Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Взаимодействие ассоциативных ризобактерий с растениями при различных агроэкологических условиях

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Взаимодействие ассоциативных ризобактерий с растениями при различных агроэкологических условиях"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

Р Г 5 О Д На правах рукописи

- я И!0И 1998

КУЛАКОВА Анна Мирославовна

ШШОДЕЙСТВИЕ АССОЦИАТИВНЫХ РИЗОБАКТЕРИЙ С АСТЕНИЯМИ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ АГРОЭКОЛОГИЧЕСКИХ

УСЛОВИЯХ

Специальность: 03.00.07 - Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском инсти сельскохозяйственной микробиологии (г.Санкг-Петербург).

Научный руководитель - кандидат биологических наук, старший научный сотруд Л.П. Кожемяков.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Г.А. Воробей» кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник Л.Н. Пароменская.

Ведущее учреждение - Московская сельскохозяйственная академия им К.А.Тимирязева.

Защита диссертации состоится " & « ¿¿-¿-сус-^я.. 1998г. в 7^(3 час.^О ы на заседании Специализированного совета К 020.26.01 по присуждению ученой степ кандидата биологических наук во Всероссийском научно-исследовательском инстт сельскохозяйственной микробиологии по адресу: 189620, г.Санкт-Петербург-Пушкин-6, шс Подбельского, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан " ? " 1998г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

А.Н. Зарецкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Возможность создания биопрепаратов на основе 1ссоциативных азотфиксирующих и ростостимулирутощих бактерий, для повышения 1родуктнвности сельскохозяйственных культур и получения экологически чистой продукции, меет большое научное и практическое значение. Однако, использование таких жопрепаратов в значительной мере сдерживается из-за отсутствия необходимых знаний в >бласти экологии этих микроорганизмов и роли агроэкологических факторов, определяющих (ффеюгавное функционирование растительно-бактериальных ассоциаций.

В то же время известно, что численность популяции микроорганизмов является >ажнейшим критерием её активности и статуса в биоценозе и, что условия внешней среды »называют существенное влияние на состав и активность микробных сообществ, в том числе I азотфиксирующих, в почве и ризосфере растений (Умаров, 1986). Предполагается, что :пецифичность реакции различных сортов и видов растений на бактеризацию обусловлена >азличиями в способности растений сохранять или терять ассоциативные связи с бактериями I зависимости от условий их возделывания (Родынюк, 1991). Помимо влияния почвенно-лиматических факторов, интродуцируемая популяция вступает в активное взаимодействие с шкрофлорой почвы и ризосферы растений, и это может оказать существенное влияние на фодуктивность инокулируемых растений (ВмЬап, 1986а; ^ко^^ка, 1987). Однако, :омплексные исследования по изучению влияния агроэкологических факторов на □аимодействия растений с ассоциативными ризобакгериями, а также эффективность [спользования корневых диазотрофов в различных агроэкологических условиях практически [е изучены, и не было попыток количественно оценить вклады экологических факторов и енотипов партнеров в формирование эффективного ассоциативного симбиоза.

Данная работа финансировалась Международным проектом "Интербиоазот-2000", Ъросовской стипендией 1996г. (грант а96-232).

Цель и задачи исследований. Целью данной работы было изучение эффективности заимодействия ассоциативных бактерий, относящихся к разным родам АЛро/егит 137, {.тузогепз 7, А.гасЧоЬааег 10, НспоЪааегшт лрХЗО в почве и на корнях растений при 1азличных агроэкологических условиях.

В соответствии с целью были определены следующие задачи исследований: сравнить способность штаммов диазотрофных бактерий колонизировать ризоплану различных растений (ячмень, пшеница, овес, рис, люцерна и др.) и установить взаимосвязь

между влиянием инокуляции на рост растений и приживаемостью интродуцированных бактерий.

• изучить влияние температуры, влажности и кислотности почвы на выживаемость бактерий в почве и на корнях растений и определить эффективность инокуляции.

• изучить физиологическую реакцию растений (содержание пролина и хлорофилла) на стресс при инокуляции растений.

• определить способность производственных штаммов ассоциативных бактерий к аккумуляции радионуклидов ('°8г, "'Се) и тяжелых металлов (Сё, РЬ) при культивировании на питательных средах и в почве, а также выяснить влияние тяжелых металлов на эффективность и приживаемость бактерий на корнях ячменя и поступление токсичных элементов в растения.

• оценить относительные вклады экологических факторов и генотипов партнеров в определении продуктивности растений при инокуляции.

Научная новизна.

• Впервые рассмотрен комплекс условий влияния различных агроэкологических факторов на взаимодействие ассоциативных бактерий с растениями. Установлено, что некоторые штаммы ассоциативных бактерий являются более эффективными симбионтами растений в условиях стресса, чем в оптимальных условиях

• Показано, что в условиях стресса (дефицит влаги в почве, высокая кислотность) инокуляция растений корневыми диазотрофами включает ряд защитных механизмов (снижает содержание свободного пролина и восстанавливает фотосинтетическую деятельность растений) тем самым, уменьшая стрессовое воздействие неблагоприятных факторов среды.

• Впервые показана способность изучаемых штаммов ассоциативных бактерий иммобилизовать (аккумулировать) ®°8г, '"Сб, а также изменять поглощение '"Сэ растениями.

• Установлено, что инокуляция ячменя ассоциативными бактериями на загрязненных тяжелыми металлами почвах (С<3, РЬ), способна улучшать рост, азотное питание и влиять на аккумуляцию тяжелых металлов, уменьшая их поступление в растения.

• С использованием метода двухфакторного дисперсионного анализа изучены относительные вклады экологических факторов и генотипов партнеров. Показано, что решающее влияние на эффективность ассоциативного симбиоза оказывает температура и влажность почвы, генотип растений в меньшей степени оказывает влияние на успешное

взаимодействие с растениями, а генотип бактерий вносит наименьший вклад в формирование урожая инокулированных растений.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований установлено, что изучаемые корневые диазотрофы могут быть использованы на широком спектре растений (ячмень, пшеница, овес, рис, люцерна, пекинская капуста) для увеличения их продуктивности. В условиях засухи, на кислых почвах, а так же на почвах загрязненных тяжелыми металлами, для уменьшения поступления токсичных элементов в растения, целесообразно применение биопрепарата на основе A.lipoferum 137. Использование Flavobacterium jp.L30 на кислых почвах позволит существенно (на 28,8%) повысить продуктивность кислоточувствительных сортов ячменя. Биопрепараты, на основе A.radiobacter 10 и A.mysorens 7 могут быть использованы в северных регионах в условиях прохладного климата.

Апробация работы. Результаты работы доложены на 1-ой Европейской конференции по азотфиксации (Венгрия, 1994), Международном научном симпозиуме NATO по Azospirillum и родственным микроорганизмам (Венгрия, 1994), Всероссийской конференции по биотехнологии (С-Петербург, 1994), на 10-ом Международном конгрессе по биологической фиксации азота (С-Петербург, 1995), Международном симпозиуме по взаимодействию азотфиксирующих бактерий с растениями (Саратов, 1995), 9-ом Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 1995), 7-ом Международном симпозиуме по биологической фиксации азота с небобовыми растениями (Пакистан, 1996), на 11 Международном конгрессе по биологической фиксации азота (Франция, Париж, 1997).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ и 4 работы находятся в печати.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения в 5 главах полученных результатов и их обсуждение, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах

машинописного текста, иллюстрирована рисунками, таблицами и 18

приложениями. Список литературы включает 253 наименования, из них 86 - на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследований. Объектом исследований служили штаммы ассоциативных бактерий, селекции ВНИИСХМ: Azospirillum lipoferum 137 (препарат Азоризин), Arthrobacter mysorens 7 (препарат Мизорин), Agrobacterium radiobacter 10 (препарат Агрофил) и Flavobacterium sp.L-30 (препарат Флавобактерин), на основе которых в

настоящее время изготавливаются бактериальные препараты комплексного действия для повышения урожайности многих сельскохозяйственных культур (Кожемяков, Доросинский, 1989; Васюк, 1989).

Для проведения вегетационных и полевых опытов использованы производственные сорта ярового ячменя (Hordeum vulgare) Целинный-5, Белорусский-18, Темп и Абааа, пшеница (Triticum durum), сорт Атлант, овес (Avena sativa), сорт Нарымский-943, рис(Oryza sativa), сорт Дубовский-129 и Краснодарский-424, пекинская капуста (Brassica chinensis), сорт Хибинская, райграс(1о/шот rigidum), сорт Изорский и люцерна (Medicago sativa), сорт Зайкевич.

Вегетационные опыты проводили в теплице с естественным и искусственным освещением в весенний и летний периоды. Растения выращивали в сосудах, содержащих 2,5 кг субстрата (дерново-подзолистой слабоокулыуренной почвы, выщелоченный чернозем). Для питания растений использовали смесь элементов Прянишникова с внесением азота в форме аммиачной селитры. Инокуляцию проводили при посеве, выращенными на модифицированной среде ДАС (Берестецкий с соавт., 1985) с добавлением 1г/л дрожжевого экстракта и сахарозы, Зх суточными бактериальными суспензиями в расчете 107-108 клеток на одно семя. Повторность опытов 5-кратная.

Влияние температуры среды на взаимодействие растений и диазотрофов изучали в вегетационном опыте с использованием камер искусственного климата типа "Sherer" (Канада), Средние значения температур за весь период вегетации растений составляли: 14°С для режима холодное лето; 18.5°С для режима оптимальное лею и 23°С для жаркого лета.

Для изучения влияния влажности почвы на эффективность и приживаемость корневых диазотрофов на корнях ячменя, влажность почвы поддерживали на уровне 30, 60 и 90% от ППВ регулярным поливом сосудов по весу.

Для изучения влияния кислотности почвы на эффективность инокуляции ячменя, использовали почву с рН=4.3, часть нейтрализовали мелом до рН=6.2. Содержание подвижного алюминия в почве определяли методом обратного титрования по Крупскому, основанному на образовании комплекса алюминия с трилоном Б (Петербургский, 1968).

Для изучения влияния тяжелых металлов на приживаемость корневых диазотрофов в ризоплане и эффективность ячменя, в почву вносили уксуснокислый свинец в количестве 100 мг/кг почвы и 550 мг/кг почвы), а также Cd(NCb)2 в количестве 25 мг/кг почвы и 75 мг/кг почвы.

Влияние радиоактивных элементов на эффективность и приживаемость ассоциативных бактерий изучалось в эксперименте, где в почву дополнительно вносили радиоактивный цезий в количестве 89000Бк/кг и 16600 Бк/кг.

Полевые опыты по изучению влияния тяжелых металлов на взаимодействие ассоциативных ризобактерий с растениями проводили на базе ВНИИМЗ (г. Тверь). Ячмень выращивали па дерново-подзолистой, легкосуглинистой почве, осушенной закрытым дренажем. Содержание гумуса 1,8%; N=9,88 мг/100г почвы Р205=25,9 мг/ЮОг почвы, К:0=23,2 мг/100г почвы, рН=5,8. Удобрения вносили в дозах N30P80K90.

Фоновое содержание свинца в данной почве составляло РЬ<>=14,1+0,83 мг/кг почвы, в почву искусственно вносили уксуснокислый свинец из расчета 3 ПДК РЬ (58,1+16,0 мг/кг почвы) и 10 ПДК (364+150 мг/кг почвы).

Инокуляцию увлажненных семян проводили в день посева бактериальными препаратами на основе торфа. В контрольном варианте семена только увлажняли водой.

Содержание азота в растениях и почве определяли методом Кьельдаля на полуавтоматическом анализаторе "Kjeftec auto".

Приживаемость интродуцированных штаммов изучали в ризоплане ячменя методом генетической маркировки с помощью мутантов, устойчивых к 500 мг/мл стрептомицина и к 40 мг/мл рифампицина, Для определения численности штамма A.lipoferum 137 в среду ДАС дополнительно вносили индикатор конго красный (Rodriguez-Caceres, 1982). Для идентификации интродуцируемых бактерий использовали серологический метод определения бактерий (Ladha et al.,1982).

Для оценки устойчивости растений к стрессовым условиям использовали метод Бэйтса по накоплению свободного пролина в тканях растений (Bates et al., 1973) и изменение содержания хлорофилла в листьях по методике Зеленского (Зеленский, Могилева, 1980).

Определение устойчивости ассоциативных бактерий к низким рН и содержанию А13+ изучали при выращивании бактерий на среде ДАС с созданием различных концентраций А13+ на фоне различных рН. Рост бактерий учитывали путем измерения оптической плотности (D) бактериальной суспензии при 540 нм на фотоэлектроколориметре.

Влияние ассоциативных бактерий на устойчивость различных сортов ячменя к повышенной кислотности среды и алюминию оценивали по изменению длины корней в начальные фазы развития растений в условиях гидропоники (Franco, Mums, 1982).

Определение устойчивости бактерий к тяжелым металлам проводили на среде ТМ, следующего состава (г/л): пептон-1; сахароза-1; глюкоза-1; дрожжевой экстракт-1; MgSO<-0.2;

CaCk-0.02; FeCb-0.01; NH4NO3-O.5; NaCl-O.l; агар-20; pH=6.8. Растворы тяжелых металлов, различных концентраций, стерилизовали отдельно и за тем добавляли в среду, далее репликатором проводили посев микроорганизмов на чашки со средой, содержащей тяжелые металлы.

Иммобилизацию кадмия бактериями определяли по методу Кьюрека (Kurek et aL, 1982). Концентрацию кадмия в образцах определяли с использованием атомно-адсорбционного спектрофотометра (SOLAR S929 АА).

Концентрацию I34Cs в среде, почве, бактериальной и растительной массе определяли используя сцинцилляторный гамма-спектрофотометр БДЭ-23. Бета-радиометр SBT-13 использовали для определения содержания 90Sr.

Статистическую обработку данных проводили по Лакину (Лакин, 1990). Расчеты выполняли на компьютере IBM PC AT, с использованием программ "DIANA" и "REANAL" (Воробьев с соавт., 1989).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Влияние влажности, температуры и кислотности почвы на взаимодействие корневых диазотрофов с ячменем.

Установлено, что все изучаемые штаммы способны активно колонизировать ризоплану различных растений (ячмень, пшеница, рис, овес, пекинская капуста, райграс, люцерна) и повышать продуктивность этих растений. Анализ выживаемости 4х штаммов корневых диазотрофов в почве в зависимости от ее влажности и кислотности показал, что штаммы A.lipoferum 137, A.mysorens 7 и A.radiobacter 10 были способны длительное время (более 120 дней) сохраняться в почве, и при оптимальной влажности низкая pH почвы не оказала

и

существенного влияния на выживаемость бактерий, также как и влажность почвы не повлияла на численность бактерий в нейтральной почве.

При выращивании растений при различных температурных условиях установлено, что температура почвы не оказала существенного влияния на численность ассоциативных бактерий в ризоплане ячменя. Однако, эффективность инокуляции зависела от температуры почвы (Таблица 1).

Так, инокуляция ячменя A.mysorens 7, A.radiobacter 10 и A.lipoferum 137 увеличивала урожай зерна в условиях холодного лета (14°С). В условиях жаркого лета (23°С) прибавка зерна получена при инокуляции A.radiobacter 10, A.lipoferum 137 и Flavobacterium sp. L30. В тоже время, в условиях оптимального температурного режима почвы (18,5°С) не наблюдалось

увеличение урожая зерна при инокуляции, за исключением штамма А.тузогет 7. Таким образом, наибольший эффект от инокуляции наблюдался при моделировании стрессовых для роста растений температурных условиях.

Таблица 1.

Влияние инокуляции корневыми диазотрофами на урожай зерна ячменя при различной

температуре почвы. Данные выражены как % отклонения контроля Контроль - абсолютные величины в г/сосуд.

Вариант Температура почвы

14°С 18,5°С 23°С

контроль 2,4 5,9 4,3

А.Про/егит 137 4,2 -13,7 9,3

А.ту^огет 7 25* 16,9* 0

А.гасИоЬааег 10 25* -10,2 18,6*

ЯауоЬа^епит ¡р. ЬЗО 0 -6,8 11,6

* - достоверные различия

Установлено, что влажность почвы оказала большее влияние, чем температура на приживаемость интродуцированных диазотрофов на корнях ячменя. Так, численность популяций А.тузогет 7, А.гасНоЬаЫег 10 и Па\'оЬас1епит ¡р.ЬЗО была в 10-20 раз выше при недостаточном увлажнении почвы (30% от ППВ) по сравнению с оптимальным режимом (60% от ППВ) и в условиях избытка почвенной влаги (90% от ППВ) (Рисунок 1). Влияние влажности почвы на динамику популяции А.Про/егит 137 проявилось только в условиях лимитирования роста растений минеральным азотом.

Положительное влияние на продуктивность ячменя инокуляция оказала только в условиях дефицита почвенной влаги. Так, штамм А.Про/егит 137 повысил урожай зерна на 69%, а штамм А.тузогет 7 - на 42%. Эффективность действия бактерий снижалась с увеличением влажности почвы.

Известно, что в стрессовых ситуациях в вегетативных органах растений накапливается свободный пролин, который является фактором контроля стрессовых реакций растений (Шевякова, 1983). В нормальных условиях содержание аминокислоты пролина в тканях растений низкое. Однако, оно резко повышается при действии на растение стрессовых факторов - засуха, засоление, низкое рН и т.д.

Мы показали, что корневые диазотрофы способны снижать содержание свободного пролина в растениях в условиях нарастающей засухи (Таблица 2). Наиболее сильно

содержание пролина снижалось при инокуляции растений штаммами А.гайюЪасШ 10 и МауоЬас1егшт ¿р.Ь-30, в течение всех 10 дней засухи.

^ численности, кл/г сырых корней А.Иро/егит 137

7-1 6,56 5,5 5 4,5 Н 4

-1-1-1-1-1

0 10 25 40 60 70 сутки

8 п

7,5 7 6,5 65,55

0 10 25 40 60 70 сутки

А.гайюЬасгег 10

8п 7,5 7 -6,56 5,55

ПамЬааепит эр. ЬЗО

—I-1-1-1-1

0 10 25 40 60 70 сутки

I I—I-•-1-1

О 10 25 40 60 70 сутки

Рисунок 1. Влияние влажности дерново-подзолистой почвы на приживаемость диазотрофов в ризоплане ячменя сорта Целинный - 5.

♦------♦ -30% отППВ; ■-■ -60%отППВ; А---А -90%отППВ.

Другим показателем устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды является содержание хлорофилла V и "Ь" в листьях растений. Известно, отношение хлорофилла "а" к хлорофиллу "г?" характеризует стабильность фотосинтетической системы, и уменьшение этого показателя, а также снижение общего содержания хлорофилла, свидетельствует о нарушении фотосинтетической деятельности растений (Чернядьев, 1997).

Таблица 2

Влияние засухи на содержание пролина и хлорофилла в листьях ячменя при

инокуляции растений корневыми диазотрофами.

Засуха

Вариант опыта Норма 6-е сутки 10-е сутки

Соде ржание свободного пролина, мкг/г.сыр.массы

Без инокуляции 20,8 380 1617

A.lipoferum 137 15,5* . 331* 1582

A.mysorens 7 15,9* 278* 1587

A.radiobacter 10 18,5 144* 1093*

Flavobacterium sp.L30 18,9 161* 1175*

HCPo.05 4,77 46,7 132

Соотношение хлорофилла в растениях, хл "а"/хл "А", мкг/г.сырой массы

Без инокуляции 2,58 2,25 2,23

A.lipoferum 137 2,62 2,32 2,50*

A.mysorens7 2,95* 2,91* 2,36

A.radiobacter 10 2,71* 2,83* 2,32

Flavobacterium ,sp.L30 2,50 2,52* 2,53*

HCP 0,05 0.12 0.18 0.21

*- достоверные различия

Мы показали, что инокуляция корневыми диазотрофами стимулирует фотосинтетическую деятельность растений, за счет увеличения содержания более физиологически активного хлорофилла "а". В условиях нарастающей засухи происходит нарушение процесса фотосинтеза, в то же время, инокуляция A.mysorens 7, A.radiobacter 10 и Flavobacterium jp.L-30 восстанавливает фотосинтетическую деятельность растений (Таблица 2).

Другим фактором среды, влияющим на рост растений, а также на активность почвенных микроорганизмов, является концентрация водородных ионов в почвенном растворе. Нами установлено, что in vitro изучаемые штаммы ассоциативных бактерий устойчивы к низким значениям рН высоким концентрациям алюминия, за исключением A.lipoferum 137 для которого ингибирование роста наступало при рН=5,0. При интродукции в почву все ассоциативные бактерии активно колонизировали ризоплану ячменя сорта Целинный-5 как в кислой, так и нейтральной почве (Таблица 3). Максимальный эффект от

инокуляции получен когда растения выращивали на кислой почве. Наиболее эффективными были штаммы А.Нро/егит 137 и Р1сп>оЬас1епит зр.Ъ30, которые в условиях стресса (рН=5,0) давали наибольшую прибавку урожая (Таблица 3).

Таблица 3

Влияние кислотности почвы на взаимодействие ризобактерий с ячменем.

(Контроль - абсолютные величины, г/сосуд).

Вариант опыта рН=5,0 рН=6,1

Урожай зерна (прибавка в % к контролю)

контроль 5,9 6,4

А.Нро/егит 137 28.8* 12.5

А.тузогепя 7 16.9 0

А.гасИоЬас1ег 10 15.3 3.1

ПстоЬааегЫт ¿р.ЬЗО 28.8* 4.7

Масса соломы (прибавка в % к контролю)

контроль 9,5 10,6

А.Нро/егит 137 12,6 -1,9

А.тузогеги 7 4,2 -5,7

А.гасИоЬасХег 10 20,0* -9,5

Е1ауоЬас1егшт хр.ЬЗО 11,6 -3,8

Численность бактерий в ризоплане, №г сырых корней

А.Нро/егит 137 5,63±0,09 5,63+0,07

А.тучогет 7 6,40+0,06 7,04+0,05

А.гасИоЬа&ег 10 6,66+0,07 6,66+0,15

ПтоЬаМегтт лрХЗО 5,61+0,12 5,27+0,08

Содержание свободного пролина, мкг/г.сыр.массы

рН=43 рН=5,0

Без инокуляции 7,3 4,2

А.Нро/егит 137 1,2* 0,9*

А.ту50геп51 8,1 4,2

А.гаНоЪасШ 10 3,2 3,0

ПсмоЪаШггит ¿р.ЬЗО 1,6* 1,2*

НСРо.05 5,2 2,0

* - достоверные различия

Показано, что с увеличением кислотности почвы в корнях ячменя происходит накопление свободного пролина. В то же время, инокуляция штаммами А.Нро/егит 137 и ИауоЬаМпит ¿гр.ЬЗО достоверно снижала содержание аминокислоты пролина в корнях. Возможно, микроорганизмы активизируют адаптацию растений к кислой среде за счет продуцирования биологически активных веществ, улучшая азотное и фосфорное питание (Кравченко с соавт., 1993). Также известно, что азоспириллы имеют способность усиливать выброс протонов через мембрану корней и стабилизировать кислотность среды в ризосфере пшеницы за счет продуцирования биологически активных веществ (ВавЬап, 1990).

2. Влияние радионуклидов и тяжелых металлов на взаимодействие корневых дпазотрофов с растениями.

Мы показали, что все изучаемые ассоциативные бактерии были способны аккумулировать радиоактивный цезий и стронций в жидких питательных средах, причем наибольшее накопление радиоактивных элементов наблюдалось у А.Иро/егит 137.

Таблица 4

Урожай и накопление 134Сз растениями ячменя, инокулированного ассоциативными

бактериями.

Вариант Корни Солома Зерно В сумме

Урожай ячменя, г./сосуд.

Без инокуляции 2,4 9,1 7,9 19,4

А.Иро/егит 13 7 1,8 10,0* 8,6 20,4

Па\'оЬас1епит. ¡р.ЬЗО 2,3 11,3* 8,7 22,3*

НСР0 05 1,0 0,8 1,3 2,3

Содержание шСв, Вд г"1

Без инокуляции 5.1 1.4 0.43 6,93

А.Иро/егит 137 4.3* 0.9* 0.38 5,58*

ЯстоЬааегшт. 5р.ЬЗО 4.8 1.5 0.50 6,80

НСРо 05 0.7 0.3 0.13 1,13

Поступление и4Сз, Вд сое"1

Без инокуляции 12.3 127 3.4 28.4

А.Иро/егит 137 7.3 9.1* 3.2 19.6*

ЯтоЪааегтт. ¡р.¿30 15.9 16.8* 4.3 37.0*

НСРо.05 5.4 3.4 1.1 7.7

* - достоверные различия

Инокуляция ячменя Л.Про/егит 137 снижала содержание (на 17%) и поступление 134Сэ (на 30%) по сравнению с неинокулируемым контролем (Таблица 4). В то же время инокуляция ПтоЬасШ'тт зр.ЬЗО увеличивала накопление радиоактивного цезия в растениях ячменя за счет увеличения биомассы растений.

Влияние тяжелых металлов на ассоциативных ризобактерий и взаимодействие их с растениями изучалось в модельных, вегетационных и полевьк опыта:;. Установлено, что все изучаемые бактерии устойчивы к высоким концентрациям тяжелых металлов (РЬ, Си, С<1, 7x1, Нд, Мо) в питательной среде за исключением ахоЪас1епит ¿рХЗО, который чувствителен к кадмию в среде в концентрации >0.5 мгСс!/л.

Интродуцируемые бактерии активно колонизировали корни ячменя, выращенного на почве загрязненной свинцом и кадмием, за исключением Р1атЬас!егшт зр.ЬЗО, который не :пособен выживать в ризоплане ячменя, при загрязнении почвы кадмием.

В то же время, инокуляция ассоциативными бактериями на почве загрязненной 25 мгСЯ/кг значительно увеличивала содержание азота в растениях, но не влияла на урожай ячменя (Таблица 5). Однако, при выращивании на сильнозагрязненной почве кадмием (75 мгС(3/кг) биомасса ячменя резко уменьшалась и при этом содержание азота в растениях особенно сильно возрастало в неинокулируемом контроле. Это свидетельствует о нарушении роста и азотного метаболизма растений на фоне сильного загрязнения почвы тяжелыми металлами.

Однако, инокуляция растений корневыми диазотрофами существенно снижала содержание общего азота в растениях, причем с уменьшением содержания кадмия в ячмене уменьшалось содержание азота и возрастал урожай. Вероятно, это связано с тем, что инокуляция ассоциативными бактериями уменьшала стрессовое влияние тяжелых металлов за счет улучшения азотного обмена в растениях. Инокуляция ячменя изучаемыми бактериями значительно (в 2-4 раза) уменьшала содержание кадмия в растениях.

Таблица 5

Влияние инокуляции ассоциативными бактериями на урожай ячменя, содержание азота и

аккумуляцию тяжелых металлов растениями.

Сухая масса, г/сос. Содержание И, % Содержание

Вариант СУ в растениях,

зерно солома зерно солома мг/сос

Почва без металлов

Без инокуляции 10,1 -9,4 1,7 0,46 0,030

АМро/егит 137 9,6 8,6 1,7 0,46 0,014

А.туяцгет.? 9,4 8,5* 1,7 0,48 0,026

А.гасИоЬааег 10 10,2 9,5 1,8 0,50 0,012

Ма\-оЬас(ег. хр.ЬЗО 9,5 8,7 1,7 0,48 0,021

НСРо.о5 1.1 0,86 0,2 0,04 0,021

С<1,25 иг/кг

Без инокуляции 11,7 9,6 1,7 0,46 16,6

АМро/егит 137 10,7 8,9 1,7 0,52* 13,2

А.тухогею 7 11,3 9,0 1,9 0,53* 6,2*

А.гасИоЬасСег 10 10,8 9,1 2,0 0,54* 5,9*

НскоЪаМег. $р.Ь30 11,0 9,9 2,1* 0,54* 6,4*

НСРо.оз 1,1 0,8 0,31 0,05 5,9

са, 75 мг/кг

Без инокуляции 0,6 2,9 10,6 1,7 103

АМро/егит 137 5,1* 6,7* 2,4* 1,0* 27*

А.туьогегк 7 3,4* 5,8* 2,6* 1,4 28*

А.гасИоЬаМег 10 4,9* 5,9* 2,4* 0,9* 25*

Ясп/оЬааег. йр.ЬЗО 6,1* 6,4* 2,4* 0,8* 29*

НСРо.05 2,5 1,2 0,5 0,34 8

* - достоверные различия

Таким образом, показано, что инокуляция ассоциативными бактериями способна улучшать рост, азотное питание и влиять на аккумуляцию тяжелых металлов растениями, выращенных на загрязненных почзах.

Совместно с ВНИИ мелиорированных земель была проведена серия полевых опытов по изучению влияния тяжелых металлов на взаимодействие корневых диазотрофов с растениями.

Показано, что загрязнение почвы свинцом не оказало отрицательно действия на приживаемость интродуцируемых бактерий. Инокуляция ассоциативными бактериями достоверно увеличивала урожай зерна ячменя на слабозагрязненной свинцом почве, в то же время на почве без металлов инокуляция была неэффективной, за исключением ИскоЬайепит зр.ЬЗО, который достоверно увеличивал урожай ячменя (Таблица 6). Однако, при этом бактеризация повлияла на качество продукции.

Таблица 6

Влияние корневых диазотрофов на урожай и качество ячменя, выращенного на

загрязненной свинцом почв г.

Урожай, ц/га Содержание РЬ, Накопление РЬ,

Доза РЬ Вариант мг/кг г/га

зерно солома зерно солома зерно солома

Без инокуляции 42,5 88,7 0.39 1.39 1,6 6 12,3

- А.Нро/егит 137 41,3 80,5 0.28* 1.17 1,16* 9,42*

Фон А.тувогепз 7 41,1* 85,2 0.20* 1.17 0,81* 10,0

А.гаЛоЪаШг 10 36,8* 72,3 0.33* 1.13 1,21* 8,20

ЯсгюЬааег. ¡р. 130 43,8* 99,2 0.34* 1.27 00 • 12,6

НСР0,05 1,2 21,3 0.02 0.27 0,04 2,7

Без инокуляции 41,1 75,8 0.39 3.22 1,62 24,4

% пшт А.Нро/егит 137 42,7* 89,8 0.29* 3.27 1,23* 29,4

А.тузогепя 7 42,6* 107,3* 0.35* 4.16 1,48* 44,6*

РЬ А.гаЛоЬасГег 10 39,8 89, 0.39 5.07 1,55* 45,5*

Нсп/оЬашг. яр. 130 44,4* 80,5 0.32* 3.49 1,42* 28,1

НСРо.и 1,49 20,5 0.03 2.31 0,05 8,1

Без инокуляции 45,9 87,5 0.40 8.31 1,81 72,7

А.Нро/егит 137 46,2 103,8 0.30* 12.0 1,40* 124,6*

ШНДГУ, А.тувогет 7 45,1 102,7 0.32* 7.92 1,46* 81,3

РЬ А.гсиНоЪааег 10 41,6* 93,3 0.42 10.2 1,75* 95,2

ПауоЬас1ег. яр.ЬЗО 42,5 99,2 0.37 10.7 1,56* 106,1*

НСРо.о5 1,38 27,2 0.04 5.75 0,52 25,7

* - достоверные различия

Следует особо отметить, что под действием всех бактериальных культур происходило снижение содержания свинца в зерне ячменя: А.Нро/егит 137 - на 39%, А.туяогепз 7 - на 97%;

A.radiobacter 10 - на 19%; Flavobacterium jp.L30 - на 15%, что важно в условиях интенсивного поступления свинца в окружающую среду.

В то же время содержание и накопление свинца в соломе возрастало. Это связано с наличием двух элементо-статических барьеров в растениях на границе корень-стебель и стебель-зерно, которые препятствуют накоплению токсичных элементов в зерне, и тем самым способствуют увеличению токсичных элементов в соломе, а также с градиентом концентрации этих элементов, за счет чего их концентрация в зерне меньше, чем в соломе. Также было установлено, что бактеризация оказывает значительное влияние на элементный состав зерна и соломы ячменя, увеличивая содержание жизненно-необходимых макроэлементов, таких как Р, S, К, Ca и снижая содержание тяжелых металлов - Cd, Ва, Cr, Pb, As и других.

Механизмы протекторного действия интродуцируемых бактерий могут быть весьма разнообразны: растворение или осаждение тяжелых металлов за счет изменения pH и окислительно-восстановительного потенциала среды, изменения валентности элементов, продуцирования хелатирующих веществ и сидерофоров, а также биосорбции и биоаккумуляции элементов (Francis, 1990; 1994; Gadd,1990; White et al., 1997). Другой механизм влияния микроорганизмов на поступление токсичных элементов в растение может быть связан с их положительным влиянием на рост и питание растений, за счет продуцирования фитогормонов (Rubio et al., 1994; Hasnain and Sabri, 1996), а также за счет улучшения азотного обмена растений, который играет ключевую роль в адаптации растений к стрессовым условиям.

" Таким образом, инокуляция ячменя ассоциативными бактериями способствует снижению токсичного действия тяжелых металлов на растения, путем улучшения азотного питания растений, нормализации химического состава растений, уменьшения поступления металлов в растения за счет перевода последних в недоступное для растений состояние, в целом повышая устойчивость растений к негативному действию тяжелых металлов.

3. Вклады различных факторов в определение эффективности взаимодействия ассоциативных ризобактерий с растениями.

С использованием метода двухфакгорного дисперсионного анализа измерены суммарные вклады факторов (генотипа бактерий, генотипа растений, температуры, влажности и кислотности почвы) в определении эффективности взаимодействия партнеров ассоциативного симбиоза Установлено, что при взаимодействии различных сортов (видов) растений и штаммов бактерий урожай растений существенно зависит от генотипа растения и

влияния "неконтролируемых" факторов (случайное варьирование или ошибка опыта) (Таблица 7). В то же время влияние температуры и влажности почвы вносит наибольший вклад в формирование эффективного ассоциативного симбиоза, где эти факторы (температуры и влажности) контролируют 80-87% от общего варьирования признака. Однако, в случае определения влияния кислотности почвы на взаимодействие ассоциативных бактерий с растениями показано, что этот фактор контролирует всего 30-40% варьирования урожая.

Таблица 7

Вклады экологических и генотипических факторов в определение эффективного взаимодействия растений с ассоциативными ризобактериями (среднее по опытам).

Виды факторов Изучено Вклады факторов в общее варьирование признака (%)

Штаммы (А) Факторы (В) А В АВ г

генотип растений 4 4 5,7 33,5 10,0 50,8

температура 4 3 2,27 87,6 9,39 0,74

влажность почвы 4 3 6,07 81,7 5,19 7,07

рН почвы 4 3 4,34 39,0 2,51 53,7

Таким образом, решающее влияние на эффективность ассоциативного симбиоза оказывает температура и влажность почвы, генотип растений в меньше степени оказывает влияние на успешное взаимодействие ризобактерий с растениями, а генотип бактерий вносит наименьший вклад в формирование урожая инокулированных растений.

ВЫВОДЫ

1. Все изученные ассоциативные ризобахгерии способны активно колонизировать ризоплану различных видов и сортов растений (ячмень, пшеница, овес, рис, пекинская капуста, райграс, люцерна) и длительное время (более 120 суток) сохраняться в почве при разных агроэкологических условиях.

2. Температура почвы существенно не влияет на приживаемость корневых диазотрофов в ризоплане ячменя. Однако, при низкой температуре почвы 14°С инокуляция А.тутгел* 7 способна повышать продуктивность растений на 25%, а инокуляции А.гасИоЬаМег 10 в условиях экстремальных температур (14°С и 23°С) на 25% и 19%, соответственно.

3. Влажность почвы оказывает существенное влияние на колонизацию ризопланы и эффективность взаимодействия интродуцированных бактерий с растениями. В условиях

засухи (30% от ППВ) получен наибольший эффект от инокуляции A.lipoferum 137 и A.mysorens 7 (прибавка до 69%) на продуктивность растений.

4. Кислотность почвы оказала влияние на приживаемость бактерий и зависела устойчивости сортов ячменя к низким рН. Однако, инокуляция A.lipoferum 137 и Flavobacterium sp.LîQ существенно (на 28,8%) повысила продуктивность кислоточувствительных сортов ячменя при низких значениях рН (рН=4,5-5,0) почвы.

5. Все изученные культуры ассоциативных азотфиксаторов способны аккумулировать n4Cs и ,0Sr и влиять на поступление тяжелых металлов в растения. A.lipoferum 137 наиболее активно аккумулирует радионуклиды и тяжелые металлы, препятствуя поступлению их в растения.

6. Инокуляция повышает содержание биофильных элементов, таких как Р, К, Са и оказывает влияние на поступление микроэлементов в растения.

7. Показано, что в экстремальных условиях (дефицит влаги в почве, высокая кислотность) инокуляция корневыми диазотрофами оказывает антистрессовое воздействие на растения, включая рад защитных механизмов устойчивости растений, таких как снижение содержания свободного пролина и восстановление фотосинтетической деятельности растений.

8. С использованием метода двухфакторного дисперсионного анализа показано, что экологические факторы контролируют 50-90% варьирования урожая, генотип растения - 30%, а генотип бактерий - 5-10%

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Белимов А.А., Поставская С.М., Хамова О.Ф., Кожемяков А.П., Кунакова А.М., Груздева Е.В. Приживаемость и эффективность корневых диазотрофов при инокуляции ячменя в зависимости от температуры и влажности почвы. Микробиология, 1994, № 5.,т.63, с.900-908.

2. Kunakova А.М., Gruzdeva E.V., Sokova S M., Ivanchikov A.U., Belimov A.A., Kojemyakov A.P. Survival of bacteria applied as biofertilizers in soil and rhizoplane of inoculated plants. Int. Conf. "Biotechnology St. Petersburg'94", Sept. 21-23,1994,p.l28-129.

3. Kojemyakov A.P., Belimov A A., Kunakova A.M. The efficiency of inoculation and survival of nitrogen fixers in rhizoplane of barley grown under stress ecological conditions. Abstr. 1th European Nitrogen Fixation Conference, Aug.28 - Sept.2,-Szeged, Hungary, 1994, p.105.

4. Kojemyakov A.P., Belimov A.A., Kunakova A.M. Population dynamics of associative nitrogen fixers on roots and their interaction with inoculated plants. "NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Microorganisms., 3-7 Sept., Sarvar, Hungary, 1994.

5. Kunakova A.M., Peshkova S.S., Gruzdeva E.V., Belimov A.A., Kozhemyakov A.P. Effect of soil acidity and nitrogen status of barley on survival of associative nitrogen fixers on roots and response of plants to inoculation. Abstr. Int. Work, on Associative Interactions of Nitrogen-Fixing Bacteria with Plants, Saratov, Russia, June 5-8,1995, p.49.

6. Belimov A.A., Kunakova A.M., Alekseyeva E.G., Martsinkevitch O.N., Kojemyakov A.P. Survival of associative nitrogen fixers in rhizoplane as a criterion for estimation of their effect on inoculated plants. Azospirfflum VI and Related Microorganisms. NATO ASI Series, Vol.G37, edited by I.Fendric., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, 1995. p.535-542.

7. Belimov A.A., Kunakova A.M., Gruzdeva E.V., Vasilyeva N.D., Vorobyev N.I., Kojemyakov A.P., Khamova O.F., Postavskaya S.M., Sokova S.M. Relationship between survival rates of associative nitrogen fixers on roots and yield response of plants to inoculation. FEMS Microbiol. EcoL, 1995, Y.17, p.187-196.

8. Belimov A.A., Kunakova A.M., Khamova O.F., Postavskaya S.M., Sokova S.A., Gruzdeva E.V., Vorobyev N.I., Kozhemyakov A.P. Survival of associative bacteria on roots and efficiency of inoculation under various environmental conditions. Nitrogen fixation: Fundamentals and Applications, Proc. 10th Int. Congr. on Nitrogen Fixation, St.-Petersburg, May, 1995, Ed. I.A.Tikhonovich et al., Kluwer Acad. Publ., p.751.

9. Kozhemyakov A.P., Chernyaeva I.I., Belimov A.A., Kunakova A.M., Fomenko E.V., Yudkin L.Y., Stepanok V.V., Rabinovitch G.Y., Cherenok I.V. Effect of inoculation with nitrogen fixing bacteria on heavy metals and radionuclides uptake by the plants grown in contaminated soils. Nitrogen fixation: Fundamentals and Applications, Proc. 10th Int. Congr. on Nitrogen Fixation, St.-Petersburg, May, 1995, Ed. I.ATikhonovich et al., Kluwer Acad. Publ., p.765.

Ю.Белимов А. А., Кулакова A.M., Груздева E.B., Хамова О.Ф., Поставская С.М. Повышение устойчивости растений к засухе при инокуляции ассоциативными азотфиксаторами. Тез. докл. "9-й Баховский колл. по азотфиксадии", Москва, 24-26 янв., 1995, с.74.

11.Belimov A.A., Kunakova А.М., Dritchko V.F., Tashmukhamedova I.R., Alekseyev Yu.V. Tolerance to and immobilization of heavy metals and radionuclides by nitrogen Fixing bacteria. Abst:

1Л International Symposium on BNF with Non-Legumes, Oct. 16-21, 1996, Faisalabad, Pakistan, p.163.

12.Kojernyakov A.P., Belimov A.A., Kimakova A.M. Associative nitrogen-fixing bacteria: colonization of the roots and efficacy on non-legumes plants. Biological Nitrogen Ffixation for the 21st Centure, Proc. 11th Int. Congr. on Nitrogen Fixation, Paris, France, July 20-25, 1997, Ed. С .Elmerich et al., Kluwer Acad. PubL, р.39б.

13.Belimov А.А, Kunakova A M, Vasilyeva N.D.,.Kovatcheva T.S, Dritchko V.F., Kuzovatov S.N., Trushkina I.R., Alekseyev Yu.V. Accumulation of radionuclides by associative bacteria and the uptake of 13<Cs by the inoculated barley plants. In: Nitrogen Fixation with non-legumes. Ed. K. A.Malik et al., Klu. Acad. Publ., 1998, p.276-280 (в печати).

14.Belimov A.A., Kunakova A.M., Kozhemiakov A.P., Stepanok V.V., Yudkin L.Y. Effect of associative bacteria on barley grown in heavy metal contaminated soiL Proc. Int.Symp. "Agroenvironmental-98", May 25-30, 1998, Faisalabad, Pakistan (в печати).

15.Kunakova A.M., Belimov A.A., Gruzdeva E.V., Kozhemyakov A.P. The response of barley cultivais to inoculation with associative bacteria depends on soil pH. Abstr: 8a International Symposium on Microbial Ecology, August 9-14,1998, Halifax, Canada (в печати).

16.Белимов A.A., Кунакова A.M., Груздева E.B. Влияние pH почвы на взаимодействие ассоциативных бактерий с ячменем. Микробиология, 1998, №4 (в печати).