Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие компонентов системы инициации трансляции с цитоскелетом

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие компонентов системы инициации трансляции с цитоскелетом"

На правах рукописи

ИВАНОВ ПАВЕЛ АЛЕКСАНДРОВИЧ

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСЛЯЦИИ С ЦИТОСКЕЛЕТОМ

03.00.03 - Молекулярная биолология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2003

Работа выполнена в отделе функциональной биохимии биополимеров НИИ физико-химической биологии им. А.Н Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова и в группе клеточной биологии Института белка РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук

Надеждина Елена Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Отпценко Галина Евгеньевна

доктор биологических наук

Степанов Александр Семенович

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им В.А.Энгельгардта РАН

Защита диссертации состоится

декабря 2003 г. в

час. на заседании

диссертационного совета Д 501.001.76 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992 Москва, Ленинские горы, МГУ, Лаб Корп. «А», НИИ физико-химической биологии им А.Н. Белозерского, в аудитории 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан_ноября 2003 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Н.О. Калинина

ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Процесс трансляции является наиболее сложным и наименее изученным из всех процессов реализации генетической информации в клетке. Его расшифровка - одна из ключевых задач современной молекулярной и клеточной биологии. В настоящее время существует крайне мало данных об организации процесса биосинтеза белка в цитоплазме живых клеток, поскольку изучение его проводилось в основном в бесклеточных системах. В частности, в цитоплазме живой клетки, в отличие от бесклеточной системы, наблюдается ограничение скоростей диффузии, в особенности диффузии крупных макромолекулярных комплексов. В процессе трансляции происходит объединение нескольких десятков компонентов аппарата трансляции, что означает необходимость достаточно быстрого перемещения их по цитоплазме. Перемещение по цитоплазме за счет свободной диффузии многих из них ограничено в силу достаточно больших размеров.

Мы предположили, что перемещение по цитоплазме массивных компонентов аппарата трансляции возможно при активном транспорте по микротрубочкам или микрофиламентам. В качестве модели для изучения взаимодействия компонентов аппарата трансляции с цитоскелетом, нами было выбрано образование стрессовых гранул. При стрессорных воздействиях на клетку происходит резкое уменьшение общего белкового синтеза. На визуальном уровне, этот процесс сопровождается быстрым накоплением компонентов 48S инициаторного комплекса в нескольких десятках локусов в цитоплазме, называемых стрессовыми гранулами (Stress-granule). Предполагается, что в цитоплазме клетки конститутивно существуют определенные области, где происходит переход мРНК от стадии инициации трансляции к элонгации. При стрессориых воздействиях на клетку происходит ингибирование этого процесса, что приводит к накоплению в этих зонах компонентов 48S инициаторного комплекса (мРНК, малая рибосомальная субъединица, факторы инициации трансляции elFl, eIF4F и eIF3) и, соответственно, визуализации этих областей как стрессовых гранул (Kedersha and Anderson, 2001). Достаточно высокая скорость накопления компонентов 48S инициагорных комплексов в стрессовых гранулах позволяет предположить, что этот процесс может быть связан с цитоскелетными структурами. В частости, за счет активного транспорта могут перемещаться компонеюп^^^^^^мдч-

БИБЛИОТЕКА I

Изучению взаимосвязи между образованием стрессовых гранул и цитоскелетом посвящена первая часть нашей работы.

Вторым направлением нашей работы было исследование взаимодействия одного из компонентов стрессовых гранул - фактора eIF3 - с микротрубочками в норме. Первоначально в нашей лаборатории были получены данные, что большая субъединица этого фактора - белок р170 - находится в препарате микротрубочек, выделенных из мозгового слоя надпочечников крупного рогатого скота (Severin et ей., 1999). Поэтому мы решили изучить, существует ли специфическое взаимодействие с микротрубочками этого белка и, если существует, чем оно может быть опосредовано.

Цель настоящей работы. Целью настоящей работы было установление взаимодействия компонентов системы инициации трансляции с цитоскелетом. Первым направлением исследований являлось изучение роли цитоскелета в распределении компонентов аппарата трансляции в условиях образования стрессовых гранул. Вторым направлением исследований явилось изучение взаимодействия с цитоскелетом конкретного компонента аппарата трансляции -фактора инициации elF3. В рамках этих двух направлений исследований нами были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Исследовать влияние системы микротрубочек на образование стрессовых гранул.

2. Исследовать влияние системы микрофиламентов на образование стрессовых гранул.

3. При обнаружении взаимосвязи между одной из систем цитоскелета и образованием стресс-гранул показать, что экспериментальное воздействие, выявляющее данную взаимосвязь, не вызывает изменений в регуляторном пути, приводящим к индукции (прессовых гранул.

4. Проверить наличие взаимодействий большой субъединицы фактора eIF3 р170 с микротрубочками.

5. При наличии взаимодействия с микротрубочками, картировать область в белке р170, необходимую для такого взаимодействия.

Научная новизна и практическое значение работы. Работа вносит значительный вклад в изучение одной из фундаментальных проблем биологии -изучение механизма биосинтеза белка в клетке. Первая часть работы посвящена цедавно открытому для клеток млекопитающих явлению - образованию

стрессовых гранул, при котором происходит накопление некоторых компонентов аппарата трансляции в определенных зонах цитоплазмы. В работе впервые показано участие системы микротрубочек в процессе формирования стрессовых гранул. Хотя явление образования стрессовых гранул наблюдается только при стрессорных воздействиях на клетку, оно, вероятно, отражает общие закономерности пространственного и временного распределения компонентов аппарата трансляции в цитоплазме живой клетки. Данные, полученные при изучении этого явления, важны для понимания организации процесса трансляции в зукариотической клетке и, с другой стороны, для понимания механизма токсических воздействий на клетки. В работе исследована также ассоциация с микротрубочковым цитоскелетом одного из компонентов стрессовых гранул - фактора eIF3. Впервые получены данные о возможном взаимодействии этого фактора с микротрубочками в клетках высших эукариот. Впервые локализован участок связывания с белком микротрубочек тубулином в молекуле большой субъединицы eIF3 - белке р170.

Полученные в диссертации оригинальные данные могут быть применены в дальнейшей экспериментальной работе при изучении механизмов биосинтеза белка в клетке, а также при разработке комплексных цитостатических воздействий на клетки и ткани. Данные также могут быть использованы при чтении лекций и написании учебников по курсу клеточной биологии.

Приведенный в настоящей работе обзор литературы имеет самостоятельное значение. В нем собраны и обобщены имеющиеся в литературе сведения о компонентах эукариотического аппарата трансляции и о возможной их связи с цитоскелетом.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на ежегодных конференциях Института белка РАН (Пущине, 1999, 2002), Всероссийском симпозиуме «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000), симпозиуме "The Л ant Cytoskeleton: functional diversity and biotechnological implications" (Киев, 2002), семинаре лаборатории анализа генома в Институте общей генетики РАН (2003), Московском семинаре по клеточной биологии (2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура работы. Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение результатов», «Выводы» и «Список литературы».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Работа с культивируемыми клетками. Клетки культур CV-1 (фибробласты почки зелбной мартышки) и Cos? (дериват CV-1 с постоянной экспрессией Т-антигена вируса SV-40) выращивали на смеси 1:1 сред DMEM и F10. В среду добавляли 10% сыворотки крови новорожденных телят («Sigma") или 10% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота («Биолот»), а также 100 мкг/мл гентамицина. Культуры росли при стандартных условиях (температура 37°С, содержание углекислого газа в среде 5%.)

Для индукции окислительного стресса клетки инкубировали в течение 30 минут в среде, содержащей 2,8 мМ арсенат натрия. Для разрушения микротрубочек клетки инкубировали в среде, содержащей метил-[5-(тиенилкарбонил)-Ш-бензимидазол-2-ил]карбамат (нокодазол, "Sigma") в концентрации 1,6 или 6,6 мМ. Для стабилизации микротрубочек использовали алкалоид из коры Taxus brevifolia таксол ("Sigma") в концентрации 11,7 мМ. Для разрушения актиновых филаментов применяли токсин Latrunculia magnifica латранкулин В ("Calbiochem") в концентрации 2 мМ.

Иммунофлуоресцентные исследования. Для последующего непрямого иммунофлуоресцеитного окрашивания клетки фиксировали 1% глутаровым альдегидом, 3% формалином или абсолютным метанолом при -20°С. Использовали поликлональные кроличьи антитела к белку р 170 и к тубулину (полученные ранее в лаборатории), поликлональные кроличьи антитела к поли(А)-связывающему белку (РАВР, любезно предоставленные И. Н. Шатским), моноклональные мышиные антитела к тубулину DM-1A ("Sigma") и к зеленому флуоресцентному белку (GFP) ЗА9 (любезно предоставленные А. Ю. Суровым). В качестве вторых использовали козьи антитела к иммуноглобулинам кролика или мыши, соответственно, меченные FITC или TRITC ("Sigma", "Life technologies"). Для выявления F-актина использовали фаллоидин, меченный TRITC ("Sigma"). Препараты клеток просматривали в микроскопе Axiophot («Zeiss»), фотографии получали с помощью цифровой

видеокамеры MicroMax («Princeton Instruments»). Использовали объективы Planapo бЗх и 40х.

Трансфекция. Для трансфекции эукариотических клеток выделение плазмидной ДНК проводили с использованием колонок фирм "Gibco" или "Qiagen". Трансфекцию проводили липосомным методом согласно протоколу производителя с использованием реагентов Unifectin-56 и Unifectm-21 (любезно предоставленных в Институте биоорганической химии им. М_ А. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН). Клетки наблюдали и фиксировали через 18-24 часа после трансфекции.

Клонирование. Полимеразную цепную реакцию, а также рестрикцию, лигирование и трансформацию бактерий проводили согласно принятым методикам (Satnbrook et al., 1989). Также согласно протоколам производителей проводили синтез в E.coli белков, трансляционно слитых с GST (вектор pGEX-4Т, "Strategen") и их очистку на глютатион-агарозе ("Sigma"). В качестве матрицы для ПЦР полноразмерного р170 и его фрагментов использовали кДНК KIA00139, любезно предоставленную Kazusa DNA Research Institute (Япония). Для клонирования и наращивания ДНК использовали штамм Е. coli DH-5a Для экспрессии белков, трансляционно слитых с GST, использовали штамм Б. coli BL-21.

Электрофорез и иммуноблотинг белков. Электрофорез белков проводили в 10% акриламидном геле в денатурирующих условиях (Laemmli, 1970). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли методом влажного переноса (Kyhse-Andersen, 1984). Для выявления белков на мембране применяли описанные выше первые антитела, а также моноклональные антитела к фосфорилированной форме фактора еШ2а ("Life Technologies"). Использовали вторые антитела, коньюгированные с пероксидазой хрена или щелочной фосфатазой («Имтек»),

Выделение тубулияа и изучение его взаимодействия с р170. Тубулин выделяли из мозга крупного рогатого скота описанным ранее методом полимеризации-деполимеризации (Kuznetsov et al., 1978) и очищали его на колонке с фосфоцеллюлозой ("Whatman»). Фрагменты белка р170, трансляционно слитые с GST, очищали из клеток Е. coli и сорбировали на глютатион-агарозе. Смолу с сорбированными белками инкубировали в

осветленном лизате клеток Cos7 или в растворе чистого тубулина, промывали и анализировали связавшиеся белки методом иммуноблотинга.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ При индукции окислительного стресса, вызванного воздействием арсеиата натрия, мы наблюдали образование стрессовых гранул, выявляя их в клетке антителами к большой субъединице фактора eIF3 р170. Стрессовые гранулы располагались, главным образом, в области окружающей ядро и центральную часть клетки, исключая район, где предположительно располагается центросома (Рис.1).

Рисунок 1. Индукция образования стрессовых гранул в клетках С\М действием арсената. Распределение р170 А - в контрольных клетках, Б - после 30 минут окислительного стресса. Иммунофлуоресцентные микрофотографии, кон траст изображения инвертирован. Масштаб -10 мкы.

В наших условиях индукции окислительного стресса стрессовые гранулы образовывались в большинстве клеток (74+16%). Среднее количество стрессовых гранул в клетке было около 100 (101+50). Эти гранулы были неодинаковы по размерам, варьируя от <0,5 мкм до >1,5 мкм (Рис.2).

Для проверки влияния цитоскелета на образование стрессовых гранул мы использовали предобработку клеток различными агентами, влияющими на систему микрсггрубочек или микрофиламевгов перед индукцией окислительного стресса. Сами по себе, эти вещества не индуцировали образование стрессовых гранул. Разрушение системы микротрубочек, вызванное обработкой клеток нокодазолом, приводило к резкому ухудшению

и.) 1-й *1Л«ш

Рисунок 2. Неоднородность стрессовых гранул по размеру. Слева -стрессовые гранулы в цитоплазме (иммунофлуоресцентная микрофотография, контраст изображения инвертирован), справа - относительное количество стрессовых гранул различного размера (в %).

образования стрессовых гранул в клетках, уменьшению доли клеток, образующих гранулы и доли больших стрессовых гранул (Рис.3, 5, б). Степень ухудшения формирования стрессовых гранул зависела от концентрации нокодазола, то есть, от степени сохранности микротрубочек в клетке. Эффект, наблюдаемый нами при разрушении микротрубочек, был обратим. При восстановлении системы микротрубочек (после удаления из среды нокодазола) на фоне окислительного стресса, мы наблюдали возникновение стрессовых гранул (Рис. 3).

Для проверки влияния цитоскелета на образование стрессовых гранул мы использовали предобработку клеток различными агентами, влияющими на систему микротрубочек или микрофиламентов перед индукцией окислительного стресса. Сами по себе, эти вещества не индуцировали образование стрессовых гранул. Разрушение системы микротрубочек, вызванное обработкой клеток нокодазолом, приводила к резкому ухудшению образования стрессовых гранул в клетках, уменьшению доли клеток, образующих гранулы и доли больших стрессовых гранул (Рис.3, 5, 6). Степень ухудшения формирования стрессовых гранул зависела от концентрации нокодазола, то есть, от степени сохранности микротрубочек в клетке. Эффект, наблюдаемый нами при разрушении микротрубочек, был обратим. При восстановлении системы микротрубочек (после удаления из среды нокодазола) на фоне

окислительного стресса, мы наблюдали возникновение стрессовых гранул (Рис. 3).

Рисунок 3. Обратимость ингибирования образования стрессовых гранул в клетках при разрушении микротрубочек и их последующем восстановлении. Верхняя пара фотографий - действие на клетки арсената натрия на фоне нокодазола. Средняя пара фотографий - 12 минут, нижняя пара фотографий -30 минут отмывки нокодазола. Левая колонка фотографий -иммунофлуоресцентное окрашивание на р170. Правая колонка фотографий -иммунофлуоресцентное окрашивание антителами на тубулин. Контраст изображения инвертирован.

запускающего образование стрессовых гранул. В настоящий момент считается, что запуск образования стрессовых гранул в клетке происходит при фосфорилировашш фактора инициации трансляции еДОа. Методом иммуноблотинга мы выявили в гомогенатах клеток фосфорилированную форму е!Р2а и показали, что предварительное разрушение микротрубочек не влияет на

фосфорилирование этого фактора при окислительном стрессе (Рис. 4). Это свидетельствует о том, что эффект разрушения микротрубочек на образование стрессовых гранул является первичным.

р170

РАВР Тубулив Phospho-eIF2a

Рисунок 4. Иммуноблотинг гомогенатов клеток CV-1, подвергнутых окислительному cipeccy. Дорожки - DMSO - контроль (0,2% DMSO, как при обработке нокодазолом), Noc - клетки, обработанные нокодазолом, Ars -клетки, где был индуцирован окислительный стресс, NocArs - клетки, в которых перед индукцией окислительного стресса были разрушены микротрубочки. Специфическими антителами выявляли белок р170, РАВР, тубулин и фосфоршшрованную форму eIF2a.

Поскольку для выявления стрессовых гранул мы использовали антитела к большой субъединице eIF3 р170, можно было заподозрить, что разрушение микротрубочек не ингибирует формирования стрессовых гранул как таковых, а только препятствует включению туда одного компонента - фактора eIF3. Для проверки этого предположения мы выявляли стрессовые гранулы, используя антитела к РАВР. В клетках, где система микротрубочек была разрушена, РАВР также не входил в состав стрессовых гранул.

Обработка клеток таксолом стабилизирует микротрубочки, что приводит к увеличению их количества и хаотизации расположения в цитоплазме. В клетках, предобработанных этим агентом, мы наблюдали укрупнение стрессовых гранул (Рис. 6) и некоторую хаотизацию их расположения в цитоплазме.

Интересно, что разрушение микрофиламентов не оказывало ингибирующего эффекта на образование стрессовых гранул. В клетках, где микрофиламенты были разрушены обработкой латранкулином В, мы наблюдали даже некоторое улучшение формирования стрессовых гранул - доля крупных гранул была увеличена (Рис. 5, б).

DMSO Noc Ar» NocArs

^»riwq AMI г----ч

*»-■—. » Два»

¿1

ж

31,

ЮШО N0«, N<№1 Тих 1,6шМ 6,6тМ

Шг

Рисунок 5. Доля клеток с стресс-гранулами после 30 минутной инкубации с арсенагом. БМвО - преинкубация с 0М80; Мое, 1,6 тМ - преинкубация с нокодазолом, 1,6 тМ; Ыос, 6,6 тМ - преинкубация с нокодазолом, 6,6 тМ; Тах - преинкубация с таксолом; Ьай- -преинкубация с латранкулином В.

- результат, статистически достоверно отличающийся от контроля.

Таким образом, мы показали, что для формирования стрессовых гранул необходима система микротрубочек, ее нарушение приводило к уменьшению количества клеток, где мы наблюдали образование стрессовых гранул и уменьшению доли крупных стрессовых гранул. Вероятнее всего, роль микротрубочек в формировании стрессовых гранул заключается в транспорте компонентов, входящих в их состав.

I

ШЕ^Ш-,

0М80

1Чос, Кос, Ты 1,6шМ 6,6шМ

Шг

Рисунок б. Доля крупных стрессовых гранул в клетках после 30 минут инкубации с арсенагом. Обозначения, как на рисувке 5.

DMSO Noc, Not, Tax l,6mM iteM

Рисунок 7. Среднее количество стрессовых гранул в клетках после 30 минут инкубации с арсенатом. Обозначения, как на рисунке 5.

Поскольку предполагается, что стрессовые гранулы существуют в цитоплазме конститутивно как места перехода мРНК от инициации к элонгации, наши данные о влиянии системы микротрубочек на образование стрессовых гранул означают наличие связи с микротрубочками (скорее всего эта связь заключается в активном транспорте) одного или нескольких компонентов 48S комплекса. Возникает вопрос о том, какой из компонентов этого комплекса может быть связан с микротрубочками. Существуют указания (Fusco et al., 2003), что одним из компонентов аппарата трансляции, ассоциированным с цитоскелегом, может быть мРНК (в виде мРНП).

Возможно, что с микротрубочками ассоциированы и другие компоненты аппарата трансляции. Мы предположили, что одним из таких компонентов может быть фактор инициации трансляции eIF3. Первоначально в нашей лаборатории были получены данные, что большая субъединица этого фактора -белок р170 - находится в препарате микротрубочек, выделенных из мозгового слоя надпочечников крупного рогатого скота (Severin et al., 1999). Мы проверили, насколько взаимодействие белка р170 с микротрубочками является специфичным, оценивая потерю этого белка из препарата микротрубочек в циклах полимеризации-деполимеризации при выделении микротрубочек из мозга крупного рогатого скота. Метод выделения тубулина микротрубочек основывается на повторяющихся полимеризациях и деполимеризациях тубулина с центрифугированием после каждой стадии (Рис. 8). При этом происходит потеря белков, не ассоциированных или слабо ассоциированных с микротрубочками. Белок р170 при подобной очистке оставался в препарате

тубулина в течении двух циклов полимеризации-деполимеризации (Рис. 8). Это указывает на наличие специфического взаимодействия между р170 и микротрубочками.

.-■/ N/ \ * Р4 г* >о

I

I

Рисунок 8. Соочшцение белка р170 с микротрубочками. Слева - схема |

выделения тубулина из мозга крупного рогатого скота, справа - анализ фракций на наличие белка р170 (иммуноблотинг со специфическими антителами) и тубулина (окрашивание Понсо). I

i

I

Также было показано (Н. А. Шанина, персональное сообщение), что р170 находится в препарате микротрубочек в комплексе с остальными {

субъединицами, то есть в составе полного фактора eIF3. :

При иммунофлуоресцентном выявлении р170 в клетках, данный белок выявлялся в цитоплазме диффузно и в составе мелких гранул, иногда мы видели его частичную локализацию в составе филаментных структур в интерфазных клетках (Рис. 9А). При одновременном выявлении в интерфазных клетках белка щ

р170 и микротрубочек, мы наблюдали частичную со-локализацию филаментных структур, выявляемых антителами к р170 и микротрубочек (Рис. 9А, Б). В

■

митотических клетках белок р170 концентрировался в веретене деления (Рис. 9В). Интересно, что в интерфазных клетках белок р170 практически отсутствовал в районе клеточного центра (Рис. 1 А).

Таким образом, мы показали как in vitro, так и in vivo, что белок р170 взаимодействует с микротрубочками. Возможно, что именно взаимодействие с микротрубочками р170 определяет взаимодействие с микротрубочками фактора eIF3.

♦37«С; ЦЧ>

Рисунок 9. Иммунофлуоресцентное выявление белка р170 в клетках CV-1. Контраст изображения инвертирован. А, Б - интерфазная клетка, В - клепса в митозе. А, В - р170, Б - микротрубочки. Стрелки указывают на распределение р170 вдоль микротрубочек.

Фактор eIF3 состоит из 11-12 разных субъединиц с общим весом около 900 kDa. Функции и взаимодействия субъединиц в составе фактора в настоящий момент изучены крайне плохо. Относительно р170, большой субьединицы фактора, существуют данные, полученные in vitro, что ее наличие не существенно для функционирования фактора в процессе инициации трансляции (Chaudhuri et al., 1997). Исходя из полученных нами данных можно предполагать, что одной из функций этой субьединицы является ассоциация фактора eIF3 с микротрубочками. Возможным объяснением подобной ассоциации с микротрубочками может быть то, что этот фактор может транспортироваться по микротрубочкам (сам по себе или в составе каких-либо комплексов). Гипотеза о транспорте eIF3 по микротрубочкам объясняет также наши данные по иммунофлуоресценции, когда с микротрубочками со-локализовывалась только часть белка р170. Такая частичная «»локализация может быть вызвана тем, что с микротрубочками связывается только транспортирующийся комплекс eIF3.

Показав взаимодействие белка р170 с микротрубочками, мы решили выявил» область в этом белке, необходимую для такого взаимодействия. Мы экспрессировали в клетке фрагменты белка р170, трансляционно слитые с GFP,

которые в совокупности перекрывали всю аминокислотную последовательность белка р170.

Для разделения на фрагменты, мы проанализировали аминокислотную последовательность белка р170 (Рис. 10). Четыре фрагмента (Ы-концевой, Центральный, С-концевой и С-концевой после повторов) мы клонировали и экспрессировали в клетках в виде белков, трансляционно слитых с ОБР (Рис. 10).

р18

р16,7

р15,6

NLS

PCI

А Б

REPEATS

NLS

Ж

1381

В

Рисунок 10. А. Функциональные мотивы, предсказанные в аминокислотной последовательности белка р170. Б. Расположение предполагаемых участков формирующих структуру типа «скрученная спираль». В. Экспрессированные нами фрагменты р170. NLS - сигнал ядерной локализации (23-39аа, 605-62laa, 85б-872аа, 857-873аа, 858-874аа,1274-1290,1280-1296аа), PCI -мотив, обнаруживаемый в субъедицах фактора eIF3, протеосомы и комплекса СОР9 (427-507аа), Repeats - 24 повтора состава (A/M)DDDRGPRRG (952-1152аа)

Два из четырех экспрессированных фрагментов (центральный, М и С-концевой после повторов, Сс) локализовались только в ядре (Рис. 11), N-концевой (N) и С-концевой (С) фрагменты распределялись в ядре и цитоплазме (Рис. 12), причем С-концевой фрагмент локализовался в цитоплазме в виде хаотично распределенных мелких гранул (Рис. 12), N-концевой фрагмент распределялся в цитоплазме диффузно (Рис. 12). При экспрессии всех этих фрагментов р170 система микротрубочек в трансфицированных клетках не нарушалась, также мы не наблюдали солокализации экспрессированных продуктов с микротрубочками (Рис. 12). Интересно, что при экспрессии N-фрагмента часть белка концентрировалась в двух ярких точках, расположенных в области схождения микротрубочек, возможно, в центросоме.

Рисунок 11. Экспрессия в клетках СУ-1 С-концевого после повторов (Сс, верхняя пара фотографий) и центрального фрагментов (М, нижняя пара фотографий) белка р170, слтых с вРР. Слева - свечение вРР, справа -иммунофлуоресцентное окрашивание тубулина. Контраст изображений инвертирован.

Рисунок 12. Экспрессия в клетках СУ-1 С- и К-фрагментов белка р170, слитых с СЁР. Верхняя пара фотографий - экспрессия С-концевого фрагмента, нижняя пара фотографий - экспрессия И-концевого фрагмента. Слева - свечение вРР, справа - иммунофлуоресцентное окрашивание тубулина. Контраст изображений инвертирован.

Мы предположили, что фрагмент р170, где находится участок, необходимый для взаимодействия с микротрубочками, может также связывать димерный тубулин (причем, исходя из экспериментов по соосаждению эндогенного р170, аффинность этого участка к микротрубочкам не очень велика). В этом случае при экспрессии данного фрагмента будет наблюдаться, скорее, диффузное распределение белка в цитоплазме. Подобное распределение характеризовало Н-концевой фрагмент р170. Мы предположили, что именно в этом фрагменте локализуется область, необходимая для взаимодействия с тубулином.

Таким образом, можно предполагать, что взаимодействие белка р170 с микротрубочками определяется аминокислотной последовательностью, расположенной в Н-концевой области, и это взаимодействие прямое.

А Б

1 2 3 4 1 2 3 4 5

Рисунок 13. Связывание тубулина иммобилизованным N-концевым рекомбинантным фрагментом белка р170. Иммуноблотинг с антителами к тубулину. А - преципитация тубулина из клеточного лизата. Дорожки: 1 -клеточный лизат, 2 - 4 - преципитация иммобилизованными белками: 2 - N-концевым фрагментом р170, 3 - С-концевым фрагментом р170 без повторов, 4 - глютатион-8-трансферазой. Б - преципитация иммобилизованным N-концевым фрагментом р170 очищенного тубулина в разных соотношениях pl70N : тубулин. Дорожки: 1 - N-концевой фрагмент, не инкубировавшийся в растворе тубулина, 2 - соотношение pl70N: тубулин 1:2,3 -1:4,4 -1:10, дорожка 5 - препарат очищенного тубулина.

Для проверки этого предположения N-концевой фрагмент р170 экспрессировапи в К coli в виде белка, трансляциояно слитого с глютатион-S-трансферазой, иммобилизовывали на глютатион-агарозе и инкубировали в лизате клеток. Мы обнаружили, что иммобилизованный N-концевой фрагмент,

в отличие от иммобилизованного С-концевого фрагмента или глютатнон-в-трансферазы, может преципигировать димерный тубулин из лизата клеток (Рис.1 ЗА). Таким образом, можно утверждать, что в М-концевой области содержится участок, необходимый для взаимодействия с тубулином. Поскольку в клеточном лизате содержится достаточно много белков, возник вопрос, прямое ли это взаимодействие или оно опосредуется какими-либо дополнительными факторами. Для проверки, может ли М-концевой фрагмент взаимодействовать с димерным тубулином прямо, очищенный и иммобилизованный М-концевой фрагмент инкубировали в растворе, содержащем очищенный на фосфоцеллюлозе тубулин. В этом случае мы также наблюдали преципитацию тубулина М-концевой областью р170 (РисЛЗБ). Таким образом, мы показали, что р170 может непосредственно связываться с тубулином.

ВЫВОДЫ

1. Для образования стрессовых гранул в клетках млекопитающих необходимы цитоплазматические микротрубочки. Экспериментальное разрушение микротрубочек приводит к ингибированию формирования стрессовых гранул. Экспериментальная стабилизация микротрубочек улучшает образование стрессовых гранул.

2. Ингибирующий эффект разборки микротрубочек на образование стрессовых гранул не связан с ингибированием фосфорилирования фактора еП^а.

3. Система актиновых филаментов не является необходимой для формирования стрессовых гранул.

4. Большая субъединица еП?3 р170 взаимодействует с микротрубочками в клетках млекопитающих.

5. Большая субъедшшца еШЗ р170 может взаимодействовать с тубулином микротрубочек напрямую. Последовательность, взаимодействующая с тубулином, расположена в И-концевой части молекулы р170.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Н.А.Шанина, П.А.Иванов, Е.М.Чудинова, Ф.Ф.Северин, Е.С.Надеждина. (2001). Фактор инициации трансляции eIF3 может связываться с микротрубочками в клетках млекопитающих. Молекулярная биология, т. 35. №4. с. 638-646.

2. Е.М.Чудинова, Н.А.Шанина, П.А.Иванов, Ф.Ф.Северин, Е.С.Надеждина. (2001). Взаимодействие белка eIF3 с микротрубочками. Цитология, т. 43. № 4. с. 413.

3. П.А.Иванов, Е.М.Чудинова, Е.С.Надеждина. (2003). Микротрубочки необходимы для образования стресс-гранул. Цитология, т. 45. № 9. с. 880.

4. Е.М.Чудинова, П.А.Иванов, Н.А.Шанина, Е.С.Надеждина. (2003). Поиск участка молекулы большой субъединицы фактора инициации трансляции-3 белка р170 (eEF3a), имеющего аффинность к микротрубочкам. Цитология, т. 45. № 9. с. 944-945.

5. Ivanov, Р.А., Chudinova, Е.М., Nadezhdina, E.S. (2003). RNP stress-granule formation is inhibited by microtubule disruption. Cell Biology International, vol. 27. p. 207-208.

6. Ivanov, P.A., Chudinova, E.M., Nadezhdina, E.S. (2003). Disruption of microtubules inhibits cytoplasmic ribonucleoprotein stress granule formation. Experimental Cell Research, vol. 290. p. 227-233.

Издательство ООО "МАКС Пресс". Лицензия ИД № 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 10.11.2003 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печл. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 872. Тел. 939-3890,939-3891,928-1042. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В.Ломоносова.

Л810 6 1 j

2.0 03-A '

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Иванов, Павел Александрович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Иммобилизация и транспорт компонентов аппарата трансляции в цитоплазме.

Иммобилизация компонентов аппарата трансляции в цитоплазме.

Специфическая локализация мРНК в специализированных клетках.

Специфическая локализация мРНК в неспециализированных клетках.

Активный транспорт белковых компонентов аппарата трансляции.

2. Стрессовые гранулы.

3. Инициация трансляции.

Кэп-независимая инициация трансляции.

Регуляция инициации трансляции.

4. Фактор инициации трансляции 3 (eIF3).

Мотивы, содержащиеся в субъединицах eIF3.

Фактор инициации eIF3 почкующихся дрожжей S. cerevisia.

Фактор инициации eIF3 делящихся дрожжей S. pombe.

Фактор инициации eIF3 человека.

5. Большая субъединица фактора инициации 3 eIF3a.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Работа с ДНК.

Бактериальные штаммы и среды.

Полимеразная цепная реакция.

Рестрикция и лигирование.

Приготовление компетентных клеток и трансформация клеток

Е. coli плазмидной ДНК.

Выделение плазмидной ДНК.

Электрофорез ДНК и элюция из геля.

2. Работа с белками.

Синтез белков в Е. coli.

Очистка рекомбинантных белков, трансляционно слитых с глютатион-Б-трансферазой (GST).

Очистка рекомбинантных белков, трансляционно слитых с 6 His.

Получение поликлональных антител.

Очистка поликлональных антител.

Другие использованные в работе антитела.

Электрофорез белков и иммуноблотинг.

Выделение тубулина из мозга крупного рогатого скота.

Получение МТ из раствора тубулина.

3. Работа с культивируемыми клетками млекопитающих.

Клеточные культуры.

Трансфекция культивируемых клеток.

Фиксация культивируемых клеток.

Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание клеток.

Прямое флуоресцентное окрашивание культивируемых клеток.

Количественные наблюдения клеток с стрессовыми гранулами и статистическая обработка результатов.

Преципитация белков из лизата клеток рекомбинантными фрагментами р170, иммобилизованными на в8Т-агарозе.

4. Буферные растворы.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. Изучение формирования стрессовых гранул.

Качественные исследования стрессовых гранул.

Выявление стрессовых гранул с использованием антител к р170 и

РАВР.

Выявление РНК-связывающего белка р50 в составе стресс-гранул.

Изучение солокализации стрессовых гранул с актиновыми филаментами и микротрубочками.

Подавление образования стрессовых гранул в клетках с разрушенными микротрубочками.

Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток с подавленным образованием стрессовых гранул на РАВР.

Разрушение микротрубочек не влияет на фосфорилирование е1Б2а при последующей индукции стрессовых гранул.

Образование стрессовых гранул при восстановлении

Микротрубочек в присутствии арсената натрия.

Предобработка клеток винбластином.

Предобработка клеток таксолом.

Предобработка клеток латранкулином В.

Количественные исследования стрессовых гранул.

30 минут инкубации с арсенатом.

Сравнение доли клеток со стрессовыми гранулами при различных условиях предобработки клеток

30 мин. инкубации с арсенатом).

Сравнение количества стресс-гранул в клетках при различных условиях предобработки клеток

30 мин. инкубации с арсенатом).

Сравнение относительного количества мелких стресс-гранул при различных условиях предобработки клеток (30 мин. инкубации с арсенатом).

Сравнение количества крупных стресс-гранул при различных условиях предобработки клеток (30 мин. инкубации с арсенатом).

120-минутная инкубация с арсенатом.

Сравнение доли клеток с стресс-гранулами при различных условиях предобработки (120 мин. инкубации с арсенатом).

Сравнение относительного количества стресс-гранул в клетках при различных условиях предобработки (120 минут инкубации с арсенатом).

Сравнение относительного количества мелких стресс-гранул при различных условиях предобработки клеток (120 мин. инкубации с арсенатом).

Сравнение количества крупных стресс-гранул при различных условиях предобработки клеток (120 мин. инкубации с арсенатом).

2. Изучение взаимодействия большой субъединицы е1РЗ р с микротрубочками.

Анализ первичной и предсказанной вторичной структуры белка р170.82 Клонирование полноразмерного р167 и его отдельных фрагментов

N-концевого, центрального, С-концевого и короткого С-концевого без аминокислотных повторов).

Характеристика антител к фрагменту р170Сс.

Установление идентичности белка, выявляемого антителами А170-Сс, и большой субъединицы фактора eIF3 pl 70.

Выявление р170 в препарате микротрубочек на различных стадиях очистки микротрубочек.

Иммунофлуоресцентное выявлние локализации белка pl в клетках CV-1.

Экспрессия в клетках полноразмерного pl70 и его фрагментов, трансляционно слитых с GFP.

Экспрессия полноразмерного pl70.

Экспрессия N-концевого фрагмента pl70N.

Экспрессия центрального фрагмента р170М.

Экспрессия С-концевого с повторами фрагмента р170С.

Экспрессия С-концевого без повторов фрагмента р170Сс.

Соосаждение тубулина с N-концевой областью р170, экспрессированной в E.coli, из лизата клеток Cos-1.

Соосаждение тубулина с N-концевой областью pl70, экспрессированной в E.coli, из раствора тубулина.

ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Взаимодействие компонентов системы инициации трансляции с цитоскелетом"

Процесс трансляции является наиболее сложным и наименее изученным из всех процессов реализации генетической информации в клетке. Его расшифровка - одна из ключевых задач современной молекулярной и клеточной биологии. До последнего времени изучение процесса трансляции в основном проводилось на бесклеточных системах. Однако эти системы отличаются по своим свойствам от живых клеток. В частности, скорость общего синтеза белка в интактной клетке обычно в несколько раз выше, чем в бесклеточной системе. Данный феномен, скорее всего, связан с определенной пространственной организацией компонентов аппарата трансляции в цитоплазме, которая пока не была смоделирована в бесклеточной системе.

Очевидно, что пространственная организация аппарата трансляции возможна в случае иммобилизации компонентов аппарата трансляции в цитоплазме. Иммобилизация в цитоплазме может осуществляться за счет взаимодействия с какими-либо мембранными структурами (в частности, с эндоплазматическим ретикулумом) или за счет связывания с цитоскелетными элементами. Взаимодействие с эндоплазматическим ретикулумом транслирующих рибосом хорошо изучено. Существенно менее исследованным остается вопрос об иммобилизации аппарата трансляции за счет взаимодействия с цитоскелетом. Такое взаимодействие существует, поскольку при обработке клетки детергентами не происходит существенных потерь компонентов аппарата трансляции. Конкретные взаимодействия белковых или нуклеиновых компонентов аппарата трансляции с конкретными цитоскелетными структурами исследованы крайне слабо.

Цитоскелетные элементы, расположенные в цитоплазме, относятся к трем типам: это промежуточные филаменты, выполняющие структурную функцию, микрофиламенты, необходимые для движения и микротрубочки, функцией которых является чаще всего внутриклеточный транспорт. Для актиновых филаментов были показаны статические взаимодействия с факторами элонгации, связь с микротрубочками наблюдалась в случае активного транспорта по клеткам ряда мРНК.

Мы предположили, что перемещение по цитоплазме массивных компонентов аппарата трансляции возможно при активном транспорте по микротрубочкам или микрофиламентам. В качестве модели для изучения взаимодействия компонентов аппарата трансляции с цитоскелетом, нами было выбрано образование стрессовых гранул. При стрессорных воздействиях на клетку происходит резкое уменьшение общего белкового синтеза. На визуальном уровне, этот процесс сопровождается быстрым накоплением компонентов 48S инициаторного комплекса в нескольких десятках локусов в цитоплазме, называемых стрессовыми гранулами (Stress-granule). Предполагается, что в цитоплазме клетки конститутивно существуют определенные области, где происходит переход мРНК от стадии инициации трансляции к элонгации. При стрессорных воздействиях на клетку происходит ингибирование этого процесса, что приводит к накоплению в этих зонах компонентов 48S инициаторного комплекса (мРНК, малая рибосомальная субъединица, факторы инициации трансляции elFl, eIF4F и eIF3) и, соответственно, визуализации этих областей как стрессовых гранул (Kedersha and Anderson, 2001). Достаточно высокая скорость накопления компонентов 48S инициаторных комплексов в стрессовых гранулах позволяет предположить, что этот процесс может быть связан с цитоскелетными структурами. В частности, за счет активного транспорта могут перемещаться компоненты стрессовых гранул.

Изучению взаимосвязи между образованием стрессовых гранул и цитоскелетом посвящена первая часть нашей работы.

Вторым направлением нашей работы было исследование взаимодействия одного из компонентов стрессовых гранул - фактора eIF3 - с микротрубочками в норме. Первоначально в нашей лаборатории были получены данные, что большая субъединица этого фактора - белок pi 70 - находится в препарате микротрубочек, выделенных из мозгового слоя надпочечников крупного рогатого скота (Severin et al, 1999). Поэтому мы решили изучить, существует ли специфическое взаимодействие с микротрубочками этого белка и, если существует, чем оно может быть опосредовано.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Иванов, Павел Александрович

выводы

1. Для образования стрессовых гранул в клетках млекопитающих необходимы цитоплазматические микротрубочки. Экспериментальное разрушение микротрубочек приводит к ингибированию формирования стрессовых гранул. Экспериментальная стабилизация микротрубочек улучшает образование стрессовых гранул.

2. Ингибирующий эффект разборки микротрубочек на образование стрессовых гранул не связан с ингибированием фосфорилирования фактора е1Р2а.

3. Система актиновых филаментов не является необходимой для формирования стрессовых гранул.

4. взаимодействует с микротрубочками в клетках млекопитающихю.

5. Большая субъединица еШЗ р 170 может взаимодействовать с тубулином напрямую. Последовательность, взаимодействующая с тубулином, расположена в Ы-концевой части молекулы р170.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Иванов, Павел Александрович, Москва

1. Anderson J, Phan L, Hinnebusch AG. The Gcdl0p/Gcdl4p complex is the essential two-subunit tRNA( 1-methyladenosine) methyltransferase of Saccharomyces cerevisiae. //Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Vol.97(10). p. 5173-8

2. Arrigo AP, Suhan JP, Welch WJ. Dynamic changes in the structure and intracellular locale of the mammalian low-molecular-weight heat shock protein. //Mol Cell Biol 1988 Vol. 8(12). p. 5059-71

3. Aronov S, Aranda G, Behar L, Ginzburg I. Visualization of translated tau protein in the axons of neuronal P19 cells and characterization of tau RNP granules. //J Cell Sci. 2002 Vol. 115(Pt 19). p. 3817-27.

4. Asano K, Phan L, Anderson J, and Hinnebusch AG. Complex Formation by All Five Homologues of Mammalian Translation Initiation Factor 3 Subunits from Yeast Saccharomyces cerevisiae. //J Biol Chem 1998 273, No. 29. p. 18573-18585.

5. Asano K, Clayton J, Shalev A, Hinnebusch AG. //Genes Dev 2000 Vol. 14(19). p. 2534-46

6. Bachmann F, Banziger R, Burger MM. Cloning of a novel protein overexpressed in human mammary carcinoma. //Cancer Res 1997 Vol. 57(5). p. 988-94

7. Ballestra J. Ihibitors of Eucaryotic Protein Synthesis. H. Trachseh, editor. CRC Press, London, 1991.

8. Bandyopadhyay A, Maitra U. Cloning and characterization of the p42 subunit of mammalian translation initiation factor 3 (eIF3): demonstration that eIF3 interacts with eIF5 in mammalian cells. //Nucleic Acids Res 1999. Vol. 27(5). p. 1331-7

9. Barbarese E, Koppel DE, Deutscher MP, Smith CL, Ainger K, Morgan F, Carson JH. Protein translation components are colocalized in granules in oligodendrocytes. //J Cell Sci. 1995 Vol.l08( Pt 8). p.2781-90.

10. Bassell GJ, Powers CM, Taneja KL, Singer RH. Single mRNAs visualized by ultrastructural in situ hybridization are principally localized at actin filament intersections in fibroblasts. //J Cell Biol. 1994 Vol. 126(4). p. 863-76.

11. Bektas M, Nurten R, Gurel Z, Sayers Z, Bermek E. Interactions of eukaryotic elongation factor 2 with actin: a possible link between protein synthetic machinery and cytoskeleton. //FEBS Lett. 1994 Vol. 356(1). p. 89-93.

12. Benne R, Hershey JW. The mechanism of action of protein synthesis initiation factors from rabbit reticulocytes. //J Biol Chem 1978 Vol. 253(9). p. 3078-87

13. Block KL, Vornlocher HP, Hershey JW. Characterization of cDNAs encoding the p44 and p35 subunits of human translation initiation factor eIF3. //J Biol Chem 1998 Vol. 273(48). p. 31901-8

14. Broadus J, Doe CQ. Extrinsic cues, intrinsic cues and microfilaments regulate asymmetric protein localization in Drosophila neuroblasts. //Curr Biol. 1997 Vol.7(11). p. 827-35.

15. Browning KS, Gallie DR, Hershey JW, Hinnebusch AG, Maitra U, Merrick WC, Norbury C. Unified nomenclature for the subunits of eukaryotic initiation factor 3. //Trends Biochem Sci 2001 Vol.26(5). p. 284

16. Burgin KE, Waxham MN, Rickling S, Westgate SA, Mobley WC, Kelly PT. In situ hybridization histochemistry of Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase in developing rat brain. //J Neurosci 1990 Vol. 10(6). p. 1788-98

17. Burks EA, Bezerra PP, Hahn Le, Gallie DR, Browning KS. Plant Initiation Factor 3 Subunit Composition Resembles Mammalian Initiation Factor 3 and Has a Novel Subunit. //JBC Vol. 276, No. 3 pp. 2122-2131

18. Bushell M, Wood W, Clemens MJ, Morley SJ. Changes in integrity and association of eukaryotic protein synthesis initiation factors during apoptosis. //Eur J Biochem 2000 Vol. 267(4). p. 1083-91

19. Carson JH, Worboys K, Ainger K, Barbarese E. (1997) Translocation of myelin basic protein mRNA in oligodendrocytes requires microtubules and kinesin. //Cell Motil Cytoskeleton. 1997 Vol. 38(4). p. 318-28

20. Chaudhuri J, Chowdhury D, Maitra U. Distinct functions of eukaryotic translation initiation factors elFIA and eIF3 in the formation of the 40 S ribosomal preinitiation complex. //J Biol Chem 1999 Vol. 274(25). p.17975-80

21. Chen CR, Li YC, Chen J, Hou MC, Papadaki P, Chang EC. Moel, a conserved protein in Schizosaccharomyces pombe, interacts with a Ras effector, Scdl, to affect proper spindle formation. //Proc Natl Acad Sci U S A 1999 Vol. 19. p. 96

22. Chen RH, Miettinen PJ, Maruoka EM, Choy L, Derynck R. A WD-domain protein that is associated with and phosphorylated by the type II TGF-beta receptor. //Nature 1995 Vol. 377(6549). p. 548-52

23. Chen, J.-J. Heme-regulated eIF-2alpha kinase, p. 529-546. In N. Sonenberg, J. W. B. Hershey, and M. B. Mathews (ed.), Translational control of gene expression. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.

24. Cohen CM, Foley SF, Korsgren C. A protein immunologically related to erythrocyte band 4.1 is found on stress fibres on non-erythroid cells. //Nature 1982 Vol. 299(5884). p.648-50

25. Collier, N. C., Heuser, J., Levy, M. A. and Schlesinger, M. J. Ultrastructural and biochemical analysis of the stress granule in chicken embryo fibroblasts. //J. Cell Biol. Vol. 106. p. 1131-1139.

26. Collier AJ, Gallego J, Klinck R, Cole PT, Harris SJ, Harrison GP, Aboul-Ela F, Varani G, Walker S. A conserved RNA structure within the HCV IRES eIF3-binding site. //Nat Struct Biol. 2002 Vol. 9(5). p.375-80.

27. Conboy JG. Structure, function, and molecular genetics of erythroid membrane skeletal protein 4.1 in normal and abnormal red blood cells. //Semin Hematol 1993 Vol. 30(1). p.58-73

28. Crosby, J. S., K. Lee, I. M. London, and J.-J. Chen. Erythroid expression of the heme-regulated eIF-2alpha kinase. //Mol. Cell. Biol. Vol. 14. p. 3906-3914

29. Danaie P, Wittmer B, Altmann M, Trachsel H. Isolation of a protein complex containing translation initiation factor Prtl from Saccharomyces cerevisiae. //J Biol Chem 1995 Vol. 270(9). p.4288-92

30. Dasso MC, Milbura SC, Hershey JW, Jackson RJ. Selection of the 5'-proximal translation initiation site is influenced by mRNA and eIF-2 concentrations. //Eur J Biochem 1990 Vol. 187(2). p.361-71

31. Fletcher CM, Pestova TV, Hellen CU, Wagner G. Structure and interactions of the translation initiation factor elFl. //EMBO J 1999 Vol. 18(9). p. 2631-7

32. Furukawa R, Jinks TM, Tishgarten T, Mazzawi M, Morris DR, Fechheimer M. Elongation factor lbeta is an actin-binding protein. //Biochim Biophys Acta. 2001 Vol. 1527(3). p. 130-40.

33. Fusco D, Accornero N, Lavoie B, Shenoy SM, Blanchard JM, Singer RH, Bertrand E. Single mRNA molecules demonstrate probabilistic movement in living Mammalian cells. //Curr Biol. 2003 Vol. 13(2). p. 161-7

34. Gaba A, Wang Z, Krishnamoorthy T, Hinnebusch AG, Sachs MS. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. //EMBO J 2001 Vol. 20(22). p. 6453-63

35. Gallouzi IE, Brennan CM, Stenberg MG, Swanson MS, Eversole A, Maizels N, Steitz JA. HuR binding to cytoplasmic mRNA is perturbed by heat shock. //Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Vol. 97(7). p. 3073-8

36. Garcia-Barrio MT, Naranda T, Vazquez de Aldana CR, Cuesta R, Hinnebusch AG, Hershey JW, Tamame M. GCD10, a translational repressor of GCN4, is the RNA-binding subunit of eukaryotic translation initiation factor-3. //Genes Dev 1995 Vol. 9(14). p. 781-96

37. Garcia-Mata R, Bebok Z, Sorscher EJ, Sztul ES. Characterization and dynamics of aggresome formation by a cytosolic GFP-chimera. //J Cell Biol. 1999 Vol. 146(6). p. 1239-54.

38. Garner CC, Tucker RP, Matus A. Selective localization of messenger RNA for cytoskeletal protein MAP2 in dendrites. //Nature 1988 Vol. 336(6200). p. 674-7

39. Gilbert SP, Webb MR, Brune M, Johnson KA. Pathway of processive ATP hydrolysis by kinesin. //Nature. 1995 Vol. 373(6516). p. 671-6.

40. Gingras AC, Raught B, Sonenberg N. eIF4 initiation factors: effectors of mRNA recruitment to ribosomes and regulators of translation. //Annu Rev Biochem 1999 Vol. 68. p. 913-63

41. Guo J, Hui DJ, Merrick WC, Sen GC. A new pathway of translational regulation mediated by eukaryotic initiation factor 3. //EMBO J 2000 Vol. 19(24). p. 6891-9

42. Hanachi P, Hershey JW, Vornlocher HP. Characterization of the p33 subunit of eukaryotic translation initiation factor-3 from Saccharomyces cerevisiae. //J Biol Chem 1999 Vol. 274(13). p. 8546-53

43. Harding HP, Zhang Y, Ron D. Protein translation and folding are coupled by an endoplasmic-reticulum-resident kinase. //Nature 1999 Vol. 397(6716). p. 271-4

44. Harding HP, Novoa I, Zhang Y, Zeng H, Wek R, Schapira M, Ron D. Regulated translation initiation controls stress-induced gene expression in mammalian cells. //Mol Cell 2000 Vol. 6(5). p. 1099-108

45. Hasek J, Kovarik P, Valasek L, Malinska K, Schneider J, Kohlwein SD, Ruis H. Rpglp, the subunit of the Saccharomyces cerevisiae eIF3 core complex, is a microtubule-interacting protein. //Cell Motil Cytoskeleton 2000 Vol. 45(3). p. 235-46

46. Heuijeijans JH, Pieper FR, Ramaekers FC, Timmermans LJ, Kuijpers H, Bloemendal H, Van Venrooij WJ. Association of mRNA and eIF-2 alpha with the cytoskeleton in cells lacking vimentin. //Exp Cell Res. 1989 Vol. 181(2). p. 317-30.

47. Hoareau Alves K, Bochard V, Rety S, Jalinot P. Association of the mammalian proto-oncoprotein Int-6 with the three protein complexes eIF3, COP9 signalosome and 26S proteasome. //FEBS Lett 2002 Vol. 527(1-3). p. 15-21

48. Hofmann K, Bucher P. The PCI domain: a common theme in three multiprotein complexes. //Trends Biochem Sci 1998 Vol. 23(6). p. 204-5

49. Hou CL, Tang C, Roffler SR, Tang TK. Protein 4.1R binding to eIF3-p44 suggests an interaction between the cytoskeletal network and the translation apparatus. //Blood 2000 Vol. 96(2). p. 747-53

50. Howe JG, Hershey JW. Translational initiation factor and ribosome association with the cytoskeletal framework fraction from HeLa cells. //Cell. 1984 Vol. 37(1). p. 85-93

51. Humphrey T, Enoch T. Suml, a highly conserved WD-repeat protein, suppresses S-M checkpoint mutants and inhibits the osmotic stress cell cycle response in fission yeast. //Genetics 1998 Vol. 148(4). p. 1731-42

52. Ingelfmger D, Arndt-Jovin DJ, Luhrmann R, Achsel T. The human LSml-7 proteins colocalize with the mRNA-degrading enzymes Dcpl/2 and Xrnl in distinct cytoplasmic foci. //RNA 2002 Vol. 8(12). p. 1489-501

53. Jansen RP. RNA-cytoskeletal associations. //FASEB J. 1999 Vol. 13(3). p. 455-66.

54. Johnstone O, Lasko P. Translational regulation and RNA localization in Drosophila oocytes and embryos. //Annu Rev Genet. 2001 Vol. 35. p. 365-406.

55. Johnston J, Ward L, Kopito R. Aggresomes: A cellular response to misfolded proteins. //J. Cell Biol. Vol. 143. p. 1883-1898

56. Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., and Anderson, P. RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. //J Cell Biol. Vol. 147. p. 1431-1442.

57. Kedersha, N., Cho, M. R., Li, W., Yacono, P. W., Chen, S., Gilks, N., Golan, D. E., and Anderson, P. Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules. //J Cell Biol. Vol. 151. p. 1257-1268.

58. Kimball SR, Everson WV, Flaim KE, Jefferson LS. Initiation of protein synthesis in a cell-free system prepared from rat hepatocytes. //Am J Physiol. 1989 Vol. 256(11). p. C28-34.

59. Kimball SR, Horetsky RL, Ron D, Jefferson LS, Harding HP. Mammalian stress granules represent sites of accumulation of stalled translation initiation complexes. //Am J Physiol Cell Physiol. 2003 Vol. 284(2). p. 273-84.

60. Kopito RR. Aggresomes, inclusion bodies and protein aggregation. //Trends Cell Biol. 2000 Vol. 10(12). p. 524-30.

61. Knowles RB, Sabry JH, Martone ME, Deerinck TJ, Ellisman MH, Bassell GJ, Kosik KS. Translocation of RNA granules in living neurons. //J Neurosci. 1996 Vol. 16(24). p. 7812-20.

62. Korneeva NL, Lamphear BJ, Hennigan FL, Rhoads RE. Mutually cooperative binding of eukaryotic translation initiation factor (elF) 3 and eIF4A to human eIF4G-l. //J Biol Chem 2000 Vol. 275(52). p. 41369-76

63. Kozak M The scanning model for translation: an update. //J Cell Biol 1989 Vol. 108. p. 229-241

64. Krauss SW, Chasis JA, Rogers C, Mohandas N, Krockmalnic G, Penman S. Structural protein 4.1 is located in mammalian centrosomes. //Proc Natl Acad Sci U S A 1997 Vol. 94(14). p. 7297302

65. Kurasawa Y, Watanabe Y, Numata O. Characterization of F-actin bundling activity of Tetrahymena elongation factor 1 alpha investigated with rabbit skeletal muscle actin. //Zoolog Sci. 1996 Vol. 13(3). p. 371-5.

66. Latham VM, Yu EH, Tullio AN, Adelstein RS, Singer RH. A Rho-dependent signaling pathway operating through myosin localizes beta-actin mRNA in fibroblasts. //Curr Biol. 2001 Vol. 11(13). p. 1010-6.

67. Lawrence JB, Singer RH. Intracellular localization of messenger RNAs for cytoskeletal proteins. //Cell. 1986 Vol. 45(3). p. 407-15.

68. Lenk R, Ransom L, Kaufmann Y, Penman S. A cytoskeletal structure with associated polyribosomes obtained from HeLa cells. //Cell. 1977 Vol. 10(1). p. 67-78.

69. Leto TL, Pratt BM, Madri JA. Mechanisms of cytoskeletal regulation: modulation of aortic endothelial cell protein band 4.1 by the extracellular matrix. //J Cell Physiol 1986 Vol. 127(3). p. 423-31

70. Li D. And Roberts R. WD-repeat proteins: structure characteristics, biological function, and their involvement in human diseases. //Cell. Mol. Life Sci. 2001 Vol. 58. p. 2085-2097

71. Li P, Yang X, Wasser M, Cai Y, Chia W. Inscuteable and Staufen mediate asymmetric localization and segregation of prospero RNA during Drosophila neuroblast cell divisions. /Cell. 1997 Vol. 90(3). p. 437-47.

72. Lin L, Holbro T, Alonso G, Gerosa D, Burger MM. Molecular interaction between human tumor marker protein pi50, the largest subunit of eIF3, and intermediate filament protein K7. //J Cell Biochem 2001 Vol. 80(4). p. 483-90

73. Lu L, Han A and Chen J Translation Initiation Control by Heme-Regulated Eukaryotic Initiation Factor 2alpha Kinase in Erythroid Cells under Cytoplasmic Stresses. //Molecular and Cellular Biology 2001 Vol. 21. p. 7971-7980,

74. Luby-Phelps K, Castle PE, Taylor DL, Lanni F. Hindered diffusion of inert tracer particles in the cytoplasm of mouse 3T3 cells. //Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Vol. 84(14). p. 4910-3.

75. Mallardo M, Schleich S, Krijnse Locker J. (2001) Microtubule-dependent organization of vaccinia virus core-derived early mRNAs into distinct cytoplasmic structures. //Mol Biol Cell. 2001 Vol. 12(12). p. 3875-91.

76. Mathews, M. B. //Semin. Virol. 1984 Vol. 4. p. 247-257

77. Mayeur GL, Hershey JW. Malignant transformation by the eukaryotic translation initiation factor 3 subunit p48 (eIF3e). //FEBS Lett 2002 Vol. 514(1). p. 49-54

78. Medrano S, Steward O. Differential mRNA localization in astroglial cells in culture. //J Comp Neurol. 2001 Vol. 430(1). p. 56-71.

79. Methot N, Song MS, Sonenberg N. A region rich in aspartic acid, arginine, tyrosine, and glycine (DRYG) mediates eukaryotic initiation factor 4B (eIF4B) self-association and interaction with eIF3. //Mol Cell Biol 1996 Vol. 16(10). p. 5328-34

80. Methot N, Rom E, Olsen H, Sonenberg N. The human homologue of the yeast Prtl protein is an integral part of the eukaryotic initiation factor 3 complex and interacts with pi70. //J Biol Chem 1997 Vol. 272(2). p. 1110-6

81. Meyer LJ, Brown-Luedi ML, Corbett S, Tolan DR, Hershey JW. The purification and characterization of multiple forms of protein synthesis eukaryotic initiation factors 2, 3, and 5 from rabbit reticulocytes. //J Biol Chem 1981 Vol. 256(1). p. 351-6

82. Moriya M, Tanaka S. Prominent expression of protein kinase C (gamma) mRNA in the dendriterich neuropil of mice cerebellum at the critical period for synaptogenesis. //Neuroreport 1994 Vol. 5(8). p. 929-32

83. Morris EJ, Evason K, Wiand C, L'Ecuyer TJ, Fulton AB. Misdirected vimentin messenger RNA alters cell morphology and motility. //J Cell Sci. 2000 Vol. 113. p. 2433-43.

84. Morris-Desbois C, Bochard V, Reynaud C, Jalinot P. Interaction between the Ret finger protein and the Int-6 gene product and co-localisation into nuclear bodies. //Journal of Cell Science Vol. 112.p.3331-3342

85. Morris-Desbois C, Rety S, Ferro M, Garin J, Jalinot P. The human protein HSPC021 interacts with Int-6 and is associated with eukaryotic translation initiation factor 3. //J Biol Chem 2001 Vol. 276(49). p. 45988-95

86. Miyazaki S, Kozak CA, Marchetti A, Buttitta F, Gallahan D, Callahan R. The chromosomal location of the mouse mammary tumor gene Int6 and related pseudogenes in the mouse genome. //Genomics 1995 Vol. 27(3). p. 420-4

87. Naranda T, MacMillan SE, Hershey JW. Purified yeast translational initiation factor eIF-3 is an RNA-binding protein complex that contains the PRT1 protein. //J Biol Chem 1994 Vol. 269(51). p. 32286-92

88. Negrutskii BS, Stapulionis R, Deutscher MP. Supramolecular organization of the mammalian translation system. //Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Vol. 91(3). p. 964-8.

89. Nover, L., Scharf, KD., and Neumann, D. Formation of cytoplasmic heat shock granules in tomato cell cultures and leaves. //Mol. Cell. Biol. Vol. 3. p. 1648-1655.

90. Nover, L., Scharf, KD. and Neumann, D. Cytoplasmic heat shock granules are formed from precursor particles and are associated with a specific set of mRNAs. //Mol. Cell. Biol. Vol.9, p. 1298-1308.

91. Oleynikov Y, Singer RH. Real-time visualization of ZBP1 association with beta-actin mRNA during transcription and localization. //Curr Biol. 2003 Vol. 13(3). p. 199-207.

92. Ong LL, Er CP, Ho A, Aung MT, Yu H. Kinectin anchors the translation elongation factor-1 delta to endoplasmic reticulum. //J Biol Chem. 2003 Vol.28

93. Pestova TV, Lomakin IB, Lee JH, Choi SK, Dever TE, Hellen CU. The joining of ribosomal subunits in eukaryotes requires eIF5B. //Nature 2000 Vol. 403(6767). p. 332-5

94. Pestova TV, Kolupaeva VG, Lomakin IB, Pilipenko EV, Shatsky IN, Agol VI, Hellen CU. Molecular mechanisms of translation initiation in eukaryotes. //Proc Natl Acad Sci U S A 2001 Vol. 98(13). p. 7029-36

95. Phan L, Schoenfeld LW, Valasek L, Nielsen KH, Hinnebusch AG. A subcomplex of three eIF3 subunits binds elFl and eIF5 and stimulates ribosome binding of mRNA and tRNA(i)Met. //EMBO J 2001 Vol. 20(11). p. 2954-65

96. Pincheira R, Chen Q, Zhang JT. Identification of a 170-kDa protein over-expressed in lung cancers. //Br J Cancer 2001 Vol.84(l 1). p. 1520-7

97. Piron M, Vende P, Cohen J, Poncet D Rotavirus RNA-binding protein NSP3 interacts with eIF4GI and evicts the poly(A) binding protein from elF4F. //EMBO J 1998 Vol 1. p. 17

98. Racca C, Gardiol A, Triller A. Dendritic and postsynaptic localizations of glycine receptor alpha subunit mRNAs. //J Neurosci. 1997 Vol. 17(5). p. 1691-700.

99. Ruzanov PV, Evdokimova VM, Korneeva NL, Hershey JW, Ovchinnikov LP. Interaction of the universal mRNA-binding protein, p50, with actin: a possible link between mRNA and microfilaments. //J Cell Sci. 1999 Vol. 112. p. 3487-96

100. Saramaki 0, Willi N, Bratt O, Gasser TC, Koivisto P, Nupponen NN, Bubendorf L, Visakorpi T. Amplification of EIF3S3 gene is associated with advanced stage in prostate cancer. //Am J Pathol 2001 Vol. 159(6). p. 2089-94

101. Scholler JK, Kanner SB. The human pl67 gene encodes a unique structural protein that contains centrosomin A homology and associates with a multicomponent complex. //DNA Cell Biol 1997 Vol. 16(4). p. 515-31

102. Shestakova EA, Motuz LP, Minin AA, Gelfand VI, Gavrilova LP. Some of eukaryotic elongation factor 2 is colocalized with actin microfilament bundles in mouse embryo fibroblasts. //Cell Biol Int Rep. 1991 Vol. 15(1). p. 75-84

103. Sheth U, Parker R. Decapping and decay of messenger RNA occur in cytoplasmic processing bodies. //Science 2003 Vol. 300(5620). p. 805-8

104. Shi J, Feng Y, Goulet AC, Vaillancourt RR, Sachs NA, Hershey JW, Nelson MA. The p34cdc2-related Cyclin-dependent kinase 11 Interacts with the p47 Subunit of Eukaryotic Initiation Factor 3 during Apoptosis. //J Biol Chem 2003 Vol. 278(7). p. 5062-71

105. Smith KE, Henshaw EC. Binding of Met-tRNA-f to native and derived 40S ribosomal subunits. //Biochemistry 1975 Vol. 14(5). p. 1060-7

106. St Johnston D, Brown NH, Gall JG, Jantsch M. A conserved double-stranded RNA-binding domain. //Proc Natl Acad Sci USA. 1992 Vol. 89(22). p. 10979-83

107. St Johnston D, Beuchle D, Nusslein-Volhard C. Staufen, a gene required to localize maternal RNAs in the Drosophila egg. //Cell. 1991 Vol. 66(1). p. 51-63

108. Stapulionis R, Kolli S, Deutscher MP. Efficient mammalian protein synthesis requires an intact F-actin system. //J Biol Chem. 1997 Vol. 272(40). p. 24980-6

109. Tang SJ, Meulemans D, Vazquez L, Colaco N, Schuman E. A role for a rat homolog of staufen in the transport of RNA to neuronal dendrites. //Neuron. 2001 Vol. 32(3).p. 463-75.

110. Taupin JL, Tian Q, Kedersha N, Robertson M, Anderson P. The RNA-binding protein TIAR is translocated from the nucleus to the cytoplasm during Fas-mediated apoptotic cell death. //Proc Natl Acad Sci U S A 1995 Vol. 92(5). p. 1629-33

111. Tiwari,R.K., Kusari,J. and Sen,G.C. Functional equivalents of interferon-mediated signals needed for induction of an mRNA can be generated by double-stranded RNA and growth factors. //EMBO J. Vol. 6. p. 3373-3378.

112. Tourriere H, Chebli K, Zekri L, Courselaud B, Blanchard JM, Bertrand E, Tazi J. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. //J Cell Biol 2003 Vol. 160(6). p. 823-31

113. Trachsel H, Erni B, Schreier MH, Staehelin T. Initiation of mammalian protein synthesis. II. The assembly of the initiation complex with purified initiation factors. //J Mol Biol 1977 Vol. 116(4). p. 755-67

114. Trachsel H, Staehelin T, Initiation of mammalian protein synthesis. The multiple functions of the initiation factor eIF-3. //Biochim Biophys Acta 1979 Vol. 565(2). p. 305-14

115. Valasek L, Trachsel H, Hasek J, Ruis H. Rpgl, the Saccharomyces cerevisiae homologue of the largest subunit of mammalian translation initiation factor 3, is required for translational activity. //J Biol Chem 1998 Vol. 273(33). p. 21253-60

116. Valasek L, Phan L, Schoenfeld LW, Valaskova V, Hinnebusch AG. Related eIF3 subunits TIF32 and HCR1 interact with an RNA recognition motif in PRT1 required for eIF3 integrity and ribosome binding. //EMBO J 2001 Vol. 20(4). p. 891-904

117. Valasek L, Hasek J, Nielsen KH, Hinnebusch AG. Dual function of eIF3j/Hcrlp in processing 20 S pre-rRNA and translation initiation. Hi Biol Chem 2001 Vol. 276(46). p. 43351-60

118. Valasek L, Nielsen KH, Hinnebusch AG. Direct eIF2-eIF3 contact in the multifactor complex is important for translation initiation in vivo. //EMBO J 2002 Vol. 21(21). p. 5886-98

119. Wells SE, Hillner PE, Vale RD, Sachs AB. Circularization of mRNA by eucaryotic translation initiation factors. //Mol Cell Vol. 2. p. 135-40

120. Wickham L, Duchaine T, Luo M, Nabi IR, DesGroseillers L. Mammalian staufen is a double-stranded-RNA and tubulin-binding protein which localizes to the rough endoplasmic reticulum. //Mol Cell Biol. 1999 Vol. 19(3). p. 2220-30.

121. Wu S, Kaufman R J. Double-stranded (ds) RNA Binding and Not Dimerization Correlates with the Activation of the dsRNA-dependent Protein Kinase (PKR). //JBC 1996 Vol. 271. p. 1756-1763

122. Wu S, Hu Y, Wang JL, Chattel.ee M, Shi Y, Kaufman RJ. Ultraviolet light inhibits translation through activation of the unfolded protein response kinase PERK in the lumen of the endoplasmic reticulum. //J Biol Chem 2002 Vol. 277(20). p. 18077-83

123. Yen HC, Chang EC. Yin6, a fission yeast Int6 homolog, complexes with Moel and plays a role in chromosome segregation. //Proc Natl Acad Sci U S A 2000 Vol. 97(26). p. 14370-5

124. Yen HC, Gordon C, Chang EC. Schizosaccharomyces pombe Int6 and Ras homologs regulate cell division and mitotic fidelity via the proteasome. //Cell 2003 Vol. 112(2). p. 207-17

125. Yisraeli JK, Sokol S, Melton DA. A two-step model for the localization of maternal mRNA in Xenopus oocytes: involvement of microtubules and microfilaments in the translocation and anchoring of Vgl mRNA. //Development. 1990 Vol. 108(2). p. 289-98.

126. Zhou Y, King ML. RNA transport to the vegetal cortex of Xenopus oocytes. //Dev Biol. 1996 Vol. 179(1). p. 173-83.