Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление аминокислотных остатков, определяющих специфичность ферментов семейств альфа-бета гидролаз и пенициллин-связывающих белков, методами биоинформатического анализа
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Выявление аминокислотных остатков, определяющих специфичность ферментов семейств альфа-бета гидролаз и пенициллин-связывающих белков, методами биоинформатического анализа"
На правах рукописи
Суплатов Дмитрий Андреевич
Выявление аминокислотных остатков, определяющих специфичность ферментов семейств альфа-бета гидролаз и пенициллин-связывающих белков, методами биоинформатического анализа
03.01.04 - биохимия
Москва - 2011
4851018
Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики и в Научно-исследовательском институте физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Московского государственного университета имени
М.В.Ломоносова
Научный руководитель:
Швядас В.К., профессор, доктор химических наук
Официальные оппоненты:
Синицын А.П., профессор, доктор химических наук Рахманов C.B., старший научный сотрудник, кандидат биологических наук
Ведущая организация:
Институт биохимии имени А.Н.Баха РАН
Защита состоится » апреля 2011 года в 1500 на заседании
диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова
Автореферат разослан 25 марта 2011 года
Ученый секретарь диссертационного совета, Л
кандидат химических наук, Сакодынекая И.К.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Установление связи между структурной организацией белков и их функциональными свойствами представляет одну из фундаментальных проблем современной биохимии. Консервативные позиции в структурах гомологичных ферментов, связанные особыми ограничениями на изменчивость в процессе эволюции и потому содержащие аминокислоты одного функционального типа, как правило важны для обеспечения общей функции в семействе. В то же время ферменты одного семейства, обладая, например, общим каталитическим механизмом, могут значительно различаться по другим функциональным свойствам. Актуальным является поиск и изучение таких специфических позиций в структурах белков одного семейства, изменчивость которых в процессе эволюции привела к разнообразию их функциональных характеристик (субстратной специфичности, стереоселективности, стабильности и др.). Широкие возможности для решения этой задачи предоставляют методы биоинформатики и молекулярного моделирования, эффективность которых в последнее время постоянно растет в связи с развитием суперкомпьютерных технологий.
Цели и задачи исследования. Целью исследования являлась разработка алгоритма поиска специфических позиций в структуре белка {специфических позиций подсемейства), изменчивость которых в процессе эволюции привела к разнообразию функциональных характеристик в семействе ферментов (субстратной специфичности, стереоселективности, стабильности и др.), на основе анализа геномной и структурной информации, а также реализация алгоритма в виде программного кода для ЭВМ;
разработка метода биоинформатического анализа для определения специфических позиций больших семейств ферментов;
биоинформатический анализ роли специфических позиций в определении типа катализируемой реакции в суперсемействе альфа-бета гидролаз - одной из наиболее крупных групп ферментов со схожей структурной организацией и широким разнообразием типов активностей;
биоинформатический анализ роли специфических позиций в формировании субстратной специфичности Б-аминопептидазы из ОсИгоЬаМгит атИгор! (семейство пенициллинсвязывающих белков).
Научная новизна. Предложен систематический подход для изучения структурно-функциональных взаимосвязей в семействах ферментов на основе биоинформатического анализа и определения специфических позиций подсемейства. Разработан и реализован в виде программного кода для ЭВМ алгоритм поиска специфических позиций подсемейства. Разработан алгоритм сравнительного анализа удаленных гомологов на уровне структурной
организации активных центров. Биоинформатический анализ впервые применен для изучения вариабельных аминокислотных остатков, определяющих разнообразие свойств суперсемейств ферментов альфа-бета гидролаз и пенициллин-связывающих белков.
Практическая значимость работы. Программа поиска специфических позиций подсемейств и метод биоинформатического анализа могут быть использованы при изучении эволюции ферментов, особенностей структурной организации их активных центров и механизма действия. Сравнение удаленных гомологов позволяет изучать ферменты различных классов и охватить широкое разнообразие свойств. Информация о специфических позициях подсемейства может быть использована для получения ферментов с заданными свойствами и открывает принципиально новые возможности дизайна биокатализаторов.
Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международных конференциях: Международном конгрессе по биокатализу Biocat2010, Гамбург, Германия, 2010 г.; Международной конференции "Biocatalysis-2009: Fundamentals&Applications", Архангельск, 2009 г.; Международной конференции «Moscow Conference on Computational Molecular Biology», Москва, 2009 г.; Симпозиуме «ESF-EMBO symposium "Protein Design and Evolution for Biocatalysis"», Сан-Фели-де-Гюксольс, Испания, 2008 г.; Второй международной конференции «2nd International Conference "Biocatalysis in Non-Conventional Media"» Москва, 2008 г.; Научно-практической конференции "Живые Системы" ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы", в 2008 и 2009 г.г., Москва; Конференциях «Ломоносов-2010», Москва, 2010 г. и «Ломоносов-2008», Москва 2008 г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, постановки задачи, описания методов и протоколов расчетов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц и 56 рисунков.
Содержание работы
1. Биоинформатический анализ специфических позиций подсемейства, определяющих функциональное разнообразие внутри семейств ферментов
В процессе эволюции белки развиваются от общего предка путем аминокислотных замен, вставок и делеций, что обеспечивает функциональное многообразие семейств гомологичных ферментов.
Подсемейство I ;
11 '."".-—1 .у,.^^—-5—- —;——]
■¡вгашняял |
1 2 3 4 5 б 7
3 й
! к1
Р. Гч 3 к
■: с 5 Г У к
к 3
к Е
к в
к Е
к В
к Е
э Б
I I I I
бЦУ
14 ш
Консервативная
Неинформативная позиция СПТТ - специфическая позиция позиция
подсемейств
Рис. 1. Схематичное представление различных типов аминокислотных остатков при биоинформатическом анализе семейства ферментов: (1) Консервативная позиция -определяет общую для всего семейства функцию или особенность каталитического механизма (кол. 16); Специфическая позиция подсемейства - отвечает за специфические свойства, присущие подсемействам по отдельности (кол. 4, 7, 10, 12, 14); Неинформативная позиция - распределение аминокислот не соответствует ни одной из двух предыдущих закономерностей (кол. 1).
Некоторые аминокислотные остатки в структуре важны для функции и поэтому связаны особыми ограничениями на изменчивость в процессе эволюции. Множественное выравнивание является ключевым инструментом изучения структурно-функциональных взаимосвязей белков по их первичным и третичным структурам. Важным этапом биоинформатического анализа является поиск консервативных позиций, которые определяют общие свойства1 семейства ферментов. Замена аминокислотных остатков в этих позициях, как правило, приводит к потере каталитических функций.
Однако ферменты одного семейства, обладая общими характеристиками, могут значительно различаться в свойствах. Представляет интерес выявление и изучение аминокислотных остатков, изменчивость которых в процессе эволюции привела к разнообразию функциональных особенностей в семействе. Такие аминокислотные остатки консервативны только внутри определенных функциональных групп (подсемейств) внутри семейства и различаются между группами.
1 Варфоломеев С.Д., Упоров И.В., Федоров Е.В. // Биохимия, 2002
Мы предлагаем называть такие позиции в колонке множественного выравнивания специфическими позициями подсемейства (СПП), чтобы подчеркнуть различие аминокислотных остатков в этих позициях у подсемейств с разными свойствами.
Таким образом, при проведении биоинформатического анализа семейств ферментов можно идентифицировать следующие позиции:
• Консервативная позиция - определяет общие для всего семейства функции или особенности каталитического механизма {Рис.1, кол. 16);
• Специфическая позиция подсемейства - отвечает за специфические свойства, присущие подсемействам по отдельности {Рис.1, кол. 4, 7, 10, 12,14);
• Неинформативная позиция - распределение аминокислот не соответствует ни одной из двух предыдущих закономерностей {Рис.1, кол. 1).
Задачей диссертационной работы была разработка алгоритма поиска специфических позиций подсемейства, написание программы на основе этого алгоритма, создание метода биоинформатического анализа больших семейств ферментов и его применение для суперсемейств ферментов альфа-бета гидролаз и пенициллинсвязывающих белков.
1.1 Алгоритм поиска СПП состоит из трех этапов:
Разбиение семейства гомологичных ферментов на подсемейства с потенциально разными свойствами. Оптимальным критерием разбиения семейства ферментов на группы с разными свойствами является экспериментальная аннотация субстратной специфичности, стабильности, типа активности и т.д., для каждого представителя семейства. Белки могут быть объединены в одно подсемейство, если они имеют одинаковый признак по изучаемому свойству. Однако применение такого подхода не позволяет учитывать всю доступную геномную и структурную информацию о малоизученных ферментах. В связи с этим была разработана процедура кластеризации на подсемейства. Для каждых трех последовательностей семейства /, ] и к рассчитывается трехмерная матрица С(у'Д) количества консервативных колонок в этих последовательностях. Далее семейство разбивается на подсемейства: для каждого значения Т (от 1 до количества колонок в выравнивании) последовательности г и / объединяются в подсемейство, если существует последовательность к, такая что С(1,],к) больше или равно Т. Таким образом, множественное выравнивание преобразуется в граф, где каждая вершина соответствует последовательности выравнивания, а каждое ребро Е(/1/') соответствует наибольшему С (/,/',/с). Далее, каждая связная компонента с Т консервативными колонками закрепляется как новое подсемейство. Таким образом, процедура учитывает
функциональное многообразие ферментов и не ограничивается единственным разбиением семейства на подгруппы.
Расчет специфичности колонки выравнивания. Для каждой колонки выравнивания с учетом выбранного разбиения на функциональные подсемейства необходимо количественно оценить степень специфичности -т.е. сходства аминокислот внутри функциональных групп семейства и различия между группами. Критерий основывается на сравнении наблюдаемых (в выравнивании ферментов семейства) и случайных (сгенерированных) колонок множественного выравнивания для того, чтобы оценить степень случайности получаемых результатов.
Для оценки специфичности колонки выравнивания вводится следующая функция, основанная на формуле относительной энтропии:
¿1 =
2^М(АВ) х <7((АВ, в)
в АВ
С А 11\ ;
где А и В обозначают тип аминокислоты в колонке множественного выравнивания (в том числе и делецию); <?,(АВ, О - частота пары АВ в подсемействе в колонки г; «у,(А) и д,(А, в) - частоты аминокислоты типа А в колонке / и в подсемействе в этой колонки соответственно; обозначает общее количество подсемейств, а значение М(АВ) соответствует оценке взаимозаменяемости аминокислот типов А и В, рассчитанной как М(АВ) =
!тах(т) 7п1п(т)' Где т(АВ) - значение матрицы ВЬ08иМ62. Все частоты д
О, A=gap ог В^ар
опционально могут быть рассчитаны с учетом взвешивания последовательностей. Все диагональные элементы М(АА) считаются равными 1, чтобы исключить переоценку редких аминокислот. Представленная оценка специфичности 5, будет максимальна для колонок выравнивания с высокой степенью сходства аминокислот внутри подсемейств и различиями между подсемействами. Для того чтобы провести статистическую оценку полученного значения применяется процедура перетасовки2. Чтобы распознать, является ли распределение аминокислот по колонке случайным или ассоциировано с разбиением на конкретные подсемейства, каждая колонка случайно перетасовывается п раз. Для каждого случайного распределения вычисляется оценка 5',""'. В окончательном варианте оценка специфичности колонки г для заданного разбиения на подсемейства выражается через 2-оценку стандартного нормального
распределения: г1 = '
2 М1гпу Ц 6е№апс1 М // ,1.Мо1.Вю1., 2002, 321, 7-20
5
Большие значения Z-оценки соответствуют высокой степени специфичности позиции. Полученные Z-оценки корректируются с использованием информации о пространственной организации фермента для того, чтобы улучшить показатели аминокислотных остатков, которые располагаются в структуре в окружении консервативных остатков или других специфических позиций подсемейства:
z; = yZStSP + в, в = (1 - у) ^ max(zfns, Zfp) / N
i
где zfsp обозначает Z-оценку специфичности колонки (subfamily-specific position), a Zfm обозначает Z-оценку ее консервативности, j - соседи по структуре аминокислотного остатка, который представлен в колонке i выравнивания, а N - общее количество структурных соседей. Список соседей рассчитывается по структуре одного из ферментов, представленных во множественном выравнивании, для каждого остатка в радиусе 4А. Для оценки консервативности колонки I выравнивания используется оценка Valdar&Thornton.
Статистический анализ заключается в присвоении каждой Z-оценке специфичности колонки выравнивания так называемой Р-оценки, которое является мерой случайности полученного результата. Для этого использовалась процедура ранговой статистики Бернулли B-cutoff3. Полученные Z-оценки специфичности сортируются по убыванию, после чего ранг к рассчитывается так, что первые к оценок (соответствующие к колонкам выравнивания) представляют результаты, которые с наименьшей вероятностью могут возникнуть в случайном распределении:
к = org к minP (there are at least k Z-scores Z > Z^ =
argk minfl- £ ClnqlPn~l\
\ i=n-k+l 1
где n обозначает общее число посчитанных Z-оценок, а
Г 1
р - P(Z > Zk) = ^ -j=exp(-Z2) dZ, q = l-p.
Таким образом, мы получаем список специфических позиций подсемейства, отсортированных в порядке убывания статистической достоверности.
По завершении работы алгоритм определяет такие разбиения семейства на подсемейства, которые привели к обнаружению наиболее статистически
3 Vinogradov D.V., Mironov A.A.//BGRS'2002, 2002, Novosibirsk, Russia, July 1, 28-30
значимых специфических позиций, и находит наиболее достоверные группы ферментов с разными свойствами внутри семейства.
Реализация. Разработанный алгоритм поиска специфических позиций подсемейства был реализован в виде программного кода для ЭВМ на языке Java. Программа с рабочим названием ZEBRA была оптимизирована для работы в параллельном режиме на компьютерах, оснащенных многоядерными процессорами, и может функционировать на всех основных операционных системах.
Тестирование программы было проведено на семействах гомологичных ферментов аденилилциклаз (ЕС 4.6.1.1) и гуанилилциклаз (ЕС 4.6.1.2). Были найдены СПП, определяющие субстратную специфичность ферментов к связыванию нуклеотидов. Полученные результаты полностью соответствовали имеющимся литературным данным, что подтвердило правильность работы программы.
1.2 Биоинформатический анализ семейств ферментов
Для поиска и изучения специфических позиций в больших семействах ферментов был разработан метод биоинформатического анализа, который состоит из следующих этапов:
i. Подготовка выборки гомологичных ферментов: поиск гомологичных ферментов по сходству структур или аминокислотных последовательностей с помощью программ SSM и PSI-BLAST. Последовательности, идентичные более чем на 95%, группируются в кластеры, из которых для последующего анализа отбирается только один представитель;
И. Подготовка множественного выравнивания. Сравнительный биоинформатический анализ ферментов является важным шагом при изучении взаимосвязи их структуры и функции. Сравнение удаленных гомологов позволяет изучать ферменты различных классов и охватить широкое разнообразие свойств. Однако многие ферменты, произошедшие от одного предка в результате эволюции и претерпевшие значительные функциональные изменения в ходе естественного отбора, не обладают достаточным сходством по аминокислотным последовательностям для проведения статистически достоверного сравнительного анализа. При этом пространственная организация активных центров таких ферментов может быть консервативной, а остальные части структуры -принципиально отличаться. В связи с этим при изучении общих принципов организации гомологичных ферментов представляется целесообразным проводить сравнительный биоинформатический анализ наиболее важных с функциональной точки зрения элементов структуры -
активных центров, т.е. аминокислотных остатков, формирующих участки связывания субстрата и участвующих в механизме каталитического превращения. В связи с этим был разработан алгоритм для выделения структур активных центров ферментов, основанный на использовании базы данных структур белков PDB, алгоритмов структурного анализа, а также идентификации функционально важных аминокислотных остатков и полостей в структуре фермента. Для множественного структурного выравнивания полноразмерных структур и активных центров, а также последовательностей ферментов используются программы T-coffee и Mustang;
iii. Поиск специфических позиций подсемейства: с помощью разработанной программы ZEBRA, отбор наиболее статистически достоверных результатов;
iv. Изучение роли специфических позиций подсемейства с помощью программ визуализации данных (Pymol, Jalview) и методов молекулярного моделирования. Конструирование молекулярных моделей ферментов с заменами по СГТГТ, изучение роли аминокислот в специфических позициях в процессе связывания субстрата с помощью метода молекулярного докинга. При компьютерном скрининге библиотеки мутантных ферментов для характеристики продуктивного связывания в фермент-субстратных комплексах, полученных в результате докинга, следует использовать структурные фильтры, накладывая ограничения, например, на величину расстояния между кислородом каталитического остатка серина и карбонильным атомом субстрата -2,7±0,2Á, величину угла между кислородом серина, карбонильными углеродом и кислородом субстрата - 94±7°; а также на величину двугранного угла между плоскостями нуклеофильной атаки и амидной связи - 89±7° (Рис. 2).
Рисунок 2. Характеристики структурных фильтров для оценки реакционной способности фермент-субстратных
комплексов при молекулярном
моделировании: расстояние между взаимодействующими атомами, простой и двугранный углы нуклеофильной атаки каталитического серина на амидную связь субстрата. Объяснение в тексте.
Метод биоинформатического анализа может быть использован для изучения закономерностей и особенностей организации активных центров и механизма действия ферментов. При этом сравнение удаленных гомологов позволяет изучать ферменты различных классов и охватить широкое разнообразие свойств. Этот метод открывает принципиально новые возможности для изучения взаимосвязи структуры и функции ферментов и представляет информацию для направленного изменения свойств биокатализаторов.
2. Биоинформатический анализ ферментов суперсемейства альфа-бета гидролаз на уровне сравнения структурной организации активных центров
Дивергентная эволюция создала родственные ферменты, которые способны катализировать различные химические превращения несмотря на структурное сходство активных центров. Понимание того, как изменение структуры фермента приводит к изменению его функциональных свойств, представляет одну из важнейших задач современной энзимологии. С этой целью разработанная методология была применена к одной из наиболее крупных групп ферментов со схожей структурной организацией -суперсемейству альфа-бета гидролаз, которая охватывает такие активности, как гидролиз эпоксидов, пептидов, сложных эфиров и амидов карбоновых кислот, ацильный перенос, синтез С-С связей и перокисление органических соединений.
При изучении структурно-функциональных взаимосвязей между дальними эволюционными родственниками выравнивание третичных структур является значительно более информативным и точным, чем выравнивание аминокислотных последовательностей. Биоинформатический анализ показал, что ферменты суперсемейства альфа-бета гидролаз с различными типами активностей в значительной степени потеряли сходство не только по аминокислотным последовательностям, но и по трехмерным структурам. При этом было установлено, что пространственная организация активных центров оказалась наиболее консервативным элементом структуры альфа-бета гидролаз. В связи с этим для сравнительного биоинформатического анализа ферментов семейства альфа-бета гидролаз с липазной, пептидазной и оксинитрилазной активностью был разработан и использован алгоритм выделения структур изолированных активных центров. Пространственное выравнивание активных центров удаленных гомологов показало консервативность и гомологичное расположение в структуре аминокислот каталитической триады {Рис.3).
Анализ консервативных позиций определил четыре остатка с наибольшей статистической достоверностью, а именно (нумерация по липазе Б из
9
Candida Antarctica) — остатки каталитической триады 105Ser, 224His и 187Asp, а также остаток 39Gly, близкий к остатку оксианионного центра Thr40. Анализ специфических позиций подсемейства определил 6 наиболее значимых аминокислотных остатков - 79N, 104W, 38Р, 40Т, 134D, 225А {Табл. 1), еще 17 остатков были определены как СПП с меньшей степенью статистической достоверности. Варьирование аминокислотных остатков в этих позициях в основном обеспечивает разнообразие свойств между отдельными подсемействами. Изучение роли обнаруженных специфических позиций подсемейства проводили методами молекулярного моделирования.
2.1 Изучение роли специфических позиций подсемейства в проявлении липазной и амидазной активностей в альфа-бета гидролазах
Липазы (триацилгрицерол гидролазы, ЕС 3.1.1.3) катализируют реакцию гидролиза сложных эфиров жирных кислот. Липазы гидролизуют амиды с чрезвычайно низкой скоростью, в то время как родственные пептидазы способны эффективно гидролизовать как амиды, так и сложные эфиры. Как с фундаментальной, так и практической точки зрения важно понять, как эта разница каталитических свойств обеспечивается на уровне организации активных центров родственных ферментов, можно ли усилить минорную или индуцировать новую каталитическую активность в ферменте.
Биоинформатический анализ специфических позиций подсемейства {Табл.1) выявил четкие различия между альфа-бета гидролазами с липазной и амидазной активностями. Так, например, остаток А1а225 липазы В из Candida antarctica заменяется в карбоксипептидазах на Met и Glu, остаток GIul34 - на Leu, и т.д. Роль специфических позиций подсемейства в дискриминации липазной и амидазной активностей в ферментах суперсемейства альфа-бета гидролаз, была изучена методами молекулярного моделирования. Были проведены замены аминокислот в специфических позициях липазы Б из Candida Antarctica на аминокислотные остатки, характерные для пептидаз, и проведен скрининг свойств возможных мутантов (11971 комбинация) in silico. Исследование способности мутантов образовать реакционноспособные фермент-субстратные комплексы с амидными субстратами позволило обнаружить замены, усиливающие проявление амидазной активности: Leu278Ala, Trpl04Phe, AIa225[Met/Val], Aspl34Leu и Glnl57Leu {Рис.4). Остатки Тгр104 и А1а225 расположены в липазе Б из Candida antarctica в непосредственной близости от каталитической триады. Замена Leu278Ala необходима для правильной ориентации Ala225Met, а в результате замен Aspl34Leu и Glnl57Leu создается благоприятное окружение для связывания гидрофобных заместителей субстрата.
Ранг Позиция Ъ-оценка Р-оценха Липазы Карбоксипептидазы Дилвптидилпептидаэы ОНЛ
1 ТЭЯ* 6.652475 1.210460Е-09 ББЕББ БЗБЗБ нмнны ыызмм мн ЬАУУА УУЬАЧ ИУУУ V ТТТТТ ттттт УТТТА т ЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕ РРРРР ррр УУУ
2 104У«* 5.940676 7.021722Е-15 ННННН ННННН ННННН ИНИНН нинни ш ЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕ Е ЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕЕ Е ГЕГШ ННННН МИНИН ААААА ААА РЕЕ
3 38Р* 5.794331 3.844048Е-21 ННННН ННННН НЬЖНР РРРРР РРРРР РР МНИ ТТШТ ТЫТЫМ N МЫМ МШИ N АСССС АСАйС ААССА ССйАС ССССС СйС ННН
4 40Т* 5.118177 2. 695955Е-27 ттттт ттттт ТТТТТ ттттт ттттт тт ССвСС вССвС б ссссе ссссо с РРРРР РРРРР РРРРР РРРРР РРРРР РРР АН
5 134Р* 4 .599652 3.648069Е-26 ТТТБЭ БТТТР ТЭБАА ООЭОО ООООО ОБ ЬЬЬЬЬ 1,1.11,1. МУЬЫ, Ь ЬЬОЬЬ УЫЛЛ. Х-УЬЬЬ I, \OTVV \rjWJ УУУУУ ттттт ттт П,У
6 225А+ 4.497449 2.574429Б-29 АОУЦ, ЬЬАОО льуьв ААЕЕА Ш£3 1А МФМН МФМН »мм« м ЕЕЕЕЕ ЕЕЕЕХ {ЕШ Е й&ЖЭ СЭСва ОСБЭС ЗЗСбС ннннм МММ ккк
7 19Ю* 4.041383 1.080419Е-26 ттттт таттт ттттт 00000 ОЕЯОО 00 ШШЫ ^ШИ ЫШМ N РРРРР РРРРР РРРРР Р ННННН ННННН ННННН ННННН БРЗЗР РБЭ РЬЬ
в 137С* 3.530454 4.014081Е-25 вввса ссссв ссссс сссвс аасаа са РРРРР РРРРР РРРГТ т согаш ооош) ь ИГНГИ ММПМ НИ¥М НМГИГ БЕООК ЕБО ЬУУ
9 109Ь* 3.138349 2. 917 945Е-21 УТАММ МАЬТМ УММА1 ЬЬЬРЬ ьььы ы. ННННН ННННН ННН11 I ННННН ННННН ННННН н УГУРР УУУУУ УУУЕУ ГУРУР ГГРГР ГЕР иь
10 76Т* 2.999971 3.785976Е-21 11111 11111 1УАЬУ ТТУ1А АА1А1 АБ ТТЕЕТ ЕЕТТЕ ЕОЕОО 0 ТОООО 00000 00000 э ОСССО ССССО ССССй СйССС ССССС СйС УРГ
11 139У* 2.505505 6. 968691Е-15 ТЭТТТ ТТТБА ТБОТТ WIVL ЕЯ 00000 00000 000^ N 00000 00000 00000 0 УЬУЬА УГУЬУ УУГЬУ АПУЬ ГГЕЕГ ГЕР УЬЬ
12 131Г* 2.387914 1.788333Е-14 1ЛЛ1Л ЬУУЬМ ЬЫУЪ ГГШ П№ 1Р СССЗСС ссссй ссссс с всссв свссс свйсс й УТУТв УУУУУ WGVV сетут ННННН ННН ЬНН
13 41С* 2.359597 8.530478Е-17 УНБИТ стшв ССААС ССАСА йС РРРРР РРРРР РРРРР р РРРРР РРРРР РРРРР р СбССО СЫСйС ссосс ооссс 00000 ООО УСС
14 133Р* 2.212031 4 .177797Е-18 ААРРР РАРАА АРРРА РРРРР РРРРй РР 301306 ссссй ссесс с ССССй ААААР РАРРР Р РРРРР РРРРР РРРРР РРРРР ССССб ССй АБЭ
15 188Е* 2.161328 1.025878Е-19 ОТЕЕЕ ЕЕТТТ ООЕСТ ЕЕЕЕЕ ЕЕКЕР ЕЕ УПД-Р ЫЛП. МУЬММ м ААААА САСБА бЭБЗЭ Б РОйОЕ ООООБ ООЕОР ЕЕОРО ЕУГГУ УЕГ ККЕ
16 132А* 2.151781 7.563415Е-21 <ЗОААУ ТСАОС СБАСУ ААЗвв 85333 £А итога NNN№1 ынмны н ышога топш тпот н ААААА ААААА ААААА ААААА ООШО ООО юга
17 1060* 1.980272 1.814714Е-19 01-000 ОООЬО ооооо 00000 00000 00 УУУУУ УУУУУ УУУУУ у УУУУУ УУУУУ УУУУУ У УУУУУ УУУУУ УУУУУ УУУУУ ГУГГУ УРГ РСС
18 135У* 1.894755 1.111038Е-18 шмы ЛНУ^ ншны уурру уг^р Г* ТТТТТ ТТТТТ УТТБА Б ИМИ 1ТЬТУ ттььь ь БЭЗЭТ БТЭТБ ЗЗТТБ ТТЗББ РЕЕГР РРР ььь
19 2015* 1 .689616 3.442086Е-15 ББООО ооооо оэ йСОСС ССССС ССССй й ААСАА 5БААС САБЗС й ССОСЭ СССИО СбССС ССССб ссссс ссс РРР
20 1930* 1.450093 2.841031Е-11 ррууу УУНРЫ РУНЕ!* оо«мо оомоо оо УWWWW wwwwи РНЮРР г ЬЬУЬЬ УШЬ УУЬГГ ь СРР
21 138Т* 1.265302 9.918473Е-09 ттсгт ттттт ттттт ттттт ттттт тт ЬЬААЬ ААЬЬА УТЕЕЕ Е УУНУУ «ГЕНУ ЕООЬО 0 ОЕО
22 14 9У* 1.119167 4.920354Е-07 ХАТЯЯ АГУАР 1УКРН УУАЬА АЬАРР ЭЬ IVl.LV ЬЬУУЬ М1ЬЫ, ь ими ЬЬУМЬ УХМММ м ООО
23 72М* 0.910317 3.748176Е-05 ССвСС йСАСА СТСАГ ММББЬ РМБИЭ ЬМ ЭЭККА отшо мши, ь ккткк нокзк окккк к -------- —
Таблица 1. Аминокислотные остатки, определенные как СПП среди ферментов суперсемейства альфа-бета гидролаз с липазиой, пептидазной и оксинитрилазной (ОНЛ) активностями. Результаты представлены в порядке уменьшения статистической достоверности (2-оценка), показано разделение выборки на подсемейства. Р-оценка является мерой статистической достоверности результатов (см. стр.6). Красным выделены пороги статистической достоверности - наиболее значимыми являются первые шесть специфических позиций (79Ы, 104\У, 38Р, 40Т, 1340, 225А).
Рисунок 3. Пространственное выравнивание структур активных центров ферментов семейства альфа-бета гидролаз: сериновой карбоксипептидазы из Triticum aestivum, липазы Б из Candida antarctica, оксинитрилазы из Hevea brasiliensis, а также их гомологов. Одинаковые расположение и ориентация аминокислотных остатков каталитической триады в структуре показаны стрелками.
Мутанты липазы Б из Candida antarctica с заменами, отобранными в результате биоинформатического анализа и молекулярного моделирования, были получены компанией Novozymes (Дания) в рамках совместного проекта 7-й рамочной программы ЕС. Результаты предварительных исследований показывают, что предложенные замены в СПП L278A, W104F, А225К и А225М приводят к увеличению амидазной активности, в то время как замены этих позиций на другие остатки, а также замены не по СПП, подавляют и без того чрезвычайно низкую амидазную активность липазы. Эти экспериментальные данные подтверждают выводы проведенного нами биоинформатического анализа.
2.2 Изучение роли специфических позиций подсемейства в проявлении эстеразной и оксинитрилазной активностей в альфа-бета гидролазах
Гомологичные ферменты эстеразы и оксинитрилазы катализируют различные химические реакции: эстеразы осуществляют гидролиз сложноэфирных связей, оксинитрилазы участвуют в присоединении цианида к альдегидам (кетонам) и катализируют образование С-С связей.
Рисунок 4. Структура фермент-субстратного комплекса мутанта липазы Б с амидным субстратом 2-хлоро-М-бензилацетамидом. Показаны замены по специфическим позициям - 278А, 104Р, 225М и гидрофобная поверхность, закрывающая каталитический гистидин от раствора.
По механизму действия оксинитрилазы с альфа-бета укладкой (ЕС 4.1.2.11, 4.1.2.37) существенно отличаются от других альфа-бета гидролаз. Биоинформатический анализ специфических позиций подсемейств выявил четкие различия между альфа-бета гидролазами с эстеразной и оксинитрилазной активностями. Возможность введения замен по специфическим позициям, которые могут привести к проявлению эстеразной активности в оксинитрилазах и наоборот, была исследована при помощи молекулярного моделирования. In silico скрининг каталитических свойств 21633 мутантов оксинитрилазы из Hevea brasiliensis по специфическим позициям подсемейства по отношению к библиотеке из 7 сложноэфирных субстратов позволил выявить наиболее важные специфические позиции для контроля типа катализируемой реакции: Thrl 1, Lys236 и Hisl4 (нумерация по оксинитрилазе из Hevea brasiliensis), которые в эстеразах и липазах заменены на небольшие гидрофобные аминокислоты. Остаток Thrl 1 участвует в координации гидроксильной группы циангидрина, a Lys236 (гомолог А1а225 в липазе Б из C.antarctica) выполняет несколько функций в механизме действия оксинитрилаз: участвует в связывании и ориентации субстрата, стабилизации отрицательного заряда на уходящей CN- группе и
Рисунок 5. Связывание сложного эфира (4-нитрофенилацетата) в активном центре мутанта Thrl !Gly/Hisl4Gly/Lys236Leu оксинитрилазы из Hevea brasiliensis, способного проявлять гидролитическую активность. Показаны аминокислотные остатки каталитической триады (Ser80, His235, Asp207), а также остатки оксианионного центра, Не12 и Cys81, которые стабилизируют тетраэдрический интермедиат.
обеспечивает изменение рКа каталитического остатка гистидина His2354. Отобранный в результате компьютерного скрининга тройной мутант Thrl !Gly/Hisl4Gly/Lys236Leu оксинитрилазы из Hevea brasiliensis был предложен для экспериментальной проверки эстеразной активности (Рис. 5).
Рекомендованный тройной мутант оксинитрилазы был получен в Техническом университете г.Дельфт (Голландия) в рамках совместного проекта 7-й рамочной программы ЕС. Эксперименты, проведенные голландскими коллегами, показывают, что замены в специфических позициях T11G, H14G, K236L подавляют оксинитрилазную активность и приводят к появлению эстеразной активности в соответствии с результатами молекулярного моделирования.
4 Gruber К, Gartler G, Krammer В, Schwab Н, Kratky C//J Biol Chem, 2004, 279, 19, 20501-10
14
Рнсунок 6. Связывание манделонитрила в активном центре мутанта эстеразы из ЬИсоНапа IаЬасит а2Т и М239К (светлый). Структура комплекса наложена на кристаллографическую структуру фермент-субстратного комплекса оксинитрилазы из Я. ¿ган/геи-уй с манделонитрилом (1УВ6, темный). Нумерация по И]СоЧапа гаЬасит.
Для решения обратной задачи - превращения эстеразы в оксинитрилазу -был выбран фермент из Nicotiana tabacum. Аминокислоты Thrll и Lys236 оксинитрилазы из Hevea brasiliensis заменены в эстеразе из Nicotiana tabacum на, соответственно, глицин и метионин. Для индуцирования оксинитрилазной активности в этом ферменте мы использовали мутации, обратные отобранным для моделирования эстеразной активности в оксинитрилазах - G12T и М239К (нумерация по эстеразе из Nicotiana tabacum). Молекулярный докинг показал возможность связывания и правильную ориентацию субстратов оксинитрилазы в активном центре мутантов эстеразы из Nicotiana tabacum с образованием водородных связей с Thrl2 и каталитическим Ser81. Цианогруппа также ориентирована правильно в направлении положительно заряженного Lys239 {Рис. 6). Влияние предложенных замен G12T/M239K в эстеразе из Nicotiana tabacum на оксинитрилазную активность было экспериментально проверено независимой группой исследователей5. Было показано угнетающее действие мутаций на эстеразную активность и появление оксинитрилазной активности. Эти экспериментальные данные подтвердили результаты проведенного нами биоинформатического анализа.
5 Padhi S.K., Fuji i R., Legatt G.A., et.al. // Chemistry & Biology, 2010, August 27, 17, 863-871
15
3. Биоинформатический анализ ферментов семейства пенициллин-связывающих белков. Изучение роли специфических позиций подсемейства в формировании субстратной специфичности D-аминопептидазы.
Семейство пенициллин-связывающих белков включает также D-аминопептидазы, D-амидазы аминокислот, щелочные D-пептидазы и ß-лактамазы. Для биоинформатического анализа ферментов этого семейства был проведен поиск гомологов D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi по первичной и третичной структуре в банках данных белковых последовательностей UniProt и белковых структур PDB, получена выборка из 734 гомологов по первичной структуре и 24 гомологов по третичной структуре. Биоинформатический анализ показал, что область активного центра D-аминопептидазы обладает достоверным сходством с D-амидазами аминокислот, щелочными D-пептидазами и ß-лактамазами как на уровне аминокислотной последовательности, так и на уровне пространственной организации (Рис.7). Одиннадцать аминокислотных остатков были определены как наиболее вероятные специфические позиции в подсемействе D-аминопептидаз: 112D, 159R, 115А, 128F, 66Q, 222W, 114W, 2201, 288G, 156G, 229С (приведены в порядке уменьшения статистической значимости, Табл.2). Специфичность D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi к ацильной группе субстрата ограничена D-аминокислотами с небольшой боковой цепью, такими как аланин и валин, и их производными: D-AlaHN2, а также D-Ala-D-Ala и D-Ala-L-Ala дипептидами.
Таблица 2. Аминокислотные остатки, определенные как наиболее вероятные специфические позиции в семействе пенициллин-связывающих белков: 112D, 159R, 115А, 128F, 66Q, 222W, 114W, 2201, 288G, 156G, 229С.
# Позиция Z-оценка р-оценка Подсемейства
1 112D* 32 45 1 08Е-18 DDDDD DD LLLLL L ААААА A SSSSS s RRRR KKK
2 159R* 31 63 3 77Е-22 RRRRR RR GGGGG G MMMMM M DDDDD D SSAA LLL
3 115А* 27 87 1 76Е-32 ААААА АА PPPPP P QQQQQ Q TTTTT T PPPP SSS
4 128F* 30 54 5 69Е-33 FFFFF FF - QQQQQ Q NNNNN N CCCC ---
5 66Q* 27 12 1 82Е-34 QQQQQ QQ TTTTT T MMMMM M AAAAA A VTTV FFF
6 222W* 25 85 6 57Е-44 WWWWW WW LLLLL L GGGGG G WWWWW W HHHH QQQ
7 114W* 25 73 2 64Е-55 WWWWW WW FVIVL V PPPPP P IIIII I TTW KKK
8 2201* 25 78 4 10Е-57 IIIII II GGGGG G MMMMM M NNNNN N SÄLV LLL
9 288G* 23 28 1 91Е-55 GGGGG GG . TTTTT T YYYYY Y SSSSS S NNAA NNN
10 156G* 24 62 3 19Е-53 GGCGC QG PSSAA s vvvw V MMMMM M LLLL GGG
11 229С* 23 41 4 37Е-61 CCSCS GC KKKKK к FFFFF F MMMMM M FFYY YYY
Нумерация позиций представлена по кристаллографической структуре 1EI5. Результаты представлены в порядке уменьшения статистической достоверности (Z-оценка). В графе «Подсемейства» показан аминокислотный состав соответствующих колонок множественного выравнивания, разделенный на потенциальные подсемейства (через «.») с различной субстратной специфичностью.
Рисунок 7. Фрагмент трехмерного выравнивания представителей семейства пенициллин-связывающих белков - структурных гомологов D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi. Показаны остатки активного центра, участвующие в каталитическом механизме (Ser62, Lys65, Туг 153, His287) и являющиеся консервативными в D-аминопептидазе и других представителях семейства - D-амидазах аминокислот, щелочных D-пептидазах и ß-лактамазах.
Структурный анализ показал, что три позиции отвечают за связывание ацильной группы субстрата и геометрически расположены в соответствующей полости активного центра D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi'. 222W, 114W, 2201. Их роль в определении субстратной специфичности была изучена методами молекулярного докинга и молекулярного моделирования.
Результаты биоинформатического анализа свидетельствуют о том, что аминокислотный остаток 114Тгр подсемейства DAP может заменяться в других подсемействах на Phe, Val, Pro, Ile, Thr, Lys и Glu; остаток 22011e - на Gly, Met, Asn, Leu и Val; a остаток 222Trp - на Leu, Gly, His, Gin и Туг.
In silico скрининг каталитических свойств 1981 мутанта D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi по специфическим позициям подсемейства по отношению к библиотеке производных L- и D-аминокислот позволил
HÍS287
Туг153
Рисунок 8. Молекулярная модель тройного мутанта W222H.W114L.I220V DAP из Ochrobactrum anthropi в комплексе с D-фенилаланинамидом D-PheNH2 (нумерация согласно структуре 1EI5 из банка данных PDB). Карбонильный углерод амидной связи расположен на оптимальном расстоянии 2.8А от атакующего гамма кислорода каталитического Ser62, промежуточный тетраэдрический интермедиат стабилизируется в оксианионном центре водородными взаимодействиями с атомами азота основной цепи Ser62 и А1а290 (2.2А and 2.0А, соответственно).
выявить замены, позволяющие расширить субстратную специфичность фермента. Была показана способность мутанта
Trp222His/Trpl 14Leu/Ile220Val взаимодействовать с D-PheNH2, D-IleNH2, D-CysNH2, D-ValNH2 и D-AlaNH2 (Рис. 8).
Экспериментальное конструирование, выделение и очистка предсказанного тройного мутанта D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi была проведена японскими партнерами в рамках совместного проекта. Результаты экспериментального исследования каталитических свойств, проведенные в нашей лаборатории И.Г.Халиуллиным, подтвердили расширенную субстратную специфичность тройного мутанта
Trp222His/Trp 114Leu/Ile220Val и доказали правильность выводов проведенного биоинформатического анализа.
Основные результаты и выводы
1. Разработан алгоритм поиска специфических позиций в структуре белка (специфических позиций подсемейства) на основе анализа геномной и структурной информации; алгоритм, способный функционировать на всех основных операционных системах, реализован в виде программного кода для ЭВМ и использован в программе для работы в параллельном режиме на суперкомпьютере;
2. Разработан метод биоинформатического анализа больших семейств ферментов на уровне аминокислотных последовательностей, полноразмерных структур и уровне структурной организации активных центров;
3. Проведен биоинформатический анализ удаленных гомологов суперсемейства альфа-бета гидролаз с липазной, амидазной и оксинитрилазной активностями. Определен список статистически достоверных специфических позиций подсемейств;
4. Определены специфические позиции суперсемейства альфа-бета гидролаз, ответственные за дискриминацию липазной и амидазной активностей (Trp104, А1а225, Asp 134, Gin 157 и Leu278 в липазе Б из Candida antarcticá)',
5. Определены специфические позиции суперсемейства альфа-бета гидролаз, ответственные за дискриминацию эстеразной и оксинитрилазной активностей (Thrll, His 14 и Lys236 в оксинитрилазе из Hevea brasiliensis)\
6. Проведен биоинформатический анализ ферментов семейства пенициллин-связывающих белков. Определены специфические позиции 222W, 114W и 2201, ответственные за формирование специфичности D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi к ацильной части субстрата.
Публикации по теме работы
1. Д.А.Суплатов, В.К.Аржаник, В.К.Швядас; Сравнительный биоинформатический анализ изолированных структур активных центров эволюционно удаленных гомологов суперсемейства ферментов альфа-бета гидролаз; Acta Naturae, 2011,3(1), 99-105.
2. И.Г.Халиуллин, Д.А.Суплатов, Д.Н.Шалаева, М.Оцука, Я.Асано, В.К. Швядас; Биоинформатический анализ и молекулярное моделирование участия Lys65 в каталитической триаде D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi; Acta Naturae 2010, 2 (2), 70-74.
3. Д.А.Суплатов; рН-Зависимость активности и стабильности бактериальных пенициллинацилаз; Доклады на юбилейном заседании, посвященном 200-летию Московского общества испытателей природы; М. МОИП, 2005, стр. 48-62.
4. I. Khaliullin, D. Suplatov, V. Svedas, Y. Asano, M. Otsuka, D. Shalaeva; "The Role of Lys65 Residue in the Catalytic Triad of D-aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi Revealed by Bioinformatic Analysis and Molecular Modeling"; Proc. 5th Internat. Congress on Biocatalysis Biocat2010, Hamburg, Germany, August 29 - September 2, 2010, p.196.
5. D.A. Suplatov, I.V. Pouliakhina, V.K. Arzhanik, D.T. Guranda, V.K. Svedas; "Bioinformatic analysis reveals crucial penicillin acylase inactivation step and outlines strategy for pH-stabilisation"; Proceedings of the International Conference "Biocatalysis-2009: Fundamentals &Applications", Arkhangelsk, June 19-24, 2009, 70-71.
6. D. Suplatov, I. Pouliakhina, V. Arzhanik, V. Svedas; "Modeling of structure and substrate recognition of penicillin acylase from Streptomyces mobaraensis using molecular docking to evaluate proper active site geometry"; Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, Moscow, July 20-23, 2009, 343-344.
7. D.A. Suplatov, D.T. Guranda, V.K. Svedas; Bioinformatic analysis of penicillin acylase family reveals key residues essential for enzyme stability, ESF-EMBO symposium "Protein Design and Evolution for Biocatalysis"; Book of Abstracts, San Feliu de Guixols, Spain, 2008, 122.
8. D.A. Suplatov, D.T. Guranda, V.K. Svedas; Sequence, structural and kinetic analyses of penicillin acylase family; Abstracts of Oral Presentations, 2nd International Conference "Biocatalysis in Non-Conventional Media" June 11-16,2008, Moscow, Russia, p.33-34.
9. Shalaeva D.N., Suplatov D.A., Khaliullin I.G., Svedas V.K.; Bioinformatics insight into structural determinants of D-aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi substrate specificity to amino acid derivatives; Международная конференция «Ломоносов-2010», 2010, Москва.
Ю.Д.Ф.Гуранда, А.В. Немухин, Б.Л. Григоренко, В.И. Тишков, Д.А. Суплатов, Н.В. Панин, М.Г. Хренова, И.В. Поляков, П.А. Кудрявцев, И.В. Шаповалова, И.Г. Халиуллин, В.К. Швядас, Д.А. Долгих, М.Э. Гаспарян, Р.В. Черткова, Е.Н. Люкманова, Г.А. Копеина,
П.А. Елистратов, М.П. Кирпичников, О.В. Строганов, Ф.Н. Новиков, B.C. Стройлов, Г.Г. Чилов, Г.А. Ушаков, О.В. Ямскова, A.C. Ясная, М.И. Юшко, Е.В. Тарасова, A.A. Семенова, И.Р. Куклина; Рациональный дизайн промышленных ферментов, основанный на методах молекулярного моделирования. Материалы итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы», Москва, 25-27 ноября 2009 г, 251-252.
Список сокращений
спп Специфическая позиция подсемейства
PDB Protein data bank - банк структур белков
Z-оценка Безразмерная случайная величина, имеющая стандартное нормальное распределение. Используется в математической статистике для расчета достоверности некой полученной оценки (например, оценки специфичности колонки выравнивания). Для этого искомая оценка вычисляется для реальных данных, а впоследствии центрируется и нормируется относительно случайно полученных данных. Таким образом вычисляется степень отличия реальных данных от случайных. Формула расчета Z-оценки приведена на стр. 5
Р-оценка Вероятность случайной встречи полученных результатов, иными словами, их статистическая достоверность. Значение, близкие к 0, говорят о высокой значимости результатов. Для результатов, отсортированных в порядке уменьшения Z-оценки, Р-оценка позиции ранга i означает вероятность одновременной встречи позиций с первой по i в случайно распределенном выравнивании. Разъяснения к расчету и интерпретации Р-оценки приведены на стр.6
D-PheNH2 D-фенилаланинамид
D-IleNH2 D- изолейцинамид
D-CysNH2 D-цистеинамид
D-ValNH2 D-валинамид
D-AlaNH2 D-аланинамид
Заказ № 13-А/04/2011 Подписано в печать 24.03.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,1
ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таП:info@cfr.ru
Содержание диссертации, кандидата химических наук, Суплатов, Дмитрий Андреевич
1. Список сокращений.
2. Введение.
3. Литературный обзор.
3.1 Множественное выравнивание - источник информации о структуре и функции гомологичных ферментов: основы построения и анализа.
3.1.1 Динамическое программирование.
3.1.2 Алгоритм глобального выравнивания Нидлмана-Вунша.
3.1.3 Алгоритм локального выравнивания Смита-Ватермана.
3.1.4 Матрицы аминокислотных замен.
3.1.5 ClustalW и T-coffee — современные алгоритмы создания качественного множественного выравнивания аминокислотных последовательностей белков за разумное время.
3.1.6. Mustang - алгоритм выравнивания трехмерных структур белков.
3.2 Консервативные позиции - поиск общих закономерностей в семействе ферментов методами биоинформатики.
3.2.2 Определение функционально-важных аминокислотных остатков по аминокислотным последовательностям ферментов одного семейства.
3.2.3 Использование структурной информации для определения аминокислотных остатков, участвующих в связывании субстрата и каталитическом механизме.
3.3 Вариабельные аминокислоты, ответственные за функциональное разнообразие в семействе ферментов.
3.3.1 Алгоритмы поиска вариабельных функционально значимых аминокислотных остатков методами биоинформатики.
3.3.2 Использование вариабельных аминокислотных остатков для изучения структурно-функциональных взаимосвязей в ферментах.
3.3.3 Биоинформатический анализ вариабельных позиций для изучения молекулярных механизмов структурно-функциональных взаимосвязей в ферментах.
3.4 Общие сведения о суперсемействе ферментов альфа-бета гидролаз.
3.4.1 Основные структурные и функциональные характеристики суперсемейства ферментов альфа-бета гидролаз.
3.4.2 Многообразие каталитической функции суперсемейства альфа-бета гидролаз
3.4.3 Липазы. Структура и функция липазы Б из Candida Antarctica. Функциональное многообразие липазы Б из Candida Antarctica.
3.4.4 Гидролазы пептидов - семейство карбоксипептидаз.
3.4.5 Семейство оксинитрилаз.
3.5 Общие сведения о семействе D-аминопептидаз.
3.5.1 Субстратная специфичность и катализируемые реакции.
3.5.2 Структура фермента и организация его активного центра.
3.5.3 Исследования методами сайт-направленного мутагенеза.
4. Выводы анализа литературы и постановка задачи.
5. Методы и материалы.
5.1 Методика реконструкции эволюционных родственников фермента по первичным и третичным структурам.
5.2 Подготовка множественного выравнивания.
5.3 Визуализация.
5.4 Молекулярное моделирование пространственных структур ферментов.
5.5 Предсказание функционально важных аминокислотных остатков в структуре ферментов.
5.6 Методика компьютерного скрининга каталитических свойств ферментов.
6. Результаты и обсуждение.
6.1 Поиск СПП - специфических позиций подсемейства - аминокислотных остатков, определяющих функциональное разнообразие внутри семейств ферментов, на основе биоинформатического анализа.
6.1.1 Концепция и структура алгоритма поиска.
6.1.2 Алгоритм определения подсемейств ферментов с потенциально разными свойствами.
6.1.3 Оценка функциональной значимости аминокислотных остатков в структуре фермента.
6.1.4 Расчет статистической достоверности полученных результатов.
6.1.5 Использование алгоритма для определения подсемейств ферментов с разными свойствами.
6.1.6 Метод биоинформатического анализа больших семейств ферментов.
6.2 Биоинформатический анализ ферментов семейства пенициллин-связывающих белков. Изучение роли специфических позиций подсемейства в формировании субстратной специфичности Б-аминопептидазы.
6.2.1 Биоинформатический анализ суперсемейства пенициллин-связывающих белков
6.2.2 Моделирование субстратной специфичности В-аминопептидазы из ОскготоЪаагит аЫгорг к Б-фенилаланинамиду путем изменения СПП.
6.3 Биоинформатический анализ ферментов суперсемейства альфа-бета гидролаз на уровне сравнения структурной организации активных центров.
6.3.1 Биоинформатический анализ ферментов альфа-бета гидролаз с липазной, пептидазной и оксинитрилазной активностями.
6.3.2 Изучение роли специфических позиций подсемейства в проявлении липазной и амидазной активностей в альфа-бета гидролазах.
6.3.3 Изучение роли специфических позиций подсемейства в проявлении эстеразной и оксинитрилазной активностей в альфа-бета гидролазах.
6.3.4 Роль специфических позиций подсемейства в проявлении различных активностей в альфа-бета гидролазах.
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Суплатов, Дмитрий Андреевич
8. Основные результаты и выводы
1. Разработан алгоритм поиска специфических позиций в структуре белка (специфических позиций подсемейства) на основе анализа геномной и структурной информации; алгоритм, способный функционировать на всех основных операционных системах, реализован в виде программного кода для ЭВМ и использован в программе для работы в параллельном режиме на суперкомпьютере;
2. Разработан метод биоинформатического анализа больших семейств ферментов на уровне аминокислотных последовательностей, полноразмерных структур и уровне структурной организации активных центров;
3. Проведен биоинформатический анализ удаленных гомологов суперсемейства альфа-бета гидролаз с липазной, амидазной и оксинитрилазной активностями. Определен список статистически достоверных консервативных и специфических позиций;
4. Определены специфические позиции суперсемейства альфа-бета гидролаз, ответственные за дискриминацию липазной и амидазной активностей (Тгр104, Ala225, Aspl34, Glnl57 и Leu278 в липазе Б из Candida antarctica);
5. Определены специфические позиции суперсемейства альфа-бета гидролаз, ответственные за дискриминацию эстеразной и оксинитрилазной активностей (Thrl 1, Hisl4 и Lys236 в оксинитрилазе из Hevea brasiliensis);
6. Проведен биоинформатический анализ ферментов семейства пенициллин-связывающих белков. Определены специфические позиции Trp222, Trpl 14 и 11е220, ответственные за формирование специфичности D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi к ацильной части субстрата;
7. Предложена функциональная классификация специфических позиций подсемейства в суперсемействах альфа-бета гидролаз и пенициллинсвязывающих белках.
8. Благодарности
Автор выражает благодарность сотрудникам компании Novozymes A/S Allan Svendsen и Werner Besenmatter за предоставление результатов экспериментального исследования амидазной активности в предсказанных нами мутантных вариациях липазы Б из Candida antarctica, сотрудникам Технического университета г. Дельфта Jianfeng Jin, Linda Otten и Ulf Hanefeld за предоставление результатов экспериментального исследования эстеразной активности в предсказанных нами мутантных вариациях оксинитрилазы из Manihot esculenta, а также проф. А.А.Миронову и М.С.Гельфанду за плодотворные беседы и обсуждения.
7. Заключение
В процессе эволюции белки развиваются от общего предка путем изменения первичной' структуры — аминокислотных замен, вставок и делеций — и, таким образом, дают начало функциональному многообразию семейств гомологичных ферментов. Позиции в структуре белков обладают разной вариабельностью в ходе естественного отбора — некоторые аминокислоты важны для функции, стабильности или структуры и поэтому связаны особыми ограничениями на изменчивость. Установление связи между структурной организацией белков и их функциональными свойствами представляет одну из фундаментальных проблем современной биохимии.
При выполнении диссертации был разработан метод сравнительного биоинформатического анализа эволюционно удаленных гомологов на уровне наиболее важных с функциональной точки зрения элементов структуры - активных центров, т.е. аминокислотных остатков, формирующих участки связывания субстрата и участвующих в механизме каталитического превращения. Это позволяет изучать ферменты, произошедшие от одного предка в результате эволюции, но претерпевшие значительные функциональные изменения в ходе естественного отбора и, таким образом, позволяет охватить большое разнообразие свойств. Были изучены специфические позиции в структурах белков одного семейства, изменчивость которых в процессе эволюции привела к разнообразию их функциональных характеристик. Был разработан и реализован в виде программного кода для ЭВМ алгоритм поиска специфических позиций на основе анализа геномной и структурной информации. Разработан метод биоинформатического анализа больших семейств ферментов. Предложенный подход был применен для анализа удаленных гомологов суперсемейства альфа-бета гидролаз с липазной, амидазной и оксинитрилазной активностями, а также суперсемейства пенициллин-связывающих белков. Были определены специфические позиции суперсемейства альфа-бета гидролаз, ответственные за дискриминацию липазной и амидазной активностей (Тгр104, А1а225, Aspl34, Glnl57 и Leu278 в липазе Б из Candida antarcticá), а также эстеразной и оксинитрилазной активностей (Thrll, His 14 и Lys236 в оксинитрилазе из Hevea brasiliensis). Определены позиции, ответственные за формирование специфичности D-аминопептидазы из Ochrobactrum anthropi к ацильной части субстрата (222W, 114W и 2201).
Результаты анализа позволяют классифицировать аминокислотные остатки в специфических позициях подсемейства по следующим функциональным типам:
1. Непосредственное участие в каталитическом механизме или влияние на кислотно-основные свойства аминокислот, принимающих непосредственное участие в каталитическом механизме. (А1а225 в CALB и гомологи в других ферментах, в том числе Lys236 в оксинитрилазах);
2. Стабилизация переходного состояния или интермедиата (Thr40 и GlnlOó в CALB и гомологи в других ферментах)
3. Участие в связывании субстрата (Gly39 и Тгр104 в CALB и гомологи в других ферментах, а также Тгр222, Тгр114 и 11е220, в D-аминопептидазе из Ochrobactrum anthropi)
4. Структурная роль - образование сети стабилизирующих взаимодействий
Thr40, GlnlOó, Asn79 и Met72 в CALB и гомологи в других ферментах)
Можно также предположить участие СПП в процессах, не относящихся напрямую к катализу - поддержание активной конформации структуры белка за счет образования стабилизирующих взаимодействий, участие во взаимодействии белка с внешними объектами, например мембраной, и т.д.
Программа поиска специфических позиций подсемейств и метод биоинформатического анализа могут быть использованы при изучении эволюции ферментов, особенностей структурной организации их активных центров и механизма действия. Сравнение удаленных гомологов позволяет изучать ферменты различных классов и охватить широкое разнообразие свойств. Информация о специфических позициях подсемейства может быть использована для получения ферментов с заданными свойствами и открывает принципиально новые возможности дизайна биокатализаторов. J
Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Суплатов, Дмитрий Андреевич, Москва
1. Radzicka A, Wolfenden R // A proficient enzyme // Science, 1995, 267, 90-93
2. Варфоломеев С.Д. // Химическая энзимология // М.: Издательский центр «Академия»,2005, 472 стр.
3. Todd АЕ, Orengo СА, Thornton JM // Evolution of function in protein superfamilies, from a structural perspective // Journal of Molecular Biology, 2001, 307, 1113-1143
4. Nobeli I, Spriggs RV, George RA, Thornton JM // A ligand-centric analysis of the diversity and evolution of protein-ligand relationship in E.coli // Journal of Molecular Biology, 2005, 347,415-436
5. Devos D, Valencia A // A practical limits of function prediction // Proteins, 2000,41, 98-107
6. Gerlt JA, Babbit PC // Divergent evolution of enzymatic function: mechanistically diverse superfamilies and functionally distinct superfamilies //Annu. Rev. Biochem., 2001, 70,209246
7. Sylvestre J, Chautard H, Cedrone F, Delcourt M // Directed evolution of biocatalysts // Org
8. Process Res Dev, 2006, 10, 562-571
9. Dalby PA // Optimising enzyme function by directed evolution // Curr Opin Struct Biol, 2003,13,500-505
10. Turner NJ // Directed evolution of enzymes for applied biocatalysis // Trends Biotech, 2003,21,474-478
11. Glieder A, Farinas ET, Arnold FH // Laboratory evolution of a soluble, self-sufficient, highly active alkane hydroxylase //Nat Biotechnol, 2002, 20, 1135-1139
12. Yoshikuni Y, Ferrin ТЕ, Keasling JD // Designed divergent evolution of enzyme function // Nature, 2006,440,1078-1082
13. Reetz MT, Zonta A, Schimossek K, Liebeton K, Jaeger KE // Creation of enantioselective biocatalysts for organic chemistry by in vitro evolution //Angew Chem Int Edit, 1997,36, 2830-2832
14. May O, Nguyen PT, Arnold FH // Inverting enantioselectivity by directed evolution of hydantoinase for improved production of Lmethionine //Nat Biotechnol, 2000, 18, 317-320
15. Carr R, Alexeeva M, Enright A, Eve TSC, Dawson MJ, Turner NJ // Directed evolution of an amine oxidase possessing both broad substrate specificity and high enantioselectivity // Angew Chemlnt Edit, 2003,42, 4807-4810
16. Merz A, Yee MC, Szadkowski H // Improving thecatalytic activity of a thermophilic enzyme at low temperatures // Biochemistry, 2000, 39, 880-889
17. Miyazaki K, Wintrode PL, Grayling RA, Rubingh DN, Arnold FH// Directed evolution study of temperature adaptation in a psychrophilic enzyme // J Mol Biol, 2000, 297, 1015-1026
18. Cherry JR // Directed evolution of microbial oxidative enzymes // Current Opin Biotech, 2000, 11,250-254
19. Moore JC, Arnold FH // Directed evolution of a para-nitrobenzyl esterase for aqueous-organic solvents // Nat Biotechnol, 1996, 14, 458-467
20. Hao JJ, Berry A// A thermostable variant of fructose bisphosphate aldolase constructed by directed evolution also shows increased stability in organic solvents // Protein Eng Des Sel, 2004, 17, 689-697
21. Chen K, Arnold FH // Tuning the activity of an enzyme for unusual environments: sequential random mutagenesis of subtilisin E for catalysis in dimethylformamide // Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90, 5618-5622
22. Stemmer WPC // Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling // Nature, 1994, 370, 389-391
23. Zhao H, Giver L, Shao Z, Affholter JA, Arnold FH // Molecular evolution by staggered extension process (StEP) in vitro recombination // Nat Biotechnol, 1998, 16,258-261
24. Coco WM, Levinson WE, Crist MJ // DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes // Nat Biotechnol, 2001, 19, 354-359
25. Кормен T, Лейзерсон Ч, Ривест P, Штайн К. // АЛГОРИТМЫ: построение и анализ // Москва-Санкт-Петербург-Киев, 2007, второе издание
26. Needleman SB, Wunsch CD''// A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins // Journal of molecular Biology, 1970,48,443-53
27. Smith T, Waterman M // Identification of Common Molecular Subsequences // Journal of molecular biology, 1980,147,195-197
28. Dayhoff MO, Schwartz RM, Orcutt BC // A model of evolutionary change in proteins // Atlasof protein sequence and structure, 1978, 5 345-352
29. Schwartz RM, DayhoffMO // Matrices for detecting distant relationship // Atlas of protein sequence and structure, 1978, 5 353-358
30. Henikoff S, Henikoff JG // Aminoacid substitution matrices from protein blocks // PNAS, 1992, 89,10915- 10919
31. Henikoff S, Henikoff JG, Pietrokovski S // Blocks+: a non-redundant database of protein alignment blocks from multiple compilations // Bioinformatics, 1999,15, 471-479
32. Henikoff JG , Greene EA, Pietrokovski S, Henikoff S // Increased coverage of protein families with the blocks database servers // Nucleic Acids Research, 2000,28,228-230
33. Henikoff S, Henikoff JG, Alford WJ, Pietrokovsky S // Automated construction and graphical presentation of protein blocks from unaligned sequences // Gene, 1995, 163, 17-26
34. Henikoff S, Henikoff JG // Performance evaluation of amino acid substitution matrices // Proteins, 1993,17,49-61
35. Henikoff S, Henikoff JG // Embedding strategies for effective use of information from multiple sequence alignments // Protein Science, 1997, 6, 698-705
36. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ // ClustalW: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting? Position-specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Research, 1994, 22, 4673-4680
37. Notredame C, Higgins DG, Heringa J // T-Coffee: A novel method for fast and accurate multiple sequence alignment // J Mol Biol, 2000,302,1,205-217
38. Dutta S, Zardecki C, Goodsell DS, Berman HM // Promoting a structural view of biology for varied audiences: an overview of RCSB PDB resources and experiences // Journal of Applied Crystallography, 2010,43, 5,1224-1229
39. Koehl P// Protein structure similarities // Curr Opin Struct Biol, 2001, 11, 348 -353
40. Caprara A, Carr R, Istrail S, Lancia G, Walenz B //1001 optimal pdb structure alignments: integer programming methods for finding the maximum contact map overlap // J Comput Biol, 2004, 11,27-52
41. Konagurthu AS,Whisstock JC, Stuckey PJ, Lesk AM // MUSTANG: A Multiple Structural
42. Alignment Algorithm // PROTEINS, 2006,64,559 -574
43. Pazos F, Bang J-W // Computational prediction of functionally important regions in proteins // Current bioinformatics, 2006, 1, 15-23
44. Venter JC, Remington K, Heidelberg JF // Environmental genome shotgun sequence of the Sargasso Sea// Science, 2004, 304, 66-74
45. Sali A // 100 000 protein structures for the biologist // Nature structural biology, 1998, 5, 1029-1032
46. Devos D, Merino E, Pazos F, Valencia A// Multiple sequence alignments information in structure and function prediction // Artificial Intelligence and Heuristic Methods for Bioinformatics, 2002, 83-94
47. Zuckerlandl E, Pauling L // Evolutionary divergence and convergence in proteins // В книге "Evolving genes and proteins", Academic press, NY: 1965, 97-166
48. Villar HO, Kauvar LM // Amino-acid preferences at protein binding sites // FEBS Letters, 1994, 349,125-130
49. Valdar WSJ // Scoring residue conservation // Proteins, 2002, 48, 227-241
50. Shannon CE // A mathematical theory of communication. The Bell System Technical J // 1948, 27, 379^423, 623-656
51. Sander C, Schneider R // Database of homology-derived protein structures and the structural meaning of sequence alignment // Proteins 1991, 9, 56-68
52. Shenkin PS, Erman B, Mastrandrea LD // Information-theoretical entropy as a measure of sequence variability // Proteins, 1991, 11,297-313
53. Taylor WR // The classification of amino acid conservation // J Theor Biol, 1986,119, 205218
54. Zvelibil MJ, Barton GJ, Taylor WR, Sternberg MJ // Prediction of protein secondary structure and active sites using the alignment of homologous sequences // J Mol Biol, 1987, 195, 957961
55. Armon A, Graur D, Ben-Tal N // ConSurf: an algorithmic tool for the identification of functional regions in proteins by surface mapping of phylogenetic information // J Mol Biol, 2001, 307, 447—463
56. Miyata T, Miyazawa S, Yashunaga T // Two types of amino acid substitutions in protein evolution// J Mol Evol, 1979, 12,219-236
57. Altschul SF, Lipman-DM Equal animals //Nature, 1990, 348, 493^194
58. May AC // Optimal classification of protein sequences and selection of representative sets from multiple alignments: application to homologous families and lessons for structural genomics // Protein Eng, 2001, 14, 209-217
59. Pupko T, Bell RE, Mayrose I, Glaser F, Ben-Tal N // Rate4Site: an algorithmic tool for the identification of functional regions in proteins by surface mapping of evolutionary determinants within their homologues // Bioinformatics, 2002, 18, S71-S77
60. Ota M, Kinoshita K, Nishikawa K // Prediction of catalytic residues in enzymes based on known tertiary structure, stability profile, and sequence conservation // J Mol Biol, 2003, 327, 1053-1064
61. Innis CA, Anand AP, Sowdhamini R // Prediction of functional sites in proteins using conserved functional group analysis // J Mol Biol, 2004, 337, 1053-1068
62. Fariselli P, Pazos F, Valencia A, Casadio R // Prediction of protein-protein interaction sites in heterocomplexes with neural networks // Eur J Biochem, 2002,269, 1356-1361
63. Zhou HX, Shan Y // Prediction of protein interaction sites from sequence profile and residue neighbor list // Proteins, 2001,44, 336-343
64. Koike A, Takagi T // Prediction of protein-protein interaction sites using support vector machines // Protein Eng Des Sel, 2004, 17, 165-173
65. Di Gennaro JA, Siew N, Hoffman BT // Enhanced functional annotation of protein sequences via the use of structural descriptors // J Struct Biol, 2001,134, 232-245
66. Wallace AC, Borkakoti N, Thornton JM // TESS: A geometric hashing algorithm for deriving 3D coordinate templates for searching structural databases. Application to enzyme active sites // Protein Sci, 1997, 6, 2308-2323
67. Stark A, Russell RB //Annotation in three dimensions. PINTS: Patterns in Non-homologous Tertiary Structures //Nucl Acids Res, 2003, 31, 3341-3344
68. Orengo CA, Thornton JM // Protein families and their evolution — a structural perspective // Annu. Rev. Biochem., 2005, 74, 867-900
69. Cheng ZQ, McFadden BA// A study of conserved in-loop and out-of-loop glycine residues in the large subunit of ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase by directed mutagenesis // Protein Eng., 1998, 6, 457-465
70. Wajant H, Pfizenmaier K // Identification of Potential Active-site Residues in the Hydroxynitrile Lyase from Manihot esculenta by Site-directed Mutagenesis // The Journal of Biological Chemistry, 1996, 271, 42, 25830-25834
71. Lichtarge O, Bourne HR, Cohen FE // An Evolutionary Trace method defines binding surfaces common to protein families // Journal of Molecular Biology, 1996, 257, 342-358
72. Pazos F, Rausell A, Valencia A // Phylogeny-independent detection of functional residues // Bioinformatics, 2006,22,12,1440-1448
73. Shaw E, Dordick JS // Predicting amino acid residues responsible for enzyme specificity solely from protein sequences // Biotechnology and Bioengineering, 2002, 79, 3, 295-300
74. Capra JA, Singh M // Characterization and prediction of residues determining protein functional specificity // Bioinformatics, 2008,24, 13,1473-1480
75. Mayer KM, McCorkle SR, Shanklin J // Linking enzyme sequence to function using conserved property difference locator to identify and annotate positions likely to control specific functionality // BMC Bioinformatics, 2005, 6, 284-293
76. Hannenhalli SS, Russel RB //Analysis and prediction of functional sub-types from protein sequence alignments // J.Mol.Biol., 2000,303,61-76
77. Chakrabarti S, Bryant SH, Panchenko AR // Functional specificity lies within the properties and evolutionary changes of amino acids // J.MoLBiol., 2007, 373, 801-810
78. Mimy L, Gelfand M // Using orthologous and paralogous proteins to identify specificity-determining residues in bacterial transcription factors // J.Mol.Biol., 2002, 321,7-20
79. Kalinina OV, Mironov AA, Gelfand MS, Rakhmaninova AB //Automated selection of positions determining functional specificity of proteins by comparative analysis of orthologous groups in protein families // Protein Science, 2004, 13,443-456
80. Donald JE, Shakhnovich EI // Predicting specificity-determining residues in two large eukaryotic transcription factor families // Nucleic Acids Research, 2005, 33, 14,4455-4465
81. Lichtarge O, Yamamoto KR, Cohen FE // Identification of functional surfaces of the zinc binding domains of intracellular receptors // J.Mol.Biol., 1997,274, 325-337
82. Kalinina OV, Gelfand MS, Russel RB // Combining specificity determining and conserved residues improves functional site prediction // BMC Bioinformatics, 2009, 10, 174-198
83. Good P // Permutation tests: A practical guide to resampling methods for testing hypotheses // Springer series in statistics, Springer, 2000, New York
84. Vinogradov, DV, Mironov, AA // Siteprob: Yet another algorithm to find regulatory signals in nucleotide sequences // Proceedings 3rd Int. Conf. On Bioinformatics of Genome Regulation and Structure BGRS'2002, 2002, Novosibirsk, Russia, July 1, 28-30
85. Pavelka A, Chovancova E, Damborsky J // HotSpot Wizard: a web server for identification of hot spots in protein engineering // Nucleic acids research, 2009, 37, W376-W383
86. Kretz,KA, Richardson,TH, Gray,KA, Robertson,DE, Tan,X, Short,JM // Gene site saturation mutagenesis: A comprehensive mutagenesis approach // Methods. Enzymol., 2004, 388, 3-11
87. Bosma,T, Damborsky,J, Stucki,G, Janssen,DB // Biodégradation of 1,2,3-trichloropropane through directed evolution and heterologous expression of a haloalkane dehalogenase gene // Appl. Environ. Microbiol., 2002, 68,3582-3587
88. Broun, P, Shanklin, J, Whittle, E, and Somerville, C // Catalytic plasticity of fatty acid modification enzymes underlying chemical diversity of plant lipids // Science, 1998, 282, 1315-1317
89. Cook PD, Kubiak RL, Toomey DP, Holden HM // Two site-directed mutations are required for the conversion of a sugar dehydratase into an aminotransferase // Biochemistry, 2009, 48, 5246-5253
90. Zhang ZR, Bai M, Wang XY, Zhou JM, Perrett S // "Restoration" of glutathione transferase activity by single-site mutation of the yeast prion protein Ure2 // J Mol Biol, 2008, 384, 641651
91. Xiang, H, Luo, L, Taylor, KL, and Dunaway-Mariano, D // Interchange of catalytic activity within the 2-enoyl-coenzyme A hydratase/isomerase superfamily based on a common active site template // Biochemistry, 1999, 38, 7638-7652
92. Seebeck, FP, Hilvert, D // Conversion of a PLP-dependent racemase into an aldolase by a single active site mutation // J. Am. Chem. Soc., 2003, 125,10158-10159
93. Bakker, M, van Rantwijk, F, Sheldon, R A // Metal substitution in thermolysin: Catalyticproperties of tungstate thermolysin in sulfoxidation with H202 // Can. J. Chem., 2002, 80, 622625.
94. Seelig, B., Szostak, J. W. // Selection and evolution of enzymes from a partially randomized non-catalytic scaffold // Nature, 2007, 448, 828-831
95. Ollis D.L., Cheah E., Cygler M., Dijkstra B., Frolow F., Franken S.M., Harel M., Remington S.J., Silman L, Schräg J., Sussman J.L., Verschueren K.H.G., Goldman A. // The a/b hydrolase fold // Protein Engineering, 1992, 5,197-211
96. Bornscheuer U.T., Kazlauskas R.J. // Hydrolases in organic synthesis, 2nd edition // Willer-VCH, Weinheim, 2005
97. Patel R.N. // Biocatalysis: synthesis of chiral intermediates for drugs // Curr Opin Drug Discov Devel, 2006, 9(6), 741-64.
98. Edited by Bornscheuer U.T. // Enzymes in Lipid Modification // Wiley-VCH, Weinheim, 2000
99. Pleiss J., Scheib H., Schmid R.D. // The his gap motif in microbial lipases: a determinant of stereoselectivity toward triacylglycerols and analogs // Biochimie, 2000, 82, 1043-1052
100. Holmquist M. //Alpha/Beta-hydrolase fold enzymes: structures, functions and mechanisms // Curr Protein Pept Sei, 2000, 1 (2), 209-35
101. Fujii R., Nakagawa Y., Hiratake J., Sogabe A., Sakata K. // Directed evolution of Pseudomonas aeruginosa lipase for improved amide-hydrolyzing activity // Protein Eng Des Sei, 2005, 18(2), 93-101
102. Henke E., Bornscheuer U.T. // Fluorophoric assay for the high-throughput determination of amidase activity //Anal Chem, 2003, 75(2), 255-60
103. Reetz M.T., Carballeira J.D., Vogel A. // Iterative saturation mutagenesis on the basis of B factors as a strategy for increasing protein thermostability // Angew Chem Int Ed Engl, 2006, 45(46), 7745-51
104. Bartsch S., Kourist R., Bornscheuer U.T. // Complete inversion of enantioselectivity towards acetylated tertiary alcohols by a double mutant of a Bacillus subtilis esterase //Angew Chem Int Ed Engl, 2008,47(8), 1508-11
105. Ivancic M., Valinger G., Gruber K., Schwab H. // Inverting enantioselectivity of Burkholderia gladioli esterase EstB by directed and designed evolution // J Biotechnol. 2007, 29(1), 109-22
106. Koga Y., Kato K., Nakano H., Yamane T. // Inverting enantioselectivity of Burkholderia cepacia KWI-56 lipase by combinatorial mutation and high-throughput screening using single-molecule PCR and in vitro expression IIJ Mol Biol, 2003, 331(3), 585-92
107. Jochens H., Stiba K., Savile C., Fujii R., Yu J.G., Gerassenkov T., Kazlauskas R.J., Bornscheuer U.T. // Converting an esterase into an epoxide hydrolase // Angew Chem Int Ed Engl, 2009,48(19), 3532-5
108. Yin D.L., Bernhardt P., Morley K.L., Jiang Y., Cheeseman J.D., Purpero V., Schrag J.D., Kazlauskas R.J. // Switching catalysis from hydrolysis to perhydrolysis in Pseudomonas fluorescens esterase // Biochemistry, 2010,49(9), 1931-42
109. Kazlauskas R.J., Bornscheuer U.T. // Finding better protein engineering strategies // Nat Chem Biol, 2009, 5(8), 526-9
110. Blow D.M., Birktoft J. J., Hartley B.S. // Role of a buried acid group in the mechanism of action of chymotrypsin// Nature, 1969, 221, 337-339
111. Wright C.S., Alden R.A., Kraut J. // Structure of subtilisin BPN' at 2.5 angstrom resolution // Nature, 1969,221,235-242
112. Heikinheimo P., Goldman A., Jeffries C., Ollis D.L. // Of barn owls and bankers: a lush variety of alpha/beta hydrolases // Structure, 1999, 7, 141-146
113. Hotelier T, Renault L, Cousin X, Negre V, Marchot P, Chatonnet A // ESTHER, the database of the alpha/beta-hydrolase fold superfamily of proteins // Nucleic Acids Research, 2004, 32, D145-7
114. Rogalska E., Cudrey C., Ferrato F., Verger R. // Stereoselective hydrolysis of triglycerides by animal and microbial lipases // Chirality, 1993,5, 24-30
115. Schmid R.D., Verger R. // Lipases: Interfacial Enzymes with Attractive Applications II Angew. Chem. Int. Ed., 1998,37,12, 1608-1633
116. Rubin B., Dennis E.A. // Lipases Part B: Enzyme Characterization and Utilization // Methods in Enzymology, 1997, 286, 1-563
117. Rubin B., Dennis E.A. // Lipases, Part A: Biotechnology // Methods in Enzymology, 1997, 284, 1-408
118. Sh0nheyder F., Volqvartz K. // On the Affinity of Pig Pancreas Lipase for Tricaproin in Heterogeneous Solution//Acta Physiol. Scand., 1945, 9, 1, 57-67
119. Sarda L., Desnuelle P. //Actions of pancreatic lipase on esters in emulsions // Biochim. Biophys. Acta, 1958, 30, 513-521
120. Derewenda U., Brzozowski A.M., Lawson D.M., Derewenda Z.S. // Catalysis at the interface: the anatomy of a conformational change in a triglyceride lipase // Biochemistry, 1992,31,1532-1541
121. Holmquist M., Clausen I.G., Patkar S., Svendsen A., Hult K. // Probing a functional role of Glu87 and Trp89 in the lid of Humicola lanuginosa lipase through transesterification reactions in organic solvent // J. Protein Chem., 1995,14,217-224
122. Uppenberg J., Hansen M.T., Patkar S., Jones T.A. // The sequence, crystal structure determination and refinement of two crystal forms of lipase B from Candida Antarctica // Current Biology, 1994, 2, 293-398
123. Frykman«H., Ohmer N., Norin T., Hult K. // S-ethyl thiooctanoate as acyl donor in lipase catalysed resolution of secondary alcohols // Tetrahedron let., 1993, 34, 1367-1370
124. Adelhorst K., Bjorkling F., Godtfrcdscn S., Kirk 0. // Enzyme catalyzed preparation of 6-0*acylglucopyranosides // Synthesis, 1990,2, 112-115
125. Kim J., Copley S.D. // Why methabolic enzymes are essential or nonessential for growth of Escherichia coli on glucose // Biochemistry, 2007, 46, 12501-12511
126. Babtie A., Tokuriki N., Hollfelder F. // What makes an enzyme promiscuous? // Current Opinion in Chemical Biology, 2010, 14, 200-207
127. Torre O., Alfonso I., Gotor V. //Lipase catalysed Michael addition of secondary amines to acrylonitrile // Chem. Commun., 2004, 1724-1725
128. Svedendahl M., Hult K., Berlung P. // Fast carbon-carbon bond formation by a promiscuous lipase // J. Am. Chem. Soc., 2005, 127,17988-17989
129. Endrizzi J. A., Breddam K., Remington S.J. // 2.8-A structure of yeast serine carboxypeptidase // Biochemistry, 1994, 33, 11106-11120
130. Shilton B., Thomas D.Y., Cygler M. // Crystal structure of Kexldeltap, a prohormonev processing carboxypeptidase from Saccharomyces cerevisiae // Biochemistry, 1997,36, 90029012
131. Rudenko G., Bonten E., d'Azzo A., Hoi W.G.J. // Three-dimensional structure of the human 'protective protein': structure of the precursor form suggests a complex activation mechanism // Structure, 1995,3, 1249-1259
132. Stennicke H.R., Mortensen U.H., Breddam K. // Studies on the hydrolytic properties of (serine) carboxypeptidase Y// Biochemistry, 1996, 35, 7131-7141
133. Jung G., Ueno H., Hayashi R. // Proton-relay system of carboxypeptidase Y as a solecatalytic site: studies on mutagenic replacement of his 397 // J. Biochem., 1998, 124,446-450
134. Breddam K., Soren S.B., Svendsen I. // Determination of C-terminal sequences by digestion with serine carboxypeptidases: the influence of enzyme specificity // Carlsberg Research Communications, 1987, 52, 297-311
135. Bullock T.L., Branchaud В., Remington S.J. // Structure of the complex of L-benzylsuccinate with Wheat Serine carboxypeptidase II at 2.0-A resolution // Biochemistry, 1994,33, 11127-11134
136. Byers L.D., Wolfenden R. // A potent reversible inhibitor of carboxypeptidase A // J Biol Chem, 1972, 247,2,606-608
137. Knowles J.R. // Enzyme catalysis: not different, just better // Nature, 1991, 350, 6314, 121124
138. Johnson F. A., Lewis S.D., Shafer J. A. // Perturbations in the free energy and enthalpy of ionization of histidine-159 at the active site of papain as determined by fluorescence spectroscopy // Biochemistry, 1981, 20, 1, 52-58
139. Hickel A, Hasslacher M, Griengl H. // Hydroxynitrile lyases: Functions and Properties //
140. Physiol Plant, 1996, 98, 891-898i
141. Kruse CG. // Chiral cyanhydrins—Their manufacture and utility as chiralbuilding blocks //
142. В книге Collins AN, Sheldrake GN, Crosby J, eds. Chirality in industry, 1992, London, John Wiley and Sons Ltd
143. Klempier N, Griengl H, Hayn M. // Aliphatic (S)-cyanhydrins by enzyme catalysed synthesis // Tetrahedron Lett, 1993, 34, 4769-4772
144. Johnson DV, Griengl H. // Biocatalytic applications of hydroxynitrile lyases //Adv Biochem Eng Biotechnol, 1999, 63, 31-55
145. EfFenberger F. // Synthesis and reactions of optically-active cyanohydrins //Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1994, 33, 1555-1564
146. Kuroki GW; Conn EE. // Mandelonitrile lyase from Ximenia americana L.: Stereospecificity • and lack of flavin prosthetic group // Proc Natl Acad Sci, 1989, 86, 6978-6981
147. Xu L-L, Singh BK, Conn EE. // Purification and characterization of acetone cyanhydrin lyase from Linum usitatissimum II Arch Biochem Biophys, 1988, 263, 256-263
148. Hughes J, Carvalho FJPDC, Hughes MA// Purification, characterization, and cloning о a-hydroxynitrile lyase from cassava (Manihot esculenta Crantz) // Arch Biochem Biophys, 1994,311,496-502
149. Wajant H, Mundry KWII Hydroxynitrile lyase from Sorghum bicolor: A glycoprotein heterotetramer//Plant Science, 1993, 89, 127-133
150. Wagner UG, Hasslacher M, Griengl H, Schwab H, Kratky С // Mechanism of cyanogenesis: The crystal structure of hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis // Structure, 1996, 4, 811-822
151. Hasslacher M, Kratky C, Griengl H, Schwab H, Kohlwein SD // Hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis: Molecular characterization and mechanism of enzyme catalysis // Proteins Struct Funct Genet, 1997,27,438-449
152. Wharton CW. // The serine proteinases // В книге Sinnott M, ed. Comprehensive biological catalysis, 1998, London, Academic Press
153. Zuegg J, Gruber K, Gugganig M, Wagner UG, Kratky C. // Three-dimensional structures of enzyme-substrate complexes of the hydroxynitrile lyase from Hevea brasiliensis // Protein Science, 1999, 8, 10,1990-2000
154. Asano Y, Nakazawa A, Kato Y, Kondo К // Properties of a novel D-stereospecific aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi // J Biol Chem, 1989,264,24,14233-14239
155. Kato Y, Asano Y, Nakazawa A, Kondo К // Synthesis of D-Alanine Oligopeptides
156. Catalyzed by D-Aminopeptidase in Non-Aqueous Media // Biocat. Biotrans, 1990,3,3 ,207-215156
157. Asano Y, Kato Y, Yamada A, Kondo K. // Structural similarity of D-aminopeptidase to carboxypeptidase DD and beta-lactamases // Biochemistry, 1992, 31,8, 2316-28
158. Okazaki S, Suzuki A, Komeda H, Asano Y, Yamane T // Deduced catalytic mechanism of D-amino acid amidase from Ochrobactrum anthropi SV3 // J Synchrotron Radiat, 2008, 15, 3, 250-253
159. Massova I, Kollman PA // pKa, MM, and QM studies of mechanisms of beta-lactamases andpenicillin-binding proteins: acylation step // J Comput Chem, 2002, 23, 16, 1559-1576
160. Ke YY, Lin TH // A theoretical study on the activation of Ser70 in the acylation mechanism of cephalosporin antibiotics // Biophys Chem, 2005, 114, 2-3, 103-113
161. Khaliullin I.G., Suplatov D.A., Shalaeva D.N., Otsuka M., Asano Y., Svedas V.K. // Bioinformatic Analysis, Molecular Modeling of Role of Lys65 Residue in Catalytic Triad of D-aminopeptidase from Ochrobactrum anthropi // Acta Naturae, 5, 66-70
162. Doerr A. // Unnatural design //Nature methods, 2010, 7, 671
163. Wolfenden R., Snider M.J. // The depth of chemical time and the power of enzymes as catalysis //Acc. Chem. Res., 2001, 34, 938-945
164. Zuckerkandl E., Pauling L. // Molecules as documents of evolutionary history // J. Theoret.1571. Biol., 1965, 8,357-366
165. Varfolomeev S.Dl, Gurevich K.G. // Enzyme active sites: bioinformatics, architecture, and? mechanisms of:action // Russian chemical-bulletin; 2001, 50, 10; 1709-1717
166. Altschul S., Madden T., Schaffer A;, Zhang Ji, Zhang Z., Miller W., Lipman D. // Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Research, 1997, 25, 3389-3402
167. The UniProt Consortium // Ongoing and future developments at the Universal Protein Resource // Nucleic Acids Res., 39, D214-D219,2011
168. Lee M.M., Chan M., Bundschuh R. // Simple is beautiful: a straightforward approach to improve the delineation of true and false positives in PSI-BLAST searches //Bioinformatics, 2008, 24 1339-1343
169. Soding J., Biegert A., Lupas A.N. // The HHpred interactive server for protein homology detection and structure prediction //Nucleic Acids Research, 2005, 33, W244-W248
170. The PyMOL Molecular Graphics System, Version l.Orl, Schrodinger, LLC
171. Waterhouse A., Procter J., Martin D., Clamp-M;, Barton G. // Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench // Bioinformatics, 2009, 25, 1189-1191
172. Sali A., Blundell T.L. // Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints // J. Mol. Biol., 1993,234j 779-815
173. Rodriguez R, Chinea G, Lopez N, Pons T, Vriend G // Homology modeling, model and software evaluation: three relatedresources // CABIOS, 1998, 14, 523-528
174. Laskowski R A, MacArthur M W, Moss D S & Thornton J M // PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures // J. Appl. Cryst., 1993,26,283-291
175. Dolinsky TJ, Czodrowski P, Li H, Nielsen JE, Jensen JH, Klebe G, Baker NA. // PDB2PQR: Expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations // Nucleic Acids Res, 35, W522-5, 2007
176. Li H, Robertson AD, Jensen JH // Very Fast Empirical Prediction and Interpretation of Protein pKa Values // Proteins, 2005, 61, 704-721
177. Hunter AD //ACD/ChemSketch 1.0 (freeware); ACD/ChemSketch 2.0 and its Tautomers, Dictionary, and 3D Plug-ins; ACD/HNMR 2.0; ACD/CNMR 2.0 // J. Chem. Educ., 1997, 748., 905
178. Stewart JJP // MOPAC2009, Stewart Computational Chemistry, Colorado Springs, CO, USA, http://OpenMOPAC.net (2008)
179. Huey R, Morris GM, Olson AJ, Goodsell DS // A Semiempirical Free Energy Force Field with Charge-Based Desolvation//J. Computational Chemistry, 2007, 28, 1145-1152'
180. Valdar W.S .J., Thornton J.M.: Protein-protein interfaces: analysis of amino acid conservation in homodimes . Proteins, 2001, 42:108-124
181. Vingron M., Argos P.: A fast and sensitive multiple sequence alignment algorithm. Comput.Appl.Biosci., 1989, 5:115-121
182. Eckstein F, Romaniuk PJ, Heideman W, Storm DR.: Stereochemistry of the mammalian adenylate cyclase reaction. J Biol Chem., 1981,256(17):9118-9120
183. Gerlt JA, Coderre JA, Wolin MS.: Mechanism of the adenylate cyclase reaction. Stereochemistry of the reaction catalyzed by the enzyme from Brevibacterium liquefaciens. J Biol Chem., 1980,2552:331-334
184. Tucker C.L., Hurley J.H., Miller T.R., Hurley J.B.: Two amino acid substitutions convert a guanylyl cyclase, RetGC-1, into an adenylyl cyclase. Prot.Natl.Acad.Sci. USA, 1998, 59935997
185. Lauble H, Miehlich B, Förster S, Wajant H, Effenberger F.: Crystal structure of hydroxynitrile lyase from Sorghum bicolor in complex with the inhibitor benzoic acid: a novel cyanogenic enzyme. Biochemistry, 2002, 41(40):12043-12050
186. Boersma YL, Pijning T, Bosma MS, van der Sloot AM, Godinho LF, Dröge MJ, Winter RT, van Pouderoyen G, Dijkstra BW, Quax WJ.: Loop grafting of Bacillus subtilis lipase A: inversion of enantioselectivity. Chem.Biol., 2008,15(8):782-789
187. Morley K., Kazlauskas R.J. // Improve enzyme properties: when are closer mutations better //TRENDS in Biotechnology, 2005,23(5):231-237
188. Pearl FM, Bennett CF, Bray JE, Harrison AP, Martin N, Shepherd A, Sillitoe I, Thornton J, Orengo CA// The CATH database: an extended protein family resource for structural and functional genomics //Nucleic Acids Research, 2003, 31,452-455
189. Koonin E., Galperin M. // Sequence-Evolution-Function // Kluwer Academic Publishers,2003
190. Porter C.T., Bartlett G.J., Thornton J.M. // The Catalytic Site Atlas: a resource of catalytic sites and residues identified in enzymes using structural data // Nucl. Acids. Res., 2004, 32, D129-D133.
191. Dundas J., Ouyang Z., Tseng J., Binkowski A., Turpaz Y., Liang J. // CASTp: computed atas of surface topography of proteins with structural and topographical mapping of functionally annotated residues // Nucl. Acids Res., 2006, 34, W116-W118
192. Winkler FK, D'Arcy A, Hunziker W. // Structure of human pancreatic lipase // Nature, 1990, 343, 6260, 771-4
193. Jaeger KE, Liebeton K, Zonta A, Schimossek K, Reetz MT // Biotechnological application of Pseudomonas aeruginosa lipase: efficient kinetic resolution of amines and alcochols // Appl. Microbiol. Biotechnol., 1996, 46, 99-105
194. Zerner B., Bond R. P. M., Bender M. L. // Kinetic evidence for the formation of acyl-enzyme intermediates in the a,-chymotrypsin-catalyzed hydrolysis of specific substrates // J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 3674
195. Bonneau PR, Graycar TP, Estell DA, Jones JB // Alteration of the specificity of subtilisin BPN'by site-directed mutagenesis in its SI and Sl'binding sites // J. Am. Chem.
196. Soc., 1991, 113, 1026-1030
197. Pleiss J, Fischer M, Peiker M, Thiele C, Schmid RD // Lipase engineering database Understanding and exploiting sequence-structure-function relationships // J. Mol. Catal. B-Enzym., 2000, 10,491-508
198. Lauble H, Miehlich B, Förster S, Kobler C, Wajant H, Effenberger F. // Structure determinants of substrate specificity of hydroxynitrile lyase from Manihot esculenta // Protein Sei, 2002,11,1,65-71
199. Lauble H, Miehlich B, Förster S, Wajant H, Effenberger F // Mechanistic aspects of cyanogenesis from active-site mutant Ser80Ala of hydroxynitrile lyase from Manihot esculenta in complex with acetone cyanohydrins // Protein Sei, 2001,10, 5,1015-22.
200. Padhi S.K., Fujii R., Legatt G.A., Fossum S.L., Berchtold R., Kazlauskas R.J. // Switching from an esterase to a hydroxynitrile lyase mechanism requires only two amino acid substitutions // Chemistry & Biology, 2010, August 27, 17, 863-871
201. Hedstrom L. // Serine protease mechanism and specificity // Chem Rev, 2002, 102, 12, 4501-24.
202. Wang Q, Yang G, Liu Y, Feng Y. // Discrimination of esterase and peptidase activities of acylaminoacyl peptidase from hyperthermophilic Aeropyrum pernix K1 by a single mutation // J Biol Chem, 2006, 281,27, 18618-25
203. Fersht A.R. //Acyl-transfer reactions of amides and esters with alcohols and thiols. Reference system for the serine and cysteine proteinases. Nitrogen protonation of amides and amide-imidate equilibriums //J Am Chem Soc, 1971, 93, 14, 3504-15
204. Bott RR, Chan G, Domingo B, Ganshaw G, Hsia CY, Knapp M, Murray CJ. // Do enzymes change the nature of transition states? Mapping the transition state for general acid-base catalysis of a serine protease // Biochemistry, 2003,42, 36,10545-53
205. Liao D.-I., Breddam K., Sweet R.M., Bullock T., Remington S.J. // Refined atomic model of Wheat serine carboxypeptidase II at 2.2-A resolution // Biochemistry, 1992, 31, 9796-9812
206. Breddam K. // Chemically modified carboxypeptidase Y with increased amidase activity // Carlsberg Res Commun, 1984,49, 535-554
207. Argiriadi MA, Morisseau C, Goodrow MH, Dowdy DL, Hammock BD, Christianson DW // Binding of alkylurea inhibitors to epoxide hydrolase implicates active site tyrosines in substrate activation // J Biol Chem, 2000, 275, 20, 15265-70
-
Суплатов, Дмитрий Андреевич
-
кандидата химических наук
-
Москва, 2011
-
ВАК 03.01.04
- Характеристика некаталитических модулей мультимодульной термостабильной ламинариназы Lic16A Clostridium thermocellum
- Эволюция транскрипционной регуляции метаболизма углеводов в бактериях
- Конформационная динамика альфа-фетопротеина, его пептидных фрагментов и их биологическая активность
- Компьютерное исследование влияния высокого давления и температуры на структуру и функцию РНК-связывающего белка семейства Nip7 архей
- Идентификация онко-ассоциированных генов при светлоклеточном раке почки
