Foidart J.M. Transactivation of vimentin by beta-catenin in human breast cancer cells //Cancer Res. 2003. V. 63. № 10. P. 2658-2664.

33. Gopalakrishnan V. REST and the RESTless: in stem cells and beyond //Future Neurol. 2009. V. 4. № 3. P. 317-329.

34. Gottardi C.J. and Gumbiner B.M. Distinct molecular forms of beta-catenin are targeted to adhesive or transcriptional complexes //J Cell Biol. 2004. V. 167. № 2. P. 339-349.

35. Gottardi C.J. and Peifer M. Terminal regions of beta-catenin come into view //Structure. 2008. V. 16. № 3. P. 336-338.

36. Haegel H., Larue L., Ohsugi M., Fedorov L., Herrenknecht K. and Kemler R. Lack of beta-catenin affects mouse development at gastrulation //Development. 1995. V. 121. № 11. P. 3529-3537.

37. Hamazaki T., Oka M., Yamanaka S. and Terada N. Aggregation of embryonic stem cells induces Nanog repression and primitive endoderm differentiation //J Cell Sci. 2004. V. 117. № Pt 23. P. 5681-5686.

38. Hanna J.H., Saha K. and Jaenisch R. Pluripotency and cellular reprogramming: facts, hypotheses, unresolved issues //Cell. 2010. V. 143. № 4. P. 508-525.

39. Hao J., Li T.G., Qi X., Zhao D.F. and Zhao G.Q. WNT/beta-catenin pathway up-regulates Stat3 and converges on LIF to prevent differentiation of mouse embryonic stem cells//Dev Biol. 2006. V. 290. № l.P. 81-91.

40. Hari L., Brault V., Kleber M., Lee H.Y., Ille F., Leimeroth R., Paratore C., Suter U., Kemler R. and Sommer L. Lineage-specific requirements of beta-catenin in neural crest development //J Cell Biol. 2002. V. 159. № 5. P. 867-880.

41. Harris T.J. and Peifer M. Decisions, decisions: beta-catenin chooses between adhesion and transcription //Trends Cell Biol. 2005. V. 15. № 5. P. 234-237.

42. Hecht A. and Kemler R. Curbing the nuclear activities of beta-catenin. Control over Wnt target gene expression //EMBO Rep. 2000. V. 1. № 1. P. 24-28.

43. Heuberger J. and Birchmeier W. Interplay of cadherin-mediated cell adhesion and canonical Wnt signaling //Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010. V. 2. № 2. P. a002915.

44. Huelsken J. and Behrens J. The Wnt signalling pathway //J Cell Sci. 2002. V. 115. №Pt 21. P. 3977-3978.

45. Huelsken J. and Birchmeier W. New aspects of Wnt signaling pathways in higher vertebrates //Curr Opin Genet Dev. 2001. V. 11. № 5. P. 547-553.

46. Huelsken J., Vogel R., Brinkmann V., Erdmann B., Birchmeier C. and Birchmeier W. Requirement for beta-catenin in anterior-posterior axis formation in mice //J Cell Biol. 2000. V. 148. № 3. P. 567-578.

47. Ilan N., Mahooti S., Rimm D.L. and Madri J.A. PECAM-1 (CD31) functions as a reservoir for and a modulator of tyrosine-phosphorylated beta-catenin //J Cell Sci. 1999. V. 112 Pt 18. № P. 3005-3014.

48. Jaenisch R. and Young R. Stem cells, the molecular circuitry of pluripotency and nuclear reprogramming //Cell. 2008. V. 132. № 4. P. 567-582.

49. Jiang J., Chan Y.S., Loh Y.H., Cai J., Tong G.Q., Lim C.A., Robson P., Zhong S. and Ng H.H. A core Klf circuitry regulates self-renewal of embryonic stem cells //Nat Cell Biol. 2008. V. 10. № 3. P. 353-360.

50. Jones S.M. and Kazlauskas A. Growth factor-dependent signaling and cell cycle progression //FEBS Lett. 2001. V. 490. № 3. P. 110-116.

51. Kawasaki H., Eckner R., Yao T.P., Taira K., Chiu R., Livingston D.M. and Yokoyama K.K. Distinct roles of the co-activators p300 and CBP in retinoic-acid-induced F9-cell differentiation //Nature. 1998. V. 393. № 6682. P. 284-289.

52. Kelly K.F., Ng D.Y., Jayakumaran G., Wood G.A., Koide H. and Doble B.W. beta-catenin enhances Oct-4 activity and reinforces pluripotency through a TCF-independent mechanism //Cell Stem Cell. 2011. V. 8. № 2. P. 214-227.

53. Klaus A. and Birchmeier W. Wnt signalling and its impact on development and cancer //Nat Rev Cancer. 2008. V. 8. № 5. P. 387-398.

54. Kleber M. and Sommer L. Wnt signaling and the regulation of stem cell function //Curr Opin Cell Biol. 2004. V. 16. № 6. P. 681-687.

55. Kormish J.D., Sinner D. and Zorn A.M. Interactions between SOX factors and Wnt/beta-catenin signaling in development and disease //Dev Dyn. 2010. V. 239. № l.P. 56-68.

56. Kozar K. and Sicinski P. Cell cycle progression without cyclin D-CDK4 and cyclin D-CDK6 complexes //Cell Cycle. 2005. V. 4. № 3. P. 388-391.

57. Krieghoff E., Behrens J. and Mayr B. Nucleo-cytoplasmic distribution of beta-catenin is regulated by retention //J Cell Sci. 2006. V. 119. № Pt 7. P. 1453-1463.

58. Lianguzova M.S., Chuykin I.A., Nordheim A. and Pospelov V.A. Phosphoinositide 3-kinase inhibitor LY294002 but not serum withdrawal suppresses proliferation of murine embryonic stem cells //Cell Biol Int. 2007. V. 31. № 4. P. 330-337.

59. Lilien J. and Balsamo J. The regulation of cadherin-mediated adhesion by tyrosine phosphorylation/dephosphorylation of beta-catenin //Curr Opin Cell Biol. 2005. V. 17. №5. P. 459-465.

60. Lin C.J., Cencic R., Mills J.R., Robert F. and Pelletier J. c-Myc and eIF4F are components of a feedforward loop that links transcription and translation //Cancer Res. 2008. V. 68. № 13. P. 5326-5334.

61. Lindsley R.C., Gill J.G., Kyba M„ Murphy T.L. and Murphy K.M. Canonical Wnt signaling is required for development of embryonic stem cell-derived mesoderm //Development. 2006. V. 133. № 19. P. 3787-3796.

62. Lluis F., Ombrato L., Pedone E., Pepe S., Merrill B.J. and Cosma M.P. T-cell factor 3 (Tcf3) deletion increases somatic cell reprogramming by inducing epigenome modifications //Proc Natl Acad Sci U S A. 2011. V. 108. № 29. P. 11912-11917.

63. Lluis F., Pedone E., Pepe S. and Cosma M.P. Periodic activation of Wnt/beta-catenin signaling enhances somatic cell reprogramming mediated by cell fusion //Cell Stem Cell. 2008. V. 3. № 5. P. 493-507.

64. Lluis F., Pedone E., Pepe S. and Cosma M.P. The Wnt/beta-catenin signaling pathway tips the balance between apoptosis and reprograming of cell fusion hybrids //Stem Cells. 2010. V. 28. № 11. P. 1940-1949.

65. Lyashenko N., Winter M., Migliorini D., Biechele T., Moon R.T. and Hartmann C. Differential requirement for the dual functions of beta-catenin in embryonic stem cell self-renewal and germ layer formation //Nat Cell Biol. 2011. V. 13. № 7. P. 753-761.

66. Mansukhani A., Ambrosetti D., Holmes G., Cornivelli L. and Basilico C. Sox2 induction by FGF and FGFR2 activating mutations inhibits Wnt signaling and osteoblast differentiation //J Cell Biol. 2005. V. 168. № 7. P. 1065-1076.

67. Marson A., Foreman R., Chevalier B., Bilodeau S., Kahn M., Young R.A. and Jaenisch R. Wnt signaling promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency //Cell Stem Cell. 2008. V. 3. № 2. P. 132-135.

68. Martin G.R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells //Proc Natl Acad Sci USA. 1981. V. 78. № 12. P. 7634-7638.

69. Meijer L., Flajolet M. and Greengard P. Pharmacological inhibitors of glycogen synthase kinase 3 //Trends Pharmacol Sci. 2004. V. 25. № 9. P. 471-480.

70. Miyabayashi T., Teo J.L., Yamamoto M., McMillan M., Nguyen C. and Kahn M. Wnt/beta-catenin/CBP signaling maintains long-term murine embryonic stem cell pluripotency //Proc Natl Acad Sci USA. 2007. V. 104. № 13. P. 5668-5673.

71. Miyanari Y. and Torres-Padilla M.E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog //Nature. 2012. V. 483. № 7390. P. 470-473.

72. Morin P.J. beta-catenin signaling and cancer //Bioessays. 1999. V. 21. № 12. P. 1021-1030.

73. Nelson W.J. and Nusse R. Convergence of Wnt, beta-catenin, and cadherin pathways //Science. 2004. V. 303. № 5663. P. 1483-1487.

74. Nichols J., Silva J., Roode M. and Smith A. Suppression of Erk signalling promotes ground state pluripotency in the mouse embryo //Development. 2009. V. 136. № 19. P. 3215-3222.

75. Nichols J. and Smith A. Naive and primed pluripotent states //Cell Stem Cell. 2009. V. 4. № 6. P. 487-492.

76. Nishihara S., Tsuda L. and Ogura T. The canonical Wnt pathway directly regulates NRSF/REST expression in chick spinal cord //Biochem Biophys Res Commun. 2003. V. 311. № l.P. 55-63.

77. Niwa H. How is pluripotency determined and maintained? //Development. 2007a. V. 134. № 4. P. 635-646.

78. Niwa H. Open conformation chromatin and pluripotency //Genes Dev. 2007b. V. 21. №21. P. 2671-2676.

79. Niwa H., Burdon T., Chambers I. and Smith A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3 //Genes Dev. 1998. V. 12. № 13. P. 2048-2060.

80. Niwa H., Ogawa K., Shimosato D. and Adachi K. A parallel circuit of LIF signalling pathways maintains pluripotency of mouse ES cells //Nature. 2009. V. 460. №7251. P. 118-122.

81. Ogawa K., Nishinakamura R., Iwamatsu Y., Shimosato D. and Niwa H. Synergistic action of Wnt and LIF in maintaining pluripotency of mouse ES cells //Biochem Biophys Res Commun. 2006. V. 343. № 1. P. 159-166.

82. Ombrato L., Lluis F. and Cosma M.P. Regulation of self-renewal and reprogramming by TCF factors //Cell Cycle. 2012. V. 11. № 1. P. 39-47.

83. Otero J.J., Fu W., Kan L., Cuadra A.E. and Kessler J.A. Beta-catenin signaling is required for neural differentiation of embryonic stem cells //Development. 2004. V. 131. № 15. P. 3545-3557.

84. Paling N.R., Wheadon H., Bone H.K. and Welham M.J. Regulation of embryonic stem cell self-renewal by phosphoinositide 3-kinase-dependent signaling //J Biol Chem. 2004. V. 279. № 46. P. 48063-48070.

85. Panopoulos A.D. and Izpisua Belmonte J.C. Anaerobicizing into pluripotency //Cell Metab. 2011. V. 14. № 2. P. 143-144.

86. Pesce M. and Scholer H.R. Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development //Stem Cells. 2001. V. 19. № 4. P. 271-278.

87. Pinto D., Gregorieff A., Begthel H. and Clevers H. Canonical Wnt signals are essential for homeostasis of the intestinal epithelium //Genes Dev. 2003. V. 17. № 14. P. 1709-1713.

88. Rahl P.B., Lin C.Y., Seila A.C., Flynn R.A., McCuine S., Burge C.B., Sharp P.A. and Young R.A. c-Myc regulates transcriptional pause release //Cell. 2010. V. 141. № 3. P. 432-445.

89. Rohwedel J., Guan K. and Wobus A.M. Induction of cellular differentiation by retinoic acid in vitro //Cells Tissues Organs. 1999. V. 165. № 3-4. P. 190-202.

90. Rossant J. Stem cells and early lineage development //Cell. 2008. V. 132. № 4. P. 527-531.

91. Silva J., Barrandon O., Nichols J., Kawaguchi J., Theunissen T.W. and Smith A. Promotion of reprogramming to ground state pluripotency by signal inhibition //PLoS Biol. 2008. V. 6. № 10. P. e253.

92. Silva J., Chambers I., Pollard S. and Smith A. Nanog promotes transfer of pluripotency after cell fusion //Nature. 2006. V. 441. № 7096. P. 997-1001.

93. Silva J. and Smith A. Capturing pluripotency //Cell. 2008. V. 132. № 4. P. 532-536.

94. Singh S.K., Kagalwala M.N., Parker-Thornburg J., Adams H. and Majumder S. REST maintains self-renewal and pluripotency of embryonic stem cells //Nature. 2008. V. 453. № 7192. P. 223-227.

95. Smith A.G. Embryo-derived stem cells: of mice and men //Annu Rev Cell Dev Biol. 2001. V. 17. № P. 435-462.

96. Smith A.G., Heath J.K., Donaldson D.D., Wong G.G., Moreau J., Stahl M. and Rogers D. Inhibition of pluripotential embryonic stem cell differentiation by purified polypeptides //Nature. 1988. V. 336. № 6200. P. 688-690.

97. Stead E., White J., Faast R., Conn S., Goldstone S., Rathjen J., Dhingra U., Rathjen P., Walker D. and Dalton S. Pluripotent cell division cycles are driven by ectopic Cdk2, cyclin A/E and E2F activities //Oncogene. 2002. V. 21. № 54. P. 8320-8333.

98. Takahashi K., Mitsui K. and Yamanaka S. Role of ERas in promoting tumour-like properties in mouse embryonic stem cells //Nature. 2003. V. 423. № 6939. P. 541545.

99. Takahashi K. and Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors //Cell. 2006. V. 126. № 4. P. 663-676.

100. Takao Y., Yokota T. and Koide H. Beta-catenin up-regulates Nanog expression through interaction with Oct-3/4 in embryonic stem cells //Biochem Biophys Res Commun. 2007. V. 353. № 3. P. 699-705.

101. Thiery J.P., Acloque H., Huang R.Y. and Nieto M.A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease //Cell. 2009. V. 139. № 5. P. 871-890.

102. Toyooka Y., Shimosato D., Murakami K., Takahashi K. and Niwa H. Identification and characterization of subpopulations in undifferentiated ES cell culture //Development. 2008. V. 135. № 5. P. 909-918.

103. Umehara H., Kimura T., Ohtsuka S., Nakamura T., Kitajima K., Ikawa M., Okabe M., Niwa H. and Nakano T. Efficient derivation of embryonic stem cells by inhibition of glycogen synthase kinase-3 //Stem Cells. 2007. V. 25. № 11. P. 27052711.

104. Wang J. and Wynshaw-Boris A. The canonical Wnt pathway in early mammalian embryogenesis and stem cell maintenance/differentiation //Curr Opin Genet Dev. 2004. V. 14. №5. P. 533-539.

105. Willert K. and Jones K.A. Wnt signaling: is the party in the nucleus? //Genes Dev. 2006. V. 20. № 11. P. 1394-1404.

106. Wohrle S., Wallmen B. and Hecht A. Differential control of Wnt target genes involves epigenetic mechanisms and selective promoter occupancy by T-cell factors //Mol Cell Biol. 2007. V. 27. № 23. P. 8164-8177.

107. Wray J. and Hartmann C. WNTing embryonic stem cells //Trends Cell Biol. 2012. V. 22. №3. P. 159-168.

108. Wu B., Crampton S.P. and Hughes C.C. Wnt signaling induces matrix metalloproteinase expression and regulates T cell transmigration //Immunity. 2007. V. 26. № 2. P. 227-239.

109. Yamada Y., Aoki H., Kunisada T. and Hara A. Rest promotes the early differentiation of mouse ESCs but is not required for their maintenance //Cell Stem Cell. 2010. V. 6. № l.P. 10-15.

110. Yi F., Pereira L., Hoffman J.A., Shy B.R., Yuen C.M., Liu D.R. and Merrill B.J. Opposing effects of Tcf3 and Tcfl control Wnt stimulation of embryonic stem cell self-renewal //Nat Cell Biol. 2011. V. 13. № 7. P. 762-770.

111. Yi F., Pereira L. and Merrill B.J. Tcf3 functions as a steady-state limiter of transcriptional programs of mouse embryonic stem cell self-renewal //Stem Cells. 2008. V. 26. № 8. P. 1951-1960.

112. Ying Q.L., Nichols J., Chambers I. and Smith A. BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3 //Cell. 2003. V. 115. № 3. P. 281-292.

113. Ying Q.L., Wray J., Nichols J., Batlle-Morera L., Doble B., Woodgett J., Cohen P. and Smith A. The ground state of embryonic stem cell self-renewal //Nature. 2008. V. 453. №7194. P. 519-523.

114. Young R.A. Control of the embryonic stem cell state //Cell. 2011. V. 144. № 6. P. 940-954.

115. Сердечно благодарю мою семью и друзей, поддержка которых очень много для меня значит.

Информация о работе

Синева, Галина Сергеевна
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Адгезионная и транскрипционная функции β-катенина в самообновлении эмбриональных стволовых клеток мыши - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы