Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дифференцировка и регенерация скелетных мышц мышей mdx после клеточной терапии стволовыми клетками костного мозга

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Дифференцировка и регенерация скелетных мышц мышей mdx после клеточной терапии стволовыми клетками костного мозга"

На правах рукописи

004605293

СОКОЛОВА Анастасия Владимировна

ДИФФЕРЕНЦИРОВКА И РЕГЕНЕРАЦИЯ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ МЫШЕИ т(1х ПОСЛЕ КЛЕТОЧНОЙ ТЕРАПИИ СТВОЛОВЫМИ КЛЕТКАМИ КОСТНОГО МОЗГА

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010

1 7 ИЮН ?9'0

004605203

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии

РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Михайлов Вячеслав Михайлович, Институт цитологии РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Михельсон Виктор Михайлович,

Институт цитологии РАН

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Баранов Владислав Сергеевич, Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН

Ведущая организация: Санкт-Петербургский государственный

Университет. Биолого-почвенный факультет

Защита состоится 28 мая 2010 года н-^-часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д.4.

Сайт института: http://www.cytspb.rssi.ru;

адрес электронной почты института: cellbio@mail.cytspb.rssi.ru;

факс института: (812) 297-03-41

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан <?Ь апреля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук ■.Е.В. Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Мышечные дистрофии представляют собой гетерогенную группу генетических расстройств, характеризующихся прогрессирующей потерей силы скелетных мышц. Одной из самых распространенных и тяжелых форм мышечной дистрофии является Х-сцепленная рецессивная мышечная дистрофия Дюшенна (МДД; см. список сокращений па с. 7) [1]. Для исследования возможностей лечения МДД используют различных животных, являющихся моделью этого заболевания [2, 3]. Наиболее широко используемой экспериментальной моделью МДД являются мыши тс1х с точечной мутацией в X-хромосоме, приводящей к блокаде синтеза связанного с мембраной белка дистрофина [4, 5]. Обширные исследования мышей гпс1х показали, что с возрастом их скелетные мышцы подвергаются структурным и функциональным изменениям, сходным с теми, которые наблюдаются при МДД [6]. В настоящее время в качестве основных патогенетических механизмов, лежащих в основе повреждения мышечных волокон в отсутствие дистрофина и ассоциированного с ним белкового комплекса, рассматриваются: 1) ослабление сарколеммы в результате потери механической поддержки, обеспечиваемой дистрофином; 2) не соответствующий нормальному уровню приток кальция в клетки; 3) нарушение передачи сигналов клетками; 4) окислительный стресс; 5) периодически повторяющаяся ишемия мышц [7, 8]. Так, показано, что развивающийся в поперечнополосатых мышечных волокнах (ППМВ) мышей тих окислительный стресс [9, 10] приводит к гибели ППМВ. Гибель мышечных волокон протекает преимущественно по типу апоптоза [11, 12, 13, 14]. За гибелью ППМВ следует регенерация. Постоянно повторяющиеся циклы дегенерации—регенерации, приводят к тому, что большая часть ППМВ имеет центрально расположенные ядра [15], указывающие на то, что дифференцировка ППМВ заторможена на стадии мышечных трубочек [14]. Кроме того, в скелетных мышцах мышей тс1х наблюдаются нарушения структуры нейромышечных соединений (НМС) [15, 16].

В настоящее время проводятся интенсивные исследования, направленные на поиски путей восстановления нормальной структуры ППМВ мышей гп(1х. В работах используют как фармакологические подходы, так и методы генной [17] и клеточной терапии [18]. Широкое распространение также получило изучение возможностей

клеточной терапии с использованием стволовых клеток. Предполагается, что вхождение в состав мутантных ППМВ ядер стволовых клеток дикого типа с нормальным генотипом способно исправить метаболизм ППМВ и превратить их в нормальные сократительные клетки. В качестве источников стволовых клеток для трансплантации предлагают, в первую очередь, костный мозг [19, 20], мышечную ткань [21]. По литературным данным, наиболее эффективными клетками оказались мезоангиобласты и перициты [22, 23]. Однако, несмотря на разнообразие источников стволовых клеток, для которых показана способность дифференцироваться в миогенном направлении, и которые, соответственно, могут использоваться для клеточной терапии мышечных дистрофий, костный мозг остается наиболее доступным источником. Кроме того, до настоящего времени не достаточно изучено влияния на дифференцировку ППМВ полной замены мутантных клеток костного мозга (ККМ) мышей тих на стволовые клетки костного мозга (СККМ) дикого типа. В частности, не получено объяснения низкой функциональной активности ядер СККМ, включившихся в состав ППМВ после такой замены. В качестве возможных агентов, стимулирующих экспрессию специфических для мышц генов с ядер трансплантированных клеток, могут, по-видимому, рассматриваться воздействия, влияющие на регенерацию тканей. В частности, способность значительно усиливать рост и регенерацию различных тканей показана для слабых комбинированных магнитных полей, настроенных на ион-параметрический резонанс для Са2+ (Са2+-КМП) [24, 25, 26, 27].

Таким образом, изучение участия СККМ, трансплантированных мышам тих, в регенерации и дифференцировке ППМВ мышей тих представляется актуальной задачей, как с точки зрения изучения регенерации скелетных мышц, так и с точки зрения разработки методов лечения МДД, моделью которой и являются мыши тих.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении влияния трансплантированных местно или внутривенно стволовых клеток костного мозга мышей С57В176 на дифференцировку и регенерацию поперечнополосатых мышечных волокон мутантных мышей тих. Для достижения данной цели решались следующие задачи:

1. Оценить участие стволовых клеток костного мозга дикого типа, трансплантированных внутримышечно или внутривенно, в регенерации поперечнополосатых мышечных волокон мышей mdx в сингенных условиях.

2. Оценить влияние внутримышечной трансплантации Lin(-) популяции стволовых клеток костного мозга дикого типа на структуру нейромышечпых соединений скелетных мышц мышей mdx.

3. Исследовать изменение дифференцировки поперечнополосатых мышечных волокон мышей mdx на разных сроках после внутримышечной трансплантации Lin(-) стволовых клеток костного мозга нормальных мышей C57BL/6 по таким признакам, как уровень гибели поперечнополосатых мышечных волокон, изменение доли поперечнополосатых мышечных волокон без центрально расположенных ядер и экспрессия дистрофика.

4. Исследовать дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон радиационных химер mdx, полученных после облучения в дозе 5 Гр, и возможность усиления дифференцировочных процессов в мышцах этих мышей под действием слабых комбинированных магнитных полей, настроенных на ион-параметрический резонанс для Са2+.

5. Исследовать дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон после сингенной внутривенной трансплантации клеток костного мозга дикого типа облученным в дозе 3 Гр мышам mdx.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. СККМ мышей C57BL/6 участвуют в регенерации ППМВ мутантных мышей mdx как после внутримышечной трансплантации, так и после внутривенного введения предварительно облученным животным.

2. Трансплантированные внутримышечно Lin(-) стволовые клетки костного мозга (Lin(-)-CKKM) мышей C57BL/6 усиливают дифференцировку ППМВ мышей mdx, что выражается в усилении синтеза дистрофина, увеличении доли ППМВ без центрально расположенных ядер (ЦЯ (-)), а также в снижении уровня гибели ППМВ.

3. Внутримышечная трансплантация Lin(-)-CKKM мышей C57BL/6 изменяет распределение кластеров (АХР) в НМС мышей mdx так, что приближает структуру НМС мышей mdx к структуре НМС нормальных мышей C57BL/6.

4. Внутривенная трансплантация ККМ мышей С57ВЬ/6 мышам тс!х, предварительно облученным рентгеновыми лучами в дозе 5 Гр, не приводит к нарастанию синтеза дистрофина в ППМВ. Воздействие Са2+-КМП усиливает дифференцировку и синтез дистрофина в скелетных мышцах радиационных химер мышей 1П(1х, полученных путем внутривенной трансплантации ККМ мышам шёх, облученным в дозе 5 Гр.

5. Сингенная внутривенная трансплантация ККМ дикого типа после рентгеновского облучения в дозе 3 Гр вызывает усиление синтеза дистрофина в ППМВ, увеличивает долю ЦЯ (-) ППМВ и снижает долю погибших ППМВ у мышей тс1х.

Научная новизна работы. Впервые показано, что внутримышечная трансплантация 1ип(-)-СККМ дикого типа приводит к изменениям структуры НМС мышей т<1х, которые приближают ее к структуре НМС нормальных мышей С57ВЬ/6.

Впервые показано, что Са2+-КМП способно влиять на функционирование ККМ, внутривенно трансплантированных мышам гш!х, облученным в дозе 5 Гр, и вызывать усиление синтеза дистрофина в ППМВ этих мышей через 2 мес после трансплантации.

Впервые показано, что внутривенная трансплантация ККМ мышам тс!х, облученным в дозе 3 Гр, приводит к увеличению доли дистрофин-положительных ППМВ и усилению дифференцировки ППМВ этих мышей на длительных сроках наблюдения (6 мес).

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание участия ККМ в регенерации ППМВ. Данные, свидетельствующие о влиянии трансплантированных внутримышечно СККМ на структуру НМС мышей тс!х, могут служить основой для дальнейших исследований возможности применения трансплантации СККМ для лечения дегенеративных нейромышечных заболеваний. Кроме того, данные об усилении синтеза дистрофина у радиационных химер шёх, полученных путем внутривенной трансплантации ККМ дикого типа мышам гпёх, облученным в дозе 3 Гр, и данные об усилении синтеза дистрофина у радиационных химер тс1х, полученных после облучения в дозе 5 Гр и дополнительно подвергавшихся действию Са2+-КМП, позволяют предлагать эти воздействия для

дальнейшей разработки способов лечения мышечной дистрофии мышей mdx и, в последующем, МДД у людей.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на конференции «Молекулярная и структурная биология» Политехнического симпозиума «Молодые ученые - промышленности Северо-Западного региона» (Санкт-Петербург, 2006), Всероссийской школе-конференции «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения» (Москва, 2008), XIV Международном конгрессе Мирового мышечного общества (Женева, Швейцария, 2009). Всероссийской научной школе-конференции «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (Москва, 2009), Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург,

2009), II Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург,

2010). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных семинарах группы генетики клеточных популяций Института цитологии РАН.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего c&tyссылок. Диссертация изложена на страницах и иллюстрирована эисунками и таблицами.

Список основных сокращений

АХР - ацетилхолиновый рецептор, ККМ - клетки костного мозга, МДД -мышечная дистрофия Дюшенна, НМС - нейромышечное соединение, ППМВ -поперечнополосатые мышечные волокна, Са2+-КМП - комбинированное магнитное поле, настроенное на ион-параметрический резонанс для Са2+ , СККМ - стволовые клетки костного мозга, ЦЯ (-) - не имеющие центрально расположенных ядер; GFP -зеленый флуоресцирующий белок, BSA - бычий сывороточный альбумин, TMR-a-ВТХ - tetramethylrhodamine-a-bungarotoxin.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. В ходе работы использовали мышей линии C57BL/6, полученных из государственного питомника Рапполово (Санкт-Петербург), мутантных мышей mdx, являющихся даром проф. Партриджа (Т.А Partridge, Hammersmith Hospital, Великобритания), и трансгенных мышей C57BL/6, экспрессирующих зеленый

флуоресцирующий белок (GFP) (Jackson Laboratory, США; дар Оклецдского детского госпиталя, Калифорния, США). Мыши содержались в виварии Института цитологии РАН на обычном питании и при стандартном световом режиме.

Выделение ККМ. Мышей линии C57BL/6 или трансгенных мышей C57BL/6, экспрессирующих GFP, забивали под эфирным наркозом, выделяли бедренные и большие берцовые кости; вымывали костный мозг из кости раствором Дальбекко без ионов Са2+ и Mg2+ (DPBS без Са2+ и Mg2+) (БиолоТ, Россия) и дополнительно разрушали костный мозг до однородной клеточной суспензии, пропуская его через иглу шприца.

Выделение Lin(-)-CKKM. Полученную суспензию ККМ наслаивали на 63 %-ный Перколл, центрифугировали при 1500 g в течение 20 мин. Отбирали клетки на границе Перколла и буфера и клеточную суспензию дважды отмывали, добавляя 7 мл того же буферного раствора и затем осаждая при 700 g в течение 10 мин. Полученные клетки ресуспендировали в DPBS без Са и Mg2+ (10106 клеток в 1 мл буфера). К суспензии ККМ добавляли антитела против мышиных антигенов CD3, CD8a, CD38, CD45R, Terl 19, Ly-6G и F4/80 (Caltag, США) из расчета 1 мкл каждого антитела на 106 клеток. Инкубировали при 10-12 °С в течение 30 мин, постоянно перемешивая. Далее осаждали клетки при 300 g, убирали супернатант и ресуспендировали клетки в прежнем объеме буфера. К суспензии клеток добавляли магнитные шарики покрытые антителами к крысиным антигенам (Dynabeads® Sheep anti-Rat IgG (Dynal Biotech ASA, Норвегия)), предварительно отмытые в соответствии с фирменной прописью. Суспензию клеток вместе с шариками инкубировали при 10-12 °С в течение 30 мин, постоянно перемешивая. Далее помещали суспензию клеток в магнитный штатив на 2 мин и отбирали жидкость, содержащую клетки, не связавшиеся с шариками. Таким образом, получали клетки, у которых отсутствует экспрессия lineage маркеров (маркеров дифференцированных клеток) и которые называют Lin(-)-CKKM [28,29].

Цитофлуориметрический анализ Lin(-)-CKKM. Полученную суспензию Lin(-)-СККМ и суспензию клеток цельного костного мозга исследовали на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter, США). Клетки окрашивали в течение 30 мин антителами к антигенам CD38, CD34, CD117, Sca-1, конъюгированными с фикоэритрином (РЕ), и антителами к CD45, конъюгированными с FITC. Удаление из суспензии ККМ дифференцированных клеток контролировали по экспрессии

антигена CD38. Данные цитометрического анализа показывают, что в суспензии Lin(-)-CKKM клетки, экспреесирующие антиген CD38, практически отсутствуют (рис. 1). Следовательно, можно предположить, что клетки, экспреесирующие другие антигены, антитела к которым мы использовали при очистке, также отсутствуют. Кроме того, примерно 93 % полученных СККМ экспрессируют CD45 (рис. 1). После

очистки двукратно увеличивалось количество CD34-, CD117- и Sea-1-положительных клеток по сравнению с исходной суспензией ККМ.

Рис. 1. Цитофлуориметрический анализ клеток цельного костного мозга (а, б) и Lin(-)-CKKM (в, г).

По горизонтали - FS, малоугловое светорассеяние (а, в) или флуоресценция клеток, связавших FITC-меченные антитела против CD45 (б, г); по вертикали - SS, боковое светорассеяние (а, в) или флуоресценция клеток, связавших РЕ-меченные антитела против CD38 (б, г).

Внутримышечная трансплантация Lin(-)-CKKM.

Мышей mdx и C57BL/6 наркотизировали нембуталом (40 мг на 1 кг веса животного). Суспензию GFP-положительных Lin(-)-CKKM вводили мышам mdx по (0.5-0.8)-106 клеток в 250 мкл в 7-9 точек одной из четырехглавых мышц бедра (m. quadriceps femoris). В контрлатеральную мышцу вводили только буфер. Мышцы исследовались через 2 нед после трансплантации. Суспензию Lin(-)-CKKM мышей C57BL/6 вводили мышам mdx по (0.5-0.8)-106 клеток в 250 мкл в 7-9 точек обеих четырехглавых мышц бедра. Мышцы, в которые водили СККМ, исследовали через 4, 8, 16 и 24 нед после трансплантации.

Создание радиационных химер mdx. Мышей mdx облучали на рентгеновском аппарате РУМ-17 (U=200 кВ. 1=13 мА; фильтр 0.5 мм Си + 1 мм А1, мощность 45 Р/мин) в дозе 5 или 3 Гр. Через сутки после облучения мышам mdx. наркотизированным нембуталом, вводили в яремную вену по (15-20)-10 ККМ трансгенных мышей C57BL/6. экспрессирующих GFP. полученных, как было описано выше. Было показано, что через 2 мес после трансплантации в костном мозгу химер mdx 5 Гр присутствовало 71.1 ±4.0 % клеток, экспрессирующих GFP, что подтверждает замену мутантных ККМ на трансплантированные стволовые клетки.

Облучение радиационных химер mdx слабым комбинированным магнитным полем. Са2+-КМП создавали с помощью установки, сконструированной

CD4iFtTC

Г.В. Соколовым (ЦНИИ им. акад. А.Н. Крылова), описанной в работе [30]. В работе использовали комбинированное магнитное поле, где постоянная составляющая магнитного поля складывалась из модуля индукции магнитного поля Земли (МПЗ) и вертикальной составляющей постоянного магнитного поля индуктора, которые создавали суммарный модуль индукции магнитного поля, равный 65.7 мкТл. Переменная компонента поля частотой fac=50 Гц создавалась индуктором и была направлена вертикально, амплитуда магнитной индукции переменной компоненты -Вас=90 мкТл. Радиационных химер mdx 5 Гр подвергали воздействию Са2+-КМП каждый день (кроме выходных) по 30 мин в течение 4 нед. Данное воздействие начинали производить через 4 нед после трансплантации ККМ. Контрольные животные находились в МПЗ (Bdc = 48 мкТл).

Гистологические и иммуногистохимические методы.

Приготовление срезов мышц. Поперечные и продольные срезы четырехглавых мышц бедра толщиной 10 мкм получали на криостате Bright Со Ltd (Великобритания) после предварительного охлаждения мышцы в жидком азоте. Подсушенные срезы фиксировали 1 мин в смеси этанола и карбинола (1:1) при температуре -20 °С или 30 мин при комнатной температуре в 10%-ном формалине (Bio Optica, Italy).

Оценка экспрессии GFP после трансплантации СККМ от GFP-положительных доноров осуществляли по собственной флуоресценции GFP. Ядра окрашивали пропидий иодидом в течение 5 мин. Срезы промывали PBS и заключали в глицерин. Полученные препараты исследовали на конфокальном микроскопе LSM 5 Pascal (Carl Zeiss) или на конфокальном микроскопе Leica TCS SL (Leica Microsystems).

Иммуногистохимия. На срезы, толщиной 10 мкм, фиксированные в смеси этанола и карбинола, наносили 1%-ный бычий сывороточный альбумин (BSA) (Sigma, США) на 30 мин. Срезы отмывали 5 мин в PBS (Биолот, Россия). Наносили поликлональные кроличьи антитела к дистрофину (Abeam, США) в разведении 1:100 на 1 ч. На часть срезов вместо антител наносили PBS для последующего контроля неспецифического связывания вторичных антител. Срезы отмывали в PBS 3 раза по 5 мин. Наносили вторичные антитела (goat anti-rabbit), меченные F1TC (Sigma, США), в разведении 1:150 на 1 ч. Промывали срезы в PBS 3 раза по 5 мин. Ядра докрашивали DAPI или иодидом пропидия, и срезы заключали в глицерин. Полученные препараты исследовали на конфокальном микроскопе LSM 5 Pascal (Carl Zeiss).

На срезы, толщиной 10 мкм, фиксированные в смеси этанола и карбинола, наносили 1%-ный BSA на 30 мин. Срезы отмывали 5 мин в PBS и инкубировали или с поликлональными кроличьими антителами к дистрофину (Abeam, США) в разведении 1:100, или с кроличьими антителами к GFP (Sigma, США) в разведении 1:100 при +4 °С в течение ночи. На часть срезов вместо антител наносили PBS для последующего контроля неспецифического связывания вторичных антител. Далее наносили раствор 0.03 %-ной Н202 на 30 мин. Для уменьшения неспецифического связывания стрептоавидина с эндогенным биотином на срезы наносили реагенты Avidin/Biotin Bloking Kit (Zymed Laboratories Inc., Invitrogen, США) согласно фирменной прописи. Затем наносили вторичные анти-кроличьи антитела, меченные биотином в разведении 1:100 (Sigma, США) на 1 ч. На срезы наносили стрептоавидин, конъюгированный с пероксидазой, в разведении 1:200 (Sigma, США) на 30 мин. После каждого описанного этапа срезы промывали в PBS 3 раза по 5 мин. Далее наносили диаминобензидин (10 мг диаминобензидина растворяли в 10 мл PBS и смешивали с 0.5 мл 0.1%-ного раствора Н202 в PBS) на 5 мин. Затем промывали в проточной воде. При слабой реакции срезы дополнительно инкубировали в диаминобензидине с ацетатом кобальта в течение 5 мин и далее отмывали в проточной воде [31]. Ядра докрашивали красителем Гимза. Далее срезы обезвоживали в этанолах возрастающей концентрации, проводили через 3 порции ксилола и заключали в канадский бальзам.

Окраска гематоксилином и эозином производили по общепринятой методике.

Определение площади ППМВ. Срезы, окрашенные гематоксилином-эозином, исследовали на микроскопе Axiophot (Zeiss), изображение получали с помощью камеры Baumer optronic и выводили на экран монитора, далее с помощью программы ВидиоТест-Размер5.0 (Россия) измеряли площадь ППМВ.

Исследование нейромышечных соединений. На продольные и поперечные срезы мышц, фиксированные в формалине, наносили tetramethylrhodamine-a-bungarotoxm (TMR-a-BTX) (Biotium, США) в концентрации 1 мкг/мл. TMR-a-BTX специфически связывается с АХРами. Затем срезы промывали в PBS 3 раза по 5 мин и заключали в реагент, уменьшающий неспецифическую флуоресценцию (Biomeda corp, США). Приготовленные препараты просматривали на конфокальных микроскопах LSM 5 Pascal (Carl Zeiss, Германия) или Leica TCS SL (Leica Microsystems, Германия). Ha

полученных снимках поперечных срезов мышц в программе ImageJ (National Institutes of Health, США) определяли площадь НМС. На продольных срезах ткани также в программе ImageJ измеряли общую площадь, занимаемую НМС на ППМВ, площади отдельных кластеров АХР, составляющих НМС, и количество таких кластеров в каждом НМС. Измерение общей площади производили по минимальной внешней границе, заключающей все кластеры АХР, составляющих НМС.

Полученные данные статистически обрабатывали в программе MS Excel. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при р<0.05.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ Участие Lin(-)-CKKM в регенерации ППМВ мышей mdx после внутримышечной трансплантации. В настоящее время широко исследуются возможности применения клеточной терапии для лечения МДД. В наших экспериментах источником клеток для клеточной терапии мышей mdx служил костный мозг. В первой части работы изучали влияние трансплантированных внутримышечно ККМ, не содержащих дифференцированных клеток (Lin(-)-CKKM), на регенерацию и дифференцировку мышц мышей mdx. Показано, что после внутримышечной трансплантации Lin(-)-CKKM трансгенных мышей C57BL/6, экспрессирующих GFP, мышам mdx и мышам C57BL/6 в течение 2 нед введенные клетки сохраняются в мышце. Кроме того, наблюдается присутствие GFP-положительных (GFP (+)) ППМВ как у мышей mdx, так и у мышей C57BL/6 (рис. 2, табл. 1). Присутствие GFP (+) ППМВ свидетельствует о том, что данные волокна содержат ядра донорского происхождения и что, соответственно, трансплантированные клетки участвовали в регенерации этих ППМВ. Количество

GFP (+) ППМВ значительно выше у мышей mdx по сравнению с мышами дикого типа (табл. 1). Это, вероятно, связанно с тем, что для мышей mdx

Рис. 2. Экспрессия GFP в ППМВ мышей mdx через 2 недели после внутримышечной трансплантации Lin(-)-CKKM.

Ядра окрашены иодидом пропидия. Об. 20х 1. - окраска ядер иодидом пропидия; 2, - естественная флуоресценция GFP; 3 - совмещенное изображение.

характерен высокий уровень гибели ППМВ и, соответственно, высокий уровень регенерации. Постоянно протекающая в мышце регенерация приводит к значительно более высокому потреблению мышцей стволовых клеток.

Таблица 1. Экспрессия GFP в ППМВ мышей C57BL/6 и mdx после внутримышечной трансплантации Lin(-)- GFP (+) СККМ

Исследуемое животное GFP (+) ППМВ, %

Опытная мышца Контрлатеральная мышца

C57BL/6 (4) 0.2±0.1 0.10±0.05

mdx (6) 2.0±0.8 1.2±0.6

Примечание: в этой и табл. 2, 3, 4, 5 в скобках указано количество животных в каждой группе.

Кроме того, GFP (+) клетки и GFP (+) ППМВ были обнаружены и в контрлатеральной мышце, в которую вместо клеток вводили только буфер (табл. 1). Эти данные свидетельствуют о том, что после локального введения СККМ способны покидать область трансплантации и распространяться в другие органы и ткани, что говорит о необходимости более тщательного контролирования поведения СККМ даже в условиях местного воздействия.

Внутримышечное введение Lin(-)-CKKM вызывает усиление дифференцировки ППМВ мышей mdx. Как уже было описано выше, в ППМВ мышей mdx отсутствует белок дистрофии. Поэтому для оценки эффективности клеточной терапии мы в первую очередь подсчитывали долю дистрофин-положительных (дистрофии (+)) ППМВ у контрольных мышей mdx и у мышей mdx после внутримышечной трансплантации СККМ. Известно, что, несмотря на дефект гена дистрофина у мышей mdx в мышцах присутствует небольшая доля ППМВ, содержащих дистрофии, так называемых ревертантных мышечных волокон [32]. В нашем исследовании у контрольных мышей mdx, не подвергавшихся трансплантации СККМ, также были обнаружены отдельные небольшие группы ППМВ, экспрессирующие дистрофии (рис. 3, б).

В исследованиях по внутримышечному введению СККМ, экспрессирующих GFP, мы наблюдали GFP (+) ППМВ уже через 2 нед после трансплантации, что свидетельствует о включении ядер введенных клеток в ППМВ мышей mdx. Однако мы не наблюдали увеличения доли дистрофии (+) ППМВ ни через 4, ни через 8 нед после трансплантации (табл. 2), что согласуется с данными других авторов [33].

Рис. 3. Дистрофин-положительные ППМВ на поперечных срезах четырехглавых мышц бедра мышей C57BL/6 (a), mdx (б) и mdx через 16 нед после внутримышечной трансплантации СККМ (в).

Волокна мечены антителами к днстрофину, вторичные - FITC. Ядра окрашены DAPI (синий цвет). Масштабный отрезок 50 мкм.

Отсутствие синтеза дистрофина в мышцах мышей mdx после трансплантации им СККМ дикого типа, по мнению одного из них [34], отражает блокаду экспрессии мышечных генов в ядрах дикого типа, включившихся в состав мутантных ППМВ.

Таблица 2. Характеристика ППМВ в четырехглавой мышце бедра контрольных мышей mdx и мышей mdx после внутримышечной трансплантации СККМ

Время после трансплантации СККМ, нед Дистрофии (+) ППМВ, % ЦЯ (-) ППМВ, % Погибших ППМВ, %

0(контроль) 0.47 ±0.09 (3) 10.5 ± 1.0(11) 2.2 ±0.3 (11)

4(3) 0.69 ±0.2 12.5 ± 1.8 1.0 ±0.2

8(5) 0.57 ±0.07 18.0 ± 1.0 1.2 ±0.2

16(6) 1.69 ±0.3 18.1 ±0.8 1.4 ±0.2

24 (5) 1.79 ±0.4 16.0 ± 1.2 0.95 ± 0.07

Тем ни менее, через 16 и 24 нед после трансплантации мы зарегистрировали нарастание доли ППМВ, содержащих дистрофии (табл. 2, рис. 3, в). Увеличение доли дистрофии (+) ППМВ свидетельствует о начале экспрессии гена дистрофина донорских ядер в составе ППМВ мышей гг^х и, соответственно, об усилении дифференцировки ППМВ [14].

Так как отсутствие дистрофина приводит к гибели ППМВ у мышей гг^х, то для мышц мышей гг^х характерно присутствие определенного количества погибших ППМВ (рис. 4, б). Снижение доли погибших ППМВ регистрируется, начиная с 4-й недели после трансплантации (табл. 2), (рис. 4, в). Кроме того, большая часть ППМВ у мышей гт^х имеют центрально расположенные ядра (рис. 4. г). Начиная с 8-й недели после трансплантации, доля ЦЯ (-) ППМВ превышает характерную для мышей гг^х долю (рис. 4, <3), и не уменьшается на более поздних сроках (табл. 2). Для мышей тёх, так же характерно уменьшение средних поперечных размеров

и о «

% l)

Рис. 4. Поперечный срез четырехглавой мышцы бедра мышей нормальных C57BL/6 (a), mdx (б, г) и mdx через 16 нед после внутримышечной трансплантации СККМ (в, <)).

а - ПГТМВ с периферически расположенными ядрами; б - очаг гибели ППМВ; в - уменьшение области дегенерации ППМВ через 16 нед после трансплантации СККМ; г -центральное расположение ядер у

основной части ППМВ; д - мышечных волокон и больший разброс диаметра возрастание числа ППМВ без

центрально расположенных ядер через ППМВ по сравнению с мышами дикого типа [14, 16 нед после трансплантации СККМ.

Окраска гематоксилин-эозином. Ув.: 151 (Рис- 4> а и г')• После трансплантации Lin(-)-об2°х' СККМ наблюдается тенденция к увеличению

площади поперечного сечения ППМВ. Так, у контрольных мышей mdx площадь поперечного сечения ППМВ составляет 2064.6 ±195.3 мкм2, через 4 нед и 16 нед после введения СККМ - 2263.2 ± 138.1 мкм2 и 2429.7 ± 211.4 мкм" соответственно, и у нормальных мышей C57BL/6 - 2615.6 ± 107.2 мкм2.

Изменение структуры НМС мышей mdx после внутримышечного введения Lin(-)-CKKM. Как было описано выше, внутримышечная трансплантация Lin(-)-СККМ дикого типа усиливает дифференцировку ППМВ мышей mdx, однако стабильная дифференцировка ППМВ невозможна без взаимодействия с нервной системой и образования дифференцированных НМС. Как и описано в литературе [15, 35, 36, 37 ,38, 39], распределение АХРов в НМС мышей mdx изменено по сравнению с мышами дикого типа. Если НМС мышей C57BL/6 состоят из нескольких кластеров АХРов, и при окраске продольных срезов TMR-a-BTX эти кластеры имеют форму ветвей (рис. 5, а), то у мышей mdx структура НМС нарушена, что выражается в распаде больших кластеров АХР на более мелкие и в приобретении ими формы отдельных островков (рис. 5, б). При этом число кластеров АХР, составляющих НМС, у мышей mdx увеличено по сравнению с НМС дикого типа, а площадь отдельных кластеров снижена (табл. 3).

Уже через 4 нед после трансплантации Lin(-)-CKKM количество кластеров АХР, составляющих НМС, уменьшается. Одновременно их площадь увеличивается (табл. 3). При этом увеличение размеров кластеров АХР не сопровождается увеличением

а 4 • 6

Рис. 5. НМС на продольных срезах четырехглавой мышцы бедра мышей С57ВЬ/6 (а), мышей тс!х контрольных (б), через 4 (в) и 16 (г) нед после введения

сккм.

Окраска ТМЯ-а-ВТХ. Масштабный отрезок 37.5 мкм.

а - у нормальных мышей С57В176 НМС состоит из кластеров АХР, имеющих форму протяженных ветвей; б - разрушение больших кластеров АХР в НМС мышей тс!х на более мелкие, имеющие форму отдельных островков; в - через 4 нед после трансплантации СККМ уменьшается число кластеров АХР в НМС и возрастает их площадь; г - через 16 нед после трансплантации СККМ площадь кластеров АХР возрастает, а их количество увеличивается, что приводит к росту общей площади НМС.

как величины общей площади НМС,

так и суммарной площади кластеров АХР (рис. 5, в). Можно заключить, что увеличение размеров кластеров АХР в ранних сроках после клеточной терапии происходит за счет слияния АХР в пространстве НМС. Наиболее вероятно, что наблюдаемое нами увеличение размеров отдельных кластеров АХР на 4-й неделе после трансплантации является следствием паракринного влияния трансплантированных и прижившихся в мышце СККМ.

Таблица 3. Характеристика НМС по продольным срезам мышц нормальных

мышей С57ВЬ/6 и мышей тс!х после клеточной терапии

Исследуемые животные Площадь отдельных кластеров АХР, мкм2 Среднее число кластеров АХР в НМС Площадь НМС, 2 МКМ Сумма площадей кластеров АХР, составляющих НМС, мкм2

С57ВЬ/6 (3) 129.2 ±23.1 2.22 ± 0.04 403.8 ± 77.1 291.5 ±50.3

тс!х (контроль), (3) 58.0 ±3.9 4.7 ±0.3 385.4 ±51.6 273.6 ±30.5

шёх, 4 нед после трансплантации СККМ (3) 80.0 ±4.9 3.7 ± 0.1 364.2 ± 10.9 296.5 ± 12.9

тёх, 16 нед

после трансплантации СККМ (3) 93.9 ±4.6 4.7 ±0.1 666.0 ±46.1 438.7 ± 13.7

Через 16 нед после трансплантации СККМ количество кластеров АХР, составляющих НМС, возрастает до уровня, характерного для контрольных мышей

тих, и при этом площадь отдельных кластеров АХР остается выше площади кластеров АХР у контрольных мышей тих (табл. 3). Одновременно наблюдается рост общей площади НМС (рис. 5, г). Эти изменения в НМС коррелируют с усилением в ППМВ синтеза дистрофина.

Для оценки изменения структуры НМС мышей тих после клеточной терапии Ып(-)-СККМ дикого типа мы также измерили площади НМС на поперечных срезах мышц. У контрольных мышей тих площадь НМС составила 78.4 ± 5.1 мкм2. После внутримышечного введения СККМ на сроке 4 нед после трансплантации площадь НМС превышает значение (р<0.05), полученное для контрольных мышей тих, приближается к соответствующему значению для нормальных мышей С57ВЬ/6 (102.8 ± 3.0 мкм2) и составляет 106.9 ± 3.4 мкм2. Через 8, 16 и 24 нед после трансплантации СККМ площадь НМС соответственно равна 91.6 ± 2.7, 104.3 ±10.5 и 97.2 ± 6.2 мкм2, что не отличается от контрольных животных (р<0.05).

Таким образом, однократная внутримышечная трансплантация Ьт(-)-СККМ дикого типа вызывает частичное восстановление структуры НМС скелетных мышц у мутантных мышей тих, приближая её к структуре НМС ППМВ нормальных мышей С57ВЬ/6. Улучшение структуры НМС мышей тих после клеточной терапии СККМ происходит на фоне развития дифференцировки мутантных ППМВ, которое выражается в усилении синтеза дистрофина и увеличении доли ЦЯ (—) ППМВ, а также в уменьшении доли погибших ППМВ.

Участие СККМ в регенерации и дифференцировке ППМВ радиационных химер тс1х. В ходе опытов мыши тих и С57ВЬ/6 облучали в дозе 5 Гр, через сутки облученным мышам внутривенно вводили ККМ трансгенных мышей С57ВЬ/6, экспрессирующих ОРР. Через 2-3 мес после трансплантации СП-Р (+) клетки были обнаружены в костном мозге, крови, поперечнополосатых мышцах, в миокарде, печени, надпочечниках, щитовидной железе, почке мышей-реципиентов. Таким образом, экспериментальные животные представляли собой радиационных химер, содержащих как собственные клетки, так и клетки ОРР-положительных доноров.

Как и после внутримышечного введения СККМ, в мышцах радиационных химер тих присутствовали СИР (+) ППМВ, однако усиления экспрессии дистрофина в ППМВ мы не наблюдали. Так, через 2 мес после замены костного мозга доля дистрофии (+) ППМВ оставалась на уровне контрольных мышей тих и составляла

порядка 1 % . Кроме того, у химер тс!х не наблюдалось значительного снижения доли погибших ППМВ и нарастания доли ЦЯ (-) ППМВ. Таким образом, несмотря на то, что замена костного мозга позволяет доставлять стволовые клетки дикого типа в скелетные мышцы и доказано их участие в регенерации ППМВ, низкая эффективность такой трансплантации для мышц, регистрируемая по незначительному нарастанию экспрессии дистрофина, не позволяет использовать данный подход в качестве эффективного способа лечения МДЦ. По-видимому, для повышения экспрессии дистрофина после тотальной замены костного мозга необходимы дополнительные воздействия на мышей-реципиентов с целью усиления функциональной активности трансплантированных стволовых клеток дикого типа.

Влияние Са2+-КМП на участие СККМ в дифференцировке ППМВ химерных мышей тс1х. Известно, что слабые магнитные поля влияют на биологические объекты [24]. Так, показано, что воздействие Са2+-КМП значительное усиливает рост и регенерацию костей [25, 26]. Кроме того, описано, что Са2+-КМП ускоряет регенерацию головы у планарий [27]. В связи с этим нами было исследована возможность использования Са2+-КМП в качестве фактора, стимулирующего регенерацию и дифференцировку ППМВ химерных мышей тс!х.

Показано, что у радиационных химер тс!х после воздействия Са -КМП в течение 1 мес, наблюдалось значительное возрастание доли дистрофии (+) ППМВ по сравнению с контрольными группами (табл. 4, рис. 6). Доля ЦЯ (-) ППМВ также нарастала (табл. 4). При этом уровень гибели ППМВ во всех группах животных не изменялся (табл. 4).

Таблица 4 Характеристика ППМВ в четырехглавой мышце бедра контрольных мышей тс!х и мышей тс1х после облучения в дозе 5 Гр и внутривенного введения ККМ и воздействия Са2+-КМП

Исследуемое животное Дистрофии (+) ППМВ, % Погибшие ППМВ, % ЦЯ (-) ППМВ, %

тёх, контроль (3) 1.1±0.4 2.2±0.6 10.5±1.0

тс1х, 2 мес после облучения в дозе 5 Гр и введения ККМ (3) 1.2±0.6 1.6±0.2 11.2±1.5

тс!х, 2 мес после облучения в дозе 5 Гр, введения ККМ и воздействия Са2+-КМП (5) 15.8±3.8 2.1±0.6 22.8±3.0

Рис. 6. Дистрофии (+) ППМВ у мышей С57ВЬ/6 (а), mdx контрольных (б) и химеры п^х после воздействия Са2+-КМП (в).

ППМВ мечены антителами к дистрофину, вторичные антитела мечены пероксидазой. Ядра окрашены красителем Гимза. Ув.: об.

20х.

Таким образом, воздействие Са2+-

КМП значительно повышает

эффективность трансплантации ККМ мышам шёх после облучения в дозе

5 Гр. Данный физический фактор вероятно может или интенсифицировать функционирование донорских ядер, включившихся в состав ППМВ, или усиливать регенерацию, осуществляющуюся за счет ККМ, заменяя большее количество мутантных ядер ППМВ мышей тёх на ядра дикого типа из костного мозга.

2.3. Влияние замены костного мозга на фоне рентгеновского облучения в дозе 3 Гр на дифференцировку ППМВ мышей п^х. Основную часть исследований участия ККМ в регенерации скелетных мышц мышей тёх производили на радиационных химерах, полученных путем введения ККМ мышам, предварительно облученным летальными дозами или рентгеновского, или у-излучения [19, 33]. В свою очередь показано, что донорский химеризм в костном мозге мышей после трансплантации ККМ наблюдается и в случае, если клетки трансплантировались животным, предварительно облученным в дозе 3 Гр. 1.6 Гр [40] и даже необлученным мышам [41]. В связи с этим было принято решение о снижении дозы облучения до 3 Гр при приготовлении химер тёх. Оказалось, что, в соответствии с литературными данными [40], у мышей, облученных в такой дозе, наблюдается присутствие значительного количества СРР (+) в костном мозге. Так же, как и у облученных большими дозами животных, введенные клетки распространялись по организму животного, и их присутствие наблюдалось в мышцах, сердце, надпочечнике и других органах.

Как и в предыдущих экспериментах, в мышцах химер мышей тёх имелись как ППМВ. экспрессирующие СРР, так и отдельные вГР (+) клетки. Обнаружено, что доля дистрофии (+) ППМВ нарастает с течением времени у химер тёх, полученных при облучении в дозе 3 Гр (табл 5. рис. 7). Кроме того, после трансплантации ККМ

мышам тёх, облученным в дозе 3 Гр, наблюдалось снижение уровня гибели ППМВ и нарастание доли ЦЯ (-) ППМВ (табл 5).

Таблица 5. Характеристика ППМВ в четырехглавой мышце бедра контрольных мышей тс1х и мышей тс!х после облучения в дозе 3 Гр и внутривенного введения

ККМ.

Время после трансплантации ККМ, мес Дистрофин(+) ППМВ, % Погибших ППМВ, % ЦЯ (-) ППМВ, %

0, контроль 1. 1±0.4 (3) 2.2±0.6 (3) 10.5± 1.0 (3)

2 4.1±0.9 (3) 1.4±0.3 (4) 16.1± 1.7 (4)

6 27.6±6.7 (5) 0.7±0.1 (5) 22.6±1.9 (5)

Рис. 7. Дистрофии (+) ППМВ на поперечных срезах четырехглавой мышцы бедра мышей тих (а, б), нормальных С57ВЬ/6 (в, г) и химеры тих 3 Гр, через 6 мес после трансплантации ККМ (д, е).

Окраска на дистрофин. Вторичные антитела, меченные пероксидазой. Ядра окрашены красителем Гимза. а, в, й-ув.: об. 10х. б, г, е-ув.: об. 40х.

Таким образом, мы наблюдали значительное усиление дифференцировки ППМВ химерных мышей тих через 6 мес после трансплантации ККМ. Следовательно, снижение дозы облучения повышает эффективность участия введенных СККМ в регенерации ППМВ. Так, по литературным данным [331, введение ККМ мышам тих, облученным в дозе 9 Гр, не вызывает достоверного усиления экспрессии дистрофина ни на ранних сроках (1, 3 мес), ни на рассматриваемом нами сроке 6 мес. Аналогичное отсутствие нарастания синтеза дистрофина мы наблюдали и в наших экспериментах на химерах, полученных после облучения в дозе 5 Гр.

Выводы

1. Стволовые клетки костного мозга мышей C57BL/6 участвуют в регенерации поперечнополосатых мышечных волокон мышей mdx как после внутримышечной, так и после внутривенной трансплантации.

2. Внутримышечная сингенная трансплантация Lin(-) стволовых клеток костного мозга мышей C57BL/6 усиливает дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон мышей mdx; при этом, в первую очередь, уменьшается доля погибших поперечнополосатых мышечных волокон, на более длительных сроках наблюдения увеличивается доля поперечнополосатых мышечных волокон, не имеющих центрально расположенных ядер, и возрастает доля дистрофин-положительных поперечнополосатых мышечных волокон.

3. Сингенная внутримышечная трансплантация Lin(-) популяции стволовых клеток дикого типа мышам mdx частично улучшает структуру нейромышечных соединений скелетных мышц, приближая её к структуре нейромышечных соединений скелетных мышц нормальных мышей C57BL/6.

4. Воздействие слабых комбинированных магнитных полей, настроенных на ион-параметрический резонанс для Са2+ усиливает дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон и синтез дистрофина в скелетных мышцах радиационных химер mdx.

5. Сингенная внутривенная трансплантация клеток костного мозга дикого типа мышам mdx, облученных в дозе 3 Гр, усиливает дифференцировку и синтез дистрофина в поперечнополосатых мышечных волокон мышей mdx.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Михайлов В.М., Евтифеева Е.В., Переверзев А.Е., Зенин В.В., Карманова A.B. , Сериков В.Б. 2005. Различная степень участия GFP-положительных стволовых клеток костного мозга в регенерации скелетных мышц мышей mdx и C57BL/6. Онтогенез. 36 (5): 384-385.

2. Михайлов В.М., Евтифеева Е.В., Сериков В.Б., Переверзев А.Е., Карманова A.B., Зенин В.В. 2006. Участие стволовых клеток костного мозга в дифференцировке поперечнополосатых мышц мышей mdx. Цитология. 48 (5): 410-417.

3. Карманова A.B.. Михайлов В.М. 2006. Влияние клеточной терапии на дифференцировку скелетных мышц мышей mdx. Молодые ученые - промышленности

Северо-Западного региона: Материалы конференций политехнического симпозиума. Декабрь 2006 года. 1:193.

4. Михайлов В.М., Карманова А.В.. Зенин В.В., Сериков В.Б. 2006. Генно-клеточная терапия скелетных мышц мышей mdx. Клеточные культуры: информационный бюллетень. СПб.: Ассоциация специалистов по клеточным культурам, Институт цитологии РАН. 21: 1726.

5. Карманова А.В.. Михайлов В.М. 2007. Изменения структуры нейромышечных соединений мышей mdx после клеточной терапии стволовыми клетками костного мозга. Клеточные культуры: информационный бюллетень. СПб.: Ассоциация специалистов по клеточным культурам, Институт цитологии РАН. 22: 10-16.

6. Михайлов В.М., Соколова А.В.. Зенин В.В., Кузоватов С.Н., Каминская Е.В. 2008. Внутривенная трансплантация стволовых клеток костного мозга «дикого типа» облученным мышам mdx стимулирует дифференцировку поперечно-полосатых мышечных волокон. Клеточные культуры: информационный бюллетень. СПб.: Ассоциация специалистов по клеточным культурам, Институт цитологии РАН. 23: 30-35.

7. Соколова А.В.. Зенин В.В., Михайлов В.М. 2008. Клеточная терапия Lin(-) стволовыми клетками костного мозга мышей C57BI/6 усиливает дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон мышей mdx. Материалы Всероссийской школы-конференции: «Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения», Москва, 9-11 июня 2008 г. 1: 50.

8. Sokolova A.V.. Zenin V.V., Mikhailov V.M. 2008. Size of neuromuscular junction as mark of success of mdx mice striated muscle fibers differentiation after bone marrow stem cells therapy. Abstracts of the Keystone Symposia on Molecular and cellular Biology: Stem Cells, Cancer and Aging, September 29 - October 4,2008, Singapore. 1:78.

9. Sokolova A. Zenin V, Mikhailov V. 2008. Lin(-) Bone marrow stem cells transplantation restores normal structure of mdx mice neuromuscular junctions. Abstracts of the AABB Annual Meeting and TXPO. October 4-8, 2008. Montreal, Quebec, Canada, Transfusion. 48(Suppl 2): 140.

10. Соколова A.B.. Зенин B.B., Михайлов В.М. 2009. Восстановление структуры нейромышечных соединений скелетных мышц мышей mdx после клеточной терапии стволовыми клетками костного мозга. Материалы Всероссийской научной школы-конференции: «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования», Москва, 21-26 сентября 2009 г. 1: 67-68.

11. Sokolova A.V.. Zenin V.V., Mikhailov V.M. 2009. Lin(-) bone marrow stem cells transplantation repairs structure of mdx mice neuromuscular junctions. Abstracts of the 14th International Congress of the World Muscle Society, Geneva, Switzerland, 9th - 12th September 2009. Neuromuscular Disorders 19(8-9): 634

12. Михайлов B.M., Арсеньев A.B., Белова H.A., Дудин М.Г., Соколова А.В.. Соколов Г.В. 2009. Магниточувствителыюсти клеточных популяций костно-хрящевой ткани и перспективы использования слабых магнитных полей в вертебрологии. Материалы Республиканской научно-практической конференции: «Развитие вертебрологии на современном этапе», Минск, 1-2 октября 2009 года. 1: 225-227

13. Соколова А. В.. Зенин В. В., Михайлов В. М. 2009. Трансплантация Lin(-) стволовых клеток костного мозга дикого типа улучшает дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон мутантных мышей mdx. Цитология. 51 (9):786-787.

14. Соколова А.В., Зенин В.В., Михайлов В.М. 2010. Структура нейромышечных соединений и дифференцировка поперечнополосатых мышечных волокон у мышей mdx после клеточной терапии стволовыми клетками костного мозга. Цитология. 52 (5):399-406.

15. Соколова А.В.. Михайлов В.М. 2010. Трансплантация стволовых клеток костного мозга как способ лечения миодистрофии мышей mdx. Цитология. 52(5): 451.

' - с 08.2007 г. - Соколова А.В.

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Dalkilic I., Kunkel L.M. 2003. Curr. Opin. Genet. Dev. 13: 231-238. 2. Watchko J.F. et al. 2002. J. Appl. Physiol. 93: 407-417. 3. Collins C.A., Morgan J.E. 2003. Int. J. Exp. Pathol. 84: 165172. 4. Bulfield G. et al. 1984. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 1189-1192. 5. Sicinski P. et al. 1989. Science. 244: 1578-1580. 6. Partridge T.A. 1997. In: Dystrophin - gene, protein and cell biology. Cambridge: University Press. 1: 310-327. 7. Petrof B.J. 2002. Am. J. Phys. Med. Rehabil. 81: SI62-174. 8. Dudley R.W. et al. 2006. Am. J. Pathol. 168: 1276-1287. 9. Niebroj-Dobosz I., Hausmanowa-Petrusewicz I. 2005. Acta Biochim. Pol. 52: 449-452. 10. Tidball J.G., Wehling-HenricksM. 2007. J. Appl. Physiol. 102: 1677-1686. 11. MatsudaR. et al. 1995. J. Biochem. 118: 959-964. 12. Tidball J.G. et al. 1995. J. Cell Sci. 108: 2197-2204. 13. Spencer M.J. et al. 1997. J. Clin. Invest. 99: 2745-2751. 14. Михайлов В.М. и др. 1998. Цитология. 40(5): 394-400. 15. Torres L.F., Duchen L.W. 1987. Brain. 110: 269-299. Id. Kitaoka K. et al. 1997. J. Electron. Microsc. (Tokyo). 46: 193-197. 17. Chamberlain J.S. 2002. Hum. Mol. Genet. 11(20): 2355-2362. 18. Farini A. et al. 2009. J. Cell Physiol. 221(3): 526-534. 20. Bittner R.E. et al. 1999. Anat. Embryol. (Berl). 199: 391-396. 19. Gussoni E. et al. 1999. Nature. 401: 390-394. 21. Peault B. et al. 2007. Mol. Ther. 15: 867-877. 22. Galvez B.G. et al. 2006. J. Cell Biol. 174: 231-243. 23. Dellavalle A. et al. 2007. Nat. Cell Biol. 9: 255-267. 24. Леднев В.В. 1996. Биофизика. 1: 224232. 25. Liboff A.R. et al. Patent 4.932.951 USA. Date of patent 12.06.1990 - p. 17. 26. Арсеньев А.В. и др. 2007. Травматология и ортопедия России, приложение. 3(45): 12. 27. Тирас Х.П. и др. 1996. Биофизика. 41(4): 826-831. 28. Spangrude G.J. et al. 1988. Science. 241: 58-62. 29. Orlic D. et al. 2001. Nature. 410: 701-705. 30. Дудин М.Г. и др. Патент 2212258 РФ. опубл. 20.09.2003, Бюл. № 26. - 20 с. 31. Полак Дж., Ван Норден С. 1987. Пер. с англ. - М.: Мир. -74 с. 32. Lu Q.L. et al. 2000. J. Cell Biol. 148: 985-996. 33. Chretien F. et al. 2005. Am. J. Pathol. 166: 1741-1748. 34. Cossu G. 2004. J. Clin. Invest. 114: 1540-1543. 35. Kong J., Anderson J.E. 1999. Brain Res. 839: 298-304. 36. Rafael J.A. et al. 2000. Hum. Mol. Genet. 9: 1357-1367. 37. Minatel E. et al. 2001. Muscle Nerve. 24: 410-416. 38. Marques M.J. et al. 2007. Anat. Rec. 290: 846-854. 39. Marques M.J. et al. 2007. Anat. Rec. 290: 181-187. 40. Goebel W.S. et al. 2002. Exp. Hematol. 30: 1324-1332. 41. Stewart F.M. et al. 1993. Blood. 81: 2566-2571.

Лицензия ЛР № 020593 от 07.08.97

Подписано в печать 20.04.2010. Формат 60x84/16. Печать цифровая. Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 5923Ь.

Отпечатано с готового оригинал-макета, предоставленного автором, в Цифровом типографском центре Издательства Политехнического университета. 195251, Санкт-Петербург, Политехническая ул., 29. Тел.: (812)550-40-14 Тел./факс: (812) 297-57-76

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколова, Анастасия Владимировна

Список сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.

1. Дифференцировка и регенерация поперечнополосатых скелетных мышц.

1.1. Развитие скелетных мышц в эмбриогенезе.

1.2. Формирование нейромышечных соединений.

1.3. Регенерация скелетных мышц.

1.4. Миогенные клетки в регенерации скелетных мышц.

2. Мышечная дистрофия Дюшенна.

2.1. Дистрофии и дистрофин-ассоциированный гликопротеиновый комплекс.

2.2. Мыши тсЫ как животная модель мышечной дистрофии Дюшенна.

2.3. Лечение мышечной дистрофии Дюшенна.

2.3.1. Генная терапия мышечной дистрофии Дюшенна.

2.3.2. Клеточная терапия мышечной дистрофии Дюшенна.

3. Воздействие слабых комбинированных полей на биологические объекты.

3.1. Ионный циклотронный резонанс (модель А.Р. Либова).

3.2. Теория магнитного параметрического резонанса (в биосистемах) (Теория В.В. Леднева).

И. Материалы и методы.

1. Животные.

2. Внутримышечная трансплантация 1лп(-)-СККМ мышей С57ВЬ/6 и С57ВЬ/6, экспрессирующих ОБР, мышам тс!х.

2.1. Выделение Ып(-)-СККМ.

2.2. Цитофлуориметрический анализ Ып(-)-СККМ.

2.3. Внутримышечная трансплантация Lin(-)-CKKMмышам mdx.

3. Создание радиационных химер.

4. Облучение радиационных химер mdx слабым комбинированным магнитным полем.

5. Гистологические и иммуногистохимические методы.

5.1. Получение срезов мышц.

5.2. Оценка экспрессии GFP после трансплантации СККМ GFP (+) доноров.

5.3. Иммуногистохимия.

5.4. Окраска гематоксилином-эозином.

5.5. Определение площади ППМВ.

6. Исследование НМС.

III. Результаты.

1. Влияние внутримышечной трансплантации Lin(-)-CKKM на регенерацию и дифференцировку ППМВ мышей mdx.

1.1. Участие GFP (+) Lin(—)-CKKM в регенерации ППМВ мышей mdx после внутримышечной трансплантации.

1.2. Внутримышечное введение Lin(—)-CKKM вызывает усиление дифференцировки ППМВ мышей mdx.

1.3. Изменение структуры НМС мышей mdx после внутримышечного введения Lin(-)-СККМ.

2. Участие СККМ в регенерации и дифференцировке ППМВ мышей mdx у радиационных химер.

2.1. Трансплантация СККМ облученным в дозе 5 Гр мышам mdx не вызывает усиления дифференцировки ППМВ.

2.2. Влияние Са2+-КМП на участие СККМ в дифференцировке ППМВ химерных мышей mdx.

2.3. Влияние замены костного мозга на фоне рентгеновского облучения в дозе 3 Гр на дифференцировку ППМВ мышей mdx.

IV. Обсуждения.

1. Lin(-)-CKKM после внутримышечного введения участвуют в регенерации ППМВ мышей mdx и усиливают их дифференцировку.

2. ККМ участвуют в регенерации и дифференцировке ППМВ мышей mdx после внутривенного введения облученным мышам mdx.

2.1. Воздействие Са -КМП увеличивает эффективность участия

СККМ в дифференцировке ППМВ мышей mdx.

2.3. Внутривенное введение ККМ мышам mdx, обученным в дозе 3 Гр усиливает экспрессию. дистрофина и дифференцировку ППМВ мышей mdx. Ill

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Дифференцировка и регенерация скелетных мышц мышей mdx после клеточной терапии стволовыми клетками костного мозга"

ч

Актуальность исследования. Мышечные дистрофии представляют собой гетерогенную группу генетических расстройств, характеризующихся прогрессирующей потерей силы скелетных мышц. Одной из самых распространенных и тяжелых форм мышечной дистрофии является X-сцепленная рецессивная мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) (Dalkilic, Kunkel, 2003). Для исследования возможностей лечения МДД используют различных животных, являющихся моделью этого заболевания (Watchko et al., 2002, Collins, Morgan, 2003). Наиболее широко используемой экспериментальной моделью МДД являются мыши mdx с точечной мутацией в Х-хромосоме, приводящей к блокаде синтеза мембранно-ассоциированного белка дистрофина (Bulfield et al., 1984, Sicinski et al., 1989). Обширные исследования мышей mdx показали, что с возрастом их скелетные мышцы подвергаются структурным и функциональным изменениям, сходным, с теми, которые наблюдаются при МДД (Partridge, 1997). В настоящее время в качестве основных патогенетических механизмов, лежащих в основе повреждения мышечных волокон в отсутствии дистрофина и ассоциированного с ним белкового комплекса, рассматриваются: 1) ослабление сарколеммы в результате потери механической поддержки, обеспечиваемой дистрофином; 2) несоответствующий нормальному уровню приток кальция в клетки; 3) нарушение передачи сигналов клетками; 4) окислительный стресс; 5) периодически повторяющаяся ишемия мышц (Petrof, 2002, Dudley et al., 2006). Так показано, что развивающийся в поперечнополосатых мышечных волокнах (ППМВ) мышей mdx окислительный стресс (Niebröj-Dobosz, Hausmanowa-Petrusewicz, 2005; Tidball, Wehling-Henricks, 2007a), приводит к гибели ППМВ. Гибель мышечных волокон протекает преимущественно по типу апоптоза (Matsuda et al., 1995; Tidball et al., 1995; Spencer et al, 1997; Михайлов и др., 1998). За гибелью ППМВ следует регенерация. Характерные постоянно повторяющиеся циклы дегенерации—регенерации, приводят к тому, что большая часть ILL 1MB имеет центрально расположенные ядра (Torres, Duchen, 1987). Центральное расположение ядер указывает на то, что дифференцировка 1111MB заторможена на стадии мышечных трубочек (Михайлов и др., 1998). Кроме того, в скелетных мышцах мышей mdx наблюдаются нарушения структуры нейромышечных соединений (НМС) (Torres, Duchen, 1987; Kitaoka et al., 1997).

В настоящее время проводятся интенсивные исследования, направленные на поиски путей восстановления нормальной структуры ill 1MB мышей mdx. В работах используют как фармакологические подходы, так и методы генной (Chamberlain, 2002; Баранов и др., 2007) и клеточной терапии (Farini et al., 2009). Так широкое распространение получает изучение возможностей клеточной терапии с использованием стволовых клеток. Предполагается, что вхождение в состав мутантных 1111МВ ядер стволовых клеток дикого типа с нормальным генотипом способно исправить метаболизм 1111MB и превратить их в нормальные сократительные клетки. В качестве источников стволовых клеток для трансплантации • предлагают, в первую очередь, костный мозг (Gussoni et al., 1999; Bittner et al., 1999), мышечную ткань (Peault et al., 2007). По литературным данным, наиболее эффективными клетками оказались мезоангиобласты и перициты (Galvez et al., 2006; Dellavalle et al., 2007). Однако, несмотря на разнообразие источников стволовых клеток, для которых показана способность дифференцироваться в миогенном направлении, и соответственно, которые могут использоваться для клеточной терапии мышечных дистрофий, костный мозг остается наиболее доступным источником стволовых клеток. Кроме того, до настоящего времени не достаточно изучено влияния на дифференцировку 1111MB полной замены мутантных клеток костного мозга (ККМ) мышей mdx на стволовые клетки костного мозга (СККМ) дикого типа. В частности, не получено объяснения низкой функциональной активности ядер СККМ, включившихся в состав

ППМВ после такой замены. В качестве возможных агентов, стимулирующих экспрессию специфических для мышц генов с ядер трансплантированных клеток, могут, по-видимому, рассматриваться воздействия, влияющие на регенерацию тканей. В частности, способность значительно усиливать рост и регенерацию различных тканей показана для слабых комбинированных магнитных полей, настроенных на ион-параметрический резонанс для Са2+ (Са2+-КМП) ег а1., 1990; Леднев, 1996; Тирас и др., 1996; Арсеньев и др, 2007).

Таким образом, изучение участия СККМ, трансплантированных мышам тс1х, в регенерации и дифференцировке ППМВ мышей тс1х представляется актуальной задачей, как с точки зрения изучения регенерации скелетных мышц, так и с точки зрения разработки методов лечения МДД, моделью которой и являются мыши тс1х.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении влияния трансплантированных местно или внутривенно стволовых клеток костного мозга мышей С57ВЬ/6 на дифференцировку и регенерацию поперечнополосатых мышечных волокон мутантных мышей тс1х. Для достижения данной цели решались следующие задачи:

1. Оценить участие стволовых клеток костного мозга дикого типа, трансплантированных внутримышечно или внутривенно, в регенерации поперечнополосатых мышечных волокон мышей тс!х в сингенных условиях.

2. Оценить влияние внутримышечной трансплантации 1лп(-) популяции стволовых клеток костного мозга дикого типа на структуру нейромышечных соединений скелетных мышц мышей тс1х.

3. Исследовать изменение дифференцировки поперечнополосатых мышечных волокон мышей тс1х на разных сроках после внутримышечной трансплантации Ып(-) стволовых клеток костного мозга нормальных мышей С57ВЬ/6 по таким признакам, как уровень гибели поперечнополосатых мышечных волокон, изменение доли поперечнополосатых мышечных волокон без центрально расположенных ядер и экспрессия дистрофина.

4. Исследовать дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон радиационных химер тёх, полученных после облучения в дозе 5 Гр, и возможность усиления дифференцировочных процессов в мышцах этих мышей под действием слабых комбинированных магнитных полей, настроенных на ион-параметрический резонанс для Са .

5. Исследовать дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон после сингенной внутривенной трансплантации клеток костного мозга дикого типа облученным в дозе 3 Гр мышам тс1х.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. СККМ мышей С57ВЬ/6 участвуют в регенерации ППМВ мутантных мышей тёх как после внутримышечной трансплантации, так и после внутривенного введения предварительно облученным животным.

2. Трансплантированные внутримышечно 1лп(—) стволовые клетки костного мозга (Ьт(-)-СККМ) мышей С57ВЬ/6 усиливают дифференцировку ППМВ мышей тс1х, что выражается в стимуляции синтеза дистрофина, увеличении доли ППМВ без центрально расположенных ядер, а также в снижении уровня гибели ППМВ.

3. Внутримышечная трансплантация 1лп(-)-СККМ мышей С57ВЬ/6 изменяет распределение кластеров ацетилхолиновых рецепторов (АХР) в НМС мышей шёх так, что приближает структуру НМС мышей тс1х к структуре НМС нормальных мышей С57ВЬ/б.

4. Внутривенная трансплантация ККМ мышей С57ВЬ/6 мышам тёх, предварительно облученным рентгеновыми лучами в дозе 5 Гр, не приводит

04к нарастанию синтеза дистрофина в ППМВ. Воздействие Са -КМП усиливает дифференцировку и синтез дистрофина в скелетных мышцах радиационных химер мышей тс!х, полученных путем внутривенной трансплантации ККМ мышам шёх, облученным в дозе 5 Гр.

5. Сингенная внутривенная трансплантация ККМ дикого типа после рентгеновского облучения в дозе 3 Гр вызывает усиление синтеза дистрофина в ППМВ, увеличивает долю ППМВ без центрально расположенных ядер и снижает долю погибших ППМВ у мышей шёх.

Научная новизна работы. Впервые показано, что внутримышечная трансплантация 1лп(—)-СККМ дикого типа приводит к изменениям структуры НМС мышей шёх, которые приближают ее к структуре НМС нормальных мышей С57В1У6.

Впервые показано, что Са2+-КМП способно влиять на функционирование ККМ, внутривенно трансплантированных мышам тс1х, облученным в дозе 5 Гр, и вызывать усиление синтеза дистрофина в ППМВ этих мышей через 2 месяца после трансплантации.

Впервые показано, что внутривенная трансплантация ККМ мышам тс!х,, облученным в дозе 3 Гр, приводит к увеличению доли дистрофин-положительных ППМВ и усилению дифференцировки ППМВ этих мышей на длительных сроках наблюдения (6 мес).

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание участия ККМ в регенерации ППМВ. Данные, свидетельствующие о влиянии трансплантированных внутримышечно СККМ на структуру НМС мышей шёх, могут служить основой для дальнейших исследований возможности применения трансплантации СККМ для лечения дегенеративных нейромышечных заболеваний. Кроме того, данные об усилении синтеза дистрофина у радиационных химер тс!х, полученных путем внутривенной трансплантации ККМ дикого типа мышам шёх, облученным в дозе 3 Гр, и данные об усилении синтеза дистрофина у радиационных химер тс!х, полученных после

21, облучения в дозе 5 Гр и дополнительно подвергавшихся действию Са -КМП, позволяют предлагать эти воздействия для дальнейшей разработки способов лечения мышечной дистрофии мышей шёх и, в последующем, МДД у людей.

I. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Соколова, Анастасия Владимировна

Выводы

1. Стволовые клетки костного мозга мышей С57ВЬ/6 участвуют в регенерации поперечнополосатых мышечных волокон мышей шёх как после внутримышечной, так и после внутривенной трансплантации.

2. Внутримышечная сингенная трансплантация 1лп(—) стволовых клеток костного мозга мышей С57ВЬ/6 усиливает дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон мышей тс1х; при этом, в первую очередь, уменьшается доля погибших поперечнополосатых мышечных волокон, на более длительных сроках наблюдения увеличивается доля поперечнополосатых мышечных волокон, не имеющих центрально расположенных ядер, и возрастает доля дистрофин-положительных поперечнополосатых мышечных волокон.

3. Сингенная внутримышечная трансплантация 1лп(-) популяции стволовых клеток дикого типа мышам тёх частично улучшает структуру нейромышечных соединений скелетных мышц, приближая её к структуре нейромышечных соединений скелетных мышц нормальных мышей С57ВЬ/6.

4. Воздействие слабых комбинированных магнитных полей, настроенных на ион-параметрический резонанс для Са усиливает дифференцировку поперечнополосатых мышечных волокон и синтез дистрофина в скелетных мышцах радиационных химер тс!х.

5. Сингенная внутривенная трансплантация клеток костного мозга дикого типа мышам шёх, облученных в дозе 3 Гр, усиливает дифференцировку и синтез дистрофина в поперечнополосатых мышечных волокон мышей тс!х.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколова, Анастасия Владимировна, Санкт-Петербург

1. Афанасьев Ю.И., Юрина H.A., Котовский Е.Ф. и др. 1999. Гистология: Учебник. Под ред. Ю.И. Афанасьева, H.A. Юриной. М., Медицина. 744 с.

2. Баранов А.Н., Киселев A.B., Баранов B.C. 2007. Генная терапия миодистрофии Дюшенна. Медицинская генетика. 6 (4): 9-16

3. Баранов B.C. 1999. Генная терапия -медицина XXI века. Соросовский образовательный журнал. 3: 63-68.

4. Баранов B.C., Баранов А.Н. 2000. Генная терапия моногенных наследственных болезней. Миодистрофия Дюшенна. Вопросы медицинской химии. 46(3): 279-292.

5. Белова H.A., Леднев В.В. 2000. Активация и ингибирование гравитропической реакции растений с помощью слабых комбинированных магнитных полей. Биофизика. 45 (6): 1102-1107.

6. Белова H.A., Леднев В.В. 2001. Влияние крайне слабых переменных магнитных полей на гравитропизм растений. Биофизика. 46 (1): 122-125.

7. Быков В.Л. 2002. Цитология и общая гистология (функциональная морфология клеток и тканей человека). СПб., СОТИС. 520 с.

8. Бычковская И.Б., Степанов Р.П., Федорцева Р.Ф. 2002. Необычная трансформация клеточных популяций после слабых радиационных и некоторых других воздействий. Цитология. 44 (1): 69-83.

9. Гривенников H.A., Мануйлова Е.С. 2003. Эмбриональные стволовые клетки в изучении функции генов в процессе дифференцировки и развития. Вкн.: Проблемы и перспективы молекулярной генетики. Том 1. М., Наука. 1: 290-306.

10. Гринчук Т.М., Иванцов K.M., Алексеенко JI.J1., Кожухарова И.В., Зайчик A.M., Петров Н.С., Михайлов В.М., Попов Б.В. 2008. Характеристика культуры мезенхимных стволовых клеток мыши, экспрессирующих GFP. Цитология. 50 (12): 1030-1035.

11. Демцун H.A., Махонина М.М., Темурьянц H.A., Мартынюк B.C. 2008. Влияние электромагнитного экранирования различной продолжительности на регенерацию планарий Dugesia Tigrina. Физика живого. 16(1): 68-73.

12. Зеленин A.B. 2001. Генная терапия на границе третьего тысячелетия. Вестник Российской академии наук. 71 (5): 387-395.

13. Леднев В.В. 1996. Биоэффекты слабых комбинированных, постоянных и переменных магнитных полей. Биофизика. 1: 224-232.

14. Михайлов В.М., Евтифеева Е.В., Сериков В.Б., Переверзев А.Е., Карманова A.B., Зенин В.В. 2006. Участие стволовых клеток костного мозга в дифференцировке поперечнополосатых мышц мышей mdx. Цитология. 48(5): 410-417.

15. Михайлов В.М., Зеленин A.B., Штейн Г.И., Тарасенко O.A., Колесников В.А., Зеленина И.А., Шафеи Р.А, Баранов B.C. 1998. Дифференцировка мышечных волокон мышей mdx после баллистической трансфекции кДНК гена дистрофина человека. Цитология. 40(5): 394-400.

16. Михайлов В.М., Кропотов A.B., Зеленин A.B., Крутилина Р.И., Колесников В.А., Зеленина И.А., Баранов А.Н., Штейн Г.И., Остапенко О.В.,

17. Томилин Н.В., Баранов B.C. 2002. Гены BCL-xL и ACR-1 способствуют дифференцировке и уменьшают гибель мышечных волокон мышей mdx. Генетика. 38 (11): 1445-1450.

18. Мусина P.A., Егоров Е.Е. Белявский A.B. 2004. Стволовые клетки: свойства и перспективы использования в медицине. Молекулярная биология. 38 (4): 563-577.

19. Полак Дж., Ван Норден С. 1987. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы: Пер. с англ. М., Мир. 74 с.

20. Пономаренко Г.Н., Соколов Г.В, Шустов С.Б., Киселева Т.П., Мажара Ю.П., Анисимов А.И., Калинин A.B., Носова В.Ф. 1998. Анализ клинических эффектов ион-параметрической магнитотерапии. Вопросы курортологии, физиотерапии и ЛФК. 1: 6-9.

21. Попов Б.В., Петров Н.С., Михайлов В.М., Томилин А.Н., Алексеенко JI.JI., Гринчук Т.М., Зайчик A.M. 2009. Спонтанная трансформация и иммортализация мезенхимных стволовых клеток в культуре in vitro. Цитология. 51 (2): 91-102.

22. Семенова M.JL, Зеленина И.А., Шафеи P.A., Голиченков В.А. 2005. Наследственная миодистрофия: биоинженерные подходы к репарациимышечных волокон. Материалы конференции, посвященной 100-летию Б.Л. Астаурова. Онтогенез. 36 (4): 310-318.

23. Сукач А.Н. 2006. Перспективы использования генной и клеточной терапий для лечения мышечных дистрофий. Клет. Транспл. 1 (2): 44-50.

24. Тирас Х.П., Сребницкая JI.K., Ильясова E.H., Климов A.A., Леднев В.В. 1996. Влияние слабого комбинированного магнитного поля на скорость регенерации планарий Dugesia Tigrina. Биофизика 41 (4): 826-831.

25. Шевченко Ю.Л. 2008. Клеточная терапия. М., ООО «Медицинское информационное агентство». 240 с.

26. Шиффер И.В. Стрелин Г.С., Бычковская И.Б., Зильберг Ю.Г. 1978. Значение лучевого поражения нормальной ткани для приживления опухолевых клеток. Мед. радиология. 1:31 33.

27. Aartsma-Rus A., Janson A.A., Kaman W.E., Bremmer-Bout M., van Ommen G.J., den Dünnen J.T., van Deutekom J.C. 2004. Antisense-induced multiexon skipping for Duchenne muscular dystrophy makes more sense. Am. J. Hum. Genet. 74: 83-92.

28. Aartsma-Rus A, Janson AA, van Ommen GJ, van Deutekom JC. Antisense-induced exon skipping for duplications in Duchenne muscular dystrophy. BMC Med Genet. 2007 Jul 5;8:43.

29. Aartsma-Rus A., van Ommen G.J. 2007- Antisense-mediated exon skipping: a versatile tool with therapeutic and research applications. RNA. 13: 1609-1624.

30. Adams M.E., Kramarcy N., Krall S.P., Rossi S.G., Rotundo R.L., Sealock R., Froehner S.C. 2000. Absence of alpha-syntrophin leads to structurally aberrant neuromuscular synapses deficient in utrophin. J. Cell. Biol. 150: 1385-1398.

31. Allen D.G. 2004. Skeletal muscle function: role of ionic changes in fatigue, damage and disease. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31: 485-493.

32. Asakura A., Seale P., Girgis-Gabardo A., Rudnicki M.A. 2002. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J. Cell. Biol. 159: 123134.

33. Banks G.B., Chamberlain J.S., Froehner S.C. 2009. Truncated dystrophins can influence neuromuscular synapse structure. Mol. Cell. Neurosci. 40: 433-441.

34. Banks G.B., Fuhrer C., Adams M.E., Froehner S.C. 2003. The postsynaptic submembrane machinery at the neuromuscular junction: requirement for rapsyn and the utrophin/dystrophin-associated complex. J. Neurocytol. 32: 709-726.

35. Bhagavati S., Xu W. 2005. Generation of skeletal muscle from transplanted embryonic stem cells in dystrophic mice. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333: 644-649.

36. Bittner R.E., Schofer C., Weipoltshammer K., Ivanova S., Streubel B., Hauser E., Freilinger M., Hoger H., Elbe-Burger A., Wachtler F. 1999.

37. Recruitment of bone-marrow-derived cells by skeletal and cardiac muscle in adult dystrophic mdx mice. Anat. Embryol. (Berl). 199: 391-396.

38. Blackman C.F., Blanchard J.P., Benane S.G, House D.E. 1995. The ion parametric resonance model predicts magnetic field parameters that affect nerve cells. FASEB J. 9:547-551.

39. Blake D.J., Weir A., Newey S.E., Davies K.E. 2002. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82: 291329.

40. Bodensteiner J.B., Engel A.G. 1978. Intracellular calcium accumulation in Duchenne dystrophy and other myopathies: a study of 567,000 muscle fibers in 114 biopsies. Neurology. 28: 439-446.

41. Buetler T.M., Renard M., Offord E.A., Schneider H., Ruegg U.T. 2002. Green tea extract decreases muscle necrosis in mdx mice and protects against reactive oxygen species. Am. J. Clin. Nutr. 75: 749-753.

42. Bulfield G., Siller W.G., Wight P.A., Moore K.J. 1984. X chromosome-linked muscular dystrophy (mdx) in the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81: 1189-1192.

43. Burden S.J. 2002. Building the vertebrate neuromuscular synapse. J. Neurobiol. 53: 501-511.

44. Cao B., Huard J. 2004. Muscle-derived stem cells. Cell. Cycle. 3: 104-107.

45. Cao B., Zheng B., Jankowski R.J., Kimura S., Ikezawa M., Deasy B., Cummins J., Epperly M., Qu-Petersen Z., Huard J. 2003. Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential. Nat. Cell. Biol. 5: 640-646.

46. Chamberlain J.S., Corrado K., Rafael J.A., Cox G.A., Hauser M., Lumeng C. 1997. Interactions between dystrophin and the sarcolemma membrane. Soc. Gen. Physiol. Ser. 52: 19-29.

47. Chamberlain J.S., Metzger J., Reyes M., Townsend D., Faulkner J.A. 2007. Dystrophin-deficient mdx mice display a reduced life span and are susceptible to spontaneous rhabdomyosarcoma. FASEB J. 21: 2195-2204.

48. Chamberlain J.S. 2002. Gene therapy of muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 11: 2355-2362.

49. Chargé S.B., Rudnicki M.A. 2004. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol. Rev. 84: 209-238.

50. Collins C.A., Morgan J.E. 2003. Duchenne's muscular dystrophy: animal models used to investigate pathogenesis and develop therapeutic strategies. Int. J. Exp. Pathol. 84: 165-172.

51. Corrado K., Rafael J.A., Mills P.L., Cole N.M., Faulkner J.A., Wang K., Chamberlain J.S. 1996. Transgenic mdx mice expressing dystrophin with a deletion in the actin-binding domain display a "mild Becker" phenotype. J. Cell. Biol. 134: 873-884.

52. Cossu G. 2004. Fusion of bone marrow-derived stem cells with striated muscle may not be sufficient to activate muscle genes. J. Clin. Invest. 114: 15401543.

53. Crawford G.E., Faulkner J.A., Crosbie R.H., Campbell K.P., Froehner S.C., Chamberlain J.S. 2000. Assembly of the dystrophin-associated protein complex does not require the dystrophin COOH-terminal domain. J. Cell. Biol. 150: 13991410.

54. Crawford G.E., Lu Q.L., Partridge T.A., Chamberlain J.S. 2001. Suppression of revertant fibers in mdx mice by expression of a functional dystrophin. Hum. Mol. Genet. 10: 2745-2750.

55. Dalkilic I., Kunkel L.M. 2003. Muscular dystrophies: genes to pathogenesis. Curr. Opin. Genet. Dev. 13: 231-238.

56. Darabi R., Gehlbach K., Bachoo R.M., Kamath S., Osawa M., Kamm K.E., Kyba M., Perlingeiro R.C. 2008. Functional skeletal muscle regeneration from differentiating embryonic stem cells. Nat. Med. 14: 134-143.

57. Deibert M.C., Mcleod B.R., Smith S.D., Liboff A.R. 1994. Ion resonance electromagnetic field stimulation of fracture healing in rabbits with a fibular ostectomy. J. Orthop. Res. 12: 878-885.

58. Delgado J.M., Leal J., Monteagudo J.L., Gracia M.G. 1982. Embryological changes induced by weak, extremely low frequency electromagnetic fields. J. Anat. 134 (Pt 3): 533-551.

59. Disatnik M.H., Chamberlain J.S., Rando T.A.2000. Dystrophin mutations predict cellular susceptibility to oxidative stress. Muscle Nerve. 23: 784-792.

60. Dreyfus P.A., Chretien F., Chazaud B., Kirova Y., Caramelle P., Garcia L., Butler-Browne G., Gherardi R.K. 2004. Adult bone marrow-derived stem cells in muscle connective tissue and satellite cell niches. Am. J. Pathol. 164: 773-779.

61. Dudley R.W., Khairallah M., Mohammed S., Lands L., Des Rosiers C., Petrof B.J. 2006b. Dynamic responses of the glutathione system to acute oxidative stress in dystrophic mouse (mdx) muscles. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 291: R704-R710.

62. Emery A.E. 2002. Muscular dystrophy into the new millennium. Neuromuscul. Disord. 12: 343-349.

63. Ervasti J.M., Campbell K.P. 1993. A role for the dystrophin-glycoprotein complex as a transmembrane linker between laminin and actin. J. Cell. Biol. 122: 809-823.

64. Fadic R. 2005. Cell surface and gene expression regulation molecules in dystrophinopathy: mdx vs. Duchenne. Biol. Res. 38: 375-380.

65. Farini A., Razini P., Erratico S., Torrente Y., Meregalli M. 2009. Cell based therapy for Duchenne muscular dystrophy. J. Cell. Physiol. 221: 526-534.

66. Ferrari G., Cusella-De Angelis G., Coletta M., Paolucci E., Stornaiuolo A., Cossu G., Mavilio F. 1998. Muscle regeneration by bone marrow-derived myogenic progenitors. Science. 279: 1528-1530.

67. Ferrari G., Mavilio F. 2002. Myogenic stem cells from the bone marrow: a therapeutic alternative for muscular dystrophy? Neuromuscul. Disord. 12 (Suppl 1): S7-10.

68. Fertuck H.C., Salpeter M.M. 1974. Localization of acetylcholine receptor by 1251-labeled alpha-bungarotoxin binding at mouse motor endplates. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 71: 1376-1378.

69. Fitzsimmons R.J., Ryaby J.T., Magee F.P., Baylink D.J. 1994. Combined magnetic fields increased net calcium flux in bone cells. Calcif. Tissue Int. 55: 376-380.

70. Franco AJr., Lansman J.B. 1990. Calcium entry through stretch-inactivated ion channels in mdx myotubes. Nature. 344: 670-673.

71. Friedenstein A.J. 1976. Precursor cells of mechanocytes. Int. Rev. Cytol. 47 : 327—359.

72. Galvez B.G., Sampaolesi M., Brunelli S., Covarello D., Gavina M., Rossi

73. B., Constantin G., Torrente Y., Cossu G. 2006. Complete repair of dystrophic skeletal muscle by mesoangioblasts with enhanced migration ability. J. Cell. Biol. 174:231-243.

74. Gang E.J., Darabi R., Bosnakovski D., Xu Z., Kamm K.E., Kyba M., Perlingeiro R.C. 2009. Engraftment of mesenchymal stem cells into dystrophin-deficient mice is not accompanied by functional recovery. Exp. Cell. Res. 315: 2624-2636.

75. Gang E.J., Jeong J.A., Hong S.H., Hwang S.H., Kim S.W., Yang I.H., Ahn

76. C., Han H., Kim H. 2004. Skeletal myogenic differentiation of mesenchymal stem cells isolated from human umbilical cord blood. Stem Cells. 22: 617-624.

77. Gao J., Dennis J.E., Muzic R.F., Lundberg M., Caplan A.I. 2001. The dynamic in vivo distribution of bone marrow-derived mesenchymal stem cells after infusion. Cells Tissues Organs. 169: 12-20.

78. Goodell M.A., Brose K., Paradis G., Conner A.S., Mulligan R.C. 1996. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183: 1797-1806.

79. Gregorevic P., Blankinship M.J., Allen J.M., Chamberlain J.S. 2008. Systemic microdystrophin gene delivery improves skeletal muscle structure and function in old dystrophic mdx mice. Mol. Ther. 16: 657-664.

80. Gussoni E., Blau H.M., Kunkel L.M. 1997. The fate of individual myoblasts after transplantation into muscles of DMD patients. Nat. Med. 3: 970-977.

81. Gussoni E., Soneoka Y., Strickland C.D., Buzney E.A., Khan M.K., Flint A.F., Kunkel L.M., Mulligan R.C. 1999. Dystrophin expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. Nature. 401: 390-394.

82. Hack A.A., Ly C.T., Jiang F., Clendenin C.J., Sigrist K.S., Wollmann R.L., McNally E.M. 1998. Gamma-sarcoglycan deficiency leads to muscle membrane defects and apoptosis independent of dystrophin. J. Cell. Biol. 142: 1279-1287.

83. Haslett J.N., Kang P.B., Han M., Kho A.T., Sanoudou D., Volinski J.M., Beggs A.H., Kohane I.S., Kunkel L.M. 2005. The influence of muscle type and dystrophin deficiency on murine expression profiles. Mamm. Genome. 16: 739748.

84. Haverich A., Graf H. 2002. Stem Cell Transplantation and Tissue Engineering. Springer. 127 p.

85. Hawke T.J., Garry D.J. 2001. Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology. J. Appl. Physiol.91: 534-551.

86. Head S.I. 1993. Membrane potential, resting calcium and calcium transients in isolated muscle fibres from normal and dystrophic mice. J. Physiol. 469: 11-19.

87. Heemskerk H., de Winter C.L., van Ommen G.J., van Deutekom J.C., Aartsma-Rus A. 2009. Development of antisense-mediated exon skipping as a treatment for duchenne muscular dystrophy. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1175: 71-79.

88. Hoffman E.P., Brown R.H. Jr., Kunkel L.M. 1987. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51: 919-928.

89. Huard J., Cao B., Qu-Petersen Z. 2003. Muscle-derived stem cells: potential for muscle regeneration. Birth Defects Res. C. Embryo Today. 69: 230-237.

90. Jackson K.A., Mi T., Goodell M.A. 1999. Hematopoietic potential of stem cells isolated from murine skeletal muscle. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96: 1448214486.

91. Kallestad K.M., McLoon L.K. 2010. Defining the heterogeneity of skeletal muscle-derived side and main population cells isolated immediately ex vivo. J. Cell. Physiol. 222: 676-684.

92. Karpati G., Pouliot Y., Zubrzycka-Gaarn E., Carpenter S., Ray P.N., Worton R.G., Holland P. 1989. Dystrophin is expressed in mdx skeletal muscle fibers after normal myoblast implantation. Am. J. Pathol. 135: 27-32.

93. Kim N., Stiegler A.L., Cameron T.O., Hallock P.T., Gomez A.M., Huang J.H., Hubbard S.R., Dustin M.L., Burden S.J. 2008. Lrp4 is a receptor for Agrin and forms a complex with MuSK. Cell. 135: 334-342.

94. Kong J., Anderson J.E., 1999. Dystrophin is required for organizing large acetylcholine receptor aggregates. Brain Res. 839: 298-304.

95. LaBarge M.A., Blau H.M. 2002. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury. Cell. Ill: 589-601.

96. Lansman J.B., Franco-Obregón A. 2006. Mechanosensitive ion channels in skeletal muscle: a link in the membrane pathology of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33: 649-656.

97. Lapidos K.A., Kakkar R., McNally E.M. 2004b. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ. Res. 94: 1023-1031.

98. Lee K.H., Baek M.Y., Moon K.Y., Song W.K., Chung C.H., Ha D.B., Kang M.S. 1994. Nitric oxide as a messenger molecule for myoblast fusion. J. Biol. Chem. 269: 14371-14374.

99. Li S., Kimura E., Ng R., Fall B.M., Meuse L., Reyes M., Faulkner J.A., Chamberlain J.S. 2006. A highly functional mini-dystrophin/GFP fusion gene for cell and gene therapy studies of Duchenne muscular dystrophy. Hum. Mol. Genet. 15: 1610-1622.

100. Liang K.W., Nishikawa M., Liu F., Sun B., Ye Q., Huang L. 2004. Restoration of dystrophin expression in mdx mice by intravascular injection of naked DNA containing full-length dystrophin cDNA. Gene Ther. 11: 901-908.

101. Liboff A.R. 1985. Geomagnetic cyclotron resonance in living cells. J. Biol. Phys. 13: 99-102.

102. Liboff A.R. 2003. Ion cyclotron resonance in biological systems: Experimental evidence. In: Stavroulakis P, editor. Biological effects of electromagnetic field. Berlin, Springer. Chapter 2.4: 76-113.

103. Liyanage Y., Hoch W., Beeson D., Vincent A. 2002. The agrin/muscle-specific kinase pathway: new targets for autoimmune and genetic disorders at the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 25: 4-16.

104. Lu Q.L., Mann C.J., Lou F., Bou-Gharios G., Morris G.E., Xue S.A., Fletcher S., Partridge T.A., Wilton S.D. 2003. Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse. Nat. Med. 9: 1009-1014.

105. Lumeng C.N., Phelps S.F., Rafael J.A., Cox G.A., Hutchinson T.L., Begy C.R., Adkins E., Wiltshire R., Chamberlain J.S. 1999. Characterization of dystrophin and utrophin diversity in the mouse. Hum. Mol. Genet. 8: 593-599.

106. Luth E.S., Jun S.J., Wessen M.K., Liadaki K., Gussoni E., Kunkel L.M. 2008. Bone marrow side population cells are enriched for progenitors capable of myogenic differentiation. J. Cell. Sci. 121(Pt 9): 1426-1434.

107. Luz M.A., Marques M.J., Santo Neto H. 2002. Impaired regeneration of dystrophin-deficient muscle fibers is caused by exhaustion of myogenic cells. Braz. J. Med. Biol. Res. 35: 691-695.

108. Lynch G.S., Rafael J.A., Chamberlain J.S., Faulkner J.A. 2000. Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx, and control mice. Am. J. Physiol. Cell .Physiol. 279: CI290-1294.

109. Mann C.J., Honeyman K., Cheng A.J., Ly T., Lloyd F., Fletcher S., Morgan J.E., Partridge T.A., Wilton S.D. 2001. Antisense-induced exon skipping and synthesis of dystrophin in the mdx mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 42-47.

110. Markert C.D., Atala A., Cann J.IC., Christ G., Furth M., Ambrosio F., Childers M.K. 2009. Mesenchymal stem cells: emerging therapy for Duchenne muscular dystrophy. PMR. 1: 547-559.

111. Marques M.J., Pertille A., Carvalho C.L., Santo Neto H. 2007b Acetylcholine receptor organization at the dystrophic extraocular muscle neuromuscular junction. Anat. Rec. (Hoboken). 290: 846-854.

112. Marques M.J., Taniguti A.P., Minatel E., Neto H.S. 2007a. Nerve terminal contributes to acetylcholine receptor organization at the dystrophic neuromuscular junction ofmdx mice. Anat. Rec. (Hoboken). 290: 181-187.

113. Matsuda R., Nishikawa A., Tanaka H. 1995. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J. Biochem. 118: 959-964.

114. Mauro A. 1961. Satellite cell of skeletal muscle fibers. J. Biophys. Biochem. Cytol. 9: 493-495.

115. McKinney-Freeman S.L., Jackson K.A., Camargo F.D., Ferrari G., Mavilio F., Goodell M.A. 2002. Muscle-derived hematopoietic stem cells are hematopoietic in origin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99: 1341-1346.

116. Megeney L.A., Kablar B., Garrett K., Anderson J.E., Rudnicki M.A. 1996. MyoD is required for myogenic stem cell function in adult skeletal muscle. Genes Dev. 10: 1173-1183.

117. Minatel E., Neto H.S., Marques M.J. 2001. Acetylcholine receptors and neuronal nitric oxide synthase distribution at the neuromuscular junction of regenerated muscle fibers. Muscle Nerve. 24: 410-416.

118. Muskiewicz IC.R., Frank N.Y., Flint A.F., Gussoni E. 2005. Myogenic potential of muscle side and main population cells after intravenous injection into sub-lethally irradiated mdx mice. J. Histochem. Cytochem. 53: 861-873.

119. Nakae Y., Stoward P.J., Kashiyama T., Shono M., Akagi A., Matsuzaki T., Nonaka I. 2004. Early onset of lipofuscin accumulation in dystrophin-deficient skeletal muscles of DMD patients and mdx mice. J. Mol. Histol. 35: 489-499.

120. Nakae Y., Steward P.J., Shono M., Matsuzaki T. 2001. Most apoptotic cells in mdx diaphragm muscle contain accumulated lipofuscin. Histochem. Cell. Biol. 115:205-214.

121. Nakamura A., Takeda S. 2009. Exon-skipping therapy for Duchenne muscular dystrophy. Neuropathology. 29: 494-501.

122. Nicholson L.V., Johnson M.A., Bushby K.M., Gardner-Medwin D. 1993. Functional significance of dystrophin positive fibres in Duchenne muscular dystrophy. Arch. Dis. Child. 68: 632-636.

123. Niebrój-Dobosz I., Hausmanowa-Petrusewicz I. 2005. The involvement of oxidative stress in determining the severity and progress of pathological processes in dystrophin-deficient muscles. Acta Biochim. Pol. 52: 449-452.

124. Odom G.L., Gregorevic P., Allen J.M., Finn E., Chamberlain J.S. 2008. Microutrophin delivery through rAAV6 increases lifespan and improves muscle function in dystrophic dystrophin/utrophin-deficient mice. Mol. Ther. 16: 15391545.

125. Odom G.L., Gregorevic P., Chamberlain J.S. 2007. Viral-mediated gene therapy for the muscular dystrophies: successes, limitations and recent advances. Biochim. Biophys. Acta. 1772: 243-262.

126. Ohlendieck K., Campbell K.P. 1991. Dystrophin-associated proteins are greatly reduced in skeletal muscle from mdx mice. J. Cell. Biol. 115: 1685-1694.

127. Orlic D., Kajstura J., Chimenti S., Jakoniuk I., Anderson S.M., Li B., Pickel J., McKay R., Nadal-Ginard B., Bodine D.M., Leri A., Anversa P. 2001. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 410: 701-705.

128. Parise G., O'Reilly C.E., Rudnicki M.A. 2006. Molecular regulation of myogenic progenitor populations. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 31: 773-781.

129. Partridge T.A. 1997. Models of dystrophinopathy, pathological mechanisms and assessment of therapies. In: Dystrophin gene, protein and cell biology. Ed. by S.C. Brown, J.A. Lucy. Cambridge University Press. 1: 310-327.

130. Partridge T.A., Morgan J.E., Coulton G.R., Hoffman E.P., Kunkel L.M. 1989. Conversion of mdx myofibres from dystrophin-negative to -positive by injection of normal myoblasts. Nature. 337: 176-179.

131. Pawlikowski B., Lee L., Zuo J., Kramer R.LI. 2009. Analysis of human muscle stem cells reveals a differentiation-resistant progenitor cell population expressing Pax7 capable of self-renewal. Dev. Dyn. 238: 138-149.

132. Péault B., Rudnicki M., Torrente Y., Cossu G., Tremblay J.P., Partridge T., Gussoni E., Kunkel L.M,. Huard J. 2007. Stem and progenitor cells in skeletal muscle development, maintenance, and therapy. Mol. Ther. 15: 867-877.

133. Petrof B.J., Shrager J.B., Stedman H.H., Kelly A.M., Sweeney H.L. 1993. Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 3710-3714.

134. Petrof B.J. 2002. Molecular pathophysiology of myofiber injury in deficiencies of the dystrophin-glycoprotein complex. Am. J. Phys. Med. Rehabil. 81(11 Suppl): S162-174.

135. Phelps S.F., Hauser M.A., Cole N.M., Rafael J.A., Hinkle R.T., Faulkner J.A., Chamberlain J.S. 1995. Expression of full-length and truncated dystrophin mini-genes in transgenic mdx mice. Hum. Mol. Genet. 4: 1251-1258.

136. Prins K.W., Humston J.L., Mehta A., Tate V., Ralston E., Ervasti J.M. 2009. Dystrophin is a microtubule-associated protein. J. Cell. Biol. 186: 363-369.

137. Rafael J.A., Townsend E.R., Squire S.E., Potter A.C., Chamberlain J.S., Davies K.E. 2000. Dystrophin and utrophin influence fiber type composition and post-synaptic membrane structure. Hum. Mol. Genet. 9: 1357-1367.

138. Rando T.A., Disatnik M.H., Yu Y., Franco A. 1998. Muscle cells from mdx mice have an increased susceptibility to oxidative stress. Neuromuscul. Disord. 8: 14-21.

139. Reed P., Bloch R.J. 2005. Postnatal changes in sarcolemmal organization in the mdx mouse. Neuromuscul. Disord. 15: 552-561.

140. Rodino-Klapac L.R, Chicoine L.G., Kaspar B.K., Mendell J.R. 2007. Gene therapy for duchenne muscular dystrophy: expectations and challenges. Arch. Neurol. 64: 1236-1241.

141. Rybakova I.N., Patel J.R., Ervasti J.M. 2000. The dystrophin complex forms a mechanically strong link between the sarcolemma and costameric actin. J. Cell. Biol. 150: 1209-1214.

142. Sampaolesi M., Blot S., D'Antona G., Granger N., Tonlorenzi R., Innocenzi A., Mognol P., Thibaud J.L., Galvez B.G., Barthélémy I., Perani L., Mantero S., Guttinger M., Pansarasa O., Rinaldi C., Cusella De Angelis M.G., Torrente Y.,

143. Bordignon C., Bottinelli R., Cossu G. 2006. Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs. Nature. 444: 574-579.

144. Sanes J.R., Lichtman J.W. 2001. Induction, assembly, maturation and maintenance of a postsynaptic apparatus. Nat. Rev. Neurosci. 2: 791-805.

145. Seale P., Rudnicki M.A. 2000. A new look at the origin, function, and "stem-cell" status of muscle satellite cells. Dev. Biol. 218: 115-124.

146. Seale P., Sabourin L.A., Girgis-Gabardo A., Mansouri A., Gruss P., Rudnicki M.A. 2000. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102: 777-786.

147. Shi X., Garry D.J. 2006. Muscle stem cells in development, regeneration, and disease. Genes Dev. 20: 1692-1708.

148. Sicinski P., Geng Y., Ryder-Cook A.S., Barnard E.A., Darlison M.G., Barnard P.J. 1989. The molecular basis of muscular dystrophy in the mdx mouse: a point mutation. Science. 244: 1578-1580.

149. Smith S.D., McLeod B.R., Liboff A.R., Cooksey K. 1987. Calcium cyclotron resonance and diatom mobility. Bioelectromagnetics. 8: 215-227.

150. Spangrude G.J., Heimfeld S., Weissman I.L. 1988. Purification and characterization of mouse hematopoietic stem cells. Science. 241: 58-62.

151. Spencer M.J., Walsh C.M., Dorshkind K.A., Rodriguez E.M., Tidball J.G. 1997. Myonuclear apoptosis in dystrophic mdx muscle occurs by perforin-mediated cytotoxicity. J. Clin. Invest. 99: 2745-2751.

152. Sell S. 2004. Stem cells handbook. Totowa, New Jersey, Humana Press. 528 P

153. Stewart F.M., Crittenden R.B., Lowry P.A., Pearson-White S., Quesenbeny P.J. 1993. Long-term engraftment of normal and post-5-fluorouracil murine marrow into normal nonmyeloablated mice. Blood. 81: 2566-2571.

154. Straub V., Bittner R.E., Léger J.J., Voit T. 1992. Direct visualization of the dystrophin network on skeletal muscle fiber membrane. J. Cell. Biol. 119: 11831191.

155. Straub V., Rafael J.A., Chamberlain J.S., Campbell K.P. 1997. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J. Cell. Biol. 139: 375-385.

156. Suchyna T.M., Sachs F. 2007. Mechanosensitive channel properties and membrane mechanics in mouse dystrophic myotubes. J. Physiol. 581(Pt 1): 369387.

157. Sun D., Martinez C.O., Ochoa O., Ruiz-Willhite L., Bonilla J.R., Centonze V.E., Waite L.L., Michalek J.E., McManus L.M., Shireman P.K. 2009. Bone marrow-derived cell regulation of skeletal muscle regeneration. FASEB J. 23: 382395.

158. Sweeney H.L., Barton E.R. 2000. The dystrophin-associated glycoprotein complex: what parts can you do without? Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 97: 1346413466.

159. Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M., Narita M., Ichisaka T., Tomoda K., Yamanaka S. 2007. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131: 861-872.

160. Takahashi K., Yamanaka S. 2006. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126: 663676.

161. Tamaki T., Akatsuka A., Ando K., Nakamura Y., Matsuzawa H., Hotta T., Roy R.R., Edgerton V.R. 2002. Identification of myogenic-endothelial progenitor cells in the interstitial spaces of skeletal muscle. J. Cell. Biol. 157: 571-577.

162. Tare R.S., Babister J.C., Kanczler J., Oreffo R.O. 2008. Skeletal stem cells: phenotype, biology and environmental niches informing tissue regeneration. Mol. Cell. Endocrinol. 288: 11-21.

163. Terada M., Lan Y.B., Kawano F., Ohira T., Higo Y., Nakai N., Imaizumi K., Ogura A., Nishimoto N., Adachi Y., Ohira Y. 2010. Myonucleus-related properties in soleus muscle fibers of mdx mice. Cells Tissues Organs. 191: 248-259.

164. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J J., Marshall V.S., Jones J.M. 1998. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282: 1145-1147.

165. Tian C., Lu Y., Gilbert R., Karpati G. 2008. Differentiation of murine embryonic stem cells in skeletal muscles of mice. Cell Transplant. 17: 325-335.

166. Tidball J.G., Albrecht D.E., Lokensgard B.E., Spencer M.J. 1995. Apoptosis precedes necrosis of dystrophin-deficient muscle. J. Cell. Sci. 108 ( Pt 6): 21972204.

167. Tidball J.G., Wehling-Henricks M. 2007b. Macrophages promote muscle membrane repair and muscle fibre growth and regeneration during modified muscle loading in mice in vivo. J. Physiol. 578(Pt l):327-336.

168. Tidball J.G., Wehling-Henricks M. 2007a. The role of free radicals in the pathophysiology of muscular dystrophy. J. Appl. Physiol. 102: 1677-1686.

169. Torres L.F., Duchen L.W. 1987. The mutant mdx: inherited myopathy in the mouse. Morphological studies of nerves, muscles and end-plates. Brain. 110 ( Pt 2): 269-299.

170. Tourovskaia A., Li N., Folch A. 2008. Localized acetylcholine receptor clustering dynamics in response to microfluidic focal stimulation with agrin. Biophys J. 95: 3009-3016.

171. Turk R., Sterrenburg E., de Meijer E,J., van Ommen G.J., den Dünnen J.T., 't Hoen P.A. 2005. Muscle regeneration in dystrophin-deficient mdx mice studied by gene expression profiling. BMC Genomics. 6: 98.

172. Vincze G., Szasz A., Liboff A.R. 2008. New theoretical treatment of ion resonance phenomena. Bioelectromagnetics. 29: 380-386.

173. Wakayama Y., Schotland D.L., Bonilla E., Orecchio E. 1979. Quantitative ultrastructural study of muscle satellite cells in Duchenne dystrophy. Neurology. 29: 401-407.

174. Wang B., Li J., Fu F.H., Xiao X. 2009. Systemic human minidystrophin gene transfer improves functions and life span of dystrophin and dystrophin/utrophin-deficient mice. J. Orthop. Res. 27: 421-426.

175. Watchko J.F., O'Day T.L., Hoffman E.P. 2002. Functional characteristics of dystrophic skeletal muscle: insights from animal models. J. Appl. Physiol. 93: 407417.

176. Wehling M., Spencer M.J., Tidball J.G. 2001. A nitric oxide synthase transgene ameliorates muscular dystrophy in mdx mice. J. Cell. Biol. 155: 123131.

177. Whitehead N.P., Yeung E.W., Allen D.G. 2006. Muscle damage in mdx (dystrophic) mice: role of calcium and reactive oxygen species. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 33: 657-662.

178. Williams M.W., Bloch R.J. 1999. Extensive but coordinated reorganization of the membrane skeleton in myofibers of dystrophic (mdx) mice. J. Cell. Biol. 144: 1259-1270.

179. Wilton S.D., Dye D.E., Blechynden L.M., Laing N.G. 1997. Revertant fibres: a possible genetic therapy for Duchenne muscular dystrophy? Neuromuscul. Disord. 7: 329-335.

180. Witzemann V. 2006. Development of the neuromuscular junction. Cell Tissue Res. 326:263-271.

181. Woods C.E., Novo D., DiFranco M., Capote J., Vergara J.L. 2005. Propagation in the transverse tubular system and voltage dependence of calcium release in normal and mdx mouse muscle fibres. J. Physiol. 568(Pt 3): 867-880.

182. Woods C.E., Novo D., DiFranco M., Vergara J.L. 2004. The action potential-evoked sarcoplasmic reticulum calcium release is impaired in mdx mouse muscle fibres. J. Physiol. 557(Pt 1): 59-75.

183. Wozniak A.C., Kong J., Bock E., Pilipowicz O., Anderson J.E. 2005. Signaling satellite-cell activation in skeletal muscle: markers, models, stretch, and potential alternate pathways. Muscle Nerve. 31: 283-300.

184. Xu R., Salpeter M.M. 1997. Acetylcholine receptors in innervated muscles of dystrophic mdx mice degrade as after denervation. J. Neurosci. 17: 8194-8200.

185. Yablonka-Reuveni Z., Anderson J.E. 2006. Satellite cells from dystrophic (mdx) mice display accelerated differentiation in primary cultures and in isolated myofibers. Dev. Dyn. 235: 203-212.1. C^

186. Yang X., Arber S., William C., Li L., Tanabe Y., Jessell T.M., Birchmeier

187. C., Burden S.J. 2001. Patterning of muscle acetylcholine receptor gene expression in the absence of motor innervation. Neuron. 30: 399-410.

188. Yeung E.W., Whitehead N.P., Suchyna T.M., Gottlieb P.A., Sachs F., Allen

189. D.G. 2005. Effects of stretch-activated channel blockers on Ca2+.i and muscle damage in the mdx mouse. J. Physiol. 562(Pt 2): 367-380.

190. Yin H., Moulton H.M., Betts C., Seow Y., Boutilier J., Iverson P.L., Wood M.J. 2009. A fusion peptide directs enhanced systemic dystrophin exon skipping and functional restoration in dystrophin-deficient mdx mice. Hum. Mol. Genet. 18: 4405-4414.

191. Yin H., Moulton H.M., Seow Y., Boyd C., Boutilier J., Iverson P., Wood M.J. 2008. Cell-penetrating peptide-conjugated antisense oligonucleotides restore systemic muscle and cardiac dystrophin expression and function. Hum. Mol. Genet. 17: 3909-3918.

192. Yokota T., Lu Q.L., Partridge T., Kobayashi M., Nakamura A., Takeda S., Hoffman E. 2009. Efficacy of systemic morpholino exon-skipping in Duchenne dystrophy dogs. Ann. Neurol. 65: 667-676.

193. Zhadin M.N. 2001. Review of russian literature on biological action of DC and low-frequency AC magnetic fields. Bioelectromagnetics. 22: 27-45.

194. Zhuang W., Eby J.C., Cheong M., Mohapatra P.K., Bredt D.S., Disatnik M.H., Rando T.A. 2001. The susceptibility of muscle cells to oxidative stress is independent of nitric oxide synthase expression. Muscle Nerve. 24: 502-511.