Взаимодействие клеток бактерий с соединениями серебра и золота: влияние на рост, образование биопленок, механизмы действия, биогенез наночастиц

Радциг, Марина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Взаимодействие клеток бактерий с соединениями серебра и золота: влияние на рост, образование биопленок, механизмы действия, биогенез наночастиц
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие клеток бактерий с соединениями серебра и золота: влияние на рост, образование биопленок, механизмы действия, биогенез наночастиц"

на правах рукописи

005048333 //./ щ

Радциг Марина Александровна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КЛЕТОК БАКТЕРИЙ С СОЕДИНЕНИЯМИ СЕРЕБРА И ЗОЛОТА: ВЛИЯНИЕ НА РОСТ, ОБРАЗОВАНИЕ БИОПЛЕНОК, МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ, БИОГЕНЕЗ НАНОЧАСТИЦ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ЯН8 2013

Москва, 2013 г.

005048333

Работа выполнена в Лаборатории регуляции экспрессии генов микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной генетики Российской академии наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Хмель Инесса Александровна

Научный консультант: доктор химических наук

Надточенко Виктор Андреевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Манухов Илья Владимирович

ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»), ведущий научный сотрудник

кандидат биологических наук Зарубина Алевтина Петровна ФГБОУ ВПО Московский государственный университет

имени М.В.Ломоносова, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Государственное учреждение Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи Российской академии медицинских наук.

Защита состоится 19 февраля 2013 г. в 15:30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологический факультет, ауд. М-1.

Тел: 8(495)939-54-83, эл. почта: npiskunkova@rambler.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан оЛб »^¿/СгЛ-£/Ср2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук 7/С^-^ Пискункова Н.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В последние годы все увеличивающееся внимание исследователей привлекают вопросы, связанные с биомедицинским использованием наночастиц металлов. Это объясняется, прежде всего, насущной необходимостью разработки принципиально новых лекарственных препаратов против инфекций микроорганизмов, что обусловлено широким распространением форм патогенных бактерий - возбудителей различных острых и хронических инфекций, устойчивых к антибиотикам и другим антибактериальным средствам. Кроме того, существенные перспективы может дать в будущем применение лекарственных средств на основе наноматериалов в онкологии и многих других важных областях медицины. Основой этого послужили значимые успехи, достигнутые в разработке методов получения наночастиц металлов различной формы и размера, нанокомпозитов и покрытий устройств медицинского назначения. Активно проводятся исследования перспектив использования наночастиц (НЧ) с адресной доставкой лекарств для антираковой терапии, конструируемых на основе магнитных наночастиц и наночастиц золота, активируемых светом, что обуславливает их фототермальный эффект.

Наиболее изученными и используемыми в биомедицииских исследованиях являются наноматериалы на основе серебра. Соединения серебра проявляют высокую токсичность по отношению к широкому ряду микроорганизмов, и в силу этого они эффективно применяются в медицине против разнообразных инфекций, в том числе в виде наночастиц, покрытий различных имплантируемых устройств, дезинфицирующих фильтров и т.п. Несмотря на то, что бактерицидные свойства соединений серебра хорошо известны и давно используются человеком, биохимические механизмы их действия изучены лишь частично.

В настоящее время развернут широкий фронт исследований наночастиц металлов и полупроводников, их действия на микроорганизмы и другие живые клетки, а также перспектив их использования в биомедицине.

Большую проблему для медицины представляет способность патогенных бактерий формировать биопленки - сообщества бактерий, прикрепленные к различным поверхностям и окруженные матриксом, состоящим из внеклеточных полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот и др. Устойчивость бактерий, обитающих в биопленках, к лекарственным препаратам многократно повышена по сравнению с планктонно

растущими бактериями. К настоящему времени действие НЧС на биопленки исследовано крайне мало.

Кроме изучения свойств и использования наноматериапов, исследования многих авторов направлены на разработку биологических подходов к синтезу НЧ различных металлов. Изучение биогенеза НЧ с помощью экстрактов растений, грибов, дрожжей, водорослей, бактерий становится все более важным, поскольку такой процесс их получения дает высокий процент выхода готовых НЧ, практически нетоксичен, экономически выгоден, позволяет контролировать их размер и форму. Следует отметить, что перечисленные биологические объекты используются в биосинтезе НЧ как для восстановления ионов металлов до наночастиц, так и для стабилизации образующихся частиц за счет продуцируемых белков, полисахаридов, липидов клеточной стенки и т.д.

Данная работа посвящена изучению действия ионов и наночастиц серебра и золота на бактериальный рост, образование биопленок и разрушение зрелых биопленок. Получены данные о некоторых аспектах механизмов действия соединений серебра и золота на клетки. Кроме того, проведены исследования, направленные на получение наночастиц металлов биологическим способом с использованием различных штаммов цианобактерий и АююЬас/ег. Разработан метод оптоперфорации клеточной стенки цианобактерий в присутствии наночастиц золота. Этот метод был использован для разрушения бактериальных клеток и биопленок наночастицами золота, облученными лазерным импульсом ближнего ИК диапазона.

Цели и поставленные задачи

Целью работы было сравнительное исследование антибактериальных эффектов ионов и наночастиц серебра и золота, изучение некоторых аспектов механизма их действия и разработка методов получения наночастиц золота с помощью бактерий.

Конкретными задачами работы были:

• изучение влияния ионов и наночастиц серебра (НЧС) и золота (НЧЗ) на рост бактерий, формирование и деградацию биопленок;

• изучение чувствительности к ионам серебра, золота и НЧС клеток Е. соП с мутациями в генах, участвующих в репарации ДНК, с целью выяснения роли разных типов репарации ДНК в защите клеток при действии этих соединений;

• определение роли транспортных белков поринов в антибактериальном действии соединений серебра и золота;

• исследование влияния ионов и наночастиц серебра и золота на клетки бактерий, дефектные по глобальным регуляторам экспрессии генов;

• разработка метода и изучение оптоперфорации стенки цианобактерий и биопленок в присутствии НЧЗ;

• разработка методов получения НЧ металлов биологическим способом с использованием бактерий.

Научная новизна и практическая ценность работы

Определены концентрационные закономерности ингибирующего действия ионов серебра, золота и НЧС на рост и формирование биопленок грамотрицательными бактериями. Показано, что эти соединения вызывают деградацию зрелых биопленок Escherichia coli и гибель клеток в них в концентрациях значительно более высоких, чем те, которые подавляют планктонный рост бактерий и формирование биопленок. В работе были исследованы механизмы повышенной резистентности биопленок Е. coli к действию НЧС и ионов серебра и золота.

Проведены исследования некоторых аспектов механизмов действия соединений серебра и золота на бактериальные клетки. Впервые показано, что мутации в генах, ответственных за репарацию окислительных повреждений ДНК (mutY, mutS, mutM, mutT, nth), увеличивали чувствительность клеток Е. coli к ионам серебра и НЧС; повидимому, эти гены вовлечены в восстановление окислительных повреждений ДНК, связанных с действием соединений серебра. Однако, мы не обнаружили подобных эффектов при действии ионов золота. Полученные результаты показывают, что механизмы бактерицидного действия ионов золота и соединений серебра (ионов и НЧС) на бактериальные клетки существенно различаются.

Не наблюдалось различий в чувствительности к ионам серебра, золота и НЧС у штаммов Е. coli дикого типа и штаммов, дефектных по эксцизионной репарации (uvrA, uvrB мутанты), SOS-репарации и рекомбинации (recA, lexA, recBC, umuC и umuD мутанты). Это показывает, что чувствительность бактерий к соединениям серебра и золота не связана с повреждениями ДНК, которые могут быть восстановлены при участии этих систем. Не обнаружено значительных различий в чувствительности штаммов, дефектных по сигме S субъединице РНК-полимеразы и Quorum Sensing регуляции, т.е. эти глобальные регуляторы не играют существенной роли в контроле чувствительности/ устойчивости к исследуемым веществам.

Впервые показано, что мутантные штаммы Е. coli, лишенные белков поринов OmpF или ОтрС, были существенно более устойчивыми к НЧС по сравнению со

штаммом дикого типа. Поры, образуемые поринами OrapF и ОтрС, имеют размер 1 — 1,1 нм, поэтому через них могут проходить ионы серебра, выделяемые наночастицами, но не исследованные НЧС (8,3 ± 1,9 нм). Эти данные свидетельствуют о том, что антибактериальное действие НЧС на клетки Е. coli связано, главным образом, с проникновением ионов серебра через клеточную стенку.

Полученные в данной работе результаты расширяют наши представления о механизмах действия соединений серебра и золота на бактериальные клетки.

Разработан метод оптоперфорации фемтосекундными (~ 100 фс) лазерными импульсами ближнего ПК диапазона клеточной стенки цианобактерий и биопленок Е. coli в присутствии НЧЗ. Показано, что наночастицы золота за счет плазмонного резонанса понижают порог оптоперфорации, и при этом формируются субмикронные отверстия в стенке бактерий и биопленках.

Проведены эксперименты по получению наночастиц металлов с помощью бактерий. Получены стабильные НЧЗ при культивировании цианобактерий и Azotobacter в среде, содержащей соль золота. Была исследована возможность получения НЧ золота при варьировании условий культивирования.

Практическая значимость работы связана, прежде всего, с перспективностью использования наночастиц серебра и золота в качестве антибактериальных агентов. Полученные закономерности действия этих соединений на рост бактерий и биопленки могут быть полезны для разработки методов их применения в антибактериальной терапии и других областях их использования. Представляют интерес для практики также данные о получении стабильных НЧЗ биологическим методом, с помощью бактерий.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на конференции «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», Москва (26-29 мая 2009 г.); I и II Международном конкурсе научных работ молодых ученых в области нанотехнологии, Москва (3-5 декабря 2008 и 6-8 октября 2009 г.); международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова, Москва-Пущино (28 сентября -1 октября 2009 г.); 3 Евразийском конгрессе по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика - 2010», Москва (21-25 июня 2010 г.); 5 Всероссийской конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой», Саратов (сентябрь, 2010 г.); XXIV Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»,

Москва (7-9 февраля 2012 г.); 7th European meeting on solar chemistry and photocatalysis: environmental applications, Porto, Portugal (17-20 июня 2012); II International Conference on Antimicrobial Research (ICAR2012), Lisbon, Portugal (21-23 ноября 2012); ежегодных отчетных научных конференциях ИМГ РАН (2009-2012 г.), а также регулярных семинарах Лаборатории регуляции экспрессии генов микроорганизмов ИМГ РАН.

Публикации

По теме работы опубликованы 4 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включая таблиц, рисунков. Список

цитируемых литературных источников включает работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Антимикробные свойства серебра известны очень давно. Ионы серебра проявляют широкий спектр действия, они подавляют рост патогенных бактерий, вирусов, грибов. Относительно механизма действия серебра на бактерии известно, что соединения серебра взаимодействуют с белками, различными ферментами, нуклеиновыми кислотами, вызывают структурные изменения клеточной стенки и мембран бактерий, ингибируют цепи переноса электронов клетки, что приводит в конечном итоге к разрушению и гибели бактерий. Однако, многие вопросы, связанные с действием НЧС и ионов на бактерии, в том числе, механизмы транспорта НЧС в бактериальную клетку, генетический контроль чувствительности и резистентности клеток бактерий к соединениям серебра изучены мало.

Возросший интерес к изучению соединений золота связан прежде всего с тем, что применение НЧЗ рассматривается перспективным для терапии рака. Это вызвано тем, что НЧЗ проявляют фотохимический и фототермальный эффект при различных видах облучения. Разрабатываются методы их адресной доставки, в том числе с присоединением к ним различных лекарственных препаратов.

Влияние ионов и наночастиц серебра и золота на рост бактерий

Объектом наших исследований были раствор ионов серебра AgNOj в воде и сферические наночастицы серебра (НЧС) размером 8,3 ± 1,9 нм, которые были стабилизированы пептидами, образующимися при щелочном гидролизе казеина. Массовая доля серебра в данном растворе составляла не менее 70%.

Для определения чувствительности к ионам и наночастицам серебра клеток Е. coli К12, Pseudomonas aeruginosa PAOl, Serratia proteamaculans 94 проводилось измерение минимальных ингибирующих концентраций (МИК). Суммарные данные по значениям МИК НЧС и AgNOi для представителей различных грамотрицательных бактерий приведены в таблице 1. МИК измеряли в 96-луночных полистироловых планшетах, используя метод серийных двукратных разведений; каждая лунка содержала ~ 1х105 клеток в мл в среде NB. Измерения проводили после инкубации бактерий в течение 24 часов при 30 °С на 2550 Microplate Reader (Bio-Rad, США) при 600 нм.

Было показано, что МИК AgNOi для грамотрицательных штаммов бактерий дикого типа Escherichia coli К12 и Serratia proteamaculans 94 были в среднем 0,10 мкг/мл, для Pseudomonas aeruginosa PAOl и P. chlororaphis 449 - 0,20 - 0,30 мкг/мл AgNOi (таб.1).

Таблица 1. Минимальные ингибирующие концентрации НЧС и AgNO, у грамотрицательных бактерий.

Штаммы МИК AgNOj мкг /мл МИК (AgN03) [Ag+] mM МИК НЧС, мкг/мл МИК (НЧС) [Ag°] mM МИКНЧС частиц/мл

Е. coli AB 1157 0,1 ±0,05 0,00059 0,5±0,25 0,0032 1,М0П

Р. aeruginosa PAOl 0,3±0,011 0,0018 8,0±0,30 0,052 1,81012

Pseudomonas chlororaphis 449 0,2±0,05 0,0012 8,0±0,20 0,052 1,8-10'2

Serratia proteamaculans 94 0,1±0,15 0,00059 2,0±0,25 0,013 4,5-10"

* Величины МИК приведены по результатам 2-3 опытов, каждый опыт проводился в двух повторностях.

МИК НЧС для E.coli ABl 157 была в пределах 0,5 мкг/мл, для представителей бактерий рода Pseudomonas - 8 мкг/мл и для Serratia - 2 мкг/мл. В пересчете на количество наночастиц в растворе минимальные ингибирующие концентрации НЧС колебались в районе 1,1-10"-Ч,8-1012 частиц/мл. В таблице приведены также данные для

действующих аналитических концентраций атомов [Ag°], в случае НЧС, и ионов [Ag+], в случае AgNO^. Можно видеть, что значения минимальных ингибирующих концентраций AgNC>3 были существенно ниже по сравнению с МИК НЧС.

Суммарные данные по значениям МИК для Е. coli К12, Pseudomonas aeruginosa PAOl и Serratia proteamaculans 94 при действии ионов золота приведены в таблице 2. МИК НАиСЦ для E.coli AB 1157 был в пределах 1,0 мкг/мл, для представителей бактерий рода Pseudomonas — 80 мкг/мл и для Serratia - 1,4 мкг/мл.

Таблица 2. Минимальные ингибирующие концентрации ионов золота у грамотрицательных бактерий.

Штаммы МИК НАиСЦ, мкг/мл*

Escherichia coli ABl 157 1,0±0,3

Pseudomonas aeruginosa РАО 1 80±10

Serratia proteamaculans 94 Serratia proteamaculans 94/pME6000 Serratia proteamaculans 94/pME6863 1,4±0,03 1,4±0,03 1,4±0,03

* Величины МИК приведены по результатам 2-3 опытов, каждый опыт проводился в двух повторностях.

Принято считать, что наночастицы золота инертны в отношении прокариотических и эукариотических клеток. Однако в последнее время появились данные о том, что НЧЗ оказывали антибактериальное действие (Chatteijee et al. 2011; Cui et al. 2012; Zhou et al. 2012) и действовали на клетки высших организмов (Li et al. 2010; Schaeublin et al. 2011).

В связи с этим представляло интерес изучить действие НЧЗ на бактериальные клетки более подробно.

Были исследованы образцы НЧЗ, диаметром 15±2 нм, имеющими форму нанопалочек и стабилизированные различными способами, и нами не было обнаружено какого-либо влияния раствора НЧЗ на клетки. Один из исследуемых образцов проявлял антибактериальное действие, но при дальнейших исследованиях было показано, что подавляющее действие оказывает цетилтриметиламмонийбромид (СТАВ) - детергент, используемый при синтезе НЧЗ и одновременно служащий стабилизатором полученного раствора. Не исключено, что антибактериальное действие на клетки, отмеченное в указанных выше работах, оказывали не сами НЧЗ, а вещества-детергенты.

Действие ионов и наночастиц серебра на формирование биопленок бактерий

Более 99% бактерий существуют в природных экосистемах в виде специфически организованных, прикрепленных к твердым поверхностям биопленок. Биоплекки имеют характерную архитектуру и заключены в экзополимерный матрикс. Существование патогенных бактерий в составе биопленок создает большие трудности для медицинской практики, т.к. при этом многократно повышается устойчивость бактерий к действию антибактериальных препаратов. Было показано, что введение соединений серебра в различные материалы препятствует бактериальному обрастанию (Chopra 2007). Однако, количественные данные о влиянии ионов серебра на формирование биопленок были получены только недавно для P. aeruginosa (Bjarnsholt et al. 2007). Мы исследовали действие AgNOj и НЧС, а также ионов золота на образование биопленок у Е. coli АВ1157, P. aeruginosa PAOl и S. proteamaculans 94 (рис.1). Ночные культуры исследуемых штаммов бактерий разбавляли в 300-1000 раз в среде NB. Для измерения образования биопленок культуры выращивали в полистироловых планшетах 24 ч с перемешиванием на качалке при 30 °С, после чего определяли рост планктонных, т.е. неприкрепленных клеток, при 600 нм. Образование биопленок измеряли после удаления среды, окрашивания прикрепленных клеток красителем кристаллический фиолетовый. Краситель из биопленок экстрагировали 96% этанолом, оптическую плотность раствора измеряли при 600 нм. По интенсивности окраски судили об уровне образования биопленок.

У Е. coli АВ1157 (рис.1а) и S. proteamaculans 94 (рисЛв) наблюдалось резкое уменьшение планктонного роста и формирования биопленок при увеличении концентрации от 0,075-0,15 мкг/мл до 0,3 мкг/мл AgN03 (при последней концентрации биопленки отсутствовали). У P. aeruginosa PAOl (рис. 16) уровень образования биопленок снижался при 0,3 мкг/мл AgNOj, и при концентрации AgNOa 0,6 мкг/мл биопленки не образовывались. При этом величины планктонного роста и уровня образования биопленок снижались практически до нуля при одной и той же концентрации AgN03 у Е. coli АВ1157 и S. proteamaculans 94. У P. aeruginosa PAOl при 0,3 мкг/мл AgN03 наблюдалось несколько большее снижение планктонного роста, чем уровня биопленок, при увеличении концентрации серебра вдвое оба показателя уменьшались до нуля.

На рис. 1г приведены данные для действия НЧС на клетки Е. coli АВ1157. Планктонный рост оставался неизменным при концентрации НЧС до 1 мкг/мл, при дальнейшем ее повышении происходило его постепенное снижение; при 5-10 мкг/мл планктонный рост практически не наблюдался. Процесс образования биопленок был

несколько менее чувствителен к действию НЧС - снижение уровня биопленок наблюдалось при концентрации НЧС выше 2 мкг/мл.

0,04 0,075 0,15

Концентрация АдГЧОз, мкг/мл

0 0,125 0,25 0,5

Концентрация НЧС, мкг/мл

Концентрация AgN03, мкг/мл

Концентрация НЧС, мкг/мл

0,04 0.075 0,15

Концентрация АдГМОз, мкг/мл

0,15 0,3 0,6 1,25 2,5 5

Концентрация НЧС, мкг/мл

Рис. 1. Зависимость роста планктонных клеток (белые столбики) и образования биопленок (черные

столбики) от различных концентраций AgN03 и НЧС.

а,г: Е.соЧ АВ1157 , б,д: P. aeruginosa PAOl, в,е: S. proteamaculans 94

При действии НЧС на Pseudomonas aeruginosa PAOl (рис. 1д) при концентрациях НЧС от 0 до 1,25-2,5 планктонный рост сохранялся на одном уровне, при концентрации НЧС выше 5 мкг/мл величина планктонного роста и уровень биопленок снижались, при 10-20 мкг/мл НЧС наблюдалось резкое падение обеих характеристик роста Р. aeruginosa PAOl. В случае Serratia proteamaculans спад планктонного роста и уровня образования биопленок наблюдались при 10 мкг/мл НЧС; при 20 мкг/мл НЧС происходило резкое снижение этих показателей практически до нулевого уровня (рис. 1е).

Следует отметить, что концентрации AgNC>3 , подавляющие рост планктонных клеток и формирование биопленок, были значительно ниже, чем в случае действия НЧС. Практически одновременный спад планктонного роста и образования биопленок позволяет предполагать, что уменьшение формирования биопленок является следствием подавления роста бактерий в присутствии соединений серебра, а не связано со специфическим действием ионов и наночастиц серебра непосредственно на процесс образования биопленок.

В литературе практически не встречается данных о влиянии ионов золота на рост планктонных клеток и образование биопленок бактерий. В настоящей работе были выявлены количественные закономерности действия раствора тетрахлороаурата (III) водорода в воде (НАиСЦ) на образование биопленок у Е. coli АВ1157, P. aeruginosa РА01 и S. proteamaculans 94 (рис. 2).

Рис. 2. Зависимость роста планктонных клеток (белые столбики) и образования биопленок (черные столбики) от различных концентраций Аи3+. а: Я. coli AB 1157 б: Р. aeruginosa PAOl в: S. proteamaculans 94

0,02 0,04 0,08 0,IS 0,32 0,64 Концентрация HAuCI4, мкг/мл

Концентрация HAuCI4, мкг/мл

На рис.2а приведены данные для Е. coli ABl 157. Планктонный рост и уровень образования биопленок оставались неизменными при концентрации НАиСЦ до 0,08 м кг/мл.

При действии ионов золота на Р. aeruginosa РА01 (рис. 26) при концентрациии НАиСЦ выше 40 мкг/мл величина планктонного роста и уровень биопленок резко снижались. В случае S. proteamaculans спад планктонного роста и уровня образования биопленок наблюдался при 2,5 мкг/мл НАиСЦ; при 5 мкг/мл ионов золота происходило резкое снижение этих показателей практически до нулевого уровня (рис. 2в).

Влияние НЧС и ионов золота на разрушение биопленок бактерий и гибель клеток в них

Как уже говорилось ранее, образование биопленок является одной из основных стратегий, повышающих выживаемость бактерий в окружающей среде, в том числе, в организме-хозяине. Клетки в составе сформированных биопленок являются крайне устойчивыми к действию антибиотиков и других лекарственных препаратов, в связи с этим представляло интерес исследовать действие НЧС и ионов золота на бактерии, живущие в уже образованных биопленках бактерий.

В качестве объекта изучения был выбран модельный штамм Е. coli ABl 157. Исследование проводили с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM) Zeiss LSM 510 laser module при lOOx увеличении с длиной волны возбуждающего лазера 488 нм; клетки окрашивали с использованием LIVE/DEAD Вас Light Bacterial Viability and Counting Kit.

На рисунке 3 показаны результаты конфокальной лазерной сканирующей микроскопии биопленок бактерий Е.соИ ABl 157 после обработки их НЧС.

а б в

Рис. 3. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия биопленок бактерий Е. coli ABl 157 после обработки их НЧС: а- контроль, б- концентрация НЧС 50 мкг/мл, в- концентрация НЧС 150 мкг/мл.

На первом снимке показан контроль (биопленки в отсутствие НЧС), видно преобладание зеленого окрашивания, что свидетельствует о том, что большинство клеток живые. Рисунки бив иллюстрируют нарастание интенсивности красного окрашивания с увеличением концентрации НЧС, что свидетельствует о гибели клеток в составе уже сформированных биопленок. Следует отметить, что гибель клеток, живущих в биопленках, наблюдается при более высоких концентрациях НЧС, чем подавление их образования. Бактериальные клетки ' в составе биопленок оказались до 25 раз более устойчивыми к действию НЧС размером 8,3 нм, чем планктонные клетки.

Параллельно проводили количественное измерение степени разрушения уже образованных биопленок при действии НЧС. Для этого выросшие на стеклах биопленки обрабатывали разными концентрациями НЧС, после чего стекла окрашивали кристалл-виолетом. Нами было показано, что биопленки на стеклах с увеличением НЧС уменьшаются по сравнению с контролем. Важно заметить, что клетки в составе биопленки гибнут, однако ее матрикс практически не разрушается.

На рис. 4 показаны результаты конфокальной лазерной сканирующей микроскопии биопленок бактерий E.coli АВ1157 после обработки их раствором НАиСЦ. При концентрации 15 мкг/мл НАиСЦ наблюдали уменьшение количества живых клеток по сравнению с контролем до 80%. Таким образом, Аи+ катионы вызывают гибель клеток в составе уже сформированных биопленок. Однако, клетки в составе биопленок значительно более устойчивы к действию ионов золота, чем планктонные клетки. При действии ионного золота наблюдается та же закономерность, что и при обработке биопленок соединениями серебра: бактериальные клетки в составе биопленок гибнут, однако ее матрикс разрушается слабо.

а б в

У Ж,;

«Î'/ -.лгт-

Л ' Jr

У*

■ > ■. . п

Рис. 4. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия биопленок бактерий E.coli ABl 157 после обработки их НАиСЦ: а- контроль, б- концентрация НАиСЦ 15 мкг/мл, в- концентрация НАиСЦ 150 мкг/мл.

Чувствительность к ионам серебра, золота и НЧС клеток Е. соН с мутациями в генах, участвующих в глобальной регуляции экспрессии генов бактерий, репарации и рекомбинации ДНК, синтезе транспортных белков поринов

Для определения чувствительности к ионам серебра и золота и НЧС штаммов Е. coli дикого типа и мутантов мы сравнивали минимальные ингибирующие концентрации (МИК) при действии этих соединений.

BER репарация ДНК (base excision repair) восстанавливает геномную ДНК после повреждений, вызванных действиями реактивных форм кислорода ROS (reactive oxygen species) и алкилирующих агентов. ROS, образовываясь внутриклеточно, могут повреждать структуру ДНК, белков и липидов. Основания ДНК крайне восприимчивы к окислительным повреждениям. Наиболее часто встречающимся и стабильным из таких повреждений является 8-оксогуанин (8-oxoG). В присутствии таких повреждений нарушается целостность двойной спирали ДНК и блокируется ее репликация (Farr and Kogoma 1991). У Е. coli существует целый ряд ферментов, которые инициируют выщепление модифицированных азотистых оснований путем гидролиза N-гликозидной связи. Было показано, что ионы серебра могут ингибировать дыхательные ферменты, способствуя синтезу активных форм кислорода, и тем самым вызывать окислительные повреждения бактериальной клетки (Holt and Bard 2005). С целью выяснения роли репарации окислительных повреждений ДНК в устойчивости клеток к действию AgNOj, НЧС и НАиСЦ нами было проведено сравнение величин МИК при действии этих соединений для изогенных штаммов Е. coli дикого типа и ряда мутантов, дефектных по белкам, участвующим в репарации ДНК этого типа.

Было показано, что инактивация генов miilS, mut Y, mutM и mutT приводит к уменьшению значения МИК при действии AgNOî по сравнению с клетками дикого типа (рис. 56).

Im.ill

а б

Рис 5. Влияние мутаций в генах, участвующих в репарации окислительных повреждений ДНК, на МИК Е. coli при действии а: НЧС, б: AgN03

В случае действия различных концентраций НЧС инактивация генов xthA, nth, mutS, mutM и mutT также приводила к уменьшению резистентности мутантных клеток по сравнению с клетками дикого типа (рис.5а). Мутация в гене mut Y понижала устойчивость клеток при действии НЧС до 10 раз. На основании этого, можно предположить, что эти гены могут быть вовлечены в восстановление окислительных повреждений ДНК, связанных с действием ионов и наночастиц серебра.

Сравнительное изучение чувствительности к ионам золота клеток Е. coli BW25113 и указанных выше изогенных мутантных штаммов не обнаружило различия между этими штаммами. Это показывает, что чувствительность бактерий к соединениям золота не связана, по-видимому, с окислительными повреждениями ДНК.

Не наблюдалось различий в чувствительности к ионам серебра и золота, а также НЧС, штаммов Е. coli дикого типа и штаммов, дефектных по эксцизионной репарации (uvrA, uvrB мутанты), SOS-репарации и рекомбинации (recA, lexA, гесВС, итиС и umuD мутанты). Это позволяет предположить, что эти системы репарации ДНК не играют существенной роли в защите клеток от действия соединений серебра и золота.

Сигма S субъединица РНК-полимеразы, кодируемая геном rpoS, является глобальным регулятором, контролирующим транскрипцию большого количества генов при различных стрессовых воздействиях (Hengge-Aronis 2002). Можно было ожидать поэтому, что rpoS мутанты будут более чувствительными к действию ионов и наночастиц серебра, а также ионам золота; однако, мы не наблюдали подобного эффекта этой мутации.

Другой глобальный регулятор транскрипции, сигма N субъединица РНК-полимеразы (ее кодирует ген rpoN), участвующая в контроле азотного обмена бактерий (Magasanik 1994), также не оказывала заметного влияния на чувствительность Е. coli к соединениям серебра и золота. Инактивация гена глобального регулятора белка CRP, участвующего в контроле катаболитной репрессии и экспрессии большого количества генов бактерий, не вызывала изменения чувствительности клеток Е. coli к ионам серебра и золота и НЧС. Lon протеаза играет важную роль в деградации дефектных (денатурированных) и ряда короткоживущих регуляторных белков (Gottesman 1999) и также относится к глобальным регуляторам транскрипции генов бактерий. Сравнительное изучение чувствительности к соединениям серебра и золота клеток Е. coli ABl 157 и изогенного Ion мутантного штамма AB 1899 не обнаружило различия между этими штаммами.

Quorum Sensing (QS) - специфический тип регуляции экспрессии генов бактерий, зависящей от плотности их популяции. QS системы включают низкомолекулярные

сигнальные молекулы, аутоиндукторы (АИ), легко диффундирующие через клеточную стенку, и регуляторные рецепторные белки, взаимодействующие с АИ. Представляло интерес исследовать вопрос о том, участвуют ли QS системы в регуляции чувствительности / устойчивости клеток бактерий к серебру и золоту. Штаммы Pseudomonas и Serratia, исследуемые в этой работе, содержали QS системы Luxl / LuxR типа, функционирующие с участием сигнальных молекул N-ацил-гомосеринлактонов (АГЛ).

Нами было показано, что по чувствительности к ионам серебра, золота и НЧС штаммы, несущие клонированный ген гомосеринлактоназы AiiA, деградирующей АГЛ, не отличались от штаммов, содержащих векторную плазмиду (S. proteamaculans 94/рМЕ6863 aiiA и S. proteamaculans 94/рМЕ6000, P. chlororaphis 449/ рМЕ6863 aiiA и P. chlororaphis 449/ рМЕбООО).

Было проведено также сравнение МИК штамма Serratia liquefaciens MGI и мутанта этого штамма S. liquefaciens MG44, не способного синтезировать АГЛ. Мы также не видели различий в чувствительности к ионам серебра, золота и НЧС у этих двух штаммов. Таким образом, QS регуляция не участвовала в контроле чувствительности к серебру у исследованных бактерий, относящихся к разным видам и родам.

Антимикробные агенты, включая тяжелые металлы, должны войти в клетку, чтобы подействовать на соответствующие мишени. В проникновении различных низкомолекулярных соединений в клетки бактерий и выведении их из клеток участвуют порины - белки клеточной стенки бактерий, обладающие способностью образовывать заполненные водой поры (каналы).

Мы исследовали влияние мутаций в генах, кодирующих порины OmpF и ОтрС, на чувствительность Е. coli к нитрату и наночастицам серебра, а также ионам золота, у нескольких хорошо изученных штаммов (рис. 6). Мутантные штаммы, лишенные поринов OmpF или ОтрС, или обоих поринов, были более устойчивыми к ионам серебра по сравнению со штаммом дикого типа; эффект мутаций для штаммов, лишенных одного из поринов (ОтрС ) или обоих поринов вместе, колебался при действии ионов серебра в 3-4 раза по сравнению со штаммом дикого типа. Штамм, мутантный по порину OmpF , был до 8 раз более резистентным к действию AgNOi (рис. 66). О роли белков поринов в чувствительности бактерий по отношению к НЧС ранее не сообщалось. Нами было показано, что мутантный штамм, лишенный обоих поринов OmpF и ОтрС, был наиболее устойчивым к НЧС по сравнению со штаммом дикого типа; эффект мутации колебался в разных опытах до 8 раз (рис. ба). Однако следует отметить, что диаметр пор, образуемых белками поринами, колеблется в пределах 1,0-5-1,1 нм (Pugsley and Schnaitman 1978;

Nikaido 1994). Такой размер пор в мембране бактериальных клеток предусматривает проникновение внутрь ионов серебра, но не НЧ размером 8,3 нм. В связи с этим, можно предположить, что антибактериальный эффект НЧС связан скорее с проникновением внутрь клеток ионов серебра, образуемых НЧС, чем самих НЧС.

МС4100 ТК 821 МН 1471 МН225

wt strain ompF"ompC" ofnpFompC''' omp^ompC

а б

Рис 6. Влияние мутаций в генах белках поринов на МИК Е. coli при действии а: НЧС, б: AgNOî

Мутантные штаммы, лишенные поринов OmpF или OmpC, не отличались заметно по чувствительности к ионам золота по сравнению со штаммом дикого типа; тем самым подразумевается возможность иных механизмов транспорта ионов золота в клетки.

На основании полученных данных можно предположить, что механизмы антибактериального действия ионов золота и соединений серебра (ионы и НЧС) существенно различаются.

Фемтосекундная оптоперфорация стенки цианобактерий Anabaena sp. 7120 wt в присутствии наночастиц золота

Известно, что НЧЗ могут проявлять фотохимические и фототермальные эффекты при различных видах облучения.

Относительно недавно предложен метод оптоперфорации стенки клетки с использованием фемтосекундных лазерных импульсов (Tirlapur and Kunig 2002; Stevenson et al. 2006). Оптическое разрушение стенки может использоваться для инактивации клеток, например, клеток патогенных бактерий (Pitsillides et al. 2003; Zharov et al. 2006). Кроме этого, специальным образом проведенная процедура перфорации стенки позволяет внедрить молекулы в биоклетку через непроницаемую для них мембрану, например, осуществить трансфекцию.

Совместно с сотрудниками Института проблем химической физики РАН, Черноголовка, нами был исследован эффект перфорации стенки цианобактерии Anabaena 7120 wt (в этих опытах Anabaena использована как модельный организм), покрытых НЧЗ,

i S

iiiOO

s iloo

900

Ï3700 f 2600

S S 500 m S

g g400

se |зоо If §200 5 ^100 0

при воздействии фемтосекундными импульсами с длиной волны 800 нм. Золотые наночастицы были образованы в среде растущих клеток цианобактерий при добавлении АиНСЦ(См. ниже).

На рис. 7 показано изображение клетки цианобактерии АпаЬае?1а 7120 и<1 с НЧЗ на её поверхности, полученное с помощью электронного микроскопа, и приведена гистограмма размеров НЧ. Средний размер НЧ, определенный из этого изображения, составил 15 ± 6 нм. Форму большинства НЧ можно аппроксимировать сферой, также встречаются более крупные НЧ в форме пластин.

Рис. 7. Гистограмма распределения НЧЗ по размеру и изображение клетки цианобактерии АпаЬаепа 7120 с НЧЗ на её поверхности (светлые пятна). АпаЬаепа 7120 с золотыми наночастицами после 4 недель роста [АиНС14]=0,25 тМ. При получении электронно микроскопического изображения клетка находилась в камере высокого давления, что привело к её деформированию.

На клетки с НЧЗ на её поверхности действовали сфокусированным фемтосекундным лазерным излучением, с различными временами экспозиции и энергиями в импульсе, при этом наблюдалось образование перфорированного отверстия (ПО) в стенке или образование пузырька кипения (ПК). Эти типы разрушения клеточной стенки имели место как для клеток с НЧЗ, так и в случае контрольных образцов клеток без золота. Рис. 8 демонстрирует типичный процесс образования ПК при облучении клетки импульсами с высокой энергией, что сопровождается разрывом стенки. На рис. 9 показано образование ПО при более низкой энергии в импульсе.

а б В /

Им км

ятт

Рис. 8 На рисунке показаны: а) клетки до включения лазера, б) образование пузырька кипения после 10 мсек облучения импульсами 0,7 нДж, в) образование отверстия с неровными краями, как результат ПК.

Рис. 9. На рисунке показаны: а) клетки до включения лазера, б) образование перфорированного отверстия клеточной стенки после включения лазера (0,15 нДж/50мс)

Наблюдения показали, что в случае клеток, содержащих НЧЗ, образование пузырька кипения и перфорированного отверстия наблюдаются при более низких энергиях импульса и при менее длительных экспозициях воздействия фемтосекундного лазерного излучения по сравнению с контролем (клетки, не обработанные НЧЗ). Полученные данные указывают на снижение энергетического порога оптоперфорации клеточной мембраны в присутствии НЧЗ. Среди механизмов активации оптической перфорации золотыми наночастицами могут быть рассмотрены два возможных предположения: усиления оптического поля и локального теплового разогрева в районе нахождения НЧЗ.

Разработка метода разрушения биопленок с помощью лазерного облучения наночастиц золота

Как говорилось выше, борьба с биопленками представляется очень важной задачей в современной медицине. В настоящее время установлено, что многие хронические инфекции, которые возникают при использовании медицинского имплантируемого оборудования — катетеров, глазных линз, искусственных клапанов сердца, протезов и др. -связаны со способностью патогенных бактерий образовывать биопленки на этих устройствах или внутри них. В связи с этим совместно с сотрудниками Института проблем химической физики РАН нами были сделаны первые шаги в сторону разработок альтернативных способов борьбы с биопленками. Представляло интерес провести опыты по действию фемтосекундного лазерного излучения на биопленки Е. coli, обработанные НЧЗ, для того чтобы попытаться точечно разрушить клетки в составе биопленок или ее матрикс. Такой способ разрушения биопленок может быть в дальнейшем использован в комплексе с применением антибактериальных средств.

Для исследования этого способа разрушения биопленок были выращены биопленки Е. coli на стеклах, далее на биопленки наносилось некоторое количество НЧЗ и затем полученные образцы облучались фемтосекундным лазером. Параллельно проводилось облучение контрольных биопленок (без их обработки НЧ).

На рис. 10а приведена съемка слоя биопленок на стеклянной подложке до действия фемтосекундного лазерного облучения и после него (рис. 10 б и в).

а б в

Рис. 10. На рисунке показаны: а) клетки в составе биопленок до включения лазера, б) образование пузырька кипения после 30 мсек облучения импульсами мощностью 40 мВт, в) образование отверстия в слое биопленок, как результат ПК.

Результаты опыта показывают точечное разрушение слоя биопленок, с

увеличением энергии импульса происходит более активное разрушение биопленок.

Следует отметить, что при облучении слоя биопленок, не обработанных НЧЗ импульсом мощностью до 60 мВт, видимых разрушений не наблюдается.

Таким образом, НЧЗ снижают энергетический порог повреждения клеток. Образование субмикронных отверстий в биопленках может привести к разрушению слоя биопленок и появлению локальных отверстий, нарушающих их целостность. Отверстия в биопленках могут способствовать улучшению проникновения внутрь биопленок антибактериальных препаратов. Таким образом, предложенный метод разрушения биопленок является первым этапом в исследованиях возможности деградации уже образованных биопленок с использованием НЧЗ и лазерного облучения.

Получение наночастиц металлов биологическими способами

Вторым аспектом этой работы является разработка методов получения наночастиц металлов биологическими способами. В последнее время уделяется большое внимание разработке таких методов, так как их использование открывает новые возможности для развития экономически выгодных способов получения НЧ заданной формы и размера.

В качестве субстрата для получения НЧ использовались растворы НАиСЦ. В экспериментах были использованы бактерии различных таксономических групп. Длительность культивирования варьировала от 3 дней до 4 дней роста, менялись условия роста. Все опыты проводились при комнатной температуре в аэробных условиях роста. Первоначально оценку образования наночастиц проводили визуально (при образовании НЧЗ цвет культурального раствора изменялся в зависимости от размера наночастиц от бледно-розового до пурпурно красного), а затем с помощью снятия спектров поглощения суспензии клеток с образованными НЧ и без них на спектрофотометре Shimadzu; наиболее удачные образцы отбирались для сканирующей электронной микроскопии SEM (scanning electron microscope). На рис. 11 представлена электронная микрофотография НЧЗ, которые были получены при инкубировании клеток цианобактерии Anabaena 7120 wt с раствором ионов золота.

Рис.11. Электронная микрофотография НЧЗ, полученных при инкубировании штаммов бактерий с раствором соли золота [НАиСЦ]=0,25 тМ(8ЕМ микроскопия).

На рис. 12 представлены стандартные спектры экстинкции суспензии исходных клеток Anabaena 7120 wt и клеток с НЧЗ.

Образование НЧЗ приводит к существенным изменениям спектров экстинкции, что проявляется в виде пика плазмонного резонанса НЧ в области 552 нм. Образование НЧЗ в Anabaena sp. РСС 7120 сопровождается выцветанием пигментов цианобактерии на длинах волн ~436 нм и -680 нм хлорофилла, ~496 нм каротиноидов, ~628 нм фикобилисом (Liu et al. 2005), что может говорить о гибели клеток цианобактерии в процессе биогенеза.

Была исследована возможность получения НЧЗ при использовании бактерий различных таксономических групп (цианобактерии АпаЬаепа, Ми/ос -3 штамма, 5уиесйосу^г«, 5упесИососст - 4 штамма; Аго1оЬас1ег \!те1апс1и, А2о1оЪааег сЪгоососсит) и варьировании условий культивирования (разные концентрации соли золота, среды с добавлением азота и без, темновые и световые условия роста, разное количество углеводов).

В ходе работы было показано, что образование НЧЗ наблюдается только у азотофиксирующих бактерий, таких как АпаЪаепа, Nostoc, Azotobacter, и не происходит у остальных исследованных организмов. При добавлении в культуральную среду этих азотофиксаторов азота извне (NaNCh в случае цианобактерий и (NH^SOi в случае Azotobacter) процесс образования НЧЗ не наблюдается или наблюдается в значительно меньшей степени. НЧЗ образуются также в супернатантах выше перечисленных бактерий. В темновых условиях роста цианобактерий образование НЧЗ не наблюдалось. С увеличением времени культивирования количество и размер НЧ растет, что подтверждено спектрофотометрически.

Основываясь на полученных данных, образование наночастиц металлов с помощью биогенеза представляется нам простым, дешевым и продуктивным способом.

ВЫВОДЫ

1. Определены закономерности ингибирующего действия ионов серебра, золота и наночастиц серебра (НЧС) на планктонный рост и образование биопленок Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Serratia proteamaculans. Эти соединения вызывали разрушение образованных биопленок Е. coli и гибель клеток в них в концентрациях значительно более высоких (в 20-30 раз), чем те, которые подавляют рост и формирование биопленок.

2. Мутации в генах, ответственных за репарацию окислительных повреждений ДНК (mutY, mutS, mutM., mutT, nth), увеличивали чувствительность клеток к НЧС и ионам серебра, что предполагает участие указанных генов в репарации повреждений ДНК, вызванных соединениями серебра.

3. Мутации в генах, участвующих в репарации окислительных повреждений ДНК, не оказывали заметного влияния на чувствительность клеток Е. coli к ионам золота. Это свидетельствует о различиях в механизмах действия на клетки ионов золота и соединений серебра. Не обнаружено антибактериального действия наночастиц золота (НЧЗ) на клетки бактерий в обычных условиях выращивания.

4. Мутации в генах, ответственных за эксцизионную и SOS - репарацию ДНК, не влияли на чувствительность Е. coli к НЧС, ионам серебра и золота. Это показывает, что антибактериальное действие соединений серебра и золота не связано со значительными повреждениями ДНК, которые могут быть восстановлены при участии этих репаративных систем.

5. QS системы LuxI/LuxR типа не участвовали в контроле чувствительности / устойчивости к соединениям серебра и ионам золота у P. chlororaphis и Serratia. Мутации в генах глобальных регуляторов Е. coli rpoS, crp, Ion не влияли на чувствительность бактерий к соединениям серебра и золота.

6. Мутантные штаммы Е. coli с инактивированными генами транспортных белков поринов OmpF и ОтрС были в 4 - 8 раз более резистентны к НЧС и ионам серебра, чем штамм дикого типа, что свидетельствует о важной роли поринов в антибактериальном действии этих соединений.

7. Показано, что НЧЗ при действии фемтосекундного лазерного излучения способствуют оптоперфорации клеточной стенки цианобактерий и биопленок Е. coli.

8. Получены стабильные НЧЗ при культивировании на среде с солью трехвалентного золота цианобактерий (Nostoc, АпаЬаепа) и Azotobacter в условиях азотфиксации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах

1. Antibacterial effects of silver nanoparticles on gram-negative bacteria: Influence on the growth and biofilms formation, mechanisms of action// M.A. Radzig. V.A. Nadtochenko, O.A. Koksharova J. Kiwi, V.A. Lipasova, I.A. Khmel // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces // 2013, V. 102 P. 300-306

2. Фемтосекундная оптоперфорация стенки цианобактерий АпаЬаепа sp. 7120 wt в присутствии наночастиц золота// Ю. Барбашов, А.Залеский, А.Айбушев, О.М. Саркисов, М.А. Радциг. И.А.Хмель, O.A. Кокшарова, В.А. Надточенко // Российские нанотехнологии// 2011, Том 6, №9-10, С. 32-37.

3. Антимикробное действие наночастиц металлов и полупроводников // В.А.Надточенко, М.А.Радциг. И.А.Хмель// Российские нанотехнологии// 2010, Том 5, №56, С. 37-46

4. Антибактериальные эффекты ионов серебра: влияние на рост грамотрицательных бактерий и образование биопленок // М.А.Радциг. О. А.Кокшарова, И.А.Хмель// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология// 2009, №4, С.27-31.

Тезисы конференций

1. М.А. Radzig and I.A. Khmel // Effect of silver nanoparticles on growth and biofilm formation of Gram-negative bacteria, mechanisms of action// II International Conference on Antimicrobial Research (ICAR2012), Lisbon, Portugal, 21-23 ноября 2012

2. Nadtochenko V., Alboushev A.. Radzig M„ Barbashov Yu., Kiwi J., Kostrov A., Kanaev A., Museur L., Khmel I. // Plasmonics and antibacterial effects // 7th European meeting on solar chemistry and photocatalysis: environmental applications, Porto, Portugal - 17-20 June 2012. p. 21-23.

3. M. А. Радциг. О. А. Кокшарова, В.А. Надточенко, И. А. Хмель// Изучение антибактериальных эффектов ионов золота.Биогенез наночастиц золота с помощью различных бактерий // XXIV Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 7-9 февраля 2012 г.;

4. Радциг М.А.. Хмель И.А.// Особенности антибактериального действия наночастиц серебра// 3 Евразийский Конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика — 2010», Москва 2010, 21-25 июня, Т.З. Раздел: Нанотехнологии в медицине, стр. 324-326.

5. Радциг М.А.. Хмель И.А.// Антибактериальные эффекты наночастиц серебра// Сборник тезисов докладов участников второго международного конкурса научных работ молодых ученых в области нанотехнологий, Москва 2009, 6-8 октября, стр. 805-807.

6. Радциг М.А.. Хмель И.А.// Антибактериальные эффекты ионов и наночастиц серебра// Тезисы международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения ак. Ю.А.Овчинникова, Москва-Пущино 2009, 28 сент-1 окт., стр. 331-332.

7. Радциг М.А., Кокшарова O.A., Липасова В.А., Хмель И.А.// Бактериальный рост, формирование биопленок и Quorum Sensing регуляция при действии ионов и наночастиц серебра.//Тезисы докладов конференции физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах, Москва 2009, 26-29 мая, стр. 185-186.

8. Радциг М.А.. Кокшарова O.A., Хмель И.А.//Действие наночастиц серебра на бактерии: жизнеспособность, образование биопленок и Quorum Sensing регуляция.// Тезисы докладов Международного форума по нанотехнологиям, Москва 2008, 3-5 декабря, стр.296-298.

Заказ № 428-1/12/2012 Подписано в печать 20.12.2012 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цнфровичок", тел. (495) 649-83-30 )) www.cfr.ru ; е-таИ:zak@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Радциг, Марина Александровна

I. ВВЕДЕНИЕ.

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ.

11.1. ВВЕДЕНИЕ.

11.2. АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫЕ ЭФФЕКТЫ ИОНОВ СЕРЕБРА.

II. 2.1. Механизмы действия ионов серебра.

II. 2.2. Резистентность к ионам серебра.

11.3. ДЕЙСТВИЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА.

II. 3.1. Механизмы действия НЧС.

11.4. ИНГИБИРОВАНИЕ НАНОЧАСТИЦАМИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ

ОБЛУЧЕНИИ СВЕТОМ.

II. 4.1. Фотокаталитический механизм.

II.4.2. Фототермальный эффект.

11.5. СИНТЕЗ НАНОЧАСТИЦ.

II.5.1. Биосинтез наночастиц с использованием бактерий.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Радциг, Марина Александровна

VI. выводы

1. Определены закономерности ингибирующего действия ионов серебра, золота и НЧС на планктонный рост и образование биопленок Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Serratiaproteamaculans. Эти соединения вызывали разрушение образованных биопленок Е. coli и гибель клеток в них в концентрациях значительно более высоких (в 20-30 раз), чем те, которые подавляют рост и формирование биопленок.

2. Мутации в генах, ответственных за репарацию окислительных повреждений ДНК (mutY, mutS, mutM, mutT, nth), увеличивали чувствительность клеток к НЧС и ионам серебра, что предполагает участие указанных генов в репарации повреждений ДНК, вызванных соединениями серебра.

3. Мутации в генах, участвующих в репарации окислительных повреждений ДНК, не оказывали заметного влияния на чувствительность клеток Е. coli к ионам золота. Это свидетельствует о различиях в механизмах действия на клетки ионов золота и соединений серебра. Не обнаружено антибактериального действия наночастиц золота на клетки бактерий в обычных условиях выращивания.

4. Мутации в генах, ответственных за эксцизионную и SOS - репарацию ДНК, не влияли на чувствительность Е. coli к НЧС, ионам серебра и золота; это показывает, что их антибактериальное действие не связано со значительными повреждениями ДНК, которые могут быть восстановлены при участии этих репаративных систем.

5. QS системы LuxI/LuxR типа не участвовали в контроле чувствительности / устойчивости к соединениям серебра и ионам золота у Р. chlororaphis и Serratia. Мутации в генах глобальных регуляторов Е. coli rpoS, crp, Ion не влияли на чувствительность бактерий к соединениям серебра и золота.

6. Мутантные штаммы Е. coli с инактивированными генами транспортных белков поринов OmpF и ОшрС были в 4 - 8 раз более резистентны к НЧС и ионам серебра, чем штамм дикого типа, что свидетельствует о важной роли поринов в антибактериальном действии этих соединений.

7. Показано, что наночастицы золота при действии фемтосекундного лазерного излучения способствуют оптоперфорации клеточной стенки цианобактерий и биопленок E.coli.

8. Получены стабильные наночастицы золота при культивировании на среде с солыо трехвалентного золота цианобактерий (Nostoc, Anabaena) и Azotobacter в условиях азотфиксации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Радциг, Марина Александровна, Москва

1. Ahmad, A., P. Mukherjee, et al. (2003). "Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles using the fungus Fusarium oxysporum." Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 28(4): 313-318.

2. Ahmad, A., S. Senapati, et al. (2003). "Intracellular synthesis of gold nanoparticles by a novel alkalotolerant actinomycete, Rhodococcus species." Nanotechnology 14(7): 824.

3. Ahmad, A., S. Senapati, et al. (2003). "Extracellular Biosynthesis of Monodisperse Gold Nanoparticles by a Novel Extremophilic Actinomycete, Thermomonospora sp." Langmuir 19(8): 3550-3553.

4. Aiboushev, A. V., A. A. Astafiev, et al. (2009). "Enhanced luminescence and two-photon absorption of silver nano-clusters." physica status solidi (c) 6(S1): S162-S166.

5. Amato, E., Y. A. Diaz-Fernandez, et al. (2011). "Synthesis, characterization and antibacterial activity against Gram positive and Gram negative bacteria of biomimetically coated silver nanoparticles." Langmuir 27(15): 9165-9173.

6. Asahi, R., T. Morikawa, et al. (2001). "Visible-light photocatalysis in nitrogen-doped titanium oxides." Science (New York. N.Y.") 293(5528): 269-271.

7. Babu, M. M., J. Sridhar, et al. (2011). "Global transcriptome analysis of Bacillus cereus ATCC 14579 in response to silver nitrate stress." J Nanobiotechnology 9: 49.

8. Bacsa, R., J. Kiwi, et al. (2005). "Preparation, testing and characterization of doped Ti02 active in the peroxidation of biomolecules under visible light." The journal of physical chemistry. B 109(12): 5994-6003.

9. Baker, C., A. Pradhan, et al. (2005). "Synthesis and antibacterial properties of silver nanoparticles." J Nanosci Nanotechnol 5(2): 244-249.

10. Balagurunathan, R., M. Radhakrishnan, et al. (2011). "Biosynthesis of gold nanoparticles by actinomycete Streptomyces viridogens strain HM10." Indian J Biochem Biophys 48(5): 331-335.

11. Balogh, L., D. R. Swanson, et al. (2001). "DendrimerSilver Complexes and Nanocomposites as Antimicrobial Agents." Nano Lett. Nano Letters 1(1): 18-21.

12. Baram-Pinto, D., S. Shukla, et al. (2010). "Inhibition of HSV-1 attachment, entry, and cell-to-cell spread by functionalized multivalent gold nanoparticles." Small 6(9): 1044-1050.

13. Baram-Pinto, D., S. Shukla, et al. (2009). "Inhibition of herpes simplex virus type 1 infection by silver nanoparticles capped with mercaptoethane sulfonate." Bioconjug Chem 20(8): 1497-1502.1 >A *

14. Bazylinski, D. A. and R. B. Frankel (2004). "Magnetosome formation in prokaryotes." Nat Rev Microbiol 2(3): 217-230.

15. Belly, R. and G. Kydd (1982). "Silver resistance in microorganisms." Dev. Ind Microbiol 23: 567—577.

16. Bharde, A., A. Wani, et al. (2005). "Bacterial aerobic synthesis of nanocrystalline magnetite." J Am Chem Soc 127(26): 9326-9327.

17. Bjarnsholt, T., K. Kirketerp-Moller, et al. (2007). "Silver against Pseudomonas aeruginosa biofilms." APMIS 115(8): 921-928.

18. Bjarnsholt, T., K. Kirketerp-M0Ller, et al. (2007). "Silver against Pseudomonas aeruginosa biofilms." APMIS 115(8): 921-928.

19. Blake, D., P.-C. Maness, et al. (1999). "Application of the Photocatalytic Chemistry of Titanium Dioxide to Disinfection and the Killing of Cancer Cells." Separation & Purification Reviews 28(1): 1-50.

20. Böhm, J. (1928). Z. Kristallogr 68: 567.

21. Bragg, P. D. and D. J. Rainnie (1974). "The effect of silver ions on the respiratory chain of Escherichia coli." Can J Microbiol 20(6): 883-889.

22. Brayner, R., H. Barberousse, et al. (2007). "Cyanobacteria as bioreactors for the synthesis of Au, Ag, Pd, and Pt nanoparticles via an enzyme-mediated route." J Nanosci Nanotechnol 7(8): 2696-2708.

23. Brayner, R., C. Yepremian, et al. (2009). "Photosynthetic microorganism-mediated synthesis of akaganeite (beta-FeOOH) nanorods." Langmuir 2507): 10062-10067.

24. Bresee, J., K. E. Maier, et al. (2011). "Growth inhibition of Staphylococcus aureus by mixed monolayer gold nanoparticles." Small 7(14): 2027-2031.

25. Brust, M., M. Walker, et al. (1994). "Synthesis of thiol-derivatised gold nanoparticles in a two-phase Liquid?Liquid system." J. Chem. Soc., Chem. Commun.(7).

26. Burda, C., X. Chen, et al. (2005). "Chemistry and properties of nanocrystals of different shapes." ChemRev 105(4): 1025-1102.

27. Calamai, P., S. Carotti, et al. (1997). "Biological properties of two gold(III) complexes: AuC13(Hpm) and AuC12(pm).n J Inorg Biochem 66(2): 103-109.

28. Canizal, G., J. A. Ascencio, et al. (2001). "Multiple Twinned Gold Nanorods Grown by Bio-reduction Techniques." Journal of Nanoparticle Research 3(5): 475-481.

29. Carlson, C., S. M. Hussain, et al. (2008). "Unique Cellular Interaction of Silver Nanoparticles: Size-Dependent Generation of Reactive Oxygen Species." J. Phys. Chem. B 112(43): 13608-13619.

30. Chang, Q., L. Yan, et al. (2007). "Bactericidal mechanism of Ag/A1203 against Escherichia coli." Langmuir 23(22): 11197-11199.

31. Changela, A., K. Chen, et al. (2003). "Molecular basis of metal-ion selectivity and zeptomolar sensitivity by CueR." Science 301(5638): 1383-1387.

32. Checa, S. K. and F. C. Soncini (2011). "Bacterial gold sensing and resistance." Biometals 24(3): 419-427.

33. Chen, P. and C. He (2004). "A general strategy to convert the MerR family proteins into highly sensitive and selective fluorescent biosensors for metal ions." J Am Chem Soc 126(3): 728-729.

34. Chen, W. J. and Y. C. Chen (2010). "Fe304/Ti02 core/shell magnetic nanoparticle-based photokilling of pathogenic bacteria." Nanomedicine (Lond) 5(10): 1585-1593.

35. Choi, J. Y., C. J. Chung, et al. (2009). "Photocatalytic antibacterial effect of tio2 film of tiag on streptococcus mutans." Angle Orthod 79(3): 528-532.

36. Choi, O., C. P. Yu, et al. (2010). "Interactions of nanosilver with Escherichia coli cells in planktonic and biofilm cultures." WaterRes 44(20): 6095-6103.

37. Chopra, I. (2007). "The increasing use of silver-based products as antimicrobial agents: a useful development or a cause for concern?" J Antimicrob Chemother 59(4): 587-590.

38. Chun, M. J., E. Shim, et al. (2007). "Surface modification of orthodontic wires with photocatalytic titanium oxide for its antiadherent and antibacterial properties." Angle Orthod 77(3): 483-488.

39. Coleman, H. M., C. P. Marquis, et al. (2005). "Bactericidal effects of titanium dioxide-based photocatalysts." Chemical Engineering Journal Chemical Engineering Journal 113(1): 55-63.

40. Cunningham, D. P. and L. L. Lundie, Jr. (1993). "Precipitation of cadmium by Clostridium thermoaceticum." Appl Environ Microbiol 59(1): 7-14.

41. David, S. S., V. L. O'Shea, et al. (2007). "Base-excision repair of oxidative DNA damage." Nature 447(7147): 941-950.

42. Deliyanni, E. A., D. N. Bakoyannakis, et al. (2003). "Sorption of As(V) ions by akaganeite-type nanocrystals." Chemosphere 50fl): 155-163.

43. Deplanche, K., G. Attard, et al. (2007). "Biorecovery of Gold from Jewellery Wastes by Escherichia Coli and Biomanufacture of Active Au-Nanomaterial " Advanced Materials Research 20 21: 647-650.

44. Deplanche, K., I. Caldelari, et al. (2010). "Involvement of hydrogenases in the formation of highly catalytic Pd(0) nanoparticles by bioreduction of Pd(II) using Escherichia coli mutant strains." Microbiology 156(Pt 9): 2630-2640.

45. Dhanjal, S. and S. S. Cameotra (2010). "Aerobic biogenesis of selenium nanospheres by Bacillus cereus isolated from coalmine soil." Microb Cell Fact 9: 52.

46. Dibrov, P., J. Dzioba, et al. (2002). "Chemiosmotic mechanism of antimicrobial activity of Ag(+) in Vibrio cholerae." Antimicrob Agents Chemother 46(8): 2668-2670.

47. Dong, Y. H., L. H. Wang, et al. (2001). "Quenching quorum-sensing-dependent bacterial infection by an N-acyl homoserine lactonase." Nature 411(6839): 813-817.

48. Du, L., H. Jiang, et al. (2007). "Biosynthesis of gold nanoparticles assisted by Escherichia coli DH5a and its application on direct electrochemistry of hemoglobin." Electrochemistry Communications 9(5): 1165-1170.

49. Dubas, S. T., P. Kumlangdudsana, et al. (2006). "Layer-by-layer deposition of antimicrobial silver nanoparticles on textile fibers." COLLOIDS AND SURFACES A PHYSICOCHEMICAL AND ENGINEERING ASPECTS 289(1-3): 105-109.

50. Eberl, L., M. K. Winson, et al. (1996). "Involvement of N-acyl-L-hormoserine lactone autoinducers in controlling the multicellular behaviour of Serratia liquefaciens." Mol Microbiol 20(1): 127-136.

51. Elahifard, M. R., S. Rahimnejad, et al. (2007). "Apatite-Coated Ag/AgBr/Ti02~ Visible-Light Photocatalyst for Destruction of Bacteria." JOURNAL- AMERICAN CHEMICAL SOCIETY 129(31): 9552-9553.

52. Elechiguerra, J. L., J. L. Burt, et al. (2005). "Interaction of silver nanoparticles with HIV-1." J Nanobiotechnology 3: 6.

53. Erkan, A., U. Bakir, et al. (2006). "Photocatalytic microbial inactivation over Pd doped Sn02 and Ti02 thin films." JOURNAL OF PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY A 184(3): 313-321.

54. Es-Souni, M. and II. Fischer-Brandies (2008). "Versatile nanocomposite coatings with tunable cell adhesion and bactericidity." Adv. Funct. Mater. 18(20): 3179-3188.

55. Faraday (1857). "Experimental Relations of Gold (and Other Metals) to Light." Philosophical Transactions of the Royal Society 147: 145.

56. Farr, S. B. and T. Kogoma (1991). "Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium." Microbiol Rev 55(4): 561-585.

57. Feng, Q. L., J. Wu, et al. (2000). "A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus aureus." J Biomed Mater Res 52(4): 662-668.

58. Ferrando, R., J. Jellinck, et al. (2008). "Nanoalloys: from theory to applications of alloy clusters and nanoparticles." Chem Rev 108(3): 845-910.

59. Finney, L. A. and T. V. O'Halloran (2003). "Transition metal speciation in the cell: insights from the chemistry of metal ion receptors." Science 300(5621): 931-936.

60. Flink, S., F. C. J. M. v. Veggel, et al. (2000). "Review Sensor Functionalities in Self-Assembled Monolayers." Advanced materials. 12(18): 1315.

61. Franke, S., G. Grass, et al. (2001). "The product of the ybdE gene of the Escherichia coli chromosome is involved in detoxification of silver ions." Microbiology 147(Pt 4): 965972.

62. Fu, M., Q. Li, et al. (2006). "Rapid Preparation Process of Silver Nanoparticles by Bioreduction and Their Characterizations." Chinese Journal of Chemical Engineering 14(1): 114-117.

63. Furno, F., K. S. Morley, et al. (2004). "Silver nanoparticles and polymeric medical devices: a new approach to prevention of infection?" JOURNAL OF ANTIMICROBIAL CHEMOTHERAPY 54(6): 1019-1024.

64. Galdiero, S., A. Falanga, et al. (2011). "Silver nanoparticles as potential antiviral agents." Molecules 16(10): 8894-8918.

65. Gao, X., J. Zhang, et al. (2002). "Hollow Sphere Selenium Nanoparticles: Their In-Vitro Anti Hydroxyl Radical Effect." Advanced Materials 14(4): 290-293.

66. Ghandour, W., J. A. Hubbard, et al. (1988). "The uptake of silver ions by Escherichia coli K12: toxic effects and interaction with copper ions." Applied Microbiology and Biotechnology 28(6): 559-565.

67. Ghosh, S., S. Patil, et al. (2012). "Synthesis of silver nanoparticles using Dioscorea bulbifera tuber extract and evaluation of its synergistic potential in combination with antimicrobial agents." Int J Nanomedicine 7: 483-496.

68. Gogoi, S. K., P. Gopinath, et al. (2006). "Green fluorescent protein-expressing Escherichia coli as a model system for investigating the antimicrobial activities of silver nanoparticles." Langmuir 22(22): 9322-9328.

69. Gong, P., H. Li, et al. (2007). "Preparation and antibacterial activity of Fe~30~4 @ Ag nanoparticles." Nanotechnology. 18(28): 285604.

70. Gottesman, S. (1999). "Regulation by proteolysis: developmental switches." Curr Opin Microbiol 2(2): 142-147.

71. Gupta, A., K. Matsui, et al. (1999). "Molecular basis for resistance to silver cations in Salmonella." Nat Med 5i2~): 183-188.

72. Gupta, A., L. T. Phung, et al. (2001). "Diversity of silver resistance genes in IncH incompatibility group plasmids." Microbiology 147(Pt 12): 3393-3402.

73. Gupta, A. and S. Silver (1998). "Silver as a biocide: will resistance become a problem?" Nat Biotechnol 16(10): 888.

74. Hayden, S. C., N. K. Allam, et al. (2010). "Ti02 nanotube/CdS hybrid electrodes: extraordinary enhancement in the inactivation of Escherichia coli." J Am Chem Soc 132(41): 1440614408.

75. Hoffman, L. R., D. A. D'Argenio, et al. (2005). "Aminoglycoside antibiotics induce bacterial biofilm formation." Nature 436(7054): 1171-1175.

76. Howard-Flanders, P. and L. Theriot (1966). "Mutants of Escherichia coli K-12 defective in DNA repair and in genetic recombination." Genetics 53(6): 1137-1150.

77. Hu, C., Y. Lan, et al. (2006). "Ag/AgBr/Ti02 visible light photocatalyst for destruction of azodyes and bacteria." The journal of physical chemistry. B 110(9): 4066-4072.

78. Husseiny, M. I., M. A. El-Aziz, et al. (2007). "Biosynthesis of gold nanoparticles using Pseudomonas aeruginosa." Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc 67(3-4): 10031006.

79. Jackson, D. W., J. W. Simecka, et al. (2002). "Catabolite repression of Escherichia coli biofilm formation." J Bacteriol 184(12): 3406-3410.

80. Jagani, S., R. Chelikani, et al. (2009). "Effects of phenol and natural phenolic compounds on biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa." Biofouling 25(4): 321-324.

81. Jain, P. K., X. Huang, et al. (2007). "Review of Some Interesting Surface Plasmon Resonance-enhanced Properties of Noble Metal Nanoparticles and Their Applications to Biosvstems." PLASMONICS 2(3): 107-118.

82. Jayaseelan, C., A. A. Rahuman, et al. (2012). "Novel microbial route to synthesize ZnO nanoparticles using Aeromonas hydrophila and their activity against pathogenic bacteria and fungi." Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc 90: 78-84.

83. Jiang, S., C. T. Ho, et al. (2012). "Mercury capture into biogenic amorphous selenium nanospheres produced by mercury resistant Shewanella putrefaciens 200." Chemosphere 87(6): 621-624.

84. Johnson, N. C., S. Manchester, et al. (2008). "Mercury vapor release from broken compact fluorescent lamps and in situ capture by new nanomaterial sorbents." Environ Sci Technol 42(15): 5772-5778.

85. Jung, W. K., H. C. Koo, et al. (2008). "Antibacterial activity and mechanism of action of the silver ion in Staphylococcus aureus and Escherichia coli." Appl Environ Microbiol 74(7): 2171-2178.

86. Kalimuthu, K., R. Suresh Babu, et al. (2008). "Biosynthesis of silver nanocrystals by Bacillus licheniformis." Colloids Surf B Biointerfaces 65(1): 150-153.

87. Kashefi, K., J. M. Tor, et al. (2001). "Reductive precipitation of gold-by dissimilatory Fe(III)-reducing bacteria and archaea." Appl Environ Microbiol 67(7): 3275-3279.

88. Keren, I., N. Kaldalu, et al. (2004). "Persister cells and tolerance to antimicrobials." FEMS Microbiol Lett 230(1): 13-18.

89. Khmel, I. A., M. I. Ovadis, et al. (2005). "Activity of Serratia plymuthica IC1270 gene chiA promoter region in Escherichia coli mutants deficient in global regulators of transcription." J Basic Microbiol 45(6): 426-437.

90. Kikuchi, Y., K. Sunada, et al. (1997). "Photocatalytic bactericidal effect of Ti02~ thin films: dynamic view of the active oxygen species responsible for the effect." JOURNAL OF PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY A 106(1/3): 51-56.

91. Kim, J. S., E. Kuk, et al. (2007). "Antimicrobial effects of silver nanoparticles." Nanomedicine 3(1): 95-101.

92. Kiwi, J. and V. Nadtochenko (2004). "New Evidence for Ti02 Photocatalysis during Bilayer Lipid Peroxidation." The Journal of Physical Chemistry B 108(45): 17675-17684.

93. Kiwi, J. and V. Nadtochenko (2005). "Evidence for the mechanism of photocatalytic degradation of the bacterial wall membrane at the Ti02 interface by ATR-FTIR and laser kinetic spectroscopy." Lanmnuir 21(10): 4631-4641.fr).

94. Klasen, H. J. (2000). "Historical review of the use of silver in the treatment of burns. I. Early uses." Burns 26(2): 117-130.

95. Klaus, T., R. Joerger, et al. (1999). "Silver-based crystalline nanoparticles, microbially fabricated." Proc Natl Acad Sei U S A 96(24): 13611-13614.

96. Konishi, Y., K. Ohno, et al. (2004). "Microbial synthesis of gold nanoparticles by metal reducing bacterium " Trans Mater Res Soc Jpn 29 2341-2343.

97. Krishnan, S. and N. V. Prasadarao (2012). "Outer membrane protein A and OprF: versatile roles in Gram-negative bacterial infections." FEBS J 279(6): 919-931.

98. Magasanik, B. (1994). "A charmed life." Annu Rev Microbiol 48: 1-24.

99. Maneerung, T., S. Tokura, et al. (2008). "Impregnation of silver nanoparticles into bacterial cellulose for antimicrobial wound dressing." Carbohydrate polymers. 72(1): 43-51.

100. Marino, T., N. Russo, et al. (2012). "Theoretical investigation on DNA/RNA base pairs mediated by copper, silver, and gold cations." Dalton Trans 41(6): 1816-1823.

101. Marshall, M. J., A. S. Beliaev, et al. (2006). "c-Type cytochrome-dependent formation of U(IV) nanoparticles by Shewanella oneidensis." PLoS Biol 4(9): e268.

102. Matsunaga, T., R. Tomoda, et al. (1985). "Photoelectrochemical sterilization of microbial cells by semiconductor powders." FEMS Microbiology Letters 29(1-2): 211-214.

103. Mazeina, L., S. Deore, et al. (2006). "Energetics of Bulk and Nano-Akaganeite, p-FeOOH: Enthalpy of Formation, Surface Enthalpy, and Enthalpy of Water Adsorption." Chemistry of Materials 18(7): 1830-1838.

104. McClean, K. H., M. K. Winson, et al. (1997). "Quorum sensing and Chromobacterium violaceum: exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acylhomoserine lactones." Microbiology 143 ( Pt 12): 3703-3711.

105. McDonnell, G. and A. D. Russell (1999). "Antiseptics and disinfectants: activity, action, and resistance." Clin Microbiol Rev 12(1~): 147-179.

106. Menendez, P., L. Wang, et al. (2005). "Genetic manipulation of human embryonic stem cells: a system to study early human development and potential therapeutic applications." Curr GeneTher5(4): 375-385.

107. Meruvu, H., M. Vangalapati, et al. (2011). "Synthesis and characterization of zinc oxide nanoparticles and its antimicrobial activity against Bacillus subtilis and Escherichia coli." J. Rasavan Chem. 4: 217-222.

108. Mikheenko, I. P., M. Rousset, et al. (2008). "Bioaccumulation of palladium by Desulfovibrio fructosivorans wild-type and hydrogenase-deficient strains." Appl Environ Microbiol 74(19): 6144-6146.

109. Minaeian, S., A. Shahverdi, et al. (2008). "Extracellular biosynthesis of silver nanoparticles by some bacteria." J. Sci. I. A . U (JSIAID 17.

110. Morones, J. R., J. L. Elechiguerra, et al. (2005). "The bactericidal effect of silver nanoparticles." Nanotechnology 16(10): 2346-2353.

111. Moyer, C. A., L. Brentano, et al. (1965). "Treatment of Large Human Burns with 0.5 Per Cent Silver Nitrate Solution." Arch Surg 90: 812-867.

112. Mullen, M. D., D. C. Wolf, et al. (1989). "Bacterial sorption of heavy metals." Appl Environ Microbiol 55(12): 3143-3149.

113. Nadtochenko, V., N. Denisov, et al. (2009). "Correlations for photocatalytic activity and spectral features of the absorption band edge of Ti02 modified by thiourea." Applied Catalysis B: Environmental 91(1-2): 460-469.

114. Nadtochenko, V., N. Denisov, et al. (2006). "Laser kinetic spectroscopy of the interfacial charge transfer between membrane cell walls of E. coli and TiO"2." Journal of Photochemistry & Photobiology. A: Chemistry 181(2-3): 401-407.

115. Nadtochenko, V. A., A. G. Rincon, et al. (2005). "Dynamics of E. coli membrane cell peroxidation during Ti02 photocatalysis studied by ATR-FTIR spectroscopy and AFM microscopy." Journal of photochemistry and photobiology. A. Chemistry. 169(2): 131.

116. Nair, B. and T. Pradeep (2002). "Coalescence of Nanoclusters and Formation of Submicron Crystallites Assisted by Lactobacillus Strains." Crystal Growth & Design 2(4): 293-298.

117. Nangia, Y., N. Wangoo, et al. (2009). "A novel bacterial isolate Stenotrophomonas maltophilia as living factory for synthesis of gold nanoparticles." Microb Cell Fact 8: 39.

118. NCCLS (2000). Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically. Wayne, PA: National Committee for Clinical Laboratory Standards.

119. Nics, D. H. (2003). "Efflux-mediated heavy metal resistance in prokaryotes." FEMS Microbiol Rev 27(2-3): 313-339.

120. Nikaido, H. (1994). "Porins and specific diffusion channels in bacterial outer membranes." J Biol Chem 269(6): 3905-3908.

121. Norman, R. S., J. W. Stone, et al. (2008). "Targeted Photothermal Lysis of the Pathogenic Bacteria, Pseudomonas aeruginosa, with Gold Nanorods." NANO LETTERS 8(1): 302306.

122. Ogino, C., M. Farshbaf Dadjour, et al. (2006). "Enhancement of sonocatalytic cell lysis of Escherichia coli in the presence of TiO"2." Biochemical Engineering Journal 32(2): 100105.

123. Pal, S., Y. K. Tak, et al. (2007). "Does the antibacterial activity of silver nanoparticles depend on the shape of the nanoparticle? A study of the Gram-negative bacterium Escherichia coli." Appl Environ Microbiol 73(6): 1712-1720.

124. Parikh, R. Y., S. Singh, et al. (2008). "Extracellular synthesis of crystalline silver nanoparticles and molecular evidence of silver resistance from Morganella sp.: towards understanding biochemical synthesis mechanism." Chembiochem 9(9): 1415-1422.

125. Park, H. J., J. Y. Kim, et al. (2009). "Silver-ion-mediated reactive oxygen species generation affecting bactericidal activity." Water Res 43(4): 1027-1032.

126. Peng, D., J. Zhang, et al. (2007). "Size effect of elemental selenium nanoparticles (Nano-Se) at supranutritional levels on selenium accumulation and glutathione S-transferase activity." J Inorg Biochem 101(10): 1457-1463.

127. Pissuwan, D., S. M. Valenzuela, et al. (2007). "A Golden Bullet? Selective Targeting of Toxoplasma gondii Tachyzoites Using Antibody-Functionalized Gold Nanorods." Nano letters. 7(12): 3808.

128. Pitsillides, C. M., E. K. Joe, et al. (2003). "Selective cell targeting with light-absorbing microparticles and nanoparticles." Biophys J 84(6): 4023-4032.

129. Plyuta, V., J. Zaitseva, et al. (2013). "Effect of plant phenolic compounds on biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa." APMIS in print.

130. Prasad, G. K., G. S. Agarwal, et al. (2009). "Photocatalytic inactivation of Bacillus anthracis by titania nanomaterials." Journal of Hazardous Materials 165(1-3): 506-510.

131. Price, W. R. and M. Wood (1966). "Silver nitrate burn dressing. Treatment of seventy burned persons." Am J Surg 112(5): 674-680.

132. Pugsley, A. P. and C. A. Schnaitman (1978). "Outer membrane proteins of Escherichia coli. VII. Evidence that bacteriophage-directed protein 2 functions as a pore." J Bacteriol 133(3): 1181-1189.

133. Quisenberry, L. R., L. H. Loetscher, et al. (2009). "Catalytic inactivation of bacteria using Pd-modified titania." Catalysis Communications 10(10): 1417-1422.

134. Rai, M., A. Yadav, et al. (2009). "Silver nanoparticles as a new generation of antimicrobials." Biotechnol Adv 27m: 76-83.

135. Rao, C. N. R., A. Muller, et al. (2007). Nanomaterials chemistry : recent developments and new directions. Weinheim; Chichester, Wiley-VCH ; John Wiley, distributor.

136. Raulio, M., V. Pore, et al. (2006). "Destruction of Deinococcus geothermalis biofilm by photocatalytic ALD and sol-gel Ti02 surfaces." J Ind Microbiol Biotechnol 33(4): 261268.

137. Reddy, P., A. Venugopal, et al. (2007). "Ilydroxyapatite-supported AgTi02 as Escherichia coli disinfection photocatalyst." Water Research Water Research 41(2): 379-386.

138. Reimmann, C., N. Ginet, et al. (2002). "Genetically programmed autoinducer destruction reduces virulence gene expression and swarming motility in Pseudomonas aeruginosa PAOl." Microbiology 148(Pt 4): 923-932.

139. Reith, F., M. F. Lengke, et al. (2007). "The geomicrobiology of gold." ISMEJ 1(7): 567-584.

140. Rengifo-Herrera, J. A., N. C. Castillo, et al. (2008). "Escherichia coli inactivation by N, S co-doped commercial TiO2 powders under UV and visible light." Appl. Catal. B Environ. 84(3-4): 448-456.

141. Rensing, C., B. Fan, et al. (2000). "CopA: An Escherichia coli Cu(I)-translocating P-type ATPase." Proc Natl Acad Sei U S A 97(2): 652-656.

142. Richards, R. M., H. A. Odelola, et al. (1984). "Effect of silver on whole cells and spheroplasts of a silver resistant Pseudomonas aeruginosa." Microbios 39(157-158): 151-157.

143. Rincon, A. G. and C. Pulgarin (2003). "Photocatalytical inactivation of E. coli: effect of (continuous-intermittent) light intensity and of (suspended-fixed) Ti02 concentration." APPLIED CATALYSIS B 44(3): 263-284.

144. Rincón, A. G. and C. Pulgarin (2007). "Absence of E. coli regrowth after Fe3+ and Ti02 solar photoassisted disinfection of water in CPC solar photoreactor." CATALYSIS TODAY 124(3-4): 204-214.

145. Roberts, M. E. and P. S. Stewart (2004). "Modeling antibiotic tolerance in biofilms by accounting for nutrient limitation." Antimicrob Agents Chemother 48(1): 48-52.

146. Rodríguez-Arguelles, M. C., C. Sieiro, et al. (2011). "Chitosan and silver nanoparticles as pudding with raisins with antimicrobial properties." J Colloid Interface Sei 364(1): 80-84.

147. Roe, D., B. Karandikar, et al. (2008). "Antimicrobial surface functionalization of plastic catheters by silver nanoparticles." Journal of Antimicrobial Chemotherapy 61(4): 869876.

148. Rogers, J. V., C. V. Parkinson, et al. (2008). "A preliminary assessment of silver nanoparticle inhibition of monkeypox virus plaque formation." Nanoscale Research Letters 3(4): 129133.

149. Roucoux, A., J. Schulz, et al. (2002). "Reduced transition metal colloids: a novel family of reusable catalysts?" Chem Rev 102(10): 3757-3778.

150. Russell, A. D. and W. B. Hugo (1994). "Antimicrobial activity and action of silver." Prog Med Chem 31: 351-370.

151. Russell, A. D., W. B. Hugo, et al. (1982). Principles and practice of disinfection, preservation, and sterilisation. Oxford ; Boston, Blackwell Scientific Publications ; St. Louis, Mo. : Blackwell Mosby Book Distributors.

152. Sahoo, A. K., M. P. Sk, et al. (2011). "Plasmid DNA linearization in the antibacterial action of a new fluorescent Ag nanoparticle-paracetamol dimer composite." Nanoscale 3(10): 42264233.

153. Saifuddin, N., C. W. Wong, et al. (2009). "Rapid Biosynthesis of Silver Nanoparticles Using Culture Supernatant of Bacteria with Microwave Irradiation." E-Journal of Chemistry 6(1): 61-70.

154. Schaeublin, N. M., L. K. Braydich-Stolle, et al. (2011). "Surface charge of gold nanoparticles mediates mechanism of toxicity." Nanoscale 3(2): 410-420.

155. Schreurs, W. J. and H. Rosenberg (1982). "Effect of silver ions on transport and retention of phosphate by Escherichia coli." J Bacteriol 152(1): 7-13.

156. Shahverdi, A. R., A. Fakhimi, et al. (2007). "Synthesis and effect of silver nanoparticles on the antibacterial activity of different antibiotics against Staphylococcus aureus and Escherichia coli." Nanomedicine 3(2): 168-171.

157. Shankar, S. S., A. Ahmad, et al. (2003). "Bioreduction of chloroaurate ions by geranium leaves and its endophytic fungus yields gold nanoparticles of different shapes." Journal of Materials Chemistry 13m: 1822-1826.

158. Sharma, V. K., R. A. Yngard, et al. (2009). "Silver nanoparticles: green synthesis and their antimicrobial activities." Adv Colloid Interface Sci 145(1-2): 83-96.

159. Shchukin, D. G., E. A. Ustinovich, et al. (2004). "Heterogeneous photocatalysis in titania-containing liquid foam." Photochemical & Photobiological Sciences 3(2): 157-159.

160. Silver, S. (2003). "Bacterial silver resistance: molecular biology and uses and misuses of silver compounds." FEMS Microbiol Rev 27(2-3): 341-353.

161. Silver, S., T. Phung le, et al. (2006). "Silver as biocides in burn and wound dressings and bacterial resistance to silver compounds." J Ind Microbiol Biotechnol 33(7): 627-634.

162. Singh, M., S. Singh, et al. ( 2008). "Nanotechnology in medicine and antibacterial effect of silver nanoparticles." Digest J. Nanomater. Biostruct 3: 115-122.

163. Sintubin, L., W. De Windt, et al. (2009). "Lactic acid bacteria as reducing and capping agent for the fast and efficient production of silver nanoparticles." Appl Microbiol Biotechnol 84(4): 741-749.

164. Skorb, E. V., L. I. Antonouskaya, et al. (2008). "Antibacterial activity of thin-film photocatalysts based on metal-modified TiO"2 and Ti0"2:In"20"3 nanocomposite." Applied Catalysis B, Environmental 84(1-2): 94-99.

165. Slawson, R. M., J. T. Trevors, et al. (1992). "Silver accumulation and resistance in Pseudomonas stutzeri." Archives of Microbiology 158(6): 398-404.

166. Slawson, R. M., M. I. Van Dyke, et al. (1992). "Germanium and silver resistance, accumulation, and toxicity in microorganisms." Plasmid 27(1): 72-79.

167. Smith, S. G., V. Mahon, et al. (2007). "A molecular Swiss army knife: OmpA structure, function and expression." FEMS Microbiol Lett 273(1): 1-11.

168. Sokmen, M., F. Candan, et al. (2001). "Disinfection of E. coli by the Ag-Ti02/UV system: lipidperoxidation." JOURNAL OF PHOTOCHEMISTRY AND PHOTOBIOLOGY A 143(2-3): 241-244.

169. Solioz, M. and A. Odermatt (1995). "Copper and silver transport by CopB-ATPase in membrane vesicles of Enterococcus hirae." J Biol Chem 270(16): 9217-9221.

170. Solioz, M. and C. Vulpe (1996). "CPx-type ATPases: a class of P-type ATPases that pump heavy metals." Trends Biochem Sci 21(7): 237-241.

171. Sondi, I. and B. Salopek-Sondi (2004). "Silver nanoparticles as antimicrobial agent: a case study on E. coli as a model for Gram-negative bacteria." J Colloid Interface Sci 275(1): 177182.flVrJ

172. Spoering, A. L. and K. Lewis (2001). "Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials." J Bacteriol 183(23): 6746-6751.

173. Srinivasan, C. and N. Somasundaram (2003). "REVIEW ARTICLES Bactericidal and detoxification effects of irradiated semiconductor catalyst, Ti02." Current science. 85(10): 1431.

174. Stevenson, D., B. Agate, et al. (2006). "Femtosecond optical transfection of cells: viability and efficiency." Optics express 14(16): 7125-7133.

175. Stoyanov, J. V., D. Magnani, et al. (2003). "Measurement of cytoplasmic copper, silver, and gold with a lux biosensor shows copper and silver, but not gold, efflux by the CopA ATPase of Escherichia coli." FEBS Lett 546(2-3): 391-394.

176. Subba Rao, K. V., B. Zhuo, et al. (2006). "Photoinduced Bactericidal Properties of Nanocrystalline Ti02 Thin Films." Journal of Biomedical Nanotechnology 2(1); 71-73.

177. Summers, A. O. (2009). "Damage control: regulating defenses against toxic metals and metalloids." Curr Opin Microbiol 12(2): 138-144.

178. Sun, L., A. K. Singh, et al. (2008). "Silver Nanoparticles Inhibit Replication of Respiratory Syncytial Virus." Journal of Biomedical Nanotechnology 4(2): 149-158.

179. Sun, R. W. Y., R. Chen, et al. (2005). "Silver nanoparticles fabricated in Hepes buffer exhibit cytoprotective activities toward HIV-1 infected cells." CHEMICAL COMMUNICATIONS- ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY(40): 5059-5061.

180. Sun, S., B. Sun, et al. (2008). "Preparation and antibacterial activity of Ag-TiO2 composite film by liquid phase deposition (LPD) method." Bulletin of Materials Science 31(1): 61-66.

181. Sunada, K., T. Watanabe, et al. (2003). "Bactericidal activity of copper-deposited Ti02 thin film under weak UV light illumination." Environmental science & technology 37(20): 47854789.

182. Sunada, K., T. Watanabe, et al. (2003). "Studies on photokilling of bacteria on Ti02 thin film." Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 156(1-3): 227-233.

183. Sweeney, R. Y., C. Mao, et al. (2004). "Bacterial biosynthesis of cadmium sulfide nanocrystals." Chem Biol 11(11): 1553-1559.

184. Teitzel, G. M. and M. R. Parsek (2003). "Heavy metal resistance of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa." Appl Environ Microbiol 69(4): 2313-2320.

185. Thakkar, K. N., S. S. Mhatre, et al. (2010). "Biological synthesis of metallic nanoparticles." Nanomedicine 6(2): 257-262.

186. Tirlapur, U. K. and K. Keonig (2002). "Targeted transfection by femtosecond laser." Nature 418(6895): 290-291.lfi

187. Turkevich, J., P. C. Stevenson, et al. (1951). "A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold." Discussions of the Faraday Society 11: 55-75.

188. Vacaroiu, C., M. Enache, et al. (2009). "The effect of thermal treatment on antibacterial properties of nanostructured TiO2(N) films illuminated with visible light." World J. Microbiol. Biotechnol. 25m: 27-31.

189. Van Aken, B. and L. S. Lin (2011). "Effect of the disinfection agents chlorine, UV irradiation, silver ions, and Ti02 nanoparticles/near-UV on DNA molecules." Water Sci Technol 64(6): 1226-1232.

190. Vogel, A., J. Noack, et al. (2005). "Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues." Applied Physics B: Lasers and Optics 81(8): 1015-1047.

191. Waite, R. D., A. Papakonstantinopoulou, et al. (2005). "Transcriptome analysis of Pseudomonas aeruginosa growth: comparison of gene expression in planktonic cultures and developing and mature biofilms." J Bacteriol 187(18): 6571-6576.

192. Wang, Z. L., Y. Liu, et al. (2003). Handbook of nanophase and nanostructured materials. New York, Kluwer Academic/Plenum.

193. Watts, R. J., S. Kong, et al. (1995). "Photocatalytic inactivation of coliform bacteria and viruses in secondary wastewater effluent." Water research. 29(1): 95.

194. Wei, X., M. Luo, et al. (2012). "Synthesis of silver nanoparticles by solar irradiation of cell-free Bacillus amyloliquefaciens extracts and AgN03." Bioresour Technol 103(1): 273-278.

195. Williams, P. (2007). "Quorum sensing, communication and cross-kingdom signalling in the bacterial world." Microbiology 153(Pt 12): 3923-3938.

196. Wosten, M. M., L. F. Kox, et al. (2000). "A signal transduction system that responds to extracellular iron." Cell 103(1): 113-125.

197. Xu, X. H., W. J. Brownlow, et al. (2004). "Real-time probing of membrane transport in living microbial cells using single nanoparticle optics and living cell imaging." Biochemistry 43(32): 10400-10413.

198. Yakabe, Y., T. Sano, et al. (1980). "Kinetic studies of the interaction between silver ion and deoxyribonucleic acid." Chem. Lett. Chemistry Letters(4): 373-376.

199. Yamamoto, O. (2001). "Influence of particle size on the antibacterial activity of zinc oxide." International Journal of Inorganic Materials 3(7): 643-646.

200. Yamanaka, M., K. Hara, et al. (2005). "Bactericidal actions of a silver ion solution on Escherichia coli, studied by energy-filtering transmission electron microscopy and proteomic analysis." Appl Environ Microbiol 71(11): 7589-7593.

201. Yang, C., G. L. Liang, et al. (2009). "Bactericidal functionalization of wrinkle-free fabrics via covalently bonding Ti02@Ag nanoconjugates." J Mater Sci 44(7): 1894-1901.

202. Yao, Y., Y. Ohko, et al. (2008). "Self-sterilization using silicone catheters coated with Ag and Ti02 nanocomposite thin film." Journal of biomedical materials research. Part B, Applied biomaterials. 85(2): 453-460.

203. Yu, J. C., W. Ho, et al. (2005). "Efficient Visible-Light-Induced Photocatalytic Disinfection on Sulfur-Doped Nanocrystalline Titania." Environmental science & technology 39(4): 1175-1179.

204. Yuranova, T., A. G. Rincon, et al. (2006). "Performance and characterization of Agcotton and Ag/Ti02 loaded textiles during the abatement of E. coli." Journal of Photochemistry and Photobiology A 181(2-3): 363-369.

205. Zaitseva, J., V. Granik, et al. (2009). "Effect of nitrofurans and NO generators on biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PAOl and Burkholderia cenocepacia 370." Res Microbiol 160(5): 353-357.

206. Zaporojtchenko, V., R. Podschun, et al. (2006). "Physico-chemical and antimicrobial properties of co-sputtered Ag-Au/PTFE nanocomposite coatings." Nanotechnology. 17(19): 49044908.

207. Zhang, H. and G. Chen (2009). "Potent Antibacterial Activities of Ag/Ti02 Nanocomposite Powders Synthesized by a One-Pot Sol-Gel Method." Environmental science & technology. 43(8): 2905.

208. Zhang, H., Q. Li, et al. (2007). "Accumulation of silver(I) ion and diamine silver complex by Aeromonas SH10 biomass." Appl Biochem Biotechnol 143(1): 54-62.

209. Zhang, H. J. and D. Z. Wen (2007). "Antibacterial properties of SbTi02 thin films by RF magnetron co-sputtering." Surface and Coatings Technology 201(9-11): 5720-5723.

210. Zhang, L., J. C. Yu, et al. (2003). "Ambient Light Reduction Strategy to Synthesize Silver Nanoparticles and Silver-Coated Ti02~ with Enhanced Photocatalytic and Bactericidal Activities." Langmuir 19: 10372-10380.

211. Zhang, S.-Y., J. Zhang, et al. (2004). "Synthesis of selenium nanoparticles in the presence of polysaccharides." Materials Letters 58(21): 2590-2594.

212. Zharov, V. P. and D. O. Lapotko (2005). "Photothermal imaging of nanoparticles and cells." IEEE J. Select. Topics Quantum Electron. 11(4): 733-751.

213. Zharov, V. P., K. E. Mercer, et al. (2006). "Photothermal Nanotherapeutics and Nanodiagnostics for Selective Killing of Bacteria Targeted with Gold Nanoparticles." Biophysical journal 90(2): 619-627.

214. Zhou, Y., Y. Kong, et al. (2012). "Antibacterial activities of gold and silver nanoparticles against Escherichia coli and bacillus Calmette-Guerin." J Nanobiotechnology 10: 19.

215. Zolotavin, P., E. Permenova, et al. (2008). "Two-photon luminescence enhancement of silver nanoclusters photodeposited onto mesoporous Ti02 film." Chemical Physics Letters 457(4—6): 342-346.

216. Егорова, E. M., А. А. Ревина, et al. (2001). "Бактерицидные и каталитические свойства стабильных металлических наночастиц в обратных мицеллах." Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. 42: 332-338.

217. Ильина, Т. С., Ю. М. Романова, et al. (2004). "Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития." Генетика. 11: 1-12.

218. Липасова, В. А., Э. Э. Атамова, et al. (2009). "Экспрессия гена N-ацил-гомосеринлактоназы AiiA влияет на свойства ризосферного штамма Pseudomonas chlororaphis 449." Генетика 45: 38-42.

219. Хмель, И. A. and А.З.Метлицкая (2006). "Quorum sensing регуляция экспрессии генов -перспективная мишень для создания лекарств против патогенности бактерий." Молекулярная биология 40: 195-210.

220. Хмель, И. A. and А. 3. Метлицкая (2006 ). "Регуляция экспрессии генов перспективная мишень для создания лекарств против патогенности бактерий. ." Мол.биология. 40(2): 195-210.1. VIII. БЛАГОДАРНОСТИ

Информация о работе

Радциг, Марина Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.06

Диссертация

Взаимодействие клеток бактерий с соединениями серебра и золота: влияние на рост, образование биопленок, механизмы действия, биогенез наночастиц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы