Взаимодействие малого белка теплового шока HSPB6 с универсальным адаптерным белком 14-3-3

Судницына, Мария Викторовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие малого белка теплового шока HSPB6 с универсальным адаптерным белком 14-3-3
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие малого белка теплового шока HSPB6 с универсальным адаптерным белком 14-3-3"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Судницына Мария Викторовна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МАЛОГО БЕЛКА ТЕПЛОВОГО ШОКА НБРВб С УНИВЕРСАЛЬНЫМ АДАПТЕРНЫМ БЕЛКОМ 14-3-3

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2012

2 9 НОЯ 2012

005056043

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.ВЛомоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Гусев Николай Борисович

Официальные оппоненты: Муронец Владимир Израилевич

доктор биологических наук, профессор, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова, зав. отделом биохимии животной клетки Воротников Александр Вячеславович

кандидат биологических наук, Институт экспериментальной кардиологии Федерального государственного учреждения «Российский кардиологический производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Защита состоится 10 декабря 2012 года в 15 часов 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, биологический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан « » ноября 2012 года.

диссертационного совета

Ученый секретарь

Медведева Марина Валерьевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В группу малых белков теплового шока объединяют белки с небольшой молекулярной массой от 12 до 43 кДа, обнаруженные во всех организмах от архей до млекопитающих [1, 2]. Общим свойством белков этой группы является наличие в их структуре так называемого а-кристаллинового домена, расположенного в С-концевой части молекулы белка [3]. Этот домен имеет преимущественно (3-складчатую структуру и принимает участие в образовании димеров, которые являются строительными блоками при образовании крупных олигомерных комплексов, характерных для большинства малых белков теплового шока [4].

Основной функцией малых белков теплового шока является предотвращение агрегации частично денатурированных белков [1, 2, 4]. Связывая такие белки-субстраты, малые белки теплового шока способны передавать их либо на АТР-зависимые шапероны для последующего рефолдинга, либо ускорять процесс их протеолитической деградации в протеасомах или аутофагосомах [2, 5]. В настоящее время обнаружено 10 генов, кодирующих различные малые белки теплового шока человека [2, 4]. Одним из этих белков является малый белок теплового шока с кажущейся молекулярной массой 20 кДа, получивший обозначение №рВ6 или Нвр20. Этот белок экспрессируется практически во всех тканях, особенно большие количества этого белка обнаружены в различных типах мышц [2, 6]. Как и все малые белки теплового шока, №рВ6 обладает шапероноподобной активностью и связывает частично денатурированные белки, препятствуя их дальнейшей агрегации [7]. Помимо этого, НврВб играет важную роль в регуляции расслабления гладкой мускулатуры, обладает кардиопротекторными свойствами, а также, вероятно, принимает участие в процессах агрегации тромбоцитов и регуляции инсулин-зависимого транспорта глюкозы в мышечных клетках [2, 8]. По крайней мере отчасти такая полифункциональность может быть обусловлена тем, что №рВ6 является партнером универсального белка-адаптера 14-3-3, вовлеченного в регуляцию многочисленных и разнообразных внутриклеточных процессов [9, 10].

Белки семейства 14-3-3 найдены практически во всех эукариотических организмах, в организме человека экспрессируется 7 изоформ этого белка [11]. Эти белки представляют собой стабильные гомо- и гетеродимеры; считается, что димерная структура необходима для их эффективного функционирования [12]. Белки 14-3-3 преимущественно связывают

Синеок сокращений: БСА - бычий сывороточный альбумин, МЭ - p-меркаптоэтанол, ФМСФ -фенилметилсульфонилфторид, ЭДТА - этилендиаминтетраацетат, АТР — аденозинтрифосфат, сАМР — циклический аденозинмонофосфат, IgG - иммуноглобулины класса G, pHspB6 - фосфорилированный HspB6, SDS - додецилсульфат натрия, WT - белок дикого типа.

фосфорилированные белки-мишени и, таким образом, оказывают влияние на их активность, внутриклеточную локализацию и взаимодействие с другими партнерами. К настоящему времени описано более 300 потенциальных белков-мишеней 14-3-3 [13]. Взаимодействуя с таким большим количеством партнеров, 14-3-3 принимает участие во множестве различных процессов, таких как регуляция апоптоза, клеточного цикла, транскрипции, функционирования ионных каналов и переносчиков, организации цитоскелета [14]. 14-3-3 не только преимущественно взаимодействует с фосфорилированными белками-партнерами, но и сам может подвергаться фосфорилированию in vivo. Фосфорилирование Ser58, Serl84 и Thr232 может влиять на структуру и свойства 14-3-3, а также на его взаимодействие с белками-мишенями [15].

Запуск различных сигнальных каскадов в клетке приводит к активации циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ, которые фосфорилируют HspB6 по остатку Serió, окружение которого соответствует мотиву RXX(pS/pT)XP, узнаваемому 14-3-3 [16]. Фосфорилированный HspB6 приобретает способность взаимодействовать с 14-3-3. Высказывается предположение, что взаимодействие HspB6 с 14-3-3 может лежать в основе механизма регуляции расслабления гладких мышц. Согласно гипотезе Брофи и соавт. [9, 17], фосфорилированный HspB6 способен вытеснять фосфорилированный кофилин из комплекса с 14-3-3. Освободившийся кофилин подвергается быстрому дефосфорилированию, активируется и способствует деполимеризации актина, что приводит к расслаблению гладких мышц. Учитывая тот факт, что концентрация HspB6 в мышцах достаточно высока, можно предположить, что фосфорилированный HspB6 может эффективно конкурировать со многими белками-партнерами 14-3-3 и тем самым опосредованно участвовать в регуляции многочисленных внутриклеточных процессов. В этой связи представлялось целесообразным провести подробное исследование взаимодействия HspB6 с 14-3-3, изучить влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3, на его способность связывать HspB6, а также проанализировать влияние HspB6 на взаимодействие 14-3-3^ с фосфорилированным кофилином.

Цель и задачи работы. Целью данной работы был подробный анализ взаимодействия HspB6 с 14-3-3^ дикого типа, его мутантами, имитирующими фосфорилирование, а также мутантами, препятствующими димеризации. Помимо этого целью работы была проверка гипотезы о том, что HspB6 регулирует расслабление гладких мышц, вытесняя фосфорилированный кофилин из его комплекса с 14-3-3. В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:

1. Используя различные методы, исследовать взаимодействие HspB6 с 14-3-3¡¡ дикого типа in vitro.

2. Проанализировать влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-З-ЗС, на его способность связывать ШрВб.

3. Исследовать взаимодействие НврВб с мутантными формами 14-3-3, не способными образовывать димеры.

4. Изучить влияние фосфорилированного ШрВб на взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным кофилином.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Фосфорилирование протеинкиназой А резко увеличивает прочность взаимодействия ШрВб с 14-3-3^ дикого типа, при этом образуется комплекс ШрВ6/14-3-3 со стехиометрией 1:2 или 2:2.

2. Мутации, имитирующие фосфорилирование, влияют на взаимодействие 14-3-3 с ШрВб. При этом мутация 8184Е немного увеличивает, а мутация Б58Е значительно ослабляет взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным ШрВб.

3. Мутации, предотвращающие димеризацию, не ослабляют взаимодействия 14-3-3 с ШрВб. Образующийся комплекс ШрВб/мономерный 14-3-3 имеет стехиометрию 1:1.

4. 14-3-3^ не способен образовывать прочных комплексов с кофилином, фосфорилированным ЫМ-киназой.

Научная новизна и практическая ценность работы. Методами нативного электрофореза, химического «сшивания», иммунопреципитации и гель-фильтрации исследовано взаимодействие фосфорилированного НврВб с 14-3-3^ дикого типа и его мутантными формами, имитирующими фосфорилирование по остаткам 8ег58 (Э58Е), Эсг184 (3184Е), ТЬг232 (Т232Е). Изучено взаимодействие фосфорилированного ШрВб с мутантными формами 14-3-3 12ЬАЕ14—12СКЗК.14 (\VM\V) и Е5-»К5, 12ЬАЕ14-*12(3(21114 (MMW), не способными к димеризации.

Установлено, что фосфорилированный НярВб образует прочные комплексы с димером 14-3-3 дикого типа, стехиометрия которых составляет 1:2 или 2:2. Обнаружено, что мутации, имитирующие фосфорилирование 14-3-3, влияют на его взаимодействие с НврВб. Мутация Э184Е немного увеличивает прочность комплекса 14-3-3 с НврВб, что является редким примером того, что фосфорилирование усиливает взаимодействие 14-3-3 с белком-партнером. Мутация Т232Е немного ослабляет прочность взаимодействия 14-3-3 с НэрВб, что согласуется с данными литературы, свидетельствующими о том, что фосфорилированный С-конец может конкурировать с белками-мишенями за связывание с субстрат-связывающим участком 14-3-3. Мутация 858Е, приводящая к частичной диссоциации димеров и влияющая на структуру 14-3-3, ухудшает его взаимодействие с

HspB6. Таким образом, регуляция взаимодействия HspB6 с 14-3-3£ может осуществляться путем фосфорилирования 14-3-3.

Проанализировано связывание HspB6 с мутантными формами 14-3-3, не способными образовывать димеры. Установлено, что мономерные му-ганты (так же как и белок дикого типа) избирательно взаимодействуют только с фосфорилированным HspB6, образуя прочные комплексы со стехиометрией 1:1.

Методами вестерн-блоттинга, нативного электрофореза, химического «сшивания» и гель-фильтрации установлено, что вне зависимости от фосфорилирования кофилин не способен взаимодействовать с 14-3-3. Установлено, что 14-3-3 не влияет на связывание кофилина с F- и G-актином. Таким образом, полученные данные опровергают высказанную в литературе гипотезу о том, что кофилин и 14-3-3 прочно взаимодействуют друг с другом и что фосфорилированный HspB6 может вытеснять кофилин из комплекса с 14-3-3 и, таким образом, регулировать расслабление гладких мышц. Тем не менее, представленные данные не исключают возможности опосредованного участия 14-3-3 и HspB6 в регуляции цитоскелета. Индуцированное действием гормонов увеличение концентрации фосфорилированного HspB6 в клетке может приводить к вытеснению из комплексов с 14-3-3 различных протеинкиназ (LIM-, TES-киназы) или протеинфосфатаз (Slingshot), участвующих в фосфорилировании/дефосфорилировании кофилина. Освободившиеся

протеинкиназы/протеинфосфатазы могут влиять на степень фосфорилирования кофилина, следствием чего может стать реорганизация цитоскелета и последующее расслабление. Исследования механизма действия фосфорилированного HspB6 на гладкую мускулатуру могут иметь важное практическое значение в сердечно-сосудистой хирургии и при разработке препаратов для лечения бронхиальной астмы.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международной конференции «Biological motility: fundamental and applied science» (Пущино 2012), на IV съезде биофизиков России (Нижний Новгород 2012).

Публикации. По материалам исследования опубликовано 4 печатные работы в рецензируемых журналах и 2 тезиса сообщений.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 119 страницах и включает 39 рисунков и 3 таблицы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Выделение белков. HspB6, кофилин-1 и кофилин-2 человека, мутанты кофилина, имитирующие фосфорилирование (S3D), а также каталитический домен LIM-киназы экспрессировали в клетках E.coli штамма BL21(DE3)pLysS. Плазмиды, содержащие кДНК HspB6 и кофилинов, были любезно предоставлены к.б.н. A.C. Сейт-Неби. Мутантные формы кофилина были получены на основе кДНК белка дикого типа с помощью мутантных праймеров. Плазмида, несущая последовательность каталитического домена LIM-киназы, была любезно предоставлена доктором Г. Бокочем (Исследовательский институт Скриппс, Ла-Йолла, Калифорния, США). При выделении HspB6 использовали методы фракционирования сульфатом аммония, ионообменной хроматографии на Q-Sepharose и гидрофобной хроматографии на Phenyl-Sepharose. Очистку кофилина проводили с помощью фракционирования сульфатом аммония с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex 200. Частично очищенный каталитический домен LIM-киназы, содержащий последовательность из 8 гистидинов на С-конце, получали путем хроматографии бактериального лизата на колонке HisTrapHP. Рекомбинантный 14-3-3 дикого типа и его мутантные формы были любезно предоставлены к.б.н. H.H. Случанко. Рекомбинантная каталитическая субъединица протеинкиназы А была любезно предоставлена Е.В. Мымриковым. Рекомбинантный каталитический фрагмент киназы РАК1 был любезно предоставлен к.б.н. А.Ю. Хапчаевым. Актин выделяли из ацетонового порошка из мышц кролика по методу Парди и Спудич [18].

Фосфорилирование белков проводили в буфере Ф, содержащем 20 мМ трис/НС1, 15 мМ КН2РО4, pH 7,5, 3,5 мМ MgCb, 14 мМ меркаптоэтанола (МЭ), 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) и 0,1-0,15 мМ АТР, содержащей следовые количества [у-32Р]-АТР. В случае HspB6 реакцию начинали добавлением каталитической субъединицы протеинкиназы А и инкубировали реакционную смесь в течение 1 ч при 37°С. В случае кофилина каталитический домен LIM-киназы предварительно активировали в среде фосфорилирования с каталитическим фрагментом РАК-киназы, после чего начинали реакцию, внося кофилин и и инкубировали реакционную смесь в течение 2 ч

при 37°С. Для контроля включения радиоактивного фосфата во время инкубации отбирали аликвоты из реакционной среды, наносили их на фильтры Whatman ЗММ, отмывали в 10% растворе трихлоруксусной кислоты и определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике Rackbeta 1214 (LKB). Степень фосфорилирования HspB6 и кофилина составляла -0.6-0.8 моль фосфата на моль белка.

Химическое сшивание проводили в буфере С (25 мМ трис/HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl,

14 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ), содержащем 0,05% глутарового альдегида. Пробы инкубировали

15 мин при 37°С, после чего реакцию останавливали добавлением 4-кратного буфера для образцов, содержащего додецилсульфат натрия (SDS). Белковый состав проб анализировали методом SDS-электрофореза в градиентном 5-20% полиакриламидном геле. Окрашенные Кумасси R-250 гели сканировали и интенсивность пятен обсчитывали с помощью программы ImageJ. Высушенные гели подвергали авторадиографии.

Нативный электрофорез по методу Шауба и Перри [19] был использован для анализа взаимодействия HspB6 и кофилина с 14-3-3. В случае HspB6 и 14-3-3 буфер для образцов, разделяющий и концентрирующий гели, а также электродный буфер содержали 1 мМ MgCl2. Смесь исследуемых белков наносили на 18% полиакриламидный гель и проводили электрофорез в течение 18 ч. В случае кофилина и 14-3-3 использовали 15% гель и электрофорез проводили в течение 2,5 ч. Для исследования взаимодействия кофилина с G-актином использовали метод нативного электрофореза [20]. Смесь G-актина, кофилина и 143-3 наносили на 10% полиакриламидный гель, содержащий 0,2 мМ АТР и 0,2 мМ СаСЬ. Электродный буфер также содержал 0,2 мМ АТР и 0,2 мМ СаСЬ-

Гель-Фильтрацию изолированных HspB6, 14-3-3 и кофилина, а также их смесей проводили на колонке Superdex 200 в буфере Г, содержащем 20 мМ трис/ацетат, рН 7,6, 150 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 14 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ. Полученные фракции анализировали методом SDS-электрофореза в 15% полиакриламидном геле. В случае если HspB6 или кофилин содержали радиоактивный фосфат, радиоактивность фракций определяли на сцинтилляционном счетчике Rackbeta 1214 (LKB). Для определения молекулярной массы образующихся комплексов колонку предварительно калибровали по белкам-стандартам с известной молекулярной массой.

Иммунопреципитацию комплексов HspB6 с 14-3-3 проводили с использованием моноклональных антител на HspB6 человека, предварительно иммобилизованных на BrCN-активированной сефарозе. Антитела были любезно предоставлены д.б.н. А.Г. Катрухой. Иммобилизованные антитела добавляли к пробе, содержащей HspB6 и 14-3-3 в буфере И (20 мМ трис/ацетат, рН 7,6, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ, 2 мг/мл БСА) и инкубировали в течение 30 мин при 25°С при постоянном перемешивании. Сефарозу промывали несколько раз, осаждали центрифугированием и элюировали связавшиеся белки денатурирующим буфером для образцов, не содержащим МЭ. Сефарозу отделяли центрифугированием, а к полученным образцам добавляли МЭ и анализировали их состав методом SDS-электрофореза в 15% полиакриламидном геле. После окраски и отмывки гели подвергали количественному сканированию.

Метод наслаивания (overlay) использовали для анализа взаимодействия кофилина и HspB6 с 14-3-3, иммобилизованным на нитроцеллюлозной мембране. На мембрану наносили 1, 2 и 4 мкг 14-3-3 дикого типа. В первом случае мембраны инкубировали в буфере Т (20 мМ трис/HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% TWEEN20), содержащем 3% БСА и 0,4 мг/мл фосфорилированных в присутствии [у-32Р]-АТР кофилина или HspB6, в течение ночи при 4°С. По окончании инкубации мембраны отмывали и подвергали авторадиографии. Во втором случае после сорбции 14-3-3 мембраны блокировали 5% раствором сухого молока, после чего инкубировали в течение ночи в буфере Т, содержащем 0,4 мг/мл фосфорилированного или нефосфорилированного кофилина. Мембраны отмывали и наличие кофилина на мембране определяли с помощью моноклональных антител на кофилин (Cell Signalling). Конъюгат вторичных антител с пероксидазой хрена был любезно предоставлен д.б.н. А.Г. Катрухой. Для детекции сигнала использовали набор Supersignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific).

Метод коседиментации использовали для анализа взаимодействия кофилина с F-актином. К предварительно полимеризованному актину добавляли кофилин и 14-3-3, инкубировали 30 мин при 25°С и подвергали ультрацентрифугированию. Белковый состав осадка и супернатанта анализировали методом SDS-электрофореза. После окраски и отмывания проводили количественное денситометрирование гелей.

Результаты и их обсуждение

Взаимодействие HspB6 с 14-З-ЗС и влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование

14-3-3, на это взаимодействие Ранее в лаборатории Брофи [9] и в нашей группе [10] было установлено, что фосфорилированный малый белок теплового шока HspB6 является партнером 14-3-3. Регуляция этого взаимодействия может осуществляться как посредством фосфорилирования HspB6, так и посредством фосфорилирования 14-3-3. Используя точечные мутации S58E, S184E, Т232Е, а также тройную мутацию ЗЕ, где все указанные остатки серина и треонина были заменены на глутамат, мы имитировали процесс фосфорилирования 14-3-3^ и анализировали влияние этих мутаций на взаимодействие 14-3-3 с HspB6.

Для исследования взаимодействия двух белков мы использовали метод химического «сшивания». Исследуемые белки инкубировали с глутаровым альдегидом и анализировали состав проб методом SDS-электрофореза. Если обработке глутаровым альдегидом подвергались изолированные белки, то на электрофореграмме удавалось выявить полосы, соответствующие мономерам и димерам HspB6 (рис.1 А, дорожка 1) и мономерам и димерам

О S-юо

л 1

Î -9- 80 о M

0 J,

1 ■? 60

§ S

S.40

14-3-3 (рис.1А, дорожка 2). Указанные полосы были обнаружены и в случае, когда химическому «сшиванию» подвергали смесь нефосфорилированного НврВб и 14-3-3 данные не представлены). Эти результаты полностью согласуются с данными литературы и

свидетельствуют о том, что нефосфорилированный НврВб не взаимодействует с 14-3-3. Если «сшиванию» глутаровым альдегидом подвергали смесь фосфорилированного НэрВб и различных форм 14-3-3, то на электрофореграммах удавалось выявить три дополнительные полосы (рис.1 А, дорожки 3-7). В том случае, если в опыте использовался НврВб, фосфорилированный в присутствии [у-32Р]-АТР, оказалось, что все три указанных дополнительных полосы содержат радиоактивный фосфат. Кроме того, появление указанных полос коррелировало с уменьшением интенсивности полосы димера 14-3-3. Все эти данные позволили заключить, что указанные полосы действительно соответствуют комплексам, образованным фосфорилированным №рВ6 и 14-3-3.

Определив кажущиеся молекулярные массы «сшитых» комплексов и зная кажущиеся молекулярные массы ШрВб и 143-3, можно сделать предварительное заключение о стехиометрии образующихся комплексов. Полоса с кажущейся молекулярной массой 48 кДа, вероятно, соответствует комплексу, образованному мономером ШрВб и мономером 14-3-3. Интенсивность этой полосы не зависела от мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3. Полосы с кажущимися молекулярными массами 80 и 100 кДа, по всей видимости, соответствуют комплексам, образованным мономером НврВб и димером 143-3 и димером НврВб и димером 14-3-3, соответственно. Интенсивность этих полос, а также сумма интенсивностей этих двух полос зависела от мутаций 14-3-3, имитирующих фосфорилирование (рис.1 Б). Оказалось, что суммарная интенсивность двух указанных полос уменьшается в ряду 8184Е>1ЛТ=Т232Е>ЗЕ>858Е. Представленные данные означают, что

о WT S58E S184E T232E ЗЕ

Рис.1. Химическое «сшивание»

фосфорилированного HspB6 и различных форм 14-3-3. А. Электрофореграмма «сшитых» глутаровым альдегидом изолированного HspB6 (1), изолированного 14-3-3 (2), смесей фосфорилированного HspB6 с 14-3-3 дикого типа (3) и с его мутантами S58E (4), S184E (5), Т232Е (6), ЗЕ (7). Стрелками указано положение мономеров и димеров HspB6 и 14-3-3, а также «сшитых» комплексов и маркеров молекулярных масс. Б. Суммарные интенсивности зон комплексов со стехиометрией 14-3-3/HspB6 2:1 и 2:2.

мутация 8184Е увеличивает, а мутация 858Е уменьшает вероятность «сшивания» 14-3-3 с фосфорилированным ШрВб.

Сходные результаты были получены при использовании метода нативного электрофореза. При проведении нативного электрофореза при щелочных значениях рН кислые белки (такие как НврВб и 14-3-3) несут значительный отрицательный заряд, что ведет к дестабилизации взаимодействия между ними. Вероятно, именно поэтому мы не смогли выявить образования комплексов между 14-3-3 и фосфорилированным НврВб в

немодифицированной системе Шауба-Перри. Если нативный электрофорез проводили в присутствии 1 мМ Г^С12, то на гелях удавалось выявить полосы,

электрофоретическая подвижность которых отличалась от подвижности полос изолированного 14-3-3 (рис.2, дорожки 1-5) или изолированного фосфорилированного ШрВб, мигрирующего, по-видимому, в двух конформациях (рис.2, дорожка б). Появление указанных полос сопровождалось ослаблением интенсивности полос, соответствующих изолированным белкам (рис.2, дорожки 7-11), что позволяло предположить, что указанные полосы соответствуют комплексам, образованным двумя белками. Для подтверждения этого предположения указанные полосы вырезали из геля, экстрагировали из них белки и анализировали белковый состав методом БОЗ-электрофореза с последующей окраской серебром. Оказалось, что в составе полученного экстракта присутствовали как НврВб, так и 14-3-3 (данные не представлены), что позволяет утверждать, что указанные полосы действительно соответствуют комплексам, образованным НврВб и 14-3-3. Как видно на рис.2, эти полосы обладают различной электрофоретической подвижностью, которая увеличивается в ряду S184E<WT<T232E<S58E<3E. В нативных условиях электрофоретическая подвижность зависит от заряда, формы и молекулярной массы исследуемых белков или их комплексов. Если принять, что для точечных мутантов 143-3 заряд и форма комплексов, образуемых ими с НврВб, является более-менее постоянной величиной, то подвижность будет преимущественно зависеть от молекулярной массы, и поэтому более прочные комплексы 14-3-3 с ШрВб будут обладать наименьшей электрофоретической подвижностью. Таким образом, анализируя результаты нативного

14-3-3 рНэрВб

10 11

Рис.2. Нативный электрофорез изолированного 143-3 дикого типа (1), его мутантов 858Е (2), й 184Н (3), Т232Е (4), ЗЕ (5), изолированного фосфорилированного НзрВб (6) и смесей фосфорилированного НэрВб с 14-3-3 дикого типа (7) и с его мутантами 858Е (8), 8184Е (9), Т232Е (10), ЗЕ (11). Стрелками помечено положение изолированных белков и образующихся комплексов.

кДа

67-»

43-

зо-2014-

- БСА

- 1дв

-14-3-3 " |до -рНврВб

Рис.3. Иммунопреципитация 14-3-3 дикого типа (1) и его мутантов в58Е (2), 8184Е (3), Т232Е (4) и ЗЕ (5) с фосфорилированным НврВв. Контроль на неспецифическую сорбцию 14-3-3 на сефарозе с иммобилизованными антителами (6). Стрелками отмечено положение ШрВб, 143-3, БСА, легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов и маркеров

молекулярных масс.

электрофореза, можно сделать вывод, что мутация 8184Е увеличивает, а мутация 858Е значительно уменьшает сродство 14-3-3 к фосфорилированному ШрВб.

Это заключение было подтверждено методом иммунопреципитации.

Фосфорилированный №рВ6 инкубировали с 14-33 дикого типа или его точечными мутантами в присутствии моноклональных антител на ШрВб, иммобилизованных на сефарозе. Аффинный сорбент тщательно отмывали, белки, связавшиеся с сефарозой, элюировали буфером для образцов и состав проб анализировали методом ЗОЭ-электрофореза (рис.3). Как видно на рис.3, с НэрВб связывается значительное количество 14-3-3 дикого типа и мутанта 8184Е, тогда как количество мутантов Т232Е, Б58Е и ЗЕ, связавшихся с ШрВб, заметно ниже. Интенсивность зоны 14-3-3, соосаждающегося с фосфорилированным НврВб, убывает в ряду 8184Е>\УТ>Т232Е>858Е=;ЗЕ.

Стехиометрию комплексов, образующихся между фосфорилированным НврВб и 14-33, анализировали методом гель-фильтрации. Вне зависимости от фосфорилирования изолированный ШрВб элюировался в виде симметричного пика с объемом элюции ~ 14,7 мл, а изолированный 14-3-3 - в виде пика с объемом элюции ~13,9 мл (рис.4А). Если на колонку наносили смесь нефосфорилированного НэрВб и 14-3-3, то на профиле элюции были выявлены только два пика с объемами элюции, полностью совпадающими с объемами элюции изолированных белков (данные не приведены). В том случае, если на колонку наносили смесь фосфорилированного ШрВб и 14-3-3, то на профиле элюции появлялся асимметричный пик с максимумом -13,5 мл и небольшим «плечом» -14,7 мл (рис.4А). Анализ белкового состава полученных фракций методом 8Б8-электрофореза показал, что в основном пике элюировался комплекс 14-3-3 и НврВб, а в плече - оставшийся несвязанным НврВб. Откалибровав колонку по белкам-стандартам, мы определили кажущиеся молекулярные массы изолированных белков и комплекса, образованного ими. Оказалось, что кажущаяся молекулярная масса изолированного 14-3-3, составляет -85 кДа (что несколько больше ожидаемой молекулярной массы димера 14-3-3, равной 60 кДа), а молекулярная масса изолированного №рВ6 составляет -50 кДа (что соответствует молекулярной массе димера НврВб). Молекулярная масса комплекса, образованного двумя белками, составляет 110-120 кДа, что может соответствовать комплексу, состоящему из димера 14-3-3 и

100-

80- рНэрВвн- / 14-3-3 \ / V'« ^ 14-3-3

< 60 Е / \ \

8 40 < I \ , рНврВб 1 /

20 0

мономера №рВ6 (85 кДа+25 кДа), либо комплексу, состоящему из димера 14-3-3 и димера НврВб (85 кДа+50 кДа).

Если на колонку наносили смесь НврВб и 8184Е мутанта 14-3-3, то пик, соответствующий комплексу, сдвигался влево, в область больших молекулярных масс, а

«плечо», соответствующее свободному НврВб, уменьшалось по амплитуде (рис. 4Б). Это может свидетельствовать об образовании более прочного комплекса по сравнению с 14-3-3 дикого типа. В том случае, если на колонку наносили смесь №рВ6 и мутантов Б58Е, Т232Е, ЗЕ, то пик, соответствующий комплексу, сдвигался вправо, в сторону меньших молекулярных масс, а амплитуда «плеча» несколько возрастала (рис.4Б). Это свидетельствует об ослаблении взаимодействия НврВб с указанными мутантами 14-3-3. К такому же заключению можно прийти, анализируя распределение радиоактивного фосфата, связанного с фосфорилированным НэрВб, по профилю элюции. Если на колонку наносили смесь фосфорилированного НэрВб и 8184Е мутанта 14-3-3, то количество 32Р в пике,

13 14 15

Объем элюции, мл 13 14 15

рН5рВ6+

ИТ

1' п рНгрВ5+

. 1 V, ^ Э58Е

рн$рвб+ ./;

5184Е\;/' \\ рНэрВб

38 40 42 44 46 48 50 52

Номера фракций 38 40 42 44 46 48 50 52

ш 100

£ го

| 50 «

го О.

рНзрВ6+ Э184Е \ рНэрВ6+ \ Б58Е / \ / 1 \ рнэрве

рНгрВв + ИТ \ 1 щ О V

Рис.4. Анализ взаимодействия

фосфорилированного НврВб с 14-3-3 методом гель-фильтрации. А. Профиль элюции изолированных 14-3-3 и фосфорилированного НврВб и эквимолярной смеси двух белков. Б. Профили элюции изолированного фосфорилированного НБрВб и его смеси с 143-3 дикого типа и его мутантами Б58Е и 5184Е. В. Распределение радиоактивности по профилям элюции, представленным на панели Б.

соответствующем комплексу НэрВб/М-З-З, было больше, чем количество 32Р в пике, соответствующем изолированному НврВб. Соотношение указанных пиков менялось на противоположное, если на колонку наносили смесь фосфорилированного НэрВб и 858Е, Т232Е или ЗЕ мутантов 14-3-3 (рис.4В). Измеряя радиоактивность в пике остающегося свободным НэрВб, или измеряя амплитуду пика остающегося свободным НврВб, мы могли определить прочность комплексов, образуемых фосфорилированным НэрВб с различными мутантами 14-3-3. Оказалось, что амплитуда

пика свободного НврВб возрастает в ряду S184E<WT<T232E<S58E<3E. Таким образом, в хорошем согласии с ранее представленными данными, результаты гель-фильтрации свидетельствуют о том, что мутация 8184Е увеличивает, а мутации Т232Е и 858Е ослабляют взаимодействие 14-3-3 с №рВ6.

Данные литературы свидетельствуют о том, что фосфорилирование по остатку 8ег58 или мутации, имитирующие фосфорилирование этого участка, вызывают частичную диссоциацию димеров 14-3-3 [21, 22]. Кроме того, фосфорилирование этого остатка вызывает ослабление взаимодействия 14-3-3 с некоторыми белками-партнерами [23]. Полученные нами результаты также свидетельствуют о том, что мутация 858Е значительно ослабляет взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным НкрВб. Такой эффект мутации может быть вызван двумя причинами: частичным нарушением димерной структуры 14-3-3 или изменением структуры 14-3-3 вблизи амфипатической бороздки, обеспечивающей связывание белка-субстрата. Второе объяснение кажется нам более вероятным, поскольку в выбранных нами условиях 858Е представлен преимущественно в виде димера, о чем свидетельствуют данные гель-фильтрации.

8ег184 располагается в непосредственной близости от места связывания белков-партнеров 14-3-3 [24], и по данным литературы фосфорилирование этого остатка также может приводить к диссоциации комплексов 14-3-3 с некоторыми белками-партнерами [25]. В то же время, полученные нами результаты свидетельствуют о том, что мутации, имитирующие фосфорилирование этого остатка, могут сопровождаться увеличением (а не уменьшением) прочности комплексов, образуемых 14-3-3 с одним из белков-партнеров. Если принять во внимание достаточно высокие концентрации НврВб в некоторых клетках, то фосфорилирование 14-3-3 по Яег184 может вызвать быстрое вытеснение некоторых белков-партнеров 14-3-3 фосфорилированным НврВб.

Как уже отмечалось, мутация Т232Е, расположенная в С-концевом участке 14-3-3, приводит к ослаблению взаимодействия 14-3-3 с фосфорилированным НврВб. Это может быть обусловлено конкуренцией между НэрВб, взаимодействующим с субстрат-связывающим участком 14-3-3, и фосфорилированным С-концом, который также связывается в указанной области [26].

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что мутации, имитирующие фосфорилирование 14-3-3, оказывают различное влияние на его взаимодействие с малым белком теплового шока НврВб.

Взаимодействие малого белка теплового шока HspB6 смутантными формами 14-3-3, не способными образовывать димеры

Считается, что белки семейства 14-3-3 представлены в клетке в виде стабильных димеров, и при этом димерная структура обеспечивает как прочное связывания белков-мишеней, так и эффективное функционирование белков семейства 14-3-3 [12]. Долгое время считалось, что мономеры 14-3-3 нестабильны, не способны прочно взаимодействовать с белками-мишенями и регулировать их активность. В то же время очевидно, что после синтеза на рибосоме в цитозоль на какое-то время освобождается мономер 14-3-3. Вероятно, именно наличие свободных мономеров делает возможным образование гетеродимеров 14-33. Кроме того, фосфорилирование Ser58 сопровождается частичной диссоциацией димеров и накоплением мономеров 14-3-3 [21]. Наконец, в последнее время появились данные об альтернативном сплайсинге, ведущем к появлению неспособных к димеризации мономерных форм 14-З-Зе, которые, по-видимому, способны выполнять некоторые функции димерных форм белка [27]. В связи с тем, что свойства мономеров 14-3-3 изучены достаточно поверхностно, представлялось целесообразным получить мономерные формы 14-3-3 С, и исследовать их взаимодействие с HspBö.

В нашей лаборатории к.б.н. H.H. Случанко провел мутирование нескольких аминокислотных последовательностей, участвующих в димеризации 14-3-3, и получил мутанты WMW с заменами 12LAE14->-12QQR14 и MMW с заменами Е5->К5,12LAE14->12QQR14. Анализ физико-химических свойств этих мутантов показал, что введенные мутации не влияют на вторичную или третичную структуру, но полностью предотвращают димеризацию в широком диапазоне концентраций белка. Получив мономерные формы 14-3-3, мы могли приступить к анализу их взаимодействия с HspBö.

Используя метод химического «сшивания», мы исследовали взаимодействие фосфорилированного и нефосфорилированного HspB6 с мутантами WMW и MMW. Изолированные белки или их смесь инкубировали с глутаровым альдегидом, после чего анализировали состав проб методом SDS-электрофореза. Как видно на рис.5 (дорожки 2, 3), если «сшиванию» подвергали смесь нефосфорилированного HspBö и WMW или MMW мутантов 14-3-3, то на электрофореграмме удавалось выявить только полосы, соответствующие мономерам (20кДа) и димерам (40 кДа) HspBö и мономерам (30 кДа) WMW или MMW. Таким образом, WMW и MMW мутанты, в отличие от белка дикого типа (рис.5 дорожка 1), не способны образовывать «сшитые» димеры. Кроме того, эти мутанты не способны взаимодействовать с нефосфорилированным HspBö. Если «сшиванию» глутаровым альдегидом подвергали фосфорилированный HspBö и мономерные формы 14-33 (рис.5, дорожки ö, 7), то помимо упомянутых выше полос, на электрофореграмме можно

кДа

9467 —

зо-2014-

Рис.5. Химическое «сшивание» изолированного НврВб (4), смеси нефосфорилированного НэрВб с 143-3 дикого типа (1) и его (2) и МШУ (3) мутантами, а также смеси фосфорилированного НярВб с 14-3-3 дикого типа (5) и его \УМ\У (б) и MMW (7) мутантами. Стрелками указано положение мономеров и димеров НэрВб и 14-3-3, образующихся комплексов и маркеров молекулярных масс.

было обнаружить одну дополнительную 14-з-3:рнэрВб полосу с кажущейся молекулярной массой 50 кДа. Указанная молекулярная масса хорошо соответствует

молекулярной массе «сшитого» комплекса, состоящего из мономера 143-3 и мономера НЬрВб. Таким образом, мономерные формы 14-3-3 специфически взаимодействуют с фосфорилированным НврВб и образуют с ним только один тип комплексов со стехиометрией 1:1. Следует отметить, что при «сшивании» глутаровым альдегидом 14-3-3 дикого типа образует с фосфорилированным НэрВб три типа комплексов со стехиометрией НэрВб/М-З-З равной 1:1, 1:2 и 2:2 (рис.5, дорожка 5).

Метод нативного электрофореза в модифицированной системе Шауба-Перри был также использован для анализа взаимодействия мономерных мутантов 14-3-3 с №рВ6. Как видно на рис.6 (дорожки 1-3), изолированные мономерные мутанты и 14-3-3 дикого типа обладают различной электрофоретической подвижностью. Это связано с различием в их

размерах (14-3-3\\Т - димер, \VM\V и ММ\¥ -мономеры) и зарядах, которые изменяются у мономерных форм вследствие внесенных мутаций. При нанесении на гель смеси фосфорилированного

ъс

-рНэрВб НэрВб и различных форм 14-3-3 (рис.6, дорожки 57), удавалось выявить диффузные полосы с более низкой электрофоретической подвижностью, чем подвижность изолированных белков. Кроме того, появление этих полос сопровождалось ослаблением интенсивности полос изолированных белков. Эти данные вместе с ранее полученными результатами свидетельствуют о том, что указанные полосы соответствуют комплексам, образованным фосфорилированным ШрВб и 14-3-3 дикого типа (рис.6, дорожка 5), а также его

\Л/М\/У-

1 2 3 4 5 6 7

Рис.6. Нативный электрофорез

изолированных 14-3-3 дикого типа (1), его \VM\V (2), ММ\У (3) мутантов, фосфорилированного НзрВб (4), а также смеси фосфорилированного НбрВб с 14-3-3 дикого типа (5) и его \VlvrW (6) и ММ\¥ (7) мутантами. Стрелками показано положение изолированных белков и образующихся комплексов.

мономерными \VM\V (рис.6, дорожка 6) и ММ\¥ (рис.6, дорожка 7) мутантами. Таким образом, метод нативного электрофореза позволил выявить образование комплексов между фосфорилированным ШрВб и 14-3-3 дикого типа и его мутантными формами, не способными образовывать димеры.

Для независимого подтверждения полученных результатов был использован метод иммунопреципитации. Фосфорилированный ШрВб и связавшиеся с ним различные формы 14-3-3 осаждали из раствора с помощью моноклональных антител на НврВб, иммобилизованных на сефарозе. Белковый состав проб анализировали при помощи БОБ-электрофореза. Полученные электрофореграммы сканировали и определяли относительное количество различных форм 14-3-3, связавшихся с НврВб. При проведении расчетов учитывали количество 14-3-3, не специфически сорбировавшееся на сефарозе в присутствии нефосфорилированного НэрВб. Оказалось, что количество мономерных форм 14-3-3, соосаждающихся с ШрВб, в среднем в 2 раза меньше, чем количество 14-3-3 дикого типа. Это может быть связано с тем, что стехиометрия комплекса НврВб/М-З-З дикого типа отличается от стехиометрии комплекса НэрВб/мономерные мутанты 14-3-3.

Для более полной характеристики образующихся комплексов был использован метод гель-фильтрации. Изолированные мономерные мутанты 14-3-3 элюировались в виде симметричного пика с объемом элюции -15,3 мл, а изолированный НврВб вне зависимости от фосфорилирования элюировался в виде пика с максимумом при -14,7 мл (рис.7А). Если на колонку наносили смесь нефосфорилированного НэрВб и мономерных мутантов 14-3-3, то профиль элюции совпадал с суммой профилей элюции изолированных белков (данные не приведены). В то же время, если на колонку наносили смесь фосфорилированного НврВб и одного из исследуемых мутантов, то на профиле элюции были выявлены два плохо разрешенных пика с объемами элюции —14,3 мл и -15,2 мл (рис.7А). По данным ЗОБ-электрофореза в первом пике элюируется комплекс, образованный НврВб и мономерным мутантом 14-3-3, а второй пик содержит оставшийся свободным мономер 14-3-3. Откалибровав колонку белками-стандартами с известными молекулярными массами, мы определили кажущуюся молекулярную массу комплекса и изолированных белков. Молекулярная масса и ММ\У составила ~40 кДа, что сопоставимо с молекулярной

массой мономера 14-3-3 (30 кДа). Молекулярная масса комплекса составила ~70 кДа. Учитывая то, что кажущаяся молекулярная масса димера ШрВб при гель-фильтрации составляет -50 кДа, можно заключить, что комплекс с кажущейся молекулярной массой 70 кДа состоит из мономера фосфорилированного ШрВб (-25 кДа) и мономера 14-3-3 (-40 кДа).

Используя метод гель-фильтрации, мы попытались оценить константы диссоциации комплексов мономерных мутантов 14-3-3 с фосфорилированным ШрВб и сравнить их с константой диссоциации комплекса, образованного 14-3-3 дикого типа и НврВб. На колонку наносили пробы, содержащие фиксированную концентрацию

фосфорилированного №рВ6 и

увеличивающиеся концентрации мутантов 143-3. Как видно на рис.7Б, увеличение концентрации 14-3-3 сопровождалось значительным увеличением амплитуды пика с максимумом -15,2 мл, в котором элюируется свободный 14-3-3. Концентрацию свободного 14-3-3 определяли по амплитуде этого пика, используя предварительно построенный график зависимости амплитуды пика 14-3-3 от его концентрации в пробе, нанесенной на колонку. Зная концентрацию свободного 14-3-3 и общие концентрации 14-3-3 и ШрВб в пробе и принимая стехиометрию образующегося комплекса равной 1:1, строили график зависимости концентрации связанного 14-3-3 от концентрации свободного 14-3-3 и рассчитывали кажущуюся константу диссоциации. Определенные таким способом константы диссоциации составили 1,2±0,1 и 1,4±0,3 дМ для комплексов, образованных и ММ\У мутантами, соответственно. Значение константы диссоциации

для комплекса, образованного 14-3-3 дикого типа, полученное ранее в нашей лаборатории, составило 7,1 ±2,1 рМ. Таким образом, мономерные мутанты связываются с фосфорилированным ШрВб со сродством сопоставимым или даже несколько большим, чем 14-3-3 дикого типа.

Суммируя этот раздел, можно заключить, что мономерные мутанты 14-3-3 специфически и с высоким сродством взаимодействуют с фосфорилированным НврВб. Образующиеся при этом комплексы имеют стехиометрию 1:1 и отличаются в этом отношении от комплексов НврВ6/14-3-3 дикого типа, стехиометрия которых составляет 1:2 или 2:2.

< Е

70-

60- рНэрВб+ / \ , \л/м\л/

50- \ZVMW / \ I 'тг

40- \ рНэрВб

30- \_J_-- у/

20- / ^

10- \л

14 15 16

Объем элюции, мл 14 15 16

Рис.7. Исследование взаимодействия фосфорилированного НэрВб с мономерным мутантом 14-3-3. А. Профиль элюции изолированных НБрВб, мутанта \VM\V и их эквимолярной смеси. Б. Профили элюции проб, содержащих фиксированную концентрацию НярВб и увеличивающиеся концентрации мутанта \VM\V.

Взаимодействие I4-i-iC с кофилином и влияние HspB6 на это взаимодействие

Известно, что фосфорилирование малого белка теплового шока HspB6 циклонуклеотид-зависимыми протеинкиназами коррелирует с расслаблением гладкой мускулатуры [28, 29]. Для объяснения этой корреляции было выдвинуто несколько гипотез. Согласно одной из наиболее популярных гипотез считалось, что фосфорилированный HspB6 вытесняет фосфорилированный кофилин из его комплекса с 14-3-3 [9, 17]. Освободившийся кофилин подвергается быстрому дефосфорилированию, активируется и вызывает деполимеризацию фибриллярного актина. Следствием этого является перестройка актинового цитоскелета и расслабление гладких мышц. Очевидно, что эта гипотеза основана на предположении, что фосфорилированный кофилин прочно взаимодействует с 14-3-3. Действительно, в ставшей классической работе Бокоча и соавт. [30] методом наслаивания (overlay) было установлено, что фосфорилированный кофилин прочно взаимодействует с 143-3. Мы попытались воспроизвести эти данные. Для этого кофилин-1 фосфорилировали

активированной LIM-киназой, a HspB6 фосфорилировали сАМР-зависимой протеинкиназой в присутствии радиоактивной АТР. 14-3-3 наносили на нитроцеллюлозу и инкубировали в растворе, содержащем либо 20 |iM фосфорилированного HspB6, либо 20 |J.M фосфорилированного кофилина. Мембрану тщательно отмывали от радиоактивных белков и подвергали авторадиографии. При такой постановке опыта оказалось, что оба фосфорилированных белка одинаково эффективно связываются с

иммобилизованным 14-3-3 (рис. 8). На первый взгляд, эти результаты хорошо согласуются с проверяемой нами гипотезой. Однако связывание кофилина наблюдалось только при высокой концентрации белка (20 Ц.М), что значительно превышает константу диссоциации комплекса кофилин/14-3-3 (60-100 нМ), приводимую в литературе [30]. Кроме того, оказалось, что связывание с 14-3-3 не зависит от фосфорилирования кофилина. Действительно, при инкубации иммобилизованного на нитроцеллюлозе 14-3-3 с фосфорилированным или нефосфорилированным кофилином с последующей окраской антителами на кофилин оказалось, что с мембраной связывается примерно равное количество обоих белков (данные не представлены). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что как фосфорилированный, так и нефосфорилированный кофилин неспецифически взаимодействует с иммобилизованным на нитроцеллюлозе 14-3-3 с более низким сродством,

А Б

* «— 1 мкг—► •

• «—2 мкг—»■ •

• «—4 мкг—► •

Рис.8. Взаимодействие кофилина и НБрВб с 14-3-3, иммобилизованным на нитроцеллюлозной мембране.

Мембрану с иммобилизованным 14-3-3 (1-4 мкг) инкубировали в растворе, содержащем фосфорилированный радиоактивный кофилин (А) или фосфорилированный радиоактивный НврВб (Б), мембрану отмывали и подвергали авторадиографии.

70-1

60-

50-

3 < 40-

я 30-

< 20-

10-

П-

ч п \

1 СО \

* \

/ О

14 15 16 Объем элюции, мл 14 16 16

чем указывалось в литературе. Для проверки этого заключения мы обратились к исследованию взаимодействия 14-3-3 и кофилина в растворе.

Методы нативного электрофореза и химического «сшивания» позволяют выявить образование комплексов между фосфорилированным НврВб и 14-3-3 (см. рис. 1, 2). Однако, используя эти методы, мы не смогли обнаружить формирование комплексов между 14-3-3 и фосфорилированными ЫМ-киназой кофилином-1 и кофилином-2 или мутантами ЭЗО, имитирующим фосфорилирование кофилина (данные не представлены).

Метод гель-фильтрации был также использован для анализа взаимодействия кофилина с 14-3-3. При гель-фильтрации изолированный кофилин-1 элюируется в виде симметричного пика с объемом элюции ~16,5 мл, а изолированный 14-3-3 - в виде пика с объемом элюции ~14 мл (рис.9А). Если на колонку наносили смесь исследуемых белков, то независимо от степени фосфорилирования кофилина профиль элюции полностью совпадал с алгебраической суммой профилей элюции изолированных белков (рис.9А). Аналогичный результат был получен, если гель-фильтрации подвергали смесь кофилина-1 и \VM\V мутанта 14-3-3, не способного образовывать димеры (рис.9Б).

Согласно гипотезе Брофи и соавт. [9, 17] фосфорилированный кофилин и

фосфорилированный ШрВб конкурируют между собой за связывание с 14-3-3. Мы попытались проверить это предположение методом гель-фильтрации. Для этого мы исследовали влияние кофилина на образование комплекса 14-3-3 с НэрВб. Как было показано ранее (см. рис.4А), смесь 14-3-3 и фосфорилированного ШрВб элюируется в виде асимметричного пика с объемом элюции -13,5 мл. Передняя часть этого пика содержит комплекс фосфорилированного НврВб и 14-3-3. Если в пробу до гель-фильтрации добавляли фосфорилированный кофилин-1, то ни положение указанного пика на профиле элюции, ни его амплитуда или белковый состав не изменялись, а добавленный кофилин элюировался в

Рис.9. Исследование взаимодействие кофилина и 14-3-3 методом гель-фильтрации. А. Профиль элюции изолированного кофилина (точечная линия), изолированного 14-3-3 (пунктирная линия) и их смеси (сплошная линия). Б. Профиль элюции изолированного кофилина (точечная линия), изолированного \VM\V мутанта 14-3-3 (пунктирная линия) и их смеси (сплошная линия).

виде изолированного пика с объемом элюции -16,5 мл (данные не представлены). Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что фосфорилированный кофилин и 14-3-3 не способны образовывать прочного комплекса в растворе.

2,5 цМ

5цМ

ЮцМ

2,5 цМ

5цМ

10 цМ

Рис.10. Исследование взаимодействия кофилина с Р-актином в отсутствие и в присутствии 14-3-3 методом коседиментации. А. Доля нефосфорилированного кофилина, соосаждающегося с Р-актином (Р) и остающегося в супернатанте (Б) в отсутствие (белые столбики) и в присутствии (серые столбики) 14-3-3. Б. Доля фосфорилированного кофилина, соосаждающегося с Р-актином (Р) и остающегося в супернатанте (Я) в отсутствие (белые столбики) и в присутствии (серые столбики) 14-33. Цифрами под чертой обозначены суммарные концентрации кофилина в пробах.

В литературе были указания на то, что 14-3-3 может частично предотвращать

взаимодействие кофилина с Р-актином [31]. Для проверки этого предположения был

использован метод коседиментации, основанный на соосаждении фибриллярного актина и

актин-связывающих белков. Как и следовало ожидать, нефосфорилированный кофилин-1

соосаждается с Р-актином, причем количество кофилина в осадке возрастает с увеличением

концентрации кофилина в пробе (рис.ЮА). В то же время фосфорилированный кофилин-1 не

взаимодействует с Б-актином и практически целиком остается в супернатанте после

ультрацентрифугирования (рис.1 ОБ). Добавление 14-3-3 в пробы не влияло на распределение

кофилина между супернатантом и осадком, что

свидетельствует об отсутствии конкуренции

комплекс между 14-3-3 и актином за связывание кофилин/актин

кофилина.

МММ ММ

- актин -14-3-3

1 23456789 10

Рие.11. Нативный электрофорез

изолированного кофилина (1), изолированного 14-3-3 (2), изолированного актина (3), смеси актина и кофилина в трех разных концентрациях (4-6), смеси актина и 14-3-3 в двух разных концентрациях (7, 8), смеси актина, кофилина и 14-3-3 (9, 10).

Используя метод нативного

электрофореза [20], мы проанализировали влияние 14-3-3 на взаимодействие кофилина-1 с О-актином. Как видно на рис.11, изолированный 14-3-3 (рис.11, дорожка 2) и изолированный актин (рис.11, дорожка 3) обладают высокими

электрофоретическими подвижностями, в то время как кофилин, имеющий щелочную изоэлектричеекую точку, практически не входит в гель (рис.11, дорожка 1). При нанесении на гель смеси кофилина и G-актина удавалось выявить полосы с промежуточной электрофоретической подвижностью, соответствующие комплексам, образованным двумя белками (рис.11, дорожки 4-6). Добавление 14-3-3 не влияло ни на интенсивность, ни на электрофоретическую подвижность этих полос (рис.11, дорожки 9, 10). Это свидетельствует о том, что 14-3-3 не оказывает существенного влияния на взаимодействие кофилина с G-актином.

Данные, представленные в этом разделе, позволяют заключить, что вне зависимости от степени фосфорилирования кофилин слабо взаимодействует с 14-3-3. Используя методы химического «сшивания», нативного электрофореза и гель-фильтрации, нам не удалось обнаружить образования прочных комплексов между кофилином и 14-3-3. При этом эти же методы убедительно свидетельствуют о том, что 14-3-3 прочно взаимодействует с HspB6. Кроме того, 14-3-3 не влияет на взаимодействие кофилина с F- и G-актином. Все эти факты исключают возможность того, что прямое взаимодействие кофилина и 14-3-3 может лежать в основе регуляции цитоскелета и регуляции сократительной активности гладкой мускулатуры. В то же время представленные данные не исключают возможности опосредованного участия HspB6 и 14-3-3 в реорганизации цитоскелета. Известно, что 14-3-3 образует комплексы с LIM- и TES-киназами [31, 32] и фосфатазой Slingshot [33], участвующими в фосфорилировании/дефосфорилировании кофилина. Представляется вероятным, что индуцированное действием гормонов повышение концентрации фосфорилированного HspB6 может привести к вытеснению указанных протеинкиназ/протеинфосфатаз из их комплексов с 14-3-3 и изменению степени фосфорилирования кофилина, что в свою очередь будет сопровождаться реорганизацией актинового цитоскелета и последующим расслаблением.

выводы

1. Установлено, что фосфорилированный сАМР-зависимой протеинкиназой НврВб прочно взаимодействует с 14-3-3^; образующиеся комплексы НврВб/М-З-З имеют стехиометрию 1:2 или 2:2.

2. Мутации, имитирующие фосфорилирование, влияют на связывание 14-3-3 с НэрВб, при этом мутация 858Е ослабляет, а мутация 8184Е увеличивает прочность образующегося комплекса.

3. Мутации, предотвращающие димеризацию, не влияют на способность 14-3-3 избирательно и с высоким сродством взаимодействовать с фосфорилированным №рВ6; стехиометрия образующихся комплексов составляет 1:1.

4. 14-3-3^ не образует прочных комплексов с кофилином, фосфорилированным ЫМ-киназой, и не влияет на связывание кофилина с Б- и О-актином.

5. Опровергнута гипотеза о том, что фосфорилированный №рВ6 вызывает расслабление гладких мышц, вытесняя кофилин из его комплекса с 14-3-3. Высказано предположение, что фосфорилированный НврВб может вытеснять из комплексов с 14-3-3 протеинкиназы и/или протеинфосфатазы кофилина и, таким образом, регулировать реорганизацию актинового цитоскелета.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Sluchanko NN, Sudnitsvna MV. Chernik IS, Seit-Nebi AS, Gusev NB. Phosphomimicking mutations of human 14-3-3£ affect its interaction with tau protein and small heat shock protein HspB6. Arch Biochem Biophys. 2011, 506(1), pp. 24-34.

2. Sluchanko NN, Sudnitsvna MV. Seit-Nebi AS, Antson AA, Gusev NB. Properties of the monomelic form of human 14-3-3^ protein and its interaction with tau and HspB6. Biochemistry. 2011, 50(45), pp. 9797-9808.

3. Sudnitsvna MV. Mymrikov EV, Seit-Nebi AS, Gusev NB. The role of intrinsically disordered regions in the structure and functioning of small heat shock proteins. Curr Protein Pept Sci. 2012,13(1), pp. 76-85.

4. Sudnitsvna MV. Seit-Nebi AS, Gusev NB. Cofilin weakly interacts with 14-3-3 and therefore can only indirectly participate in regulation of cell motility by small heat shock protein HspB6 (Hsp20). Arch Biochem Biophys. 2012,521(1-2), pp. 62-70.

Тезисы докладов

1. Sudnitsvna MV. Seit-Nebi AS, Gusev NB. Interaction of 14-3-3 with cofilin and probable participation of small heat shock protein HspB6 and 14-3-3 in regulation of smooth muscle contraction. Biological motility. Fundamental and applied science. Pushchino, 2012, pp. 206-208.

2. Случанко H.H., Судницына M.B.. Гусев Н.Б. Свойства мономерной формы универсального адаптерного белка 14-3-3. IV съезд биофизиков России. Том V, стр. 31, Нижний Новгород, 2012.

Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 10-04-00026а).

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Vos MJ, et al. (2008) Biochemistry, 47: 7001 -11.

2. Mymrikov EV, et al. (2011) Physiol Rev, 91: 1123-59.

3. Kappe G, et al. (2010) Cell Stress Chaperones, 15: 457-61.

4. Basha E, et al. (2012) Trends Biochem Sci, 37: 106-17.

5. Vos MJ, et al. (2011) Autophagy, 7: 101-3.

6. Kato K, et al. (1994) J Biol Chem, 269: 15302-9.

7. Bukach OV, et al. (2004) Eur J Biochem, 271: 291-302.

8. Gusev NB, et al. (2005) Biochemistry (Mosc), 70: 629-37.

9. Dreiza CM, et al. (2005) FASEB J, 19: 261-3.

10. Chernik IS, et al. (2007) Mo! Cell Biochem, 295: 9-17.

11. Aitken A. (2006) Semin Cancer Biol, 16: 162-72.

12. Yaffe MB. (2002) FEBSLett, 513: 53-7.

13. Mackintosh C. (2004) Biochem J, 381: 329-42.

14. Sluchanko NN, Gusev NB. (2010) Biochemistry (Mosc), 75: 1528-46.

15. Aitken A. (2011) Semin Cell Dev Biol,

16. Beall A, et al. (1999) J Biol Chem, 274: 11344-51.

17. Dreiza CM, et al. (2010) Cell Stress Chaperones, 15: 1-11.

18. Pardee JD, Spudich JA. (1982) Methods Enzymol, 85 Pt B: 164-81.

19. Schaub MC, Perry SV. (1969) Biochem J, 115: 993-1004.

20. Nosworthy NJ, et al. (2001) Proteomics, 1: 1513-8.

21. Woodcock JM, et al. (2003) J Biol Chem, 278: 36323-7.

22. Sluchanko NN, et al. (2008) Arch Biochem Biophys, 477: 305-12.

23. Powell DW, et al. (2003) Mol Cell Biol, 23: 5376-87.

24. Gardino AK, et al. (2006) Semin Cancer Biol, 16: 173-82.

25. Tsuruta F, et al. (2004) EMBO J, 23: 1889-99.

26. Obsilova V, et al. (2004) J Biol Chem, 279: 4531-40.

27. Han D, et al. (2010) Biochem Biophys Res Commun, 396: 401-6.

28. Beall AC, et al. (1997) J Biol Chem, 111: 11283-7.

29. Rembold CM, et al. (2000) J Physiol, 524 Pt 3: 865-78.

30. Gohla A, Bokoch GM. (2002) Curr Biol, 12: 1704-10.

31. Birkenfeld J, et al. (2003) Biochem J, 369: 45-54.

32. Toshima JY, et al. (2001) J Biol Chem, 276: 43471-81.

33. Nagata-Ohashi K, et al. (2004) J Cell Biol, 165: 465-71.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

Заказ № 419-1/11/2012 Подписано в печать 02.11.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru ; e-maihzak@cfr.ru

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие малого белка теплового шока HSPB6 с универсальным адаптерным белком 14-3-3"

В дальнейших исследованиях на клеточных культурах кардиомиоцитов, а также на трансгенных животных с повышенной экспрессией HspB6 в сердечной мышце было продемонстрировано защитное действие HspBó при различных патологических состояниях. Так, например, у трансгенных животных с повышенным уровнем экспрессии HspBó ишемия/реперфузия сопровождалась существенным уменьшением некроза и апоптоза кардиомиоцитов и более быстрым восстановлением сердечной функции, чем у контрольных животных [87]. Повышенная экспрессия HspBó защищала кардиомиоциты от действия токсичного цитостатика доксорубицина [88] и липополисахаридов, внутрибрюшинное введение которых моделирует состояние сепсиса у животных [89]. При выявлении механизмов антиапоптотического действия HspBó на кардиомиоциты оказалось, что он может взаимодействовать с различными белками, вовлеченными в процесс регуляции апоптоза. Так, например, HspBó предотвращает транслокацию проапоптотического белка ВАХ в митохондрии [87], инактивируетссовую киназу ASK1 [90], а также способствует сохранению активности протеинкиназы Akt, предотвращая активацию проапоптотического белка BAD [88]. При развитии сепсиса HspBó снижает активность транскрипционного фактора NF-кВ, уменьшая продукцию кардиомиоцитами провоспалительных цитокинов [89]. Помимо этого было установлено, что уменьшение степени фосфорилирования HspBó (достигаемое путем экспрессии в клетках нефосфорилируемого мутанта S16A) сопровождается увеличением гибели клеток вследствие ишемии. Этот эффект, по всей видимости, связан с ингибированием процесса аутофагии в кардиомиоцитах [91].

В последнее время появились данные о том, что HspBó может стимулировать ангиогенез в сердечной мышце [92]. Это интересный пример внеклеточного действия HspBó,

4 4 < > А который активно секретируется кардиомиоцитами и взаимодействует с рецептором фактора роста сосудов (VEGFR2), запуская сигнальный каскад в клетках эндотелия, приводящий к ангиогенезу.

Весьма вероятно, что протекторное действие HspB6 не ограничивается только сердечной мышцей. Существуют данные, свидетельствующие о корреляции между уровнем экспрессии HspB6 и такими патологическими состояниями, как рак и болезнь Альцгеймера [84].

2.2.2 Влияние HspBó на процесс агрегации тромбоцитов.

Повреждение стенки сосуда вызывает активацию тромбоцитов, которые, взаимодействуя между собой и с межклеточным коллагеновым матриксом, образуют агрегаты, препятствующие кровотечению. Этот процесс строго регулируется и находится под контролем различных факторов, таких как тромбин, коллаген, ADP. Оказалось, что HspB6 способен специфически связываться с тромбоцитами и ингибировать их агрегацию под действием тромбина, но не ADP [93]. Дальнейшие исследования показали, что HspB6 предотвращает вход Са2+ через клеточную мембрану тромбоцитов, индуцированный тромбином и коллагеном, однако не влияет на выход Са из внутриклеточных депо [94]. Высказывается предположение, что действие HspB6 связано с ингибированием активности фосфолипазы С тромбоцитов [95]. Любопытно отметить, что сходным эффектом на агрегацию тромбоцитов обладает не только интактный полноразмерный HspB6, но и короткие пептиды HspB6 и а-В-кристаллина [96]. При этом активный девятичленный пептид HspB6 содержит в своем составе Serió - остаток, подвергающийся фосфорилированию протеинкиназой А.

Таким образом, данные литературы свидетельствуют о том, что HspB6 может выступать в роли ингибитора агрегации тромбоцитов. Этот факт представляется особенно интересным, потому что сердечно-сосудистые заболевания могут сопровождаться повышением уровня HspB6 в плазме крови [94, 95].

2.2.3 Участие HspBó в регуляции сократительной активности гладкой мускулатуры.

Спустя несколько лет после идентификации HspBó как представителя семейства малых белков теплового шока интерес к этому белку резко возрос. Это было связано с обнаружением того факта, что фосфорилирование HspBó коррелировало с расслаблением гладкой мускулатуры сосудов [78]. В настоящее время рассматриваются два основных участие в регуляции сократительной активности гладких мышц. Дальнейшее продолжение исследований в этом направлении позволило установить, что обработка гладкой мускулатуры сосудов и воздухоносных путей фосфорилированным пептидом HspB6, слитым с последовательностью, обеспечивающей его проникновение в клетку, эффективно обеспечивает расслабление гладкой мускулатуры [99, 100]. При этом нефосфорилированный пептид и пептид с заменой Ser 16—*Ala были неэффективны.

В ходе дальнейшего изучения механизма действия HspB6 оказалось, что активация в клетке циклонуклеотид-зависимого сигнального каскада не только приводит к расслаблению, но также препятствует последующему сокращению мышечных клеток под действием серотонина [101]. При этом степень фосфорилирования легких цепей миозина и потребление кислорода мышечными клетками оставалось на высоком уровне. Учитывая этот факт, К. Брофи и соавт. предложили следующую гипотезу, объясняющую механизм расслабления гладких мышц под действием фосфорилированного HspB6. Согласно этой гипотезе, нефосфорилированный HspB6 взаимодействует с элементами цитоскелета, поддерживая его целостность. Фосфорилирование вызывает диссоциацию HspB6 от актинового цитоскелета и нарушение фиксации актиновых филаментов в области фокальных контактов [101]. Частичная разборка актинового цитоскелета приводит к расслаблению, при этом сам процесс образования актомиозинового комплекса не ингибируется, о чем свидетельствует активное потребление мышцей кислорода. В пользу этой гипотезы свидетельствуют полученные в лаборатории К. Брофи данные о том, что HspB6 может связываться как с актином [70], так и с а-актинином, одним из компонентов фокальных контактов [71]. При этом по данным К. Брофи и соавт. нефосфорилированный HspB6 преимущественно взаимодействует с F-актином, а фосфорилированный - с G-актином, что также может способствовать разборке актиновых филаментов.

Прямо противоположные результаты были получены в лаборатории К. Рембольда. В экспериментах, проведенных этой группой, было установлено, что фосфорилированный HspB6 соосаждался с фибриллярным актином, а нефосфорилированный HspB6 оставался в супернатанте. По данным этих исследователей при расслаблении сонной артерии, вызванном действием активаторов гуанилатциклазы, происходило снижение потребления мышцей кислорода, что могло свидетельствовать об ингибировании взаимодействия головок миозина с актином [97]. Более того, в структуре HspB6 был обнаружен пептид (остатки 110-121), в определенной степени гомологичный ингибиторному участку тропонина I, регулирующему взаимодействие актина и миозина в скелетных и сердечных мышцах [97]. Таким образом, была сформирована альтернативная гипотеза, предполагающая, что фосфорилирование гладкомышечного HspB6 циклонуклеотид-зависимыми протеинкиназами вызывает его транслокацию на актиновые филаменты, где он, подобно тропонину I в скелетных и сердечных мышцах, препятствует взаимодействию головок миозина с тонкими филаментами и, как следствие, ингибирует мышечное сокращение [102, 103].

Несмотря на очевидное противоречие двух гипотез, обе они базировались на предположении о том, что HspB6 является истинным актин-связывающим белком. Тем не менее, в серии биохимических экспериментов, выполненных in vitro, не удалось установить прямого взаимодействия HspB6 (или его мутанта, имитирующего фосфорилирование) с интактным актином [73].

Продолжая свои исследования на клеточных культурах, К. Брофи и соавт. обнаружили, что повышенная экспрессия HspB6 ингибировала сократительную активность немышечных клеток [100], а добавление к культуре клеток фосфорилированного пептида HspB6, слитого с последовательностью, обеспечивающей его проникновение в клетку, вызывало разборку актиновых стресс-фибрилл [49, 99]. При изучении белков-партнеров фосфопептида HspB6 в клеточных лизатах оказалось, что он взаимодействует с универсальным белком-адаптером 14-3-3 [49] (см. раздел 3). Чуть позднее было установлено, что не только фосфорилированный пептид, но и фосфорилированный интактный HspB6 способен взаимодействовать с 14-3-3 [50]. Кроме того, оказалось, что появление в клетке фосфорилированного HspB6 или его фосфопептида коррелировало с уменьшением степени фосфорилирования актин-связывающего белка кофилина [49, 99], также считающегося партнером 14-3-3 [104, 105].

На основе описанных экспериментальных фактов была сформулирована новая гипотеза, постулирующая непрямое влияние фосфорилированного HspB6 на актиновый цитоскелет (рис.4). Согласно этой гипотезе, образующийся при активации циклонуклеотид-зависимых протеинкиназ фосфорилированный HspB6 вытесняет фосфорилированный неактивный кофилин из комплекса с 14-3-3. Фосфорилированный кофилин подвергается быстрому дефосфорилированию, становится активным и обеспечивает деполимеризацию и фрагментацию актиновых филаментов, что в конечном итоге приводит к расслаблению гладких мышц и реорганизации цитоскелета немышечных клеток [49, 51]. эти процессы могут играть важную роль в формировании примембранного актинового цитоскелета и обеспечении направленного движения клеток.

Фосфорилирование кофилина по остатку Ser3 предотвращает его взаимодействие с актином. Две изоформы LIM-киназы, экспрессирующиеся повсеместно [114, 115], а также менее изученные TES-киназы, обнаруженные в различных тканях, но преимущественно экспрессирующиеся в семенниках [116, 117], участвуют в фосфорилировании кофилина. В регуляцию активности LIM-киназ вовлечены сигнальные пути, связанные с Rho-GTP-азами. РАК- и Rho-киназы, активируемые под действием Rho-GTP-аз, фосфорилируют и активируют LIM-киназы [115, 118]. Активация TES-киназ происходит при запуске сигнальных путей, связанных с интегриновыми рецепторами [116]. Данные литературы свидетельствуют о том, что фосфорилированная TES-киназа! может взаимодействовать с белком-адаптером 14-3-3 [119], что вызывает ингибирование киназной активности фермента и влияет на его внутриклеточную локализацию. Данные литературы о взаимодействии LIM-киназы1 и 14-3-3 достаточно противоречивы [105, 120]. Процесс дефосфорилирования кофилина находится под контролем двух фосфатаз, так называемых Slingshot и Chronophin [121, 122]. Как уже отмечалось, дефосфорилирование приводит к активации кофилина. Механизм регуляции фосфатазы Chronophin остается пока практически не изученным. Механизмы регуляции фосфатазы Slingshot изучены полнее. Считается, что этот фермент может связываться с фибриллярным актином и это приводит к повышению ферментативной активности [120]. Фосфорилирование Slingshot приводит к образованию комплекса с белком 14-3-3 [123, 124], что вызывает диссоциацию фосфатазы от актиновых филаментов и ингибированию ее активности. Судя по всему, описываемая система регуляции имеет много обратных связей. Например, Slingshot способна дефосфорилировать не только кофилин, но и LIM-киназу [123], регулируя ее активность. Таким образом, в клетке существует сложная система регуляции кофилина, важную роль в которой играет универсальный адаптерный белок 14-3-3. изоформ, причем у е изоформы отсутствует также третий солевой мостик, что, возможно, связано с уменьшением стабильности гомодимера и повышенной склонностью е изоформы образовывать гетеродимеры [136].

На внутренней стороне каждого мономера располагается субстрат-связывающий участок - так называемая амфипатическая бороздка, образованная спиралями аЗ, а5, а7 и а9. С одной стороны в бороздке находятся гидрофобные остатки L172, L216, L220 и L227, принадлежащие спиралям а7 и а9. С другой стороны бороздки преимущественно располагаются заряженные остатки К49, R56, R60, К120, D124, R127, а также Y128, принадлежащие аЗ и а5 спиралям [135]. Таким образом, наиболее консервативные аминокислотные остатки расположены в области межсубъединичных контактов, а также на внутренней поверхности мономеров, в то время как наружная поверхность димера образована сравнительно вариабельными аминокислотными остатками.

Дальнейшие исследования показали, что кристаллические структуры всех изоформ 14-3-3 млекопитающих очень похожи. Кроме того, они представляют собой довольно жесткие структуры и не изменяют свою конформацию при связывании фосфопептидов и даже полноразмерных белков-партнеров [136-138].

3.3 Взаимодействие 14-3-3 с белками-партнерами.

В настоящее время известно более 300 белков-партнеров 14-3-3, к которым относятся различные протеинкиназы, белки-рецепторы, ферменты, белки цитоскелета, транскрипционные факторы, белки-регуляторы апоптоза и др. [139]. Несмотря на большое разнообразие белков-партнеров, большинство белков, взаимодействующих с 14-3-3, имеют в своей структуре фосфорилированные остатки Ser/Thr, расположенные в достаточно консервативном окружении, так называемых консенсусных последовательностях [140]. В литературе описано несколько таких консенсусных последовательностей. Так первичная структура мотива I, узнаваемого 14-3-3, имеет вид RSX(pS/pT)X(P/G), а мотив II, также узнаваемый 14-3-3, имеет несколько иную первичную структуру - RX(Y/F)X(pS/pT)XP [137]. Был обнаружен также и мотив III, располагающийся на С-конце белка-партнера и имеющий структуру pSXi.2-COOH [141]. Участки, узнаваемые 14-3-3, могут несколько отличаться от упомянутых выше консенсусных последовательностей. Например, в случае HspB6 последовательность, узнаваемая 14-3-3, имеет вид RRApSAP. Тем не менее высказывается предположение, что чем ближе последовательность к консенсусной, тем прочнее белок-партнер взаимодействует с 14-3-3 [137].

Данные, полученные при анализе кристаллических структур комплексов 14-3-3 с фосфопептидами, свидетельствуют о том, что фосфопептид располагается в амфипатической бороздке 14-3-3, вытягиваясь вдоль нее, и взаимодействует с аминокислотными остатками спиралей а5, а7 и а9. При этом фосфатная группа координируется консервативными остатками К49, 1156, Ш27 и У128 [136, 137]. Пролин в положении +2 относительно фосфосерина обеспечивает изгиб полипептидной цепи, необходимый для правильного расположения узнаваемой последовательности в амфипатической бороздке.

Помимо консенсусного мотива, узнаваемого 14-3-3, большинство белков-партнеров объединяет еще одна структурная особенность. Оказалось, что более 90% этих белков имеют в своей структуре неупорядоченные участки, причем консенсусные последовательности для связывания 14-3-3, как правило, располагаются именно в этих участках [142]. Существует точка зрения, что при связывании с 14-3-3 эти неупорядоченные участки начинают приобретать определенную структуру. Такой способ взаимодействия может объяснить наличие чрезвычайно широкого круга белков-партнеров 14-3-3, обладающих существенными структурными и функциональными различиями.

Наличие димерной структуры и размер внутреннего центрального канала 14-3-3 предполагают возможность одновременного связывания двух белков-лигандов или одного белка-лиганда, имеющего в своей структуре два центра связывания (два фосфорилируемых мотива). Кроме того оказалось, что наличие в структуре белка-партнера второго участка связывания увеличивает его сродство к 14-3-3 более чем в 30 раз [137, 143], что может иметь важное физиологическое и функциональное значение [144]. Высказывается предположение, что участок в структуре белка-партнера, обладающий высоким сродством, может выступать в качестве своеобразного «привратника». Связывание этого участка с 14-3-3 позволяет должным образом ориентировать белок-партнер и обеспечивает связывание второго участка, обладающего более низким сродством. Замыкание второго контакта обеспечивает образование чрезвычайно прочного комплекса, что может приводить к очень существенным изменениям структуры и свойств белка-партнера [145].

Несмотря на то, что 14-3-3 преимущественно взаимодействует с фосфорилированными белками-партнерами, существует много примеров, когда 14-3-3 образует комплексы и с нефосфорилированными лигандами. Так, например, связывание 143-3 бактериального токсина экзоэнзима 8 не зависит от фосфорилирования [146]. Интересно отметить, что и в этом случае участок связывания 14-3-3 располагается в амфипатической бороздке, а остаток аспарагиновой кислоты полипептидной цепи экзоэнзима Б имитирует фосфат и взаимодействует с консервативным остатком У128 14-3-3 [136].

Существует несколько механизмов, с помощью которых 14-3-3 может влиять на функционирование белков-партнеров в клетке. Во-первых, связывание белка с 14-3-3 может препятствовать его взаимодействию с другими белками-партнерами. Так, например, образование комплекса фосфатазы Slingshot с 14-3-3 препятствует ее связыванию с актиновыми филаментами, что может приводить к ингибированию ее активности [120, 123]. Прочное взаимодействие 14-3-3 с транскрипционным фактором F0X04, осуществляемое сразу по двум участкам, не позволяет последнему связываться с регуляторными областями на молекуле ДНК [144]. Многочисленные данные литературы свидетельствуют о том, что 143-3 может защищать белки-партнеры от действия фосфатаз и/или протеаз.

Во-вторых, взаимодействие с 14-3-3 может влиять на активность фермента, изменять его кинетические параметры и сродство к субстратам, как это происходит в случае арилалкиламин-М-ацетилтрансферазы [138], а также триптофан- и тирозин- гидроксилаз и некоторых других ферментов. По-видимому, это происходит вследствие того, что жесткая структура 14-3-3 может изменять конформацию белка-партнера, благоприятствуя образованию фермент-субстратного комплекса или стабилизируя переходное состояние при образовании продукта [145].

В третьих, 14-3-3 может влиять на внутриклеточную локализацию белка-партнера, маскируя или экспонируя определенные последовательности в его структуре [147].

В-четвертых, 14-3-3 может играть роль своеобразного адаптера, сближая два белка-партнера и способствуя их взаимодействию. Примером такого взаимодействия может служить тройной комплекс, состоящий из 14-3-3, протеинкиназы С-С, и протеинкиназы Raf-1. Образование такого комплекса благоприятствует фосфорилированию Raf-1 протеинкиназой С-С, и ее последующей активации [129].

Очевидно, что некоторые из этих механизмов функционирования (например, выполнение роли адаптера) подразумевают обязательное наличие димерной структуры у 143-3. Тем не менее, вопрос о необходимости димерной структуры 14-3-3 для его эффективного функционирования, также как и вопрос о существовании и возможной функциональной роли мономеров 14-3-3 остаются до сих пор открытыми. Установлено, что мутантная форма 14-3-3, с делецией N-концевого участка и не способная к димеризации, тем не менее эффективно связывает фосфорилированную триптофан-гидроксилазу [148]. В то же время точечные мутации в области межсубъединичных контактов, приводящие к диссоциации димеров 14-3-3, не влияли на взаимодействие 14-3-3 с протеинкиназой Raf, но полностью предотвращали способность 14-3-3 поддерживать Raf в активном состоянии [149]. О важной функциональной роли димерной структуры говорят также данные о том, что мутантные формы 14-3-3, не способные к димеризации, обладают пониженной способностью связывать фосфорилированные белки-партнеры [150]. Кроме того, такие мутанты крайне нестабильны in vivo, а их экспрессия в клетке сопровождается быстрой протеолитической деградацией [151]. С другой стороны, при экспрессии в культуре клеток недимеризующиеся мутантные формы 14-3-3 были способны модулировать активность Са2+-зависимого К+-канала [152], а обнаруженная недавно сплайс-форма 14-З-Зе, не способная к димеризации, эффективно защищала клетки от апоптоза, вызванного ультрафиолетовым излучением [153]. Таким образом, вполне вероятно, что мономерная форма 14-3-3 может играть определенную функциональную роль, особенно если учесть, что стабильность димеров может регулироваться путем фосфорилирования 14-3-3.

3.4 Регуляция 14-3-3 путем фосфорилирования.

Взаимодействие белков семейства 14-3-3 с партнерами может регулироваться не только путем фосфорилирования белков-партнеров, но также путем фосфорилирования самого 14-3-3. В составе 14-3-3 известно три остатка, подвергающихся фосфорилированию под действием различных протеинкиназ как in vivo, так и in vitro - Ser58, Serl84 и Thr232. Необходимо отметить, что эти остатки не всегда консервативны, они могут отсутствовать у некоторых изоформ. Кроме того, некоторые протеинкиназы могут фосфорилировать одни изоформы и не фосфорилировать другие, что может быть связано с различиями в первичной структуре вблизи участков фосфорилирования. Единственной изоформой, фосфорилирование которой по всем трем участкам было показано in vivo, является Ç изоформа 14-3-3 [154]. Рассмотрим фосфорилирование Ç изоформы 14-3-3 более подробно.

Ser58 расположен в области межсубъединичных контактов димера 14-3-3, что может существенно затруднять его фосфорилирование. Тем не менее, известно, что он подвергается фосфорилированию под действием различных протеинкиназ, таких как PKB/Akt [155], МАРКАРК2 [156], РКА [157], SOK-1 [158], сфингозин-зависимая протеинкиназа (каталитический домен РКС5) [159, 160]. По мнению большинства авторов фосфорилирование Ser58 приводит к нарушению димерной структуры 14-3-3 [156, 157, 159, 160] и частичной или полной диссоциации димеров, что может быть следствием появления объемной фосфатной группы в области плотного контакта между двумя мономерами. Высказывается предположение, что мономеры, образующиеся вследствие фосфорилирования Ser58, крайне нестабильны. По этой причине фосфорилирование Ser58 может приводить к регулируемой деградации 14-3-3 [151]. Помимо этого фосфорилирование Ser58 сопровождается ослаблением прочности взаимодействия 14-3-3 с некоторыми белками-партнерами, такими как Raf-1 [156], р53 [157], ASK1 [158], ВАХ [160]. Такой эффект фосфорилирования Ser58 может быть связан как с нарушением димерной структуры i '

14-3-3, так и со стерическими затруднениями при связывании фосфорилированного участка белка-партнера в амфипатической бороздке, поскольку Ser58 расположен в непосредственной близости к Arg56 и Arg60, взаимодействующих с фосфатной группой. Интересный способ регуляции фосфорилирования Ser58 был обнаружен Дж. Вудкок и соавт. Оказалось, что доступность Ser58 для различных протеинкиназ резко возрастает при взаимодействии 14-3-3 со сфингозином, который образуется при расщеплении сфинголипидов [161]. Таким образом, фосфорилирование Ser58 14-3-3 в клетке находится под строгим контролем и может влиять как на время жизни 14-3-3, так и на способность 143-3 взаимодействовать с белками-партнерами.

Фосфорилирование Serl84 связывают с регуляцией антиапоптотической активности 14-3-3. Serl84 подвергается фосфорилированию под действием протеинкиназы JNK, которая активируется при различных стрессах. Следствием фосфорилирования является высвобождение из комплекса с 14-3-3 и активация таких проапоптотических белков, как ВАХ [162], F0X03a, BAD [163], c-Abl [164]. Ослабление взаимодействия 14-3-3 с белками-партнерами может быть связано с тем, что Serl84 расположен поблизости от субстрат-связывающей бороздки 14-3-3.

Thr232 находится в подвижном С-концевом участке 14-3-3, который может располагаться в амфипатической бороздке и препятствовать связыванию белков-партнеров [165, 166]. Фосфорилирование Thr232 казеинкиназой 1а заметно уменьшает сродство 14-3-3 к c-Raf [167], а также препятствует активации арилалкиламин-Ы-ацетилтрансферазы под действием 14-3-3 [168]. По-видимому, фосфорилированный С-концевой участок 14-3-3 активно конкурирует с белками-партнерами 14-3-3 за связывание с амфипатической бороздкой [168].

Таким образом, по всей видимости, фосфорилирование является эффективным способом регуляции функционирования 14-3-3. * *

Завершая обзор литературы, можно заключить, что малый белок теплового шока HspB6 способен влиять на многочисленные и разнообразные процессы в клетке. Нет сомнений в том, что фосфорилирование HspB6 по остатку Serl6 каким-то образом оказывает влияние на процесс расслабления гладкой мускулатуры. Опираясь на данные литературы, можно предположить, что в основе этого эффекта лежит взаимодействие HspB6 с универсальным белком-адаптером 14-3-3, который также вовлечен в регуляцию большого количества внутриклеточных процессов. Следует, однако, констатировать, что, несмотря на f,1 привлекательность этой гипотезы и многочисленные исследования, детальный механизм, с помощью которого HspB6 влияет на процесс расслабления гладких мышц, остается малопонятным. Выяснение этого механизма и способов его регуляции может быть важным не только с теоретической точки зрения, но может оказаться полезным при решении некоторых практических задач, таких как разработка методов борьбы с астмой и спазмами сосудов головного мозга, а также при трансплантации сосудов в сердечно-сосудистой хирургии [51, 169].

В связи с этим целью данной работы был подробный анализ взаимодействия HspB6 с 14-3-3^ дикого типа, его мутантами, имитирующими фосфорилирование, а также мутантами, не способными к димеризации. Помимо этого целью работы была проверка гипотезы о том, что HspB6 регулирует расслабление гладких мышц, вытесняя фосфорилированный кофилин из его комплекса с 14-3-3. В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:

1. Используя различные методы, исследовать взаимодействие HspB6 с 14-3-3^ дикого типа in vitro.

2. Проанализировать влияние мутаций, имитирующих фосфорилирование 14-3-3^, на его способность связывать HspB6.

3. Исследовать взаимодействие HspB6 с мутантными формами 14-3-3, не способными образовывать димеры.

4. Изучить влияние фосфорилированного HspB6 на взаимодействие 14-3-3 с фосфорилированным кофилином.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Препаративные методы

1. Получение рекомбинантных белков. 1.1. Получение рекомбинантного HspB6 человека.

1.1.1. Экспрессия рекомбинантного HspB6.

Для получения рекомбинантного HspB6 использовали плазмиду рЕТ23(Ь), содержащую полноразмерную копию мРНК HspB6 человека. Плазмида была любезно предоставлена к.б.н. A.C. Сейт-Неби. Для экспрессии HspB6 использовали штамм Е. coli BL21(DE3)pLysS. К 100 мкл суспензии компетентных клеток добавляли 2 мкл плазмиды, инкубировали клетки на льду 30 мин, после чего проводили тепловой шок при 42°С в течение 50 с. К охлажденным во льду клеткам добавляли 900 мкл среды LB и растили при 37°С в течение 60 мин при постоянном перемешивании. Полученные клетки высевали на твердую среду LB-arap, содержащую 0,1 мг/мл ампициллина, и растили при 37°С в течение ночи. Чашки Петри с колониями клеток хранили в холодильнике.

Клетки с одной колонии переносили в 50 мл среды LB, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, и растили в термостате-качалке при 37°С в течение ночи. Полученную «ночную» культуру переносили в 1 л среды LB, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, и растили в термостате-качалке при 37°С до достижения оптической плотности, равной 0,5-0,6 при 600 нм. После этого добавляли IPTG до конечной концентрации 0,5 мМ и растили клетки при 30°С в течение 4 ч. По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием (15 мин, 2000 g) и суспендировали осадок в 20 мл лизис-буфера, содержащего 50 мМ трис/НС1, 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 14 мМ ß-МЭ, 0,1 мМ ФМСФ. Суспензию клеток хранили на -20°С.

1.1.2. Выделение рекомбинантного HspB6.

Суспензию клеток Е. coli, в которых была проведена препаративная экспрессия HspB6, размораживали и обрабатывали лизоцимом в концентрации 0,06 мг/мл в течение 30 мин на льду. Для разрушения бактериальной ДНК добавляли ДНКазу I до конечной концентрации 3 мкг/мл и MgCb до конечной концентрации 2 мМ и инкубировали суспензию 15 мин при комнатной температуре. Клетки бактерий разрушали обработкой на ультразвуковом дезинтеграторе Branson S250D (выходная мощность 20%) три раза по 1 мин во льду. Полученную суспензию центрифугировали 15 мин при 23700 g. Супернатант отделяли, а осадок ресуспендировали в 20 мл лизис-буфера. Процедуру экстракции, начиная с обработки ультразвуком, повторяли еще два раза. Полученные супернатанты объединяли, добавляли сульфат аммония до степени насыщения 30% и инкубировали 1 ч на льду при постоянном перемешивании. По окончании периода инкубации суспензию центрифугировали 15 мин при 23700 g, осадок растворяли в 15 мл буфера Б (20 мМ трис/ацетат, рН 7,6, 10 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 14 мМ 0-МЭ, ОД мМ ФМСФ) и диализовали против 2 л буфера Б в течение ночи.

На следующем этапе частично очищенный препарат HspB6 подвергали дальнейшей очистке с помощью хроматографических методов. Препарат HspB6 после диализа центрифугировали (30 мин при 105000 g), разводили в 4 раза и наносили порциями на колонку HiTrapQ (Amersham-Pharmacia) объемом 5 мл, предварительно уравновешенную буфером Б. Колонку промывали 4 объемами буфера Б, затем проводили элюцию линейным градиентом NaCl от 10 до 360 мМ в 12 объемах колонки. Во время проведения хроматографии собирали фракции объемом 1 мл, состав которых анализировали при помощи SDS-электрофореза (см. раздел 11.1). Фракции, содержащие наибольшее количество HspB6 объединяли и подвергали дополнительной очистке с помощью метода гидрофобной хроматографии. К полученному препарату HspB6 добавляли сульфат аммония до концентрации 0,3 М и наносили его порциями на колонку PhenylHP HiTrap (Amersham Pharmacia) объемом 5 мл, предварительно уравновешенную буфером Б, содержащим 0,3 М сульфата аммония. Колонку промывали 4 объемами буфера уравновешивания, затем проводили элюцию в два этапа линейным градиентом (NH^SCU. На первой стадии (7 объемов колонки) концентрация сульфата аммония уменьшалась с 300 до 15 мМ, а на второй стадии (10 объемов колонки) концентрация сульфат аммония уменьшалась с 15 до 0 мМ. Во время проведения хроматографии собирали фракции объемом 1 мл, состав которых анализировали при помощи SDS-электрофореза (см. раздел 11.1). Фракции, содержащие наибольшее количество целевого белка, объединяли, концентрировали при помощи ультрафильтрации и диализовали в течение ночи против 2 л буфера Б, содержащего 1 мМ ДТТ вместо Р-МЭ. Концентрацию белка в конечном препарате определяли спектрофотометрически, принимая коэффициент экстинкции HspB6 при 280 нм равным 0,582 (мг/мл)"' - см"'. Выход белка сіл бактериальной культуры составил ~80 мг. Полученный препарат делили на аликвоты и хранили при -20°С.

1.2 Получение рекомбинантного 14-3-3£ человека и его мутантных форм.

Рекомбинантный 14-3-3^ и его мутантные формы были любезно предоставлены к.б.н. H.H. Случанко.

1.3. Получение рекомбинантных кофилина-1 и кофилина-2 человека и их мутантных форм, имитирующих фосфорилирование.

1.3.1. Получение молекулярных конструкций для экспрессии мутантных форм S3D кофилина-1 и кофилина-2.

Для получения рекомбинантного кофилина-1 и кофилина-2 использовали плазмиду рЕТ23(Ь), содержащую полноразмерные копии мРНК кофилинов человека. Плазмида была любезно предоставлена к.б.н. A.C. Сейт-Неби. Для того чтобы получить молекулярные конструкции для экспрессии мутантных форм кофилинов, несущих замену Ser3 на Asp, использовали мутагенные (мутантный триплет показан жирным шрифтом) «прямые» ген-специфичные праймеры с сайтом узнавания эндонуклеазы рестрикции Ndel (показано курсивом): ААТТАС4 ТА rGGCCGACGGTGTGGCTGTC ДЛЯ кофилина-1 И

АТАТАС4 ТАrGGCTGACGGAGTTACAGTG для кофилина-2. В качестве «обратных» праймеров использовали ген-специфичные праймеры с сайтом узнавания эндонуклеазы рестрикции Xhol (показано курсивом): AT AT ACTCG^ GTC AC AAAGGCTTGCCCTCC AG для кофилина-1 и ATATACrCG^íGTTATAATGGTTTTCCTTCAAGTG для кофилина-2. Праймеры синтезировали в компании «Евроген». Проба для полимеразной цепной реакции содержала по 0,2 цМ прямых и обратных праймеров, 0,2 ц,М каждого из четырех dNTP, 2,5 ед. Pfu-ДНК-полимеразы (Fermentas), 1-кратный буфер для Pfu-ДНК-полимеразы (Fermentas) и следовые количества матрицы. В качестве матрицы использовали плазмиду, содержащую копию мРНК кофилина дикого типа. Амплифицированную таким образом вставку переосаждали из раствора в присутствии 65%-ного спирта и 0,2 М NaCl. Для клонирования полученной вставки ее и предварительно выделенный вектор рЕТ23(Ь) обрабатывали одновременно двумя эндонуклеазами рестрикции Ndel и Xhol (Fermentas) в буфере «О» (Fermentas). По окончании периода инкубации вектор дополнительно обрабатывали щелочной фосфатазой (Fermentas) для минимизации лигирования пустого вектора. После очистки рестрикционных фрагментов через 1%-ный агарозный гель с использованием набора «Silica Bead DNA Gel Extraction Kit» (Fermentas) осуществляли лигирование вектора и вставки Т4-ДНК-лигазой (Fermentas) в однократном лигазном буфере. Молярное соотношение вектор:вставка составляло 1:3. Полученной лигазной смесью трансформировали бактерии штамма DH5a и высевали на твердую среду ЬВ-агар. Выросшие колонии скринировали на наличие вставки нужной длины при помощи полимеразной цепной реакции с использованием праймеров, комплементарных области Т7-промотора и Т7-терминатора вектора рЕТ23(Ь). «Положительные» клоны наращивали в жидкой среде ЬВ и выделяли плазмиды методом щелочного лизиса. Полученные конструкции секвенировали в компании «Евроген».

1.3.2. Экспрессия рекомбинантных кофилина-1, кофилина-2 и их мутантных форм, имитирующих фосфорилироеание.

Для экспрессии кофилинов компетентные клетки Е. соН ВЬ21(БЕЗ)рЬуз8 трансформировали плазмидами, несущими нужные вставки, и растили «ночные» культуры. Последовательность действий была аналогична той, которая описана в разделе 1.1.1, посвященном экспрессии НзрВб. Экспрессию кофилинов проводили методом самоиндукции [170]. 50 мл «ночной» культуры переносили в 1 л трехкратной среды ЬВ, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, и растили в термостате-качалке при 37°С до достижения суспензией оптической плотности, равной 0,5-0,6 при 600 нм. После этого снижали температуру инкубации до 25°С и растили культуру в течение 18-22 ч. По окончании инкубации клетки осаждали центрифугированием (15 мин, 2000 §) и суспендировали осадок в 20 мл лизис-буфера. Суспензию клеток хранили на -20°С.

1.3.3 Выделение рекомбинантных кофилина-1, кофилина-2 и их мутантных форм, имитирующих фосфорилироеание.

Процедуру разрушения бактериальных клеток и экстракцию цитоплазматических белков проводили так же, как это описано в разделе 1.1.2, посвященном выделению НврВб. К полученному экстракту добавляли сульфат аммония до степени насыщения 60% и инкубировали 30 мин во льду при постоянном перемешивании. По окончании инкубации суспензию центрифугировали 15 мин при 23700 ¡*, осадок отбрасывали, а к супернатанту добавляли сульфат аммония до степени насыщения 80%. Суспензию инкубировали 30 мин во льду при постоянном перемешивании, после чего центрифугировали 15 мин при 23700 Осадок растворяли в 8 мл буфера М, содержащего 20 мМ МЕБЛЧаОН, рН 6,0, 150 мМ №С1, 0,2 мМ ЭГТА, 14 мМ р-МЭ, 0,1 мМ ФМСФ. Для дальнейшей очистки препарата использовали метод гель-фильтрации. Частично очищенный белок наносили порциями на колонку 8ирегёех200 Н1126/60 (АгпегзЬат-РЬагтаст), уравновешенную буфером М. Во время проведения хроматографии собирали фракции объемом 3 мл, состав которых анализировали при помощи ЗБЗ-электрофореза (см. раздел 11.1). Фракции, содержащие наибольшее количество кофилина, объединяли, концентрировали при помощи ультрафильтрации и диализовали в течение ночи против 2 л буфера Б, содержащего 1 мМ ДТТ вместо ß-МЭ. В полученных препаратах определяли концентрацию белка спектрофотометрически, принимая коэффициент экстинкции кофилина-1 при 280 нм равным 0,786 (мг/мл)"1-см"1, а кофилина-2 - 0,992 (мг/мл)"' -см"1. Выход белка с 1 л бактериальной культуры составил 100-150 мг. Полученные препараты делили на аликвоты и хранили при -20°С.

1.4. Получение рекомбинантного каталитического домена LIM-киназы.

1.4.1. Получение молекулярной конструкции для экспрессии каталитического домена ЫМ-киназы.

Плазмида pcDNA3 для экспрессии в эукариотических клетках, содержащая копию участка мРНК, кодирующего каталитический домен LIM-киназы (302-647 аминокислотные остатки), была любезно предоставлена доктором Г. Бокочем (Исследовательский институт Скриппс, Ла-Йолла, Калифорния, США). Для экспрессии каталитического домена в бактериальной системе последовательность переклонировали в вектор рЕТ23(Ь). Для этого ее амплифицировали с использованием «прямого»

А ААТ АС4 ТА rGTCTCCGGGCGCTGGCTCACTG) И «обратного»

ААТТACTCGAGGTCGGGGACCTCAGGGTG) ген-специфичных праймеров, содержащих сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции Ndel и Xhol, соответственно (показано курсивом). Состав пробы для полимеразной цепной реакции и последовательность действий при переклонировании аналогичны таковым, описанным в разделе 1.2.1. Необходимо отметить, что «обратный» праймер не содержал стоп-кодон перед сайтом узнавания Xhol. Это позволяло при клонировании вставки в вектор и экспрессии целевого белка получить белок, содержащий последовательность из 8 остатков гистидинов на С-конце.

1.4.2. Экспрессия каталитического домена LIM-киназы.

Компетентные клетки Е. coli BL21(DE3)pLysS трансформировали плазмидой, содержащей последовательность каталитического домена LIM-киназы, и растили «ночную» культуру в объеме 50 мл. «Ночную» культуру вносили в 1 л среды LB, содержащей 0,1 мг/мл ампициллина, и растили в термостате-качалке при 37°С до достижения суспензией оптической плотности при 600 нм значения 0,5-0,6. После этого суспензию охлаждали до 20°С, добавляли IPTG до концентрации 0,4 мМ и растили при 20°С в течение 18-22 ч. По

38 окончании периода инкубации клетки осаждали центрифугированием (15 мин, 2000 g) и суспендировали осадок в 20 мл лизис-буфера, не содержащего ЭДТА. Суспензию клеток хранили на -20°С.

1.4.3. Выделение рекомбинантного каталитического домена ЫМ-киназы.

Процедуру разрушения бактериальных клеток и экстракцию цитоплазматических белков проводили так же, как это описано в разделе 1.1.2, посвященном выделению HspB6. В полученный экстракт добавляли NaCl до концентрации 500 мМ, имидазол и КН2РО4 до концентрации 20 мМ и доводили рН до 7,5. Экстракт наносили на колонку HisTrapHP (Amersham-Pharmacia), предварительно уравновешенную буфером Н, содержащим 20 мМ имидазол, 200 мМ КН2Р04, рН 7,5, 500 мМ NaCl, 14 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ. Элюцию проводили линейным градиентом (7 объемов колонки) имидазола от 20 до 500 мМ. При проведении хроматографии собирали фракции объемом 1 мл и анализировали их состав методом SDS-электрофореза (см. раздел 11.1), а также проверяли на наличие протеинкиназной активности. Для этого по 5 мкл фракции вносили в 22 мкл инкубационной среды, содержащей 0,9 мг/мл кофилина-1, 0,12 мМ АТР и следовые количества [у- Р]-АТР в буфере Ф (20 мМ трис/НС1, 15 мМ КН2Р04, рН 7,5, 3,5 мМ MgCl2, 14 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ). Включение радиоактивного фосфата определяли так, как это описано в разделе 4.2. Фракции, обладающие наибольшей активностью, объединяли и диализовали в течение ночи против 2 л буфера JI, содержащего 40 мМ трис/HCl, рН 7,5, 100 мМ NaCl, 0,2 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 0,1 мМ ФМСФ. Полученный препарат концентрировали при помощи ультрафильтрации, добавляли равный объем глицерина и хранили при -20°С.

2. Получение компетентных клеток.

Для получения компетентных клеток использовали методику, предложенную Чангом и соавт. с изменениями [171]. Клетки Е.соН с одной колонии переносили в 20 мл среды ЬВ и растили «ночную» культуру в термостате-качалке при 37°С в течение ночи. 2 мл «ночной» культуры переносили в 200 мл среды ЬВ и растили при 37°С до оптической плотности при 600 нм 0,3-0,4. Охлаждали колбу на льду и центрифугировали суспензию клеток 15 мин при 2000 Супернатант стерильно убирали, а осадок ресуспендировали в 7 мл среды ЬВ, содержащей 10% полиэтиленгликоль (Мг 6000), 5% ДМСО, 50 мМ MgCl2, предварительно стерилизованной пропусканием через фильтр с диаметром пор 0,2 цш. Полученную суспензию клеток инкубировали на льду в течение 10 мин, после чего расфасовывали по 300 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при -70°С.

3. Выделение актина из ацетонового порошка.

Актин скелетных мышц кролика выделяли из ацетонового порошка по методу Парди и Спудича [172]. Препарат ацетонового порошка был любезно предоставлен проф. Д.И. Левицким (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН). Навеску порошка ~1 г заливали 20-кратным объемом буфера А (2 мМ трис/HCl, рН 8,0, 0,2 мМ СаС12, 0,2 мМ АТР, 0,5 мМ МЭ, 0,005% азида натрия), экстрагировали на льду при постоянном перемешивании в течение 30 мин и центрифугировали 15 мин при 23700 g. Осадок повторно экстрагировали 10-кратным объемом буфера А и центрифугировали. Супернатанты объединяли и фильтровали через складчатый фильтр. В полученном экстракте инициировали полимеризацию актина добавлением 1 М КС1 и 40 мМ MgCl2 до конечных концентраций 50 мМ и 2 мМ, соответственно. Раствор инкубировали на льду в течение 75 мин без перемешивания для того, чтобы предотвратить фрагментацию образующихся актиновых филаментов. К полученному вязкому раствору добавляли сухой КС1 до конечной концентрации 0,6 М для диссоциации актин-связывающих белков. После добавления соли актиновые филаменты осаждали ультрацентрифугированием в течение 2 ч при 80000 g. К осадку F-актина добавляли 2 мл буфера А и гомогенизировали в ручном гомогенизаторе Поттера. Для деполимеризации раствор F-актина диализовали против 2 л буфера А в течение 2 суток, после чего оставшийся недеполимеризованным F-актин удаляли ультрацентрифугированием при 80000 g в течение 1 ч. В полученном препарате определяли концентрацию актина спектрофотометрически, принимая коэффициент экстинкции актина при 290 нм равным 0,66 (мг/млУ'-см"1. Выход белка с 1 г ацетонового порошка составил -10 мг. Полученный препарат актина хранили при +4°С в течение недели.

4. Фосфорилирование белков.

4.1. Фосфорилирование №рВ6 протеинкиназой А.

Для фосфорилирования ШрВб использовали рекомбинантную каталитическую субъединицу сАМР-зависимой протеинкиназы (протеинкиназы А), любезно предоставленную Е.В. Мымриковым. НэрВб (1 мг/мл) фосфорилировали в буфере Ф,

Ч '

1' содержащем 20 мМ трис/НС1, 15 мМ КН2Р04, рН 7,5, 3,5 мМ MgCl2, 14 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ и 0,15 мМ АТР, содержащем следовые количества [у-32Р]-АТР. Перед добавлением препарата протеинкиназы А из реакционной среды отбирали две пробы по 2 мкл, являющиеся контролем на общее содержание радиоактивности в реакционной среде, и пробу в 10 мкл, позволяющую определить неспецифическое связывание радиоактивной АТР с белком в отсутствие фермента. Пробы наносили на фильтры Whatman ЗММ, после чего в реакционную смесь вносили препарат протеинкиназы А и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Каждые 20 мин для контроля включения фосфата в белок из реакционной смеси отбирали пробы по 10 мкл и наносили их на фильтры. Фильтры высушивали и отмывали от низкомолекулярных радиоактивных веществ 10%-ным раствором трихлоруксусной кислоты, содержащим 10 мМ фосфата натрия и 10 мМ пирофосфата натрия. Фильтры, содержащие пробы для определения общего содержание радиоактивности в реакционной среде, оставляли неотмытыми. Высушенные фильтры помещали в сцинтилляционные флаконы, содержащие сцинтилляционную жидкость ЖС-106, и считали радиоактивность проб на сцинтилляционном счетчике Rackbeta 1214 (LKB). Зная общее содержание радиоактивности в пробе и включение радиоактивного фосфата в белок по окончании инкубации, рассчитывали степень фосфорилирования HspB6, которая составляла 0,7-0,8 моль фосфата на моль белка. Помимо этого, подбор количества протеинкиназы А и контроль за включением фосфата в HspB6 осуществляли также с помощью метода электрофореза в присутствии мочевины (см. раздел 11.2).

4.2. Фосфорилирование кофилина рекомбинантным каталитическим доменом LIM-киназы.

Для повышения эффективности фосфорилирования кофилина каталитический домен

LIM-киназы предварительно активировали путем фосфорилирования под действием рекомбинантного каталитического фрагмента РАК-киназы, любезно предоставленного к.б.н.

А. Ю. Хапчаевым. Для этого каталитический домен LEM-киназы инкубировали с каталитическим фрагментом РАК-киназы в буфере Ф, содержащем 0,25 мМ АТР, в течение 1 ч при 37°С. После этого реакционную среду разводили буфером Ф таким образом, чтобы концентрация АТР стала равной 0,1 мМ, и вносили кофилин до концентрации 0,5 мг/мл и следовые количества [у-32Р]-АТР. Как и в случае с HspB6, из реакционной смеси отбирали две контрольные пробы и пробу до внесения кофилина и инкубировали смесь в течение 2 ч при 37°С. Каждые 20 мин из реакционной смеси отбирали пробы для контроля включения радиоактивного фосфата в кофилин и наносили их на фильтры. Измерение радиоактивности проб и расчет степени фосфорилирования проводили так же, как это описано в разделе 4.1. В

8.2 Иммунопреципитация Н$рВ6.

Для изучения взаимодействия ШрВб с 14-3-3 методом иммунопреципитации пробы готовили следующим образом. Отдельно в пробе объемом 40 мкл смешивали НврВб (0,2 мг/мл) и 14-3-3 (0,3 мг/мл) в буфере И (20 мМ трис/ацетат, рН 7,6, 100 мМ ЫаС1, 0,1 мМ ЭДТА, 5 мМ МЭ, 0,1 мМ ФМСФ, 2 мг/мл БСА) и переносили инкубационную смесь в пластиковую пробирку, содержащую 30 мкл сефарозы с иммобилизованными антителами на ШрВб. В качестве контроля на неспецифическую сорбцию белков на сефарозе использовали пробу, содержащую сефарозу без иммобилизованных антител. Пробы инкубировали на шейкере в течение 45 мин при комнатной температуре, после чего сефарозу осаждали, супернатант отбрасывали, а сефарозу промывали 750 мкл буфера И, не содержащего БСА. Процесс промывки сефарозы повторяли трижды. После последней промывки супернатант отбирали особенно тщательно, а к сефарозе добавляли 30 мкл 1-кратного БОЭ-буфера для образцов (см. раздел 11.1), который не содержал Р-МЭ, чтобы минимизировать попадание в элюат тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. Для более полной элюции связавшихся с сефарозой белков пробы инкубировали 5 мин при комнатной температуре, периодически перемешивая, после чего сефарозу осаждали, а супернатант отбирали и добавляли к нему 1% Р-МЭ. После предварительного прогрева при 95°С в течение 5 мин белковый состав проб анализировали методом БОБ-электрофореза в 15%-ном полиакриламидном геле. Полученные гели окрашивали красителем Кумасси 11-250, отмывали и сканировали. Интенсивность пятен обсчитывали с помощью программы 1ша§е1.

9. Метод наслаивания (overlay).

Метод наслаивания использовали для исследования связывания HspB6 и кофилина с 14-3-3, иммобилизованным на нитроцеллюлозной мембране.

9.1. Метод наслаивания с последующей авторадиографией.

1, 2 и 4 мкг 14-3-3 в объеме 1 мкл наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану высушивали и отмывали от несвязавшегося белка буфером TBST (10 мМ трис/HCl, рН 7,5, 15 мМ NaCl, 0,1% TWEEN20) 3 раза по 5 мин. Мембрану инкубировали в буфере Т (20 мМ трис/HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% TWEEN20), содержащем 3% БСА и либо кофилин, либо HspB6 в концентрации 0,4 мг/мл. При этом образцы кофилина были предварительно фосфорилированы LIM-киназой, а препараты HspB6 были фосфорилированы протеинкиназой А в присутствии радиоактивной АТР. Полученные препараты фосфорилированных белков инкубировали с нитроцеллюлозной мембраной в

45 течение ночи при 4°С. По окончании инкубации мембраны отмывали буфером TBST 4 раза по 5 мин. Мембраны высушивали и подвергали авторадиографии (см. раздел 13). Время экспозиции составляло 2 суток.

9.2. Метод наслаивания с последующей окраской антителами.

1, 2 и 4 мкг 14-3-3 в объеме 1 мкл наносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану высушивали и отмывали от несвязавшегося белка буфером TBST 3 раза по 5 мин. После этого мембрану инкубировали в течение 15 мин в буфере TBST, содержащем 5% сухое молоко, для блокировки свободных мест на мембране. После блокирования мембрану инкубировали в буфере Т, содержащем 0,4 мг/мл фосфорилированного или нефосфорилированного кофилина, в течение ночи при 4°С. По окончании инкубации мембраны отмывали буфером TBST 4 раза по 5 мин. Далее мембрану инкубировали 30 минут на шейкере с первичными моноклональными антителами на кофилин (Cell Signalling), разведенными в 1000 раз буфером TBST. Мембрану отмывали и помещали в раствор вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Конъюгат был любезно предоставлен д.б.н. А.Г. Катрухой. Мембрану отмывали от вторичных антител и обрабатывали рабочим раствором из набора Supersignal West Dura Extended Duration Substrate (Thermo Scientific). После этого мембрану помещали между двумя слоями полиэтиленовой пленки, и закладывали в кассету для авторадиографии Amersham Hypercassete™ (GE Healthcare) с фотопленкой Amersham Hyperfilm™ MP (GE Healthcare). Время экспозиции составляло 1-5 мин. По окончании экспозиции пленку проявляли и фиксировали (см. раздел 13).

10. Коседиментация.

Метод коседиментации использовали для изучения влияния 14-3-3 на взаимодействие кофилина с F-актином. Для полимеризации актина к препарату G-актина в буфере А добавляли 10-кратный полимеризующий раствор, содержащий 0,5 М KCl, 20 мМ MgCb и 10 мМ АТР, и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворы кофилина и 14-3-3 предварительно центрифугировали в течение 1 ч при 130000 g. В пробы объемом 50 мкл, содержащие 20 мМ трис/HCl, pH 7,5, и 150 мМ NaCl, вносили 20 (iM полимеризованного актина, 20 (iM 14-3-3 и различные количества кофилина (2,5-10 цМ). Пробы инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего центрифугировали при 130000 g 1 ч. Супернатант отбирали, а осадок растворяли в

11.2. Электрофорез в присутствии мочевины.

Электрофорез в присутствии мочевины по методу Перри и соавт. [176] позволял разделять нефосфорилированную и фосфорилированные формы НзрВб. Электродный буфер и 15% полиакриламидный гель содержали 20 мМ трис/глицин, рН 8,6. Кроме того, гель содержал мочевину в концентрации 6 М. Для приготовления образцов к белковому раствору добавляли 4-кратный буфер для образцов, содержащий 10 мМ трис/глицин, рН 8,6, 8 М мочевину, 4 % МЭ и 0,004% бромфеноловый синий. Электрофорез проводили при силе тока 15 мА на пластину геля и напряжении 300 В в течение 2,5 ч. Гели окрашивали красителем Кумасси 11-250, отмывали и сканировали.

12. Окрашивание гелей серебром.

Окрашивание гелей серебром применяли в том случае, если было необходимо детектировать на геле очень небольшие количества белка (менее 1 мкг). Последовательность действий при окрашивании гелей серебром была следующей:

1. По окончании электрофореза гели фиксировали в растворе, содержащем 40% этилового спирта и 10% уксусной кислоты в течение 30-60 мин.

2. Промывали 2 раза (по 10 мин) в 10% этиловом спирте.

3. Промывали 5 раз (по 5 мин) водой МПИС?.

4. Инкубировали в ослабителе Фармера (0,15% К3Ре(СМ)6, 0,03% Ш28204, 0,05% ЫагСОз) в течение 2 мин.

5. Промывали 4 раза (по 5 мин) водой МПИС).

6. Инкубировали в 0,1% водном растворе AgNOз в течение 30 мин.

7. Инкубировали в 2,5% растворе Ка2С03 в течение 5 мин.

8. Проявляли в 2,5% растворе ШгСОз, содержащем 0,008% формальдегида.

Время проявления зависело от природы и количества белка, нанесенного на гель. Фиксирование окраски и последующее хранение гелей проводили в 1%-ном растворе уксусной кислоты.

13. Авторадиография.

Полиакриламидные гели, в которых проводили анализ проб, содержащих белок, фосфорилированный в присутствии анализировали при помощи метода авторадиографии. Для этого гели высушивали между двумя слоями целлофановой пленки и закладывали в кассету для авторадиографии Amersham Hypercassete™ (GE Healthcare) с фотопленкой Amersham Hyperfilm™ MP (GE Healthcare). Время экспозиции зависело от уровня радиоактивности исследуемых образцов. По окончании экспозиции пленку помещали в проявитель, содержащий 0,22% метол, 7,2% сульфит натрия, 0,88% гидрохинон, 4,8% углекислый натрий и 0,4% бромистый калий. После этого пленку промывали водой и помещали в фиксирующий раствор, содержащий 26% тиосульфат натрия, 5% хлористый аммоний и 1,7% пиросернистокислый натрий, промывали водой и высушивали.

14. Сиектрофотометрическое определение концентрации белка.

Концентрацию белка в гомогенных препаратах, полученных после выделения и очистки, определяли спектрофотометрическим методом. Для этого измеряли оптическую плотность образцов при 280 нм на спектрофотометре Ultrospec 3100 pro (Amersham Biosciences) против соответствующего буфера. Исключение составлял препарат актина, концентрацию которого измеряли при 290 нм из-за наличия в буфере А 0,2 мМ АТР. При расчете концентрации белка использовали коэффициенты экстинкции, приведенные в таблице 1.

Таблица 1. Весовые коэффициенты экстинкции (е), используемые для спектрофотометрического определения концентраций некоторых белков.

Белок £,-(мг/мл)"1'СМ"1 Длина волны, нм Источник

HspB6 0,582 280 UniProtKB 014558

14-З-ЗС 0,987 280 UniProtKB Р63104

Кофилин-1 0,786 280 UniProtKB Р23528

Кофилин-2 0,992 280 UniProtKB Q9Y281

Актин 0,660 290 [177]

III РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

1. Получение рекомбинантного HspB6 человека.

Для получения больших количеств целевого белка часто используется метод препаративной экспрессии рекомбинантного белка в клетках Е. coli. Благодаря повышенной экспрессии этот метод позволяет получать большие количества белка и существенно упростить процедуру очистки. Кроме того, этот метод позволяет получать белки таких организмов, выделение из которых затруднительно, например, белки из тканей человека.

Для того, чтобы экспрессировать целевой белок, необходимо сначала трансформировать клетки Е. coli плазмидой, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую этот белок. Для успешной трасформации бактериальные клетки подвергаются либо химической обработке, либо электропорации. В нашей работе мы получали компетентные клетки химическим методом, после чего смешивали их с плазмидой, содержащей полноразмерную копию мРНК HspB6 человека, и подвергали кратковременному тепловому шоку, чтобы обеспечить эффективное проникновение ДНК в клетку бактерии.

Методика экспрессии HspB6 была разработана в нашей лаборатории О.В. Букач и соавт. [34]. Согласно этой методике, клетки растили в жидкой среде LB при постоянном перемешивании при 37°С. После достижения бактериальной культурой логарифмической стадии роста (оптическая плотность суспензии при 600 нм составляла 0,5-0,6) синтез HspB6 инициировали добавлением 0,5 мМ EPTG и продолжали инкубацию в течение 4 ч. На каждой стадии из суспензии отбирали пробы и анализировали экспрессию HspB6 методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS. Как видно на рис.6, добавление в среду IPTG вызывает накопление в клетках бактерий белка с кажущейся молекулярной массой 20 кДа, соответствующей кажущейся молекулярной массе HspB6, при этом указанный белок находился преимущественно в растворимой фракции. выводы

1. Установлено, что фосфорилированный сАМР-зависимой протеинкиназой НэрВб прочно взаимодействует с 14-3-3^; образующиеся комплексы НзрВб/14-3-3 имеют стехиометрию 1:2 или 2:2.

2. Мутации, имитирующие фосфорилирование 14-3-3, влияют на связывание 14-3-3 с НврВб, при этом мутация 858Е ослабляет, а мутация Б184Е увеличивает прочность образующегося комплекса.

3. Мутации, предотвращающие димеризацию, не влияют на способность 14-3-3 избирательно и с высоким сродством взаимодействовать с фосфорилированным НБрВб; стехиометрия образующихся комплексов составляет 1:1.

4. 14-3-3^ не образует прочных комплексов с кофилином, фосфорилированным ЫМ-киназой, и не влияет на связывание кофилина с Б- и в-актином.

5. Опровергнута гипотеза о том, что фосфорилированный НэрВб вызывает расслабление гладких мышц, вытесняя кофилин из его комплекса с 14-3-3. Высказано предположение, что фосфорилированный НврВб может вытеснять из комплексов с 14-3-3 протеинкиназы и/или протеинфосфатазы кофилина и, таким образом, регулировать реорганизацию актинового цитоскелета. chaperone alphaB-crystallin elucidated by a triple hybrid approach. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011.108(51): p. 20491-6.

25. Lambert, H., S.J. Charette, A.F. Beraier, A. Guimond, and J. Landry, HSP27 multimerization mediated by phosphorylation-sensitive intermolecular interactions at the amino terminus. J Biol Chem, 1999. 274(14): p. 9378-85.

26. Theriault, J.R., H. Lambert, A.T. Chavez-Zobel, G. Charest, P. Lavigne, and J. Landry, Essential role of the NH2-terminal WD/EPF motif in the phosphorylation-activated protective function of mammalian Hsp27. J Biol Chem, 2004. 279(22): p. 23463-71.

27. Yang, C., J.C. Salerno, and J.F. Koretz, NH2-terminal stabilization of small heat shock protein structure: a comparison of two NH2-terminal deletion mutants of alphaA-crystallin. Mol Vis, 2005.11: p. 641-7.

28. Hayes, D., V. Napoli, A. Mazurkie, W.F. Stafford, and P. Graceffa, Phosphorylation dependence ofhsp27 multimeric size and molecular chaperone function. J Biol Chem, 2009. 284(28): p. 18801-7.

29. Aquilina, J.A., J.L. Benesch, L.L. Ding, O. Yaron, J. Horwitz, and C.V. Robinson, Phosphorylation of alphaB-crystallin alters chaperone function through loss of dimeric substructure. J Biol Chem, 2004. 279(27): p. 28675-80.

30. McHaourab, H.S., J.A. Godar, and P.L. Stewart, Structure and mechanism of protein stability sensors: chaperone activity of small heat shock proteins. Biochemistry, 2009. 48(18): p. 3828-37.

31. Haslbeck, M., S. Walke, T. Stromer, M. Ehrnsperger, H.E. White, S. Chen, H.R. Saibil, and J. Buchner, Hsp26: a temperature-regulated chaperone. EMBO J, 1999.18(23): p. 6744-51.

32. Horwitz, J., Alpha-crystallin can function as a molecular chaperone. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(21): p. 10449-53.

33. Ehrnsperger, M., S. Graber, M. Gaestel, and J. Buchner, Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EMBO J, 1997.16(2): p. 221-9.

34. Bukach, O.V., A.S. Seit-Nebi, S.B. Marston, and N.B. Gusev, Some properties of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). Eur J Biochem, 2004. 271(2): p. 291-302.

35. Khanova, H.A., K.A. Markossian, S.Y. Kleimenov, D.l. Levitsky, N.A. Chebotareva, N.V. Golub, R.A. Asryants, V.I. Muronetz, L. Saso, I.K. Yudin, K.O. Muranov, M.A. Ostrovsky, and B.I. Kurganov, Effect of alpha-crystallin on thermal denaturation and aggregation of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biophys Chem, 2007. 125(2-3): p. 521-31.

47. van de Klundert, F.A., R.H. Smulders, M.L. Gijsen, R.A. Lindner, R. Jaenicke, J.A. Carver, and W.W. de Jong, The mammalian small heat-shock protein Hsp20 forms dimers and is a poor chaperone. Eur J Biochem, 1998. 258(3): p. 1014-21.

48. Arrigo, A.P., The cellular "networking" of mammalian Hsp27 and its functions in the control of protein folding, redox state and apoptosis. Adv Exp Med Biol, 2007. 594: p. 1426.

49. Dreiza, C.M., C.M. Brophy, P. Komalavilas, E.J. Furnish, L. Joshi, M.A. Pallero, J.E. Murphy-Ullrich, M. von Rechenberg, Y.S. Ho, B. Richardson, N. Xu, Y. Zhen, J.M. Peltier, and A. Panitch, Transducible heat shock protein 20 (HSP20) phosphopeptide alters cytoskeletal dynamics. FASEB J, 2005. 19(2): p. 261-3.

50. Chernik, I.S., A.S. Seit-Nebi, S.B. Marston, and N.B. Gusev, Small heat shock protein Hsp20 (HspB6) as a partner of 14-3-3gamma. Mol Cell Biochem, 2007. 295(1-2): p. 9-17.

51. Dreiza, C.M., P. Komalavilas, E.J. Furnish, C.R. Flynn, M.R. Sheller, C.C. Smoke, L.B. Lopes, and C.M. Brophy, The small heat shock protein, HSPB6, in muscle function and disease. Cell Stress Chaperones, 2010.15(1): p. 1-11.

52. Carra, S., S.J. Seguin, H. Lambert, and J. Landry, HspB8 chaperone activity toward poly(Q)-containing proteins depends on its association with Bag3, a stimulator of macroautophagy. J Biol Chem, 2008. 283(3): p. 1437-44.

53. Shemetov, A. A. and N.B. Gusev, Biochemical characterization of small heat shock protein HspB8 (Hsp22)-Bag3 interaction. Arch Biochem Biophys, 2011. 513(1): p. 1-9.

54. Sun, Y. and T.H. MacRae, The small heat shock proteins and their role in human disease. FEBS J, 2005. 272(11): p. 2613-27.

55. Boncoraglio, A., M. Minoia, and S. Carra, The family of mammalian small heat shock proteins (HSPBs): Implications in protein deposit diseases and motor neuropathies. Int J Biochem Cell Biol, 2012.

56. Kato, K., S. Goto, Y. Inaguma, K. Hasegawa, R. Morishita, and T. Asano, Purification and characterization of a 20-kDa protein that is highly homologous to alpha B crystallin. J Biol Chem, 1994. 269(21): p. 15302-9.

57. Kappe, G., E. Franck, P. Verschuure, W.C. Boelens, J.A. Leunissen, and W.W. de Jong, The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones, 2003. 8(1): p. 53-61.

58. Taylor, R.P. and I.J. Benjamin, Small heat shock proteins: a new classification scheme in mammals. J Mol Cell Cardiol, 2005. 38(3): p. 433-44.

71. Tessier, D.J., P. Komalavilas, A. Panitch, L. Joshi, and C.M. Brophy, The small heat shock protein (HSP) 20 is dynamically associated with the actin cross-linking protein actinin. J Surg Res, 2003.111(1): p. 152-7.

72. Golenhofen, N., M.D. Perng, R.A. Quinlan, and D. Drenckhahn, Comparison of the small heat shock proteins alphaB-crystallin, MKBP, HSP25, HSP20, and cvHSP in heart and skeletal muscle. Histochem Cell Biol, 2004.122(5): p. 415-25.

73. Bukach, O.V., S.B. Marston, and N.B. Gusev, Small heat shock protein with apparent molecular mass 20 kDa (Hsp20, HspB6) is not a genuine actin-hinding protein. J Muscle Res Cell Motil, 2005. 26(4-5): p. 175-81.

74. Bukach, O.V., A.E. Glukhova, A.S. Seit-Nebi, and N.B. Gusev, Heterooligomeric complexes formed by human small heat shock proteins HspBl (Hsp27) and HspB6 (Hsp20). Biochim Biophys Acta, 2009.1794(3): p. 486-95.

75. Mymrikov, E.V., A.S. Seit-Nebi, and N.B. Gusev, Heterooligomeric complexes of human small heat shock proteins. Cell Stress Chaperones, 2012.17(2): p. 157-69.

76. Fontaine, J.M., X. Sun, R. Benndorf, and M.J. Welsh, Interactions ofHSP22 (HSPB8) with HSP20, alphaB-crystallin, and HSPB3. Biochem Biophys Res Commun, 2005. 337(3): p. 1006-11.

77. Takuwa, Y., G. Kelley, N. Takuwa, and H. Rasmussen, Protein phosphorylation changes in bovine carotid artery smooth muscle during contraction and relaxation. Mol Cell Endocrinol, 1988. 60(1): p. 71-86.

78. Beall, A.C., K. Kato, J.R. Goldenring, H. Rasmussen, and C.M. Brophy, Cyclic nucleotide-dependent vasorelaxation is associated with the phosphorylation of a small heat shock-related protein. J Biol Chem, 1997. 272(17): p. 11283-7.

79. Beall, A., D. Bagwell, D. Woodrum, T.A. Stoming, K. Kato, A. Suzuki, H. Rasmussen, and C.M. Brophy, The small heat shock-related protein, HSP20, is phosphorylated on serine 16 during cyclic nucleotide-dependent relaxation. J Biol Chem, 1999. 274(16): p. 11344-51.

80. Edwards, H.V., J.D. Scott, and G.S. Baillie, PKA phosphorylation of the small heat-shock protein Hsp20 enhances its cardioprotective effects. Biochem Soc Trans, 2012. 40(1): p. 210-4.

81. Wang, Y., A. Xu, R.B. Pearson, and G.J. Cooper, Insulin and insulin antagonists evoke phosphorylation of P20 at serine 157 and serine 16 respectively in rat skeletal muscle. FEBS Lett, 1999. 462(1-2): p. 25-30.

82. Wang, Y., A. Xu, J. Ye, E.W. Kraegen, C.A. Tse, and G.J. Cooper, Alteration in phosphorylation ofP20 is associated with insulin resistance. Diabetes, 2001. 50(8): p. 18217.

83. van de Klundert, F., I.P. van den, GJ. Stege, and W.W. de Jong, Rat Hsp20 confers thermoresistance in a clonal survival assay, but fails to protect coexpressed luciferase in Chinese hamster ovary cells. Biochem Biophys Res Commun, 1999. 254(1): p. 164-8.

84. Edwards, H.V., R.T. Cameron, and G.S. Baillie, The emerging role of HSP20 as a multifunctional protective agent. Cell Signal, 2011. 23(9): p. 1447-54.

85. Chu, G., G.F. Egnaczyk, W. Zhao, S.H. Jo, G.C. Fan, J.E. Maggio, R.P. Xiao, and E.G. Kranias, Phosphoproteome analysis of cardiomyocytes subjected to beta-adrenergic stimulation: identification and characterization of a cardiac heat shock protein p20. Circ Res, 2004. 94(2): p. 184-93.

86. Nicolaou, P., R. Knoll, K. Haghighi, G.C. Fan, G.W. Dorn, 2nd, G. Hasenfub, and E.G. Kranias, Human mutation in the anti-apoptotic heat shock protein 20 abrogates its cardioprotective effects. J Biol Chem, 2008. 283(48): p. 33465-71.

87. Fan, G.C., X. Ren, J. Qian, Q. Yuan, P. Nicolaou, Y. Wang, W.K. Jones, G. Chu, and E.G. Kranias, Novel cardioprotective role of a small heat-shock protein, Hsp20, against ischemia/reperfusion injury. Circulation, 2005.111(14): p. 1792-9.

88. Fan, G.C., X. Zhou, X. Wang, G. Song, J. Qian, P. Nicolaou, G. Chen, X. Ren, and E.G. Kranias, Heat shock protein 20 interacting with phosphorylated Akt reduces doxorubicin-triggered oxidative stress and cardiotoxicity. Circ Res, 2008.103(11): p. 1270-9.

89. Wang, X., B. Zingarelli, M. O'Connor, P. Zhang, A. Adeyemo, E.G. Kranias, Y. Wang, and G.C. Fan, Overexpression of Hsp20 prevents endotoxin-induced myocardial dysfunction and apoptosis via inhibition of NF-kappaB activation. J Mol Cell Cardiol, 2009. 47(3): p. 38290.

90. Fan, G.C., Q. Yuan, G. Song, Y. Wang, G. Chen, J. Qian, X. Zhou, Y.J. Lee, M. Ashraf, and E.G. Kranias, Small heat-shock protein Hsp20 attenuates beta-agonist-mediated cardiac remodeling through apoptosis signal-regulating kinase 1. Circ Res, 2006. 99(11): p. 123342.

91. Qian, J., X. Ren, X. Wang, P. Zhang, W.K. Jones, J.D. Molkentin, G.C. Fan, and E.G. Kranias, Blockade of Hsp20 phosphorylation exacerbates cardiac ischemia/reperfusion injury by suppressed autophagy and increased cell death. Circ Res, 2009.105(12): p. 122331.

92. Zhang, X., X. Wang, H. Zhu, E.G. Kranias, Y. Tang, T. Peng, J. Chang, and G.C. Fan, Hsp20 functions as a novel cardiokine in promoting angiogenesis via activation of VEGFR2. PLoS One, 2012. 7(3): p. e32765.

105. Birkenfeld, J., H. Betz, and D. Roth, Identification of cofilin and LIM-domain-containing protein kinase 1 as novel interaction partners of 14-3-3 zeta. Biochem J, 2003. 369(Pt 1): p. 45-54.

106. Bamburg, J.R. and B.W. Bernstein, Roles of ADF/cofilin in actin polymerization and beyond. F1000 Biol Rep, 2010. 2: p. 62.

107. Oser, M. and J. Condeelis, The cofilin activity cycle in lamellipodia and invadopodia. J Cell Biochem, 2009.108(6): p. 1252-62.

108. Carlier, M.F., V. Laurent, J. Santolini, R. Melki, D. Didry, G.X. Xia, Y. Hong, N.H. Chua, and D. Pantaloni, Actin depolymerizing factor (ADF/cofilin) enhances the rate of filament turnover: implication in actin-based motility. J Cell Biol, 1997.136(6): p. 1307-22.

109. Ichetovkin, I., W. Grant, and J. Condeelis, Cofilin produces newly polymerized actin filaments that are preferred for dendritic nucleation by the Arp2/3 complex. Curr Biol, 2002.12(1): p. 79-84.

110. Andrianantoandro, E. and T.D. Pollard, Mechanism of actin filament turnover by severing and nucleation at different concentrations of ADF/cofilin. Mol Cell, 2006. 24(1): p. 13-23.

111. Yonezawa, N., E. Nishida, K. Iida, I. Yahara, and H. Sakai, Inhibition of the interactions of cofilin, destrin, and deoxyribonuclease I with actin by phosphoinositides. J Biol Chem, 1990. 265(15): p. 8382-6.

112. van Rheenen, J., X. Song, W. van Roosmalen, M. Cammer, X. Chen, V. Desmarais, S.C. Yip, J.M. Backer, R.J. Eddy, and J.S. Condeelis, EGF-inducedPIP2 hydrolysis releases and activates cofilin locally in carcinoma cells. J Cell Biol, 2007. 179(6): p. 1247-59.

113. Frantz, C., G. Barreiro, L. Dominguez, X. Chen, R. Eddy, J. Condeelis, M.J. Kelly, M.P. Jacobson, and D.L. Barber, Cofilin is a pH sensor for actin free barbed end formation: role ofphosphoinositide binding. J Cell Biol, 2008.183(5): p. 865-79.

114. Arber, S., F.A. Barbayannis, H. Hanser, C. Schneider, C.A. Stanyon, O. Bernard, and P. Caroni, Regulation of actin dynamics through phosphorylation of cofilin by LIM-kinase. Nature, 1998. 393(6687): p. 805-9.

115. Scott, R.W. and M.F. Olson, LIMkinases: function, regulation and association with human disease. J Mol Med (Berl), 2007. 85(6): p. 555-68.

116. Toshima, J., J.Y. Toshima, T. Amano, N. Yang, S. Narumiya, and K. Mizuno, Cofilin phosphorylation by protein kinase testicular protein kinase 1 and its role in integrin-mediated actin reorganization and focal adhesion formation. Mol Biol Cell, 2001. 12(4): p. 1131-45.

117.

118.

119.

120.

121.

122.

123.

124.

125,

126.

127

128

129,

Toshima, J., J.Y. Toshima, K. Takeuchi, R. Mori, and K. Mizuno, Cofilin phosphorylation and actin reorganization activities of testicular protein kinase 2 and its predominant expression in testicular Sertoli cells. J Biol Chem, 2001. 276(33): p. 31449-58. Edwards, D.C., L.C. Sanders, G.M. Bokoch, and G.N. Gill, Activation of LIM-kinase by Pakl couples Rac/Cdc42 GTPase signalling to actin cytoskeletal dynamics. Nat Cell Biol, 1999.1(5): p. 253-9.

Toshima, J.Y., J. Toshima, T. Watanabe, and K. Mizuno, Binding of 14-3-3beta regulates the kinase activity and subcellular localization of testicular protein kinase 1. J Biol Chem, 2001. 276(46): p. 43471-81.

Nagata-Ohashi, K., Y. Ohta, K. Goto, S. Chiba, R. Mori, M. Nishita, K. Ohashi, K. Kousaka, A. Iwamatsu, R. Niwa, T. Uemura, and K. Mizuno, A pathway of neuregulin-induced activation of cofilin-phosphatase Slingshot and cofilin in lamellipodia. J Cell Biol, 2004.165(4): p. 465-71.

Niwa, R., K. Nagata-Ohashi, M. Takeichi, K. Mizuno, and T. Uemura, Control of actin reorganization by Slingshot, a family of phosphatases that dephosphorylate ADF/cofilin. Cell, 2002.108(2): p. 233-46.

Gohla, A., J. Birkenfeld, and G.M. Bokoch, Chronophin, a novel HAD-type serine protein phosphatase, regulates cofilin-dependent actin dynamics. Nat Cell Biol, 2005. 7(1): p. 21-9. Soosairajah, J., S. Maiti, O. Wiggan, P. Sarmiere, N. Moussi, B. Sarcevic, R. Sampath, J.R. Bamburg, and O. Bernard, Interplay between components of a novel LIM kinase-slingshot phosphatase complex regulates cofilin. EMBO J, 2005. 24(3): p. 473-86. Eiseler, T., H. Doppler, I.K. Yan, K. Kitatani, K. Mizuno, and P. Storz, Protein kinase D1 regulates cofilin-mediated F-actin reorganization and cell motility through slingshot. Nat Cell Biol, 2009.11(5): p. 545-56.

Aitken, A., 14-3-3 proteins: a historic overview. Semin Cancer Biol, 2006.16(3): p. 162-72. Sluchanko, N.N. and N.B. Gusev, 14-3-3 proteins and regulation of cytoskeleton. Biochemistry (Mosc), 2010. 75(13): p. 1528-46.

Boston, P.F., P. Jackson, and R.J. Thompson, Human 14-3-3 protein: radioimmunoassay, tissue distribution, and cerebrospinal fluid levels in patients with neurological disorders. J Neurochem, 1982. 38(5): p. 1475-82.

Subramanian, R.R., S.C. Masters, H. Zhang, and H. Fu, Functional conservation of 14-3-3 isoforms in inhibiting bad-induced apoptosis. Exp Cell Res, 2001. 271(1): p. 142-51. Van Der Hoeven, P.C., J.C. Van Der Wal, P. Ruurs, M.C. Van Dijk, and J. Van Blitterswijk, 14-3-3 isotypes facilitate coupling of protein kinase C-zeta to Raf-1: negative regulation by 14-3-3 phosphorylation. Biochem J, 2000. 345 Pt 2: p. 297-306.

130. Jones, D.H., S. Ley, and A. Aitken, Isoforms of 14-3-3 protein can form homo- and heterodimers in vivo and in vitro: implications for function as adapter proteins. FEBS Lett, 1995.368(1): p. 55-8.

131. Liang, X., M.B. Butterworth, K.W. Peters, W.H. Walker, and R.A. Frizzell, An obligatory heterodimer of 14-3-3beta and 14-3-3epsilon is required for aldosterone regulation of the epithelial sodium channel. J Biol Chem, 2008. 283(41): p. 27418-25.

132. Verdoodt, B., A. Benzinger, G.M. Popowicz, T.A. Holak, and H. Hermeking, Characterization of 14-3-3sigma dimerization determinants: requirement of homodimerization for inhibition of cell proliferation. Cell Cycle, 2006. 5(24): p. 2920-6.

133. Freeman, A.K. and D.K. Morrison, 14-3-3 Proteins: diverse functions in cell proliferation and cancer progression. Semin Cell Dev Biol, 2011. 22(7): p. 681-7.

134. Xiao, B., S.J. Smerdon, D.H. Jones, G.G. Dodson, Y. Soneji, A. Aitken, and S.J. Gamblin, Structure of a 14-3-3 protein and implications for coordination of multiple signalling pathways. Nature, 1995. 376(6536): p. 188-91.

135. Liu, D., J. Bienkowska, C. Petosa, R.J. Collier, H. Fu, and R. Liddington, Crystal structure of thezeta isoform of the 14-3-3 protein. Nature, 1995. 376(6536): p. 191-4.

136. Gardino, A.K., S.J. Smerdon, and M.B. Yaffe, Structural determinants of 14-3-3 binding specificities and regulation of subcellular localization of 14-3-3-ligand complexes: a comparison of the X-ray crystal structures of all human 14-3-3 isoforms. Semin Cancer Biol, 2006.16(3): p. 173-82.

137. Yaffe, M.B., K. Rittinger, S. Volinia, P.R. Caron, A. Aitken, H. Leffers, S.J. Gamblin, S.J. Smerdon, and L.C. Cantley, The structural basis for 14-3-3:phosphopeptide binding specificity. Cell, 1997. 91(7): p. 961-71.

138. Obsil, T., R. Ghirlando, D.C. Klein, S. Ganguly, and F. Dyda, Crystal structure of the 14-3-3zeta:serotonin N-acetyltransferase complex, a role for scaffolding in enzyme regulation. Cell, 2001.105(2): p. 257-67.

139. Mackintosh, C., Dynamic interactions between 14-3-3 proteins and phosphoproteins regulate diverse cellular processes. Biochem J, 2004. 381(Pt 2): p. 329-42.

140. Muslin, A.J., J.W. Tanner, P.M. Allen, and A.S. Shaw, Interaction of 14-3-3 with signaling proteins is mediated by the recognition of phosphoserine. Cell, 1996. 84(6): p. 889-97.

141. Coblitz, B., M. Wu, S. Shikano, and M. Li, C-terminal binding: an expanded repertoire and function of 14-3-3proteins. FEBS Lett, 2006. 580(6): p. 1531-5.

142. Bustos, D.M. and A.A. Iglesias, Intrinsic disorder is a key characteristic in partners that bind 14-3-3 proteins. Proteins, 2006. 63(1): p. 35-42.

143. Kostelecky, B., A.T. Saurin, A. Purkiss, P.J. Parker, and N.Q. McDonald, Recognition of an intra-chain tandem 14-3-3 binding site within PKCepsilon. EMBO Rep, 2009. 10(9): p. 983-9.

144. Obsil, T., R. Ghirlando, D.E. Anderson, A.B. Hickman, and F. Dyda, Two 14-3-3 binding motifs are required for stable association of Forkhead transcription factor F0X04 with 143-3 proteins and inhibition ofDNA binding. Biochemistry, 2003. 42(51): p. 15264-72.

145. Yaffe, M.B., How do 14-3-3 proteins work?— Gatekeeper phosphorylation and the molecular anvil hypothesis. FEBS Lett, 2002. 513(1): p. 53-7.

146. Yasmin, L., A.L. Jansson, T. Panahandeh, R.H. Palmer, M.S. Francis, and B. Hallberg, Delineation of exoenzyme S residues that mediate the interaction with 14-3-3 and its biological activity. FEBS J, 2006. 273(3): p. 638-46.

147. Muslin, A.J. and H. Xing, 14-3-3 proteins: regulation of subcellular localization by molecular interference. Cell Signal, 2000.12(11-12): p. 703-9.

148. Ichimura, T., J. Uchiyama, O. Kunihiro, M. Ito, T. Horigome, S. Omata, F. Shinkai, H. Kaji, and T. Isobe, Identification of the site of interaction of the 14-3-3 protein with phosphorylated tryptophan hydroxylase. J Biol Chem, 1995. 270(48): p. 28515-8.

149. Tzivion, G., Z. Luo, and J. Avruch, A dimeric 14-3-3 protein is an essential cofactor for Raf kinase activity. Nature, 1998. 394(6688): p. 88-92.

150. Shen, Y.H., J. Godlewski, A. Bronisz, J. Zhu, M.J. Comb, J. Avruch, and G. Tzivion, Significance of 14-3-3 self-dimerization for phosphorylation-dependent target binding. Mol Biol Cell, 2003.14(11): p. 4721-33.

151. Messaritou, G., S. Grammenoudi, and E.M. Skoulakis, Dimerization is essential for 14-3-3zeta stability andfunction in vivo. J Biol Chem, 2010. 285(3): p. 1692-700.

152. Zhou, Y., S. Reddy, H. Murrey, H. Fei, and I.B. Levitan, Monomeric 14-3-3 protein is sufficient to modulate the activity of the Drosophila slowpoke calcium-dependent potassium channel. J Biol Chem, 2003. 278(12): p. 10073-80.

153. Han, D., G. Ye, T. Liu, C. Chen, X. Yang, B. Wan, Y. Pan, and L. Yu, Functional identification of a novel 14-3-3 epsilon splicing variant suggests dimerization is not necessary for 14-3-3 epsilon to inhibit UV-induced apoptosis. Biochem Biophys Res Commun, 2010. 396(2): p. 401-6.

154. Aitken, A., Post-translational modification of 14-3-3 isoforms and regulation of cellular function. Semin Cell Dev Biol, 2011. 22(7): p. 673-80.

155. Powell, D.W., M.J. Rane, Q. Chen, S. Singh, and K.R. McLeish, Identification of 14-3-3zeta as a protein kinase B/Akt substrate. J Biol Chem, 2002. 277(24): p. 21639-42.

156. Powell, D.W., M.J. Rane, B.A. Joughin, R. Kalmukova, J.H. Hong, B. Tidor, W.L. Dean, W.M. Pierce, J.B. Klein, M.B. Yaffe, and K.R. McLeish, Proteomic identification of 14-3-3zeta as a mitogen-activated protein kinase-activated protein kinase 2 substrate: role in dimerformation and ligand binding. Mol Cell Biol, 2003. 23(15): p. 5376-87.

157. Gu, Y.M., Y.H. Jin, J.K. Choi, K.H. Baek, C.Y. Yeo, and K.Y. Lee, Protein kinase A phosphorylates and regulates dimerization of 14-3-3 epsilon. FEBS Lett, 2006. 580(1): p. 305-10.

158. Zhou, J., Z. Shao, R. Kerkela, H. Ichijo, A.J. Muslin, C. Pombo, and T. Force, Serine 58 of 14-3-3zeta is a molecular switch regulating ASK1 and oxidant stress-induced cell death. Mol Cell Biol, 2009. 29(15): p. 4167-76.

159. Woodcock, J.M., J. Murphy, F.C. Stomski, M.C. Berndt, and A.F. Lopez, The dimeric versus monomeric status of 14-3-3zeta is controlled by phosphorylation of Ser58 at the dimer interface. J Biol Chem, 2003. 278(38): p. 36323-7.

160. Kanno, T. and T. Nishizaki, Sphingosine induces apoptosis in hippocampal neurons and astrocytes by activating caspase-3/-9 via a mitochondrial pathway linked to SDK/14-3-3 protein/Bax/cytochrome c. J Cell Physiol, 2011. 226(9): p. 2329-37.

161. Woodcock, J.M., Y. Ma, C. Coolen, D. Pham, C. Jones, A.F. Lopez, and S.M. Pitson, Sphingosine and FTY720 directly bind pro-survival 14-3-3 proteins to regulate their function. Cell Signal, 2010. 22(9): p. 1291-9.

162. Tsuruta, F., J. Sunayama, Y. Mori, S. Hattori, S. Shimizu, Y. Tsujimoto, K. Yoshioka, N. Masuyama, and Y. Gotoh, JNK promotes Box translocation to mitochondria through phosphorylation of 14-3-3 proteins. EMBO J, 2004. 23(8): p. 1889-99.

163. Sunayama, J., F. Tsuruta, N. Masuyama, and Y. Gotoh, JNK antagonizes Akt-mediated survival signals by phosphorylating 14-3-3. J Cell Biol, 2005.170(2): p. 295-304.

164. Yoshida, K., T. Yamaguchi, T. Natsume, D. Kufe, and Y. Miki, JNK phosphorylation of 143-3 proteins regulates nuclear targeting of c-Abl in the apoptotic response to DNA damage. Nat Cell Biol, 2005. 7(3): p. 278-85.

165. Truong, A.B., S.C. Masters, H. Yang, and H. Fu, Role of the 14-3-3 C-terminal loop in ligand interaction. Proteins, 2002. 49(3): p. 321-5.

166. Silhan, J., V. Obsilova, J. Vecer, P. Herman, M. Sulc, J. Teisinger, and T. Obsil, 14-3-3 protein C-terminal stretch occupies ligand binding groove and is displaced by phosphopeptide binding. J Biol Chem, 2004. 279(47): p. 49113-9.

167. Dubois, T., C. Rommel, S. Howell, U. Steinhussen, Y. Soneji, N. Morrice, K. Moelling, and A. Aitken, 14-3-3 is phosphorylated by casein kinase I on residue 233. Phosphorylation at this site in vivo regulates Raf/14-3-3 interaction. J Biol Chem, 1997. 272(46): p. 28882-8.

168. Obsilova, V., P. Herman, J. Vecer, M. Sulc, J. Teisinger, and T. Obsil, 14-3-3zeta C-terminal stretch changes its conformation upon ligand binding and phosphorylation at Thr232. J Biol Chem, 2004. 279(6): p. 4531-40.

169. An, S.S., P.S. Askovich, T.I. Zarembinski, K. Ahn, J.M. Peltier, M. von Rechenberg, S. Sahasrabudhe, and J.J. Fredberg, A novel small molecule target in human airway smooth muscle for potential treatment of obstructive lung diseases: a staged high-throughput biophysical screening. Respir Res, 2011.12: p. 8.

170. Studier, F.W., Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif, 2005. 41(1): p. 207-34.

171. Chung, C.T., S.L. Niemela, and R.H. Miller, One-step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution. Proc Natl Acad Sci USA, 1989. 86(7): p. 2172-5.

172. Pardee, J.D. and J. A. Spudich, Purification of muscle actin. Methods Enzymol, 1982. 85 Pt B: p. 164-81.

173. Schaub, M.C. and S.V. Perry, The relaxing protein system of striated muscle. Resolution of the troponin complex into inhibitory and calcium ion-sensitizing factors and their relationship to tropomyosin. Biochem J, 1969.115(5): p. 993-1004.

174. Nosworthy, N.J., M. Kekic, and C.G. dos Remedios, The affinity of chick cofilin for actin increases when actin is complexed with DNase I: formation of a cofilin-actin-DNase I ternary complex. Proteomics, 2001.1(12): p. 1513-8.

175. Laemmli, U.K., Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970. 227(5259): p. 680-5.

176. Perrie, W.T. and S.V. Perry, An electrophoretic study of the low-molecular-weight components of myosin. Biochem J, 1970.119(1): p. 31-8.

177. Houk, T.W., Jr. and K. Ue, The measurement of actin concentration in solution: a comparison of methods. Anal Biochem, 1974. 62(1): p. 66-74.

178. Sluchanko, N.N., I.S. Chernik, A.S. Seit-Nebi, A.V. Pivovarova, D.I. Levitsky, and N.B. Gusev, Effect of mutations mimicking phosphorylation on the structure and properties of human 14-3-3zeta. Arch Biochem Biophys, 2008. 477(2): p. 305-12.

179. Yang, X., W.H. Lee, F. Sobott, E. Papagrigoriou, C.V. Robinson, J.G. Grossmann, M. Sundstrom, D.A. Doyle, and J.M. Elkins, Structural basis for protein-protein interactions in the 14-3-3 protein family. Proc Natl Acad Sci USA, 2006.103(46): p. 17237-42.

180. Moriyama, K., K. Iida, and I. Yahara, Phosphorylation of Ser-3 of cofilin regulates its essential function on actin. Genes Cells, 1996.1(1): p. 73-86.

181. Datskevich, P.N., E.V. Mymrikov, N.N. Sluchanko, A.A. Shemetov, M.V. Sudnitsyna, and N.B. Gusev, Expression, purification and some properties offluorescent chimeras of human small heat shock proteins. Protein Expr Purif, 2012. 82(1): p. 45-54.

182. Sarmiere, P.D. and J.R. Bamburg, Regulation of the neuronal actin cytoskeleton by ADF/cofilin. J Neurobiol, 2004. 58(1): p. 103-17.

183. Agnew, B.J., L.S. Minamide, and J.R. Bamburg, Reactivation of phosphorylated actin depolymerizing factor and identification of the regulatory site. J Biol Chem, 1995. 270(29): p. 17582-7.

184. Chen, H., B.W. Bernstein, and J.R. Bamburg, Regulating actin-filament dynamics in vivo. Trends Biochem Sci, 2000. 25(1): p. 19-23.

Информация о работе

Судницына, Мария Викторовна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Взаимодействие малого белка теплового шока HSPB6 с универсальным адаптерным белком 14-3-3 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы