Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие карнозина и родственных ему соединений с активными формами кислорода

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие карнозина и родственных ему соединений с активными формами кислорода"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.З. ЛОМОНОСОВА

Биолоппеский факультет

На правах рукописи

ТЮЛИНА ОЛЬГА ВЛАДИМИРОВНА

УДК 577.152

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КАРНОЗИНА И РОДСТВЕННЫХ ЕМУ СОЕДИНЕНИЙ С АКТИВНЫМИ ФОРМАМИ КИСЛОРОДА 03.00.04- биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа вьшолнена на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор 6ИОЛОГИЧ2СКИХ Наук профессор Д.А.Болдырев

Официальные оппопенты:

доктор биологичаских наук

Н.В.Гуляева кандидат химических наук А.Р.Хомгтов

Ведущая организация - Институт биологической и медицинской

химии РАКШ.

Защита состоится 1ЛН>Н£ 1994 г. в " часов

на заседании Специализированного Совета Д.053.05.32 при Московской Государственном Университете им. М.В.Ломоносова адресу: 119899, г.Москва, Ленинские горы, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан .¿{Ц-Е. 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета " доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Акт2альЕ0С'лЬ_пробле^ы. Гистндинсодержащие дипептидз последние ды привлекаю? внимание исследователей как природные антяоксиданты. особкость карнозина эффективно препятствовать герекисному ислекию опосредуется его прямым взаимодействием с активными рмя:л! кислорода и перз1тчнымк перекиснымн продукта)® (Болдырев, S6), однако подробной характеристики энтиоксидантных свойств дственннх карнсзину соединений до сиг пор не проводилось. Между ы ферыентаталнзя природа метаболизма, а тасте тканевая и ввдовэя ешфичность распределения дипептидов указывает на функциональную тассть иг xiMnecKia превращений. Множаствеатасть агпшныг форм слсрода, образующихся in vivo разными путями, свидетельствует о (знообргзии о;<ислительшц прсцессоз, препятствовакж которым >ебует целей системы аятиоксидантов. Изучение проблемы гзцифячности взаимодействия карнозш.*а и родственных еау веществ с [ределзнными активкыш! формами кислорода помогло бы понять причины югообразия природных дипептидов и об'яснить функциональный смысл : метаболических превращений.

Целью работа была сравнительная характеристика взакмодействия зда гистидинсодержащих дипептидов с различными активными фермами {слородз: гидроксильным радикалом, птохлорит-анионом и тероксид-анионом. Для этого были использована разные по механизму эдели их генерации:

) химическая модель образования активного гвдроксига в ходе sакции Фентона,

) ферментативная модель продукции гипохлорит-аниона в ходе ротекания миелопероксидазной реакции и

) клеточная модель генерации суперокскд-аниона и галохлорит-аниона ходе "дыхательного взрыва" стимулированных лейкоцитов.

На£тая_ндвизна. В работе были впервые получен! следующие езультаты:

. Показано, что карнозин является наиболее эффективным из истидинсодержащих дипептидов тушителем активного гидрокшла.

Обнаружено, что гистщдансодержащие дипептиды, за исключением цетилированной формы карнозина, обладают * способностью

п-

высокозффектизно нейтрализовать гипохлорит-аниок.

3. Установлено, что ьнзерин и, б меньшей степени, ацетилкарнсяш, ингиСируют активность миелопероксидазы (МПО) нейтрофилов человека.

4. Показано снижение эффективности подавления миелспероксидазной реакши в ряд?: анзерин > каркозин > гомокарнозин > гистидан.

5. Продемонстрирована двойственность эффекта гистидинсодеркащих . дипептздов на генерацию "дыхательного взрыва" иммунококлетчнтными ¡слетками - сочетание активации еупероксид-генерируыщей системы и подавления образования гипохлорит-аниона.

Практическая значимость работы. Полученные в работе данше расширяют представления о семействе природных антиоксидзптов и возможностях их применения в медицинской практике. Обнаружены эффективные способы нейтрализации гипохлорчт-аниона, избыточная • продукция которого лежит в основе пзтогенгза рада заболеваний. Углублены представления об иммуностимулирующих свойствах карнсзина и других дипептидов, предложен механизм их модулирующего действия на защитные функции клеток крови.

Апробация работы. Материалы работы обсуждались на заседаниях кафедры биохимии Биологического факультета МГУ, докладывались на Всесоюзной конференции "Биоактиоксиданты" (Москва, апрель 1992).

Публикации. По теме диссертации опубликовано з работы.

Структура и об'ем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, изложения и обсуждения результатов, заключения,

выводов и списка литературы. Работа изложена на _ стр.

машинописного текста, содержит _ рисунков и _ таблиц. Список

цитированной литература включает _наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Измерение взаимодействия карнозина и родственных ему соединений £_0Н1_Е§ЯЙБ§32Й проводили методом ЭПР-спектроскопии. Образование

гидроксильных радикалов индуцировали взаимодействием перекиси водорода с ионами двухвалентного гелэза (Feso^) з реакции ©ентона. В качество ловушки свободных радикалов использовали 5,5-ДИМеТИЛ-1-ПИррОЛИН-Н-ОКСИД (ДМПО) (Rosen and ítauckman, 19е4). Опыта проводил; в буферной среде, содержащей 1,5) H20» и 50 В качестве буфера использовали pipes (рн 7,0). Реакцию инициировали добавлением 20 мкМ Feso4. snF-сигнал ДМЮ-ОН" адцукта регистрировали на ЗПР-слектрометре varían в-4 (США).

гегнстрацию____образования_____гшюхлоркт-аниока____в_____xcge

Шгелоп^оксидазной^памщ проводили хемилшинометрически в присутствии лпшнола и перекиси водорода (Говорова и соавт.,1987). Реакционная среда содержала I0~SM люминол, 5*I0_SH Н202, 5 мМ фосфатный буфер (рН 7,4), 150 мМ КС1 и 2 нМ ШО нейтрофилов человека ("Sigma",. Опыты проводили на отечественном хемилминсыетре 1Ш1-1.

Измерение____активности____миелоперрксщазы_в____отсутствие

хлорид-аниона проводили спектрсфотометрически с использованием о-дианизидина (Kiebanoff, 1965). Реакционная среда содержала 0,3 Ш о-дианизщюк, 5*10~5М Н202> 5 ыМ фосфатный буфер срН 7,4) и 2 нМ миелопероксидазу.

Измерение хемилюминесценции активированшх_лейкопитов. Препарат общей лейкомассы получали из крови кролика описанным в литературе методом (Тотолян и соавт., 1986). Лейкоцита активировали нерастворимыми часищами сульфата бария (Владимиров, Шерстнев, 1989). Регистрацию люминесцентного сигнала проводили на хемилюминометре ькв (Швеция) при 37°С в присутствии люминесцентных зондов люминола и люцигенина. Среда измерения содержала раствор Хенкса (рН 7,4), люминесцентный зонд в концентрации 10_5М, клетки и активатор свечения Baso4, 3 мг в пробу.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Сравнительная характеристика взаимодействия гистидин-содержащих дипептидов с гидроксильным радикалом.

Прямым инициатором реакций перекисного окисления липидов in vivo является, как правило, активный гадроксил. Он химически образуется из перекиси водорода (реакция Феятонз) или при взаимодействии Н202 с супероксид-анионом (реакция Хабера-Вейсса) в

присутствии ионов металлов переменной валентности. Способность карнозина прямо взаимодействовать с ОН* была показана ранее (Ииы^оу еь а1, 1991, Болдырев и соавт., 1992). Для нас представлялось важным выяснить, является ли карнозин наиболее эффективным тушителем гидроксильного радикала, или же в ряду гистидинсодержащих дипептидов наблюдается усиление этой функции. Чтобы ответить на этот вопрос, мы воспользовались химической моделью генерации ОН" в водном растворе в ходе реакции Фентона. Регистрацию этого процесса проводили методом спиновых ловуиек с использованием ДМПО. Спиновый аддукт ловушки с радикальной формой имеет характерный спектр ЗПР, величины пиков которого пропорциональны количеству образованного аддукта и, соответственно, активного гидроксила.

Инициация реакции Фентона при добавлении геБо4 в реакционную среду приводит к возрастанию интенсивности сигнала ДМПО-ОН'. в присутствии 20 мМ карнозина величина сигнала значительно снижается уже к I мин после инициации реакции (Рис.1). В присутствии

3

Рис.1. ЭПР-спектры ДМПО (1), ДМПО-ОН" аддукта (2) и ДМПО-ОН' аддукта в присутствии 20 мМ карнозина (3), к I мин после инициации реакции.

ацетилкарнозина, анзерина и гомокарнозина наблюдается значительно меньшее подавление ЭПР-сигнала (Табл.1).

Таблада I. Влияние гистидинсодержапих дипептидов на величину сигнала ДМП-ОН' аддукта к I мин после инициации реакции (концентрация соединений 20 мМ), число измерений п = 5.

Вещество Величина сигнала, * от контроля

pipes (контроль) 100

карнозин 13 + 5

ацетилкарнозин 44 + 6

анзерин 47 + 5

гомокарнозин 54 + 4

Величины сигнала в присутствии всех указанных соединений мало изменялись к 10 мин после начала реакции, что указывает на их способность стабилизировать радикальную форму спиновой ловушки, тогда как в присутствии pipes, гистидина или смеси гистидина с £-аланином наблюдается ее спонтанный распад во времени. Однако исходное значение сигнала существенно снижалось только в присутствии карнозина, другие дипептиды оказались менее эффективными тушителями ОН". Из приведенных результатов можно сделать вывод, что химическая модификация карнозина путем его метилирования, ацетшшрования или замены р-аланильного остатка не приводит к усилению его антиоксидантной функции в отношении связывания гидроксил-радикала, хотя и модифицирует характер их взаимодействия с этой активной формой кислорода.

II. Влияние карнозина и родственных ему соединений на протекание миелопероксидазной реакции.

Миелопероксидаза - гемсодержащий фермент азурсфильных гранул нейтрофилов, катализирущий в присутствии перекиси водорода и ионов хлора образование гипохлорит-аниона. Этот фермент вносит существенный вклад в генерацию "дыхательного взрыва" нейтрофилами крови для осуществления их бактерицидной и цитотоксической роли

(Dahlgren, 1987). ПрОТИВСДеЙСТБИе ЧукерОДНСЙ ИНфеКЦИй Б ВК^З

продукции скшюго окиолигглл может сопровождаться посрекдр:з;эм собственных ткгяей организма, от которого они должны Сыть зффектиЕгто защищены. Так, после истсщащкх физических нагрузок происходит инфильтрация нейтрофялов в мышечную ткань и накопление в ней секретируемой шелопероксидазы (Морозов и соавт., 1590). Систему защиты тканей ст разрушительного воздействия 0CI" составляют таурин, восстановленный глу^атион, а такае, предположительно, кзрнозик. Показано, что при сливании водных растворов кзрнозкна и гипохлорита происходит снижение концентрации обоих Ееществ и появление пика, соотБетствувдего образованию хлораиинового комплекса (Формазюк и созвт., 1ЭЭ2). Возматно, что убыль карнозипз в ргСстапдей мышце, определяемая с помощью ын2-реагентов и не сопровождающаяся поязлениза гьстидина и 0-эланина (Дупие, 1936), объясняется необходимостью Еейтрализаиш продукта миелопероксидазной реакции. Нам предстояло выяснить, является ли карнозин ссмым зктивным нейтрализующим CCi~ агентом, или среди дипептидов есть болзе эффективные в этол отношении вещества.

А. Хемидюминсхатричесхая регистрация образования пшохлорит-аниона в ходе миелопероксидазной реакции.

Продукция 0С1" в присутствии лшинола сопровождается испусканием света с максимумом интенсивности при 425 им. Развитие хемилюминесцеагного ответа во времени выражается в увеличении интенсивности сигнала, достижении им максимального значения и его последующем падении. По скорости роста сигнала и его максимальной величине можно судить об активности фермента и количестве образованного продукта. Оказалось, что все родственные карнозияу соединения, за исключением имидазола и ацетилкарнозина, в концентрации 10 мМ полностью предотвращают появление сигнала в этих условиях, а ß-аланин в той see концентрации снижает его величину на 65%. Чтобы подробнее охарактеризовать их действие, мы исследовали концентрационную зависимость влияния этих веществ на величину максимального люминесцентного сигнала. На Рис.2 показана зависимость величины сигнала, индуцированного протеканием миелопероксидазной реакции, в t от сигнала, измеренного в присутствии pipes, от концентрации указанных соединений. Из рисунка видно, что способность родственных карнозину содинений подавлять реакцию падает в ряду:

-МПО

Х//о а. - оа - Н^

1 3 5

С,мМ

Рис.2. Изменение интенсивности максимального хемшаминесцентного сигнала миелопероксидазной реакции (I) в присутствии различных концентраций анзерина (1), карнозина (2), гоиокарнозина (З) и тастидина (4).

анзерин > карнозин > гомокарнозин > гистидан. Концентрации веществ, исследованных в диапазоне от 0 до 10 мМ, которые обеспечивают 50% и 90% подавление хемилшинесценции, представлены в Табл.2 (приведены результаты типичного эксперимента).

Из таблицы следует, что эффект дипептидсв сравняй по степени ингибирования сигнала с эффектом таурина, которой считается признанным нейтрализующим 0С1~ агентом. Интересно, что все перечисленные здесь соединения имеют в составе молекулы свободную аминогруппу, тогда как вещества, не проявлявшие активность в гтой модели, ее не имеют. Это согласуется с литературными данными об уменьшении количества аминогрупп карнозина при взаимодействии с

Таблица 2. В-отшие родственных карнозину соединений на величину максимального хемилаиинесцентНого ' сигнала, индуцированного протеканием шшдопероксидазной реакции. Представлены концентрации <х&1). обеспечивавшие 501 и 90г ингибирование МПО реакции.

Вещество Ингибирование 50% сигнала 30%

анзешн 0,05 0,5

карнознн 0,20 1,5

гомокарнозин 0,50 2,6

гнетщин + /з-зланин 0,50 3,2

гкетддш? 0,55 3,7

/>-аланин 5,00 на достигается

тзурин 0,10 2,6

гипохлоритом и указывает па ту часть часть молекулы, которая принимает непосредственное участие в реакции. Ацетилирозание г.арнозина приводит к потере функции нейтрализации гипохлорита, а его лштилирование - к усилению этой функции. Однако пр:шенекие хемилюминесцентпого метода регистрации реакции не дает возможности различить, подавляется ли она за счет связывания продукта реакции, или может иметь место ингибирование катализирующего ее протекание фермента. Падение скорости роста сигнала в присутствии дипептидов может быть вызвано как удалением 0С1~, так и снижением активности фермента. Чтобы оценить вторую возможность, мы воспользовались другим методом регистрации активности МПО.

Спектрофотоаетрическая регистрация активности миелопероксидазн в присутствии о-дианизидина.

Метод основан на том, что МПО Ее специфична в отношении одного из субстратов и может окислять в присутствии Н202 органические вещества, например, о-дианизидин, окисленный продукт которого имеет максимум поглощения в области 460 км. Это позволяет следить за протеканием реакции спектрофотометрически. кроме того, в этих условиях на образуется 0С1~, вследствие чего можно оценить влияние удаляющее его веществ на активность самого фермента. Результаты

проведенной нами оценки (типичный эксперимент)' представлены в' Таблице 3. ' • .

Полученные результаты свидетельствуют о том, что почти все ' ислэдсзакые соединения, за исключением акзеринэ и ааетилкарнозина, даже в концентрации 10 мМ довольно слабо подавляют активность МПО. Интересно, что ацетилкарнозин, не обладающий способностью связывать

Таблица 3. Влияние карнозина и родственных ему соединений на активность шелопероксидазы.

Вещество, 10 мМ Активность, г от контроля

РГРЕБ 100

гистидин + ^-аланин 81

гомокарнозин 77

гистидин 75

карнозин . 66

ацетилкарнозин 50

анзерин 0

продукт реакции, довольно значительно снижает скорость ее протекания. Единственным соединением, значительно ингибируюцим активность фермента в низких концентрациях, оказался анзерин. Но, как видно из Рис.3, анзерин в концентрации, полностью предотвращающей появление хемилюминесцентного сигнала, снижает активность фермента лишь наполовину. Таким образом, эффект, оказываемый -анзерином на протекание киелопераксидазной реакции, состоит кзк а удалении ее продукта, так и в ингибировании самого фермента. В случае же карнозина, гомокарнозина и гистидина■ (самого по себе или в смеси с р-аланином) подавление реакции. происходит главным образом за счет нейтрализации ее продукта. Ацетилкарнозин такой способностью не обладает, хотя и снижает скорость образования 0С1~. Резюмируя полученные результаты, можно сказать, что замена в молекуле карнозина остатка р-аланина на- остаток т-аминомасляной кислоты ослабляет функцию нейтрализации гипохлорята, ацетилирование приводит к потере этой функции, а метилирование значительно ее усиливает, ¿фидавая дипептиду дополнительные свойства.

г

АКТ. х/д

С,мМ С,мМ

Рис.3. Концентрационная зависимость влияния анзерина (а) и ацетилкарнозина (Б) на миелопероксидазнув активность.

В. Влияние анзерина на кинетические характеристики ниелоперокскдазной реакции.

Сигмоидальная форма кривой зависимости скорости миелопероксидазной реакции от концентрации ингибитора иохет указывать на аллостерическув природу ингибирования. Для более подробного изучения ингибируюшего действия анзерина мы исследовали зависимость скорости реакции от концентрации Н202 в контроле и в присутствии I мМ анзерина, снихащего максимальную скорость реакции приблизительно наполовину. Кинетическое поведение реакции, катализируемой ЫПО, не подчиняется закону Михаэлиса-Ментен из-за субстратного игиСировакия в области высоких концентраций перекиси водорода (Стефанов, Шафран, 1976). Полученная наш кривая концентрационной зависимости показывает близкое к гиперболическому возрастание скорости реакции до 20 мкМ Н202, ее последующий выход на плато и снижение скорости при концентрациях Н202 выше 100 мкМ (Рис. 4А, I).

Линеаризация этой зависимости в двойных обратных координатах показывает, что по начальным точкам кривой, соответствующим низким

концентрации субстрата: А - з прямых и Б - в двойных обратных координатах, I - контроль, 2 - I мМ анзерин.

концентрациям субстрата, формально мояно провести прямую • (Рис/ 4Б, I). В присутствии анзерина наблюдается сохранение субстратного ингибироБания, указывающее на отсутствие его взаимодействия с перекисью водорода. Проявляется также значительное снижение сродства Фермента к субстрату и выраженная сигмоидалъность кривой. Линеаризация начальных точек такой субстратной зависимости в двойных обратных координатах представляет собоЛ вогнутую кривую, указывающую на наличие положительной кооперативное™ по субстрату.. Расчет коэффициентов Хилла для обоих кривых разностным методом (Силонсва и соавт. 1969) показал, что в обоих случаях они блпз::и к ?,, т.е. скрытая сигаоидальность имеет место и в первой кривой, но в присутствии ингибитора она делается боле.е заметной. Приведенные экспериментальные данные не позволяют оценить изменение Км для Н2С2 в присутствии анзеринз, но качественный анализ картины указывает на снижение скорости реакции в широком диапазоне концентраций субстрата и падение сродства фермента к перекиси водорода. Представленные данные не дают возможности сделать вывода о механизме ингибирования, хотя и указывают на возможность аллостерического икгибирования фермента. Это подтверждается данньми о том, что молекула 1Ш0 из разных источников представлена ансамблем из двух неравноценных суб*единиц, способных взаимодействовать между собой

(КоЬгег е! а!., 1966, КОКрЯКОВ II СОЭВТ. ,1982).

ш. Влияние гистидинсодержаших дипептвдов на генерацию активных форм кислорода стимулированными лейкоцитами.

Стимуляция иммунокомпетентных клеток сопровождается явлением, поллучившм название "дыхательного взрыва" - интенсивной генерацией активных форм кислорода в наружную среду, или полость клеточных везикул. Атака чужеродных микроорганизмов или частиц сильными оксидантами способствует разрушению их клеточных стенок, мембран и белков, облегчает их переваривание. Лейкоциты имеют 2 системы генерации активных форм кислорода: НАДФН-оксидазный комплекс наружной набраны, генерирующий образование 02 и миелопероксидаза, находящаяся внутри азурофильных гранул, катализирующая образование .ОСГ. При стимуляции клеток запускается сложный каскад реакций, приводящих к активации обеих систем. В зависимости от характера применяемых стимулов и вида атакуемой, клеточной фракции in vivo

;.:ожёт преимущественно образовываться одна из активных форм кислорода или обе вместе. Для изучения взаимодействия дипептидов с супероксид-аююном нами была выбрана модель активации общей лейхомассы кролика частицами сульфата бария.

Характер взаимодействия карнозина с супероксид-анионом является предметом дискуссий. В трех независимых лабораториях (Гуляева, 1987, Kohen st al, 1983, Yoshikawa et al, 1991) бЫЛО Показано, ЧТО карнозин'не влияет на генерации 02, а в комплексе с цинком и медью проявляет супероксвд-перехватываагаую активность. Б модели образования 02 в ходе тгыпульсного радиолиза воды (Павлов и соавт., 1990) в присутствии карнозина продемонстрировано образование комплекса с переносом заряда, время жизни сугероксид-ЕНиона при этом увеличивалось. В то зе время получены данные, сведетельствупцие об активации карнозином люцигэиш-зависимой хешшшипесцеяции нейтрофилов человека, стимулированных опсснизированным зимезаном (Болдырев и соавт., 1992). Совокупность известных в литературе данных по этому вопросу ке дает возможности их однозначной интерпретации. Выяснение способности карнозина и родственных ему дипептидов взаимодействовать с сулероксид-апяонон явилось задачей этого раздела работы.

"Дыхательный взрыв" стимулированных клеток можно регистрировать с помощью двух люминесцентных зондов - люминола и люцпгэнина, обладающих разной специфичностью к активным формам кислорода. Люцигенин обладает способностью взаимодействовать только с 02, а лшшшол одинаково хорошо реагирует со всеми активными формами кислорода, образующимися в системе. Сочетание двух люминесцентных зондов дает возможность ответить на вопрос, какая из активных форм кислорода может связываться Исследуемыми соединениями.

При добавлении к клеткам нерастворимых частиц Baso4 исходный уровень хемилюмцнесценции резко возрастает в присутствии обоих люминесцентных зондов и после достижения максимального значения начинает снижаться. На этот процесс имидазол и pipes практически не влияют (Рис. 5). В присутствии карнозина наблюдается некоторое возрастание люминесценции люминола и более чем двухкратная активация люцигепин-зависимого сигнала. То, что в_ присутствии люцигенина действительно регистрируется образование 02, подтверждается полным подавлением хемилюминесценши в присутствии супврохсиддисмутазы (СОД). При совместном добавлении карнозина и СОД люминесценция

устраняется не полностью, что свидетельствует о возможной конкуренции между ними за супероксид-анион, поскольку количество 0^. доступного для люцигенина, в присутствии карнозина увеличивается.

Рис.5. Влияние карнозина на хемилюминесценцию активированных лейкоцитов в присутствии люиигенина (А) и люминола (Б): I -контроль, 2 - 10 мМ имидазол, 3-10 кМ карнозин, 4 - СОД, 5 - СОД + карнозин.

Тот же эффект может иметь место и без добавления СОД, т.к. суперохслддисмутазная система всегда присутствует в клетках. .В присутствии карнозина может, по-видимому, замедляться и спонтанный распад 0^.

Люминесцентный сигнал, регистрируемый в присутствии люминолг, отражает е наших условиях генерацию дсух основных соединений -супероксид-аниона и 0С1~. То, что влияние каркозика на клеточный ответ в этом случае оказалось выраженным в значительно меньшей степени можно об•лепить генерацией клетками гипохлорит-анионз, который может эффективно связываться карнозином.

В подтверждение этого ш не наблюдаем в присутствии СОД полного исчезновения сигнала, а видим снижение его амплитуды примерно на две трети. Таким образом, суммарное воздействие карнозина на 2 генерирующие активные формы кислорода системы является результатом усиления одной из них и подавления другой.

Сравнение влияния гистидаксодержзщих дипептидов на люцигенин- и люминол-завчеимую люминесценцию лейкоцитов представлено в Табл. 4.

Видно, что все исследованные наш дипептиды активируют сигнал, регистрируемый в присутствии лзоцигенина: карнозиз и анзерин - более эффективно, гомокарнозин и ацетиланзерин - менее, наиболее слабо эта способность выражена у офидкна и ацетилкарнозина. Различие активирующей способности дипептидов, вероятно, _ можно об-яснить различной эффективностью их взаимодействия с 0^ - генерирующей системой. Влияние дипептидов на суммарный люминесцентный сигнал, регистрируемый в присутствии люминола, было также различным. Почти все исследованные соединения, за исключением анзерина,- также проявляют способность активировать клеточный ответ, хотя и в значительно меньшей степени. Единственным соединением, достоверно снижавшим его величину, оказался анзерин. .Мы объясняем это тем, что он является наиболее эффективным агентом." подавляющим протекание миелоперокевдазной реакции.

Таким образом, можно сказать, что влияние гистидинсодержащих дипептидов на генерацию активных форм кислорода иммунокомпетентными клетками слагается из двух составляющих: подавления миелопероксидазной реакции, особенно эффективного в случае анзерина, и активации супероксид-анион генерирующей системы. Первый эффект важен для скелетных мышц, т. к. после интенсивной мышечной нагрузки происходит инфильтрация в мышечную ткань большого количества

Таблица 4. Влияние карнозина и "родственных ему соединений на интенсивность хеми люминесценции активированных лейкоцитов кролика.

Вещество, Величина сигнала Ср. квадр. откл. ( n-i) 10 мМ в % от контроля с коэф. Стьюдента х

(X) ( П-1)

А - в присутствии люцигенина

анзерин 240 + 18,9 8,2

карнозин 231 + 27,7 11,5

гомокарнозин 195 + 17,2 • 8,6

ацетиланзерин 184 + 12,0 6,5

офидин 137 + 25,5 18,7

ацетилкарнозин 134 + 48,1 35,9

имидазол 98 + 11,2 14,4

Б - в присутствии люминола

ацетиланзерин 170 + 50,9 29,9

гомокарнозин 143 + 48,9 34,2

карнозин 130 + 5,5 4,2

офидин 129 + 31,9 24,7

ацетилкарнозин 127 + 34,0 36,9

имидазол 79 + 17,0 21,5

анзерин 60 ± 25,7 43,0

нейтрофилов, секретирунцих в нее МПО. Мышца подвергается атаке сильного окислителя 0С1~, а в присутствии дипептидов этот эффект в значительной степени нейтрализуется. Активирующее воздействие карнозина и родственных ему дипептидов на генерацию 0¿ может оказывать благоприятное воздействие на функции моноцитов и тканевых макрофагов, не имеющих миелопероксидазы. Двойственный эффект карнозина на функционирование иммунокомпетентных клеток может быть одним из возможных объяснений иммуномодулирующего действия карнозина, обнаруженного В опытах in vivo (Nagai et ai., 1988, Курелла и соавт., 1991).

выводы.

1. Проведено сравнение способности ряда гистидинсодержащих дипептидов связывать активный гидроксил, образуемый в ходе реакции Фентона. Показано, что наиболее эффективным тушителем ОН* является каркозин, способность остальных исследованных соединений снижается в ряду: карнозин > ацетилкарнозин > анзерин > гомокарнозин.

2. Сочетанием двух методов измерения миелопероксидазной активности оценена способность гистидинсодержащих дипептидов взаимодействовать с ферментом и продуктом катализируемой им реакции. Показано, что все исследованные дипептнды, за исключением ацетилкарнозина, эффективно нейтрализуют пшохлорит-анион.

3. Показано, что эффективность подавления миелопероксидазной реакции родственными карнозину соединениями уменьшается в раду: анзерин > карнозин > гомокарнозин > гистидин.

4. Установлено, что из всех перечисленных соединений способностью ингибировать МПО в наибольшей степени обладает анзерин, эффект остальных соединений менее выражен и снижается, в ряду: анзерин » ацетилкарнозин > карнозин > гомокарнозин. В присутствии анзерина наблюдается снижение сродства фермента к одному из субстратов реакции - перекиси водорода.

5. Сопоставление влияния гистидинсодержащих дипептидов на интенсивность "дыхательного взрыва" иммунокомпетентных клеток в присутствии разных хемилюминесцентных зондов - люминола и люцигенина - указывает на двойственность оказываемого ими эффекта: активацию супероксид-генерируицей системы и подавление реакции образования гипохлорит-аниона.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Курелла Е.Г., Тюлина О.В., Болдырев A.A. Является ли карнозин антиоксидантом прямого действия. Тезисы iv Всесоюзной конференции "Биоантиоксиданты". Москва, (апрель 1ЭЭ2 г.), т. I, стр. 9Э-Ю0.

2. A.A. Болдырев, Е.Г. Курелла, A.M. Рубцов, О.В. Тюлина, М. Шара, М.Шентюрц. Прямое измерение взаимодействия карнозина и его аналогов со свободными радикалами. Биохимия, 1992, т. 57, no 9, стр. 13Б0-1365.

3. Болдырев A.A., Дудина Е.И., Дупин A.M., Часовникова Л.В., Форматах В.Е., Сергиенко В.И., Мальцева В.В., Стволинский С.Л., Тюлина О.В., Курелла Е.Г. Сравнение антиокислителх.ной активности карнозина с использованием химических и биологических моделей. Бюлл. эксп. биол. мед. 1993, т. 115, но 6, стр. 607-609.

4. О.В. Тюлина, В.Е. Каган, A.A. Болдырев. Модул^уюшии эффект карнозина и родственных соединений ка дыхательный взраз лейкоцитов, активированных сульфатом бария. Бюлл. эксп. биол. мед. 1994 (в печати).