Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выживание и гибель кардиомиоцитов при генетически обусловленной миодистрофии мышей mdx

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Выживание и гибель кардиомиоцитов при генетически обусловленной миодистрофии мышей mdx"

На правах рукописи

ООЗ165308

Веженкова Ирина Владимировна

ВЫЖИВАНИЕ И ГИБЕЛЬ КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ ГЕНЕТИЧЕСКИ ОБУСЛОВЛЕННОЙ МИОДИСТРОФИИ МЫШЕЙ МБХ

03 00 25 - гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 з МАР 2008

Санкт-Петербург 2008

003165308

Работа выполнена в Институте цитологии РАН

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Михайлов Вячеслав Михайлович Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты доктор биологических наук, профессор Михельсон Виктор Михайлович Институт цитологии РАН

доктор медицинских наук Гудкова Александра Яковлевна

Институт сердечно-сосудистых заболеваний Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им акад И П Павлова

Ведущая организация Биолого-почвенный факультет Санкт-Петербургского государственного университета

Защита состоится 21 марта 2008 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 230 01 при Институте цитологии РАН по адресу 194064 Санкт-Петербург, Тихорецкий пр , д 4 Электронная почта се11Ью1@та11 с^рЬ ги

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан_февраля 2008г

Ученый секретарь кандидат биологических наук

Диссертационного совета Е В Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Изучение механизмов дифференцировки клеток и регенерации тканей, в частности механизмов миогенеза и регенерации мышц - одна из важнейших проблем клеточной биологии и биологии развития (Румянцев, 1982) Многоклеточные организмы сформированы из множества специализированных клеточных популяций По наличию клеточного обновления популяции были разделены на обновляющиеся, растущие и статические К последним были отнесены нейроны и кардиомиоциты млекопитающих (Leblond, 1964) Эта классификация подвергается уточнениям У грызунов возможна реактивация синтеза ДНК в кардиомиоцитах желудочков сердца в пределах 0 1-05% через 3-30 сут после инфаркта миокарда (Румянцев, 1982) У людей описаны митозы кардиомиоцитов в околоинфарктной зоне (Beltrami et al, 2003)

Кардиомиоциты взрослых млекопитающих - это высокодифференцированные, высокоорганизованные клетки, специализированные для выполнения функции сокращения Ограниченная способность сердечных миоцитов (особенно желудочковых) к пролиферации в постнатальном кардиомиогенезе позволяет многим авторам определять кардиомиоциты млекопитающих как популяцию некамбиального типа В то же время кардиомиоциты способны к довольно быстрой и эффективной реорганизации своей внутренней структуры при изменении условий существования (например, при гиперфункции органа или снижении притока пластических веществ) за счет усиления или снижения процессов внутриклеточной регенерации (Саркисов, 1977)

Способность кардиомиоцитов млекопитающих к такого рода изменениям их составляющих делает эти клетки удобной моделью для изучения характера адаптивно-компенсаторных реакций в клетках, способных к реактивации митотического цикла в очень ограниченной степени Это не позволяет отнести ни одну из разновидностей кардиомиоцитов (желудочковые, предсердные, проводящей системы), даже у взрослых млекопитающих, к чисто статической (необратимо постмитотической) популяции клеток (Румянцев, 1982) Это обстоятельство так же, как и способность кардиомиоцитов некоторых видов млекопитающих (грызуны, приматы, человек) к полиплоидизации, определяет особенности регенерации сердечных миоцитов

В настоящее время накапливаются данные об участии стволовых клеток в регенерации миокарда (Dawn et al, 2005, Kajstura et al, 2005, Torella et al, 2007) Точная оценка вклада

так называемых стволовых клеток или клеток-предшественников кардиомиоцитов в поддержание и обновление клеточного состава миокарда требует дополнительных исследований (Flugelman, Lewis, 2004, Liao et al, 2007) Однако независимо от результатов решения вопроса об отнесении кардиомиоцитов к популяции обновляющегося типа не вызывает сомнения, что основную массу клеток миокарда представляют терминально дифференцированные кардиомиоциты «с достаточно жесткой репрессией синтеза ДНК и митозов» (Румянцев, 1982)

Так как обновление и тем более скорость обновления кардиомиоцитов пока остаются неизвестными, будем придерживаться мнения, что терминально-дифференцированные кардиомиоциты млекопитающих функционируют в миокарде неопределенно продолжительное время Следовательно, встает вопрос о выживаемости этих клеток Одним из подходов к анализу выживаемости кардиомиоцитов может быть использование животных с генетическим дефектом - мышей mdx Отсутствие в сократительных клетках мутантных мышей mdx синтеза белка дистрофина сопровождается развитием в них окислительного стресса, вызывающего гибель клеток

Таким образом, сократительные клетки мышей mdx являются моделью выживания клеточных популяций в условиях окислительного стресса Исходя из этого, изучение цитохимических особенностей кардиомиоцитов при генетически обусловленной кардиомиодистрофии на модели мышей mdx приобретает несомненную актуальность

Цель и задачи исследования

Цель работы заключалась в выяснении цитологических механизмов выживания и гибели кардиомиоцитов при генетически обусловленной миодистрофии мышей mdx методами авторадиографии, иммуноморфологии и морфометрии после динамического стресса Были сформулированы следующие экспериментальные задачи

1 Изучение включения 3Н-тимидина в кардиомиоциты мышей mdx и С57В1 до и после стресса

2 Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx и С57В1 до и после динамического стресса

3 Анализ динамики экспрессии гена р53 до и после динамического стресса

4 Морфометрический подсчет изменений концентраций кардиомиоцитов в миокарде мышей mdx и С57В1 до и после стресса с целью вычисления клеточной потери кардиомиоцитов мышей mdx и С57В1, вызываемой динамическим стрессом

Основные положения, выносимые на защиту

1 Кардиомиоциты мышей С57В1 характеризуются низким уровнем частоты обнаружения двунитевых разрывов ДНК (ДрДНК) Динамический стресс в сочетании с охлаждением организма усиливает образование ДрДНК Через 1 сут после стресса частота обнаружения ДрДНК в нормальных кардиомиоцитах уменьшается до контрольного уровня

2 Частота обнаружения ДрДНК в кардиомиоцитах мышей тёх при обычных условиях содержания животных превосходит таковую в кардиомиоцитах мышей Динамический стресс усиливает образование ДрДНК Через сутки после стресса частота обнаружения ДрДНК в кардиомиоцитах мышей тёх уменьшается до исходного уровня

3 После динамического стресса кардиомиоциты мышей тёх включают 3Н-тимидин в ядра

4 Динамический стресс усиливает экспрессию белка р53 в кардиомиоцитах мышей С57В1 и тс1х Динамика экспрессии белка р53 мышей тёх коррелирует с динамикой появления ДрДНК

5 Концентрация кардиомиоцитов в миокарде мышей тёх ниже, чем в миокарде мышей С57В1, а суточная потеря кардиомиоцитов у мышей тёх после динамического стресса превышает таковую у мышей С57В1

6 Репарация ДрДНК является одним из основных механизмов выживания кардиомиоцитов мышей тёх после динамического стресса

Научная новизна работы

Впервые исследована частота обнаружения ДрДНК у кардиомиоцитов мышей С57В1 и тёх в условиях динамического стресса в сочетании с охлаждением организма Впервые произведен подсчет частоты включения 3Н-тимидина у кардиомиоцитов мышей С57В1 и тёх в условиях динамического стресса в сочетании с охлаждением организма Впервые изучена экспрессия белка р53 в кардиомиоцитах мышей С57В1 и тёх в отсутствие динамического стресса, через час и через 24 ч после стресса Впервые определено, что динамика экспрессии белка р53 в кардиомиоцитах мышей тёх коррелирует с динамикой появления ДрДНК Впервые с использованием усовершенствованного метода морфометрии подсчитана концентрация кардиомиоцитов в миокарде мышей С57В1 и тёх Впервые произведен учет суточного снижения концентрации кардиомиоцитов у мышей С57В1 и тёх после динамического стресса

Теоретическое и практическое значение работы

Представление о «достаточно жесткой репрессии синтеза ДНК и митозов» основной массы терминально дифференцированных кардиомиоцитов миокарда млекопитающих сделало одной из основных задач теоретической и практической биологии кардиомиоцитов изучение их выживания и гибели при неблагоприятных ситуациях, возникающих в миокарде в случае патологии В нашем случае неблагоприятными ситуациями были состояние окислительного стресса мутантных кардиомиоцитов мышей mdx и плавание при низкой температуре, усиливающие состояние окислительного стресса Сопоставление динамики ДрДНК и уровня клеточной потери позволило заключить, что репарация ДрДНК является одним из основных механизмов выживания кардиомиоцитов мышей mdx после динамического стресса Кроме того, положительная корреляция динамики ДрДНК и экспрессии гена р53 указывает на участие активности гена р53 в регуляции гибели и выживания кардиомиоцитов Этот результат свидетельствует о том, что по механизму регуляции выживания и гибели кардиомиоциты млекопитающих соответствуют клеткам обновляющихся клеточных популяций В совокупности представленные результаты показывают, что миокард мышей mdx является экспериментальной моделью кардиомиопатии Полученные результаты и методы могут быть с успехом использованы для изучения кардиомиоцитов человека при различных формах сердечной патологии

Материалы диссертации также могут быть включены в курсы лекций по клеточной биологии для студентов медицинских и биологических специальностей высших учебных заведений

Апробация работы

В ходе выполнения работы ее результаты регулярно обсуждались на совместных семинарах Группы генетики клеточных популяций и Лаборатории патологии клетки Института цитологии РАН Материалы работы представлены на следующих научных собраниях Съезд Общества клеточной биологии, (Санкт-Петербург, октябрь 2003), Международный симпозиум "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия" (Санкт-Петербург, октябрь 2004), XV Всероссийское совещание "Структура и функции клеточного ядра" (Санкт-Петербург, октябрь 2005), Международная конференция "Acute Cardiac Care" Европейского Общества Кардиологов, (Prague, Czech Republic, October 2006), Политехнический симпозиум, конференция "Молекулярная и структурная биология", (Санкт-Петербург, декабрь 2006), 2-й съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-

Петербург, октябрь 2007), Всероссийский национальный конгресс кардиологов (Москва, октябрь 2007)

Публикации по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 5 статей в отечественных и зарубежных профильных журналах, а также тезисы 8 докладов на всероссийских и международных конференциях и съездах

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, использованных в работе, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 142 ссылки Материалы диссертации изложены на 120 страницах текста и иллюстрированы 22 рисунками и 11 таблицами

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Объектами исследования был миокард левых желудочков сердец двух групп мышей -С57В1 и mdx массой 20+0 5г Мыши С57В1 были получены из питомника "Рапполово" Мыши mdx были представлены д-ром Т Партриджем (Hammersmith Hospital, London) и получены для содержания от чл-корр РАМН, проф ВС Баранова (НИИ акушерства и гинекологии им Отта РАМН, Санкт-Петербург)

Две подгруппы мышей (С57В1 st(+) и mdx st(+)) подвергали умеренному динамическому стрессу - плаванию в течение 5 мин в воде при температуре 12 °С Такая нагрузка не вызывала гибели животных Другие 2 подгруппы мышей (С57В1 st(-) и mdx st(-)) не плавали и служили контролем

Сердца для анализа брали у мышей под диэтиловым эфирным наркозом через час и через сутки после введения 3Н-тимидина Срезы толщиной 7 мкм получали на криостате Bright С" LTD (Великобритания), фиксировали двумя способами часть срезов - смесью этанола и метанола 1 1 в течение 3 мин при -20 °С, часть - в 10%-ном растворе формалина Для авторадиографического исследования кусочки миокарда заливали в твердый парафин при 70 °С (Sigma, США) и готовили срезы толщиной 5 мкм

Метод авторадиографии (Жинкин. 1959) В работе была использована жидкая фотоэмульсия типа М или Р производства НИИХИМФОТОПРОЕКТ, Москва Современные фотоэмульсии содержат все необходимые для нанесения инградиенты (дубитель и пластификатор) Для приведения в рабочее состояние эмульсии необходимо только развести дистиллированной водой в соответствующее число раз Депарафинированные срезы помещали в дистиллированную

воду на 1-2 мин Дальнейшая работа велась в темной комнате при желто-зеленом свете фонаря Стекло со срезом опускали на несколько секунд в стаканчик с эмульсией, стоящий на водяной бане Затем стекла просушивали 2-3 ч, складывали в светонепроницаемые коробки и убирали в холодильник Стекла экспонировали в течение месяца или более Проявление вели в проявителе Д-19 при температуре 19-20 °С в течение 6 мин Затем переносили стекла в фиксатор 40%-ный раствор гипосульфита при температуре +12 °С Срезы держали 6 мин до полного просветления эмульсии, а затем переносили в воду Проводили обезвоживание в ряду спиртов возрастающей концентрации и в двух порциях ксилола В последней порции оставляли на ночь Заключали в бальзам Докрашивали препараты гематоксилином Майера или красителем Гимза

Метод (ПАШ Шолак. 1987>

В работе использован кроличий растворимый комплекс пероксидаза-антипероксидаза (ПАП) Депарафинированные срезы помещали в дистиллированную воду на 1-2 мин Споласкивали срезы в растворе PBS (фосфатно-солевой буфер), рН - 7 3 Инкубировали срезы в 0 1%-ном растворе трипсина в PBS в течение 10 мин Споласкивали срезы в растворе PBS, рН - 7 3 Инкубировали срезы в 1%-ном растворе яичного альбумина в PBS в течение 20 мин Споласкивали срезы в растворе PBS, рН - 7 3 При использовании непрямого иммуноморфологического метода использовали кроличьи моноклональные антитела к синтетическому карбокситерминальному пептиду CKATQAS(P04)QEY гистона у-Н2АХ (Stressgene, США) и моноклональные антитела к а-саркомерному актину в разведении 1 200 (Sigma, clone 5С5, США) Оставляли на ночь при температуре +10 °С Отмывали срезы в трех сменах PBS по 2 мин Наносили раствор вторых антител (AT к Ig G мыши) на один час при комнатной температуре Отмывали срезы в PBS в течение 30 мин Наносили ПАП-комплекс и оставляли срезы на ночь Отмывали срезы в PBS в течение 15 мин Окраску срезов проводили в следующем растворе 10 мг диаминобензидина растворяли в 10 мл PBS и смешивали с 0 5 мл 0 13%-ного раствора перекиси водорода в PBS Окраска проводилась до покоричневения Развитие окраски отслеживали при помощи светового микроскопа Затем срезы промывали в проточной и дистиллированной воде по 2 мин Проводили обезвоживание в ряду спиртов возрастающей концентрации и в двух порциях ксилола В последней порции оставляли на ночь Заключали в бальзам

Для выявления экспрессии гена р53 при помощи определения его продукта - белка р53 были использованы поликлональные антитела к р53 (Novocastra Lab Ltd, UK) и кроличий ПАП (Sigma-Aldrich, USA)

Метол мопФометпии

Каждое сердце было визуально разделено на 3 зоны - верхушку, середину и основание В пределах каждой зоны было сделано по 15 срезов Таким образом, для оценки концентрации кардиомиоцитов каждого сердца предварительные подсчеты были выполнены на 45 срезах

Подсчет клеток осуществляли во всех полях зрения среза, используя объектив 60х Для того чтобы посчитать максимально точно площадь каждого среза, была изготовлена печатная плата с нанесенным на нее квадратом с точно заданной площадью - 1 мм2 (ООО «Резонит» Санкт-Петербург) После этого каждый срез был сфотографирован на одном уровне с печатной платой и, с помощью программы ImageJ, подсчитана площадь среза и выражена в пикселях в единице площади среза Подсчитав таким образом пиксели на фотографии платы с 1 мм2 и среза, через обычную пропорцию получили площадь среза Подобным способом обрабатывали фотографию каждого среза с печатной платой Для вычисления объема среза площадь каждого среза умножали на 7 мкм Через отношение количества клеток в каждом срезе к объему каждого среза получили концентрацию, т е количество кардиомиоцитов и немышечных клеток в 1 мм3 для каждой зоны сердца каждой подгруппы мышей Для вычисления клеточной потери концентрацию клеток через 1 ч после динамического стресса принимали за 100% Зная концентрацию клеток через 24 ч после стресса, вычисляли при помощи пропорции ее процентный эквивалент Разница между концентрациями клеток через 1 ч и 24 ч после динамического стресса, выраженная в процентах и есть клеточная потеря через 24 ч после динамического стресса

Для измерения площадей исследуемых срезов и для статистического анализа были использованы программы ImageJ и Microsoft Excel

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Ранее было установлено, что гибель кардиомиоцитов мышей тёх, в противоположность миокарду больных миодистрофией Дюшенна, стандартными методами световой микроскопии не выявляется Но означает ли это, что ее вообще нет'' В попытках разобраться в этом вопросе была проведена целая серия работ (Михайлов и др , 1998, 2001), в результате которых была установлены некоторые особенности миокарда мышей тёх при обычном содержании животных и после динамического стресса Было выявлено, что очаговая гибель кардиомиоцитов мышей тс!х начинает регистрироваться через сутки после динамического стресса - 5-минутного плавания Между тем, у мышей тёх, содержащихся

при обычных условиях, в миокарде имеются проявления развивающегося апоптоза Признаками апоптоза являются постоянное присутствие в экстракте ДНК миокарда фрагмента размером 65 т п н и сниженная удельная плотность митохондрий кардиомиоцитов по сравнению с удельной плотностью митохондрий кардиомиоцитов мышей С57В1, "дикого" аналога мышей mdx

Мерой развития апоптоза также является степень инвагинированности ядерной мембраны Оказалось, что по этому признаку 30% ядер кардиомиоцитов мышей mdx могут быть классифицированы как патологические Для включения финальной или деструктивной стадии апоптоза необходимо усиление состояния окислительного стресса что и достигается динамическим стрессом Через 1 ч после стресса начинает определяться низкомолекулярный распад ДНК (Казаков, Михайлов, 2001) Через 1 сут после стресса доля патологических ядер уменьшается в 2 раза, до 15% Таким образом, значительная часть кардиомиоцитов мышей mdx постоянно находятся на начальной стадии апоптоза, избегая, однако, вступления во вторую, деструктивную, стадию апоптоза

Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоиитах мышей mdx

Было выдвинуто предположение, что в выживании кардиомиоцитов мышей mdx участвует механизм репарации ДНК

Для выявления ДрДНК в настоящей работе использовали антитела к фосфорилированной форме гистона Н2АХ (гистон у-Н2ЛХ, основываясь на том, что при возникновении ДР ДНК запускается фосфорилирование С-концевого отдела гистона Н2АХ по Serl39 (Rogakou et al, 1998, Vilenchik et al, 1998) Функция y-H2AX гистона состоит в фиксации свободных концов ДР ДНК (Томилин, 2002,2005)

По результатам данного эксперимента было обнаружено, что в миокарде левого желудочка у мышей С57В1/6 доля ядер с положительной окраской на гистон у-Н2АХ в отсутствие стресса очень незначительна (рис 1) и составляет 0 05 ± 0 1 % (табл 1) После динамического стресса доля ядер с положительной окраской на гистон у-Н2АХ увеличивается примерно в 20 раз, достигая величины 1 0 + 0 02 % (табл 1), что указывает на возникновение ДР в ДНК в миокарде мышей С57В1 Согласно данным из литературы, ишемия сердца повреждает ДНК с образованием ДР, что, в свою очередь, индуцирует фосфорилирование гистона Н2АХ и увеличение уровня экспрессии белков р53/р21 ( Corbucci et al, 2004)

У мышей mdx динамический стресс вызывает 7-кратное увеличения доли ядер кардиомиоцитов, имеющих ДР в ДНК, а именно до 41 7±11 4 %, (табл 1 рис 3,4) Большая часть меченых ядер относится к кардиомиоцитам

Рис. / Регистрация двунитевых разрывов ДИК в кардиомиоцитах мышей C57BI при помощи кроличьих моноклональных антител к синтетическому карбокситерминальному пептиду CKATQAS(P04)QEY

фосфорилированной формы гистона II2AX (Stressgene, США) и моноклональных антител к а- саркомерному актину (Sigma, clone 5С5, США) в отсутствие динамического стресса.

Табл.1. Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx и С57В1 при помощи кроличьих моноклональных антител к синтетическому карбокситерминальному пептиду CKATQAS(PO,t)QEY фосфорилированной формы гистона ШАХ (Stressgene, США) и моноклональных антител к а- саркомерному актину (Sigma, clone 5С5,США) через 1 ч и 24 ч после стресса.

Группы животных Доли меченых ядер клеток миокарда через 1 и 24 ч после динамического стресса, %, Х±вх

1 ч 24 ч

кардиомио-циты немышечные клетки кардиомио-циты немышечные клетки,

С57В1 st(-) 0.05+0.1 0.00+0.5 0.00+0.5 0.00+0.5

С57В1 st(+) 1.01+0.1 0.00+0.5 0.00+0.5 0.00+0.5

mdx st(-) 6.75+0.2 2.05+0.1 5.75+0.2 1,56±0.5

mdx st(+) 41.76+11.4 9.01+0.4 5.21+0.4 1.77+0.5

Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах иышей mdx и C57BI при помощи антител к гистону у-Н2АХ через 1 ч и 24 ч после стресса.

Рис. 2. Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx и С57В1 при помощи кроличьих моноклональных антител к синтетическому

карбокситерминальному пептиду

CKATQAS(P04)QEY фосфорилированной формы гистона Н2АХ (Stressgene, США) и моноклональных антител к а- саркомерному актину (Sigma, clone 5С5,США) через 1 ч и 24 ч после стресса.

Рис.3.

Рис.4.

Рис. 3,4. Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx при помощи кроличьих моноклональных антител к синтетическому карбокситерминальному пептиду CKATQAS(P04)QEY фосфорилированной формы гистона Н2АХ (Stressgene, США) и моноклональных антител к а- саркомерному актину (Sigma, clone 5С5,США) через 1 ч после стресса.

Появление ДР в ДНК в миокарде как мышей С57В1, так и мышей п^х через 1 ч после стресса коррелирует с появлением в миокарде низкомолекулярных фрагментов ДНК. Через 24 ч после стресса распад ДНК в миокарде мышей С57В1 уже не обнаруживается, тогда как в миокарде мышей тйх продолжают присутствовать низкомолекулярные фрагменты ДНК (Михайлов и др. 1998; Казаков, Михайлов, 2001).

Высокая доля ядер кардномиоцитов с ДР в ДНК (41 7±11 4%) у мышей тс1х после динамического стресса соответствует уровню образования ДрДНК в кардиомиоцитах мышей С57В1 после рентгеновского облучения в дозе 3-5 Гр (Гаврилов, Веженкова и др, 2005) Через 24 ч после динамического стресса у мышей тс!х доля ядер кардномиоцитов с ДР в ДНК уменьшилась до 5 2 ± 0 4 %, что не противоречит электрофоретическим данным о присутствии в миокарде низкомолекулярных фрагментов ДНК (Казаков, Михайлов, 2001), (табл 1, рис 2)

Такая динамика поведения ДР в ДНК в кардиомиоцитах мышей тёх после динамического стресса не совпадает с поведением ДР в ДНК кардномиоцитов мышей С57ВЬ, когда через 24 ч после рентгеновского облучения 20 % ядер клеток миокарда мышей С57В1 сохраняют ДР в ДНК (Гаврилов, Веженкова и др, 2005) Основная часть меченых клеток была кардиомиоцитами Как и в случае миокарда мышей С57В1 после рентгеновского облучения, исчезновение меченных антителами к фосфорилированной форме гистона Н2АХ ядер кардномиоцитов у мышей тс1х через 24 ч после динамического стресса может быть объяснено как репарацией ДНК, так и гибелью клеток с мечеными ядрами Считается, что ДР в ДНК репарируются в клетках двумя способами - гомологичной рекомбинацией и негомологичным соединением концов При этом допускается, что в постмитотических клетках позвоночных используется главным образом второй способ (Томилин, 1982, 2002, 2005, Така1а е1 а1, 1998)

Включение эН-тимидина в ядра клеток миокарда мышей

Для характеристики свойств мутантных кардномиоцитов мышей т<1х представляет интерес изучение возможности реактивации синтеза ДНК после динамического стресса Данные первой серии экспериментов с использованием 3Н-тимидина показали, что при введении предшественника и регистрации через 1 ч после стресса имеет место включение предшественника в ядра кардномиоцитов Доля меченых ядер кардномиоцитов у мышей тс1х после динамического стресса составила 2 0±0 6 % При введении предшественника через 12 ч и 24 ч после динамического стресса и учете результатов через 1 ч после введения 3Н-тимидина мечеными были 0 3±0 05 % кардномиоцитов мышей тс!х Эти данные показывают, что включение предшественника в ядра кардномиоцитов мышей тек происходит в ближайшее время после стресса (М1кЪа11оу е1 а1, 1999) Попытка обнаружить накопление митозов (при помощи колхицина) через 24 ч после стресса была неудачной

13

(Михайлов и др. 2003). Данные из литературы показывают, что активация синтеза ДНК у кардиомиоцитов нормальных животных происходит не раньше, чем через 1-3 сут после развития инфаркта миокарда (Румянцев, 1982). Таким образом, наиболее вероятно, что обнаруженное нами включение 3Н-тимидина в ядра кардиомиоцитов мышей тс!х при введении предшественника в ближайшее время после стресса отражает проявление репаративного синтеза ДНК. Включение 3Н-тимидина в ядра кардиомиоцитов не связано с их вступлением в митотический цикл.

В рамках данной работы, для того чтобы выявить дальнейшую судьбу ДНК-синтезирующих кардиомиоцитов через 24 ч после стресса, была поставлена серия экспериментов с введением 3Н-тимидина через I ч и регистрацией включения через 1 и 24 часа после стресса. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Как видно из полученных данных, не удалось зарегистрировать усиления включения 3Н-тимидина в кардиомиоциты мышей С57В1 через 1 ч после стресса. Исходный уровень включения 3Н-тимидина у мышей тс!х не отличался от уровня включения у кардиомиоцитов мышей С57В1. У мышей тёх через 1 ч после динамического стресса около 3% ядер кардиомиоцитов включают 3Н-тимидин, (табл.2, рис.5) Этот результат повторяет данные первой серии экспериментов (М1кЬа11оу е! а1., 1999).

Через 1 сут после стресса и введения 3Н-тимидина было обнаружено почти десятикратное уменьшение доли меченных 3Н-тимидином кардиомиоцитов у мышей пи1х (табл.2). Исчезновение меченных 311-тимидином кардиомиоцитов может быть объяснено только гибелью клеток. Таким образом, суточная потеря кардиомиоцитов, оцениваемая по исчезновению из миокарда тимидиновой метки, составила 2.5 %.

Рис.5. Включение Н-тимидина в ядрах клеток миокарда мышей тс!х , через 1 ч после введения 3Н-тимидина.

Табл 2 Включение 3Н-тимидина в ядрах клеток миокарда мышей С57В1 51(+), С57В1 в^-) и шdx , шdx в^-) через 1 ч и через 24 ч после введения 3Н-тимидина

Группы Животных Время после введения тимидина

1 ч 24 ч

доля меченых кардиомиоцитов, % доля меченых немышечных клеток, % доля меченых кардиомиоцитов, % доля меченых немышечных клеток, %

с57Ы st(-) 0 23±03 0 21+0 6 0 25±0 8 0 23+0 5

c57bl st(+) 0 35±02 0 31+0 5 0 29±04 0 37±03

mdx st(-) 031±03 0 38±03 0 31±0 4 0 36+0 2

mdx st(+) 2 90+0 5 2 22±07 0 41±0 2 0 79±05

Этот результат не соответствует нашим ранее полученным электронно-микроскопическим данным о том, что у мышей mdx через 1 сут после стресса доля кардиомиоцитов с апоптотической морфологией ядер в миокарде уменьшается в 2 раза, с 30 до 15 % Несоответствие данных анализа срезов миокарда на светооптическом уровне данным анализа ультраструктуры ядер апоптотических кардиомиоцитов можно объяснить малой выборкой изученных электронограмм кардиомиоцитов (331 изображение - Михайлов и др , 2001) по сравнению с многотысячной выборкой клеток на светооптическом уровне Кроме того, возможно также и улучшение морфологии ядер кардиомиоцитов из-за репарации ДНК Наиболее вероятно, что исчезновение в течение 1 сут из миокарда кардиомиоцитов, меченных 3Н-тимидином, соответствует уровню клеточной потери после динамического стресса у мышей mdx Учитывая величину клеточной потери, можно заключить, что уменьшение доли кардиомиоцитов с ДР в ДНК, с 41 7±11 4 до 5 2±0 4 % происходит не только за счет гибели кардиомиоцитов, но и за счет репарации их ДНК и последующего выведения гистона у-Н2АХ из состава хроматина Даже если принять уровень суточной потери кардиомиоцитов за 15 %, то и в этом случае придется согласиться с тем, что суточное уменьшение доли ядер с ДР в ДНК происходит, в том числе, и за счет репарации ДНК

Считается, что при репарации ДНК гистон у-Н2АХ исчезает из ядер клеток под действием белков, участвующих в перестройках хроматина (Kusch et al, 2004 Kruhlak et al, 2006)

Обращает на себя внимание неизменность доли меченных 3Н-тимидином немышечных клеток мышей mdx через сут после стресса Это свидетельствует или о более высокой резистентности немышечных клеток к динамическому стрессу, или о том, что немышечные клетки вступают в клеточный цикл Кроме того, существует возможность инфильтрации миокарда мышей mdx меченными 3Н-тимидином клетками из крови

Встает вопрос о том, что если включение 3Н-тимидина является репаративным, то почему наблюдается такая большая разница между частотой клеток, включивших 3Н-тимидин (2 9 %), и частотой клеток, меченных иммунной антисывороткой к гистону у-Н2АХ (42 %) Наиболее вероятно, что в основе такого расхождения лежит различная чувствительность методов регистрации ДР в ДНК при помощи антител к гистону у-Н2АХ и авторадиографического способа регистрации включения 3Н-тимидина при репарации ДНК

Роль р53 в процессе репарации кардиомиоцитов мышей mdx

В качестве еще одной попытки подтвердить или опровергнуть участие репарации ДНК в выживании кардиомиоцитов была проведена серия опытов по регистрации экспрессии гена р53 после динамического стресса при помощи антител к белку р53

Наиболее разносторонняя форма репарации ДНК, NER (нуклеотид-эксцизионная репарация), оперирует с поврежденными основаниями и нарушенным спариванием оснований, вызываемым УФ лучами или оксидативными повреждениями, которые ведут к изменениям в структуре дуплексной ДНК NER распознает широкий круг разнообразных повреждений ДНК, включая индуцированные УФ лучами циклобутан-пиримидиновые димеры (CPDs) и пиримидин-пиримидоновые продукты, фотопродукты

Влияет ли р53 на NER ш vivo'' Потеря р53 в клетках человека вызывает снижение репарации индуцированных УФЛ повреждений ДНК Интактные клетки, которые гетерозиготны по мутации р53 обнаруживают нормальную репарацию фотопродуктов, но пониженную инициальную скорость удаления CPD по сравнению с нормальными клетками Следовательно, возможно, что р53 затрагивает NER in vivo, оказывая влияние на функцию (или функции) белков, которые вовлечены в этот процесс (Sengupta, Harris, 2005)

Результаты проведенных нами экспериментов показали, что доля р53-положительных кардиомиоцитов в миокарде мышей mdx значительно выше, чем в миокарде мышей C57BI, (рис 6) Более высокий уровень экспрессии гена р53 объясняется тем, что миокарде мышей mdx постоянно регистрируется фрагментация ДНК В течение 1 ч после стресса доля меченых антителами к белку р53 ядер кардиомиоцитов у мышей mdx вырастает с 22%

(контроль) до 63%. А доля меченых ядер кардномиоцитов мышей С57В1 вырастает с 3% (контроль) до I 1%.

Через 24 ч после динамического стресса в миокарде мышей т(1х оставались окрашенными 13% ядер кардиомиоцитов, а в миокарде мышей С57В1 - 5% ядер (рис.6).

Рис б. Регистрация экспрессии белка р53 в кардиомиоцитах мышей тёх и С57В1 при помощи антител к фосфорилированной форме белка р53 через 1 ч и 24 ч после стресса.

Динамика экспрессии гена р53 коррелирует с динамикой появления и исчезновения двунитевых разрывов ДНК в реакции с антителами к гистону Н2Ах.

Таким образом, динамический стресс вызывает образование ДР в ДНК в кардиомиоцитах и немышечных клетках миокарда как у мышей С57В1, так и у мышей тс1х. Образование ДР в ДНК в кардиомиоцитах мышей тс!х после динамического стресса происходит в несколько раз интенсивнее, чем в кардиомиоцитах мышей С57В1. Как в случае миокарда мышей С57В1, так и особенно в случае мышей тс!х ДНК кардиомиоцитов повреждается сильнее, чем ДНК немышечных клеток. Не вызывает сомнения, что ДрДПК являются причиной гибели кардиомиоцитов мышей тс!х.

Сам факт изменения количества определяемых двунитевых разрывов ДНК не позволяет судить о реальном вкладе репарации ДНК в выживание кардиомиоцитов. Отсутствие морфологических данных о гибели или выживаний клеток миокарда и, особенно кардиомиоцитов, после динамического стресса не позволяет точно судить о связи выживания кардиомиоцитов и репарации ДНК. Имеющиеся данные об уменьшении в популяции доли кардиомиоцитов с апоптотическими ядрами через 1 сут после динамического стресса не дают ответа на поставленный вопрос как из-за незначительного размера изученной популяции, так и из-за возможности объяснить исчезновение апоптотических ядер репарацией ДНК. После динамического стресса мы не наблюдали гибели мышей тёх (Михайлов и др., 2001). Данные об исчезновении из миокарда меченных 311-тимидином клеток также не дают ответа на поставленный вопрос из-за отсутствия объяснения

возникновения меченных 3Н-тимидином клеток миокарда 2-3% после однократного введения предшественника (Веженкова, Михайлов, 2005, Михайлов, Веженкова, 2007)

В связи с этим завершающим этапом данной работы являлся морфометрический подсчет изменений концентраций кардиомиоцитов мышей mdx и С57В1 до и после стресса с целью вычисления потери кардиомиоцитов мышей mdx и С57В1, вызываемой динамическим стрессом

Для оценки количества кардиомиоцитов в миокарде и сердце используют различные методы, такие, как морфометрия (Hort, 1953, Black-Schaffer, Turner, 1958, Ерохина, 19686, Anversa, 1980), биохимическое определение количества ДНК в миокарде и последующий пересчет данных на число ядер, исходя из диплоидного эквивалента - 6x10 12 г ДНК (Petersen, Baserga, 1965, Adler, 1972), и подсчет числа клеток, высвобождаемых из миокарда с помощью протеолитических ферментов (De Haan et al, 1971) или 50%-ной КОН (Белов и др , 1977)

Нами был выбран морфометрический анализ, так как он более других методов подходит для поставленной нами цели определения концентрации клеток Кроме того, например, при обработке миокарда концентрированной щелочью возможно резкое занижение оценки количества мышечных ядер из-за разрушения значительной части кардиомиоцитов

В ряде работ не уделено должного внимания разграничению мышечных и немышечных клеток данные расчетов, по-видимому, относятся к их совокупности (Enesco, Leblond, 1962, De Haan et al, 1971) В данной работе было проведено разграничение между кардиомиоцитами и немышечными клетками при помощи моноклональных антител к а-саркомерному актину

Результаты морфометрического анализа представлены на рис 7-12

с57В1 "шшнимш

£ ■ ¡Р

Рис. 7. Концентрация кардиомиоцитов (КМЦ) и немышечных клеток (НМК) в различных зонах сердца мышей с57В1 бЬ- через 1 ч, после стресса, кл/мм3, Х±бх.

Рис. 8. Концентрация кардном иоцитов (КМЦ) и немышечных клеток в различных зонах сердца мышей тс1х бК через 1 ч после стресса, кл/мм3, Х±бх.

С57В1 1И

р 40000 1» ш нт . | О В' р»>ш«| ~4 Яс. ооди« 1 Во,,,,«......

Рис. 9. Концентрация кардиомиоцитов (КМЦ) и немышечных клеток (НМК) в различных зонах сердца мышей с57В1 бН- через 1 ч, после стресса, кл/мм3, Х±бх

Рис. 10. Концентрация кардиомиоцитов (КМЦ) и немышечных клеток (НМК) в различных зонах сердца мышей тёх б1+, через 1 ч после с тресса, кл/мм3, Х±бх..

Рис. II. Клеточная потеря кардиомиоцитов (КМЦ) и немышечных клеток (НМК) в различных зонах сердца мышей с57В1 б1+через 24 ч, после аресса, %, Х±бх.

Рис. 12. Клеточная потеря кардиомиоцитов (КМЦ) и немышечных клеток (НМК) в различных зонах сердца мышей тс1х б1+, через 24 ч после стресса, %, Х±бх..

Изначально следует отметить значительную разницу концентраций клеток миокарда у мышей С57В1 и мышей тс!х Как видно на рис 7 и 8, концентрация всех клеток миокарда и в частности кардиомиоцитов у мышей С57В1 выше на 20-40% Причем различия в наибольшей степени выражены на верхушке сердца Это явление наблюдается как у контрольных животных, так и через час после динамического стресса

Это указывает на постоянную медленную потерю кардиомиоцитов миокардом мышей шёх в течение предшествующей жизни Данный вывод не противоречит ранее сделанному заключению о том, что кардиомиоциты мышей тс!х постоянно находятся в первой, начальной стадии апоптоза, избегая, однако, вступления в деструктивную стадию апоптоза (Казаков, Михайлов, 2001, Михайлов и др , 2001)

Динамики концентраций Кмц и Нмк через 1 ч после динамического стресса по сравнению с контролем не наблюдается (рис 7-10)

После проведенных подсчетов было установлено (рис 12), что клеточная потеря кардиомиоцитов у мышей шёх через 24 ч после стресса варьирует в пределах от 2 4 до 2 5% Полученные результаты имеют высокую степень корреляции с полученными нами ранее сведениями о включении 3Н-тимидина в ядра кардиомиоцитов Как было уже отмечено выше, через 1 ч после динамического стресса 2 9+0 5 % ядер кардиомиоцитов мышей тс1х включают 3Н-тимидин

Потеря Нмк у мышей С57В1 через 24 ч после стресса незначительна (рис 11) В свете полученных данных представляет большой интерес выяснение участия репарации ДНК в выживании кардиомиоцитов у больных миодистрофией Дюшенна, так как считается, что у человека миодистрофия Дюшенна приводит к летальному исходу из-за остановки сердца примерно в 50 % случаев

Выводы

1 Плавание в холодной воде (динамический стресс) усиливает образование двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах «диких» мышей С57В1 (примерно в 20 раз) и в значительно большей степени усиливает накопление двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мутантных мышей шс1х (примерно в 700 раз в сравнении с мышами С57В1) Через 1 сут после стресса уровень двунитевых разрывов ДНК уменьшается до исходного уровня

2 При обычном состоянии животных экспрессия гена р53 регистрируется в

кардиомиоцитах у мышей С57В1 и особенно интенсивно в кардиомиоцитах мышей

mdx Динамический стресс усиливает экспрессию гена р53 в кардиомиоцитах обоих типов мышей примерно в 3 раза Суточная динамика экспрессии гена р53 коррелирует с суточной динамикой регистрации двунитевых разрывов ДНК

3 Корреляция экспрессии гена р53 с уровнем двунитевых разрывов ДНК показывает, что повреждение ДНК кардиомиоцитов после динамического стресса в свою очередь включает стартовые регуляторные механизмы выживания клеток, характерные для обновляющихся клеточных популяций

4 Концентрация кардиомиоцитов в миокарде мышей mdx ниже, чем в миокарде мышей C57BI

5 Суточная потеря кардиомиоцитов у мышей mdx после динамического стресса превышает таковую у мышей C57BL почти в 10 раз

6 Сопоставление суточной динамики регистрации двунитевых разрывов ДНК и уровня клеточной потери позволяет заключить, что репарация двунитевых разрывов ДНК является одним из основных механизмов выживания кардиомиоцитов мышей mdx после динамического стресса

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Gavrilov В А , Vezhenkova I.V et al 2006 Slow elimination of phosphorylated histone Y-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ Biochemical and Biophysical Research Communications 347 1048-1052

2 Михайлов В M , Веженкова И В 2007 Двунитевые разрывы ДНК кардиомиоцитов мышей C57BL и mdx после динамического стресса Цитология 49(6) 491-496

3 Mikhailov V М , Vezhenkova 1 V. 2007 Double strand breaks of DNA of C57BL and mdx mouse cardiomyocytes after dynamic stress Cell and Tissue Biology 1(4) 328-333

4 Гаврилов Б A, Фирсанов Д В, Веженкова И.В. и др 2007 Выявление фосфорилированного гистона Н2Ах в дифференцированных клетках после рентгеновского облучения ДАН, 414(1) 123-125

5 Веженкова И. В , Михайлов В М 2007 Выживание кардиомиоцитов и репарация ДНК в миокарде мышей C57BL/6 и mdx после динамического стресса Цитология, 50(4) 287-292

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Белов JI Н , Леонтьева Т А , Коган М Е 1977 Количественная характеристика размножения мышечных клеток в течение постнатального кардиомиогенеза у мышей Онтогенез 8(5) 442450

Веженкова И В , Михайлов В М 2005 Репаративный синтез ДНК как один из механизмов выживания кардиомиоцитов мышей mdx при динамическом стрессе Цитология 47(5) 800 Гаврилов Б А, Михайлов В М , Томилин Н В 2005 Динамика репарации двунитевых разрывов ДНК в постмитотических клеточных популяциях у мышей после рентгеновского облучения Цитология 47(5) 802

Ерохина И J1 1968 Динамика пролиферации клеточных элементов дифференцирующегося миокарда мыши Цитология 10(11)1391-1409

ЖинкинЛН 1959 Радиоактивные индикаторы в гистологии Л ИЭМ АМН СССР, 206с Казаков В И , Михайлов В М 2001 Фрагментация ДНК кардиомиоцитов мышей mdx и с57В1 после стресса Цитология 43(1) 72-75

Михайлов В М и др 1998 Дифференцировка мышечных волокон мышей mdx после баллистической трансфекции кДНК гена дистрофина человека Цитология 40(5) 394-400 Михайлов В М , Веженкова И В 2007 Двунитевые разрывы ДНК кардиомиоцитов мышей C57BL и mdx после динамического стресса Цитология 49(6) 491-496

Михайлов В М , Комаров С А и др 2001 Ультраструктурный и морфометрический анализ стадий апоптоза кардиомиоцитов мышей mdx Цитология 43(8) 729-733 Полак Д, Ван Норден С 1987 Введение в иммуноцитохимию современные методы и проблемы М Мир, 78с

Румянцев П П 1982 Кардиомиоциты в процессах репродукции, дифференцировки и регенерации Л Наука,, 288с

Томилин Н В 2002 Репарация двунитевых разрывов ДНК и стабильность хромосом в клетках высших эукариот В кн Бреслеровские чтения Санкт-Петербург Изд-во Российской А Наук , 70-84

Томилин Н В 2005 Репарация ДНК и ее роль в канцерогенезе В кн IX Российский онкологический конгресс М Изд Российской академии государственной службы при президенте РФ, 72-75

Томилин Н В 1983 Генетическая стабильность клетки Л Наука 156с

Adler A J , Langan Т А , Fasman G D 1972 Complexes of deoxyribonucleic acid with lysine-nch (fl) histone phosphorylated at two separate sites circular dichroism studies Arch Biochem Biophys 153(2)769-77

Anversa P, Olivetti G, Loud AV 1980 Morphometnc study of early postnatal development in the left and right ventricular myocardium of the rat I Hypertrophy, hyperplasia, and binucleation of myocytes Circ Res 46(4) 495-502

Beltrami E, Plescia J, Wilkinson JC, Duckett CS, Altien DC 2004 Acute ablation of survivin uncovers p53-dependent mitotic checkpoint functions and control of mitochondrial apoptosis J Biol Chem 279(3) 2077-84

Black-Schaffer B, Turner M E 1958 Hyperplastic infantile cardiomegaly, a form of idiopathic hypertrophy with orwithout endocardial fibroelastosis, and a comment on cardiac atrophy Am J Pathol 34(4)745-65

Corbucci, G G, С Perrino, G Donato, A Ricchi, В Lettieri, G Troncone, С Indolfi, M Chianello, Avvedimento E V 2004 Transient and reversible deoxyribonucleic acid damage m human left ventricle under controlled ischemia and reperfusion J Am Coll Cardiol 43 1992-1999 Dawn B, Stein AB, Urbanek K, Rota M, Whang B, Rastaldo R, Torella D, Tang XL, Rezazadeh A, Kajstura J, Leri A, Hunt G, Varma J, Prabhu SD, Anversa P, Bolli R 2005 Cardiac stem cells delivered intravascularly traverse the vessel barrier, regenerate mfarcted myocardium, and improve cardiac function Proc Natl Acad Sci U S A 102(10) 3766-71

De Haan R L , Duning J О 1971 Mitotic growth of the cardiac myocytes Carnegie Inst Yearb 70 1384-1389

Flugelman MY, 2004 Lewis BS The promise of myocardial repair-towards a better understanding Eur Heart J 17 1483-5

HortW1953 Quantitative histological studies on growing heart Virchows Arch 323(2)223-42 Kajstura J, Rota M, Whang B, Cascapera S, Hosoda T, Bearzi C, Nurzynska D, Kasahara H, Zias E, Bonafe M, Nadal-Ginard B, Torella D, Nascimbene A, Quaini F, Urbanek K, Len A, Anversa P 2005 Bone marrow cells differentiate in cardiac cell lineages after infarction independently of cell fusion CircRes 96(1) 127-37

Kruhlak M J , Celeste A , Dellaire G , Fernandez-Capetillo O , Muller W G , McNally J G , Bazett-Jones D P, Nussenzweig A 2006 Changes in chromatin structure and mobility m living cells at sites of DNA double-strand breaks J Cell Biol 172 823-34

Kusch T , L Florens, W H Macdonald, S K Swanson, R L Glaser, J R Yates 3rd, S M Abmayr, M P Washburn, Workman J L 2004 Acetylation by Tip60 is required for selective histone variant exchange at DNA lesions Science 306 2084-2087

Leblond C 1964 Classification of cell populations on the basis of their proliferative behaviour Natl Cancer Inst Monogr 14 119-50

Liao R , Pfister O , Jain M , and Mouquet F 2007 The bone marrow - cardiac axis of myocardial regeneration Prog Cardiovasc Dis 50(1) 18-30

Mikhailov V M , Kazakov V I, Komarov S A , Nilova V K , Stem G I, Baranov V S 1999 DNA destruction and DNA synthesis by myocardial cells of mdx mice In The XXVIII European Muscle Congress Abstracts York, UK 189

Petersen RO , Baserga R 1965 Nucleic acid and protein synthesis in cardiac muscle of growing and adult mice Exp Cell Res 40(2) 340-52

Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM 1998 DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139 J Biol Chem V 273(10) 5858-68 Sarkisov DS 1970 News concerning the study of regeneration and several problems of clinical medicine Klin Med 48(11) 14-20

Sengupta S, Harris C 2005 p53 traffic cop at the crossroads of DNA repair and recombination Nat Rev Mol Cell Biol 6(1) 44-55

Takata M M S Sasaki, E Sonoda, C Morrison, M Hashimoto, H Utsumi, Y Yamaguchi-Iwai, A Shinohara and Takeda S 1998 Homologous recombination and non-homologous end-joining pathways of DNA double-strand break repair have overlapping roles in the maintenance of chromosomal integrity in vertebrate cells The EM BO 17 5497-5508

Torella D, Ellison G M , Karakikes I, Nadal-Ginard B 2007 Growth-factor-mediated cardiac stem cell activation in myocardial regeneration Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine V 4 S46-S51

Vilenchik M M, Knudson A G 2003 Endogenous DNA double-strand breaks production, fidelity of repair, and induction of cancer Proc Natl Acad Sci USA 100 12871-12876

Лицензия ЛР №020593 от 07 08 97

Подписано в печать 15 02 2008 Формат 60x84/16 Печать цифровая Уел печ л 1,0 Тираж 100 Заказ 263 6Ь

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул , 29 Тел 550-40-14 Тел/факс 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Веженкова, Ирина Владимировна

1. Общая характеристика тканевой и ультраструктурной организации миокарда в норме.

1.1. Морфологические особенности строения миокарда млекопитающих.

1.2. Кардиомиоциты взрослых млекопитающих.

1.2.1. Желудочковые кардиомиоциты.

1.2.2. Предсердные кардиомиоциты.

2. Основные черты кардиомиогенеза.

2.1. Дифференцировка кардиомиоцитов.

2.2. Пролиферация и регенерация кардиомиоцитов.

2.3. Программируемая гибель кардиомиоцитов.

2.3.1. Представления о механизмах регуляции апоптоза.

2.3.2.Морфологические проявления апоптоза.

2.3.3. Механизм апоптоза.

2.3.4. Регуляция апоптоза.

2.4.Рольр53 в выживании клеток при повреждении ДНК.

2.4.1.Рольр53 в процессах канцерогенеза.

2.4.2. р73 ирбЗ - членыр53 семьи.

2.4.3. Участиер53 в процессе репарации ДНК.

Повреждение ДНК.

Фосфорилирование р53.

3. Сердечная недостаточность.

3.1. Миодистрофия Дюшенна.

3.1.1. Строение молекулы дистрофина.

Материал и методы.

1. Материал.

2. Методы.

2.1. Приготовление гистологических препаратов.

2.1.1. Приготовление парафиновых срезов.

2.1.1. Приготовление криосрезов.

2.2. Окраска гистологических препаратов гематоксилином — эозином.

2.3. Метод пероксидазы - антипероксидазы (ПАП). (Полак и др., 1987).

2.4. Метод авторадиографии (Жинкин, 1959).

2.5. Метод морфометрии.

Для измерения площадей исследуемых срезов и для статистического анализа были использованы программы ImageJ и Microsoft Ехсе1.3. Результаты и обсуждение.

3. Результаты и обсуждение.

3.1. Выживание и апоптоз кардиомиоцитов мышей mdx.

3.1.1. Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx.

3.1.1.1. Некоторые особенности строения и функционирования гистонов семейства Н2А, в частности гистона ШАХ (Arcady Celeste, Simone Petersen et al., 2002).

3.1.1.2. Рольp53 в процессе репарации кардиомиоцитов мышей mdx.

Сокращения, используемые в рукописи:

ДрДнк - двунитевые разрывы ДНК

МДД - миодистрофия Дюшена

PBS - фосфатно-солевой буфер

NER - нуклеотид-эксцизионная репарация

Кмц - кардиомиоциты

Нмк - немышечные клетки

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выживание и гибель кардиомиоцитов при генетически обусловленной миодистрофии мышей mdx"

Изучение механизмов дифференцировки клеток и регенерации тканей, а в частности механизмов миогенеза и регенерации мышц — одна из важнейших проблем клеточной биологии и биологии развития. Процесс дифференцировки мышечных клеток - это исключительно сложный и многоплановый процесс, который отнюдь не сводится лишь к созданию их сократительного аппарата. Параллельно возникают и совершенствуются структуры саркоплазматической сети, Т-системы и межклеточных контактов, изменяются морфофункциональные характеристики клеточной поверхности и т.п. (Румянцев, 1982).

Многоклеточные организмы сформированы из множества специализированных клеточных популяций. По наличию клеточного обновления популяции были» разделены на обновляющиеся, растущие и статические. К последним были отнесены нейроны и кардиомиоциты млекопитающих (Leblond, 1964).

Эта классификация подвергается уточнениям. У экспериментальных грызунов возможна реактивация синтеза ДНК в кардиомиоцитах желудочков сердца в пределах 0.1-0.5 % через 3-30 сут после инфаркта миокарда (Румянцев, 1982; Ерохина, 1992). У людей описаны митозы кардиомиоцитов в околоинфарктной зоне (Beltrami et al., 2003). Будучи заблокированными в синтезе ДНК и пролиферации, кардиомиоциты способны к довольно быстрой и эффективной реорганизации своей внутренней структуры при изменении условий функционирования за счет усиления или снижения процессов внутриклеточной регенерации (Sarkisov, 1970).

Сердце - это один из первых органов, который формируется у эмбриона позвоночных. На первых этапах изучения процессов клеточной репродукции в кардиомиогенезе утверждалось, в частности, что содержащие миофибрилы кардиомиоциты не синтезируют ДНК и не делятся митотически (Rumery, Rieke,1967; Bader, 2001 и др.). При этом делались попытки выявить на разных стадиях гистогенеза мышцы сердца стволовые кардиомиогенные клетки, (De Haan, 1971), а также морфологически недифференцированные премиобласты и миобласты (Masse, Harary, 1974 и др.).

После того, как была доказана способность умеренно дифференцированных кардиомиоцитов синтезировать ДНК и делиться митозом (Румянцев, 1967), возникли новые задачи. Необходимо было не только установить, сочетается ли в кардиомиогенезе пролиферация клеток, уже содержащих миофибриллы, с размножением морфологически, недифференцированных миобластов, но и охарактеризовать целый ряд, ранее неизвестных особенностей репродукции кардиомиогенных клеток. (Румянцев П.П, 1982).

Кардиомиоциты взрослых млекопитающих - это высокодифференцированные,. высокоорганизованные клетки, специализированные для выполнения функции, сокращения: В. результате-крайне ограниченной способности сердечных миоцитов (особенно желудочковых) к пролиферации в постнатальном кардиомиогенезе их возраст в, момент исследования примерно такой же, как.и животного, т.е. очень большой* по сравнению с другими клеточными популяциями и сопоставим только с возрастом нейронов головного мозга. Несмотря на это, кардиомиоциты способны к довольно быстрой и эффективной реорганизации своей внутренней; структуры при изменении условий существования (например, при гиперфункции органа или снижении притока пластических веществ) за счет усиления или снижения процессов внутриклеточной регенерации (Саркисов, 1977).

Способность кардиомиоцитов млекопитающих к такого рода изменениям их составляющих делает эти клетки удобной моделью для изучения характера адаптивно-компенсаторных реакций в тканях, способных в очень ограниченной степени к реактивации митотического цикла. Последнее свойство не позволяет отнести ни одну из разновидностей кардиомиоцитов (желудочковые, предсердные, проводящей системы), даже у взрослых млекопитающих, к чисто статической (необратимо постмитотической) популяции клеток (Румянцев, 1982). Это обстоятельство так же, как и способность кардиомиоцитов некоторых видов млекопитающих (грызуны, приматы, человек) к полиплоидизации, определяет особенности регенерации сердечных миоцитов.

В настоящее время накапливаются данные об участии стволовых клеток в регенерации миокарда (Dawn et al., 2005; Kajstura et al., 2005; Torella et al., 2005; Yoon et al., 2005). Точная оценка вклада так называемых стволовых клеток или клеток-предшественников кардиомиоцитов в поддержание клеточного состава миокарда требует дополнительных исследований (Flugelman, Lewis, 2004). Однако независимо от результатов решения вопроса об отнесении кардиомиоцитов к популяции обновляющегося типа, не вызывает сомнения, что основную массу клеток миокарда представляют терминально дифференцированные кардиомиоциты «с достаточно жесткой репрессией синтеза ДЕК и митозов» (Румянцев, 1982). У мышей 80 % кардиомиоцитов являются двуядерными клетками (2с х 2), остальные представлены тетраплоидными и октаплоидными клетками (Brodsky et al., 1985).

При инфаркте миокарда происходит потеря кардиомиоцитов, в первую очередь, локализованных в пограничной зоне инфаркта миокарда (Sharov et al., 1996). В настоящее время из-за успехов лекарственной терапии отмечается значительное повышение выживаемости пациентов после острого инфаркта миокарда, что, в свою очередь, становится причиной значительного роста заболеваемости сердечной недостаточностью, кардиомиопатий, развивающихся из-за гибели кардиомиоцитов (Chien, 1999). Таким образом, одной из проблем биологии кардиомиоцитов является их выживание при неблагоприятных ситуациях, возникающих в случаи патологии в миокарде.

Так как факт существования камбиальных клеток миокарда пока остается недоказанным, будем придерживаться мнения, что кардиомиоциты млекопитающих - некамбиальная популяция. Следовательно, встает вопрос о выживаемости этих клеток. Одним из подходов к анализу выживаемости кардиомиоцитов может быть использование животных с генетическим дефектом — мышей mdx. Отсутствие в сократительных клетках мышей mdx синтеза дистрофина сопровождается развитием в них окислительного стресса, вызывающего гибель клеток. Таким образом, сократительные клетки мышей mdx являются моделью выживания клеточных популяций в условиях окислительного стресса. Исходя из этого, целью настоящей работы являлось изучение цитохимических особенностей кардиомиоцитов при генетически обусловленной кардиомиодистрофии на модели мышей mdx.

В конкретные задачи работы входило:

1. Изучение включения Н-тимидина в кардиомиоциты мышей mdx и с57В1 до и после стресса.

2. Регистрация двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мышей mdx до и после динамического стресса.

3. Морфометрический подсчет изменений абсолютного количества кардиомиоцитов мышей mdx и С57В1/6 до и после стресса с целью вычисления клеточной потери кардиомиоцитов мышей mdx и С57В1/6, вызываемой динамическим стрессом.

4. Анализ динамики экспрессии гена р53 до и после динамического стресса.

Работа выполнена в группе генетики клеточных популяций Института цитологии РАН.

Обзор литературы.

Заключение Диссертация по теме "Гистология, цитология, клеточная биология", Веженкова, Ирина Владимировна

Выводы.

1. Плавание в холодной воде (динамический стресс) усиливает образование двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах «диких» мышей С57В1 (примерно в 20 раз) и в значительно большей степени усиливает накопление двунитевых разрывов ДНК в кардиомиоцитах мутантных мышей mdx (примерно в 700 раз в сравнении с мышами С57В1). Через 1 сут после стресса уровень двунитевых разрывов ДНК уменьшается до исходного уровня.

2. При обычном состоянии животных экспрессия гена р53 регистрируется в кардиомиоцитах у мышей С57В1 и особенно интенсивно в, кардиомиоцитах мышей mdx. Динамический стресс усиливает экспрессию гена р53 в кардиомиоцитах обоих типов мышей примерно в 3 раза. Суточная динамика экспрессии гена^53'коррелирует с суточной, динамикой регистрации!двунитевых разрывов ДНК.

3. Корреляция экспрессии гена. р53 с уровнем двунитевых разрывов ДНК показывает, что повреждение ДНК кардиомиоцитов после динамического стресса в свою очередь включает стартовые регуляторные механизмы выживания клеток, характерные для обновляющихся клеточных популяций.

4. Концентрация кардиомиоцитов в миокарде мышей mdx ниже, чем в миокарде мышей С57В1.

5. Суточная потеря кардиомиоцитов у мышей mdx после динамического стресса превышает таковую у мышей C57BL почти в 10 раз.

6. Сопоставление суточной динамики регистрации двунитевых разрывов ДНК и уровня клеточной потери позволяет заключить, что репарация двунитевых разрывов ДНК является одним из основных механизмов выживания кардиомиоцитов мышей mdx после динамического стресса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Веженкова, Ирина Владимировна, Санкт-Петербург

1. Аббасова С.Г., Липкин В.М., Трапезников Н.Н. Кушлинский Н.Е. Система Fas-FasL в норме и при патологии // Вопросы биол. мед. и фарм. химии 1999, №3, с.3-16.

2. Белов Л.Н., Леонтьева Т.А., Коган М.Е. 1977. Количественная характеристика размножения мышечных клеток в течение постнатального кардиомиогенеза у мышей. Онтогенез. 8(5): 442-450.

3. Белушкина Н.Н., Хасан Хамад Али, Северин С.Е. Молекулярные основы апоптоза // Вопросы биол. мед. и фарм. химии 1998, №4, с. 15-23.в постмитотических клеточных популяциях у мышей после рентгеновского • облучения. Цитология. 46(10): 929

4. Веженкова И.В., Михайлов В.М. 2005. Репаративный синтез ДНК как один» из механизмов выживания кардиомиоцитов мышей mdx при динамическом стрессе. Цитология. 47(5): 800!

5. Ерохина И.Л. 1968. Динамика пролиферации клеточных элементов дифференцирующегося миокарда мыши. Цитология. 10(11):1391-1409. Жинкин Л.Н. Радиоактивные индикаторы в гистологии. Л.:ИЭМ АМН СССР, 1959, 206с.

6. Заварзин А.А. Основы частной цитологии и сравнительной гистологии многоклеточных животных. Л.: 1976, 411с.

7. Комаров С.А., Нилова В.К., Михайлов В.М. Влияние стресса и отсутствия дистрофина на форму ядерной оболочки кардиомиоцитов мышей с57В1 и mdx. Цитология, Том 44, №9: 881-882.

8. Лушников Е.Ф., Загребин В.М. Апоптоз клеток: морфология, биологическая роль, механизмы развития // Архив патологии, 1987, т.49, с. 84-89.

9. Михайлов В. М. (в соавторстве с В. С. Барановым и др. 1998). Экспрессия гена дистрофина человека в мышечных волокнах мышей mdx после трансфекции с помощью липосом и синтетических олигопептидов. Генетика 34(7): 876-882.

10. Михайлов В. М. и др. 1998. Дифференцировка. мышечных-волокон мышей mdx после баллистической трансфекции кДНК гена дистрофина человека. Цитология 40(5): 394-400.

11. Михайлов В. М., Казаков В. И., Комаров С. А., Нилова В. К., Штейн Г. И. 1998: Апоптоз и деградация ДНК кардиомиоцитов мышей mdx и С57В1. Цитология. 40(5): 401-406.

12. Михайлов В.М., Веженкова И.В. 2007. Репаративный синтез ДНК как один из возможных механизмов выживания кардиомиоцитов мышей mdx, Цитология 49 (6):491-496.

13. Михайлов В.М., Гаврилов Б.А., Веженкова И.В., Переверзев А.Е., Михайлов В.М., Казаков В.И., Комаров G.A. и др. 1998. Апоптоз и деградация ДНК кардиомиоцитов мышей mdx и с57В1. Цитология, Том 40, (5): 401-406.

14. Непомнящих Л.М., Лушникова Е.Лц Непомнящих Г.И. Морфология и стереология гипертрофии сердца. Новосибирск: Наука- 1986, 304с.

15. Нестерова М.В„ Чо-Чанг Ю.С., Северин E.G. Роль антисмысловых олигонуклеотидов в регуляции клеточных процессов // Вопросы биол. мед. и фарм. химии 1998, №4, с.3-14; .

16. Новиков В.С Программированная клеточная гибель, Санкт-Петербург "Наука", 1996.

17. Полак Д., Ван Норден С. 1987. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М: Мир, 78с.

18. Саркисов'Д. С. 1970. Регенерация и её клиническое значение. М.: Медицина. 284с.

19. Уманский С.Р. Апоптоз: молекулярные и клеточные механизмы // Молекулярная биология, 1996, том. 30. вып. 3, с. 487-502.

20. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология 1996, т. 6, с. 10-23.

21. Abastado JP. 1996. Apoptosis: function and regulation of cell death. Res Immunol. Sep; 147(7):443-56.

22. Adler A.J., Langan Т. A., Fasman G.D.I 972. Complexes of deoxyribonucleic acidwith lysine-rich (fl) histone phosphorylated at two separate sites: circulardichroism studies. Arch. Biochem. Biophys. Dec;153(2):769-77.

23. Aikawa R, Nagai T. Reactive oxygen species in mechanical stress-induced cardiachypertrophy. Biochem Biophys Res Commun 2001, 289:901-7.

24. Am J Ophthalmol. Jan 15;117(l):lll-3.

25. Amalfitano A., Chamberlain J.S. 1996. The mdx-amplification-resistant mutationsystem assay, a simple and rapid polymerase chain reaction-based detection of themdx allele. Muscle Nerve. 1996 Dec;19(12):1549-53.

26. Anversa P, Olivetti G, Loud AV. 1980 Morphometric study of early postnataldevelopment in the-left and right ventricular myocardium of the rat. I.

27. Hypertrophy, hyperplasia, and binucleation of myocytes. Circ Res. Apr.46(4):495-502

28. Arends M.J., Wyllie A.H. Apoptosis. Mechanism1 and' role in patology // Intern.Rev.Exp.Pathol., 1991, v.32, p.223-254. v

29. Bachinski L., Roberts R. Causes of dilated* cardiomyopathy//Cardiology clinics 1998; 16. ~

30. Bittner R. Schofer C. et al. Recruitment of bone-marrow-derived cells by sceletal and cardiac muscle in adult dystrophic mice mdx//Anat Embriol 1999, 199(5): 391-6.

31. Bornman L., Rossouw H., Gericke G. S., and Polla B. S. 1998. Effects of Iron deprivation on the stress protein expression in murine X-linked muscular dystrophy. Biochem. Pharmacol. 56: 751-757.

32. Condorelli G, Borello U et all. Cardiomyocytes induce endothelial cells to trans-differentiate into cardiac muscle: immplications for myocardium regeneration. 2001 //Proc Natl Acad Sci USA. 98(19):10733-8.

33. Cullen M.J., Mastaglia F.L. Morphological changes in dystrophic muscle//Brit. Med. Bull. 1980, 36:145-152.

34. De Haan R.L., Duning J.O. 1971. Mitotic growth of the cardiac myocytes. Carnegie Inst Yearb. 70: 1384-1389

35. Debbas M, White E. 1993. Wild-type p53 mediates apoptosis by El A, which is inhibited by E1B. Genes Dev. Apr;7(4):546-54.

36. Dec G, Fuster V. Idiopathic dilated cardiomyopathy//N Engl J Med 1994; 331: 1564-75:

37. Donehower LA, Harvey M, Slagle BL, McArthur MJ, Montgomery CA Jr, Butel JS,

38. Emery A.E. 2002. The muscular dystrophies. Lancet, 359: 687-695. Ervasti J.M., Campbell K.P. Membrane organization of the dystrophin-glycoprotein complex//Cell 1991,66:1121-1131. failure. Am J Pathol. Jan; 148(1): 141-9.

39. Fan JT, Ortiz RG, Buettner H. 1994. Regression of choroidal metastases from a bronchial carcinoid tumor after chemotherapy with cisplatin and etoposide.

40. Farrell Т. 2001. What's new in defining hypertension and classifying hypertensive disorders in pregnancy. Aust J Midwifery.; 14(4):7-11.

41. Fatkin D, MacRai C. et al. Missense mutations in the rod domain of the lamin A/C gene as causes of dilated cardiomyopathy and conduction system disease//N Engl J Med 1999; 341: 1715-26.

42. Fernandez-Capetillo O, Liebe B, Scherthan H, Nussenzweig A. H2AX regulates meiotic telomere clustering// J Cell Biol. 2003 Oct 13; 163(1): 1520. Epub 2003 Oct 06.

43. Flugelman M. Y., Lewis B.S. 2004. The promise of myocardial repair towards a better understanding. Europ. Heart J. 25:1483-1485.

44. Flugelman MY, Lewis BS. 2004. The promise of myocardial repair—towards a better understanding. Eur Heart J! Sep;25(l 7): 1483-5.i

45. Fujioka S, Koide H, Kitaura Y. et al. Molecular detection and differentiation of enteroviruses in endomyocardial'biopsies and pericardial effusions from? dilated, cardiomyopathy and myocarditis//Am Heart J 1996; 131: 760-5. " Г

46. Fukuda K. Generation of cardiomyocytes from mesenchymal stem cells. 2000 // Tanpakushitsu Kakusan Koso. 45(13 Suppl ):2078-84. ■gastrointestinal tract of normal and p53-deficient mice. Cancer Res. Feb l;54(3):614-7.

47. Giuliana Ferrari at all, Muscle regeneration by Bone Marrow-Derived Miogenic Progenitors//Science, vol 279,1998 1528-1530.

48. Greenblatt MS, Bennett WP, Hollstein M, Harris CC. 1994. Mutations in the p53 tumor suppressor gene: clues to cancer etiology and

49. Gregory E. Crawford, Qi Long Lu et al. Suppression of revertant fibers in mdx mice by expression of a functional dystrophin//Oxford University Press Human Molecular Genetics 2001, V.10, 24: 2745-2750.

50. Gronda E., Vitali E. Left ventricle assist systems: a possible alternative to heart transplantation for heart failure patients? Patient selection, techniques and benefit. Eur J Heart Failure Dec 1999; 1: 320-5.

51. Grounds M., White J. et all. The role of stem'sells; in sceletal and cardiac muscle repair, //J Histochem Cytochem, 50(5):589-610.

52. Hani N. Apoptosis in Heart Failure. Progress in Cardiovascular diseases, Vol: 40, 6:549-562.

53. Hort W.1953. Quantitative histological studies on growing heart. Virchows Arch.323(2):223-42

54. Jacobson MD, Weil M, Raff MC. 1997. Programmed'cell death in animal development. Cell. Feb 7;88(3):347-54.

55. Jiang-Y et,al. Multipotent adult,progenitor-cells (MAPCs) (Mouse ceH"s)//Nature, 418(6893): 41-49.'

56. Kanai A., Pearce L. et al. Identification of a neuronal nitric oxide synthase in isolated cardiac mitochondria using electrochemical detection//Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98(24): 14126-31.

57. Kehat I, Kenyagen-Karsenti D et all. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. 2001 // J Clin Invest. 108(3):407-14.

58. Kehat I., Kenyagin-Karsenti D. et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocites with structural and functional properties of cardiomyocytes//The Journal of Clinical Investigation 2001, 108: 407-414.

59. Kenneth R. Chien; M.D. Stress Pathways and Heart Failure//J. Clin; Invest:, 2001,103,1483-1485:

60. Kerr JF, Searle J.J. 1972. A mode of cell loss in malignant neoplasms.

61. Kerr JFR, Harmon BV. 1991. Definition and incidence of apoptosis: an historicalperspective. In Tomei LD, Cope FO, eds. Apoptosis: the Molecular Basis of Cell

62. Death. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 5-29.

63. Kimura S., Zhang G.X., Nishiyama A., Shokoji Г., Yao L., Fan Y.Y., Rahman

64. M., Suzuki Т., Maeta H., Abe Y. 2005. Role of NAD(P)H oxidase- andmitochondria-derived reactive oxygen species in cardioprotection of ischemicreperfusion inj ury by angiotensin II: Hypertension: 45:860-866:

65. Koh G, Soonpaa M. et: al. Stable fetal cardiomyocyte graft's in- the hearts ofdystrophic mice and dogs//J Clin Invest, 1995, 96(4): 2034-42.

66. Komajda M; Charron P, Tesson F. Genetic aspects of heart failure//Eur J Heart1. Failure 1999; 121-6.

67. Magno G., Joris I. Apoptosis, oncosis, necrosis // Amer. J.Pathol. 1995, v. 146, N,1, p.3-15. 1. Abastado J.-P. Apoptosis: function and regulation of cell death // Res.Immunol. 1996, v.l47,p.443-456.

68. Manasek FJ. 1983. Control of early embryonic heart morphogenesis: a hypothesis. Ciba Found Symp. 100:4-19.

69. Megeney LA. Kablar B. Severe cardiomyopathy in mice lacking dystrophin and MyoD. Proc Natl Acad Sci USA 1999, 96: 220-5.

70. Melissa J. Spencer, Craig Mf. Waish, et al. Myonuclear Apoptosis in Dystrophic mdx Muscle Occurs by Perforin-mediated Cytotoxity//J. Clin. Invest. 1997,V.99,№11: 2745-2751.

71. Michael J. Cell Biology of Cardiac Development. Cell review 99, 2001, 99-158.

72. Mikhailov V. M., Kazakov V. I., Komarov S. A., Nilova V. K., Stein G. I'.,

73. Baranov V. S. 1999. DNA destruction and DNA synthesis by myocardial cells ofmdx mice. In: The XXVIII European Muscle Congress. Abstracts. York, UK: 189.molecular pathogenesis. Cancer Res. Sep 15;54(18):4855-78.

74. Monaco A.P, Neve R.L., Colletti-Feener C., Bertelson C.J., Kurnit D.M., Kunkel

75. M. 1986. Isolation of candidate cDNAs for portions of the Duchenne musculardystrophy, gene. Nature. 1986 Oct 16-22; 323(6089):646-50.

76. Morgenbesser SD, Williams BO, Jacks T, DePinho RA. 1994. p53-dependentapoptosis produced by Rb-deficiency in the developing mouse lens. Nature. Sepl;371(6492):72-4.

77. Olson T, Michels V., et al. Actin mutations in dilated cardiomyopathy, a heritable form of heart failure//Sciense 1998; 280.

78. Pan YZ, Wu BM, Hong XS. 1994. The clinical significance of platelet activation during exercise-induced myocardial ischemia.Zhonghua Nei Ke Za Zhi. Feb;33(2): 106-8.

79. Pasternak C., Wong S. et al. Mechanical function of dystrophin in muscle cells//J. Cell Biol. 1995, 128:355-361. Pathol. Jan;106(l):Pxi.

80. Raff MC. 1996. Size control: the regulation of cell numbers in animal development. Cell. Jul 26;86(2): 173-5.

81. Reyes et al. Mesenchymal STEM cells, 2001//Blood 98(9): 2615-2625.

82. Roell W., Fan Y. et all. Cellular cardiomyoplasty in a transgenic mouse model.2002/ATransplantation, 73(3):462-5.

83. Rogakou E. P., Pilch D. R., Orr A. H., Ivanova V.S., Bonner W. M. 1998. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273: 5858-5868.

84. Sabbah HN, Sharov VG. 1998. Apoptosis in heart failure. Prog Cardiovasc Dis. May-Jun;40(6):549-62.

85. Sakai Т., Ling Y. et all. The use of ex vivo gene transfer based on muskle derived stem sells for cardiovascular medicine, 2002//Trends Cardiovasc Med, 12(3): 11520.

86. Sarkisov DS. News concerning the study of regeneration and several problems of clinical medicine. Klin. Med, 1970 Nov;48(ll): 14-20

87. Schiaffmo S, Reggiani C. 1996. Molecular diversity of myofibrillar proteins: gene regulation and functional

88. Sinagra G, Mestroni L, Camerini F. The classification of cardiomyopathies. Cardiomyopathies 1999; p.3-8.

89. Torella D., Ellison G. M., Karakikes I., Nadal-Ginard B. Growth-factor-mediated cardiac stem cell activation in myocardial regeneration. Nature Clinical1 Practice Cardiovascular Medicine. 2007, V.4: S46-S51.

90. Torrente Y., Tremblay J. et al. Intraarterialv injection' of- muscle-derived CD(4)+Sca-1 (+) stem cells restores dystrophin in mdx mice//J Cell Biol' 2001, 152(2): 335-48.

91. Towbin J, Bowie S K, Ortiz-Lopez R, Wang Q. Genetic basis of dilated cardiomyopathy. Cardiomyopathies 1999; 56-65.

92. Tsonis P. A. Regenerative biology: the emerging field of tissue repair and restoration, 2002//Differentiation. 70(8): 397-409.

93. Tyagi S, Kumar S, Voelker DJ, et al. Differential gene expression of extracellular matrix components in dilated cardiomyopathy. J Cell Biochem 1996, november 1; 63 (2): 185-98.

94. Ueda Т., Yoshida M. et al. Hematopoetic capability of CD34+ cord blood cells: a comparison with CD34+ adult bone marrow cells//Int J Hematol 2001, 73(4): 45762.

95. Van der Ven PF, Wiesner S et all. Indications for a novel muscular dystrophy pathway. Gamma-filamin, the muscle-specific filamin isoform, interacts with myotilin. 2000 // J Cell Biol. 151(2):235-48.

96. Vaux DL, Haecker G, Strasser A. 1994. An evolutionary perspective onapoptosis. Cell. Mar ll;76(5):777-9.

97. Vilenchik M. M., Knudson A. G. 2003. Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100: 12871-12876.

98. Wakayama, Т., Tabar, V., Rodriquez, I., et al. Differentiation of embryonioc stem cell lines from adult somatic cells by nuclear transfer, 2001//Science 292: 740743.

99. Wang JS, Shum-Tim D et all. The coronary delivery of marrow stromal cells for myocardial-regeneration: pathophysiologic and therapeutic indications. 2001 //J Thorac Cardiovasc Surg. 122(4):699-705.

100. Yan L., Kitsis R. Induction of DNA Synthesis and Apoptosis in Cardiac Myocytes by El A Oncoprotein. The Journal of Cell Biology, Volume 133, Number2, 1996 325-334.

101. Zak R. 1974. Development and proliferative capacity of cardiac muscle cells. Circ Res. Aug;35(2):suppl 11:17-26.