Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование антиоксидантных свойств карнозина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование антиоксидантных свойств карнозина"

П г Я А л ( л и \J!i

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМ. М.В. ЛОМОНОСОВА

Биологический факультет

На правах руюшои КУРЕЯЛА ЕКАТЕРИНА ГРЕГОРОВНА

ИССВДОВАШЕ ЛНГИОКСИДШНЫХ СВ0ЙС1В КАШОЗМНА 03.00.04 - Сиопшия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биолопгчесхих наук

Москва - 1994

Работа выполнена на: кафодре биохимии Биологического факультета МГУ ш. М.В.Ломоносова. ,

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Официапькке оппоненты:

профессор Болдырев А.А. доктор бл'ологичоских науз:

Ерш А.Н.

кандидат биологических наук

Добрынина О.В.

Ведущая организация - НИИ физико-хииической медицины РАШ.

заседании Специализированного Совета Д.053.05.32 при Ыосковском Государственном Университете им. Ы. В. Ломоносова по адресу: г. Москва 119899. Ленинские горы. Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан_■_ 1994г.

/Учений секретарь Специализированного совета

Защита сосотоится

в

доктор биолопкеских наук, профессор

Б.Гусев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биологические функции карнозша З-аланил-гистидина), открытого в начале века (Gulevitsch. and niraägibi, 1900) и присутствующего в скелетной мускулатуре и ззге позвоночных животных дс сих пор окончательно не выяснена. 2иную роль он играет в мщпвчном сокращении (Severin, 19б4), в зязываняи ионов переменной валентности, в последнее время хтизно исследуются антиоксидантние свойства карнозша (Болдырев, Э8б). При исследовании карзознна мало использовались модельные астеш, позволяйте более или менее однозначно судить о эганизне проявления антиоксидантных свойств карнозша. акопленные к настоящему времени вкепериментальные данные авдетельствуют о наличии шокества разнообразных свойств у арнозгна, при етом больжклзтво использованных моделей не дает озмозаости разделения этих свойств и иг подробного анализа.

Целью настоящей работы явилось исследование нтискскдантннх свойств карнозша в различных моделях оследовзнняг in vivo, 1л vitro и в хяшческих модельных астемах, а такзге в проверке возможностей действия карнозшга как рямого антиоксиданта. Для сравнительного анализа антиоксидантных войств этого соединения в химических системах использовали аряду с карнезином некоторке известные его аналоги.

Научная новизна. В работе продемонстрировано активирующее лаяние карнозша на кололиэойразущую активность гемоноэтических ¡тволошх клеток при оолучешш животных. Обнаружено полное ¡одазлбние карнозином лшинол-зависимой люминесценции ^минированных нейтрофпов донорской человека. Измерены константы ■ушения лшинескенции ашглетного кислорода карнозином и его залогами. Исследовано взаимодействие карнозила с гидрокеилы^м тдихалоч. Показана спососзносгь карнозина к взаимодействии о НО "и ;адикальной формой использованного спинового аддукта НО". [роЕнализированы разлггаи, проявляемые карзозинон, полученным [репарптиванм и синтетическим путем в химических п биологических [сделях. Дредлогсн возможный мехбнизм антиоксидантпого действия мрнозина.

Практическое аначендз роботы. Полученные в работе жепериментальнне данные расширяют цредставлениз о молекулярных

механизмах аятиоксидангного действия карнозина. Полученные результаты показывают необходимость тщзтельвого сравнительногс анзлиза свойств соединений при использовании веществ сштетической природа в условиях ln vivo. Материалы дщссертаци® используются в курсе лекций "Биохимия мембран", читаемых не кафедре биохимии Биологического факультета МГУ.

Апробация работы. Отдельные части работы•докладывались не всесоюзной конференции "Биология регуляторных пептидов" (Горький, декабрь 1990т), "Биоантиоксиданты" (Москва, апрель lS92r).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы. Экспериментальной части, Обеузденшз полученных результатов, Заключения и Выводов. Диссертация изложена на/2£етр. машинописного текста. Материал иллюстрирован // таблицами и /0 рисунками. Список цитированной литература включает ÍSJT наименования.

СОДЕРКАШЕ РАБОТЫ ЭКСПЕРИЫЕЗПАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Перекристаллизацию карнозина проводили стандартным методом. Чистоту полученного карнозина определяли по диазореакции и оптическим методом (Практикум по биохимии, 1989).

Определение НБД-производных карнозина проводили с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках "Силуфол" (Ткачук и Малиновская, 1977).

Выделение везикул саркоплазматаческого ретикулума из скелетных мшшц кролика проводили методом дифференциального центрифугирования (йгаов и др., 1977).

Концентрацию бедка в препаратах CP определяли по метода Спекторз (Speotor, 197S), исяользуя в качестве стандарта бычий сывороточный альбумин.

Перекисное окисление лидидов фрагментов легкого CP проводили в Ре -аскорбат-зависимой модели (Дупин. 1986).

Количество вндогенных колоний стволовых клеток в селевенке мышей определяли на 8-й день после облучения (Nagai and Suda, 1986>. В экспериментах использовали взрослых мышей массой 24-26 г. линии (CBAXC57BL)P1. Животных облучали лучами ®°Со дозой 5.0 -

5 Гр. Селезенки фиксировали реактивом Бувна.

Измерение хемилкмияесценции суспензии нейтрофилов. Суспензию йтрофялов получали из донорской кроаи методом, описанным в тературе (Markert М. et al, 1984). . Еейтрофилы активировали ссгагзяровзннш вимозаноы.

Канатику затухания фогосенскбилизирозанной дадшесданшд; нглетного кислорода ириеряли в водных растворах при иетулъснсм зерном возбуждении (Krssnovsky et al., 1938). Измерения сводили в насыщенном воздухом 30 цМ фосфатном" буфере (рВ=7), гсготовленном на Ь^О. _ В качестве фотосенсибилизатора пользовали раствора карбоксизнтрацена.

Измерение взаимодействия карнозина с НО" радикалами сводили ие-годоч ЭПР-спектроскппш!. Ойразование свободных дикслоп яндупировэли взаимодействием перекиси водорода с УФ или 30д. В качестве ловупки свободных радикалов использовали tefobkC зонд 5.5 - диметил - 1 - шрролин -Ií-оксид (ДШО) (Rosen id Rauckman , 1934). Опыты проводили при 20°С в буферное среде, ."еркзяей 1,55! перекиси водорода и 50 мМ дао. В качестве буфера пользовали PIPES (рН = 7.0). УФ - облучение проводили в :арцэвой кювете, используя УФ лямпу мощностью 10 Вт с максимумом :ектра испускания 253 нм. ЭПР-сигнзл ДШО-КО' аддукта тастрировали на ЗПР спектрометре Varían В-4 (США).

Рэсчет ми^тиуизованшдс структур карнозина проведали, Его.чьзуя компьютерную прогргыму молекулярной гкнамики DeskTop .leeular Modelling Program (Oxford Electronics РиЪ1., ПК). В г-:гегв8 параметра минимизации использовали езободнуи энергию июкулч.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

I. Стимулирующее действие карз-гезина на гемопоэтитеехяге ' стволовые клетки.

Ранее Сило показано, что кареозин спосооек обеслетавать лигу организма от дсСстеия радиации (Shimanaka, 19S9). При этом зкчпиа радиопротекторного действия карнозина не была связана с [догеннкмн аминами ееротошком и гастагчшои (Северин к со&зт, >90).

Возможной основой аффекта карнозина является его

антиоксидантнсе действие, проявлявшееся в способности взаимодействовать с активными формами кислорода (Болдырев, 1986; Boldyrev et al, 1988; Köllen et al., 1988), а также в пологительнса воздействии карнозина на иымунокошетентные клетки (Nagal and Suda, 1983).

С целью изучения механизма действия карнозина в условиях í-облучения, ш исследовали его влияние на выживаемость животных и образование колоний в селезенке гемапсэтичеЬгаши стволовыми клетками при разных иемах взедевия карнозина. После однократного рентгеновского облучения беопородгах мышей дезой 5,0 - 5,5 Гр средняя продолжительность акязни животных составляла 12 - 17 суток, а выживаемость к 30-му дню бала 1155 при ДОзг 5,5 Гр и ЗОЙ При дозе 5.0 Гр (Табл. 1). Введение карногакз с питьевой водой из расчета 50 иля 100 иг на кг веса животных увеличивало оба показателя, щзлеи большая доза оказывалась менее эффективной. Подобный эф$зкт отмечался п при исследовании антиканцерогенного действия карнозина (Nagai and Suds, 1936; 1988). Таблица 1. Слияние карнозина на выживаемость животных щи рентгеновском облучении.

Группа животных Доза облучения Го Доза каргозииа мг/'кг веса количество серяй СШ сутки Выживаем

Облучение 5.0 5.5 - 1 4 17 12 ± 2 30 11 ±

Карнозин 1 сут до облучения 5.0 5.0 5.5 50 100 50 1 «» 4 27 25 20 ± 3 ¿I 8< 42 :

Карнозин

2 сут до облучения 5.5 50 2 15 - 1 26 ;

Карнозин через 1 сут 5.0 5,0 50 100 1 1 30 26 '

после облуч. 5.5 50 4 16 ± 4 25

Карнозин

через 2 сут 5.5 50 2 18 ± 4 58

после облуч.

Сравнение Бффэктов карзоэша в зависимости от сроков его взедения показало, что наилучшее действие набладается при сокращении интервала времени, разделящего облучение и введение карнозива. Так, введение карнозика через 1 сутки было аффективнее, чем введение через 2 суток после облучения, при использовании препарата за 2 суток до облучзгая эффект почти не выявлялся. <)

Во второй части экспериментов использовали илзей линии (CBAXC57BDF.,. Карнозин во всех вариантах введения его животным (за 30 мин до облучения, через 1 час и 1 сутки после облучения) оказывал стимуллруюцее влияние на образование вндоколоний. Наиболее вффектявно препарат действовал на стволовые клетки при введении его за 30 мин перед облучением, количество колоний в селезенке подопытных мышей при атом возрастало в 2,6 раза по сравнении о сблучетшиш; мышами, не получавшими карнозин. Однако существенней вффак? сохранялся и при введении npenspsia чараз 1 чао или 1 сутки после облучения (индекс активации колониэобразования ссстеилпл 1,7 и 1,5 соответственно).

Наилучший эЗФокт карнозина, наблюдасдайзя при его впедении непосредственно пэред облучениеи (за 30 мин) можно объяснить пр(ааы действием карнозина, как тупите ля свободных радикалов, образу:: гдихся при сблучеш^. В то же время, погтрадиционкое протекторное воздействие долдпо объясняться еЭД.зктоы карнозина или продуктов его распада на иммунную систему.

Таким образом, в условиях облучения карнозин, по-екдимсму, ке только взаимодействует с зктлвнкшс формами кислорода, образующейся в процессе облучения, но к проявляет кллуномодуляторпыэ свойства.

II. Влияаиз карнозина на хемилхаынесценпим суспензии гейтсофклов крови человека.

Нестройны щинзиавт активное у .четие в развита» повреждений мы^еч^ой ткань пегчта интенсивной мышечной нагрузки (Морозов :г соавт., 1990), а такка в процессах, сопрозоадаитсся нарушением целостности кчеток (Паркер, 1989). В результате продукции расличяых радикалов, свойственных этим клеткам, резко активируется процесс перотсисного окисления литров, прззодящгй к

порахению здоровых участков ткани. Повреждения тканей, возникающие в процессах лучевого поражения, а также сопровождающие интенсивную мышечную работу, приводят к накоплению нейтрофилов в участках поврекдения. Эти клетки секреткруют белки, в основном миелопероксидазу, продуцирующую Е0С1. Мы предположили, что радисиротекгорное действие караозина мохет быть обусловлено его влияниеи на активацию нейтрофилов.

В окапершектах было показано, что введение карнсзина (5 и 10 иМ) е среду инкубации полностью предотвращает хемилшинесценшю суспензии нейтрофилов, активированных зимозаном, вызванную взаимодействием лшинола с активными радикалами, выделяющимися в результате активации клеток (Рис. 1). Введенение в среду инкубации 0-аланина и гастидина н(е оказывает подобного еффекга на процесс активации нейтрофилов. 4

Рис. 1. Интенсивность люминесценции суспензии

нейтрофилов при активации зимозаном в контроле - 1, в присутствии 10 ММ гистидина п 10 мМ 0-аланина - 2, в присутствии 10 мМ карнсзина.

Такой аффект может быть связан со способностью карнозина реагировать с различного рода радикалами, включая радикальные производные лшинола, в таком случае он действует как прямой антаокаидант. Однако не исключена возможность действия на

ерментше системы, обеспечивающие образование и выброс активных оры кислорода из клеток нейтрофшгаз.

. Оказыьае:шй карнозкном ингибируюций вффект дает ключ к" онимания того факта, что в условиях in vivo в крови лекопитавдих присутствует активная карнозиназа. Поскольку в лучае появления карнозина в кровеносной русле происходило бы астичное или полное блокирование защитной функции организма, существляемой белыми клетками крови за счет продукции активных ори кислорода.

Использованные паш модели исследования механизма действия :арвсзкна как in vivo (действие на колониеобразуицув активность тволовнх клеток) так и в условиях in vitro (действие на ктивпость нейтрофилов) не даю? возмоззосет сделать однозначный квод - является ли карнозин прямшл антиоксидантом, и обеспечивается ли его основная роль этой функцией. Веред нами ¡стала задача найти тыле модели исследования, в результате :спользования которых mosko было би однозначно судить о :еханизмах действия ::гркозина. Наиболее предпочтительными в :знпоы случае являютсл химические модели генерации активных ферм лслорода.

III. Тушенке .чхжанеецешди: сянглетного кислорода в водных растворах карнозина и его производных

Были йзмереш: спектры люминесценции 1Og в водной среде :зрнозвном и ано-эрк^ом, а такие другая: шатдазол-еодеркаитага уединениями прямьп/ даинесцеятнЕМ методом детектирования ¡кнгл^тного кислорода (рис. Í). Время ки^ни лвнппесценцзи яшглетпого ккслород» (z,) в растворах карбоксиантрацена в В20 ¡оответствовало " 55 . Прк добавлении исследуемых соединений к застьору фотопенсибкгнззтора наблюдали сокращение величины №. Зкепсркмента показала, что зависимосгь ДТ—от концентрации г-уштеля (С_) хорошо аппроксимируется прямой. Это позволяет

Ч. -1

фиыенить для описаш* процесса гуления уравнения

Итерна-Фольмера. В резухьтаье проведенных расчетов бист получены жаченкя констант тушения лшикесцевдаи синглетного кислорода ;к ) з присутствии кгрнозжхз и его аналогов. Кайдеыкиэ значения

для исследуемых соединений приведены в . таблице 2. Эти данные демонстрируй отсутствие различий в значениях констант тушения для всех перечислении! соединений, и указывают, что действующей структурой в этом процессе является имидазольноз кольцо.

Рис. 2. Кинетики затухания (1, 2) и спектр люминесценции (3) сияглетного кислорода в 1>20. 1 - в фосфатном - буфере без туштелей , 2 - в присутствии 5x10"^ М караозина. Сенсибилизатор - карбоксиантрацен.

Таблица 2. Константы тушения люминесценции 102 карнозином и его аналогам.

Соединение К.х Ю-' (М-1 с-1)

Гесгидон 4 1

Карнозиа 3 ■ь 1

Анзерин 3 + 1

Имвдазол 2 + 1

Это согласуется с предположением, что способность имидазол-содеряавдх биологически активных соединений тушить 102 определяется главным образе»! свойапвеих входящего в их состав

щщгазола (Straight and Spikes, 1935).

IV. Исследование взаимодействия карнозина с гидроксильннм радикалом методом ЭПР-епектроскашш.

Гидроксильный радикал является одной из самых рвакционноспособшх активных форм кислорода. Его образование в кишечной ткани связано с участием ионов хселеза. Источником НО* глукат 0j~ и H^Og. Возможность исследования прямого в? апмэдействия карнозина и родственных ему соединений с гидроксильнш радккалоы представляла существенный интерес для выяснения антиоксидантной активности о тих агентов. Для этой' цели применяют обычно метод спиновой ловушки, в нашг исследованиях мы использовали для втой цели ДМПО.

Дри ультрафиолетовом облучении контрольной пробы наблвдалось быстрое возрастание интенсивности сигнала ДШЮ-НО*. В присутствии карнозина (50 кМ) радикальный вддукг образовывался значительно медленнее, при этом резко умепьпалось его количество. Снижение с короста образования спинового аддукта в присутствии карнозина ыолет происходить по двy?i причинам: в результате взаимодействия кэресзина с НО" или в результате взаимодействия дапептида с редякзльной форкой сзтаовой лов утки при образовании аддукта. Вероятно, ииеит место оба процесса. lit последовали концентрационную зависимость кинетики распада ДМПО-EG* адцукта, образование которого кпздшровалк »добавлением ' PeSO^ в инкубационную среду, содержащую tt-jOg. На рис. 3. показана кинетика распада ДШЮ-НО* адцукта, образование iwi-cporo ЛЕИЦзпруется з нулевой момент времени добсЕлэЕнем двухвалентных нонов келеза. На ргоузке видно, что по мере увеличения концентрации карнозина ст 1 до 20 v'i {{ксиолопгческие концентрации) штенслшость сигнала спинового аддукта пропорционально снгпхается. Аяалоглчглй эффект был продешпстрирсзсн npt сЗлучеаик Н^О^ ультрафгслзтол. При анализе лшеаривованша кршзах было обнгрунено.. что увеличение концентрации карьозтаа приводит к изменению наклона кривых и, следовательно, увзличонаэ значения консташн скорости распаде ДКЯО-КО* аддукта (табл. 3).

Этот эфект i,:csao объяснить спосейюэтьз кагкззида взашодоЯстзозать' с радикальной фошой сппнсеоЬ лоьугаи. 'х'акое пр^длсаенге кажется' вероятным, если учитывать способность

Таблица 3- Действие карисзяна на скорость распада ДНПО-НО' аддукта, полученного в реакции Фзнтона.

Концентрация I/IQ ( $ ) К ( мин"1 ) карнозина ( мЫ )

"О-ТШ-57(57?-

1 74 0,031

2 57 . 0,031 5 39 0,033 20 11 0,049

Рис. 3. Изменение вс времени интенсивности сигнала ДОНО-ОН аддукта, полученного в реакции Фентона в присутствии 20 мМ PIPES (1) к различных концентраций карнозинэ: 1 мЫ - (2), 2 Ш - (3), 5 мМ - (4), 20 мМ - (5)

карнозина тормозить протекавшую по радикальному механизму реакции восстановления 2.4-дакетошриыиданов гидрофосформгмат соединениями (Хомутов, 1992).

Далее наш быка проведена сравнительная характеристика способности ряда природных производных карнозина препятствовать генерации НО'-радикалов в используемой системе. Оказалось, что в присутствии 20 Ш гистидина, гомокарнозииа и анзерина наблюдалось уменьшение количества спинового аддукта даП0-Н0*(рис 4), однако ай&ект. этих соединений был слабее, чем в присутствии 20 м!4 карнозина. В то же время в присутствии высоких концентраций гвстидкна (20 мЫ) не наблюдалось увеличения скорости рапада

ДШО-НО" адцукта (риз. 4), форма кривой полностью соответствовала контролю. Лля анзерина я гошкарнозкна, наоборот, наблюдалась стабилизация тики.

100

60

80

40

20

г ■з

,1

Рис. 4. Изменение во времени интенсивности сигнала ДШО-НО аддукга, полученного в реакции Фентона в присутствии 20 мМ РЕЙВ (1) и 20 мй карнозина и его аналогов: гистидин + 0-алангщ (2), карнозин (3), анзерин

0 2 + в 8 10 12 (4), гомокарнозин (5).

Ьр*мя (ыи>у

Карюзви, в отличие от остальных использованных нами соединений, способен взаимодействовать с радикальными промежуточными соединениями таким образом, что время жизни радикальных форм резко уменьшается. Таким образом, из приведенных данных видно, что карнозин, в отличие от других гистидин-оодерсшц^х дапептидов, способен проявлять антиоксидангине свойства не только на этапе генерации активных форм кислорода, но и при взаимодействии с другими свободнорадикальными продуктами. В то Ее время другие гистидан-содержадие дипептида проявляют разную активность по отношении к процессу генерации НО".

Антиоксидантная активность карнозина была продемонстрирована в различных лабораториях о помощью разнообразных методических

V. Сравнение антиокислительной активности препаративного к синтетического карнозина.

подходов, в которых многие исследователи использовали синтетический препарат фирм Signa или Serva. В конце 80-х годов при участии нашей лаборатории был разработан промышленный метод получения препаративного карнозина из говяжьего фарша ( Лыскова и др., 1990). При сравнении свойств полученного препаративного карнозина с извэстнти синтетическими препаратами в коммерческих препаратах было обнаружено наличие оптически активных примесей. Кроме того, оказалось, что некоторые описанные к тому времени характерные свойстве синтетического карнозина не выявляются при использовании препаративного карнозина.

Все использование препараты карнозина характеризовались наличием оптически активных примесей (рис. 5). В спектрах поглощения препаратов фирм Бепга были обнаружены

дополнительные области поглощения при 260-320 ш, отсутствующие в препаративном карнозине. Содержание оптически активных примесей не превышало 0,556- 1%. При перекристаллизации синтетического карнозина поглощение в области 260 -320 ш практически полностью исчезало. Появление аналогичной области поглощения наблюдалось при кипячении водно-езшргового раствора карнозина в присутствии кислорода, но не в присутствии азота, к в меньшей степени при хранении на свету вогных растворов препаративного карнозина.

1. Оптическая характеристика црепарзтоз.

А (oom. eä)

ñic.5. Спектр поглощения 1% во,иного раствора карнозина фирглы Signa (1).препаративного парно-этна (2).

о

210 235 310

2. Действие карнозина из разных источников в различных химических и биологических моделях.

В модели Fe -аскорбатного ПОЛ CP синтетический карнозин (20 мМ) на 50% подавлял накопление продуктов перекисного окисления липвдов (ПОЯ), кроме того была обнаружена его способность к взаимодействию с лредобразованными продуктами ПОЛ. Препаративный карнозин практически не оказывал влияния на ПОЛ в етой системе, при втом после перекристаллизации синтетического караозина его эффективность резко падала, в то время как маточный раствор приобретал способность значительно подавлять ПОЛ (рис. б А-Б). .

Таким образом, в коммерческом препарате фирм Signa, "Serva были обнаружены незначительные количества примеси, обладащей ^ выраженной антиоксидантной актианостьв.

В результате полученных данных встал вопрос о существовании антиоксидаятныг свойств у карнозина как такового.

Мы проанализировали действие дипептида в различных использованных наш модельных системах. Было установлено, что характер действия дипептида на активацию нейтрофилоз периферической крови человека и констаната тушения лшинесценцаи синглетного кислорода не зависит от источника карнозина. При -исследовании взаимодействия с НО- препаративный карнозин был даже несколько более активным, чем коммерческий.

Рис. 6-А. Накопление продуктов ПОЛ в Уе-аскорбатной модели ПОЛ CP в контроле - 5 Om!í PIPES (1), в присутствии 20мМ карнозина препаративного (2), 20 Ш перэкриеталлизованного Signa (3), 20míJ Signa (4), и раствора, получепнного после перекристаллизации карнозина Signa (5).

120rD535/D535rax (S)

100

40

80

00

20

С

Рис. 6-Б. Изменение количества ТЕК - реактивных продуктов после 30 мин инкубации окисленных мембран СР в

ствии карнозина препаративного (2), перекристаллизованного Sigma (3), Sigma (4), раствора, полученного при перекристаллизации карнозина Sigma (5).

контроле PIPES ( 1 ) и в присут-

Таким образом, не было найдено различий в активности карнозина из различных источников в химических системах, где непосредственно генерировались активные $срмы кислорода, что свидетельствует о наличии у карнозина прямых антиоксвдавтыых свойств. В то же время, в моделях Ре - а скорб а т-з авнсимого пере .'-ясного окисления СР реакция образования гидроперекисей существенно подавлялась лшаь 'соединенизи, присутствующим в синтетическом каркозино.

Подробности синтеза карнозика остаются коммерческой тайной фирма, однако были основания полагать, что активным пачалом синтетического карнозина является промежуточный продукт его синтеза.

Кз литературы известно, что иидезольная группа гистидана обладает тауте^еркым свойствами и биологическое действие веществ, оодсркащих имидазольпое кольцо моь,ет существенно зависеть от таутомерией форта (С1га11 &% а!., 1936) (рис. 7). Однако присутствием разных таутсиерных форд карнозина новозио^па объяснить изменеия в УФ-сп&жгре поглощений, Лналпздруя приведенные зышэ даншге мы предоолокис:, что появление у синтетического карнозина свойств, отличных от дапепткда цриродного проз схождения, тагэке как появление соединения с

аналогичными спектральными характеристиками пр.: взаимодействии карнозина с окисляющими агентами мокет быть связано с образованием специфического соединения, представляющего собой окисле-нвую форму карнозина.

Рис. 6. Минимизированные структура таутомеров карнозина: 1 - %-карно2ИН, 2 - *в—карнозин [ Desktop Molecular Modelling Progran! (1987) - ОхХотй Electronic Publ., UK ].

3- Циклический интермедиа!

Мы предаолоиш! существование циклической структуры, образующейся в результате окисления терминальной аминогруппы карнозина (Рис. 7). Возможность подобной реакции была проанализирована теоретически, при атом мы обращали внимание на расстояние между атомом взота аминогруппы и инидазольным кольцом. Оказалось, что ето расстояние сравнимо е длиной координационной связи - порядка 3-42, что свидетельствует о возможности замыкания кольца при окислении KHg группы (Бацанов, 1936).

Таким образом, 1) - анализ минимизированной структуры карнозина показывает гипотетическую возможность замыкания цикла; 2) - анализ химической структуры карнозина показывает, что в первую очередь в процессе окисления будет участвовать свободная HHg груша, цри в том в имвдазольном кольце наиболее вероятно окисление атома углерода, расположенного меяду двумя атомами азота. Кроме того, ранее в нашей лаборатории были

продемсстрированы (ВоМугеу et а1., автиоксвдантные свойства некоторых циклических дшгептддов.

Н

\

1989)

выраженные

гастидан-содерхадах И

к

н

ч>

v /н «у

// \ члл 1

ч^н \

v 0 г—н

г

I

ен

л/

8 >7^-

А - ^

Рис. 7. Минимизированные структуры карнозина в линейной (А) и циклической форме (В). [ йгвкТор Ыо1еси1аг ЫойеШг^ Рто^гат (1987) - ОхТэгй Е1ес^п1с РиЬ1., ИК).

Последовательное окисление циклической формы карнозина может приводигь к образованна соединения, чьи восстаноБитсльные свойства могу? быть Солее выражены, чем у собственно карнезинг

(Рис. 8). о

—о-

т/н

к-а

о

>о

т

ны—^

N

О.

ии/н

г\

ын

! !! д

НМ—^ Н-м/

" Рис. 0. Механизм окисления карнозина и образование циклической фосш карнозина.

Ыы полагаем, что кроме потенциального различия а соотношении таутомерных форм карнозина возможным объяснением особенностей действия синтетического карнозина мояет являеться наличке одного из соединений, представленных на рис. 8, в качестве примеси. Кроме того, данная схема позволяет одновременно объяснить механизм образована оптически активного соединения при действии на карнозип окисляюдих агентов.

71. ЕьТ.ОДЫ

1. Введение карнозина ыыаам в условиях однократного 7гоблучения увелпззазт среднюю продолжительность их жизни и Быяяваемости. При этом карнсзип стимулирует образование епдоколоний стволовых кгеток крови в селезенка.

2. Внесение карнозина в среду инкубации (5 я ТО ыМ) полностью предотвращает лшпнол-зависямую хешлшанееценцню суспензии нейтрофилов человека, активированных зтаозаном. Введененке в среду инкубация р-алзнина я гкстидана не оказывает подобного аффекта.

3. Определены константы тушения (Kq) люминесценции синглетного кислорода гаяздазолом, гистидкном, карнозином и анзеряЕом. Значения К, для производных иыидвзола идентичны

Ч + 7

константе тупения, определенной для гаидазола 3 - 1 х 10 'М с .

4. Показано, что в присутствии кариозина (1-20 мМ) :нтенсивность сигнала радикального спинового аддукта (ДМПО-НО') снизается, пропорционально концентрации карнозина. Константы скорости распада ДМПО-НО' аддукта составляют 0,017 мин"1 в контроле и 0,049 мин-1 в присутствии 20 Ш карнозина.

5- В коммерческих препаратах карнозина фирм "Sigma" и "Serra" обнаружено прпмеснов соединение, предполагаемое как производное карнозина, которое обладает дополнительной областью поглощения при 260-320 ем и способно активно взаимодействовать с продуктами перекисного окисления лшгадов.

6. На основании полученных результатов предложен возмокный механизм участия карнозина - в регуляции концентрации

свободнорадикальных продуктов при перекисном окислении липидов.

*

711. СПИСОК ПУБЛИКАЦИИ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМВГ ДИССЕРТАЦИИ. 1. Курелла Е.Г., Мальцева В.В., Сгболинский С.Л. - Карнозин как иымуномодулятор. Тезисы Всесоюзной конференции "Биология

регуляторзых пептидов." Горький. ( декабрь 1990 ), стр. 87.

2. Курелла Е.Г., Мальцева В.В., Се славина Л. С., Стволлиский С.Л. - Стицулирувдее действие караозкна на гемопеэтические стволовые клетки. Бшл. екш. биол. мед., 1991. I. 112, Ко 7, стр.52-53-

3. Болдырев А.А., Куредла Е.Г., Рубцов А.Ы., Тшина О.В.. Шара П., Нспгхгрц и. Прямое измерение взаимодействия карнозчнй и его аналогов со свободнамк радикалами, Биохимия, 1992, Г.57. К.9, стр. 1360-1365.

4. Егоров С.О., Куредла Е.Г., Вавдырев А.А., Краопззсккй А.А. (мл). - Тушение синглетного молекулярного кислорода кзрнозвно'л и анзерином в водных растворах. Бпоорг. химия. 1992, Т.18, К. 1г стр. 142-1445. Курэллэ Е.Г., Тшшга О.В., Золдарев А.А. Является ли карзозип антиоксидантш прямого действия. Тезиса IV Всесоюзной конференции " Еиоантиокоиданты" Москва ( апрель 1952г. ), т. 1, стр. 99-100.

6. Болдырев а.А., Куредла Е.Г., Павлова Т.Н., С-геолезский С.Л., Федосова Н.У. - Биологические мекзбраны. Практо;еское руководство. 1992, Москва, 142 стр.

7. Boldyrev А.А., КоМоЪв^" А.К.. Kurella E.G., lialtsevs Y.7. and Stvolinski S.L. - natural histidins-oontaining dipeptide сагнозгпе аз a potent JiyiirojMlic antioxidant with. иеьЬгапэ etatilizing Junction. 1'olec. Chem. NeuK>pathol.,1Q93» ?cl.19, No 2, pp 185 - 191

20