Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие фенольных соединений и гидрофитов

ВАК РФ 03.00.18, Гидробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие фенольных соединений и гидрофитов"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ- КОМИТЕТ ■ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПО ВЫСШЕМУ ОБРАЗОВАНИЮ Р Г о (^ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫ!! УНИВЕРСИТЕТ

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ШОЛОГИИ

На йравах рукошоя

САКСОНОВ Михаил Наумэшч

I • ,

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФЕНОЛЬНЫХ. СОЕДИНЕНИЙ И ГИДРОФИТОВ 03.00.18 - гидробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

иа соискание учёной степени кандидата биологических наук в форме научного доклада

Иркутск - 1993

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте биологии при Иркутском государственном университете. * -

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Д.И.Стом Официальные ошшоненты: доктор биологических наук,

профессор О.П.Родченко; кандидат биологических наук Е.В.Осипова

Ведущее учреждение: Красноярский государственный университет

Защита состоится п&2 1993 г. в № часов щ*

даоедании опевдализироваяного совета К 063.23,03 при Иркутском государственном университете до адресу: 664003,"г. Иркутск, ул» Оухэ-Батора, 5, биолого-почвенный факультет ИГУ.

С авторефератом диссертации мояно ознакомиться в Научной библиотеке Иркутского государственного университета.

Автореферат разослан 1993 г,

Учёный секретарь, специализированного совета,

кандидат биологических наук ¡^Ъ^и^ Е.СЛСупчинская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

Актуальность теш. Изучение и прогнозирование состояния водных экосистем, основываюгдаеся на принципах популящюнной экологии (Кокова, 1986), должно сопровождаться контролем за физиологическими и биохимическими процессам! на организменном, клеточном, субклеточном уровнях, что может быть использовано не только дан промышленного мониторинга, но и для понимания механизма токсического действия ксенобиотиков на гидробионты (Крайнюкова, 1988; Крин, 1988; Карнаухов, 1988; Malino , 1991).

Многокомпонентность сбрасываемых вод, затрудняющая их исследование, необходимость анализа не только концентрация поступающих веществ, но и их действия на гидробионтов, заставляет всё большее внимание уделять биологическим методам анализа качества природных и сточных вод (Брагинский, 1983; Филонко, I98b; Шуберт, 1988).

По объёму, концентрация, токсичности и по трудности очистки фенолсодержащие сточные воды целлюлозно-бумажной, нефтехимической, хишческой, фармацевтической отраслей промышленности занимают одно из первых мест (Грушко, Кожова, 1978; Schv/arts , 1977) и поэгоцу изучение механизмов токсического действия феяожшх соединений (ФС) на гидробионтов имеет важное значение для решения проблем санитарной гидробиологии. Исследование токсикодаяамики эффектов, вызываемых ФС, должно способствовать пониманию механизмов токсического действия ФС на гидробионты, что монет быть полезным для разработки новых и выбора адекватных методов биотестирования сточных и природных вод. / '

Бкотестировакле фенолсодергащих сточных вод имеет свои особенности, обусловленные склоялостью ФС к.окислительным превращениям, резким различием токсичности, зависимостью их токсического эффекта от наличия ~j организмов, используемых для биотес- ■ тярования, ферментоЕ, ©кисдагоцих фенолы {Стогл, 1982; Барабой, 1984). В литературе практически, отсутствуют работы, в которых влияние фенолов на такие параметры как ионная проницаемость клеточных мембран, биоэлектрические потенциалы, флуоресценция . хлорофилла гидрофитов оценивали бн с учётом вышеизложенных особенностей.

С другой стороны такие- параметры как окисление, аккумуляция, трансформация фенолов гидробяонтами достаточно подробно изучены (Кирсо, Стом, 1986). Гораздо менее известно о механизме окисления гидрофитами смесей фенолов, хотя в реальных сточных водах

фенолы присутствуют в виде смесей» Представляет интерес исследование возможности использования закономерностей окисления фермзнташ гидрофитов сшсей фонолой да развития методов анзямодиагноотшш гидрофитов.

Целью данной работ» было изучение механизмов взаимодействия . фанолышх токсикантов 'и гидрофитов,

Р соответствии с отшл бшш поставлены следующие задачи: I» Научить влияние фенольных соединений на ионную проницаемость клеток злодеи.

8. Сопоставить характер действия полифенолов на мембранный потенциал, интенсивность флуоресценции хлорофилла и движение цптоплаз-!.ш клеток нителлы.

3» Последовать впзшшость и перспективы использования взаимодействия полифенолов с фанолокисляющиш ферментами гидрофитов для знзшлодиагностики и анализа фенольнцх соединений.

Теор--?тичвскоо значение к научная новизна, Изучены механизмы токсического действия ФС на гидрофиты, играющие в&гную роль да ■ понимания процессов, происходящих в водных растениях и экосистемах. Вшвлена зависимость мевду характером токсического действия нолифенолов на гидрофиты и физикс-осимическиш свойстваш ФС, такими как способность окисляться, растворяться в липядах, наличием у тест-объектов феаодошхсдяющих ферментов.

Показано, что вше од электролитов из клеток злодеи при действии легкоокисляюлихся иоллфенолов в отличье от трудноокисляешх не закисях от дшюф'лльног/лт их молекул и сопровождается повшенным уроьнеи выхода углеводов.

Отмечено, что при действии п-бензохикона и о-дифенода падение скорости дцаешш • «иоплазш предшествовало сшшенша шкбран-ного потенциала и щыеиию флуоресценции хлорофилла клетки нител-лц. Установлено, что действие о-днфенола на цдклоз нителлы ииеет ддухзташшй характер: на первом зтапе оффект определяется восстановленной исходной молекулой фонола, а на второй - преимущественно влиянием хинои.щшх продуктов о-дафенолоксидазного окисления пирокатехина.

Комплексное исследование (регистрация мембранного потешдаа-ла, интенсивности.фшуоресценцци хлорофилла, скорости циклоза, ипгкбиторнып анализ) эффектов о-дифенола и п-бензохинока на клетку нителлы позволило доказать наличие на поверхности клетки Безыдейных операторов цлклоза. Именно на этих операторах и реализуется первичное повреждающее действие исследуе:лнх соединений.

Изучен процесс образования интенсивно окрашенных продуктов при инкубации гидрофитов в водном растворе бинарной смеси двух-атомних фенолов. Исследована возможность использования этой индикаторной реакции для определения активности пероксиддзы гидрсфи- • топ и для анализа.ФС.

Практическое значение и использование результатов нсолодова-S-SSs. Предложена установка дач измерения выхода электролитов из клеток водных растений и лабораторный блочный микроспектрофшуори-метр, которые могут быть использованы в лабораториях и организациях, занимающихся проблемами водной токсикологии, охраной окружающей среды.

Разработан простой высокочувствительный способ определения перодсидаэы, основанный на. реакции окислешш бинарной смеси двухатомных фенолов перекисью водорода, катализируемой перокелдазой (A.C. )Ь 1262350 СССР).

Предложены ферментативные кинетические метода определения микроколичеств пирокатехина и резорцина (A.C. й I7I806I СССР, A.C. Г) I755I37 СССР), у

Разработанный способ определения активности шроксидазы используется в Гидрохимическом институте (г.Ростов-на-Дону) для анализа качества природных вод (Акт внедрения от 03.01.87 г.), в лаборатории кибернетики биохимических систем Президиума СФСО АМН СССР при исследовании катализаторов дта обезвреживания загрязняющих веществ (Акт о внедрении от 18.01.90 г.), в лаборатории физиологии устойчивости растений СИФИБРа (г.Иркутск) дяя определо- . ния активности фермента в связи с его участием в ростовых процессах клетки и корня в целом при действии низких положительных температур (Акт от 23.03.89 г.), на кафедре "фармакологии Иркутского мединститута (Акт от 16.03.88 г.), в НИИ эпидемиологии, микробиологии и гигиены №3 Лит. СС? (Акт от 21,10.38 г.).

Результаты работы включены в отчёты'ряда тем, выполнявшихся лабораторией по заданию ГХНТ С!ГСССР (№ госрегистрации 7603I4I5, 76033978, 8IG98I33). Разработанные методы включены в учебное пособие для студентов биологического факультета (ИГ/, 1990),

Апообация работы. Материалы диссертации.докладквзлис* на П Республиканском совещании "Проблемы экологии Прибайкалья" (Иркутск, 1982), I Всесоюзном ссвешании "Геохимия техногенеза" (Иркутск, 1985), Республиканской конференции "Биотоотирование и бяо-индикация природиьк и сточных иод" (Ростов-на-Дону, 1986), Всесоюзном симпозиуме по фенольным соединениям (Таллин, IS37), Ш и

1У Всесоюзных симпозиумах по антиоксидаитам (Москва, 1983, 1992).

Публикации. Материалы диссертации отражены в 24 научных публикациях, в т.ч. три авторских свидетельства на изобретения.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Постановка проблемы. На основании анализа литературных данных можно сделать вывод, что механизмы токсического действия фенолов на гидробионты изучены недостаточно. Как правило, токсическое действие ФС на гидрофиты оценивается по какого-то одному физиологическому параметру. Для понимания механизмов токсичеокого действия ФС необходимо использовать комплексную оценку влияния токсикантов на ряд физиологических показателей клетки. Это позволит выявить роль фенол окаолящах ферментов гидрофитов в механизме токсического действия ФС, использовать закономерности взаимодействия ФС и ферментов для развития методов биологического контроля.

2. Объекты й методы исследования. В качестве объектов исоле-г дованяя была выбрала водоросль из семейства харовых - нитедла

( Hlteiia вр. ), а также высшее водное растение элодея ( Elodea'canadensis ). Используемую в работе нителлу собирали в озере Байкал о глубины 3-10 м, сбор элодеи проводили в реке Ангара.

Фенольные соединения очищали методами возгонки, перегонки и парекристаллизации. Препараты о-дифенолоксидазы получали из клубней картофеля (Бузун и др., 1976), В работе использовали, коммерческие препараты пероксидазы ( Reanal , ВНР).

Скорость движения цитоплазмы в клетках нителлы определяли по (Камия, 1962), хлоропластов элодеи по (Казанцев, 1969). Выход электролитов из клеток элодеи оценивали, измеряя электропроводность раствора мостом церемонного тока Е8-2 и электродом OK-9Q2 (ВНР). Побеги элод!и, инкубированные в растворах ФС (соотношение '3 г/100 мл), помещали в тврмостатируемый шейкер ( type - 357", ПНР).

Концентрацию ионов К+ измеряли ,на пламенном фотометре ПЖ-1, Концентрацию общих углеводов определяли антроновым методом (Ермаков, 1987).

Измерение мембранного потенциала (МП) клетки нителлы осуществляли открыто вакуолкрным методом ( Tazawa , 1975). Для реги-сарации Ш использовали рН-метр ЛПУ-01, работающий в режиме мил- . ливольтметра и самопишущий потенциометр КСП-4»

Измерение интенсивности флуоресценции хлорофилла (ИФХ) клет-

ки нителлы приводили на микроспектрофлу оршлетре собственной конструкции (Саксонов, Трипу зов, 1981), Установка собрана на базе флуоресцентного микроскопа " ргиоуп! монохроматора " эре-

оо1 " и фотометрического устройства, состоящего из фотоумножителя ФЗУ-79 и микровольтметра V -623 (рис. I),

Клетку нителлы помещали в специальную камеру .с исследуемым раствором. Освещали светом ртутной лампы H130-20Q с Л =440 нм • участок междоузлия нителлы диаметром 80 км. выделяемый световым ■зондом. Измереш1е флуоресценции хлорофилла проводили при Л -685 нм. Дяя предотвращения фотохимического обесцвечивания хлорофилла при каждом последующем измерении световой зонд перемещали вдоль клетки. •

Активность пероксидазы оценивали по скорости окисления гваякола (Гавриленко, 1975) и о-дианизидина (Угарова, 1977). Концентрации перекиси водорода определяли по ( George , 1953), а пероксидазы по ( shannon , 1966). Спектры поглощения м кинетику окисления бинарных сглзсей ФС регистрировали ца спектрофотометре " Specord Ы-40". Оценку результатов осуществляли после их -статистической обработки (Плохлнский, 1970) при доверительной вероятности Р=0,95.

Принципиальная схема микрр-поктро^шуориметра

11 12

15 31-4>ЭУ; 32-мнлливольтметр; 33-регистратор; 34-ВС-22.

I-стабилизатор; 2-блок питания источника света; 3,8,10,13,21, 25-зеркала; 4-источник света; 5-коллектор; 6-светофнльтры; 7-дополнктсльная систеш освещения; 9-ирксовая диафрагш; 11,12,18,20,

Рис. I

3. Влияние -фенольных соединений да виход электролитов из клеток злодеи. Изучены концентрационные л временные зависимости выхода электролитов (ВЭ) цз клеток элодаг при действии фенола, гваякола, резорцина, пирокатехина, гидрохинона, п-бензохинона. В зависимости от строения и концентрации фенольных соединений ВЭ составлял от 2 до 50 % от исходного содержания электролитов в клетках. При действии всех фенольных соединений (ФО) на клетки влодеи наблюдали корреляцию мезду ВЭ и выходом катионов к!" из клеток элодеи. Как показали результаты экспериментов экзоосмос ионов под под влиянием хинона, гидрохинона, пирокатехина значительно вше, чем при действии фенола, гваякола, резорцина (рас, 2).

Для последних &С наблюдалось установление стационарного уровня ВЭ, который наступал через час инкубации элодеи в растворе гваякола и через два часа монофенола. Эфсект этой группы ФС, ридимо определяется их , липофильностьы. Такое преполо-жение подтвердили опиты с хло~

зависимость ВЭ из клеток элодеи от времени инкубации в растворах ФС подобна зависимости при исследовании действия хлороформа на ВЭ из злодеи (рис. 3). ВЭ при действии фенола, гваякола, резорцина и хлороформа в высоких концентрациях на клетки элодеи прямо пропорционален их коэффициентам распределения в системе октапол- вода«

Известно, что гидрохинон и пирокатехин значительно более гидрофильные соединения, чем гваякол и фенол. Кроме того, известна способность, зы-реагентов увеличивать ионную проницаемость меток водных растений (Мухмадияров, 1591). Хинон и продукты окисления пирокатехина и гидрохинона блокируют БН-группи белков' (Торчкнс:шй, 1977). Ышхо предлоло:.шть, что в основе эффекта этих соединений на ВЭ лежит• взаимодействие с моловши группами мембранных белков. Так по данным ( зи>т , 1077.1 д-лсл^о

Зашсшость выхода электролитов из клеток элодеи от концентрации фенолов в среде при времени инкубации 3 ч

1-резорцин; 2-моноФенол; З-гваякол; 4~ппрокатехин; Бнгадр о хин он з 6- -п-бен з охин он.

Рис. 2 *

Выход электролитов из клеток листьев элодеи при деистн фенолов в концентрации 50 1.« (а) и I г.Й (б)

Рис. 3

хинона на клетки элодеи приводит к значительно больше^ снижению содержания тиоловцх групп элодеи,лом пирокатехин. Действие гидрохинона вызывало и более интенсивный ВЭ из клеток, чем пирокатехин.

В пользу воздействия именно процессов окисления ФС на ВЭ из клеток элодеи свидетельствуют опыты ао влиянию на ВЭ трудноокис-ляющегося глпкозида арбутина. ВЭ из клеток элодеи под действием гидрохинона в два раза выше, чем под влиянием его глпкозида (рис. 3 б). .

По разному влияли ФС и на выход углеводов из клеток элодеи. При варьировании в среде инкубации содержания п-белзохинона, гидрохинона и тлонофзиола били подобраны концентрации, вызывающие" близкий по величине экзоосмос ионов. Выход ;че углеводов был зна-. чительно выше при действий соответствующих концентраций п-бензо-хинона я гидрохинона, чем монофенола (табл. I). Это лишний раз указывает на принципиальные различия мсхс!ш1а:.я нарушения проницаемости клеточной мембраны элодеи при действии гидрохинона, п-бензохинона и монофенола.

Полученные результаты свидетельствуют об индуцировании полифенолами ВЭ из клеток листьев элодеи. Эффект зависит от структуры ФС и он значительно выше при действии легкоокисляемкх гидрофитам! полифенолов, чем трудноонисляемых. ВЭ под влиянием трудкошшелле-мых ФС можно объяснить их ексокой степенью растворимости в лшы-•дах плазмалеммы. Тогда как увеличение проницаемости клеток элодеи для ионов и углеводов при действии легкоокисляющлхся ¿С связано с

Таблица I

Влияние монофенола, гидрохинона и п-бенэохинона на выход сл-ктролптов и углеводов из клеток элодеи

Среда инкубации (концентрация ФС, мШ Электропроводность раствора, мко Концентрация , углеводов, мг/л

Ди стиллированная

вода (контроль) 10,1+0,8 4,6+0,7

Монофенол (22,0) 65,8+5,9 5,0^0,7

Гидрохинон (1,0) 57,2+5,5 12,2+1,1

ц-Бензохиаон (0,2) 59,8+5,4 13,011,0

блокированием ХН-групп белков плазмалеьш.

4. Действия йенольных соединений на интенсивность Флуоресценции хлорофилла,.мембранный потенциал и движение цитоплазмы клеток дятелльи Изучали гашение флуоресценции хлорофилла клотки нителлы фенолами в зависимости от концентрации соединений и времени инку-' бацни» Анализ данных по степени гашения интенсивности флуоресценции хлорофилла (ИФХ) нителли позволил построить убывающий ряд токсичности: п-бензохинон, пирокатехин, гидрохинон, гваякол, монофенол, резорцин. Большой эффект пирокатехина по сравнению с гидрохиноном объясняется наличием в ндтелле активной о-дифенолоксидазы, окисляющей молекулы пирокатехина до более токсичного о-хинона.

Одновременное исследование изменения нескольких физиологических параметров клетки при действии фенольных соединении может бить полезно для выяснения механизма влияния этих веществ на клет;су в целом. В свази с отнм изучено влияние п-бензохннона, пирокатехина и гваякола в концентрациях, останавливающих движение протоплазш клотки яителлы через 15 мин., соответствующих 0,2 г.М, 2 Ш, 50 и М, на ¡Ж и мембранный потенциал (МП)-. К моменту прекращения циклоза в клетке-нителлы гваякол вызшзал значительное падение мембранного потенциала на 130+8 мв, а действие п-бензохино-на и пирокатехина но изменяло Ш по сравнению с контролем (рис. 4).

, В основе механизма токсического действия гваякола, по-види-моцу, лекит его 'влияние на плазматическую мембрану. Эти предположения хорошо согласуются с результатами исследования механизма действия данных соединений на ппклоз нителлы но принципу Фергюсо-на (Стом, 1375), Из них следует, что пирокатехин, гидрохинон и и-бензохинол относятся к структурно-опецяфическпм агоатам, эффект

Действие на МП клетки нителлы п~бензохинона и некоторых иоллфенолов в концентрациях, останавливающих движение цитоплазмы за 15" шн

которых обусловлен их хишче ским взаимодействием с компонентам! клетки, а действие гваякола близко к нар-котнческоцу. В последнем случае вещества накаплиааются в мембране, происходит "механическое" повреждение мембраны, приводящей к разобщению сопряжённых процессов (Альберт, 1971).

МП, мв

МО

100

?

60-

«1

20-

-1 8 12 16 20 24 28

1-резорцин 50 Ш; 2-п-бензохинон 0,2 гШ

А _______ . . _______ П' . 1» . *

3-гшрокатехин 2 г-М; 4-гваякол 50 г±1; 5-хлопоформ 50 г.М.

какой-то мерз подтверждалось тем, что такой наркотик как хлороформ ' в концентрации, останавливающей движение

Вышесказанное в

Рис. 4

за 15 шн вызывал падение УП, близкое к значению, отмеченного при действии гваякола. Причину наибольшей активности гваякола, вероятно, следует искать в его высоком коэффициенте распределения-липид-вода, что приводит к значительному накоплению данного соединения в мембранах, в частности в мембранах хлоропластов. В пользу этого свидетельствует подобие кинетических кривых гашения флуо- ' ресценцнн хлорофилла при действии гваякола и хлороформа.

П-бензохинон известен как общий цитосгатический агент (Вар-бье, 1978) и тушитель флуоресценции хлорофилла (Красновский, 1974). Поэтому отсутствий его влияния на И£Х в концентрации, вызывающей повреждение клетки может бить понятно, если принять, что п-беязохинсн не достигает хлоропластов, связываясь с компонентами клетки в поверхностной области кл&ша. Для проверки этого предпо-ложешм мы действовали на клетку нителлы п-хлормеркурийбензоатом натрия (ГСШЕ), Он представляет собой слабопроникающий в клетку реагент на эН-грутш. В соответствии с ожиданием эффект ПХМБ бил сходен с действием п-бенз'.'хннона: оба соединения к моменту остановки щклоза пралт.неаа не влияли на ШХ (рис. С).

«Зпси^иость па|'.о!сате;:.1иа окисляться о-дпфеносксндазсй нител-

¡¡«.¡•..а-яшую токоа-шиси'ь растьора ннрока-

Влияние фенсльных соединений

и ПХ1.1Б на интенсивность ■ флуоресценции хлорофилла клетки нителлы*

18 30 50 70 90

1-п-бензохинон 0,2 Ш;

2-11X1',0,2 1/Л) З-нкрокатехип 2 Ш; 4~пирокатех:ш после предварительной обработки клеток раствором дЭДТК, 2 Ш; 5-гваякол 50 м\1.

Рис. 5

техина. С целью разграничения влияния на'ИФХ и циклов нителлы не окисленных молекул пирокатехина от действия продуктов его окисления, перед опытом клетки нителлы обрабатывали диэтилдитиокарбаш-том натрия (ДДК) - ингибитором о-дифе 11 ол ок сида з и.

Сравнению данных по действию пирокатехина на клетки с активной и ингибированной о-дифенолоксида-зой показало, что подавление ИФХ . -изменилось незначительно, в ..то вреш как продолжительность движения протоплазмы возросла с 15 до 80 мин., причём в течение первых 12 мин характер подавления циклоза в обоих случаях одинаков (рис. 6).

На этом этапе действие пирокатехина на двкнение цитоплазмы связано преимущественно с токсическим действием полифенола. Резкое падение скорости движения протоплазмы с 12 по 15 млн в клетках с активны.'.! ферментом соответствовало действию хинона на. этом временном участке, т.е. здесь наблюдали эффект, обусловленный продуктами о-дифенолокси- -дазного окисления пирокатехина. 70 90 г,мин Таким образом выявлен двух-этапнь:;; характер действия пирокатехина на циклоз в клетках ни- • тсллы. Па первом этапе за подавление циклоза отвечают восстановленные молекулы пирокатехина, а хиноидные продукты его окисления. I

Влияние предобоаботки клеток нителлы раствором ДЭДТК (2 г.Ы) на подавление циклоза пирокатехином

.V«

цишшза

(2 Ш)

3 6 9 15 30 1-клетки, необработанные ДЭДТК;

2-клеткк, предварительно инкубированные в ДЭдТК 30 мин.

Рис. 6.

на втором

Высокая чувствительность реакции циклоза на присутствие продуктов окислительного превращения пирокатехина, остановка движения

протоплазмы под влиянием не прошшакщего в клетку 1М.2> при поиз-мешои уровне И'й, данные о локализации о-дофонолоксядазн в районе плазиалеммы клетки шателлы (Стон, 1975), проявление сильного .сродства о-бензохинона к сульфгидрилышл группам (Торчинскнй, 1977) и ведущая роль-последних в дшзешш протоплазмы (Камня, 1962) позволили предположить, что в поверхностной области клетки, возможно в плазмдлемме, имеется зп~завнсш.?ни регулятор ццклоза (Апарцпн, Саксонов, 1979).

ДЩС значительно снижал токсичность пирокатехина, определённую по остановке двкешш датоллазш клетки нителлн. Такой з/.з эффект получен при добавлении к раствору пирокатехина аскорбиновой кислоты или цпстеина, блокирующих процесс окисления пирокатехина до -о-хинона и восстанаьлнвавгок хиноны. Но восстановительными, антшжеидантньш свойства*-!« обладают и сами фонолы. Вопрос возникал, не будут ли изменять эффект иолнфенолов другие ФО, тем более, что з реальных средах - сточных п природных водах, как правило, присутствуют lie индивиду алишо соединения, а их смеси»

Для проверки такой возмсшюсти был поставлен опыт по влиянию смеси'пирокатехина и резорцина на двшшше вдтсилазш и флуоресценцию хлорофилла клетки ннтеллы. Добавление резорцина, как п ДДК, но в меньшей степени, снижало токсичность пирокатехина, оцениваемую по длительности цнклоза цдсткп нигеллы. Гашение флуоресценции хлорофилла клетки нптеллл при этом практически не изменялось по сравнении с действием одного пирокатехина.

При изучении комплексного действия полифенолов на водные растения наш было отмечено, что при инкубировании талломов нителлы и побегов элодеи в растворе смеси пярокатехшх-резорцш, раствор окрашивается в зелёный цвет. С течением времени зелёная окраска сменяется бурой и переходит в тёмно-коричневую. Скорость окрашивания раствора увеличивалась с повышением.концентрации фенолов в снеси и массы гидрофитов. Погружение этих растешш в растворы только пирокатехина или одного резорцина не приводило к окрашиванию. Известно, что некоторые способы определения активности окислительных ферментов растений оплошны на цветных реакциях окисления этими онзиыаш фенолов и аминов. Изменения активности ферментов растений при действии токсикантов используются для зн-зпмо'диагпостики объектов о:фу:лаюцей среды ( Keller , 1977).

Поэтому наш был доставлен ряд опытов с целью выяснения роли Лермонтов в набл: лаемом окрашивании смсси шрокатехнн-резор-г;г.-у; аj ьлС'-ctЬ л рь/юямя го^сг^-псти

- Ii -

использования цветной реакции для разработки новых методов энзи-модиагно стики гидр офит о в.

5. Окисление ферментам-гидрофитов бинарной смеси двухатомных Фенолов. Предварительная термическая обработка высших водных растений и водорослей, их выдерживание перед погружением в смесь двухатомных фенолов в растворах сульфида натрия, ДЦК. Добавление к смеси ФС избытка перекиси водорода подавляло возникновение зелёной окраски, либо значительно её ослабляло. Напротив, насшцениэ раствора воздухом, добавление низкой концентрации перекиси водорода, подщелачивать ускоряло образование окрашенных продуктов реакции (табл. 2).

Таблица 2

Окрашивание раствора смеси ■'

пирокатехин-резорцин в присутствии гидрофитов

Состав смеси Концентрации Гидрофиты Время, Оптическая

компояентов, i.M та плотность, Д46О

Пирокатехин 10,0 нителла 30 -

Резорцин 10,0 нителла 30 -

Пирокатехин- 2,0; 2,0 нителла 30 0,16+0,02

ре зорвдн 10,0;Ю,0 нителла 30 ' 0,32+0,04

Пирокатехин- 10,0;10,0 нет 30 -

резорцин

Пирокатехин- Ю,0;Ю,0 нет * 180 ■ 0,06+0,01

резорцин

Пирокатехин- 10,0;Ю,0; нителла 30 0,14+0,02

ре зорцин-ДЦК 2,0

Пирокатехин- 10,0;10,0; 10,0 мкг/мп нителла 30 0,25+0,03

резсрцин-

каталаза

Пирокатехин- 10,0;10,0; нителла 30 0,46+0,04

^езоридн- 2,0

Пирокатехин- 10,0; 10,0; 2,0 мкг/мл; нет 3 0,60f0,04

резорцин-

перококдаза-№

Доказательством участия ферментов в возникновении окраски раствора слукит её появление при внесении в раствор пирокатехин-резирцин препарата о-дифенолоксидазы, выделенного из клубня картофеля или пероксидазнои системы, состоящей из пероксидазы корня

хрена и перекиси водорода.

Спектры продуктов поглощения реакции окисления сглеси дифено-тшв о-дифенолоксндазнон и пероксидазной системой (рис. ?).совпадали и характеризовались двумя спектральными пиками с максицу-маг.а при 460 им и 700 нм. Продуктом окисления пирокатехина о-дифенолокспдазой является о-хинон. Поэтому следует допустить, что для возникновения зелёной окраски смесь должна содержать пирокатехин, резорцин и хлнон. При добавлении к смеси пирокатехин-резорцин п-бензохинона спектр поглощения имел те же два спектральных лика, что регистрируются при пероксидазном, а также о-дифенолоксидазном окислешщ 'смеси пирокатехин-резорщш.

При окислении двухатоглных. фенолов о-дафенолоксидазой скорость накопления продуктов реакции меньше, чем при окислении одного пирокатехина, В противоположность этогду при окислении '¿меси двухатомных фенолов перокси-дазной системой скорость накопления продуктов реакции на порядок выше, чем при окислении одного пирокатехина, т.е. именно для определения активности пероксидазы целесообразно использовать индикаторную реакцию. Возможно, отмеченное различие связано с тем, что для о-дафенолоксидазы только пирокатехин служит субстратом, тогда как для пероксидазы субстратами являются и пирокатехин и резорцдн ( Бип^га, 1936).

Для выяснения опти.лальных условий окисления смеои пирокатехина и резорцина пероксидом водорпга в присутствии пероксидазы исследованы зависимости скорости индикаторной реакции от концентраций фермента, пирокатехина, резорцина, пероксида водорода, рН буфера (рис. 8).

Как видно из рисунка скорость индикаторной реакции весьма чувствительна к изменению концентрации резорцина и при уменьшении последней в реакционной смеси с 5 до 0,5 1?1 падает в 5 раз, Индикаторная решяда не возникала в отсутствии фермента.

Спектры поглощения продуктов реакции перокоидазного шшсления смеси пирокатехин-резорцин

400 460 600 700 900 1-резорцин отсутствует;

2-0,5 Ш: 3-2 г1Л; 4-4 111: 5-15 Ш; 6-6 Ш;

рЙ буфера 7,8 концентрации пероксидазы 1,5ЧМ; перекиси водорода 10 м М

Лнм

Ряс. 7

Зависимость скорости индикаторной реакции от концентрации пероксидазн (Л, от "значения рН (Л), от концентрации перекиси водорода (о) в реакционной смеси

Рис.8

Скорость реакции в отсутствии пероксида водорода была незначительной - менее 4 % от скорости окисления системой пероксидаза-поре-кись водорода. Оптимальные значения рН 7,5-8,0, а концентрации пероксида водорода в реакционной смеси - 10-20 (рис. 8а, б).

Прямая зависимость начальной скорости индикаторлой^гакгрш от концентрации фермента в реакционной смеси в интервале 0,55,0 Ш (рис. 8 в) я определение оптимальных условий реакций позволили предложить способ определения активности пероксидазы (Саксо-нов, 1986). Достоинствами предложенного метода являются хорошая воспроизводимость, достаточно высокая чувствительность, широкая распространённость полифенолышх субстратов, а так ке отсутствие у субстратов канцерогенных свойств.

Предложенный способ был испзльзовак при.изучении токсического влияния сульфида натрия на элодею (Саксонов, 1986), действия пестицидов на корнеплоды (Акт внедрения, Вильнюс, 1988), эффекта низкой положительной температуры на клетки кукурузы (Саксонов, в печати).

• Предложенная индикаторная реакция использована и для измерения микроколичеств пирокатехина и резорцина в воде. Разработаны кинетические ферментативные способы определения шкроколлчеств резорцина и пирокатехина в воде (Саксонов, 1992), отллчаюшеся высокой чувствительностью (до I иг в пробе) и экспрессивностью (3-4 мин одно определение).

Предварительные спектральные исследования свидетельствуют о том, что предложенная система для количественного определения пирокатехина и резорщша может быть использована для измерения ш-кроколичеств других фенолов.

шяюгд

1. Установлено 5 что при действии '¡юшмшшх соедш-гшшй {ФО) на клетки водных растений, 1сс токсический оффзкт проявляется в увеличении выхода электролитов из клеток, снижении мембранного потенциала, гашении флуоресценции хлорофилла, подавлении движения цитоплазмы.,

Вил плена связь между поврекдавдкгл действием ФС т гидрофиты с одной стороны их "способностью окисляться, растворяться в липидах, с другой - активностью фенолокислнюсдх ферментов гидрофитов и их локализацией,

2, Показало, что легкоокисляемш <1>0 пирокатехин и гидрохинон оказывают более сильное повреждающее .воздействие на клетки водных растении, вызывают более высокий выход электролитов из клеток элодеи, чем трудноокисляемые гваякол, кояоТ;енол, резорцин. Положительная корреляция между вводом электролитов из клеток элодеи прц действии гваякола, моно^енола, резорщша и коэффициентом распределения в системе октапол-вода, а также подобное действие трудно-оклеляеодк <№ и хлороформа свидетельствуют о наркотическом денет-еш этих соединений,

3. В отличие от трудпоокпеляег.ак ФП не наблюдается корреляции к-ззду выходом электролитов из клеток элодеи при действии пирокатехина, гидрохинона, продуктов их окисления, в частности п-бензо-хшюна, и коэффициентами распределения в системе октанол-вода. . Зкзоосмос электролитов при действии легкошшестешк фенолов сопровождается интенсивным выходе;.» 'углеводов.

Ряд эффективности по выходу электролитов из клеток элодеи совпадает с рядом, отражающим степень ннгнблровашы ЗН-груяи в белках клеток злодей, что свидетельствует об участии зН-грушл мембранных белков в механизме действия легкоокиеллимых ФС на клетки элодеи.

4, При действии трудноокисляемьк ФС снижение скорости даша-шм цитоплазмы клеток ¡штеляы сопровождается падением мембранного потенциала и гашением флуоресценции хлорофилла. При этом кинетические кривые этих параметров подобны кинетическим кривым при действии на клетки хлороформа. ■

Снижению скорости движения цнтоплазш клеток нителта при действии легкоокисляемых ФС и п-бензохинона предшествует падению мембранного потенциала и гашению флуоресцеции хлорофилла. Следовательно снижение скорости движения цитоплазмы в клетках нлтеллы является '¿елее с-ксяресснда и чувствительным тестом по сравнению с

гашением флуоресценции хлорофилла и падением мембранного потенциала при оценке токсического действия легкоокисляемых ФС.

5. Комплексная оценка ряда физиологических параметров клеток нителлы и данные по локализации фенфгокислякщих ферментов в клетке позволяют предположить, что высокая чувствительность движения цитоплазмы к действию легкоокисляемых фенолов определяется наличием на поверхности клетки бН-завнсимых операторов циклоза, на которых первоначально к реализуется токсическое воздействие п-бензохинона и продуктов ферментативного окисления о-дифенола.

6. Сравнение скорости движения цитоплазмы в нативных клетках нителлы и в клетках с ингибированной диэтиддитиокарбагатом натрия о-дифенолоксидазой показало двухэташшй характер действия о-дифе-нолов на ыдклоз нативной клетки нителлы. На первом этапе проявляется эффект действия восстановленного пирокатехина, а второй характеризуется прею.туцественно действием хиноиднцх продуктов ферментативного окисления о-дифенола.

7. Установлено, что при действии смеси пирокатехин-резорцин на клетки нителлы повреждающий эффект на движение'цитоплазмы значительно ослабляется по сравнению с влиянием одного пирокатехина. При этом интенсивность флуоресценции хлорофилла остаётся неизменной. Бинарная смесь оказывает на исследуемые параметры действие качественно сходное с эффектом пирокатехина на' клетки нителлы с ингибированной о-дифенолоксидазой. Это позволяет предположить, что причиной ослабления повреждающего действия смеси на движение цитоплазмы является блокирование резорцином продукта окисления пирокатехина - о-бензохинона или промежуточных радикальных продуктов окисления.

8. Обнаружено, что инкубапдя гидрофитов в растворе, содержащем пирокатехин и резорцин, приводит к возникновению ярко-зелёной окраски раствора.

Показано, что образование окраски связано с взаимодействием ФС и продуктов их ферментативного окисления. Проведена оптимизация реакгщи'окисления пирокатехин-резорцин пероксидазной системой, в результате чего предложен высокочувствительный метод определения активности пероксидазы, который может быть широко использован для энзпмоднагностикк объектов окружающей среды.

9. Разработаны экспрессные способы определения широко распространённых -уенольных токсикантов - пирокатехина и резорцина, основанные на перокендазном.окислении бинарной смеси, состоящей из трудноокисляемого и легкоокисляемого фенолов.

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Апарцин М.С., Саксонов М.Н., Стом Д.И. К вопросу о механизме действия пирокатехина и п-бензохинона на метки нителлы//

' ДАН СССР, 1979.- Т.,244, Я 2.- С.510-512.

2. Влияние, п-бензохинона и некоторых полифенолов на мембранный потенциал клетки нителлы, измеренный открьгто-вакуолярным методом/ М.Н.Саксонов, М.С.Апарцин, М.П.Грудишш, Д.И.Стом// Гидробиол. вдш.-1980.- т.166, № 4.- С. 89-94.

3. Саксонов М.Н., Трипузов Г.В. Цитоспектрофлуориметр - прибор для изучения действия фенольных токсикантов на отдельные клетки нителлы// Влияние фенольных соединений на гидробионтов,- Иркутск, 1981.- С. 17-24.

4. Саксонов М.Н., Трипузов Г.В., Стом Д.И. Влияние некоторых фенолов и хинонов на выход электролитов из клеток элодеи// Проблемы экологии Прибайкалья: Тез. дом. Всесоюзн. научн. конф,- Иркутск; 1902.- С. 64-65.5. Метод определения активности пероксидазы для биотестирования природных и сточных вод/ М.Н.Саксонов, А.Э.Балаян, Т.В.Забелина, Д.И.Стом// Биоиндикация и биотестирование природных вод: Тез. докл. Всесоюзн. конф,- Ростов-на-Дону, 1986.- С.140.

6. Саксонов М.Н., ¡Забелина Т.В., Стом Д.И. Смесь пирокатехин-резорцин в качестве Н-донора при определении активности пероксидазы// Тез. докл. Всесоюзн. симпозиума по фенольным соединениям.-Таллин, 1987.- С. 135-136.

7. Саксонов М.Н. Новый способ определения пероксадазы//Инфор-мациошшй листок ЦНТИ,- Иркутск, 1987, Л 87-89.

8. Саксонов М.Н., Атавина Т.Г. Метод биотестирования по интенсивности флуоресценции хлорофилла клетки нителлы// Методы биотес-тиров&1йя вод. ' - Черноголовка, 1988,- С. 94-95.

9. Саксонов М.Н., Трипузов Г.В., Стом Д.И. Метод биотестирования по выходу электролитов из клеток элодеи// Методы биотестирования вод, - Черноголовка, 1988.- С. 96-97.

10. Саксонов М.Н..Исследование токсического действия некоторых фенольных антиоксидантов// Биоантиоксиданты: Тез.докл. Ш Всесоюзн. конф,- М.,1969.- С. 256.

11. Методы биотестирования вод/ Д.И. Стом, Т.А.Гиль,А.Э.Балаян, Ш.Саксонов, Т.Г.Атавина// Методические указания для студентов.- Иркутск: изд-во ИГУ, 1990.- 24 с.

12. Саксонов М.Н., Болмасова С.И;-Кинетический ферментативный метод определения фенольных антиоксидантов/Диоантиоксиданты: Тез. дЪкл. 1У Всесотен. конф.- М., 1992.- С. 141.

13. Смесь пирокатехин-резорцин в качестве субстрата при определении активности пероксидазн в растениях// Физиол. и био-хим. растений.- в печати .

14. Chrameova T.G., Saceonov Ы.Н., Stom D.J. Effects of

л

Phenolic compounds on chlorophyl fluoresceins intensity in Hitella Cells// Hatural. Phenols in Plant Resistance: International Scientific Symposium ( 13-17 September 1993 ) University of Mu-njch, Germany.- in ргеав. _

По материалам диссертации получено три авторских свидетельства на изобретение:

1. А.С. №1262350, СССР. Саксонов М.Н., Балаян А.Э. Забелина Т.В., Стом Д.И. Способ определения активности пероксидазы.-Заявл. 19.12.84; опубл 07.86, <5ад. 37.

2. А.С, & 1718061, СССР. Саксонов М.Н., Болмасова С.И., Стом Д.И. Способ определения резорцина.- Заявл. 27.06,90; опубл. 07.03.92, бш.9.

3. А.С. Л 1755137, СССР. Саксонов М.Н., Болмасова С.И., Стом Д.И. Способ определения пирокатехина.-'Заявл. 08.06.90; опубл. 15.08.92, бюл. 30.

Подписано к печа!И 24.11.93 Заказ 24 Объям Т.О п.л. Формат 60 х 20. 1/1б.Тирая 100 экз. Подразделение оперативной полиграфии Иркутского государственного университета 664003, г.Иркутск,б.Гагарина,36