Выявление и активация in vitro скрытых регенерационных потенций сетчатки глаза позвоночных животных

Новикова, Юлия Петровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление и активация in vitro скрытых регенерационных потенций сетчатки глаза позвоночных животных
ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Выявление и активация in vitro скрытых регенерационных потенций сетчатки глаза позвоночных животных"

На правах рукописи

dfb&z-t-tt

094602569

НОВИКОВА ЮЛИЯ ПЕТРОВНА

Выявление и активация in vitro скрытых регенерациониых потенций сетчатки глаза позвоночных животных

03.03.05 - биология развития, эмбриология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

004602569

Работа выполнена в лаборатории проблем регенерации Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук ГРИГОРЯН Элеонора Норайровна,

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор БРОДСКИЙ Всеволод Яковлевич

доктор биологических наук КАЛАМКАРОВ Григорий Рафаэлевич

Ведущая организация: Московский Государственный Университет им. М.В. Ломоносова. Биологический факультет, кафедра эмбриологии

Защита диссертации состоится « 28 » апреля 2010 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу. 119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26. Сайт: http://idbras.comcor.ru/; e-mail: idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук^Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН. \

Автореферат разослан «2£ » 2010 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Абрамова Е.Б. ele0806@yandex.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Многие заболевания глаза, приводящие к потере зрения, такие как пигментный ретинит, отслойка сетчатки, связанная с возрастом макулярная дистрофия, заболевания сетчатки при диабете и глаукоме сопровождаются гибелью нейронов сетчатки. Для того чтобы научиться лечить эти и другие заболевания сетчатки необходимо, в частности, выявить клеточные источники регенерации и найти способы их стимулировать.

У взрослых млекопитающих поврежденная сетчатка, как и другие отделы ЦНС, не регенерирует, а погибшие клетки не могут быть замещены образующимися de novo. Это связано с потерей способности ретинальных клеток взрослых млекопитающих к пролиферации и жестко стабилизированной дифферен-цировкой нейронов сетчатки. Тем не менее, это не означает, что эта ткань не располагает скрытыми внутренними клеточными источниками и механизмами для восстановления. Последние годы характеризуются наиболее активным поиском этого ресурса, локализующегося как внутри самой сетчатки, так и вне ее, но в пределах глаза.

В работе было показано, что 3D органотипическое длительное культивирование позволяет не только следить за процессами реконструкции сетчатки, но и выявить в ней популяции пролиферирующих и дедифференцированных клеток. В результате возникло предположение, что при таком способе культивирования "молчащие" клетки-предшественники могут быть стимулированы к делениям, а в дальнейшем, при направленном воздействии, и к развитию в нейро-нальном направлении. В перспективе это может дать возможность накапливать клетки предшественники, необходимые для восполнения нейронов, утраченных в результате повреждения или заболеваний сетчатки.

Цель и задачи исследования.

Выявление в сетчатке высших и низших позвоночных животных клеток, способных при повреждении сетчатки в условиях культивирования in vitro и in vivo к пролиферации и трансформации фенотипа.

Увеличение пула потенциальных клеточных источников регенерации с помощью фактора роста фибробластов (FGF2) и митохондриального антиокси-данта (SkQl).

В работе предстояло решить следующие задачи:

• С помощью метода постоянной доставки предшественника синтеза ДНК изучить in vivo популяции клеток сетчатки тритона, способные входить в пролиферативную фазу при длительной отслойке от ретинального пигментного эпителия (РПЭ).

Разработать условия роллерного органотипического культивирования in vitro для тканей глаза высших позвоночных.

• Изучить морфологические изменения в сетчатке и РПЭ в условиях долговременного культивирования этих тканей in vitro.

• На основании иммунохимических и морфологических критериев определить локализацию и фенотипы пролиферирующих клеток сетчатки тритона и крысы при культивировании in vitro.

• Исследовать профиль экспрессии генов-маркеров дифференцировки до и после культивирования сетчатки и РПЭ тритона in vitro.

• Изучить влияние фактора роста фибробластов (FGF2) и митохондри-ального антиоксиданта SkQI на жизнеспособность, пролиферативную активность и изменение фенотипа клеток тканей глаза в условиях in vitro.

Научная новизна работы.

Впервые проведено длительное органотипическое ЗБ-культивирование целой сетчатки и РПЭ, полученных из глаз взрослых позвоночных животных разных классов (тритон и крыса). Работа позволила впервые выявить скрытые, индуцированные условиями культивирования, регенерационные свойства этих тканей. Было показано, что РПЭ взрослых и тритона, и крысы сохраняет потенции к проявлению черт нейральных клеток предшественников, однако более глубокие изменения по пути ретинальной дифференцировки присущи только РПЭ тритона, где FGF2 является одним из основных регуляторов процесса. В сетчатке обоих видов определены типы клеток, обладающих митотической активностью и способностью к миграции. Впервые показана возможность усиления выявленных регенерационных ответов с помощью антиоксиданта SkQI в сетчатке тритона, путём предотвращения гибели пролиферирующих и вновь образующихся дедифференцированных клеток, а в РПЭ крысы путём существенного снижения не только клеточной гибели, но и проявления патологических изменений в РПЭ, а именно ингибирования трансформации его клеток в макрофагальный фенотип.

Научная и практическая значимость работы.

Данная работа по органотипическому культивированию целых сетчатки и РПЭ взрослых тритона и крысы осуществлена впервые и позволила выявить скрытые, индуцированные условиями культивирования, регенерационные свойства этих тканей.

Использованный подход является хорошим новым инструментом для изучения регенераторного потенциала сетчатки и его сравнения у низших и высших позвоночных. Выбранные условия культивирования индуцируют не только пролиферацию, но также дедифференцировку и миграцию клеток, что позволит в дальнейшем изучать молекулярные механизмы этих процессов, а также накапливать in vitro малодифференцированные клетки для применения их в трансплантации.

Этот подход позволяет осуществлять поиск способов подавления нежелательного с точки зрения патологии сетчатки клеточного поведения и, напротив, индукции ответов, способствующих регенерации.

Личное участие автора. Вся работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи решены с применением современных морфологиче-

ских, иммуноцитохимических и молекулярно-генетических методов. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова (Москва, 12 декабря 2007г., 16 декабря 2008 г.); на XV Школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 19-24 октября 2008 г.); на конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты» (Москва, 17-18 ноября 2005 г.); на второй (10-15 сентября 2006 г., Швейцария) и третьей (5-10 октября 2008, Испания) Европейской конференции по регенерации (European Conference on Regeneration); на научно-практической конференции «Нанотехнологии в диагностике и лечении патологии органа зрения» (Москва, НИИ глазных болезней им. Гельмгольца, 23-24 апреля 2008 г.), на школе-конференции «Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 6-10 октября 2008 г.); на всероссийской научной школе - конференции для молодежи «Аутологичные стволовые клетки: экспериментальные и клинические исследования» (21-26 сентября 2009 г. Москва); на всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клрток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино. 24-25 мая 2007 г.); на конференции «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, ноябрь 2008).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК — 3, тезисов докладов и материалов конференций - 15.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 206 страницах, содержит 34 рисунка, 3 таблицы и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы, включающего 354 цитируемых источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследовании были взрослые тритоны Pleurodeles waitI (Urodela) и взрослые (2 месяца) крысы альбиносы Wistar.

Операция но отслойке сетчатки у тритона in vivo. В эксперименте in vivo использовали модель отслойки сетчатки от РПЭ в глазу тритона (Григорян и др., 1996). После анестезии животных (MS-222, 1:1000) микрохируршчески делали поперечный разрез роговицы и удаляли хрусталик. При изоляции хрусталика вытекала стекловидная жидкость, и падало внутриглазное давление, что приводило к незначительной отслойке сетчатки, которую увеличивали за счет создания напряжения по лимбу при помощи стеклянной палочки с закрытым шариком на конце. Отслойку регистрировали через просвет зрачка. После операции животных размещали на гигроскопичной подложке из поливинил-формаля, пропитанной раствором предшественника синтеза ДНК - 5'- бром-дезоксиуридином (БрдУ).

Культивирование in vitro. Роллерное органотипическое 3D-культивирование целой сетчатки взрослых тритонов и крыс осуществляли в роллере (RM-1, Латвия). Время культивирования тканей глаза тритонов составляло 2, 3 и 4 недели, крыс - 7-10 суток. Ткани глаза тритонов культивировали со скоростью вращения 40 об/мин при температуре 20°С и смене среды раз в неделю; ткани глаза крысы - со скоростью вращения 60 об/мин при температуре 35.5°С и однократной смене среды. Среда культивирования для тканей глаза тритона состояла из среды 199 (70%), дистиллированной воды (30%), буфера HEPES (30 мкл на 100 мл среды), гентамицин сульфата (200 мкл на 100 мл среды) и 10%-ной эмбриональной бычьей сыворотки (10 мл на 100 мл среды); для тканей глаза крысы - среда ДМЕМ, 10%-ная эмбриональная телячья сыворотка (10 мл на 100 мл среды), L-глутамин (300 мг на 500 мл среды) и гентамицин, добавленный из расчета 500 мкл на 500 мл среды.

Гистологическое исследование. После окончания культивирования часть материала фиксировали в растворе Буэна. Для морфологического анализа применяли методику окрашивания клеток гематоксилином по Караччи с докрашиванием эозином, а анализ изображений и их регистрацию проводили с помощью светового микроскопа Olympus АН-3 (Австрия).

Приготовление крпосрезов. Ткани глаза после культивирования фиксировали в 4% параформальдегиде, приготовленном на 0.1 M PBS (pH 7.4), в течение 24 ч при +4 С. Затем отмывали в 3-х сменах 0.1 M PBS и последовательно выдерживали в 5% и 20% сахарозе. Ткани ориентировали в блоках и замораживали при -70°С в Tissue Тес О.С.Т. (Leica, Германия). На криостате получали поперечные срезы толщиной 10 мкм. Перед инкубацией с антителами срезы отмывали в 0.1 MPBS (30 мин).

Иммунохимический анализ. Перед инкубацией с первичными антителами срезы обрабатывали (30 мин) в 0.1%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma) на буфере, вновь отмывали и инкубировали в растворе, увеличивающем проницаемость антител (0.25% Triton Х-100 (Sigma, США) на 0.1%-ном растворе Tween/PBS (Sigma, США)). После этого проводили обработку первичными антителами (t = 20 С, в течение ночи).

Растворы первых антител включали 5-10% готового раствора BSA для устранения неспецифического связывания и 0.3% Triton Х-100 - для улучшения проницаемости для первичных антител. Список использованных антител представлен в таблице 1. После инкубации с первичными антителами срезы отмывали PBS и наносили вторичные антитела, IgG конъюгированные с FITC, TRIC и Alexa Fluor 488 или 546 (Sigma и Molecular Probes, США). В ряде случаев в качестве вторичных антител применяли меченные пероксидазой антитела и реакцию проявления окраски с DAB (все Sigma).

Таблица 1. Антитела, используемые для иммуноцитохимии.

Антитела Фирма Разведение

Mouse monoclonal anti BrdU Sigma 1 :500

Mouse monoclonal anti PCNA Sigma 1 : 100

Mouse monoclonal anti NF-200 Sigma 1: 100

Rabbit polyclonal anti rccoverin МГУ 1:20

Rabbit polyclonal anti GFAP Sigma 1 :50

Mouse monoclonal anti Clone LN-5 Sigma 1:100

Mouse monoclonal anti plll-tubulin Sigma 1:500

Рабочие концентрации вторичных антител составляли от 1:30 до 1:50. После отмывания срезы заключали под покровные стекла в среду, пролонгирующую свечение и снижающую фон (Prolong kit, Molecular Probe), или в смесь глицерина с буфером (1:10) с добавлением DABCO (Sigma).

Изучение пролиферативной активности клеток сетчатки путем долговременной доставки к ткани сетчатки предшественника синтеза ДНК бромдеоксиуридина (БрдУ). Доставка БрдУ (аналога тимидина, маркера пролиферации) осуществлялась двумя способами. При культивировании in vitro сетчатки и заднего сектора глаза тритона предшественник вводили в среду при очередной ее смене в концентрации, рекомендованной производителем (Sigma).

Для изучения потенций клеток сетчатки после отслойки in vivo впервые использован разработанный ранее в лаборатории метод насыщения водным раствором БрдУ коврика из поливинилформаля, на котором на длительный срок размещали животных. Раствор вносили в концентрации 500 мг БрдУ (Sigma) на 1000 мл воды. После содержания тритонов на коврике в течение 7, 14 и 21 дней, глаза энуклеировали и фиксировали в 4% формалине на буфере и в растворе Буэна.

Радиоавтографическое исследование клеток, находящихся в S-фазе, на полутонких срезах отслоенной сетчатки. Тритонам на 7, 14 и 28 дни после операции по отслойке сетчатки трижды внутрибрюшинно инъецировали 3Н-тимидин из расчета 5 мкКи/г веса с интервалом от 3 до 6 часов. Через 3-4 часа после последней инъекции глаза животных фиксировали (по 4 на каждый срок) для приготовления серий полутонких срезов (1-2 мкм), сделанных строго вдоль длинных осей наружных сегментов фоторецепторов, окрашивали толуидиновым синим и анализировали при увеличении 1000Х микроскопа Jenaval (Carl Zeiss, JENA). Подробно методика описана в статье Григорян и Поплинской (1999).

Окрашивание на клеточную гибель методом TUNEL. Метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl Transferase Biotin-dUTP Nick End Labeling) маркирует клетки с ДНК, деградирующей в результате активации Ca/Mg-зависимой эн-донуклеазы. Образцы после роллерного культивирования, фиксированные 4% формалином на PBS буфере, замораживали в ОСТ и изготавливали криосрезы (см. выше). Окрашивали компонентами кита DeadEnd™ Fluorometric TUNEL System (Promega Corporation, США) в соответствии с протоколом производите-

ля и заключали в смесь глицерин-PBS (1:9) под покровные стекла, после чего анализировали с помощью микроскопа Olympus АН-3.

Изучение влияния FGF2 на РПЭ тритона при ротационном культивировании. Задний сектор глаза тритона с сетчаткой культивировали в течение 17 суток, на 8 сутки в среду без нарушения стерильности одновременно добавляли FGF2 (1х108 г/мл) и БрдУ.

Морфологический количественный анализ РПЭ, культивированного в составе задней стенки глаза крысы в отсутствие антиоксиданта SkQl и при добавлении его в среду.

Образцы РПЭ в составе заднего сектора глаза крысы, фиксированные в Буэне, обрабатывали гистологически и получали серийные срезы (7 мкм). Для оценки жизнеспособности клеток, подсчитывали среднее количество пикноти-ческих ядер по отношению к общему числу ядер в слое РПЭ, используя 100 -150 поперечных срезов задней стенки глаза. Количественный анализ проводили раздельно на периферии и в центральной части дна глаза. Частоту трансформации фенотипа клеток РПЭ определяли на тех же срезах путем подсчёта клеток, находящихся в непосредственной близости от слоя РПЭ, и потерявших эпителиальную морфологию. Редкие делящиеся клетки были также посчитаны. Статистический анализ проводили с использованием пакета программ Exel. Всего было культивировано 16 образцов заднего сектора глаза.

Морфологический и количественный анализ дедифференцирован-иых клеток сетчатки тритона, культивированной при добавлении антиоксиданта SkQl в среду in vitro.

После культивирования на гистологических препаратах изучали морфологию и клеточный состав всех слоев сетчатки и регистрировали количество митозов на каждом втором срезе. Параллельно сравнивали общую долю морфологически дедифференцированных клеток в опыте (SkQl+) и контроле (SkQl-). Культивировали 8 образцов заднего сектора глаза и анализировали в каждом 100 срезов.

Исследование тканей глаза взрослого тритона, культивированных in vitro, молекулярно-биологическими методами.

Тотальную РНК из тканей глаза выделяли с помощью реактива TRI® Reagent (Sigma, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Синтез первой цепи кДНК проводили на тотальной РНК (5 мкг) с использованием обратной транскриптазы M-MLV и random-праймеров (Силекс М, Россия). Тотальную РНК предварительно обрабатывали ДНКазой "Turbo" (Ambion, США) для исключения контаминации библиотек кДНК примесями геномной ДНК.

ПЦР и анализ нуклеотидных последовательностей. Полуколичественную оценку и тканеспецифичность экспрессии исследуемых генов определяли с использованием метода полимеразной цепной реакции. ОТ-ПЦР проводили на матрице кДНК с использованием специфических праймеров (Литех, Россия), набора для амплификации, содержащего ColoredTaq полимеразу (Силекс М, Россия) на амплификаторе Eppendorf Mastercycler (Германия). ПЦР-продукты разделяли электрофорезом в агарозном геле (Amresco, США) в трис-

ацетатном буфере, с добавлением бромистого этидия (Sigma, США). Оценку интенсивности свечения продуктов полимеразпой цеппой реакции проводили на УФ-трансиллюминаторс (BIO-RAD, США), с помощью программы для анализа электрофоретического изображения QuantityOne (BIO-RAD, США). Температурный режим реакции и количество циклов подбирали в зависимости от размера и нуклеотидного состава синтезируемого ПЦР-фрагмента.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

I. Выявление регенерационного резерва тканей глаза тритона и крысы при использовании 3D- культивирования in vitro.

1. Ротационное культивирование ретинального пигментного эпителия тритона и крысы.

1.1. Морфология культивированного РПЭ.

В процессе культивирования задние отделы глаз тритона не меняли своей формы и не расслаивались, РПЭ, хороид и склера сохраняли нормальную топологию (рис. 1а). Гибель клеток РПЭ, определяемая морфологически по картинам пикнозов, через 14 сут in vitro не превышала 5%. Оказалось, что изменения в РПЭ зависят от роста фибробластов склеральной оболочки. В некоторых образцах эти клетки наползали на апикальную поверхность РПЭ и полностью его закрывали. Этот процесс, напоминающий рубцевание, приводил к тому, что клетки РПЭ утрачивали возможность дезинтеграции, вымещения и миграции из слоя и в дальнейшем не изменялись. Такие случаи позже мы не анализировали. Если "закрытие" РПЭ фибробластами склеры было частичным, то клетки на свободных участках претерпевали морфологические изменения.

Рис. 1. Задний сектор глаза тритона после 14 сут культивирования in vitro.

а - общий вид,

б - изменение фенотипа клеток РПЭ в макрофа-гальном направлении (стрелки), Х-хороид, С-склера.

в - сохранение клетками РПЭ близкой к ин-тактной морфологии,

г - образование раннего регенерата сетчатки -рядов депигментиро-ванных клеток РПЭ.

При культивировании РПЭ тритона (14 сут) часть клеток сохраняла фенотип, близкий к исходному (рис. 1 в), однако другая часть вымещалась из слоя и

формировала второй ряд частично депигментированных клеток (рис. 1г). Был обнаружен и другой тип поведения клеток РПЭ - выход за пределы слоя в сторону "полости" сектора и трансформация в «меланофаги» (рис. 16). Образование дополнительных слоев депигментирующихся клеток, а также приобретение клетками РПЭ тритона морфологии макрофагов было выявлено ранее in vivo при эпиморфной регенерации сетчатки у тритона (Keefe, 1973, Григорян, Ми-ташов, 1979).

В ходе ротационного культивирования задние стенки глаз крыс меняли форму. Это происходило из-за инвагинации вовнутрь краев чаши, в результате чего образовывалась структура, напоминающая сферу с завернутыми краями (рис. 2а). Внутри слой РПЭ сохранялся в виде единого пласта, взаимодействующего с подстилающими его сосудистой и склеральной оболочками (рис. 26).

В условиях 3D культивирования клетки РПЭ крысы проявляли сходную способность трансформироваться в макрофагальный фенотип. Похожее поведение клеток РПЭ отмечалось прежде in vivo и у других видов животных, например, кролика в условиях, когда количество слущенных наружных сегментов не соответствовало возможности их переваривания клетками РПЭ, а также в условиях отслойки сетчатки (Wallase, 1971). Это свидетельствует о сходстве поведения РПЭ у разных животных и дает возможности для дальнейшего изучения феномена изменений клеток РПЭ в макрофагальном направлении.

Рис. 2. Задний сектор глаза крысы после 10 сут культивирования in vitro.

а - общий вид, СкО -склеральная оболочка, РПЭ - ретинальный пигментный эпителий,

б - РПЭ и выстилающий его хороид (X);

в,- трансформация в макрофагальном направлении клеток РПЭ;

г - иммуноспеци-фическое окрашивание на клеточную гибель по методу TUNEL.

Следует подчеркнуть, что наиболее яркой отличительной особенностью клеток РПЭ тритона от РПЭ крысы явилась способность части популяции, вымещаясь из слоя, формировать еще один - два ряда прилежащих депигментиро-ваниых клеток, т.е. повторять поведение РПЭ при регенерации сетчатки трито-

на после удаления сетчатки или перерезки зрительного нерва in vivo. В РПЭ крыс вымещающиеся клетки имели только макрофагальный фенотип.

1.2. Пролиферативная активность клеток РПЭ.

Поиск митотических фигур в культивированном РПЭ тритона результатов не дал. При определении количества синтезирующих ДНК клеток (БрдУ-тест) были выявлены единичные меченые клетки. Это подтвердило ранее выявленные иами особенности культивируемого РПЭ тритона - во многих экспериментах in vitro эти клетки обладали длительной лагфазой и сниженной проли-феративной активностью относительно таковой in vivo. Клетки РПЭ тритона in vitro были способны к синтезу ДНК, но редко входили в фазу митоза. Такой клеточный цикл определяется, вероятно, дефицитом in vitro стимулирующих клеточные деления факторов.

Пролиферативная активность РПЭ крысы, культивированного в аналогичных условиях in vitro, была сходной с активностью для РПЭ тритона. Специально проведенный поиск картин митоза выявил только единичные клетки на периферии слоя. БрДУ - позитивных клеток на препаратах РПЭ крысы было также немного, и они были локализованы на периферии РПЭ и в цилиарных складках. Таким образом, по пролиферативной активности in vitro обнаруживается определенное сходство между РПЭ у тритона и крысы, которое характеризуется длинным S периодом и редкими митозами. Сравнивая полученные нами данные с данными литературы можно предполагать, что у тритона, но не у крысы in vivo работают дополнительные пермиссивные сигналы к пролиферации со стороны окружающих тканей глаза.

Рис. 3.

Включение БрДУ (стрелки)в клетки культивированного РПЭ

а - тритон; б- крыса

X - хороид, С - склера.

1.3. Экспрессия белков, характерных для пронейральных клеточных типов, в клетках РПЭ.

В иммунохимическом исследовании экспрессии пронейральных маркеров в некоторых клетках культивируемого РПЭ тритона мы обнаружили экспрессию белка нейрофиламентов NF-200 (рис. 4а). Для NF-200 позитивных клеток была характерна частичная депигментация и смещение в сторону полости чаши задней стенки глаза с образованием второго ряда клеток (аналогично с данными по регенерации сетчатки in vivo (Григорян, Антон, 1993)). По-видимому, для инициации экспрессии данного нейрального антигена необходимо разобщение клеток и частичная потеря ими исходных морфологических характеристик. Полученные нами результаты согласуются с данными других работ на моделях

стационарно культивированного РПЭ тритона Notophthalmus viridescens (Ike-gami et al., 2002; Susaki, Chiba, 2007).

У крыс в слое РПЭ были найдены группы клеток специфически реагирующих на обработку антителами против ßIII-тубулина, являющегося маркером ранних, но постмитотических нейронов. В то же время известно, что при стационарном культивировании РПЭ взрослых крыс (Engelhardt et al., 2005) и человека (Vinores et al., 1995; Amemiya et al., 2004) этот нейрональный маркер также выявляется. Окрашивание РПЭ с помощью нейронспецифической энола-зы (NSE) также может быть свидетельством проявления клетками признаков нейральной дифференцировки. Антитела NF-200 реагировали с соответствующим антигеном (более поздним по сравнению с ßIII-тубулином иейрональным маркером) в части клеток РПЭ (рис. 46), что является дополнительным свидетельством возможности проявления клетками РПЭ крысы in vitro некоторых свойств нейральных клеток.

1.4. Изучение профиля генов, кодирующих маркерные специфические и регуляторные белки, при культивировании РПЭ тритона

Для подтверждения данных, полученных морфологически и иммунохи-мически, было проведено молекулярно-биологическое исследование профиля генов, кодирующих маркерные специфические и регуляторные белки в натив-ном РПЭ и при роллерном культивировании РПЭ в течение 14 суток. В натив-ном РПЭ тритона удалось зафиксировать экспрессию гена, кодирующего специфический для этих клеток белок RPE65 и очень слабую экспрессию гена иук-леостемина. В культивированном РПЭ экспрессия обоих генов также имела место и даже возрастала.

Обнаруженное присутствие в РПЭ транскриптов, характеризующих его специфическую дифференцировку (RPE65) как in vivo, так и in vitro находится в соответствии с нашими морфологическими и иммунохимическими данными о том, что большая часть клеток в условиях роллерного культивирования удерживает свою терминальную дифференцировку. Увеличение экспрессии гена RPE65 при культивировании может свидетельствовать о процессе редифферен-цировки части клеток РПЭ in vitro.

Рис. 4.

Окрашивание РПЭ антитела-

ми против маркерного белка NF-200. а - тритона; б - крысы.

РПЭ до культнвнр. Культ. РПЭ

GABDH

RPE65

FGF2

Ns (нуыеостемнн)

Рис. 5. ПЦР анализ экспрессии генов в нативном и ротационно культивированном (14 сут) пигментном эпителии глаза тритона. кДНК библиотеки отнор-мированы по гену, кодирующему СЛЕШИ.

Другая часть клеток РПЭ выходит из-под контроля культивируемого эпителиального слоя и образует один - три ряда дедифферепцированных клеток. По-видимому, именно эти клетки и экспрессируют белок нуклеостемин, обнаруживаемый с помощью ПЦР.

1.5. Влияние факторов на РПЭ при его ротационном культивирова-

нии.

1.5.1. Влияние FGF2 на РПЭ тритона.

Было проведено исследование роли FGF2 в поддержании жизнеспособности, пролиферативной активности и способности к изменению фенотипа клеток РПЭ, культивированного в составе заднего сектора глаза тритона в течение 17 суток. На 8 сутки одновременно добавляли FGF2 (в концентрации 1x10"8 г/мл) и БрдУ для выявления пролиферации. Ранее на моделях in vivo и in vitro было показано, что пролиферация и последующая транедифференцировка клеток РПЭ могут быть стимулированы экзогенно вводимым FGF2 (Park, Hollenberg, 1989; Ikegami et al., 2002; Del Rio-Tsonis, Tsonis, 2003). При органотипическом 3D-культивировании заднего сектора глаза тритона в сывороточной среде экзогенно вводимый в среду FGF2 также модифицирует поведение клеток РПЭ тритона. При сохранении слоем РПЭ эпителиальной морфологии, наблюдалась частичная дедифференцировка клеток, выражающаяся в значительной потере пигмента и инициация синтеза ДНК (наблюдалось обильное БрдУ окрашивание, особенно клеток на периферии слоя) (рис. 5). Процесс формирования «мелано-фагов» был, напротив, замедлен: детектировались лишь единичные клетки, претерпевающие модуляцию дифференцировки в макрофагальном направлении. На некоторых участках слоя можно было обнаружить второй ряд клеток. Полученные нами данные согласуются с результатами других работ, ранее проведенных на модели культивированного РПЭ тритона и других животных в присутствии FGF2 (Ikegami et al., 2002; Sakaguchí, 1997, Vergara, Del Rio-Tsonis, 2009). Второй ряд клеток, образующихся вдоль слоя РПЭ при культивировании, можно рассматривать как зачаток сетчатки, возникший благодаря транедиффе-ренцировке клеток РПЭ. Его можно считать аналогичным тому, что формировался при стационарном органотипическом культивировании РПЭ тритона (Ikegami et al., 2002) и in vivo у головастиков шпорцевой лягушки (Vergara, Del Rio-Tsonis, 2009).

Увеличение пролиферативной активности культивированного РПЭ тритона, оцененное по включению БрдУ, происходило и при удалении склеральной оболочки и, тем самым, снятии натяжения слоя РПЭ. Подобное явление наблюдалось ранее при трансплантации РПЭ без склеральной оболочки в полость линзэктомированного глаза тритона (Григорян, Миташов, 1985).

Рис. 5. РПЭ тритона, через 14 сут роллер-ного культивирования А - в отсутствие РОР2

Б - в присутствии РйР2 среде. Стрелками отмечены БрдУ меченые клетки в РПЭ.

1.5.2. Влияние митохондриального антиоксиданта 8кС,)1 на РПЭ крысы при ротационном культивировании.

Был проведён ряд экспериментов по ротационному культивированию (7 и 14 сут) РПЭ крысы в присутствии антиоксиданта 8к(31 (аналога пластохинона). Добавление в среду культивирования снижало частоту трансформации

клеток РПЭ крысы в макрофагальном направлении и клеточную гибель (рис. 6, 7) и, в результате, даже спустя 14 сут ротационного культивирования задний сектор глаза крысы, и РПЭ в частности, сохраняли свою морфологическую целостность, организацию и жизнеспособность. Это является доказательством обеспечения 8к(31 жизнеспособности клеток и стабилизации их дифференцировки.

1 1 7.57*4 СЕ

■В

нин

еоае.еза ш 4,Э5±ЭЛ4

■Ж»«

ив 1,4а±1 д ..!..-, з пня ■■

ли ШШш НИ

1 в

Рис. 6. Сравнение числа (%) погибших клеток в РПЭ на 7 сутки культивирования заднего сектора глаза крысы в присутствии 8к<3 в среде и без антиоксиданта. А -в центральной части, В - на периферии заднего сектора глаза.

Рис. 7. Число клеток РПЭ, покидающих слой и приобретающих макрофагальный фенотип через 7 сут культивирования в присутствии 8к<31 в среде и без антиок-сиданта на периферии и в центре слоя. 14- среднее количество таких клеток на 1 срез. Проанализировано 100 срезов.

Полученные сведения о протективном действии SkQl позволят в дальнейшем использовать его, а возможно и другие антиоксиданты, как дополнительную меру для предотвращения гибели клеток РПЭ, выходящих в нейраль-ную дифференцировку, при разработанном нами способе стимулирования этого процесса in vitro.

В целом наши данные свидетельствуют о том, что клетки РПЭ взрослых тритона и крысы располагают внутренним потенциалом к трансформации в клетки, экспрессирующие ранние маркерные белки нейральных клеток. Учитывая низкую пролиферативную активность клеток РПЭ тритона и крысы в выбранных условиях in vitro, можно предположить, что инициация этой экспрессии не требует ни полной потери исходных морфологических характеристик, ни дополнительных клеточных делений. По-видимому, в данном случае происходит эктопическая индукция экспрессии соответствующих генов в дифференцированных или только частично дедифференцированных эпителиальных клетках. Сходные результаты были получены для РПЭ взрослых крыс и человека при иных способах культивирования, специально направленных на выявление нейрального потенциала в РПЭ (Amemiya et al., 2004; Engelhardt et al., 2005; Милюшина, Александрова, 2009).

Таким образом, наши данные свидетельствуют в пользу того, что модуляции фенотипа клеток РПЭ на уровне неполной потери исходных характеристик и приобретения некоторых ранних свойств новой нейральной дифферен-цировки возможны не только у низших, но и высших позвоночных и не только в развитии, но и во взрослом состоянии. Однако приобретение клеткам РПЭ свойств конкретных типов нейронов сетчатки требует или дополнительных направленных воздействий in vitro, или создания в ткани таких особых свойств межклеточного взаимодействия и сигнальной трансдукции, какие присущи РПЭ тритона in vitro и in vivo. Пока получены только первые данные о возможности дифференцировки клеток эмбрионального РПЭ цыпленка в фоторецепторы с помощью эктопической экспрессии гена NeuroD, кодирующего транскрипционный фактор семейства bHLH, участвующий в регуляции фоторецеп-торной дифференцировки в развитии сетчатки позвоночных (Liang et а!., 2008).

□ опыт ■ контроль

25 20 15 10 5 0

шштшжтшшят 20 02±5.80 ; 1

Hi II

Э.04±2.2Г i ШШ

периферия

центр

2. Ротационное культивирование нейральной сетчатки тритона и крысы.

2.1. Морфологические изменения в культивированной сетчатке.

При роллерном ЗБ-культивировании in vitro в результате смыкания краев (периферии) сетчатки формируются замкнутые структуры - сфероиды. Через 2 недели, несмотря на гибель отдельных клеток, в образованных сфероидах сохраняется послойная организация (рис. 8а), которая к концу культивирования, нарушается. Вблизи зоны смыкания сфероида в наружном и внутреннем ядерных слоях (НЯС и ВЯС) обнаружены многочисленные митозы (рис. 8г). В наружном ядерном слое клетки в М-фазе были среди тел фоторецепторов, чаще вблизи наружной пограничной мембраны, а в ВЯС - иногда вблизи длинного отростка клетки Мюллера.

Рис. 8. Сетчатка взрослого тритона в процессе органотипического культивирования in vitro. а - сфероид, образованный к 14 сут культивирования,

б - дедифференцированные клетки в клеточной массе в полости сфероида (28 сут), в - его внутреннем ядерном слое (28 сут),

г - митозы во внутреннем ядерном слое (28 сут) (показаны стрелками)

П - периферия, включающая ростовую зону; 3H - область выхода зрительного нерва. КМ - клеточная масса, возникшая из клеток ростовой зоны;

В некоторых участках наружного сетчатого слоя мы обнаружили клетки, мигрирующие радиально из внутреннего в наружный ядерный слой. На полутонких срезах была очевидной гипертрофия клеток мюллеровской глии. Через 2 недели культивирования в полости сфероида клеток было немного, она была заполнена волокнами ганглиозных клеток. Далеко от зоны смыкания сфероида также обнаруживались митозы в ВЯС и НЯС, однако здесь в центральной сет-

чатке митотические фигуры встречались реже, чем на периферии. Вблизи области выхода зрительного нерва были видны потоки мигрирующих из ВЯС в HЯС клеток, и многочисленные митозы.

В сетчатке, культивированной в течение 4 недель, наблюдалось большее смешение слоев, прорастание отростков клеток в полость сфероида в области смыкания края сетчатки и выхода нерва. Это свидетельствует о развитии in vitro процессов клеточной миграции, дифференцировки и роста нейральных отростков. Еще одной особенностью позднего сфероида было наличие «розеток» -небольших организованных групп нейральных клеток внутри сфероида. Известно, что такой атипичный «морфогенез» свойственен эмбриональной или ранней постнатальной ткани сетчатки, развивающейся в условиях in vitro (Germer et al., 1997; Willbold et al., 1997; Viktorov et al, 2006) или после интравитре-альной трансплантации (Ng et al., 2007). Клетки в митозе через 4 нед in vitro встречались чаще, чем через 2 нед. Морфологически дедифференцированные клетки заполняли не только полость сфероидов сетчатки (рис. 86), но и ее ядерные слои (рис. 8в). Клетки в области смыкания, также продолжали рост и активно мигрировали в полость закрытой полусферы сетчатки.

Рис. 9. Сетчатка взрослой крысы в процессе органо-типического культивирования in vitro.

а, б - замкнутый сфероид сетчатки крысы.

в, г - митоз во внутренней области сфероида.

Сетчатка взрослой крысы к концу культивирования (10 сут) также сохраняла жизнеспособность, но претерпевала значительные изменения: менялась форма - сетчатки in vitro образовывали сфероиды разной степени закрытия. В открытых сфероидах при частичном сохранении фоторецепторных отростков была выше клеточная гибель, отсутствовали митозы, а резидентные макрофаги активно заселяли запустевающий ганглиозный слой. В случае полного закрытия сфероида сетчатки крысы (рис. 9а), напротив, происходили реорганизация в ткани и клеточные ответы, которые в целом могут быть охарактеризованы, как

5 ООмш

регенерационные. Тела фоторецепторных клеток теряли наружные отростки, заполняли внутреннюю часть сфероида (рис. 96). В результате клетки ВЯС оказывались в наружной части сфероида. При этом клетки ганглиозного слоя сохраняли прежнюю локализацию. Еще одна особенность сфероида сетчатки крысы, по сравнению с сетчаткой тритона, заключалась в отсутствии «розеток».

В области смыкания также отсутствовали происходящие в сфероидах сетчатки тритона процессы, а именно, не было обнаружено ни миграции клеток ora serrata в сторону полости, ни митозов в этих клетках. В толще сетчатки выявлялись многочисленные резидентные макрофаги (микроглия), имеющие характерные морфологические особенности: большие размеры, часто смещенное на периферию серповидное ядро и пузырчатую цитоплазму. На 10 сут культивирования клетки в толще образованного сетчаткой крысы сфероида, все еще обладали относительно высокими жизнеспособностью и митотической активностью. На каждом из серийных срезов таких сфероидов мы обнаруживали 1-3 картины митотических делений.

2.2. Пролиферативная активность клеток сетчатки крысы и тритона.

Исследование в культивированных сетчатках тритона пролиферации с помощью антител против PCNA (ядерный антиген пролиферирующих клеток) и включения БрдУ выявило наличие клеток, синтезирующих ДНК. Это в совокупности с обнаружением нами многочисленных митозов, говорит о наличии в сетчатке тритона большого пула способных к делению клеток. Они принадлежат, прежде всего, к клеткам ростовой зоны сетчатки и их потомкам, а также к гли-альной популяции. Не исключена возможность пролиферации небольшого пула обнаруженных нами клеток предшественников и в витреальной части ВЯС.

При помощи БрДУ-мечения мы подтвердили наличие высокой пролифе-ративной активности клеток в культивированной сетчатке взрослой крысы. БрДУ-позитивные клетки находились в различной локализации, но чаще среди клеток ВЯС, в области расположения мюллеровской глии. Помимо этих клеток по всей толще сфероида сетчатки располагались крупные соответствующие макрофагам (микроглии) клетки. Следовательно, у крысы мы обнаружили минимум две популяции пролиферирующих клеток - резидентные макрофаги и клетки Мюллера - способные синтезировать ДНК (рис. 10а) и входить в М-фазу (рис. 9 в,г).

а - в клетку Мюллера

6 - область локализации внутренних сегментов фоторецепторных клеток.

Рис. 10. Включение

БрдУ в культивированной сетчатке крысы.

В сетчатке как тритона, так и крысы одним из факторов, вызывающих пролиферацию, являлась неизбежная при культивировании гибель части нейронов. Известно, что вызванный in vitro оксидаитом паракватом апоптоз клеток сетчатки крысы, приводит к пролиферации и дедифференцировке клеток Мюллера (Abrahan et al., 2009). Известно также, что и пролиферация макрофагов может быть стимулирована гибелью клеток сетчатки. Таким образом, обнаруженная в сетчатке тритона и крысы in vitro высокая пролиферативная активность может быть отнесена к явлению «компенсаторной пролиферации» (Fan, Bergmann, 2008).

БрДУ-специфическое окрашивание в культивированной сетчатке крысы было связано также с областью внутренних сегментов фоторецепторов (рис. 106) по всему пространству сетчатки. Внутренние сегменты фоторецепторов являются, как известно, внеядерной областью, содержащей большое число митохондрий. Мы полагаем, что в данном случае включение предшественника было связано с активным синтезом митохондриалыюй ДНК. Ранее включение 3Н-тимидина в области внутренних сегментов фоторецепторов было обнаружено in vivo в сетчатке морской свинки (Woodford, Blanks, 1989). Высокая интенсивность синтеза митохондриалыюй ДНК, выявленная нами по включению БрДУ, может свидетельствовать об активно идущих процессах репарации ДНК в фоторецепторных клетках эксплантата сетчатки крысы in vitro. Данный, выявленный нами in vitro феномен, в дальнейшем может быть использован для изучения механизмов репарации фоторецепторов - малоизученного вопроса, имеющего очень важное практическое значение.

2.3. Иммунохимическое исследование.

Окрашивание сетчатки тритона антителами против рековерина - белка фоторецепторов - показало, что рековерин-позитивные клетки имели паттерн экспрессии белка, отличный от описанного в норме in situ (Бажин и др., 2002). Если в норме в фоторецепторном слое были окрашены фоторецепторные отростки, то в нашем случае мечение наблюдалось в перикарионах клеток, т.е. там, где оно имеет место в начале формирования проспективных фоторецепторов при регенерации сетчатки после удаления in vivo (Григорян и др., 2009). Через 4 недели культивирования рековерин-положительные клетки выявлялись в нетипичной локализации (рис. 11 а,б), что свидетельствует о возможности формирования новых нейронов с признаками фоторецепторной дифференцировки. Аналогичные явления наблюдались и при окрашивании культивированной сетчатки взрослой крысы.

В сфероидах сетчатки тритона в выявленных с помощью анти-GFAP антител клетках Мюллера через 2 нед in vitro наблюдалось не только сохранение, но и значительное увеличение числа их длинных отростков (рис. 11в). Это свидетельствует о развитии в сфероидах реактивного глиоза - процесса, характерного для поврежденной сетчатки не только высших (Bringmann et al., 2006), но и низших позвоночных (Raymond et al., 2006). В сфероидах, фиксированных через 4 нед культивирования (рис. 11г), характер окрашивания на GFAP менялся - экспрессию белка наблюдали не только в отростках клеток Мюллера в

ВЯС, но и в перикарионах отдельных клеток, заполняющих полость сфероида. Эти результаты позволяют предполагать дифференцировку клеток - потомков из ростовой зоны в клетки глиального фенотипа. Нельзя исключить также экспрессию GFAP собственно дедифференцированными клетками, как это происходило, например, в популяции нейробластов при регенерации сетчатки у тритона in situ (Mitashov et al., 1995).

GFAP . , *

, À ' / » ' - j л» ♦ ? t

*r* li t'' fl , .

1 ~т щ 1 r I ' €f f*

* ß it'f n * ' " f * I

recoverin

НЯС вяс

б 20мкм

.GFAP

iL Г 20мкм

Рис. 11. Иммуиохимическое окрашивание антителами против рековерина на 14-е (а) и 28-е сут (б) культивирования, и антителами против GFAP на 14-е (в) и на 28-е сут культивирования (г), (а) и (б) - FITC - , (в) - HRP и (г) - TRIC - мечение. Толщина срезов 10 мкм.

При окрашивании сетчатки крысы антителами против GFAP и виментина мы наблюдали слабое свечение в области внутреннего сетчатого слоя и внутренней пограничной мембраны, т.е. культивированная сетчатка крысы содержит многочисленные длинные отростки клеток Мюллера с низкой экспрессией в них белков промежуточных филаментов. Объемы окрашенного на GFAP волокнистого материала возрастали снаружи вовнутрь сфероида, что свидетельствовало о прорастании его центральной части отростками глиальных клеток. Локализация рековерина в сетчатке крысы была иной по сравнению с нормальным распределением этого белка in vivo. Экспрессия обнаруживалась во внутренней части НЯС и наружном сетчатом слое (рис. 12а), а также в отдельных клетках НЯС (рис. 126).

шН

СЖЯНЯ1 вяс

НЯС J ДиШЙ

а 10 Д1К.М б 10 мкм

Рис. 12. Экспрессия рековерина в сетчатке крысы на 10-е сутки культивирования: а - в области НЯС и сетчатого слоя, б - рековерин-позитивные клетки в НЯС.

2.4. ПЦР анализ экспрессии генов в культивированной (14 сут) сетчатке глаза тритона.

Для подтверждения данных, полученных морфологическими и иммуио-химическими методами, было также проведено исследование профиля генов, кодирующих маркерные специфические и регуляторные белки в пативной и культивированной (14 сут) сетчатке тритона. Из ряда выбранных генов в сетчатке до и после культивирования тритона удалось зафиксировать экспрессию генов Рахб, нуклеостемина и родопсина, а в культивированной сетчатке

также ещё и экспрессию гена Ы1-тубулина. (рис. 13)

Ьетчатеа |до культ. Культ, сетчапса

QABDH

FGF2

Rho

Tub Ь2 ьшшмшшф

Рахб

Ns (кухжатюад *

Рис. 13. ПЦР анализ экспрессии генов в культивированной (14 сут) сетчатке глаза тритона

Эти данные свидетельствуют о том, что в условиях культивирования на фоне сохранения дифференцированных нейронов сетчатки тритона, происходит дедифференцировка отдельных клеточных популяций и размножение дедиффе-ренцированных клеток ростовой зоны. О наличии малодифференцированных или дедифференцирующихся клеток предшественников в культивируемой сетчатке тритона свидетельствует экспрессия генов, кодирующих b-Птубулин и нуклеостемин. Наличие транскриптов для гена, кодирующего FGF2, как в на-тивной, так и в культивированной сетчатке, говорит о том, что данный фактор роста присутствует в сетчатке тритона как in vivo, так и in vitro.

Все эти данные свидетельствуют о том, что обнаруженная морфологически и с помощью иммунохимических маркеров активация клеток предшественников для регенерации сетчатки тритонов в условиях in vitro находит свое яркое подтверждение в экспрессии ряда генов. Таких как маркеры состояния

сниженного уровня дифференцировки клеток (ростовая зона сетчатки, неней-ральные глиальные клетки и клетки предшественники во внутреннем ядерном слое) - нуклеостемин, ЬП-тубулин, а также регуляторные молекулы, участвующие в работе каскада генов в глазном поле в развитии (FGF2).

2.5. Влияние митохондриального антноксиданта (SkQl) на сетчатку тритона.

Было проведено определение роли митохондриального антиоксиданта SkQl в поддержании жизнеспособности, пролиферативной активности и способности к изменению фенотипа клеток в изолированной и культивированной сетчатке тритона. Отличия от контроля наблюдались в увеличении уровня пролиферативной активности клеток (особенно на периферии слоя), скорости входа в М-фазу и дедифференцировку. Через 30 дней культивирования число дедиффе-ренцированных клеток, в присутствии SkQl в среде, в некоторых случаях достигало 80% от общего числа клеток.

II. Выявление регенерацнонного резерва сетчатки тритона в экспериментах с отслойкой сетчатки in vivo.

При исследовании накопления ДНК-синтезирующих клеток в сетчатке тритона с использованием многократного мечения Н-тимидином и БрдУ было обнаружено, что меченые клетки наблюдаются в ростовой зоне, во внутреннем ядерном слое сетчатки, зрительном нерве и РПЭ.

На 7 сут после отслойки во внутреннем ядерном слое на его витреальной границе были выявлены ДНК-синтезирующие (Н3-тимидин и БрдУ-позитивные) клетки. От амакриновых клеток они отличались значительно меньшими размерами перикарионов и строгой локализацией на границе с внутренним сетчатым слоем. Морфология, расположение этих клеток в определенной нише и редкие деления являются свойствами, позволяющими расценивать эти клетки в качестве предшественников и резерва для регенерации, аналогичным предшественникам во внутреннем ядерном слое сетчатки, описанным, в частности у рыб (Otteson et al., 2001; Wu et al., 2001). Важным наблюдением было также наличие меченых клеток мюллеровской глии и их аккумуляция на границе с ростовой зоной в средней части ВЯС, свидетельствующие о воспроизведении этих клеток. Подобное явление было отмечено и у других животных - взрослых рыб, птиц на ранних сроках после вылупления, а также вскоре после повреждения сетчатки птиц нейротоксинами (Reh, Fisher, 2001). Обнаружение же двух дочерних меченых клеток Мюллера, со смещением одной в сторону НЯС свидетельствовало, как о возможности деления клеток макроглии, так и миграции ее дочерних клеток.

Ростовая зона глаза и РПЭ в условиях отслойки сетчатки демонстрировали также накопление пула пролиферирующих клеток, однако скорость процесса была ниже, чем выявляемая при других способах повреждения сетчатки у тритона, например, при перерезке зрительного нерва (Миташов, 1970, 1980). Таким образом, способные к синтезу ДНК клетки внутренней сетчатки обладают низкой скоростью воспроизведения, которая, однако, у тритона может быть необ-

ходимой и достаточной в совокупности с вкладом со стороны ростовой зоны для восстановления численности клеток после отслойки сетчатки.

Таким образом, выбранные подходы для выявления клеточного резерва для регенерации сетчатки разрабатывались нами впервые и как показали результаты работы, они являются хорошим самостоятельным инструментом для активации клеток источников регенерации сетчатки у взрослых животных. Выбранные условия культивирования очень благоприятны не только для пролиферации, но и для возможных дедифференцировки и трансформации клеток, а также их миграции и встраивания. Установлено также, что может быть проведена и дополнительная активация этого регенерационного ресурса с помощью факторов роста и антиоксидантов, поддерживающих жизнеспособность клеток. Данный метод позволит проводить в будущем самые разнообразные исследования и является хорошей альтернативой экспериментам in vivo с применением разрушения сетчатки млекопитающих и цитокинов в качестве индукторов пролиферации.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны условия органотипического ЗО-культивирования in vitro сетчатки и пигментного эпителия глаза взрослых низших (тритон) и высших (крыса) позвоночных животных для длительного поддержания жизнеспособности, активации пролиферации и изменений фенотипа клеток.

2. При отслойке сетчатки in vivo и при культивировании in vitro обнаружены процессы регенерации, выражающиеся в замещении погибающих клеток за счет пролиферирующих клеток ростовой зоны и мюллеровской глин, а также их последующей миграции в ядерные слои сетчатки. При добавлении антиоксиданта SkQl в среду культивирования сетчатки тритона пул мало дифференцированных клеток увеличивается до 80% от общего числа клеток.

3. В сетчатке крысы in vitro происходят клеточные перемещения, пролиферация макрофагов и гадальных клеток. Клетки периферии сетчатки крысы (аналога ростовой зоны сетчатки тритона) - в пролиферативную фазу не входят. На клеточном уровне в фоторецепторах сетчатки крысы обнаружены транслокация рековерина и синтез мтДНК.

4. При сравнении процессов, происходящих в ретинальном пигментном эпителии (РПЭ) тритона и крысы in vitro, наблюдается сходство, а именно выход части клеток из слоя и изменение их фенотипа в сторону макрофа-гального.

5. В клетках слоя РПЭ тритона и крысы на фоне невысокой пролифератив-ной активности регистрируется экспрессия пронейральных маркерных белков.

6. Отличительным свойством РПЭ тритона при данном способе культивирования является способность к образованию 1-3 рядов дедифференци-рующихся клеток раннего регенерата сетчатки.

7. ДНК-синтезирующая активность клеток РПЭ тритона увеличивается при добавлении в среду культивирования FGF2 или при снятии склеральной оболочки.

8. Присутствие антиоксиданта в среде культивирования РПЭ крысы не только снижает клеточную гибель, но и ингибирует трансформацию клеток РПЭ в сторону макрофагалыюш фенотипа.

Работа выполнена при поддержке грата РФФИ (грант № 07-04-00273) и при использовании оборудования Центра коллективного пользования «По биологии развития на основе использования клеточных технологий и оптических методов» ИБР РАН.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Григорян Э.Н., Новикова Ю.П., Килит О.В., Филиппов П.П. Новый метод культивирования in vitro пигментного эпителия сетчатки в составе заднего сектора глаза взрослой крысы // Клеточные технологии и биологии и медицине. 2007. № 4. С. 207-215.

2. Новикова Ю.П., Потинская В.А., Алейникова КС., Григорян Э.Н. Исследование локализации и накопления клеток в S-фазе в сетчатке после искусственной отслойки от пигментного эпителия в глазах тритона Pleurodeles waltlii //Онтогенез. 2008. Т. 39. № 2. С. 143-150.

3. Новикова Ю.П., Алейникова КС., Краснов М.С., Потинская В.А., Григорян Э.Н. Клетки пигментного эпителия сетчатки глаз' взрослых тритона и крысы в условиях органотипического культивирования in vitro II Изв. АН. Сер. биол. 2010. №3. С. 271-282.

4. Новикова Ю.П., Григорян Э.Н., Килина О.В., Филиппов П.П. Новый метод культивирования in vitro задней стенки глаза крысы для изучения состояния тканей при патологиях in vivo. II Сб. «Пролиферативный синдром в офтальмологии». Москва. МЗСР РФ и РГМУ. 2008. С. 20-22.

Подписано в печать 24.03.2010 г. Усл.печл. 1 Тираж 100 экз. Заказ № 723 Отпечатано в типографии «АллА Принт» Тел. (495) 621-86-07, факс (495) 621-70-09 www.allaprint.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Новикова, Юлия Петровна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Развитие глаза позвоночных животных.

2. Организация сетчатки позвоночных.

3. Организация пигментного эпителия позвоночных.

4. Регенерация сетчатки глаза. 17 4.1. Внутренние источники регенерации сетчатки.

4.1.1. Внутренний источник регенерации клеток нейральной 18 сетчатки рыб.

4.1.2. Внутренний источник регенерации клеток нейральной 24 сетчатки у бесхвостых амфибий.

4.1.3. Потенциальный внутренний источник регенерации клеток 27 нейральной сетчатки у хвостатых амфибий.

4.1.4. Клетки Мюллеровской глии, как источник регенерации 33 клеток сетчатки у позвоночных животных.

4.1.5. Способность к регенерации сетчатки у птиц и 35 млекопитающих.

5. Феномен трансдифференцировки клеток РПЭ в клетки сетчатки.

5.1 .Регенерация нейральной сетчатки из трансдифференцирующихся клеток ПЭС у тритонов.

5.2. Свойства клеток пигментного эпителия сетчатки 56 млекопитающих и его превращения в развитии и при патологии.

6. Модели культивирования тканей сетчатки и пигментного 61 эпителия глаза.

7. Использование антиоксидантов, как способ увеличения 66 жизнеспособности тканей глаза в условиях культивирования in vitro и при патологии in vivo.

8. Влияние факторов роста на регенерацию тканей глаза. 69 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Ротационное культивирование ретинального пигментного 89 эпителия тритона.

1.1 .Морфология культивированного РПЭ.

1.2.Изучение включения БрДУ в клетки РПЭ.

1.3. Экспрессия пан-нейральных белков клетками РПЭ.

1.4. Влияние фактора роста фибробластов (РОБ) на РПЭ тритона при 94 ротационном культивировании.

2. Ротационное культивирование РПЭ взрослой крысы.

2.1. Морфология культивированного РПЭ.

2.2. Выявление клеточной гибели.

2.3. Выявление пролиферативной активности, с помощью 100 предшественника синтеза ДНК БрДУ (BrdU) в клетки РПЭ.

2.4. Экспрессия пронейральных белков клетками РПЭ.

2.5. Протекторное действие антиоксиданта SkQl на РПЭ крысы при Ю1 ротационном культивировании.

3. Ротационное культивирование нейральной сетчатки тритона.

3.1. Морфологические изменения в культивированной сетчатке.

3.2. Пролиферативная активность клеток культивированной 112 сетчатки тритона.

3.3. Экспрессия белков - маркеров специфических клеточных 114 типов.

3.4. Влияние антиоксиданта SkQl при ротационном 116 культивировании изолированной сетчатки взрослого тритона.

3.5. Изучение профиля генов, кодирующих маркерные 118 специфические и регуляторные белки, при 3D роллерном культивировании тканей глаза взрослого тритона.

4. Ротационное культивирование сетчатки крысы.

4.1. Морфологические изменения в культивированной сетчатке.

4.2. Изучение пролиферативной активности клеток культивированной сетчатки. 4.3. Экспрессия белков - маркеров специфических клеточных 129 типов.

5. Исследование пула пролиферирующих клеток в сетчатке тритона 130 после искусственной отслойки in situ.

5.1. Исследование локализации и накопления ДНК-синтезирующих 130 клеток в сетчатке тритона с использованием многократного мечения 3Н-тимидином.

5.2. Изучение пролиферирующих клеток в сетчатке тритона с 133 помощью насыщения BrdU.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Эксперименты in vitro.

1.1. Ротационное культивирование РПЭ тритона и крысы.

1.2. Ротационное культивирование сетчатки тритона и крысы.

2. Эксперименты in vivo. 157 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 161 ВЫВОДЫ 165 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление и активация in vitro скрытых регенерационных потенций сетчатки глаза позвоночных животных"

Многие заболевания глаза, приводящие к потере зрения, такие как пигментный ретинит, отслойка сетчатки, связанная с возрастом макулярная дегенерация сетчатки, заболевания сетчатки при диабете и глаукоме сопровождаются гибелью нейронов сетчатки. Для того чтобы научиться лечить данные заболевания необходимо, в частности, определить и найти возможности стимулировать клеточные источники для регенерации сетчатки.

У взрослых млекопитающих поврежденная сетчатка, как и другие отделы ЦНС, не регенерирует, а погибшие клетки не могут быть замещены образующимися de novo. Это связано с потерей способности клеток сетчатки взрослых млекопитающих к пролиферации и жестко стабилизированной дифференцировкой нейронов сетчатки. Однако это не означает, что эта ткань не располагает скрытыми внутренними клеточными источниками для восстановления. Последние 10 лет в мире ведется активный поиск этого ресурса, локализующегося как внутри самой сетчатки, так и вне ее, но в пределах глаза (Lamba et al., 2008).

Способность восстановления сетчатки in vivo за счет клеток ретинального пигментного эпителия (РПЭ) обнаружена у многих животных в эмбриональном и личиночном состоянии (Stroeva, Mitashov, 1983). У взрослых животных такие примеры — исключение. Наивысшей способностью к регенерации сетчатки обладает РПЭ взрослых тритонов (Stone, 1950; Hasegawa, 1965; Миташов, 1968; Keefe, 1973; Григорян, Миташов, 1979; Stroeva, Mitashov, 1983; Mitashov, 1997; Chiba, Mitashov, 2007). В основе регенерации сетчатки у этих животных лежит активно изучаемый на протяжении многих лет в нашей лаборатории процесс трансдифференцировки клеток РПЭ в нейроны и глиальные клетки сетчатки. У взрослых млекопитающих, в частности крыс, РПЭ не проявляет способности к замещению погибших клеток сетчатки ни в одной из известных моделей ее повреждения. Тем не менее, относительно недавно было показано, что у птиц и млекопитающих клетки РПЭ и пигментированный эпителий цилиарного тела в условиях in vitro также способны проявлять некоторые свойства малодифференцированных клеток-предшественников (Ahmad et al, 2000; Tropepe, 2000; Engelhardt et al., 2004, 2005; Reh, Fisher, 2006; Cicero et al., 2009). При культивировании клеток РПЭ человека также была показана экспрессия пан-нейральных маркерных белков на фоне подавления исходных характеристик РПЭ (Amemiya et al., 2004). Также известно, что в условиях отслойки сетчатки у млекопитающих происходит инициация пролиферации отдельных ее клеточных типов. Так исследование включения 3Н-тимидина в отслоенной сетчатке кошки показало возможность синтеза ДНК для всех не нейральных клетках: макроглиальных клетках Мюллера, астроцитах, микроглиальных клетках и макрофагах сетчатки, а также в эндотелиальных клетках хороида (Fisher et al., 1991).

Для выявления восстановительных способностей сетчатки низших позвоночных модель отслойки сетчатки применяется редко. В немногочисленных работах исследована сборка и слущивание фоторецепторных дисков в зависимости от аппозиции сетчатки и РПЭ у Xenopus laevis (Kaplan et al., 1990, Defoe et al., 1992; Kaplan, 1998), а также изменения глутаматэргической системы при отслойке сетчатки саламандры (Sherry, Townes-Anderson, 2000). Пролиферативной активности клеток сетчатки в условиях разобщения с РПЭ посвящена только одна работа, выполненная in vitro на тканях глаза эмбрионов шпорцевой лягушки, для решения вопроса о влиянии РПЭ на выход клеток сетчатки из пролиферативной фазы (Stiemke, Hollyfield, 1995).

В последние годы микрохирургическая отслойка сетчатки у тритонов оказалась удобной моделью in vivo для выявления обладающих потенциями к пролиферации клеток сетчатки у Urodela (Григорян и др., 1995, 1996, Grigoryan, 2007). Опыты с полной отслойкой сетчатки у тритона PI. waltl. показали, что у этих животных она остается жизнеспособной на всех сроках наблюдения (около двух месяцев). В результате Н-тимидиновой импульсной радиоавтографии на полутонких серийных срезах в разные сроки после отслойки удавалось выявить несколько типов клеток, включающих меченый предшественник синтеза ДНК. В S-фазе были обнаружены клетки ростовой зоны глаза, макро- и микроглии, а также отдельные клетки витреального ряда слоя интернейронов (Григорян, Поплинская, 1999). Поскольку число обнаруженных в этом исследовании ДНК-синтезирующих клеток было невелико, работа нуждалась в дополнительных экспериментах с применением иных маркеров синтеза ДНК и использованием длительной непрерывной доставки предшественника.

В сетчатке глаза взрослых крыс также были идентифицированы клетки, способные к пролиферации и фенотипическим модуляциям. Исследования in vivo при повреждении с помощью нейротоксинов показали, что роль потенциального источника для регенерации может принадлежать клеткам Мюллера. Они входят в пролиферативную фазу, дедифференцируются, коэкспрессируют маркерный белок прогениторных клеток - нестин, и специфический белок глиальных клеток - GFAP, а затем, в определенных условиях, белки фоторецепторов и биполяров. Последнее и стало свидетельством продукции глиальными клетками Мюллера в зрелой сетчатке немногочисленных нейронов de novo (Ooto et al., 2004; Wan et al., 2008). Было также показано, что in vitro клетки Мюллера склонны к образованию сфероидов, где экспрессируются специфический для глиальных клеток ретинальальдегид (CRALBP), связывающий белок, GFAP и нестин (Monnin et al., 2007). Несмотря на эти и другие находки в области исследования скрытых регенераторных возможностей сетчатки взрослых позвоночных и человека, эта работа еще далека от завершения. В частности, в данном аспекте не проводилось сравнение сетчаток низших и высших позвоночных, культивированных в сходных условиях in vitro.

Клеточное культивирование in vitro нейронов ЦНС, и в частности сетчатки, является сложным экспериментальным подходом (Romano, Hicks, 2007). В последнее время растет число работ, где используется органотипическое культивирование изолированной сетчатки взрослых низших (Kustermann et al., 2008) и высших позвоночных животных (Koizumi et al., 2007; Fernandez-Bueno et al., 2008; Johnson, Martin, 2008; Kaempf et al, 2008). Эти исследования выполнены с различными целями, однако ни одно не связано с изучением в сетчатке клеток, являющихся источником для ее восстановления. Ранее мы показали, что 3D органотипическое длительное культивирование позволяет не только следить за реконструкцией сетчатки, но и обнаружить популяции пролиферирующих и дедифференцированных клеток (Григорян и др., 2005). В результате возникло предположение, что при таком способе культивирования "молчащие" клетки-предшественники могут быть стимулированы к делениям, а в дальнейшем, при направленном воздействии, и развитию в нейрональном направлении. Это дало бы возможность накапливать клетки для восполнения нейронов, утраченных в результате повреждения или заболеваний сетчатки.

Для ответа на другой вопрос, а именно, почему потенции ретинального пигментного эпителия (РПЭ) к трансдифференцировке в клетки сетчатки у низших и высших позвоночных проявляются в различной степени, необходимо было получить модели in vivo-like in vitro, позволяющие культивирование РПЭ разных животных в сходных условиях. В данном исследовании мы применили разработанный ранее способ длительного ротационного органотипического 3D культивирования. Ко времени начала работы данный метод в лаборатории применялся для культивирования тканей глаза тритона (Григорян и др., 2005, Grigroryan, 2007) и никем в мире не был использован для культивирования "whole amount" РПЭ в составе задней стенки глаза и изолированной сетчатки взрослых млекопитающих. Таким образом, основным направлением данной работы стало изучение клеток — потенциальных источников для восполнения нейронов сетчатки при ее повреждении у низших и высших позвоночных.

Цели исследования.

• Выявление в сетчатке высших и низших позвоночных животных клеток, способных при повреждении сетчатки в условиях культивирования in vitro и in vivo к пролиферации и трансформации фенотипа.

• Увеличение пула потенциальных клеточных источников регенерации с помощью фактора роста фибробластов (FGF2) и митохондриального антиоксиданта (SkQl).

В работе предстояло решить следующие задачи:

• Изучить влияние фактора роста фибробластов (FGF2) и митохондриального антиоксиданта SkQl на жизнеспособность, пролиферативную активность и изменение фенотипа клеток тканей глаза в условиях in vitro.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Новикова, Юлия Петровна

выводы

2. При отслойке сетчатки in vivo и при культивировании in vitro обнаружены процессы регенерации, выражающиеся в замещении погибающих клеток за счет пролиферирующих клеток ростовой зоны и мюллеровской глии, а также их последующей миграции в ядерные слои сетчатки. При добавлении антиоксиданта SkQl в среду культивирования сетчатки тритона пул малодифференцированных клеток увеличивается до 80% от общего числа клеток.

3. В сетчатке крысы in vitro происходят клеточные перемещения, пролиферация макрофагов и глиальных клеток. Клетки периферии сетчатки крысы (аналога ростовой зоны сетчатки тритона) - в пролиферативную фазу не входят. На клеточном уровне в фоторецепторах сетчатки крысы обнаружены транслокация рековерина и синтез мтДНК.

5. В клетках слоя РПЭ тритона и крысы на фоне невысокой пролиферативной активности регистрируется экспрессия пронейральных маркерных белков.

6. Отличительным свойством РПЭ тритона при данном способе культивирования является способность к образованию 1-3 рядов дедифференцирующихся клеток раннего регенерата сетчатки.

7. ДНК-синтезирующая активность клеток РПЭ тритона увеличивается при добавлении в среду культивирования РСР2 или при снятии склеральной оболочки.

8. Присутствие антиоксиданта в среде культивирования РПЭ крысы не только снижает клеточную гибель, но и ингибирует трансформацию клеток РПЭ в сторону макрофагального фенотипа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Дегенерация нейронов сетчатки позвоночных может быть вызвана различными причинами, в том числе световым повреждением, генетическими изменениями и старением организма. Все нейроны сетчатки являются терминально дифференцированными клетками, не способными войти в клеточный цикл, а поэтому они не могут быть замещены вновь образованными. Ретинальный пигментный эпителий (РПЭ) играет важнейшую роль в поддержании «здоровья» сетчатки, и в тоже время является областью патологических процессов при различных заболеваниях сетчатки, включая ретинальную дистрофию, макулярную дегенерацию и отслойку сетчатки.

В мире приложено много усилий для того, чтобы обнаружить скрытые потенции клеток сетчатки и РПЭ к их регенерации. Среди этих работ многочисленны те, где используется клеточное культивирование тканей глаза. Это заведомо ограничивает экстраполяцию получаемых результатов на системы in vivo. Использованные в работе методы длительного 3D культивирования тканей глаза "whole amount", а также модель отслойки сетчатки in vivo, позволяют максимально приблизиться к условиям глаза живого организма, но в то же время манипулировать со средой культивирования и применять на этих моделях современные технологии клеточной биологии.

Полученные в исследовании данные во многом являются новыми. При изучении пролиферативного потенциала отслоенной сетчатки тритона с помощью оригинального метода длительной и постоянной доставки предшественника синтеза ДНК (BrdU) и изучения полутонких срезов сетчатки после многократного мечения 3Н-тимидином подтверждено наличие нескольких популяций клеток, способных к входу в S-фазу: ростовая область сетчатки, глиальные клетки и предшественники во внутреннем ядерном слое. При отслойке сетчатки у тритона скорость их воспроизведения является низкой, но, по-видимому, достаточной для восстановления клеточной численности после вызванной отслойкой гибели части клеток.

Проведено 3D длительное органотипическое культивирование целой сетчатки и РПЭ, полученных из глаз позвоночных животных разных классов (тритон и крыса). Эта работа осуществлена впервые и позволила выявить скрытые, индуцированные условиями культивирования, регенерационные свойства этих тканей. С применением иммунохимических маркеров пролиферирующих клеток и клеточных фенотипов доказано участие глиальных клеток (тритон и крыса), клеток ростовой зоны и минорных популяций в ядерных слоях (тритон) и гистиоцитов (крыса) в восстановлении/реконструкции сетчатки in vitro. Для тритона понижение уровня дифференцировки названных клеточных популяций in vitro впервые подтверждено при использовании молекулярных маркеров (ENTPDase, нуклеостемин, ЬИ-тубулин). У этих животных также впервые описан способ реконструкции/регенерации сетчатки за счет клеточного замещения в ее структуре без участия РПЭ. Показана возможность усиления выявленных регенерационных ответов в сетчатке тритона с помощью антиоксиданта SkQl, предотвращающего гибель пролиферирующих и вновь образующихся дедифференцированных клеток. В изолированной сетчатке взрослой крысы обнаружены митотические деления глиальных клеток и резидентных моноцитов, а также активная транслокация тел нейронов - ответов, расцененных нами как способность к реконструкции. В целом данные свидетельствуют о том, что в сетчатке позвоночных в условиях 3D культивирования происходит активация клеток, способных к делениям и трансформации фенотипа, а также молекулярных механизмов, ответственных за процесс понижения уровня клеточной дифференцировки.

При тех же способах анализа проведено сравнительное исследование ретинального пигментного эпителия (РПЭ) в составе задней стенки глаза взрослых тритонов и крыс. Выяснено, что поведение клеток РПЭ животных с полярными возможностями для регенерации in vivo (тритон и крыса), in vitro имеет некоторые сходства. У обоих видов они обладают ДНК-синтезирующей активностью, но редко входят в митотическую фазу, а, вымещаясь, приобретают макрофагальный фенотип. Клетки в слое РПЭ удерживают исходную морфологию, но при этом часть из них экспрессирует пан-нейральные белки (NF-200, vimentin). Отличие клеток РПЭ тритона от таковых крысы выражалось в его способности формировать in vitro ряды дедифференцированных NF-200+ клеток. Об изменении дифференцировки этих клеток в сторону понижения свидетельствовала также выявленная с помощью ПЦР экспрессия гена нуклеостемина. Добавление в среду FGF2 усиливало пролиферацию и процесс дедифференцировки. В целом данные говорят о том, что РПЭ взрослых тритона и крысы сохраняет потенции к проявлению черт нейральных клеток предшественников, однако более глубокие изменения по пути ретинальной дифференцировки присущи только РПЭ тритона, где FGF2 является одним из основных регуляторов. Мы обнаружили также, что при введении в среду культивирования РПЭ крысы антиоксиданта SkQl происходит существенное снижение, как клеточной гибели, так и проявления патологических изменений РПЭ, а именно его трансформации в макрофагальный фенотип.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Новикова, Юлия Петровна, Москва

1. Бажин A.B., Григорян Э.Н., Тихомирова Н.К. и др. Иммунохимическое изучение локализации кальций-связывающего белка рековерина в сетчатке тритона Pleurodeles waltl // Изв. АН. Сер. биол. 2002. № 4. С. 427-436.

2. Григорян Э.Н Полная отслойка сетчатки вызывает изменения экспрессии цитокератинов в клетках пигментного эпителия сетчатки у тритонов // Изв. РАН. Сер. биол. 1995. № 4. С. 412-421.

3. Григорян Э.Н. Сетчатка позвоночных: внутренний клеточный резерв для регенерации // Онтогенез. 2003. Т. 34. № 6. С. 417-431.

4. Григорян Э.Н. Сетчатка хвостатых амфибий как модель для изучения регенерационных возможностей сетчатки других позвоночных // Онтогенез. 1996. Т.27. № 3. С. 173-185.

5. Григорян Э.Н., Антон Г.Дж. Появление и распределение белка нейрофиламентов НФ-200 в трансдифференцирующихся клетках пигментного эпителия и других клетках глаза в процессе регенерации сетчатки у тритонов // Онтогенез. 1993. Т. 24. № 4. С. 39-52.

6. Григорян Э.Н., Антон Г.Дж. Анализ экспрессии кератинов в клетках пигментного эпителия сетчатки в процессе их трансдифференцировки у тритонов // Онтогенез. 1995. Т. 26. № 4. С. 310-323.

7. Григорян Э.Н., Дольникова А.Э., Белкин В.М. Распределение фибронектина в процессе трансдифференцировки и пролиферации клеток глаза после отслойки сетчатки и удаления хрусталика у тритонов

8. Онтогенез. 1990. Т.21. № 4. С. 403-^08.

9. Григорян Э.Н., Иванова И.П., Поплинская В. А. Обнаружение новых, внутренних источников регенерации нейральной сетчатки после ее отслойки у тритонов. I. Морфологическое и количественное исследования //Известия РАН. Сер. биол. 1996. N 3. С. 319-332.

10. Григорян Э.Н., Краснов М.С., Алейникова КС., и др. Ротационное культивирование изолированной сетчатки тритона как способ получения малодифференцированных, пролиферирующих клеток in vitro //ДАН. 2005. Т. 404. № 5. С. 566-570.

11. Григорян Э.Н., Миташов В.И. Радиоавтографическое исследование пролиферации и синтеза меланина в клетках пигментного эпителия при регенерации глаза у тритонов // Онтогенез. 1979. Т. 10. № 2. С. 137-144.

12. Григорян Э.Н., Миташов В.И. Культивирование пигментного эпителия сетчатки в полости линзэктомированного глаза тритонов // Онтогенез. 1985. Т. 16. № 1. С. 34-^3.

13. Григорян Э.Н., Новикова Ю.П., Килина О.В., Филиппов П.П. Новый метод культивирования in vitro пигментного эпителия сетчатки в составе заднего сектора глаза взрослой крысы // Клеточные технологии и биологии и медицине. 2007. № 4. С. 207-215.

14. Григорян Э.Н., Поплинская В.А. Обнаружение внутренних источников регенерации нейральной сетчатки после ее отслойки у тритонов. II. Радиоавтографическое исследование // Известия РАН. 1999. №5. С. 583-591.

15. Дабагян Н.В. Регенерация сетчатки в глазах зародышей осетра // Журн. общ. биологии. 1960. Т. 21. С.48-53.

16. Дабагян Н.В. Регуляционные свойства глаз зародышей осетровых рыб // Докл. АН СССР. 1959. Т. 125. С. 938-940.

17. Дабагян Н.В., Спиридонова Т.Л., Оганесян P.O. Регенерация сетчатки у головастиков // Научн. докл. высш. школы. Биол. науки. 1969.1. Т. 50. № 4. С. 25-27.

18. Дабагян Н.В., Шерешева E.JI. Регенерация сетчатки у головастиков // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии. 1966. Т. 50. № 6. С. 12-19.

19. Давыдова Т.В. Ультраструктура смещенных биполяров в сетчатке черепах //Цитология. 1981. Т. 23. № 1. С. 12-15.

20. Краснов М.С., Григорян Э.Н., Ямскова В.П. Модель органотипического культивирования сетчатки вместе с тканями заднего сектора глаза тритона для изучения действия адгезивных гликопротеинов // Известия РАН. Сер. биол. 2003. № 1. С. 22-36.

21. Лопашов Г.В., Строева ОТ. Развитие глаза в свете экспериментальных исследований // М.: Изд-во. АН СССР, 1963. 205 с.

22. Митаиюв В.И. Авторадиоавтографическое исследование восстановления сетчатки у гребенчатых тритонов (Triturus cristatus) II ДАН. 1968. Т. 181. № 6. С. 1510-1513.

23. Миташов В.И. Динамика синтеза ДНК в пигментном эпителии в процессе восстановления глаза после хирургического удаления сетчатки у взрослых гребенчатых тритонов (Triturus cristatus) II Цитология. 1969а. T.l 1. № 4. С. 434^146.

24. Миташов В.И. Характеристика митотических циклов клеток пигментного эпителия и зачатка сетчатки у взрослых тритонов {Triturus cristatus, Triturus taeniatus) //Докл. АН СССР. 19696. Т. 189. №3. С.666-669.

25. Миташов В.И. Динамика синтеза ДНК в клетках пигментного эпителия взрослых тритонов при восстановлении глаза после перерезкизрительного нерва и кровеносных сосудов // Цитология. 1970а. Т. 12. № 12. С. 1521-1529.

26. Миташов В.И. Радиоавтографическое и цитофотометрическое исследование трансформации клеток пигментного эпителия в сетчатку при регенерации глаза у тритонов // Дисс. кан. биол. наук. 19706. Москва. 187 с.

27. Миташов В.И Закономерности изменений митотических циклов при клеточной трансформации и регенерации у низших позвоночных животных // Цитология. 1980. Т.22. № 4. С. 371-380.

28. Миташов В.И. Клеточные источники, регуляторные факторы и экспрессия генов при регенерации хрусталика и сетчатки у позвоночных животных // Известия РАН. Сер. биол. 1996. № 3. С. 298318.

29. Миташов В.И. Мультипотентные и стволовые клетки в развивающемся, сформированном и регенерирующем глазу позвоночных животных // Известия РАН. Сер. биол. 2001. № 6. С. 717— 727.

30. Миташов В.И, Григорян Э.Н. Радиоавтографическое исследование пролиферации клеток пигментного эпителия тритонов при трансплантации в полость безлинзового глаза // Онтогенез. 1984. Т. 15. №1. С. 49-55.

31. Миташов В.И, Кусалакос С. Молекулярные механизмы развития и дифференцировки структур глаза дрозофил и позвоночных // Онтогенез. 2001. Т. 32. С. 14-28.

32. Миташов В.И, Малиованова С Д. Пролиферативные потенции клеток пигментного и цилиарного эпителиев глаза шпорцевых лягушек в норме и при регенерации // Онтогенез. 1982. Т. 13. С. 228-234.

33. Панова И.Г., Поплинская В.А., Ершов A.B., Строева О.Г. Кинетика клеточных популяций ретинального пигментного эпителия в пре- и постнатальном развитии у крыс // Журн. общ. биологии. 1986. Т. XLVII. № 3. С. 402-410.

34. Поплинская В.А. Цитоструктура и морфогенез наружных сегментов палочек. Онтогенез. 1995. Т 26. № 1. С. 5-21.

35. Свистунов С.А., Миташов В.И. Радиоавтографическое исследование роста сетчатки у взрослых амфибий // Онтогенез. 1985. Т. 16. С. 474-482.

36. Северин С.Е., Скулачёв В.П., Ягужинский JI.C. Возможная роль карнитина в транспорте жирных кислот через митохондриальную мембрану//Биохимия. 1970. Т. 35. С. 1250-1257.

37. Сологуб A.A. Становление дифференцировки пигментного эпителия и стимуляция его метаплазии у костистых рыб // Онтогенез. 1975. Т. 6. № 1.С. 39-47.

38. Строева О.Г. Превращение пигментного эпителия в сетчатку на продвинутых стадиях эмбриогенеза крыс // Докл. АН СССР. 1962. Т. 143. С. 991-993.

39. Строева О.Г. Экспериментальное исследование морфогенетических свойств пигментного эпителия в эмбриогенезе млекопитающих//Журн. общ. биология. 1960. Т. 21. С. 113-121.

40. Строева О.Г. Морфогенез и врожденные аномалии глаза млекопитающих. 1971. М., Наука. 242 с.

41. Строева О.Г. Наследственные и экзогенные колобомы сетчатки и нормальный морфогенез глаза. I. Наследственные колобомы // Журн. Общ. Биол. 1961а. Т. 22. С. 255-264.

42. Строева О.Г. Наследственные и экзогенные колобомы сетчатки и нормальный морфогенез глаза // Журн. Общ. Биол. 19616. Т.22. С. 436- 443.

43. Строева О.Г., Миташов В.И. Дифференцировка и дедифференцировка пигментированных частей глаза позвоночных животных при метаплазии // Метаплазия тканей. 1970. Наука. М. С. 93105.

44. Школъник-Яррос Е.Г., Калинина А.В. Нейроны сетчатки. М.: Наука, 1986. 204 с.

45. Abe S., Eguchi G. An analysis of differentiative capacity of pigmented epithelial cells of adult newt iris in clonal cell culture // Develop. Growth Differ. 1977. V.19. P. 309-317.

46. Abrahan C.E., Insua M.F., Politi L.E., et al. Oxidative stress promotes proliferation of retinal glia cells in vitro II J. Neurosci. Res. 2009. V. 87. № 4. P. 964-977.

47. Acevedo M.C., Ortiz J.R. Effect of serum, fibronectin and laminin on cell morphology and growth of Xenopus laevis dorsal iris cells in vitro II J. Cell Biol. 1989. V.109. № 4. P. 324a.

48. Adler R. A model of retinal cell differentiation in the chick embryo // Prog. Ret. Eye Res. 2000. V. 19. № 5. P. 529-557.

49. Ahmad I., Jang L., Pham H. Identification of neural progenitors in the adult mammalian eye // Biochem. Biophys. Res Commu. 2000. V. 270. №2. P. 517-521.

50. Amato M., Arnaut E., Perron M. Retinal stem cells in vertebrates: parallels and divergences I I Int. J. Dev. Biol. V. 48. P. 993-1001.

51. Anndreazzoli M., Gestri G., Angeloni D., Menna E., Barsacchi G. Role of Xrxl in Xenopus eye and anterior brain development // Develoment.1999. V. 126. P. 2451-2460.

52. Amemiya K., Haruta M., Takahashi M. et al. Adult human retinal pigment epithelial cells capable of differentiating into neurons // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004. V. 316. P. 1-5.

53. Araki M, Iida I, Taketani S., Watanabe K., Ohta T., Saito T. Characterization of photoreceptor cell differentiation in the rat retinal cell culture //Developmental Biology. 1987. V. 124.№ 1. P. 239-247.

54. Araki M. Regeneration of the amphibian retina: Role of tissue interaction and related signaling molecules on RPE transdifferentiation // Develop. Growth Differ. 2007. V. 49. P. 109-120.

55. Araki M. A comparative study of amphibian retinal regeneration by tissue culture technology. // In: "Strategies for Retinal Tissue Repair and Regeneration in Vertebrates: from Fish to Human". Ed. Chiba Ch. Research Singpost, India. 2008. P. 77-93.

56. Barnstable C.J. Molecular aspects of development of mammalian optic cup and formation of retinal cell types // Prog. Retina Res. 1991. V. 10. P. 45-67.

57. Arrindell E.L., McKay B.S., Jaffe G.J., Burke J.M. Modulation of potassium transport in cultured retinal pigment epithelium and retinal glial cells by serum and epidermal growth factor // Exp. Cell Res. 1992. V. 203. P. 192-197.

58. Ban Y., Rizzolo L.J. A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions // Mol Vis. 1997. № 3 P. 18-27.

59. Belecky-Adams T., CookB., Adler R. Correlations between terminal mitosis and differentiated fate of retinal precursor cells in vivo and in vitro: analysis with the "window-labeling" technique // Devel. Biol. 1996. V. 5. № 178(2). P. 304-315.

60. Belecky-Adams T., Tomarev S., Li H.s., Ploder L, Mclnners R.R., Sundin O., Adler R. Pax6, Proxl, and ChxlO homeobox gene expression correlates with phenotypic fate of retinal precursor cells // Invest.

61. Ophthalmol. Vis. Res. 1997. V. 38. P. 1293-1303.

62. Böhmer J.A., Sellhaus B., Schräge N.F. Effects of ascorbic acid on retinal pigment epithelial cells // Curr. Eye Res. 2001. V. 23. № 3. P. 206214.

63. Bornier G., Panitz F., Zhou X., et al. Expended retina territory by midbrain transformation upon overexpression of Six6 (Optx2) in Xenopus embryos // Mech. Dev. 2000. V. 93. P. 59-69.

64. Borsani G., DeCrandi A., Billabio A. et al. EYA4, a novel vertebrate gene related to Drosophila eyes absent II Hum. Mol. Genet. 1999. V. 8. P. 11-23.

65. Bovollenta P., Mallamac Puelles L., Boncinelli E. Expression pattern of Six 3, a member af six/sine oculis family of transcription factors // Mech. Dev. 1997. V. 70. P. 201-203.

66. Braekevelt C.R. Fine structure of the retinal epithelium and tapetum lucidum in the giant danio (danio malabaricus) (teleost). Anat. Embryol. (Berl.). 1980. V. 158 № 3. P. 317-28.

67. Braisted J.E., Essman T.F., Raymond P.A. Selective regeneration of photoreceptors in goldfish retina // J. Compar. Neurol. 1994. V. 120. P. 2409-2419.

68. Bringmann A., Pannicke T., Grosche J., Francke M. et al. Müller cells in the healthy and diseased retina // Prog. Retin. Eye Res. 2006. V. 25. № 4. P. 397-424.

69. Brown N.L., Kznekar S., Vetter M.L. et al. Math5 encodes a murine basic helix-loop-helix transcription factor expressed during early stages of retinal neurogenesis // Development. 1998. V. 125. P. 4821-4833.

70. Bryan J.A., Campochiaro P.A. A retinal pigment epithelial cell-derived growth factors // Arch. Ophthalmol. 1986. V. 104. P. 422-425.

71. Bugra K., Jacquemin E., Ortiz J.R., Jeanny J.C., Hicks D. Analysis of opsin mRNA and protein expression in adult and regenerating newt retina by immunology and hybridization // J. Neurocytol. 1992. V. 21. P. 171-183.176

72. Burke J.M., Hjelmeland L.M. Mosaicism of the retinal pigment epithelium: seeing the small picture // Mol. Interv. 2005. V. 5. № 4. P. 241249.

73. Burke J.M., Twining S.S. Vitreous macrophage elicitation: generation of stimulants for pigment epithelium in vitro II Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1987. V. 28. № 7. P. 1100-7.

74. Cameron D.A. Cellular proliferation and neurogenesis in the injured retina of adult zebrafish // Vis. Neurosci. 2000. V. 17. № 5 P. 789-797.

75. Campochiaro P.A., Hackett S.F., Conway B.P. Retinoic acid promotes density-dependent growth arrest in human retinal pigment epithelial cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1991. V. 32. P. 65-72.

76. Campociaro P., Hackett S.F., Vinores S.A. et al. Platelet-derived growth factor is an autocrine growth stimulator in retinal pigmented epithelial cells // J. Cell Sci. 1994. V. 107. P. 2459-2469.

77. Campochiaro P.A., Sugg R., Grotendorst G., Hielmeland L.V. Retinal pigment epithelial cells produce PDGF-like proteins and secrete them into their media // Exp. Eye Res. 1989. V. 49. P. 217-227.

78. Casarosa S., Adreazzoli M., Simeone M., Barsacchi G. Xrx-1, a novel Xenopus homebook gene expressed during eye and pineal gland development //Mech. Dev. 1997. V. 61. P. 187-198.

79. Caubit X., Thangarajah R., Theil T. et al. Mouse Dac, a novel nuclear factor with gomology to Drosophila dachshund shows a dynamicexpression in the neural crest, the eye, the neocortex, and the limb bud // Dev. Dyn. 1999. V. 214. P. 66-80.

80. Cepko C.L. Retinal cell fate determination. // Progress Ret. Res. 1993. V.12. P. 1-12.

81. Cepko C.L. The roles of intiristic and extrinsic cues and bHLH genes in the determination of retinal cell fates // Curr. Opin. Neurobiol. 1999. V. 9. P. 37-46.

82. Cepko C. L., Austin C.P., Yang X. et al. Cell fate determination in the vertebrate retina // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 589-595.

83. Chang M.-L., Wu C.-H., Jiang-Shieh Y.-F., et al. Reactive changes of retinal astrocytes and Muller glial cells in kainite-induced neuroexcitotoxicity // J. Anat. 2007. V. 210. P. 54-65.

84. Chen S., Samuel W., Fariss R.N. et al. Differentiation of human retinal pigment epithelial cells into neuronal phenotype by N-(4-hydroxyphenyl) retinamide // J. Neurochem. 2003. V. 84. P. 972-981.

85. Chiba C., Hoshino A., Nakamura K. et al. Visual cycle protein RPE65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt // J. Comp. Neurol. 2006. V. 495. № 4. P. 391-407.

86. Cho S.H., Cepko C.L. Wnt2b/beta-catenin-mediated canonical Wnt signaling determines the peripheral fates of the chick eye. Development. 2006. V. 133. P. 3167-3177.

87. Cicero S.A., Johnson D., Reyntjens S., et al. Cells previously identified as retinal stem cells are pigmented ciliary epithelial cells // PNAS. 2009. V. 106. № 16. P. 6685-6690.

88. Close J.L., Liu J., Gumuscu B., Reh T.A. Epidermal growth factor receptor expression regulates proliferation in the postnatal rat retina//Glia.2006. V. 54. №2. P. 94-104.

89. Coulombre J.L., Coulombre A.J. Regeneration of neural retina from pigmented epithelium in the chick embryo // Devel. Biol. 1965. V. 12. P. 7992.

90. Coulombre J.L., Coulombre A.J. Influence of mouse neural retina on regeneration of chick neural retina from chick embryonic pigmented epithelium//Nature. 1970. V. 228. P. 559-560.

91. Crawford B. Some factors controlling cell polarity in chick retinal pigment epithelium cells in clonal culture // Tissue and Cell. 1983. V. 15. P. 993-1005.

92. Das A.V., Mallya K.B., Zhao X, Ahmad F., Bhattacharya S., Thoreson W.B., Hegde G. V., Ahmad I. Neural stem cell properties of Muller glia in the mammalian retina: regulation by Notch and Wnt signaling. // Dev Biol. 2006. V. 299. № 1. P. 283-302.

93. Davis R. J., Shen W., Heanue T.A., Mardon G. Mouse Dach, a homologue of Drosophila dachshund, is expressed in the developing retina, brain, and limbs // Development, Genes, Evolution. 1999. V. 209. P. 526536.

94. Del Rio-Tsonis K., Jung J.S., Chiu I.M., Tsonis P.A. Conservation of fibroblast growth factor function in lens regeneration // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 13701-13706.

95. Del Rio-Tsonis K., Tsonis P.A. Eye regeneration at the molecular age // Dev. Dyn. 2003. V. 226. P. 211-224.

96. Dickson D.H., Hollenberg M.J. The fine structure of the pigmented epithelium and photoreceptor cells of the newt, Triturus viridescens dorsalis

97. Rafinesque) // J. Morphol. 1971. V. 135. P. 389-432.

98. Duncan K.G., Bailey K.R., Kane J.P., Schwartz D.M. Human retinal pigment epithelial cells express scavenger receptors BI and BI // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 292. № 4. P. 1017-1022.

99. Duncan M.K., Kos L., Jenkins N.A., Gilbert D.J., Copeland N.G., Tomarev S.I. Eyes absent: A gene family found in several metazoan phyla // Mammalian Genome. 1997. V. 8. P. 479-485.

100. Eguchi G. Transdifferentiation in pigmented epithelial cells of vertebrate eyes in vitro // In: Mechanisms of cell change. 1979. Ebert J.D., Okada T.S. (eds.). Wiley, New York. P. 273-291.

101. Eguchi G. Lens transdifferentiation in the vertebrate retinal pigmented epithelial cells // Prog. Ret. Res. 1993. V. 12. P. 205-230.

102. Engelhardt M., Bogdahn U., Aigner L. Adult retinal pigment epithelium cells express neural progenitor properties and the neuronal precursor protein doublecorti II Brain Res. 2005. V. 1040. P. 98-111.

103. Engelhardt M., Wachs F.P., Couillard-Despres S., Aigner L. The neurogenic competence of progenitors from the postnatal rat retina in vitro II Exp. Eye Res. 2004. V.78. № 5. P. 1025-1036.

104. Eppig J. Jr. , Dumont J. W. Cytochemical localization of tyrosinase activity in pigmented epithelial cells of Rana pipiens and Xenopus laevis larvae // J. Ultrastruct. Res. 1972. V. 39. № 3. P. 397-410.

105. Ezzeddine Z.D., Yang X, DeChiara T. et al. Postmitotic cells fated to become rod photoreceptors can be respecified by CNTF treatment of the retina//Development. 1997. V. 124. P. 1055-1067.

106. Faillace M.P., Julian D., Korenbrot J.I. Mitotic activation of proliferative cells in the inner nuclear layer of the mature fish retina:regulatory signals and molecular markers // J. Compar. Neurol. 2002. V. 451. P. 127-141.

107. Fan Y., Bergmann A. Apoptosis induced compensatory proliferation. The cell is dead. Long live the cell. // Trends Cell Biol. 2008. V. 18. № 10. P. 467-473.

108. Feigenspan A., Bormann J'., Wassle H. Organotypic slice culture of the mammalian retina // Visual Neurosci. 1993. V.10. P.203-217.

109. Fernandez-Bueno I., Pastor J.C., Gayoso M.J., et al. Müller and macrophage-like cell interactions in an organotypic culture of porcine neuroretina//Mol. Vis. 2008. V.14. P. 2148-2156.

110. Flannery J.G., O'Day W., Pfeffer B.A., Horwitz J., Bok D. Uptake, processing and release of retinoids by cultured human retinal pigment epithelium // Exp. Eye Res. 1990. V. 51. P. 717-728.

111. Finlay D., Wilkinson G., Kypta R., De Curtis I., Reichardt L. Retinal cultures. //Methods Cell Biol. 1996. V. 51. P. 265-83.

112. Fischer A.J., Reh T.A. Müller glia is a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina // Nature Neurosci. 2001. V. 4. P. 247-252.

113. Fisher A. J., Reh T.A. Identification of a proliferating marginal zone of retinal progenitors in the postnatal chicken // Devel. Biol. 2000. V. 220. P. 197-210.

114. Fischer A.J., Reh T.A. Potential of Müller glia to become neurogenic retinal progenitor cells // Glia. 2003. V. 43. № 1. P. 70-76.

115. Fischer A.J., Reh T.A. Muller glia are a potential source of neural regeneration in the postnatal chicken retina // Nature neuroscience. 2001a. V. 4. P. 247-252.

116. Fischer A.J., Reh T.A. Transdifferentiation of pigmented epithelial cells: a source of retinal stem cells? // Dev. Neurosci. 2001b. V. 23. P. 268276.

117. Fisher S.K., Erickson P.A., Lewis G.P., Anderson D.H. Intraretinalproliferation induced by retinal detachment // Invest. Ophthal. Vis. Sei. 1991. V. 32. №6. P. 1739-1748.

118. Fisher S.K., Lewis G.P., Linberg K.A., Verardo M.R. Cellular remodeling in mammalian retina: results from studies of experimental retinal detachment // Prog. Retin. Eye Res. 2005. V. 24. № 3. P. 395-431.

119. Fischer A.J., Scott M.A., Tuten W. Mitogen-activated protein kinase-signaling stimulates Müller glia to proliferate in acutely damaged chicken retina// Glia. 2009. V.57. № 2. P. 166-181.

120. Foreman D.M., Pancholi S., Jarvis-Evans J., McLeod D., Boulton M.E. A simple organ culture model for assessing the effects of growth factors on corneal re-epithelialization. // Exp. Eye Res. 1996. V. 62. № 5. P. 555-64.

121. Freund C., Horsford D.J., Mclnnes R.R. Transcription factor genes and the developing eye: a genetic perspective. // Human Molecul. Genet. 1996. V. 5. P. 1471-1488.

122. Fuhrmann S., Levine E.M., Reh T.A. Extraocular mesenchyme patterns the optic vesicle during early eye development in the embryonic chick. Development. 2000. V. 127. P. 4599-4609.

123. Gaur V., Liu Y., Turner J. RPE conditioned medium stimulates photoreceptor cell survival, neurite outgrowth and differentiation in vitro // Exp. Eye Res. 1992. V. 54. P. 645-639.

124. Gay C.G., Winkles J. A. Heparin-binding growth factor-1 stimulation of human endothelial cells induces platelet-derived growth factor A-chain gene expression // J. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 3284-3292.

125. Germer A., Kuhnel K., Grosche J.,et al. Development of the neonatal rabbit retina in organ culture. 1. Comparison with histogenesis in vivo, and effect of a gliotoxin (alfa-aminoadipic acid) // Anat. Embryol. (Berl). 1997. V.196. № 1. P. 67-79.

126. Goodwin T.J., Jessup J.M., Wolf D.A. Morphologic differentiation of colon carcinoma cell lines HT-29 and HT-29KM in rotating-wall vessels.// In Vitro Cell Dev Biol. 1992. V. 28. P. 47-60.

127. Grigoryan E.N., Mitashov V.I., Anton H.J. Microgravity effects on neural retina regeneration in the newt // Advan. Space Res. 1998. V. 22. № 2. P. 293-301.

128. Grigorian E.N., Novikova Yu.P., Kilina O.V., Philippov P.P. The novel antioxidant SkQl as an effective protector of rat eye tissues cultured organotypically in vitro II Submitted. 2009.

129. Hadlock T., Sundback C., Koka R., Hunter D., Cheney M., Vacanti J. A novel, biodegradable polymer conduit delivers neurotrophins and promotes nerve regeneration // Laryngoscope. 1999. V. 109. № 9. P. 1412-6.

130. Hale I.L., Fisher S.K., Matsumoto B. Effects of retinal detachment on rod disc membrane assemble in cultured frog retinas. // Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 1991. V. 32. № 11. P. 2873-2881.

131. Halfter W, Deiss S. Axonal pathfinding in organ-cultured embryonic avian retinae // Dev. Biol. 1986. V. 114. № 2. P. 296-310.

132. Hammond T.G., Hammond J.M. Optimized suspension culture: the rotating-wall vessel.//Am. J. Physiol. Renal Physiol. 2001. V. 281. № 1. P. 12-25.

133. Harris W.A. Cellular diversification in the vertebrate retina // Curr. Opin. Gen. Devel. 1997. V. 7. № 5. P. 651-658.

134. Harris W.A., Perron M. Molecular recapitulation: the growth of the vertebrate retina // Int. J. Devel. Biol. 1998. V. 42. P. 299-304.

135. Hay E.D., Dodson J.W. Secretion of collagen by corneal epithelium. I. Morphology of the collagenous products produced by isolated epithelia grown on frozen-killed lens.// J Cell Biol. 1973 V.57. № 1. P. 190213.

136. Hayashi T., Mizuno N., Ueda Y, Okamoto M., Kondoh H. FGF2triggers iris-derived lens regeneration in newt eye // Mechan. Develop. 2004. V. 121. №6. P. 519-526

137. Hayes S., Nelson B.R., Buckingham B., Reh T.A. Notch signaling regulates regeneration in the avian retina.// Dev Biol. 2007. V. 312. № l.P. 300-11.

138. Hasegawa M. Restitution of the eye after removal of the retina and lens in the newt Triturus pyrrhogaster I I Embryologia. 1958. V. 4. № l.P. 1— 32.

139. Hasegawa M. Restitution of the eye from iris after removal of the retina and lens together with the eye coats in the newt Triturus pyrrhogaster //Embryologia. 1965. V. 8. P. 362-386.

140. Hendrickson A.E. Regeneration of the retina in the newt (Diemictylus v. viridescens). An electron microscope study // University microfilm Inc. University of Washington. Ph.D. Thesis. 1964. P. 1-254.

141. Hendrickson A. E. Landolt's club in the amphibian retina: a Golgi and electron microscope study // Invest. Ophthalm. 1966. V. 5. № 5. P. 484496.

142. Hirsch N., Harris W.A. Xenopus Pax6 and retinal development // J. Neurobiol. 1997. V. 32. P. 45-61.

143. Hitchcock P.F., Raymond P.A. Retinal regeneration // Trends Neurosci. 1992. V. 15. P. 103-108.

144. Hoff A., Hammerle H., Schlosshauer B. Organotypic culture system of chicken retina // Brain Res Brain Res Protoc. 1999. V. 4. № 3. P. 237-48.

145. Holt C.E., Bertsch T.W., Ellis H.M., Harris W.A. Cellular determination in the Xenopus retina is independent of leneage and birth date //Neuron. 1988. V.l. P. 15-26.

146. Iandiev I., Uckermann O., Pannicke T., Wurm A., Tenckhojf S., Pietsch U.C., Reichenbach A., Wiedemann P., Bringmann A., Uhlmann S. Glial cell reactivity in a porcine model of retinal detachment. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2006. V. 47. № 5. p. 2161-71.

147. Ikeda U., Ikeda M, Oguchi A. et al. Interleukin 6 stimulates growth of vascular smooth muscle cells in a PDGF-dependent mariner // Am. J. Physiol. 1991. V. 260. P. 1713-1717.

148. Ikegami Y., Mitsuda S., Araki M. Neural cell differentiation from retinal pigment eoithelial cells of the newt: an organ culture model for the urodele retinal regeneration // J. Neurobiol. 2002. V. 50. P. 209-220

149. Ingber D.E., Folkman J. How does extracellular matrix control capillary morphogenesis? // Cell. 1989. V. 58. № 5. P. 803-5.

150. Jasoni C.L., Walkar M.B., Reh T.A. A chicken achaete-scute homolog (CASH-1) is expressed in a temporally and spatially discrete manner in the developing nervous system // Development. 1994. V. 120. P. 769-783.

151. Jaworowski A., Fang Z., Khong T.F., Augusteyn R.C. Protein synthesis and secretion by cultured retinal pigment epithelia // Biochim Biophys Acta. 1995. V. 1245. № 1. P. 121-9.

152. Jean D., Ewan K, Gruss P. Molecular regulators involved in vertebrate eye development. // Mech. Dev. 1998. V. 76. P. 3-18.

153. Johns P.R. Formation of photoreceptors in larval and adult goldfish // J. Neurosci. 1982. V. 2. P. 178-198.

154. Johns P.R. Growth of the adult goldfish eye. III. Source of the new retinal cells // J. Compar. Neurol. 1977.V. 176. P. 348-358.

155. Johnson T.V., Martin K.R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2008. V. 49. № 8. P.3503-3512.

156. Julian D., Ennis K, Korenbrot J.I. Birth and fate of proliferative cells in the inner nuclear layer of the mature fish retina // J. Compar. Neurol. 1998. V. 394. P. 271-282.

157. Justilien V., Pang J.J., Renganathan K, Zhan X., Crabb J.W., Kim S.R., Sparrow JR., Hauswirth W. W., Lewin A.S. SOD2 knockdown mousemodel of early AMD // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. V. 48. № 10. P. 4407-20.

158. Kaplan M.W. Exposure of rod outer segments to serum is not responsible for abnormal disk membrane morphogenesis in a model of retinal detachment // Curr. Eye Res. 1998. V. 17. № 8. P. 793-797.

159. Kaplan M. W., Iwata R.T., Sterrett C.B. Retinal detachment prevents normal assembly of disk membranes in vitro II Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1990. V. 31. N l.P. 1-8.

160. Kawakami K, Ohto H., Takizawa T., Saito T. Identification and expression of Six family genes in mouse retina // FEBS Lett. 1996. V. 393. P. 259-263.

161. Keefe J.R. An analysis of urodelian retinal regeneration (I, II, III, IV) II J. Compar. Neurol. 1973. V. 184. P. 185-257.

162. Keefe J.R. The fine structure of the retina in the newt Triturus viridescens III Exp. Zool. 1971. V. 177. № 3. P. 263-294.

163. Kelley M.W., Turner J.K, Reh T.A. Ligands of steroid/thyroid receptors induce cone photoreceptors in vertebrate retina // Development. 1995. V. 121. № 11. P. 3777-85.

164. Klein L.R., MacLeish P.R., Weisel T.N. Immunolabeling by a newt retinal pigment epithelium antibody during retinal development and regeneration//J. Comp. Neurol. 1990. V. 293. P. 331-339.

165. Knight J.K., Raymond P.A. Retinal pigment epithelium does not transdifferentiate in adult goldfish // J. Neurobiol. 1995. V. 27. № 4. P. 447456.

166. Koizumi A., Zeck G., Ben Y., et al. Organotypic culture of physiologically functional adult mammalian retinas II PLoS ONE. 2007. V. 2. №2. P. e221.

167. Komeima K, Rogers B.S., Lu L., Campochiaro P.A. Antioxidants reduce cone cell death in a model of retinitis pigmentosa II Proc Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 130. № 30. P. 11300-5.

168. Komeima K., Rogers B.S., Campochiaro P.A. Antioxidants slow photoreceptor cell death in mouse models of retinitis pigmentosa // J Cell Physiol. 2007. V. 213. № 3. P. 809-15.

169. Korte G.E., Perlman J.I., Pollack A. Regeneration of mammalian retinal pigment epithelium // Internat. Rev. Cytol. 1994. V.152. P.223-263.

170. Korte G.E., Chandra-Wanderman M. Distribution of Na+, K+-ATPase in regenerating retinal pigment epithelium in the rabbit. A study by electron microscopic cytochemistry // Exp. Eye Res. 1993. P. 219-229.

171. Kosaka M., Kodama R., Eguchi G. In vitro culture system for iris-pigmented epithelial cells for molecular analysis of transdifferentiation // Exp Cell Res. 1998. V. 245. № 2. P. 245-51.

172. Koznick Z, Pfeffer P., Kralova J. et al. Molecular cloning and expression of the human and mouse homologues of the Drosophila dachshund gene II Dev. Gene Evol. 1999. V. 209. P. 537-545.

173. Kubota R., Hokoc J.N., Moshiri A. et al. A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates //Devel. Brain Res. 2002. V. 134. № 1-2. P. 31-41.

174. Kurz-Isler G., Wolburg H. Morphological study on the regeneration of the retina in the rainbow trout after oubain-induced damage: evidence for dedifferentiation of photoreceptors // Cell Tissue Res. 1982. V.225. P. 165178.

175. Kustermann S., Schmid S., Biehlmaier O., Kohler K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina // Cell Tissue Res. 2008. V. 332. № 2. P. 195-209.

176. Lamba B, Karl M., Reh T. Neural regeneration and cell replacement: A view from the eye. //Cell stem cells. 2008. № 2. P. 538-547.

177. Landolt E. Beitrage zur anatomie der retina von frosh, salamander undtriton//Arch. mikr. anat. 1871. Bd. 7. S. 81-88.

178. Lassen N., Black W.J., Estey T., Vasiliou V. The role of corneal crystallins in the cellular defense mechanisms against oxidative stress //

179. Semin Cell Dev Biol. 2008. V. 19. № 2. P. 100-12.

180. Layer P.G., Willbold E. Histogenesis of the avian retina in reaggregation culture: from dissociated cells to laminar neuronal networks.// Int. Rev. Cytol. 1993. V. 146. P. 1-47.

181. Leschey K.H., Hackett S.F., Singer J.H., Campochiaro P.A. Growth factor responsiveness of human retinal pigment epithelial cells // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1990. V. 31. P. 839-846.

182. Levine R.L. La regenerescence de la retina chez Xenopus laevis II Rev. Can. Biol. 1981. V. 40. P. 19-27.

183. Leure-duPree A. Ultrastructure of the pigment epithelium in the domestic sheep // Amer. J. Ophthalmol. 1968. V. 65. P. 383-398.

184. Lewis G.P., Fisher S.K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression // Int. Rev. Cytol. 2003. V. 230. P. 263290.

185. Li T., Wu S.M., Lam D.M.K., Watt C.B. Localization of classical neurotransmitters in interneurons of the larval tiger salamander retina // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1990. V. 31. № 2. P. 262-271.

186. Liberman E.A., Topaly V.P., Tsofina L.M., Jasaitis A.A., Skulachev V.P. Mechanism of coupling of oxidative phosphorylation and the membrane potential of mitochondria//Nature. 1969. V. 222. P. 1076-8.

187. Liljekvist-Larsson I., Torngren M., Abrahamson M., Johansson K. Growth of the postnatal rat retina in vitro: Quantitative RT-PCR analyses of mRNA expression for photoreceptor proteins // Mol. Vision. 2003. V. 9. P. 657-664.

188. Liu L., Cheng S.H., Jiang L.Z., Hansmann G., Layer P.G. Thepigmented epithelium sustains cell growth and tissue differentiation of chicken retinal explants in vitro // Exp. Eye Res. 1988. V. 46. № 5. P. 80112.

189. Liu H., Xu S., Wang Y., Mazerolle C., Thurig S., Coles B.L., Ren J.C., Taketo M.M., van der Kooy D, Wallace VA. Ciliary margin transdifferentiation from neural retina is controlled by canonical Wnt signaling // Dev. Biol. 2007. V. 308. P. 54-67.

190. Lu L., Garcia C.A., Mikos A.G. Retinal pigment epithelium cell culture on thin biodegradable poly(DL-lactic-co-glycolic acid) films // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 1998 V. 9. № 11. P. 1187-205.

191. Lombardo F. Course and localization of mitoses during regeneration of the retina in an adult teleost // Atti. Acad. Naz. Linzei-Rendi-conti Sci. Fis. Mat. etNat. 1972. V .53. P. 323-327.

192. Loosli F., Koster R.W., Carl N., Krone A., Wittbrodt J. Six3, a medaka homologue of Drosophila homeobox gene sine oculis in expressed in the anterior embrionic shield and the developing eye // Mech. Dev. 1998. V. 74. P. 159-164.

193. Lopashov G.V., Sologub A.A. Artificial metaplasia of pigmented epithelium into retina in tadpoles and adult frogs// J. Embryol. Exp. Morphol. 1972. V. 28. P. 521-547.

194. Machemer R., Kroll A.J. Experimental retinal detachment in the owl monkey. VII. Photoreceptor protein renewal in normal and detached retina.// // J. Embryol. Exp. Morphol. 1971. V. 71. P. 690.

195. Maier W., Wolburg H. Regeneration of the goldfish retina after exposure to different doses of ouabain // Cell Tissue Res. 1979. V. 202. P. 99-118.

196. Mack A.F., Fernald R.D. Thin slices of teleost retina continue to grow in culture. // J Neurosci. Methods. 1991. V. 36. №2-3. P. 195-202.

197. Mandelcorn M.S., Machemer R., Fineberg E., Hersch S.B. Proliferation and metaplasia of intravitreal retinal pigment epithelium cellautotransplants // Am. J. Ophthalmol. 1975. V. 80. № 2. P. 227-237.

198. Marshall J., Ansell P.L. Membranous inclusions in the retinal pigment epithelium phagosomes and myeloid bodies // J. Anat. 1971. V. 1110. P. 91-104.

199. Martinez-Morales JR., Rodrigo I., Bovolenta P. Eye development: a view from the retina pigmented epithelium // Bioassays. 2004. V. 26. № 7. P. 766-777.

200. Mathers P.H., Grinberg A., Mahon K.A., Jamrich M. The Rx homebook gene is essential for vertebrate eye development // Nature. 1997. V. 387. P. 603-607.

201. Matsuo 71, Tsutsui Y., Matsuo N. Transdifferentiation of chick embryonic retinal pigment epithelial cells to lentoid structure in suspension culture // Acta Med Okayama. 1998. V. 52. № 3. P. 125-30.

202. McDevitt D.S., Brahma S.K., Courtois Y, Jeanny J.C. Fibroblast growth factor receptors and regeneration of the eye lens // Dev. Dyn. 1997. V. 208. P. 220-226.

203. McKinnon S.J. Glaucoma: ocular Alzheimer's disease? // Front Biosci. 2003. V. 1. № 8. P. 1140-56.

204. McLaren M.J., Sasabe T., Li C.Y., Brown M.E., Inana G. Spontaneously arising immortal cell line of rat retinal pigmented epithelial cells. Exp. Cell Res. 1993. V. 204. № 2. P.311-20.

205. Mey J., Thanos S. Ontogenetic changes in the regenerative ability of chick retinal ganglion cells as revealed by organ explants // J. Neurosci. Methods. 1991. V. 264. P. 347-355.

206. Mishima N., Tomarev S. Chicken Eyes absent 2 gene: Isolation and expression pattern during development // Int. J. Dev. Biol. 1998. V. 42. P. 1109-1115.

207. Mitashov V.I. Mechanisms of retina regeneration in vertebrates // Internat. J. Devel. Biol. 1996. V. 40. P. 833-844.

208. Mitashov VI. Retinal regeneration in amphibians // Internat. J.

209. Devel. Biol. 1997. V. 41. P. 893-905.

210. Mitashov V.I., Arsanto J.P., Markitantova Y.V., Thouveny Y. Remodeling processes during neural retinal regeneration in adult urodeles: an immunohistochemical survey // Int. J. Dev. Biol. 1995. V. 39. № 6. P. 9931003.

211. Mitsuda S., Yoshii Ch., Ikegami Y., Araki M. Tissue interaction between the retinal pigment epithelium and the choroids triggers retinal regeneration of the newt Cynops pyrrhogaster // Dev. Biol. 2005. V. 280. P. 122-132.

212. Mizuno M., Takabatake T., Takahashi T.C., Takashima K. Pax-6 gene expression in newt eye development // Dev. Genes Evol. 1997. V. 207. P. 167-176.

213. Model P.G. The ultrastructural localization of 3H-DOPA in differentiating amphibian melanophores grown in vitro // Develop. Biol. 1973. V. 34. P. 297-308.

214. Model P.G., Dalton H.C. The uptake and localization of radiactive DOPA by amphibian melanoblasts in vitro // Develop. Biol. 1968. V. 17. P. 245-271.

215. Monnin J., Morand-Villeneuve N., Michel G., et al. Production of neurospheres from mammalian Miiller cells in culture //Neurosci. Lett. 2007. V.421.№ l.P. 22-26.

216. Monroy A. Ricerche sulla capacita lentogena dell' iride de gli Amfibi // Arch. Entw-Mech. 1939. V. 139. P. 536-555.

217. Moroi S.E., Hao Y., Inoue-Matsuhisa E., et al. Cell signaling in bovine ciliary epithelial organ culture // J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2000. V.16. № l.P. 65-74.

218. Moran D,, Palmer J.D., Model P.G. The role of phenylalanine in differentiating amphibian melanocytes // Develop. Biol. 1973. V. 34. P. 297308.

219. Morse D.E., McCann P.S. Neuroectoderm of the early embryonic rat eye // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1984. V. 25. P. 899-907.

220. Moscona A. Rotation-mediated histogenetic aggregation of dissociated cells. A quantifiable approach to cell interactions in vitro // Exp. Cell Res. 1961. V. 22. P. 455-75.

221. Moyer F.H. Genetic variations in the fine structure and ontogeny of mouse melanin granules // Amer. Zool. 1966. V. 6. P.43-66.

222. Moyer K.E. Internal impulses to aggression.// Trans N Y Acad. Sci. 1969. V. 31. №2. P. 104-14.

223. Murphy T.L., Sakamoto T., Hinton D.R. et al. Migration of retinal pigment epithelium cells in vitro is regulated by protein kinase C // Exp. Eye Res. 1995. V. 60. P. 683-695.

224. Neill J.M., Barnstable C.J. Expression of the cell surface antigens RET-PE2 and N-CAM by rat retinal pigment epithelial cells during development and in tissue culture // Exp. Eye Res. 1990. V.51. P.573-583.

225. Ng T.F., Kitaichi N., Taylor A. W. In vitro generated autoimmune regulatory T cells enhance intravitreous allogenic retinal graft survival //1.vest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2007. V. 48. № 11. P. 5112-5117.

226. Ogilvie J.M., Speck J.D., Lett J.M., Fleming T.T. A reliable method for organ culture of neonatal mouse retina with long-term survival //J. Neurosci. Methods. 1999. V. 87. № 1. P. 57-65.

227. Oliver G., Mailhos A., Wahr R. et. al. Six3, a murine homologue of the sine oculis gene, demarcates the most anterior border in the developing neural plate and is expressed during eye development // Development. 1995. V. 121. P. 4045-4055.

228. Ooto S., Akagi T., Kageyama R., Akita J., Mandai M., Honda Y., Takahashi M. Potential for neural regeneration after neurotoxic injury in the adult mammalian retina // PNAS, 2004. V. 101, № 37, P. 13654-13659.

229. Orts-Llorca F., Genis-Galvez J.M. Experimental production of retinal septa in the chick embryo. Differentiation of pigment epithelium into neuronal retina // Acta. Anat. 1960. V. 42. P. 31-70.

230. Okada T.S. Transdifferentiation // Oxford. Clarendon Press, 1991. 238 p

231. Osakada F., Ooto S., Akagi T., Mandai M., Akaike A., Takahashi M. Wnt signaling promotes regeneration in the retina of adult mammals// J Neurosci. 2007. V. 27. № 15. P. 4210-9.

232. Otteson D.C., D'Costa A.R., Hitchcock P.F. Putative stem cells and the lineage of rod photoreceptors in the mature retina of the goldfish // Devel. Biol. 2001. V. 232. P. 62-76.

233. Park C.M., Hollenberg M.J. Basic fibroblast growth factor induces retinal regeneration in vivo II Devel. Biol. 1989. V. 134. P. 201-205.

234. Park C.M., Hollenberg M.J. Growth factor induced retinal regeneration in vivo II Internat. Rev. Cytol. 1993. V.146. P. 49-74.

235. Park C.M., Hollenberg M.J. Induction of retinal regeneration in vivo by growth factors // Internat. Rev. Cytol. 1991. V.148. P. 322-333.

236. Perron M., Kanekar S., Vetter M.L., Harris W.A. The genetic sequence of retinal development in the ciliary margin of the Xenopus eye //

237. Dev. Biol. 1998. V. 199. P. 185-200.

238. Perron M., Harris W.A. Retinal stem cells in vertebrates // Bioassays. 2000. V. 22. № 8. P. 685-688.

239. Picaud S, Hicks D, Forster V, Sahel J\ Dreyfus H. Adult human retinal neurons in culture: Physiology of horizontal cells.// Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1998. V. 39. № 13. P. 2637-48.

240. Pinzon-Duarte G., Kohler K., Arango-Gonzalez B., Guenther E. Cell differentiation, synaptogenesis, and influence of the retinal pigment epithelium in a rat neonatal organotypic retina culture //Vision Research. 2000. V. 40. № 25. P. 3455-3465.

241. Pittack C., Grunwald G.B., Reh T.A. Fibroblast growth factors are necessary for neural retina but not pigmented epithelium differentiation in chick embryos. Development. 1997. V. 124. P. 805-816.

242. Prada C., Puga J., Perez-Mendez L. et al. Spatial and temporal patterns of neurogenesis in the chick retina // Eur. J. Neurosci. 1991. V. 3. P. 559-569.

243. Raad De S., Comte M, Nef P., et al. Distribution pattern of three neural calcium-binding proteins (NSC-1, VILIP and recoverin) in chicken, bovine and rat retina // Histochem. J. 1995. V. 27. P. 524-535.

244. Rattner A., Toulabi L., Williams J., Yu H., Nathans J. The genomic response of the retinal pigmented epithelium to light damage and retinal detachment // J. Neurosci. 2008. V.28. P. 9880-9889.

245. Raymond P.A. Retinal regeneration in teleost fish // Ciba Found Symp. 1991. V. 160. P.171-186. Discussion P. 186-91.

246. Raymond P.A. The unique origin of rod photoreceptors in the teleost retina // Trends Neurosci. 1985a. V.8. P. 12-17.

247. Raymond P.A. Cytodifferentiation of photoreceptors in larval goldfish: delayed maturation of rods // J. Comp. Neurol. 1985b. V. 236. P. 90-105.

248. Raymond P.A. Defining a retinal stem cell niche. // In: "Strategies for Retinal Tissue Repair and Regeneration in Vertebrates: from Fish to Human". Ed. Chiba Ch. Research Singpost, India. 2008. P. 1-11.

249. Raymond P.A., Barthel L.K. Retinal regeneration in goldfish: use of cell specific monoclonal antibodies to assess the reestablishment of normal cytoarchitecture// Soc. Neurosci. 1988. V. 15. P. 808-816.

250. Raymond P.A., Barthel L.K., Bernardos R.L., Perkowski J.J. Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish // BMC Dev Biol. 2006. V. 6. P. 36-43.

251. Raymond P.A., Braisted J.E., Knight J.K, Wu D., Barthel L.K Role of cell-cell interactions in the regulation of retinal regeneration // In: 6th Internat. Symp. on Neural Regeneration. Pacific Grove. 1995. P. 29.

252. Raymond P.A., Hitchcock P.F. Retinal regeneration: common principles but diversity of mechanisms // Advan. Neurol. 1997. V. 72. P. 171-184.

253. Raymond-Johns P.A. Formation of photoreceptors in larval and adult goldfish//J. Neurosci. 1982. V. 2. P. 178-198.

254. Raymond-Johns P.A., Fernald R.D. Genesis of rods in teleost fish retina//Nature. 1981. V.293. P. 141-142.

255. Reh T.A, Fischer A.J. Retinal stem cells 11 Methods Enzymol. 2006. V. 419. P. 52-73.

256. Reh T.A., Nagy T. A possible role for the vascular membrane in retinal regeneration in Rana catasbienna tadpoles. // J. Neurosci. 1987. V. 330. P. 68-71.

257. Reh T.A., Cljavin I.J. Age of differentiation determines rat germinal cell phenotype: induction of differentiation by dissociation // J. Neurosci. 1989. V. 9. P. 4179-4189.

258. Reyer R.W. DNA synthesis and the incorporation of labeled iris cells into the lens during lens regeneration in adult newts // Develop. Biol. 1971a. V. 24. № 4. P. 533-558.

259. Reyer R. W. The origins of the regenerating neural retina on two species of urodele // Anat. Rec. 1971b. V. 169. P. 410-411.

260. Reyer R.W. The amphibian eye: development and regeneration. In: Handbook of Sensory Physiology. V.II. Part 5: The visual system in vertebrates (F.Crescitelli, ed.), Springer-Verlag, Berlin Heidelberg - New-York. 1977. P. 309-390.

261. Rickman D.W. Parvalbumin immunoreactivity is enhanced by brain-derived neurotrophic factor in organotypic cultures of rat retina // J. Neurobiol. 1999. V. 41. № 3. P. 376-84.

262. Romano C., Hicks D. Adult retinal neuronal cell culture // Prog. Ret. Eye Res. 2007. V. 26. P. 379-397.

263. Ryeom S.W., Sparrow J., Silverstein R.L. CD36 participates in the phagocytosis of rod outer segments by retinal pigment epithelium // J. Cell Sci. 1996. V. 109. P. 387-395.

264. Sagara H., Hirosawa K. Monoclonal antibodies which recognize endoplasmic reticulum in the retinal pigment epithelium // Exp. Eye Res. 1991. V. 53. P. 765-771.

265. Sakaguchi D.S., Janick L.M., Reh T.A. Basic fibroblast growth factor (FGF-2) induced transdifferentiation of retinal pigment epithelium: generation of retinal neurons and glia.// Dev Dyn. 1997. V. 209. № 4. P. 387-98.

266. Sakami S., Etter P., Reh T.A. Activin signaling limits the competence for retinal regeneration from the pigmented epithelium // Mech. Dev. 2008. V. 125. P. 106-116.

267. Sal la S, Redbrake C, Becker J, Reim M. Remarks on the vitality of the human cornea after organ culture. //Cornea. 1995. V. 14. № 5. P. 502-8.

268. Sassoe-Pognetto M., Feigenspan A., Bormann J., Wassle H. Synaptic organization of an organotypic slice culture of the mammalian retina. Vis. Neurosci. 1996. V. 13. № 4. P. 759-71.

269. Sato T. Uber die Determination des fetalen Augenspalts bei Triton tainiatus // Wilhelm Roux' Arch. Entwickl.-Mech. Org. 1933. V. 128. P. 343-377.

270. Seigel G.M. The golden age of retinal cell culture // Mol. Vis. 1999. V. 19;5:4.

271. Seiji M., Shinao M.S., Birbeck C., Fitzpatrick T.B. Subcellular localization of melanin biosynthesis // Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1963. V. 100. P. 497-533.

272. Seo H.C., Drivenes O., Ellinbsen S., Fjose A. expression of two zebrafish homologs of the murine Six3 demarcates the initial eye primordia // Mech. Dev. 1998. V. 73. P. 45-57.

273. Sherry D.M., Townes-Anders on E. Rapid glutamatergic alterations in the neural retina induced by retinal detachment // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2000. V. 41. № 9. P. 2779-2790.

274. Singhal S., Vemuganti G.K. Primary adult human retinal pigment epithelial cell cultures on human amniotic membranes // Indian J. Ophthalmol. 2005. V. 53. № 2. P. 109-113.

275. Skene J.H. Axonal growth-associated proteins // An№ Rev. Neurosci. 1989. V. 12, P. 127-156.

276. Soderpalm A., Szel A., Caffe A.R., van Veen T. Selective development of one cone photoreceptor type in retinal organ culture.// Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1994. V. 35. № 11. P. 3910-21.

277. Skulachev VP. Membrane Bioenergetics, Springer- Verlag, Berlin1971. Heidenberg. 1988.

278. Steinberg R.H. Survival factors in retinal degenerations.// Curr. Opin. Neurobiol. 1994. V. 4. № 4. P. 515-24.

279. Stenkamp D.L., Barthel L.K., Raymond P.A. Spatiotemporal coordination of rod and cone photoreceptor differention in goldfish retina. // J. Comp. Neurol. 1997. V. 382. P. 272-284.

280. Stepanik P.L., Lerious V., McGinnis J.F. Developmental appearance, species and tissue specificity of mouse 23-kDa, a retinal calcium-binding protein (recoverin) // Exp. Eye Res. 1993. V. 57. № 2. P. 189-197.

281. Stiemke MM, Hollyfield J.G. Cell birthdays in Xenopus laevis retina//Differentiation. 1995. V. 58. № 3. P. 189-93.

282. Stone L.S. Neural retina degeneration followed by regeneration by surviving retinal pigment cells in grafted adult salamander eyes // Anat. Rec. 1950a. V. 106. P. 89-109.

283. Stone L.S. The role of retinal pigment cells in regenerating neural retina of adult salamander eye // J. Exp. Zool. 1950b. V.113. P. 9-31.

284. Stone L.S. Regeneration of the iris and lens from retina pigment cells in adult newt eyes // J. Exp. Zool. 1955. V. 129. P. 505-534.

285. Stone L.S. Regeneration of the retina, iris, and lens // In: Regeneration of vertebrates. III. University of Chicago Press. C.S.Thornton (Ed.). 1959. P. 3-14.

286. Stone L.S. Regeneration of the lens iris and neural retina in a vertebrate eye // Yale J. Biol. Med. 1960. V. 32. P. 464-473.

287. Stone L.S., Steinitz H. The regeneration of lenses in eyes with intact and regenerating retina in adult Triturus viridescens // J. Exp. Zool. 1953. V. 124. P. 435-^68.

288. Stone L.S., Steinitz H. Regeneration of neural retina and lens from retina pigment cells grafts in adult newts // J. Exptl. Zool. 1957. V. 135. P. 301-315.

289. Stone L.S., Zaur L.S. Reimplantation and transplantation of adult eyes in the salamander (Triturus viridescens) with return to vision // J. Exp. Zool. 1940. V. 85. P. 243-270.

290. Stramm L.E., Haskins M.E., McGovern M.M., Aguirre G.D. Tissue culture of cat retinal pigment epithelium // Exp Eye Res. 1983. V. 36. № l.P. 91-101.

291. Strauss O. The Retinal Pigment Epithelium in Visual Function //Physiol. Rev. 2005. V. 85. P. 845-881.

292. Straznicky K., Gaze R.M. The growth of the retina in Xenopus laevis: An autoradiographic study // J. Embryol. Exp. Morphol. 1971. V. 26. P.67-79

293. Stone L.S. The role of retinal pigment cells in regenerating neural retina of adult salamander eye // J. Exp. Zool. 1950. V. 113. P. 9-31.

294. Stroeva O.G. Experimental analysis of the eye morphogenesis in mammals // Internat. Rev. Cytol. 1960. V. 8. P. 349-368.

295. Stroeva O.G., Mitashov V.I. Retinal pigment epithelium: proliferation and differentiation during development and regeneration // Internat. Rev. Cytol. 1983. V. 83. P. 221-293.

296. Sullivan R., Penfold P., Pow D.V Neuronal migration and glial remodeling in degenerating retinas of aged rats and in nonneovascular AMD // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2003. V. 44. P. 856-865.

297. Susaki K., Chiba C. MEK mediates in vitro neural transdifferentiation of the adult newt retinal pigment epithelium cells: Is FGF2 an induction factor? // Pigment Cell Res. 2007. V. 20. P. 364-379.

298. Tauchi M. Displaced and indolamine-accumulating bipolar cells in the turtle retina // Neurosci. Res. 1989. V.10. P. 57-66.

299. Tezel G. Oxidative stress in glaucomatous neurodegeneration: mechanisms and consequences // Prog. Retin. Eye Res. 2006. V. 25. № 5. P. 490-513.

300. Thanos S. Alterations in the morphology of ganglion cell dendritesin the adult rat retina after optic nerve transsection and grafting of peripheral nerve segments // Cell and Tissue Res. 1988. V. 254 P. 599-609.

301. Thanos S., Bahr M., BardeY.-A., Vanselow J. Survival and axonal elongation of adult rat retinal ganglion cells. In vitro effects of lesioned sciatic nerve and brain derived neurotrophic factor // Eur. J. Neurosci. 1989. V. l.P. 19-26.

302. Tomarev S.I. Pax6, Eye absent and Prox-1 in eye development // Int. J. Dev. Biol. 1997. V. 41. P. 835-842.

303. Tosini G., Menaker M. Circadian rhythms in cultured mammalian retina.// Science. 1996. V. 272(5260) P. 419-21.

304. Toy J., Yang J.M., Leppert G.S., Sundin O.H. The optx2 homeobox gene is expressed in early precursors of the eye and activates retina-specific genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95. 10643-10648.

305. Tropepe V. Retinal stem cells in the adult mouse eye // Science. 2000. V. 287. P. 2032-2036.

306. Tsunematsu Y., Coulombre A.J. Demonstration of transdifferentiation of neural retina from pigmented retina in culture // Develop. Growth. Differ. 1981. V. 23. P. 297-311.

307. Turner D.L., Cepko C.L. A common progenitor for neurons and glia persists in rat retina late in development //Nature. 1987. V. 238. P. 131-136.

308. Underwood L.W., Ide Ch.F. An autoradiographic study during regeneratin in fully differentiated Xenopus eyes. // J. Exp. Zool. 1992. V. 262. P. 193-201.

309. Unsworth B.R., Lelkes P.I Growing tissues in microgravity // Nat Med. 1998. V. 4. № 8. P. 901-7.

310. Vergara N., Del Rio-Tsonis K. Retinal regeneration in the Xenopus laevis tadpole: a new model system // Mol Vis. 2009. V. 15. P. 1000-13.

311. Vinores S.A., Derevjanik N.L., Mahlow J. et al. Class III beta-tubulin in human retinal pigment epithelial cells in culture and in epiretinal membranes // Exp. Eye Res. 1995. V. 60. P. 385-400.

312. Viktorov I.V., Aleksandrova O.P., Alekseeva N.Y. Roller organ culture of the retina from postnatal rats // Bull. Exp. Biol. Med. 2006. V. 142. № 4. P. 486-489.

313. Victorov I.V., Lyjin A.A., Aleksandrova O.P. A modified roller method for organotypic brain cultures: free-floating slices of postnatal rat hippocampus // Brain Research Protocols. 2001. V. 7. P. 30-37.

314. Vihtelic T.S., Hyde D.R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebraflsh (Danio rerio) retina // J. Neurobiol. 2000. V. 44. № 3. P. 289-307.

315. Villegas-Perez M.P., Vidal-Sanz M., Bray G.M., Aguayo A.J. Influence of peripheral nerve grafts on the survival and regrowths of axotomized retinal ganglion cells in the adult rat // J. Neurosci. 1988. V. 8. P. 265-280.

316. Vinothkumar S., Rastegar S., Takamiya M., Ertzer R., Strahle U. Sequential and cooperative action of Fgfs and Shh in the zebraflsh retina // Dev Biol. 2008. V. 314. P. 200-214.

317. Waid D.K., McLoon S.C. Immediate differentiation of ganglion cells following mitosis in developing retina // Neuron. 1995. V. 14. № l.P. 117-124.

318. Wachs H. Neue Versuche zur Wolffschen Linsenregeneration // Archiv, for Mikroskopische Anatomie und Entwicklungsmechanik der Organismen. 1914. Bd. 39. S. 384-451.

319. Wachs H. Restitution des Auges nach Extirpation von Retina and Linse bei Triton (Neue Versuche zur Wolffschen Linsenregeneration, 2. Teil) // Roux1 Arch. Entwicklungsmech. Organismen. 1920. Bd. 46. S. 328-390.

320. Wallace S. The retinal-pigment epithelial interface. // British Journal of Ophthalmology, 1979. V. 63. P. 71-84.

321. Wan J., Zheng H., Xiao H.L., She Z.J., Zhou G.M. Sonic hedgehog promotes stem-cell potential of Müller glia in the mammalian retina.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. V. 363. № 2. P. 347-54.

322. Wan J., Zheng H., Chen Z.L., et al. Preferential regeneration of photoreceptor from Miiller glia after retinal degeneration in adult rat // Vision Res. 2008. V. 48. № 2. P. 223-234.

323. Wetts R., Fraser S.E. Multipotent precursors can give rise to all major cell types of the frog retina // Science. 1988. V. 239. P. 1142-1145.

324. Wetts R., Quon R.F. Autonomous proliferation of neural precursors in the tadpole retina revealed after partial removal of the embryonic eyebud // Devel. Brain Res. 1995. V. 86. № 1-2. P. 57-66.

325. Wetts R., Serbedzija G.№, Fraser S.E. Cell lineage analysis reveals multipotent precursors in the ciliary margin of the frog retina // Devel. Biol. 1989. V. 136. P. 254-263.

326. Wiedemann P. Growth factors in retinal disease: Proliferative vitreoretinopathy, proliferative diabetic retinopathy and retinal degeneration // Surv. Ophthalmol. 1992. V. 36. P. 373-384.

327. Willbold E., Layer P.G. A hidden retina regenerative capacity from the chick ciliary margin is reactivated in vitro, that is accompanied by down regulation of butyrylcholinesterase // Eur. J. Neurosci. 1991. V. 4. P. 210220.

328. Williams Jr.J.A. The regeneration of the neural retina from retina pigment cells in adult newt eyes: an electron microscopic study // University Microfilm Inc. Ann. Arbor. University of Michigan. Ph.D. Thesis. 1964. P. 1-82.

329. Woodford B.J., Blanks J.C. Uptake of tritiated thymidine in mitochondria of the retina// Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1989. V. 30. № 12. P. 2528-2532.

330. Wu D.M., Schneiderman T., Burgett J. et al. Cones regenerate fromretinal stem cells sequestered in the inner nuclear layer of adult goldfish retina // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2001. V. 42. P. 2115-2124.

331. Xu PX, Cheng J., Epstein J.A., Maas R.L. Mouse Eya genes during limb tendon development and encode a transcriptional activation function // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 11 974-11 979.

332. Xue L.P., Lu J., Hu S., et al. Muller glial cells express nestin coupled with glial fibrillary acidic protein in experimentally induced glaucoma in the rat retina // Neuroscience. 2006. V. 139. № 2. P. 723-732.

333. Young R. W. Protein renewal in rods and cones studied by electron microscope autoradiography // J. Cell Biol. V. 1967. V. 35. P. 1474-1489.

334. Young R.W. Biogenesis and renewal of visual cell outer segment membrane // Exp. Eye Res. 1974. V.18. № 3. P. 215-222.

335. Young R. W., BockD. Participation of the retinal pigment epithelium in the rod outer segment renewal process // J. Cell Biol. 1969. V. 42. № 2. P. 392-403.

336. Young R. W. Cell differentiation in the retina of the mouse// Anat. Rec. 1985. V. 212. P. 199-205.

337. Zhao S., Rizzolo L.J., Barnstable C.J. Differentiation and transdifferentiation of the retinal pigment epithelium // Internat. Rev. Cytol. 1997. V. 171. P. 225-266.

338. Zalokar M. Contribution a l'etude de la regeneration de cristallin chez le Triton // Rev. Suisse Zool. 1944. V.51. P. 443-521.

339. Zhao S., Thornquist S.C., Barnstable C.J. In vitro transdifferentiation of embryonic rat retinal pigment epithelium to neural retina // Brain Res. 1995. V. 677. P. 300-310.

340. Zhao S., Rizzolo L., Barnstable C. Differentiation and transdifferentiation of the retinal pigment epithelium // Internat. Rev. Cytol. 1997. V. 171. P. 225-266.

341. Zhao X, Das A.V., Soto-Leon F., Ahmad I. Growth factor-responsive progenitors in the postnatal mammalian retina // Develop. Dynam.2032005. V. 232. P. 349-358.

342. Zhu M., Provis J.M., Penfold P.L. Isolation, culture and characteristics of human foetal and adult retinal pigment epithelium // Aust N Z J Ophthalmol. 1998. P. 50-2.

343. Zuber M.E., Perron M, Philport A., Bang A., Harris W.A. Giant eyes in Xenopus leavis by overexpression of XOptx2 // Cell. 1999. V. 98. P. 341-352.

Информация о работе

Новикова, Юлия Петровна
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.03.05

Диссертация

Выявление и активация in vitro скрытых регенерационных потенций сетчатки глаза позвоночных животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы