Высшие уровни организации генетического аппарата эукариот и регуляция функциональной активности генома

Киреев, Игорь Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Высшие уровни организации генетического аппарата эукариот и регуляция функциональной активности генома
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Высшие уровни организации генетического аппарата эукариот и регуляция функциональной активности генома"

005003197

КИРЕЕВ ИГОРЬ ИГОРЕВИЧ

ВЫСШИЕ УРОВНИ ОРГАНИЗАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ЭУКАРИОТ И РЕГУЛЯЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ГЕНОМА

03.03.04 - Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

- 1 ДЕК 2011

Москва-2011

005003197

Работа выполнена в Отделе электронной микроскопии Института физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского (директор - академик РАН, профессор В .П. Скулачёв) Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Онищенко Галина Евгеньевна, доктор биологических наук, профессор Коломиец Оксана Леонидовна, доктор биологических наук, профессор Зеленин Александр Владимирович.

Ведущая организация: Институт биологии развития РАН

Зо

Защита диссертации состоится «¿0 »"¿глс^р.Ц 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.52 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Биологический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан «' ° » _ 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета кандидат биологических наук

Калистратова Е.Н.

1. ВВЕДЕНИЕ

Значительное увеличение размеров и сложности генома в процессе эволюции повысило важность решения проблемы упорядоченной пространственной организации генетического материала и его аккуратной сегрегации в ходе деления клетки у высших эукариот. Это достигается многоуровневой упаковкой ДНК в сложный нуклеопротеидный комплекс — хроматин. Вершиной такой упаковки являются митотические хромосомы, степень компактизации ДНК в которых на стадии метафазы достигает 104. Важную роль в упорядоченной укладке ДНК в составе хроматина играют как гистоны, так и негистоновые белки, причем до недавнего времени считалось, что гистоны выполняют исключительно структурную роль, обеспечивая упаковку ДНК на низших уровнях компактизации - в составе нуклеосом и 30-нм фибрилл хроматина. Дальнейший способ упаковки 30-нм фибриллы и формирование т.н. высших уровней организации хроматина до сих пор остаются предметом дискуссий. Неполнота и противоречивость сведений о пространственной организации хроматина существенно осложняют адекватную интерпретацию биохимических и генетических данных о молекулярных механизмах, лежащих в основе процессов компактиза-ции/декомпактизации хроматина. Например, прогресс в исследовании функциональной роли «архитектурных» негистоновых хромосомных белков, таких как топоизомераза II и белки конденсинового комплекса, существенно тормозится из-за того, что изучение характера их взаимодействия с хромосомами проводили преимущественно в системах in vitro, а также в условиях искусственной де-конденсации хромосом (Earnshaw, Heck, 1983; Hirano, Mitchison, 1994; Maeshi-ma et al, 2005). Поскольку данные об ультраструктурной локализации этих важнейших структурных компонентов хромосом в контексте нативного хроматина практически отсутствуют, многие аспекты структурно-функциональной организации и динамики хромосом в митозе остаются непонятными.

сложности в решении данной задачи связаны с тем, что структурная организация хроматина не монотонна: различные участки генома различаются по характеру упаковки ДНК, и эти различия связаны с функциональным состоянием генных локусов. Классическим примером может служить подразделение интерфазного хроматина на слабо компактизованный, транскрипционно активный эухроматин и плотно упакованный, инертный в отношение экспрессии генетической информации гетерохроматин. Различия в структурном состоянии эу- и гетерохроматина становятся менее очевидными при переходе от интерфазы к митозу, однако фундаментальные особенности структуры этих фракций генома по-видимому, сохраняются. В связи с этим особенно важно иметь возможность исследовать особенности структурной организации индивидуальных хромосомных локусов в составе нативного хроматина. Для решения такой задачи требуются новые методические подходы, поскольку используемые в настоящее время методы гибридизации in situ не позволяют в должной степени сохранить ин-тактной тонкую структуру хромосом. Одним из таких подходов является конструирование искусственных хромосомных локусов, визуализуемых при помощи системы 1ас-опреатор/1ас-репрессор как in situ, так и in vivo (Robinett et al, 1996).

Однако биологическое значение высших уровней организации хромосом эукариот не ограничивается необходимостью компактизации длинных молекул ДНК для аккуратной трансмиссии генетической информации в процессе клеточного деления. Сложно организованный и плотно упакованный хроматин неизбежно создает топологические проблемы при репликации ДНК, что требует точной координации процесса синтеза ДНК со структурными преобразованиями реплицирующегося хроматина. Отсутствие детальной информации об организации хроматиновых структур высшего порядка ограничивает выработку единой точки зрения на пространственно-временную организацию процесса синтеза ДНК и механизмы пострепликативной сегрегации сестринских хрома-тид.

Структурное состояние хроматина также является важным элементом системы эпигенетической регуляции экспрессии генов. Роль упаковки хроматина проявляется как на уровне контроля доступности ДНК для связывания трансфакторов за счет ограничения диффузии (John et al, 2011), так и на уровне модуляции их взаимодействий с хроматиновой матрицей через постгрансляционные модификации гистонов (Allis et al, 2007). В последнее время становится все более очевидным, что и высшие уровни компактизации хроматина, и даже позиционирование хромосомных локусов или целых хромосом в трехмерном пространстве интерфазного ядра представляют собой дополнительные уровни эпигенетического контроля, однако механизмы реализации такого рода регуляции, и способы поддержания эпигенетических состояний, связанных с пространственной организацией интерфазного хроматина, в ряду клеточных делений или остаются гораздо менее исследованными. Очевидно, что ответы на эти

вопросы не могут быть даны без полного понимания принципов структурной организации хроматина на этих надмолекулярных уровнях.

1.2. Цель и задачи работы.

Целью настоящей работы было исследование формирования высших уровней организации хроматина в процессе митотической компактизации хромосом и роли «архитектурных» белков хромосом в этом процессе, а также изучение взаимосвязи структурной организации хроматина и его функционального состояния, в первую очередь, в отношение транскрипционной и репликативной активности.

Конкретные задачи работы состояли в следующем:

- 1) провести сравнительный ультраструктурный анализ и исследовать особенности высших уровней компактизации ДНК в хроматиновых доменах с различным генетическим статусом (эухроматин, факультативный и конститутивный гетерохроматин), используя инактивированную Х-хро-мосому и прицентромерный гетерохроматин (хромоцентры) в качестве модели.

2) исследовать динамику высших уровней организации хроматина в процессе репликации ДНК и характер пострепликативных структурных преобразований хроматина.

3) изучить топологию рано реплицирующегося, транскрипционно активного эухроматина и поздно реплицирующегося, молчащего гетерохроматина в митотических хромосомах

4) исследовать на ультраструктурном уровне структурные преобразования хроматина при активации транскрипции, используя в качестве модели искусственные генные локусы, визуализуемые in vivo.

5) изучить динамику митотической компактизации хроматина на ультраструктурном уровне и процесс формирования высших уровней организации хроматина в ходе естественной компактизации.

6) исследовать роль Са++ в формировании высших уровней компактизации хроматина в живых клетках

7) исследовать топологию основных архитектурных белковых компонентов хромосом - конденсинового комплекса и топоизомеразы II в ход митотической компактизации хроматина и установить их связь с формирование высших уровней компактизации хромосом.

8) исследовать динамику конденсинового комплекса при искусственно индуцированных изменениях характера компактизации хромосом в живых клетках

9) исследовать топологию конденсинового комплекса в мейотических хромосомах.

1.3. Научная новизна работы.

В работе было впервые проведено детальное ультраструктурное исследование динамики формирования высших уровней компактизации хромосом млекопитающих в профазе митоза. Обнаружено, что митотическая компактиза-ция происходит с образованием как минимум двух промежуточных уровней — хроматиновых фибрилл диаметром 200-250 нм и 400 нм.

Впервые исследована трехмерная организация доменов факультативного гетерохроматина, соответствующих неактивной Х-хромосоме человека. Показано, что инактивация сопровождается упаковкой хроматина в фибриллы диаметром 200-400 нм, при сохранении доступности внутренних областей Xi для транс-факторов.

Показано, что репликативные кластеры в поздно-реплицирующемся гете-рохроматине соответствуют хроматиновым доменам диаметром 250-300 нм. Репликация не требует глобальной деконденсации плотно упакованных доменов, и репликативные комплексы распределены равномерно в объеме реплицирующегося домена, не формируя репликативные фабрики.

Исследована динамика основных архитектурных белков хроматина топо-изомеразы II и конденсинов в процессе профазной компактизации хромосом, а также в экспериментальных условиях, вызывающих изменение степени компактизации хромосом in vivo. На основании полученных данных предложена новая модель структурной организации митотических хромосом.

Впервые продемонстрирована локализация субъединиц конденсина в тельцах Кахаля, а также явление независимой локализации индивидуальных субъединиц конденсинового комплекса в различных структурно-функциональных доменах ядра.

Разработан новый метод in vivo иммуномечения клеточных белков наноча-стицами золота, и с помощью данного метода впервые удалось визуализовать на ультраструктурном уровне характер упаковки индивидуальных хромосомных локусов в виде хроматиновых фибрилл высшего порядка в интактных клетках.

Разработан метод индукции линейной и поперечной дифференциации митотических хромосом и впервые продемонстрированы различия в организации рано- и поздно реплицирующихся хроматиновых доменов относительно хромосомной оси.

Впервые в интактных клетках показано, что индукция транскрипции эухро-матиновых генов сопровождается частичной деконденсацией высших уровней организации хроматина. В то же время, транскрипция может осуществляться на плотно упакованной хроматиновой матрице.

Впервые прижизненно прослежена динамика ассоциации генов с кластерами интерхроматиновых гранул при активации транскрипции, а также продемонстрирована высокая локальная мобильность транскрибирующихся

хромосомных локусов. На основании полученных данных предложена новая модель организации процесса транскрипции в контексте нативного хроматина.

1.4. Научно-практическая ценность работы.

Настоящая работа является фундаментальным научным исследованием. В ходе ее выполнения получены новые данные об организации генетического аппарата высших эукариот и о структурных перестройках высших уровней упаковки ДНК в хромосомах, сопровождающих протекание фундаментальных биологических процессов, связанных с экспрессией, репликацией и сегрегацией генетического материала клетки. Эти данные позволяют расширить наши представления о структурно-функциональной организации генома, а также в перспективе использовать полученные сведения для разработки подходов для коррекции различных патологических процессов, связанных с нарушениями структурного состояния хроматина.

Разработанные автором методы фотостабилизации хроматина, ¡п у1уо-им-муномечения могут быть использованы и уже успешно применяются в различных цитологических исследованиях (Капага\уа е1 а1, 2011)

Результаты работы включены в учебные курсы для студентов Биологического факультета, факультета биоинформатики и биоинженерии, химического факультета МГУ, для слушателей научно-образовательного центра по нанотех-нологиям МГУ, Биологического факультета Университета штата Иллиноис (Урбана-Шампейн, США).

1.5. Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на Европейском совещании по структуре и функции ядра памяти В.Бернара (1989, 1999, 2003); Конгрессе Европейского общества по фотобиологии (Кембридж, Великобритания, 1995); Съезде Британского общества клеточных биологов (Кентербери, 1995); Совещании ЕМВО по структуре и функции клеточного ядра (Прага, Чехия, 1999). Европейского конгресса по клеточной биологии (Прага, Чехия, 1994); Конференциях Американского общества клеточных биологов (2001, 2002, 2008); 52 Симпозиуме Европейского общества гистохимии (Прага, Чехия, 2010), 17 Международной хромосомной конференции (Бун, США, 2009), 3 Конференции памяти Марии Кюри по архитектуре генома в связи с патологией (Эдинбург, 2009), Всесоюзных (всероссийских) симпозиумах "Структура и функция клеточного ядра" и «Биология клетки в культуре» (1990, 1997, 2010), 1-ом Съезде Российского общества клеточных биологов (С-Петербург, 2003), а также на семинарах Московского общества клеточных биологов, НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, Биологического факультета Университета Ренна (Франция), Департамента клеточной биологии и биологии развития

Университета Палермо (Италия), кафедры цитологии и гистологии Биологического факультета МГУ.

2. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Принятые сокращения: AT - антитела; ИФ - иммунофлуоресценция; ЭМ - электронная микроскопия; BrdU - бромдезоксиуридин; EdU - этинилдезокси-уридин; FISH - флуоресцентная гибридизация in situ, PBS - физиологический фосфатный буферный раствор, GFP - зеленый флуоресцирующий белок.

В работе были использованы несколько типов клеточных культур, включая клетки человека (HeLa, WI-38), свиньи (СПЭВ), шпорцевой лягушки (XL2), мыши (эмбриональные фибробласты), китайского хомячка (СНО Kl, СНО DG-44). Также были получены субклоны линии СНО, несущие интегрированные в геном трансгенные конструкции, содержащие тандемные повторы 1ас-операто-ра. Визуализация трансгенных локусов in vivo осуществлялась при помощи экспрессии в этих клетках GFP-Lac-penpeccopa (Robinett et al., 1996). Культивирование клеток и процедуры сихронизации клеточных популяций осуществлялись по описанным ранее методам (Li et al., 1998, Uzbekov et al., 1998). Получение препаратов распластанных зародышевых пузырьков ооцитов Xenopus laevis и иммунофлуоресцентный анализ хромосом типа «ламповые щетки» проводили по стандартной методике (Beenders et al, 2003).

Приготовление препаратов для иммунофлуоресцентной микроскопии и FISH, а также методы флуоресцентной 3 D-микроскопии описано в нескольких публикациях (Uzbekov et al, 2003; Kireeva et al, 2004; Rego et al, 2008; Hu et al, 2009). Электронномикроскопический анализ проводили на ультратонких срезах по стандартной методике, а также с использованием микроинъекции первичных антител, коньюгированных с наночастицами золота. Микроинъекцию осуществляли с помощью микроинъектора IM300 (Nikon, Япония) и микроманипулятора M0-202U (Narishige, Япония), смонтированного на инвер-тированом флуоресцентном микроскопе IMT-2 (Olympus, Япония). Электронно микроскопические исследования проводили на микроскопах HU-11B, HU-12 и Н-700 (Hitachi, Япония). Анализ 3 D-организации хроматина проводили методами реконструкции по серийным ультратонким срезам (регистрация и препроцессинг изображений и создание трехмерных моделей проводились при помощи ImageJ и Matlab) или по угловым проекциям полутонких (500-нм) срезов при 200кВ в микроскопе Philips СМ200 (FEI, Нидерланды), оборудованном гониометром с большими углами наклона (Gatan, США) и CCD-камерой Теш-Cam-F224 (TVIPS, Германия).

Прижизненные наблюдения проводились в проточной камере FCS2 (Bioptechs, США) на автоматизарованном инвертированном микроскопе Axiovert 100М (Zeiss, Германия) под контролем программы ISee (Innovision) (Carpenter et al, 2004).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. Структурные мотивы высшего порядка в организации факультативного гетерохроматина

Неактивная Х-хромосома (Xi), являющаюся классическим примером факультативного гетерохроматина, в интерфазном ядре представлена в виде гетеропикнического тельца Барра. В первичных человеческих фибробластах WI-38 (XX) доля клеток с тельцами Барра, детектируемого как единственная компактная ядерная структура, ярко окрашиваемая красителем ДАПИ или антителами против H3-3mK27. Доля клеток с четко выявляемым тельцем Барра была максимальной в конфлюэнтной культуре через 10 дней после пересева и достигала 85% (95% при применении алгоритмов деконволюции). Размеры Xi в таких клетках составляли 2.7 мкм2 против 3.4 мкм2 в клетках, находившихся в логрифмической фазе роста. Для оптимизации протоколов пробоподготовки для иммуноэлектронной микроскопии с целью максимальной сохранности натив-ной структуры Xi и получения удовлетворитель-ного контраста хроматина, хроматин в клетках WI-38 метили при помощи экспрессии GFP-H2B и сравнивали конформацию Xi in vivo и после пермеабили-зации и фиксации клеток в различных условиях. Флуоресцентная микроскопия высокого разрешения с применением деконволюции показала, что в живых клетках тельце Барра имеет фибриллярную структуру с толщиной фибрилл от 200 до 400 нм. Сравнительный анализ показал, что наибольшей сохранности этих структурных элементов можно достичь при пермеабилизации в буфере А с дополнительной фотостабилизацией с использованием в качестве сенсибилизатора бромистого этидия. Ультраструктурный анализ клеток, фиксированных 2% глутаральдеги-дом, и клеток, пермеабилизованных после фотостабилизации, показал наличие в ядрах четко различимых компактных хроматиновых доменов, по размерам, структуре и содержанию H3-3mK27 соответствующих тельцам Барра (рис.2).

Рис. 1: Оптический срез живой клетки, экспрессирующей гистон Н2В-СРР, после деконволюции. В составе тельца Барра выявляются субструктуры размеров 200-400 нм.

Анализ серийных срезов показал, что факультативный гетерохроматин XI не является сплошной массой хроматина, а представляет собой аггломерат плотно упакованных хроматиновых фибрилл высшего порядка, отличающихся

существенно большим диаметром в сравнении с фибриллами хроматина в других районах ядра. В составе XI выявлялись

пространственно обособленные

хроматиновые фирил-лы толщиной от 30 до 400 нм, с 50-400 нм промежутками между ними (рис.2).

Прямое сравнение организации факультативного и конститутивного хроматина мы провели на модели эмбриональных фибробластов мыши (МЭФ XX). которые содержат крупные легко идентифицируемые хромоцентры, образованные слиянием прицентромерного хроматина нескольких хромосом. Тельца Барра в МЭФ идентифицировали по иммуноокрашиванию НЗ-ЗшК27. Анализ полных серий ультратонких срезов ядер показал, что ультраструктура телец Барра в МЭФ очень похожа на таковую клеток человека. В них выявлялись относи-

Рис. 2. А) Ультраструктура тельца Барра после фотостабилизации и пермеабилизации в полиаминовом буфере. Б) Идентификация XI (стрелка) при помощи иммуноэлектронной микроскопии с антителами против НЗ-ЗтК27, В) Компьютерная модель тельца Барра, построенная на основе серийных ультратонких срезов.

тельно рыхло упакованные гетерохроматиновые фибриллярные домены, что резко отличало XI от хромоцентров, обладающих более плотной и гомогенной текстурой. Мы не выявили видимых хроматиновых субструктур высшего порядка в составе хромоцентров, что можно объяснить либо чрезвычайно высокой плотностью упаковки хроматина в них, либо уникальными особенностями их организации, обусловленными низкой сложностью содержащийся в них ДНК и отсутствием необходимых аз-элементов, участвующих в организации хроматина на высших уровнях компактизации.

Для более детального анализа пространственной организации хроматина в составе XI, была проведена реконструкция нескольких телец Барра по серийным ультратонким срезам толщиной 40 нм. Оказалось, что наиболее часто встречающийся структурный мотив в тельцах Барра представляет собой сегменты фибрилл толщиной около 200 нм. Такие фибриллы примерно в 2 раза больше по толщине, чем типичные для окружающего хроматина хромонемы диаметром около 100 нм. Эти элементы высших уровней организации хроматина в Х\ упакованы достаточно рыхло, в результате чего между ними образуются свободные от хроматина пространства размером до 400 нм, которые сообщаются с районами ядерных пор и окружающей нуклеоплазмой. На компьютерных ЗЭ-моделях тельца Барра, созданных при помощи сегментации интерполированных серий ультратонких срезов по электронной плотности, пористая структура XI и формирующие ее фибриллы хроматина высшего порядка проявляются наиболее отчетливо (рис.2).

При помощи флуоресцентной ЗБ-микроскопии с использованием антител против нуклеопоринов, а также на сериях ультратонких срезов было обнаружено, что во всех исследованных клетках XI контактирует с ядерной оболочкой. В тех случаях, когда XI занимал центральное положение в ядре (6 случаев из 23), этот контакт осуществлялся через глубокие инвагинации ядерной оболочки или тонкие хроматиновые фибриллы, вытягивавшиеся из компактной хромосомной территории Х\. По-видимому, подобная связь с оболочкой характерна для любого типа гетерохроматина, поскольку аналогичное расположение было выявлено и для всех хромоцентров фибробластах мыши, исследованных при помощи электронномикроскопического ЗО-анализа.

Таким образом, полученные нами данные выявляют неоднородность в структуре хроматина и свидетельствуют о существенных локальных отличиях в компактизации хроматинового материала Хк При этом именно формирование хроматиновых фибрилл высшего порядка в процессе образования факультативного гетерохроматина может являться одним из механизмов инактивации генов в Х-хромосоме.

3.2. Динамика структурной организации хроматина в процессе

репликации.

Для специфического мечения сайтов репликации и пострепликативной организации хроматина с сохранением максимальной нативности хроматина мы использовали два экспериментальных подхода. Сайты, где происходит синтез ДНК мы визуализовли при помощи экспрессии в клетках культуры тканей химерного белка ЕСЕР-РСЫА. Для анализа взаимного расположения и динамики новореплицированного хроматина относительно репликативных фокусов мы использовали мечение ДНК ЕсШ, что позволило нам сохранить интактную структуру хроматина и таким образом существенно повысить разрешение микроскопического анализа. После импульсного мечения ЕсШ (5 мин) клетки отмывали свежей средой и фиксировали немедленно или инкубировали в среде, содержащей 1 мМ тимидина в течение 20, 30 или 120 мин. При импульсном ме-чении наблюдалась полная колокализация сайтов включения ЕсШ и РСЫА-по-зитивных фокусов, которые представляли округлые или эллипсовидные структуры размером 0.2-0.3 мкм. В ряде случаев близко расположенные индивидуальные репликативные фокусы сливались в более крупные агрегаты. При этом репликативные фокусы представляют собой сегменты фибриллярных хромати-новых структур высшего порядка и чаще всего полностью совпадают с ними по диаметру. Важно отметить, что интенсивность флуоресценции ДАПИ непосредственно в местах расположения репликативных фокусов оказывалась несколько ниже, чем в соседних хроматиновых доменах с теми же линейными параметрами, что мы интерпретировали как результат частичной деконденсацией хроматина в реплицирующихся сегментах хромонемы.

Одновременно с удалением реплицированного хроматина от сайтов репликации во многих случаях наблюдаются изменения в структурной организации реплицированных локусов. Через 20 мин после мечения он принимает более вытянутую конфигурацию. Иногда можно наблюдать достаточно протяженные сегменты фибрилл высшего порядка, гомогенно меченые по всей длине. Можно предположить, что наблюдаемые в экспериментах с отложенной меткой изменения конфигурации меченых сайтов отражают пост-репликативную перестройку высших уровней организации хроматина.

Увеличение интервала между введением метки и фиксацией вплоть до 2 часов сопровождается дальнейшей сегрегацией и снижением коэффициента ко-локализации между ОБР-РСЫЛ и ЕсШ, меченым А1еха-594. В этих случаях фибриллярная структура реплицированных сегментов хроматина становится еще более выраженной (рис.3).

Для исследования динамики высших уровней компактизации хроматина в процессе репликации на ультраструктурном уровне были использованы мо-ноклональные антитела против ЕвРР и вторичные антитела, ковалентно связанных с 1.4 нм наночастицами золота. Для увеличения контраста с целью адекватной визуализации высших уровней организации хроматина, иммуномечение, а

Б В

< • * 1 к 1

ОАР1 ъ % 11 РСИА * я 1 С11С К1Т * %

РСМД С11СК1Т 91 Ч Г ч %

Рис.3. Колокализация новосинтезированной ДНК (красный) и PCNA-позитивных репликативных фокусов (зеленый) в поздней Б-фазе (А) при импульсном (5 мин) меченый Е(Ш. Через 20 мин (Б) и 2 часа (И) после мечения наблюдается сегрегация новосинтезированной ДНК и сайтов репликации. ДАПИ (синий). (Г-Д) Пост-реплкативная реорганизация хроматина. (Г) При импульсном меченый локусы новореплицированного хроматина имеют компактную округлую форму, а через 2 часа после репликации реорганизуются в сегменты фибриллярных структур высшего порядка (Д).

также А§-амплификация сигнала проводились перед заключением препаратов в смолу. В этих условиях репликативные сайты часто представляют собой меченые сегменты хроматиновых фибрилл высшего порядка диаметром около 200 нм. Хроматин в их составе обладает меньшей электронной плотностью по сравнению с окружающими немечеными (нереплицирующимися) доменами, что может быть связано с частичной локальной деконденсацией реплицирующегося хроматина, однако тотального разворачивания хроматиновых доменов высшего порядка и появления протяженных нуклеосомных фибрилл в зоне репликации не наблюдается. При этом метка располагается преимущественно на поверхности этих доменов, что может быть связано как с расположением ДНК-полимераз на периферии конденсированного хроматина (7аишп е1 а1, 2000), так и с ограниченной диффузией антител в области плотной упаковки ДНК. Чтобы

/ У/ ? «1

У> ' , . а

А 1 рт

а Л • % | т*

Б ■.шВшШя-'ш ^тлМтШ^ШШ/^К 0.5 рт

* - .«■ • V

• * . л '«Ь .

II к .

Г • '¿у

# • V-. • %

Рис.4. Иммуноокрашивание репликативньа сайтов в ядре клетки СНО, экспрессирующей ЕвРР-РСИА. (А-Б) При окрашивании фиксированных клеток метка располагается преимущественно на периферии репликацтивных сайтов. (В) При микроинъекции антител, меченых 1.4-ни частицами золота РСШ-вРР выявляется во всем объеме реплицирующихся хроматиновых доменов.

исключить влияние высокой степени конденсации хроматина на проникновение антител, был использован разработанный нами метод in-vivo иммуномечения, основанный на микроинъекции анти-GFP-Nanogold. На ультратонких срезах инъецированных клеток, находящихся в поздней S-фазе (как зафиксированных непосредственно 2.5% глутаральдегидом на буфере Зеренсена, так и предварительно пермеабилизованных в конденсирующем буфере) наблюдается интенсивное мечение дискретных ядерных доменов размером 200-350 нм, располагающихся на ядерной периферии или вокруг ядрышка. Важно отметить, что при in-vivo мечении частицы серебра распределялись практически равномерно в объеме меченого домена. Мы не наблюдали компактных агрегатов PCNA, окруженных немеченным хроматином. Это отчетливо видно как на ультратонких срезах, так и на стереоизображениях срезов толщиной 600 нм, включающих целые репликативные фокусы. Таким образом, наши наблюдения не укладываются в рамки модели «репликативных фабрик» - белковых комплексов, содержащих множество ДНК-полимераз, и окруженных хроматином, протягивающимся через фиксированные ДНК-полимеразы в ходе репликации.

3.3. Особенности структурной организации рано- и поздно-реплицирующихся доменов хроматина в составе митотиче-ских хромосом.

Для исследования структуры высших уровней организации митотиче-ских хромосом мы использовали разработанный нами метод повторяющегося гипотонического шока живых клеток с целью индукции деконденсации хромосом. Гипотоническое воздействие на митотические клетки выявляет поперечную дифференцированность хромосом (Howell, Hsu, 1979), а последующий возврат в нормотонические условия позволяет клеткам адаптироваться и возобновить движение по клеточному циклу. Повторный краткий гипотонический шок, воздействующий на клетки, достигшие митоза, выявляет в митотических хромосомах продольную неоднородность, соответствующую классическим G-бэн-дам. Короткие сроки инкубации в гипотонических растворах оказались пермиссивными и при возврате в нормотоническую среду через час после начала гипотонического шока клетки успешно адаптировались и возобновляли движение по клеточному циклу. Митотическая активность восстанавливалась через 3 часа, хотя митотический индекс снижался до 40% от контроля. Также через 30 мин востанавливался синтез ДНК в клетках, находившихся в S-фазе в момент гипотонического шока. Более того, по данным прижизненных наблюдений за клетками, эксперссирующими GFP-PCNA, репликация возобновлялась в тех же репликативных сайтах, которые были сформированы до начала гипотонического воздействия. Анализ динамики клеточного цикла, проведенный при помощи экспериментов с отложенной меткой, показал, что продолжительность S-

Рис. 5. Репликативные сайты, соответствующие рано реплицирующимся доменам хроматина локализуются преимущественно на периферии хромосом, полученных после двойной гипотонической обработки,. (А) ДНК окрашена бромистым этидием (красный), (Б) места включения БрдУ (зеленый), (В) наложение. Масштаб: 10 мкм.

фазы значительно не изменялась после гипотонического воздействия, однако наблюдалась существенное (примерно на 4 часа) удлинение 02-фазы.

На распластанных препаратах митотических хромосом, приготовленных с использованием 15% раствора Хэнкса вместо стандартного 75 мМ KCl, мета-фазные хромосомы выглядят сильно деконденсированными и не обнаруживают признаков продольной или поперечной неоднородности. Аналогичная обработка митотических хромосом, образовавшихся после реадаптации клеток к первому гипотоническому шоку, вызывает дифференциальную деконденсацию хромосом, в составе каждой хроматиды которых без дополнительных обработок выявляются отчетливые аксиальные глобулы, располагающиеся симметрично в сестринских хроматидах. Рисунок расположения аксиальных гранул маркерных хромосом выявил частичное соответствие этих структур G-бэндам, при этом наблюдалось 30%-ное удлинение хромосом по сравнению с контролем. По-видимому, удлинение хромосом и выявление аксиальных гранул связаны с дифференциальной деконденсацией хромосом, в результате чего менее устойчивый к гипотоническому воздействию материал R-бэндов деконденсируется, тогда как матерал G-бэндов остается относительно более компактным. Мы предполагаем, что данный эффект может быть связан с частичной экстракцией

Й А\ * • г 1 . V < % " Ъ ' С ■'; , > Л * ; •Л, 1? <* $ * • «•• V л К 5*" ' / ' 4 ^с/ *

Л А • - V <£ Б

Рис. 6. Репликативные сайты, соответствующие позднореплицирующимся доменам хроматина, демонстрируют преимущественно осевую локализацию в хромосомах, полученных методом двойной гипотонической обработки. (А) ДНК окрашена бромистым этидием (красный), (Б) места включения БрдУ (зеленый), (В) наложение. Масштаб: 10 мкм.

и/или перераспределением структурных белков хроматина. Необычный ответ митотических хромосом, образовавшихся в процессе компактизации такого структурно модифицированного хроматина, на повторное гипотоническое воздействие показывает, что эти изменения хроматина сохраняются в течение интерфазы и сказываются на характере компактизации или структурной стабильности хромосом в митозе.

Окрашивание таких хромосом бромистым этидием выявляло отчетливо видимое гало ДНК-содержащего материала, окружающее сестринские хромати-ды. Такое гало выявлялось исключительно в препаратах полученных после двойной гипотонической обработки. При анализе топологии рано- и поздно реплицирующегося хроматина в дифференциально деконденсированных хромосомах обнаружилось, что большинство рано реплицирующихся сайтов выявлялось в периферическом гало, окружающем хромосомы, или в пространстве между двумя сестринскими хроматидами, тогда как поздно реплицирующиеся домены располагались в осевых районах хромосом. Двойная гипотоническая обработка, вызывающая частичную деконденсацию хромосом, приводит также

к пространственному разобщению индивидуальных репликативных сайтов, выявляя гетерогенную структуру таких доменов. Таким образом, полученные нами данные вполне соответствуют гипотезе о композитной организации многих больших репликативных сайтов (Berezney et al. 2000, Koberna et al, 2005). В контрольных препаратах, приготовленных по стандартной методике, рано- и поздно реплицирующиеся домены демонстрировали одинаковое расположение относительно хромосомной оси.

Причина поперечной (и продольной) дифференцированное™ хромосом может состоять в различиях молекулярной организации G- и R-бэндов, в частности, различные по составу ансамбли структурных белков хроматина могут обеспечивать компактизацию ДНК рано- и позднореплицирующихся районов хромосом, функционируя в качестве «скрепок», стабилизирующих высшие уровни организации хромосом. Выход рано реплицирующеся хроматина в гало при двойной гипотонической обработке может быть следствием более высокой чувствительности «скрепок», поддерживающих структуру R-бэндов, к гипотоническому воздействию. В качестве возможных кандидатов на роль таких скрепок можно рассматривать конденсины. Поскольку распределение конденсинов I и II отчасти симулирует продольную дифференцированность хромосом (Опо et al, 2004), можно предположить, что они (или другие структурные белки, прямо или опосредованно рекрутируемые конденсинами (Hudson et al, 2003)), определяют поперечную дифференцированность хромосом и различия в пространственной организации хроматина G- и R-бэндов в деконденсированных хромосомах.

3.4. Динамика высших уровней организации хроматина при

активации транскрипции.

Для исследования поведения хроматиновых доменов высшего порядка при активации транскрипции была разработана модельная система, позволяющая визуализовать искусственные хромосомные локусы, содержащие индуци-бельные гены, при помощи взаимодействия 1ас-оператор/1ас-репрессор. Для этого были созданы генетические конструкции, в которых 256 копий тандемных повторов лак-оператора и ген устойчивости к канамицину/неомицину были фланкированы 19 п.н. сайтами узнавания транспозазы Тп5. Транспозицию данных конструкций в ВАС-клоны, содержащие гены дигидрофолат-редуктаза (DHFR) мыши и человеческие гены металотионеина и белка теплового шока Hsp70, существляли in vitro при помощи очищенной транспозазы Тп5 и трансформировали рекомбинантные хромосомы в E.coli. Сайты интеграции транспо-зонов определяли путем секвенирования ДНК.

Таблица 1. Изменение уровня экспрессии трансгенных конструкций при активации транскрипции

НБР70_5

контроль Тепловой шок

эндогенный трансген эндогенный трансген

Относительный 1 0.6±0.11 140±23 200±56

уровень мРНК

На одну копию 1 0.14±0.02 140±23 45±12

МТ1 14 __ DHFRD102

контроль Zn+2 2 часа Zn+2 16 ч Контроль (log-фаза) GO

Относительный 1 2.9±0.14 51±8.3 1 0.31±0.046

уровень мРНК

Каждую рекомбинантную ВАС трансфицировали в клетки СНО DG44, стабильно экспрессирующие химерный белок EGFP- димер лак-репрессора-NLS, отбирали стабильные клоны, содержащие несколько интегрированных копий трансгена на ядро, располагающихся в виде серии GFP-позитивных точек.

Преимущества разработанного нами экспериментального подхода с использованием ВАС состоят в том, что он дает возможность изучения структурных преобразований высших уровней организации хроматина при активации транскрипции в системе, наиболее точно соответствующей поведению натив-ных генов в их естественном хроматиновом контексте. Сравнение уровней экспрессии и степени индукции транскрипции эндогенных генов и ВАС трансгенов, при помощи количественной РТ-ПЦР с использованием видоспецифичных праймеров, при перерасчете на одну копию трансгена, показало, что после индукции эндогенные и трансгенные копии генов демонстрируют сходные уровни активности (см. таблицу 1).

Параллельно мы провели сравнительный анализ структурной организации высших уровней компактизации хроматина до и после индукции транскрипции во всех трех трансгенных линиях. Для этого на светооптическом уровне были измерены изменение числа GFP-позитивных точек, а также определена контурная длина кривой, соединяющей все точки (см. таблицу 2). Оказалось, что средняя степень компактизации в неиндуцированных трансгенных локусах была в 25-50 раз выше, чем расчетный линейный коэффициент компактизации 30-нм фибриллы хроматина. 1.5-3-кратная деконденсация, наблюдаемая в результате индукции транскрипции, дает в результате коэффициент компактизации около 175, что все еще в несколько раз выше, чем компактизация 30-нм фибриллы. Полученные данные не исключают возможности того, что активно транскрибирующеся гены в составе трансгенной

Таблица 2. Изменения степени компактизации трансгенных локусов при активации транскрипции

Трансгенная линия DHFRD10 2 Hsp70_5 МТ1_1_4

, Копийность (QPCR) 13(10-16) 10(8-14) 9(7-11)

Копийность (Fiber- 11/12/11 9--12

FISH) ; !

Размер ВАС (т.п.н) ! 187.1 192.6

Средняя контурная 0.65 0.52

длина локуса (контроль, мкм)

Коэффициент 1125 1200

компактизации (контроль)

Средняя контурная ; 1.4 1.51

длина локуса (после активации, мкм)

Коэффициент 520 410

компактизации (после активации) I

конструкции образуют сильно деконденсированные петли ДНК, «выпетливающиеся» наружу из высоко конденсированной «коровой» фибриллы хроматина высшего порядка (хромонемы), содержащей повторы лак-оператора. Для проверки этой возможности был проведен анализ взаимного расположения повторов лак-оператора и ВАС методом двухцветной FISH. Метка лак-оператора обычно локализовалась колинеарно с последовательностями ВАС и обычно демонстрировала высокую степень колокализации с последней. Мы не наблюдали выпетливания участков ДНК ВАС на заметное расстояние от линейного «остова» трансгенного локуса (рис.7).

Далее мы использовали метод in vivo иммуномечения для визуализации структурной организации DHFR трансгенов в клетках линии BIO и В9, используя моноклональные антитела против GFP. В полном соответствии с наблюдениями, полученными при помощи 3D-FISH, мы обнаружили локусы лак-репрессора в составе структур высшего конденсированного хроматина, соответствующих элементам хромонемы толщиной 100-130 нм (рис. 7).

Чтобы выяснить, является ли транскрипционая активность гена необходимым условием декомпактизации высших уровней упаковки хроматина, был проведен ингибиторный анализ поведения трансгенов, содержащих Hsp70 или МТ ВАС с использованием альфа-аманитина и 5,6-

16-18

185.2 0.69

1550

0.98

1090

Б щ ¡3 s ..¡^■мррж •* шш » * • ь • * » к , -

• * * • 9м* - ч

200 nm •

Рис.7. А). Повторы лак-оператора и участки ВАК, содержащие транскрибирующиеся гены, сохраняют колинеар-ность при активации транскрипции., Б) Хроматин, содержащий транскрибирующиеся локусы, сохраняет хромонемную структуру.

дихлоро-1 -бета-О-рибобензимидазола (DRE). При действии альфа-аманитина даже в условиях активации транскрипции трансгенных локусов степень их компактизации несколько увеличивается по сравнению с неиндуцированными контрольными клетками, что можно объяснить ингибированием

конститутивного уровня экспрессии. При использовании DRB степень

деконденсации была существенно ниже, чем в необработанных DRB клетках при индукции Hsp70. Для МТ ВАС статистически достоверных отличий в степени компактизации трансгенного локуса в контрольных неиндуцированных клетках и в клетках, обработанных Zn в присутствие DRB, обнаружено не было. Поскольку ген Hsp70 находится в активированном состоянии и с ним постоянно связана РНК полимераза II (Price, 2008), различия в поведении трансгенов при действии этих ингибиторов могут быть связаны с наличием РНК полимеразы на промоторе гена Hsp70. Присутствие DRB, не влияющее на связь РНК полимеразы с промотором, таким образом, не препятствует инициации транскрипции после теплового шока.

Рис.8. РНК-Р1БН с зондами против гена ОНРК (В) показывает, что практически все копии в составе тандемных повторов ИНКЕ ВАС, интегрировавшихся в хромосому, являются транскрищионно-активными.(Б) Ьас-репрессор-СРР, (Г) совмещение.

А se 35

• i ..

• i 1 . V

Поскольку уровень экспрессии исследованных трансгенов оказывается в несколько раз ниже, чем у соответствующих эндогенных генов, мы оценили долю активных генов в составе исследуемых трансгенных локусов при помощи PHK-FISH. Гибридизационный сигнал при этом выявлялся в тесной ассоциации с большинством GFP-позитивных сайтов локализации повторов лак-оператора. Также часто наблюдалась частичная или полная колокализация гибридизационного и GFP-сигналов. Таким образом, активация транскрипции, по-видимому, происходит в большинстве индивидуальных копий трансгена вне зависимости от локальной степени компактизации. Также PHK-FISH-анализ показал, что экспрессия Hsp70 начинается в 90% клеток через 5 мин после начала теплового шока, тогда как деконденсация высших уровней компактизации хроматина трансгенного локуса наблюдается лишь спустя 10-30

мин.

При индукции трансгенные локусы DHFR и МТ-ВАС как правило принимали линейную конфор-мацию, гда как в случае активации гена Hsp70 тепловым шоком в течение 30 мин значительная часть Hsp70 трансгена приобретала специфическую форму полукруга. Более того, при длительных тепловых воздействиях (30-40 мин) транскрипты аккумулировались в ДАПИ-негативной области, которую охватывала цепочка GFP-позитивных точек (рис. 6). Иммунофлуоресцентная микроскопия показала, что Hsp70 трансгены, в отличие от DHFR и МТ трансгенов, тесно связаны с ядерными доменами, соответствующими кластерам интерхроматиновых гранул (nuclear speckles), окрашиваемыми антителами против SC-35 и ASF/SF2 (рис.9). Такая ассоциация характерна для всех независимо полученных клеточных линий, содержащих Hsp70 трансген (но не для DHFR и МТ-трансгенов). In vivo иммуномечение золотом лак-репрессора-GFP в составе Hsp70 ВАС трансгена демонстрирует расположение повторов лак-оператора на периферии кластеров интерхроматиновых гранул. Анализ пространственного расположения трансгенов относительно кластера интерхроматиновых гранул на стереоизображениях срезов толщиной 0.5 мкм или на сериях наклонных проекций показывает их локализацию в области аморфного фибриллярного материала, окружающего плотный центральный гранулярный домен. Сочетание иммунофлуоресценции и РНК-

Рис. 9. Активация транскрипции трансгенного локуса, содержащего гены теплового шока, стимулирует ассоциацию трансгена (зеленый) с кластерами интерхроматиновых гранул (красный). До (А) и после активации (Б)

FISH подтверждает, что аккумуляция транскриптов Hsp70 происходит внутри SC-35-иозитивных ядерных доменов на более поздних сроках после начала тепловой обработки. Индекс ассоциации увеличивался с 47% до 85% в течение 30 мин после теплового шока, тогда как средний размер ближайшего кластера оставался относительно стабильным. Это можно объяснить перемещением Hsp70 трансгена к уже существующему кластеру. Чтобы исследовать это явление более подробно, была проведена серия экспериментов по прижизненному наблюдению за клетками в процессе активации гена теплового шока. Для этой цели клетки, несущие трансгенную конструкцию Hsp-70 ВАС и экспрессирую-ще СРР-димер-Ьас-репрессора, были трансформированы плазмидой, кодирующей mRFP-ASF/SF2.

Наблюдения за живыми клетками в процессе индукции тепловым шоком показали, что наиболее часто происходит образование новых кластеров по соседству с трансгеном или увеличение размеров предсуществующих соседних кластеров, однако в некоторых случаях происходило также и перемещение трансгенов по направлению к кластеру, причем это перемещение иногда осуществлялось на довольно значительные расстояния. При этом низкая частота наблюдавшихся перемещений трансгена по направлению к кластеру ИХГ может быть следствием фотоингибирования (Chuang et al, 2006). Действительно, в тех

Рис. 10. Модель структурных преобразований высших уровней компактизации хроматина при активации транскрипции. Слева — классическая схема, постулирующая полную деконденсацию транскрибирующегося локуса (зеленый) и его взаимодействие с транскрипционными комплексами (синий), фиксированными на ядерном матриксе, справа — модель активации транскрипции в контексте высших уровней организации хроматина.

случаях, когда мы наблюдали такое перемещение, оно происходило в самом начале периода наблюдений, т.е. до достижения ингибирующего порога. Характерно, что локусы, меченые вИР, оставались на поверхности и не погружались в глубину кластера.

Экспериментальная модель, использованная в данных экспериментах, дала возможность проанализировать локальную динамику транскрибирующихся локусов. Мы использовали прижизненные наблюдения для визуализации подвижности индивидуальных вРР-позитивных точек, принадлежащих к одному хромосомному субрегиону, относительно друг друга. Была обнаружена сходная быстрая, но ограниченная подвижность трансгенов в секундной временной шкале. Поскольку множественные точки, соответствующие колинеарно интегрированным копиям ВАС, двигались друг относительно друга, в то же время сохраняя свою колинеарность, очевидно, что наблюдаемая подвижность не является следствием перемещения всего хромосомного субрегиона или целого ядерного субдомена, а отражает локальную подвижность или конформационные изменения хромосомных доменов размером в несколько сотен тпн относительно фланкирующих цис-последовательностей. Поскольку практически все копии трансгена демонстрируют транскрипционную активность и ОБР-позитивные точки в составе БИРИ. ВАС трансгенного локуса колокализуются или контактируют с сайтами расположения транскриптов, а ген БНРЯ транскрибируется полностью за 10 мин, наши наблюдения не соответствует предсказаниям моделям, согласно которым транскрипция происходит на статичном ядерном матрик-се или на транскрипционных фабриках, заякореных на ригидном ядерном скелете. По-видимому, транскрипционная машинерия совершает подобные движения вместе с транскрибирующимся хроматином, и любые локальные взаимодействия с неподвижными ядерными струкграми являются весьма динамичными, если вообще такие взаимодействия и такие статичные структуры существуют в живой клетке (рис.10).

В целом, полученные данные демонстрируют тесную связь между декон-денсацией высших уровней организации хроматина эухроматических районов хромосом и актвацией транскрипции с базального до активированного уровня. Деконденсация, однако, не является абсолютно необходимой для транскрипции, тогда как транскрипция сама по себе, или по крайней мере компоненты транскрипционной машинерии, могут быть необходимыми факторами деконденса-ции. Таким образом, функциональная роль высших уровне организации хроматина может состоять в обеспечении тонкой настройки системы транскрипции посредством контроля крупномасштабной деконденсации хроматиновых локусов и/или ассоциации с ядерными субдоменами (такими, как кластеры ИХГ).

3.5. Высшие уровни упаковки хроматина, выявляемые в ходе

естественной компактизации хромосом в митозе.

Ядра клеток, находящихся в фазе G2, демонстрируют практически равномерное распределение хроматина в объеме ядра с элементами фибриллярных структур с размерами, находящимися за пределами разрешающей способности светового микроскопа. Просвечивающая электронная микроскопия ядер в G2-фазе выявляет эти фибриллярные элементы (хромонемы) более четко. Толщина хромонем в этих ядрах составляет около 80 нм. Реконструкция по серийным ультратонким срезам толщиной 30-40 нм показывает, что эти обособленные фибриллярные элементы могут быть прослежены на протяжение 0.5-1 мкм. Анализ проекций нескольких ультратонких срезов общей толщиной около 0.5 мкм выявил многочисленные участки, в которых хромонемные фибриллы неплотно упакованы в линейные структуры толщиной 0.2-0.4 мкм или более крупные агрегаты.

Первые видимые признаки конденсации состоят в индивидуализации и пространственном разобщении этих локальных агрегатов хроматина. При этом становятся более четко видны индивидуальные хроматиды, визуализуемые как линейные структуры. Характерным признаком ранней стадии профазной конденсации является общий коллапс хроматина по направлению к ядерной периферии и появление значительных зон внутри ядра, свободных от хроматина. Дальнейшая компактизация приводит к формированию легко различимых компактных хромосом, в составе которых еще можно различить хромонемные элементы толщиной около 80 нм (рис. 11). Однако в целом упаковка хроматина остается гетерогенной, и индивидуальные хромосомы, а также разделенные сестринские хроматиды, невозможно проследить на большом расстоянии.

Клетки в ранней профазе составляют 10 и 35% через 7 и 13 часов после выхода из блока на границе G1/S, тогда как число клеток с типичной интерфазной структурой хроматина снижается с 85% до 50%.

Переход от ранней к средней профазе соответствует формированию четко различимых хромосом, которые можно проследить как индивидуальные линейные структуры с равномерной упаковкой а протяжение нескольких мкм (рис.11). На стадии средней профазы хромосомы тесно контактируют с ядерной оболочкой. Толщина хромосом на этой стадии составляет 0.4-0.5 мкм, что несколько меньше чем у более рыхло упакованных хромосом в ранней профазе. Во многих районах хромосом на светооптическом уровне можно различить сестринские хроматиды, однако выявление сестринских хроматид на ультратонких срезах более затруднительно. Ультраструктурный анализ также выявил в составе конденсирующихся хромосом фибриллы хроматина толщиной около 100 нм, особенно на трехмерных реконструкциях протяженных серий (67 срезов по 80 нм каждый), где можно наблюдать сегменты таких фибрилл в областях с относительно более низкой степени компактизации.

Рис 11. Хромонемные элементы выявляются на всех этапах профазной компактизации. (А) Фаза С2. Компьютерная проекция 5 ультратонких срезов толщиной 35 нм (общая толщина 175 нм. Стрелки указывают на крупные домены конденсированного хроматина, маленькие стрелки — на распрямленные хромонемные фибриллы. В некоторых случаях в составе структурных элементов толщиной 200 нм видны рыхло уложенные хромонемы (стрелки). (Б-Г) Ранняя профаза. Формирующиеся хроматиды состоят из хромонемных элементов (стрелки). (Д-3) Средняя профаза. Компьютерная проекция 11 срезов толщиной 80 нм каждый (Д) и индивидуальный срез (Е) показывают отдельные хромонемные элементы (стрелки). На проекции трех ультратонких срезов (Ж) и отдельном срезе (3) видны упакованные 100-130 нм хромонемы в составе 200-250 нм хроматиды. Масштаб: 0.5 мкм (длинный) и 0.2 мкм (короткий отрезок).

Поздняя профаза характеризуется увеличением диаметра хромосом примерно вдвое (до 0.8-1 мкм). Сестринские хроматиды на этой стадии все еще находятся в плотном контакте, однако их удается различить, когда хроматиды лежат в плоскости среза. Плечи хроматид однородны по толщине, поперечные сечения хромосом также выглядят равномерно конденсированными, однако на периферии хромосом, а также на тангентальных срезах, четко выявляются элементы высших уровней упаковки толщиной 100-130 нм. Средний диаметр хроматиды составляет 0.4 мкм, что примерно в два раза меньше, чем в метафазе (0.6-0.8 мкм), тогда как в средней профазе толщина хроматид составляет примерно 0.2-0.3 мкм.

Описанные выше ранние этапы конденсации хромосом хорошо соответствуют модели иерархической упаковки хромосомы, согласно которой хромати-новые фибриллы толщиной 30 нм укладываются в фибриллярные структуры высшего порядка. Последние, в свою очередь, компактизуются с образованием митотических хромосом.

Таким образом, в профазе митоза наблюдается 3 процесса: (1) формирование хромонем; (2) частичная сегрегация сестринских хроматид и (3) укорочение и утолщение хромосом (описываемые как компактизация или конденсация). При этом образование метафазной хромосомы сопровождается формированием как минимум двух помежуточных уровней компактизации: 200-250 нм и 400 нм фибриллы.

Вопрос о молекулярном механизме конденсации остается открытым. Отсутствие высокой степени упорядоченности в структурной организации хромосом на ранних стадиях компактизации неизбежно требует, чтобы в основе процесса компактизации лежали несимметричные молекулярные механизмы, возможно, обеспечиваемые участием негистоновых белков. По данным литературы, наиболее вероятными кандидатами на роль архитектурных компонентов являются мажорные негистоновые белки хромосом: конденсины и топоизомера-за И. В то же время, следует учитывать и важнейшую регуляторную роль двухвалентных катионов (в частности, ионов Са++), влияние которых на структур хроматина in vitro детально документирована, хотя механизмы их действия in vivo остаются невыясненными.

3.6. Роль ионов Са в стабилизации высших уровней компактизации ДНК.

Нами была разработана экспериментальная модель, позволяющая контролировать реконструкцию хромосом in vivo при помощи физиологических концентраций ионов Са. В основе данной модели лежит предположение, что обработка живых клеток низкими концентрациями глутарового альдегида (0.001%) приводит к тому, что клетки теряют способность к восстановлению нормальной концентрации Са, сниженной в результате гипотонического воздействия. Поскольку вхождение Са в клетку регулируется трансметилированием фосфати-

дилэтаноламина в цитоплаз-матическом листке плазматической мембраны (воскаи сЧ а1., 1985), модификация фос-фатидилэтаноламина глюта-ральдегидом предотвращает этот процесс и сопровождающую его активацию быстрых Са-канапов. Анализ реакции хромосом на гипотоническое воздействие в условиях модификации мембран, а также характер структурных перестроек, индуцированных восстановлением физиологических концентраций Са++ при помощи селективных ионофоров (например

А23187), таким образом, может дать информацию о роли внутриклеточного Са в стабилизации их структуры.

Через 5 мин после начала инкубации клеток в гипо-тоничной среде (30% раствора Хэнкса) хромосомы на све-тооптическом уровне выглядят сильно деконденсирован-ными, но по мере адаптации клеток наблюдается рекон-

--денсация хромосом и через

20-30 мин после начала воздействия хромосомы выглядят достаточно плотными и мало отличаются по морфологии от контроля. Однако гипотоническое воздействие оказывает дезорганизующее влияние на митотический аппарат в целом, что выражается в разрушении микротрубочек веретена деления. Вследствие этого наблюдается распад метафазной пластинки и случайное распределение хромосом по клетке. Перенос адаптированных к гипотоническим условиям клеток в нормальную среду культивирования приводит к их резкому сжатию. Таким образом, гипото-ничная среда после адаптации становится для клеток «нормотоничной», а нормальная среда культивирования — гипертоничной.

Рис. 12. Ультраструктура митотических хромосом в живых клетках СПЭВ после гипотонического воздействия. (А) контроль, (Б) 5 мин, (В) 30 мин. Масштаб: 0.5 мкм

На ультраструктурном уровне, деконденсация хромосом выражается в практически полному разворачиванию всех высших уровней компак-тизации ДНК. Хромосомы представлены только рыхло упакованными фибриллами толщиной 10 нм. В процессе адаптации к гипотоническому шоку общая плотность упаковки хроматиновых фибрилл в митотических хромосомах возрастает, что сопровождается укладкой нуклеосомных фибрилл в 30-нм фибриллы хроматина, а через 2030 мин после начала гипотонического шока наблюдается восстановление фибрилл высшего по-

Модификация клеточной мембраны глутаральдегидом не изменяет первичную реакцию клеток на гипотонический шок. В первые 5 мин воздействия клетки сильно набухают, а митотические хромосомы деконденсируются и значительно теряют свою плотность. Главные различия между контрольными и обработанными глютаровым альдегидом клетками наблюдаются на стадии адаптации. Через 15-30 мин гипотонического воздействия восстановления структуры хромосом в последних не происходит, и хромосомы остаются деконденси-рованными. Однако перенос клеток, обработанных глутаровым альдегидом, в нормотоническую среду приводит к их быстрому сжатию, что говорит об активной адаптации клеточной мембраны к гипотонии и нормальном функционировании систем транспорта ионов в целом.

Восстановление структуры хромосом в клетках, обработанных глутаровым альдегидом, можно стимулировать обработкой кальциевым ионофором А23187. При добавлении ионофора в концентрации 1 мкМ через 15-20 мин после начала действия гипотонического шока происходит быстрая реконденсация хромосом и восстановление структуры хромонемных элементов, что указывает на возможную роль ионов Са в формировании и поддержании структуры высших уровней организации хромосом in vivo. Отсюда также следует, что гипото-

Рис. 13. В присутствии 0.001% глуарового альдегида реконденсация хромосом блокируется (А). При добавлении Са-ионофора А23187 происходит быстрое восстановление компактной структуры хромосом (Б).

рядка — хромонем диаметром около 100 нм (рис.12).

ническое воздействие на живые клетки должно приводить к изменениям внутриклеточной концентрации Са, и эти изменения должны коррелировать с изменениями структурного состояния хромосом. Измерения внутриклеточной концентрации Са++ при помощи красителя Fura-2 показало, что снижение осмолярности среды сопровождается резким падением концентрации свободного Са, однако затем по мере адаптации уровень Са возвращается на исходный уровень в течение 5-10 мин. В присутствие глютарового альдегида подобного восстановления не наблюдалось, и пониженная концентрация Са сохранялась в течение по крайней мере 20 мин. Добавление ионофора А23187 приводило к резкому повышению концентрации Са до уровня, превышающего исходный, что коррелирует с быстрой реконденсацией хромосом.

Можно предложить по крайней мере два объяснения тому факту, что в живых клетках физиологических концентраций Са достаточно для поддержания хроматина в конденсированном состоянии. Во-первых, в живых клетках эффект Са может быть опосредован специфическими Са-связывающими структурными белками хроматина, которые непрочно связаны с хроматином и легко экстрагируются в процессе выделения хромосом и ядер. Во-вторых, действие Са может быть основано на его участии в регуляции энзиматических систем, например, протеинкиназ, фосфорилирующих гистоны. Однако, вне зависимости от того, каков механизм действия Са, важным является то, что высшие уровни организации хроматина, образующиеся в результате действия ионофора А23187, полостью соответствуют структурным элементам хроматина, наблюдаемым in situ. Это свидетельствует в пользу адекватности используемых условий для стабилизации хроматина in vitro и правомерности экстраполяции данных ультраструктурного анализа изолированных хромосом и ядер на нативную организацию хроматина in vivo.

3.7. Роль конденсинов в структурной организации митотических хромосом.

Для анализа роли конденсинов в компактизации хромосом в митозе важно установить хронологию ассоциации архитектурных белков хромосом с конденсирующимися профазными хромосомами и их пространственную локализацию. В клетках, находящихся в <32-фазе, топоизомераза II alpha распределяется в объеме ядра более или менее диффузно, за исключением нескольких ярких фокусов, соответствующихся реплицированным центромерам (Rattner et al, 1996). В противоположность топоизомеразе II, SMC2 локализуется в виде мелких точек, часто концентрирующихся на периферии масс конденсированного хроматина. На этой стадии колокализации SMC2 и топо II практически не наблюдается.

В ранней профазе окрашивание SMC2 более отчетливо концентрируется в мелких фокусах, ассоциированных с периферией хромосом. На этой стадии короткие параллельно лежащие линейные БМС2-позитивные структуры начинают выявляться на поверхности хромосом. Топоизомераза II распределяется более

A v .1 / *».•• <~ * i 1 в" V, •'4V» , Л**1 [ЧД (V Б - íl » • * к * * * * i — - V в . . . - 1 v *«.» . ** • ж

т. я. ] '•Л • 4 J им тли* 1тС i ¿\*' ш 63

DAPI SMC2 ♦' • » 1 * > » 1 ^ > * а TOPO " « % i .* ., w ш

Рис.14. Распределение БМС2 и топоизомеразы II в средней профазе. (А) ДАПИ (зеленый) и 5МС2 (красный); (Б) ДАПИ (зеленый) и топоизомераза II (красный); (В) топоизомерза II (зеленый) и БМС2 (красный). Стрелки указывают на области, увеличенные на врезках. В средней профазае окраска 5МС2 и топоизомеразы II начинают частично совпадать, формируя колинеарные участки, расположенные преимущественно на поверхности хромосом (А-В, врезки, короткие стрелки).

диффузно, чем SMC2. Однако, в отличие от G2, в ранней профазе часто наблюдается колокализация 8МС2-позитивных фокусов с парными фокусами топоизомеразы II, соответствующим центромерам. Вне центромерных районов топо II и SMC2 практически не колокализуются.

В средней профазе колокализации SMC2 и топоизомеразы II становится еще более выраженной, но SMC2 в большей степени локализуется на периферии конденсированных участков хромосом. Области колокализации включают протяженные (до 1-2 мкм) линейные окрашенные структуры, которые преимущественно располагаются на периферии хромосом. Интересно, что в некоторых случаях линейные сегменты топо II и SMC2 располагаются параллельно друг другу, но не колокализуются полностью, и только в центромерных районах яркие точки топо II и SMC2 полностью совпадают.

Только в поздней профазе колоклизация топо II и конденсинов становится очевидной во всех областях ядра. Tono II в основном концентрируется в центромерах, но также четко видно окрашивание топо II и SMC2 вдоль плеч хромосом. При этом наблюдается как периферическая, так и осевая локализация этих окра-

Рис. 15. Аксиальная локализация БМС2 в метафазных хромосомах. Стереопары полутонких срезов изолированных метафазных хромосом, окрашенных Nanogold-кoнъюгamaмu антител с серебряным усилением, выявляют осевое распределение $МС2 в виде зоны шириной 0.15-0.2 мкм

шенных зон, а к началу метафазы осевая локализация топоизомеразы II и SMC2 становится очевидной. В полностью компактизованных хромосомах топо II и SMC2 демонстрируют высокую степень колокализации. Иммуноэлектронная микроскопия нативных метафазных хромосом позволила выявить внутри метафазных хромосом зоны окрашивания антителами против SMC2 шириной 0.150.2 мкм, что составляет примерно одну треть от общего диаметра хроматиды (0.5 мкм).

Таким образом, в ходе митотической компактизации хромосом наблюдается корреляция между морфологическими изменениями хромосом и динамическим перераспределением топо II и 8МС2-субъединицы конденсина. При этом первичное распределение топо и SMC в значительной степени связано с поверхностью компактизующихся хромосом, за исключением центромерных районов. Перераспределение этих белков с периферии в осевые области хромосом происходят значительно позже, чем завершается формирование равномерно упакованных хромосом со сформированной осью, характерное для средней профазы.

3.8. Исследование поведения конденсииов при искусственном изменении степени компактизации хромосом в живых клетках.

Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митоттеских клетках при искусственной декомпактигации хромосом в условиях обратимого гипотонического шока.

Искусственную деконденсацию хромосом в живых клетках вызывали инкубацией клеток в гипотонической среде (30% среды L-15). Поскольку такое воздействие является структурно обратимым (см. выше), можно установить связь между присутствием конденсинов и структурной целостностью митотиче-ских хромосом.

Обработка живых клеток 30% раствором среды L-15 в течение 5 минут вызывает частичную деконденсацию митотических хромосом, общая морфология хромосом при этом сохраняется. Через 15 минут инкубации начинается постепенная адаптация клеток к гипотонической среде, сопровождающаяся реконденсацией хромосом; примерно через 30 минут внешний вид хромосом близок к исходному. При этом в фазе деконденсации наблюдается частичный выход субъединиц конденсина ХСАР-Е и pEg7 в цитоплазму. В то же время, в осевых областях деконденсированных хромосом сохраняется повышенная концентрация конденсинов. Таким образом, деконден-сация хромосом in vivo не коррелирует с диссоциацией конденсинов, хотя нельзя исключить, что остающиеся связанными с хромосомами конденсиновые комплексы в этих условиях теряют активность и не выполняют своей функции стабилизации структуры хромосом. Через 30 минут после начала воздействия, когда наступает фаза реконденсации, антитела к pEg7 и ХСАР-Е перестают окрашивать хромосомы и выявляются преимущественно в цитоплазме. Однако диссоциация конденсинов не препятствует успешной реконденсации хромосом и восстановлению структуры хромонемных элементов. Таким образом, восстановление компактной структуры хромосом после гипотонического шока происходит без участия конденсинов, или по крайней мере, только незначительная доля популяции конденсинов, не выявляемая методами иммунофлуоресцентной микроскопии, остается связанной с митотическими хромосомами. Эти данные противоречат как общепринятым представлениям о конденсиновом комплексе как об интегральном компоненте хромосомного скэффолда, обеспечивающего специфическую радиально-петлевую организацию хроматина в интерфазных и митотических хромосомах (Gasser, 1995; Hirano, 1998), так и гипотезе о возможной энзиматической роли конденсинов, участвующих в активном реконфигури-ровании топологически замкнутых петлевых доменов хроматина в ходе конденсации хромосом (Kimura, Hirano, 1997; Kimura et al, 1999).

Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических клетках после

воздействия цитостатиков.

Для стабилизации хромосом в живых клетках в компактном состоянии длительное время использовали цитостатики нокодазол и таксол. Обработка нокодазолом приводит к деполимеризации микротрубочек, и полному разрушению митотического веретена, таксол, напротив, понижает критическую концентрацию полимеризации тубулина, что приводит к формированию дополнительных нецентросомальных фокусов полимеризации микротрубочек в цитоплазме митотических клеток и вызывает блок митоза вследствие нарушения обмена тубулина. При обработке клеток 0.5 мкг/мл нокодазола или 10 мкг/мл таксола в течение 6 часов происходило накопление метафазных клеток, при этом хромосомы в них сохраняли компактную структуру. В данных условиях не наблюдалось реверсии митоза, то есть перехода клеток в интерфазу без расхождения хромосом. При этом в клетках, обработанных нокодазолом, антитела к рЕ§7 и к ХСАР-Е перестают окрашивать хромосомы уже через 3 часа после начала воздействия. В клетках, инкубированных в среде, содержащей таксол, также наблюдается постепенный выход белков и

ХСАР-Е из митотических хромосом. В качестве контроля использовались антитела к топоизомеразе II, которая в метафазе локализуется вместе с конденсина-ми в осевых районах хромосом. Оказалось, что в этих условиях антитела успешно выявляют топоизомеразу II в осевых областях компактизованных хромосом, что делает маловероятным предположение об ограниченной диффузии антител против субъединиц конденсинового комплекса внутрь компактизованных хромосом.Данные наблюдения являются дополнительным аргументом против непосредственной структурной роли конденсинов в митотических хромосомах. Возможно, конденсины необходимы только на начальных этапах формирования высших уровней компактизации ДНК в митотических хромосомах, а не для стабилизации их макромолекулярной структуры, которая достигается в результате действия других структурных белков. Постоянное присутствие конденсинов на хромосомах в течение всего митоза может обеспечивать их пассивное перераспределение в дочерние ядра.

3.9. Конденсиновый комплекс в мейозе.

На стадии диплотены мейотической профазы I хромосомы амфибий приобретают конфигурацию «ламповых щеток», характерную наличием осевых структур, содержащих высококонденсированный транскрипционно неактивный хроматин, и отходящих от него петель хроматина, содержащих активно транскрибирующиеся гены. Хромосомные петли представлены сильно деконденсиро-ванными фибриллами хроматина, на которых размещены активно работающие РНК-полимеразы II. При этом, петли составляют лишь небольшую долю хромосомной ДНК, в то время как основная масса ДНК присутствует в компактной

форме в осевых районах хромосом-гомологов, каждый из которых представлен двумя сестринскими хроматидами, сохраняющими тесную когезию. Осевые районы демонстрируют линейную неоднородность в содержании хроматина, выражающуюся в формировании многочисленных последовательно расположенных гранул высококомпактизованного хроматина, называемых хромомера-ми, чередующихся с участками относительно менее плотной упаковки хроматина. Мы изучили внутриклеточную локализацию конденсинов в ооцитах Хепо-рив 1аеу1Б на стадии профазы мейоза I, обращая особое внимание на их взаимодействие с профазными хромосомами типа ламповые щетки.

Для исследования субклеточного распределения ХСАР-Е и рЕ§7, микрохирургическим методом были получены цитоплазматическая и ядерная фракции ооцитов и присутствие конденсинов в белковых экстрактах этих фракций было проанализировано методом Вестерн-блоттинга. Оба белка главным образом выявляются в цитоплазматической фракции ооцитов. Наиболее выраженную цитоплазматическую локализацию демонстрирует ХСАР-02, присутствие

которого в ядерном экстракте удалось выявить только при использовании большого стартового количества исследуемого материала, но небольшая фракция конденсинов присутствует и в ядре. Эти результаты согласуются с нашими данными о хронологии ассоциации конденсинов с профазными хромосомами в митозе, где также наблюдается существенное усиление флуоресцентного сигнала ассоциированного с хромосомами БМС2 при переходе от профазы к мета-фазе. Наличие значительного количества ХСАР-02 и ХСАР-Е в цитоплазме ооци-та, по-видимому, объясняется необходимостью накопления этих важнейших белков для обеспечения сегрегации геномов в ходе дробления. Далее мы исследовали внутриядерную локализацию ХСАР-Э2 и ХСАР-Е метода-

Р1 ХСАР-02

А Б

Мегде • В • • » » i Г 1 1 V т

Рис.16. Анализ распределения ХСАР-02 вдоль хромосомной оси. (А) Окраска иодистым пропидие (Р1) демонстрирует неравномерную компактизацию хрматина в осевой области хромосом, представленную компактными хромомерами, разделенными менее интенсивно окрашенными деконденсированными

межхромомерными участками. (Б) Хромомеры интенсивно окрашиваются антителами против ХСАР-Б2 (зеленый). (В-Г) совмещение.

ми иммунофлуоресцент-ной микроскопии в зародышевых пузырьках ооцитов на разных стадиях созревания (стадии III-VI). На всех четырех исследованных стадиях ХСАР-Б2 преимущественно обнаруживался в хромосомах типа ламповые щетки. Более детальный анализ распределения ХСАР-Б2 в хромосомах при помощи лазерной конфокальной микроскопии показал, что антитела против ХСАР-Б2 интенсивно окрашивали осевые районы хромосом и практически не выявляли данный белок в петлевых доменах. Анализ профилей интенсивности вдоль оси хромосом в двух флуоресцентных каналах (красный для ДНК (иодистый пропидий) и зеленый ХСАР-Б2 (БИС)) в протяженных сегментах хромосом (до 10 мкм) показал высокий уровень колокализа-ции, что свидетельствует о прямой корреляции между уровнем компактизации хроматина и концентрации ХСАР-Б2 в осевых районах хромосом.

В отличие от ХСАР-Б2, ХСАР-Е не обнаруживался в связи с мейотиче-скими хромосомами на III-VI стадиях созревания ооцитов. Эти ярко выраженные различия в характере локализации ХСАР-Е в митотических и мейотиче-ских хромосомах, вероятно, связаны с тем, что диплотенные хромосомы находятся на более ранней стадии компактизации. Действительно, по мере созревания ооцитов и компактизации мейотических хромосом ХСАР-Е постепенно появляется в составе последних. Тем не менее, различия в хронологии ассоциации различных субъединиц конденсинового комплекса с мейотическими хромосомами позволяет сделать вывод о том, что 8Б коровый комплекс и 11Б регулятор-ный комплекс в живых клетках могут существовать независимо друг от друга и сборка холокомплекса конденсина (по крайней мере, конденсина I) происходит не в цитоплазме, как предплагалось ранее, а непосредственно на хромосомах. При этом регуляторная субъединица pEg7/XCAP-D2, первой взаимодействую-

щие. 17. ХСАР-02 локализуется в тельцах Кахаля. На распластанных препаратах зародышевых пузырьков антитела против ХСАР-И2 (сыворотка С) интенсивно окрашивают матрикс телец Кахаля, но не выявляются в В-снурпосомах. Также наблюдается слабое окрашивание ядрышек. (А) дифференциальный интерференционный контраст. (Б) ХСАР-В2 (В) ДНК (окраска Рю^гееп), (Г) совмещение.

щая с хромосомами, рекрутирует остальные субъединицы. Отсутствие ключевых компонентов системы компактизации хроматина в мей-отических хромосомах на стадии диплотены, по всей вероятности, связано с тем, что хромосомы поддерживаются в достаточно декон-денсированном состоянии, тогда как конденсины и топоизомераза II участвуют на более поздних

этапах компактизации, или вообще не принимают участия в компактизации хромосом, а требуются в большей степени для разделения сестринских хроматид.

Помимо мейотических хромосом, мы обнаружили ассоциацию субъединиц конденсина с различными нехроматиновыми структурами ядра. Так, ХСАР-В2 выявляется в составе телец Кахаля, где он колокализуется с коилином в мат-риксе, и никогда не обнаруживается в В-снурпосомах. Функциональное значение ассоциации субъединиц конденсинов с тельцами Кахаля неясно, однако выявление в тельцах Кахаля белков, участвующих в репликации ДНК (В24, МСМЗ, сс1с21; Виол е! а1, 1993; А1Ьаш е! а1, 1998), предполагает, что функция телец Кахаля не ограничивается исключительно созреванием компонентов системы транскрипции и сплайсинга, но может включать и контроль сборки/созревания/модификации белковых комплексов, участвующих в ремоделировании хроматина.

Локализация ХСАР-Е в ядрышке подтверждает наши данные, полученные ранее на соматических клетках Хепорш ХЬ-2 (Тимирбулатова и др., 2003; игЬекоу й а1, 2003). Двойная окраска на ХСАР-Е и ДНК (с помощью высокочувствительного ДНК-специфичного флуорохрома РюоОгееп) показала, что ХСАР-Е в ядрышке не связан с рибосомной ДНК и таким образом не может участвовать в структурной организации рибосомных генов. В дальнейших экс-

Рис. 18. ХСАР-Е не связан с мейотическими хромосомами и локализуется перимущественно в ядрышках. (А) фазовый контраст (Б) ХСАР-Е (В) ДНК (окраска Р1^гееп), (Г) совмещение._

периментах были использованы антитела против маркерных белков гранулярного компонента (N038) и плотного фибриллярного компонента ядрышка (Иор-р180). Двойное окрашивание расправленных препаратов зародышевых пузырьков этими антителами и антителами против ХСАР-Е продемонстрировало высокую степень колокализации N038 и ХСАР-Е, тогда как сигналы ХСАР-Е и №р-р180 практически не перекрывались, что свидетельствует в пользу преимущественной ассоциации ХСАР-Е с гранулярным компонентом ядрышка. Эта ассоциация не нарушается при сегрегации ядрышек в ответ на ингибирование транскрипции под действием актиномицина Б или БИВ. Возможно, секвестри-рование 88 субкомплексов в ядрышке предотвращает их взаимодействие с регу-ляторными субъединицами, ассоциированными с профазными хромосомами и преждевременную сборку холокомплекса до завершения профазы I мейоза. Эта гипотеза хорошо согласуется с предложенной схемой двухступенчатой посадки конденсинового комплекса на хромосомы.

4. ВЫВОДЫ.

1. Митотическая компактизация хромосом — многостадийный процесс, сопровождающийся формированием двух промежуточных уровней упаковки хроматина: 200-250 нм и 400 нм фибрилл, образующихся путем иерархической укладки хромонем диаметром 100 нм.

2. Образование факультативного гетерохроматина при глобальная инактивации транскрипции Х-хромосомы сопровождается упаковкой хроматина в фибриллы диаметром 200-400 нм, при сохранении доступности внутренних областей хромосомной территории для трансфакторов

3. На ультраструктурном уровне гетерохроматиновые репликативные сайты представляют собой сегменты хроматиновых фибрилл высшего порядка. Индивидуальные реплисомы равномерно распределены в объеме реплицирующихся доменов, не образуя компактных реплика-тивных «фабрик». Репликация гетерохроматиновых локусов не требует полного разворачивания хромонемных фибрилл.

4. Поперечная дифференцированность митотических хромосом на периферическое гало и плотный осевой кор, выявляемая при помощи гипотонической обработки живых клеток, коррелирует с распределением эу- и гетерохроматина: транскрипционно-активный рано реплицирующийся хроматин располагается на периферии хромосом, а гетерохроматин занимает центральное положение.

5. Активация транскрипции эухроматических генов сопровождается частичной деконденсацией высших уровней упаковки хроматина и транскрипция может осуществляться на высококонденсированной матрице.

6. Транскрибирующиеся гены демонстрируют высокую локальную подвижность, что указывает на отсутствие ассоциации транскрипционных комплексов с ригидными скелетными структурами клеточного ядра.

7. Нарушение реконденсации митотических хромосом после гипотонического воздействия in vivo в результате блокады транспорта Са++ через плазматическую мембрану свидетельствует о роли физиологических концентраций Са++ в поддержании высших уровней организации хромосом.

8. Конденсины и топоизомераза II не принимают участия в формировании хромосомной оси в ходе профазной компактизации хромосом. Их роль в митотической компактизации хромосом связана со стабилизацией метафазных хромосом, возможно, путем рекрутирования других архитектурных хромосомных белков.

9. Нарушение связи конденсинов с метафазными хромосомами при индуцированной обратимой деконденсации, а также в процессе стабилизации конденсированного состояния хромосом при разрушении веретена деления свидетельствует о том, что конденсины не принимают участия в поддержании компактной структуры полностью сформированных хромосом.

10.В профазе мейоза I компактизация хроматина в осевых гранулах (хро-момерах) не требует присутствия 13S конденсина.

11.Сборка 13S конденсинового комплекса осуществляется непосредственно на хромосомах (по крайней мере, в мейозе), причем XCAP-D2, по-видимому, связывается с хроматином первым и обеспечивает рекрутирование остальных субъединиц.

12.Субъединицы конденсина локализуются в различных структурно-функциональных доменах ядра независимо друг от друга. ХСАР-D2 связывается в осевыми структурами хромосом и тельцами Кахаля, тогда как ХСАР-Е взаимодействует с гранулярным компонентом ядрышек.

Список научных статей, опубликованных по теме диссертации:

1. Belmont AS, Ни Y, Sinclair PB, Wu W, Bian Q, Kireev I. Insights into Interphase Large-Scale Chromatin Structure from Analysis of Engineered Chromosome Regions. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2010). 75: 453460.

2. Ни Y., Kireev I., Plutz M., Ashourian N„ Belmont AS. Large-scale chromatin structure of inducible genes: transcription on a condensed, linear template. J. Cell Biol. (2009), 185:87-100.

3. Kireev I, Lakonishok M, Liu W, Joshi VN, Powell R, Belmont AS. In vivo immunogold labeling confirms large-scale chromatin folding motifs. Nat Methods. (2008), 5(4):311-313.

4. Rego A, Sinclair PB, Tao W, Kireev I, Belmont AS. The facultative heterochromatin of the inactive X chromosome has a distinctive condensed ultrastructure. J Cell Sci. (2008), 121(Pt 7):1119-1127.

5. Novikov DV, Kireev I, Belmont AS. High-pressure treatment of polytene chromosomes improves structural resolution. Nat Methods. (2007), 4(6):483-485.

6. В.Ю. Поляков, О.В. Зацепина, И.И. Киреев, А.Н. Прусов, Д. Фаис, Е.В. Шеваль, Ю.В. Коблякова, С.А. Голышев, Ю.С. Ченцов. Структурно-функциональная модель митотической хромосомы. Биохимия (2006), 71(1):6-16.

7. Kobliakova I, Zatsepina О, Stefanova V, Polyakov V, Kireev I. The topology of early- and late-replicating chromatin in differentially decondensed chromosomes. Chromosome Res. (2005), 13(2):169-181.

8. Sheval EV, Kireev II, Polyakov VY. Stabilization of macromolecular chromatin complexes in mitotic chromosomes by light irradiation in the presence of ethidium bromide. Cell Biol Int. (2004), 28(12):835-843.

9. Kireeva N, Lakonishok M, Kireev I, Hirano T, Belmont AS. Visualization of early chromosome condensation: a hierarchical folding, axial glue model of chromosome structure. J Cell Biol. (2004), 166(6):775-785.

10.Prusov A.N., Kireyev I.I., Polyakov V.Yu. Visible light irradiation of ethidium bromide-stained interphase nuclei causes DNA-protein linking and structural stabilization of nucleoprotein complexes. Photochemistry & Photobiology (2003), 78 (6):592-598.

11.Beenders B, Watrin E, Leganeux V, Kireev I, Bellini M. Distribution of XCAP-E and XCAP-D2 in the Xenopus oocyte nucleus.Chromosome Res., (2003), 11:549-564.

12.Тимирбулатова Э.Р., Киреев И.И., Картавенко T.B., Гулак П.В., Поляков В.Ю., Ле Геллек К., Узбеков Р.Э. Исследование внутриклеточной локализации белка ХСАР-Е в клетках линии XL2 (Xenopus laevis) в норме и при ингибировании транскрипции и процессинга рРНК. Цитология (2003), 45:290-297.

13.Курчатова С.Ю., Филимоненко В.В., Гулак П.В., Киреев И.И., Поляков В.Ю., Гозак П. Индукция формирования ядерной оболочки вокруг индивидуальных хромосом под действием гипотонического шока. Цитология (2003), 45:298-307.

14.Uzbekov R, Timirbulatova Е, Watrin Е, Cubizolles F, Ogereau D, Gulak P, Legagneux V, Polyakov VJ, Le Guellec K, Kireev I. Nucleolar association of pEg7 and XCAP-E, two members of Xenopus laevis condensin complex in interphase cells. J Cell Sci. (2003); 116(Pt 9): 1667-1678.

15.Тимирбулатова Э.Р., Киреев И.И., Грабеклис C.A.,Гулак П.В., Jle Геллек К., Поляков В.Ю., Узбеков Р.Э. Внутриклеточная локализация конденси-нов XCAP-E pEg7 в норме и в условиях, вызывающих искусственное изменение структуного состояния митотических хромосом. Цитология (2002); 44(6):576-584.

16.ShevaI EV, Prusov AN, Kireev II, Fais D, Polyakov VY. Organization of higher-level chromatin structures (chromomere, chromonema and chromatin block) examined using visible light-induced chromatin photo-stabilization. Cell Biol Int. (2002), 26(7):579-591.

17.Chudinova EM, Kireev IL, Fais D, Gianguzza F, Giudice G, Morici G, Vorobjev LA, Poliakov VY. Noncanonical structural-functional organization of nucleoli in maturing oocytes of sea urchin Paracentrotus lividus. J Submicrosc Cytol Pathol. (2001), 33(3):301-311.

18.Шеваль E.B., Гулак П.В., Киреев И.И., Чудинова Е.М., Фаис Д., Джангуц-ца Ф., Поляков В.Ю. Особенности сегрегации «неканонического» ядрышка ооцитов морского ежа Paracentrotus lividus. Онтогенез (2001), 32(5):377-383.

19.Коблякова Ю.В., Киреев И.И., Стефанова Е.Н., Зацепина О.В., Поляков В.Ю. Дифференциальная деконденсация митотических хромосом культуры СПЭВ вызванное двойным гипотоническим шоком. Цитология (2001), 43(5):462-470.

20.111еваль Е.В., Прусов А.Н., Киреев И.И., Поляков В.Ю. Изучение структурных и структурно-функциональных субдоменов интерфазного ядра методом фотостабилизации. Цитология. (2001); 43(2):122-132.

21.Курчатова С.Ю., Прусов А.Н., Гулак П.В., Киреев И.И., Поляков В.Ю. Особенности взаимодействия белка анкоросом р68 с ядерной оболочкой в клеточном цикле. Онтогенез (2000), 31(6):429-439. Russian.

22.Vladimirskaya ЕА, Kireyev И, Prusov AN, Fais D. Spatial localization of chromosome-nuclear envelope interaction sites. Membr Cell Biol. (1999), 12(6):857-869.

23.Amchenkova AA, Buzhurina IM, Gorgidze LA, Kireyev IV, Panov MA, Polyakov VJ. The role of Ca ions in restoration of the structure of interphase and mitotic chromosomes in PK living cells after hypotonic stress. Cell Biol Int. (1998), 22(7-8):509-515.

24.Ямшанов А.Н., Киреев И.И., Прусов А.Н., Поляков В.Ю. Стабилизация макромолекулярных комплексов хроматина под действием видимого света в присутствие бромистого этидия. Цитология. (1998), 40(4):340-346.

25.Чудинова Е.М., Зацепина О.В., Воробьев И.А., Файс Д., Киреев И.И., Джудиче Д., Поляков В.Ю. Локализация аргентофильных белков в ядрышках ооцитов морского ежа Paracentrotus lividus. Цитология (1998), 40:302-307

26.Крохина Т.Б., Терехов С.М., Киреев И.И., Ляпунова H.A., Тодоров И.Н. Действие циклогексимида на синтез белка, РНК и ДНК в культуре клеток СНО и диплоидных фибробластов человека. Бюлл. Эксп. Биол.Мед. (1991), 112(8):139-141.

27.Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Динамика структурной реконструкции митотических хромосом после их искусственной деконденсации in vitro. Цитология (1990), 32(5):449-454.

28.Zatsepina O.V., Kireyev I.I., Frolova E.I., Polyakov V.Yu., Chentsov Yu.S. (1990) Chromomere - the structural unit of the chromtin in the interphase nucleus. In: Nuclear structure and functions. Eds. Zbarsky I.B., Harris J.R. Plenum Press, New York., pp. 301-304.

29.Киреев И.И., Зацепина O.B., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Ультраструктура митотических хромосом клеток СПЭВ в ходе их обратимой искусственной деконденсации in vivo. Цитология (1988), 30(8):926-932.

По материалам диссертации было также сделано 24 доклада на Всесоюзных и Всероссийских научных конференциях и 8 докладов на международных научных конференциях, тезисы которых опубликованы в научных журналах (25 докладов) или специальных сборниках (7 докладов).

Структура и объём диссертации:

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы по теме исследования, описания методов исследования, § глав результатов, заключения, выводов, листа благодарностей, библиографического списка, включающего €>8~3 наименований, и приложений. Работа изложена на ^оо листах машинописного текста, содержит -Sog фотографии, I <о графиков, ¿схем и рисунков, 2, таблиц.

Заказ №32-Р/07/2011 Подписано в печать 15.07.2011 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 \0~Vi www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Киреев, Игорь Игоревич

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11 2.1 Структурная организация хроматина

2.1.1. Начальные уровни компактизации хроматина: 11 нуклеосомы и элементарная фибрилла хроматина

2.1.2. Высшие уровни организации хроматина

2.1.3. Роль ядерного матрикса и хромосомного 22 скэффолда в формировании пелевых доменов хроматина

2.1.4. ДНК-белковые взаимодействия, определяющие 26 петлевую организацию генома

2.1.5. Высшие уровни организации хроматина в 34 интактных клетках

2.1.6. Линейная неоднородность митотических 41 хромосом

2.2. Структура и функция конденсинов

2.2.1. Семейство ЭМС-белков

2.2.2. Функции конденсинов в митозе

2.2.3. Биохимические активности конденсинов 53 2.2.4". Взаимодействие конденсинов с ДНК.

2.2.5. Конденсины и компактизация хромосом.

2.2.6. Взаимодействие топоизомеразы II и конденсина в 58 митотических хромосомах

2.2.7. Фосфорилирование и регуляция конденсинов

2.2.8. Роль регуляторных субъединиц конденсина в 63 связывании с хромосомами

2.2.8. Другие факторы, участвующие в рекрутировании 65 конденсинов

2.2.9. Взаимодействие субъединиц в составе конденсинового комплекса

2.2.10. Роль конденсинов в регуляции транскрипции

2.3. Структурная организация реплицирующегося хроматина

2.3.1. Домены хроматина и репликация

2.3.1. Репликативная организация нативного хроматина: 79 репликативные сайты

2.3.2. Ультраструктура репликационного сайта

2.4. Структурная организация хроматина и регуляция 97 транскрипции

2.4.1. Регуляция транскрипции на уровне нуклеосом

2.4.2. Петлевые домены и транскрипция

2.4.3. Пространственная организация транскрипции: 102 транскрипционные фабрики

2.4.4. Роль хроматиновых фибрилл высшего порядка в 105 регуляции транскрипции

2.4.5. Взаимосвязь транскрипционной активности генов с 107 пространственной организацией интерфазного ядра: хромосомные территории

2.4.6. Регуляция транскрипции в масштабах целой 110 хромосомы: инактивация Х-хромосомы

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

3. МАТЕРИЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Растворы

3.2. Векторы и их модификация

3.3. Культура клеток

3.4. Синхронизация клеток

3.5. Получение трансгенных клеточных линий

3.6. Ингибирование транскрипции

3.7. Световая микроскопия и иммунофлуоресценция

3.8. Визуализация реплицированного хроматина

3.9. Получение хромосомных препаратов и 127 дифференциальная окраска хромосом

3.10. Прижизненные наблюдения за клетками

3.11. Электронная микроскопия

3.12. Иммуноэлектронная микроскопия

3.13. Цифровая обработка изображения

3.14. In vivo иммуномечение ядерных белков

3.15. Гибридизация in situ

3.16. Определение копийности интегрированных 13 3 трансгенных конструкций

3.17. Выделение РНК и РТ-ПЦР

3.18. Получение препаратов мейотических хромосом 135 Xenopus laevis и иммуноокрашивание

3.19. Электрофорез и иммуноблоттинг

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Структурные мотивы высшего порядка в организации 138 факультативного гетерохроматина

4.1.1. Идентификация неактивной Х-хромосомы на 139 светооптическом и электронномикроскопическом уровне

4.1.2. Ультраструктурная организация неактивной Х- 148 хромосомы.

4.1.3. 3D-CTpyKiypa тельца Барра.

4.1.4. Позиционирование неактивной Х-хромосомы в 157 ядре.

4.2. Динамика структурной организации хроматина в 167 процессе репликации

4.2.1. Визуализация репликативных сайтов в контексте 167 интактного хроматина.

4.2.2. Пост-репликативная реорганизации хроматина

4.2.3. Ультраструктура хроматина в сайтах репликации

4.2.4. Топология реплисом в реплицирующемся 178 хроматине

4.3. Особенности структурной организации рано- и 193 позднореплицирующихся доменов хроматина в составе митотических хромосом.

4.4. Динамика высших уровней организации хроматина при 213 активации транскрипции.

4.4.1. Создание трансгенных клеточных линий с 216 множественные копии бактериальных искусственных хромосом, содержащих локусы ОНРЯ, МТ и Нзр70.

4.4.2. Индукция транскрипции в трансгенных локусах.

4.4.3. Изменения степени компактизации высших уровней 223 организации хроматина при индукция транскрипции.

4.4.4. При ингибровании транскрипции деконденсация 230 высших уровней упаковки хроматина блокируется или существенно ослабляется.

4.4.5. Тепловой шок стимулирует ассоциацию трансгена 236 Н8р70 с кластерами интерхроматиновых гранул.

4.4.6. Подвижность транскрипционно-активных локусов

4.5. Высшие уровни упаковки хроматина, выявляемые в ходе 250 естественной компактизации хромосом в митозе.

4.6. Роль ионов Са в стабилизации высших уровней 262 компактизации ДНК

4.7. Динамика рекрутирования и хромосомная локализация 273 конденсинов в ходе профазной компактизации хромосом.

4.8. Исследование поведения конденсинов при искусственном 287 изменении степени компактизации хромосом в живых клетках

4.8.1, Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических клетках при искусственной декомпактигации хромосом в условиях обратимого гипотонического шока.

4.8.2. Локализация белков ХСАР-Е и pEg7 в митотических клетках после воздействия цитостатиков.

4.9. Конденсировый комплекс в мейозе.

4.9.1. Ядерная локализация конденсинов в профазе 296 мейозаI

4.9.2. Дифференциальная ассоциация субъединиц 298 конденсинов с профазными мейотическими хромосомами

4.9.3. Независимое рекрутирование субъединиц 304 конденсинового комплекса в нехроматиновые домены ядра.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Высшие уровни организации генетического аппарата эукариот и регуляция функциональной активности генома"

Значительное увеличение размеров и сложности генома в процессе эволюции повысило важность решения проблемы упорядоченной пространственной организации генетического материала и его аккуратной сегрегации в ходе деления клетки у высших эукариот. Это достигается многоуровневой упаковкой ДНК в сложный нуклеопротеидный комплекс — хроматин. Вершиной такой упаковки являются митотические хромосомы, степень компактизации ДНК в которых на стадии метафазы достигает 104. Важную роль в упорядоченной укладке ДНК в составе хроматина играют как гистоны, так и негистоновые белки, причем до недавнего времени считалось, что гистоны выполняют исключительно структурную роль, обеспечивая упаковку ДНК на низших уровнях компактизации - в составе нуклеосом и 30-нм фибрилл хроматина. Дальнейший способ упаковки 30-нм фибриллы и формирование т.н. высших уровней организации хроматина до сих пор остаются предметом дискуссий. Неполнота и противоречивость сведений о пространственной организации хроматина существенно осложняют адекватную интерпретацию биохимических и генетических данных о молекулярных механизмах, лежащих в основе процессов компактиза-ции/декомпактизации хроматина. Например, прогресс в исследовании функциональной роли «архитектурных» негистоновых хромосомных белков, таких как топоизомераза II и белки конденсинового комплекса, существенно тормозится из-за того, что изучение характера их взаимодействия с хромосомами проводили преимущественно в системах in vitro, а также в условиях искусственной деконденсации хромосом (Еагп-shaw, Heck, 1983; Hirano, Mitchison, 1994; Maeshima et al, 2005). Поскольку данные об ультраструктурной локализации этих важнейших структурных компонентов хромосом в контексте нативного хроматина практически отсутствуют, многие аспекты структурно-функциональной организации и динамики хромосом в клеточном цикле остаются непонятными.

Следует отметить, что сложности в исследовании структуры хромосом обусловлены не в последнюю очередь особенностями их организации. Так, высокая плотность упаковки хроматина не позволяет непосредственно проследить характер укладки хроматиновых фибрилл разного уровня в составе компактизованных метафазных хромосом. Это обстоятельство и является главной причиной популярности экспериментальных подходов, использующих различные методы декомпактизации хроматина (Paulson, Laemmli, 1977; Brinkley et al, 1980; Zatsepina et al., 1983). В то же время, значительные структурные перестройки хроматина, происходящие даже в достаточно узком диапазоне изменений состава окружающей среды, могут не отражать истинной природы хромосом, а сами эти подходы могут служить потенциальным источником артефактов. Это особенно актуально для высших уровней организации хроматина, демонстрирующих высокую лабильность в системах in vivo и in vitro. В связи с этим, особое значение приобретает разработка методических подходов, направленных на исследование организации хроматина в его нативном состоянии. Дополнительные сложности в решении данной задачи связаны с тем, что структурная организация хроматина не монотонна: различные участки генома различаются по характеру упаковки ДНК, и эти различия связаны с функциональным состоянием генных локусов. Классическим примером может служить подразделение интерфазного хроматина на слабо компактизованный и транскрипционно активный эухроматин и плотно упакованный, инертный в отношение экспрессии генетической информации гетерохроматин. Различия в структурном состоянии эу- и гетерохроматина становятся менее очевидными при переходе от интерфазы к митозу, однако фундаментальные особенности структуры этих фракций генома по-видимому, сохраняются. В связи с этим особенно важно иметь возможность идентификации индивидуальных хромосомных ло-кусов для последующего структурного анализа особенностей организации хроматина в зависимости от его генетического статуса и функционального состояния. Широко используемые для этой цели методы гибридизации in situ, к сожалению, не дают необходимой информации, поскольку по природе своей являются деструктивными и существенно нарушают структуру хроматина. Поэтому особую важность приобретает разработка новых методов визуализации индивидуальных хромосомных локусов в нативном хроматине. К ним относятся методы визуализации трансгенных конструкций на основе взаимодействия Ьас-оператор/Ьас-репрессор (Robinett et al, 1986). Данные подходы не только позволяют использовать более щадящую технику иммуноцитохимического анализа и иммуноэлектронной микроскопии, но также дают возможность анализировать процессы компактизации/декомпактизации хроматина in vivo.

Однако биологическое значение высших уровней организации хромосом эукариот не ограничивается необходимостью компактизации длинных молекул ДНК для аккуратной трансмиссии генетической информации в ходе клеточного деления. Все основные генетические процессы —4 транскрипция, репликация, рекомбинация и репарация - в качестве субстрата используют не чистую ДНК, а гораздо более химически сложный и пространственно структурированный хроматин. В этих условиях структурное состояние хроматиновой матрицы может выступать важным регуляторным фактором, существенно влияющим на функционирование генома. Простейшим примером может служить ограничение доступности ДНК для транс-факторов в результате плотной упаковки хроматина (см. John et al, 2011). Роль хроматина как важного фактора эпигенетической регуляции экспрессии генов в последнее время интенсивно исследуется, особенно на уровне структуры элементарных фибрилл хроматина и посттрансляционных модификаций гистонов, входящих в состав нуклеосом.

Гораздо менее исследована в этом отношении роль высших уровней компактизации хроматина и ЗБ-организации генома, хотя уже сейчас становится ясно, что упаковка хроматина и его пространственная организация обеспечивают глобальное переключение генетических программ в процессе индивидуального развития и клеточной дифференцировки, а также могут иметь непосредственное отношение к развитию различных патологических процессов, включая канцерогенез. В связи с этим понимание принципов структурно-функциональной организации высших уровней компактизации генома важно для формирования более полного представления о клеточных и молекулярных механизмах, лежащих в основе этих процессов.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Структурная организация хроматина

Хроматин, представляющий собой кополимер ДНК и гистонов, и морфологически подразделяется на эухроматин и гетерохроматин. Эта классификация изначально основывалась на различиях в характере окрашивания ядерных структур цитологическими красителями, взаимодействующими с нуклеиновыми кислотами. Эухроматин находится в целом в более декомпактизованном состоянии по сравнению с гетерохроматином. При этом локально его функциональное состояние может быть различным — транскрипционно активным или неактивным. Гетерохроматин обычно определяют как плотно упакованный и транскрипционно неактивный хроматин. Принято также подразделять гетерохроматин на конститутивный и факультативный. Конститутивный гетерохроматин является транскрипционно некативным во всех клетках данного организма, в то время как гены в составе факультативного гетерохроматина подвергаются инактивации только в некоторых клетках, на определенных стадиях индивидуального развития, или на специфических этапах клеточного цикла. Таким образом, в клетке существует разнообразный набор структурно-функциональных состояний хроматина, причем общепринято, что эти состояния являются весьма динамичными и переходы из одного состояния хроматина в другое (ремоделирование) осуществляются в ответ на разнообразные физиологические сигналы.

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Киреев, Игорь Игоревич

6. ВЫВОДЫ

3. На ультраструктурном уровне гетерохроматиновые репликативные сайты представляют собой сегменты хроматиновых фибрилл высшего порядка. Индивидуальные реплисомы равномерно распределены в объеме реплицирующихся доменов, не образуя компактных репликативных «фабрик». Репликация гетерохроматиновых локусов не требует полного разворачивания хромонемных фибрилл.

10.В профазе мейоза I компактизация хроматина в осевых гранулах (хромомерах) не требует присутствия 13Б конденсина.

11. Сборка 13Б конденсинового комплекса осуществляется непосредственно на хромосомах (по крайней мере, в мейозе), причем ХСАР-Б2, по-видимому, связывается с хроматином первым и обеспечивает рекрутирование остальных субъединиц.

12. Субъединицы конденсина локализуются в различных структурно-функциональных доменах ядра независимо друг от друга. ХСАР-Б2 связывается в осевыми структурами хромосом и тельцами Ка-халя, тогда как ХСАР-Е взаимодействует с гранулярным компонентом ядрышек.

7. БЛАГОДАРНОСТИ

Я выражаю свою искреннюю благодарность профессору Владимиру Юрьевичу Полякову, чью поддержку и чуткое руководство я ощущал в течение всей моей научной деятельности, начиная со студенческих времен. Его помощь при подготовке настоящей работы невозможно переоценить.

Также хочу поблагодарить профессора Юрия Сергеевича Ченцова и сотрудников кафедры клеточной биологии и гистологии Биологического факультета МГУ — благодаря им я выбрал свой путь и приобрел ценнейшие знания и навыки для успешного старта научной деятельности.

Я хотел бы поблагодарить всех моих коллег и друзей в отделе Электронной микроскопии НИИ им. А.Н. Белозерского, в отделе клеточной биологии и биологии развития Университета штат Иллинойс (Урбана-Шампейн, США), департаменте биологии развития Университета Палермо (Италия), за плодотворное сотрудничество. Отдельно хочу выделить Р.Э.Узбекова и И.Б.Алиеву, чью дружескую поддержку я особенно ценю.

Благодарю всех соавторов моих публикаций, без участия которых эта работа не могла бы состояться.

Особенно хочу поблагодарить мою семью — жену Наталью Кирееву, сыновей Александра и Романа и дочь Эллину, и моих родителей за всемерную моральную поддержку и самоотверженную помощь.

Отдельная благодарность — моим друзьям Андрею Терехову и Анне Захаровой, за все те добрые дела, которые они сделали, чтобы облегчить мою работу.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мы показали, что факультативный гетерохроматин инактивирован-ной Х-хромосомы в клетках самок млекопитающих обладает специфической структурной организацией, отличающей его как от эухроматина, так и от конститутивного хроматина. Эта организация характеризуется высокой степенью компактизации хроматина с образованием структурных доменов высшего порядка с размерами фибриллярных элементов около 200-250 нм в диаметре. Также было показано, что для Xi характерно тесное взаимодействие с ядерной оболочкой. Полученные нами данные хорошо соответствуют представлениям о том, что пространственное обособление хроматина Xi способствует поддержанию инактивированного статуса Xi посредством ограничения доступа к транскрипционным факторам (Heard and Disteche, 2006), однако достигается это ограничение в первую очередь упаковкой хроматина в фибриллярные структуры высшего порядка диаметром 250-400 нм. Дальнейшие исследования должны быть направлены на прямое сравнение структурной организации активных и неактивных генов, локализованных в инактивированной Х-хромосоме и корреляцию различий в этой организации с регуляцией сайленсинга. Данный анализ потребует разработки новых методических подходов для визуализации расположения специфических геннных локусов и компонентов транскрипционной машинерии без нарушения ультраструктуры хроматина. Один из таких подходов был реализован в настоящей работе: создание хромосомных локусов, меченых in vivo при помощи системы Ьас-оператор/Ьас-репрессор, вставленных в протяженные участки геномной ДНК длиной более 100 т.п.н. и содержащих индуцибельные гены, позволило продемонстрировать непосредственную взаимосвязь между активацией транскрипции и декомпактизацией высших уровней организации хроматина. Мы показали, что, вопреки традиционным представлениям, транскрипция может осуществляться на высоко структурированной матрице, общая степень компакти-зации которой может достигать 500-1000 раз. Для прямой визуализации ультраструктуры хроматина в исследуемых локусах мы использовали оригинальный метод in vivo-иммуномечения с помощью инъекции коньюгатов первичных антител с наночастицами золота в живые клетки. Это позволило идентифицировать транскрибирующиеся локусы в составе интактного хроматина и подтвердить их организацию в виде 100-нм хромонемных фибрилл.

Исследование ультраструктурной организации реплицирующегося хроматина в условиях сохранения его нативной структуры также стало возможным в результате применения стратегии мечения функциональных доменов хромосом в живых клетках с последующим иммуномечением in vivo. Данный подход позволил продемонстрировать сходный принцип во взаимосвязи между характером упаковки хроматина и функциональной активности генных локусов. Во-первых, процесс репликации, аналогично процессу транскрипции, не требует тотальной деконденсации хроматина в сайтах репликации: реплицирующийся хроматин в средней и поздней S-фазе сохраняет свою хромонемную структур несмотря на некоторые локальные изменения. Во-вторых, репликативные комплексы равномерно распределяются в объеме реплицирующихся локусов, не образуя специальных компактных структур, окруженных немеченым хроматином, как предсказывает модель репликативных фабрик (Hozak et al, 1993). Наконец, наблюдаемая динамика сегрегации реплицированного хроматина от сайтов репликации подразумевает плавный процесс активации новых репликонов, соответствующий модели «домино» (С1^т е! а1, 2010), реализующейся на уровне индивидуальных репликонов в составе хромонемных фибрилл.

Таким образом, основным структурным мотивом организации функ-цинальных доменов хроматина оказывается 100-нм хромонемы и динамические изменения хроматина, связанные с модуляцией функциональной активности генома, осуществляются на уровне упаковки хромонемных фибрилл.

На основании детальных ультраструктурных исследований прогрессивной компактизации хромосом от С2-фазы до метафазы нам удалось идентифицировать как минимум еще один дополнительный уровень иерархии фибриллярных структур хроматина: 100-нм хромонемы укладываются в 200-250-нм фибриллу. По-видимому, 250-нм фибриллы представляют собой базовый уровень компактизации транскрипционно-неактивного факультативного гетерохроматина (парадигмой которого является тельце Барра - инактивированная Х-хромосома), и это состояние сохраняется в течение всего клеточного цикла.

Далее, модель иерархической укладки предсказывает упаковку про-фазной хроматиды толщиной 200-250 нм в составе метафазной хромосомы. Действительно, структурные домены такого порядка были обнаружены в составе митотических хромосом (81хикоу е1 а1., 2003). Однако, при спиральной укладке фибрилл такого диаметра в составе 500 нм метафазной хроматиды должны выявляться свободные от хроматина зоны в осевой области хроматид, чего обнаружить не удается. Более того, центральная треть хроматиды содержит конденсиновый кор шириной примерно 300 нм, не оставляя достаточного места для размещения спирально уложенной 250-нм фибриллы. Эти наблюдения можно интерпретировать следующим образом: распределение конденсинов в метафазной хромосоме пронизыва

30 пт 100-130 пт

200-250 пт

500-750 пт

Рис. 5.1: Модель компактизации митотической хромосомы (А) Стадии компактизации. Изменения характера укладки высших уровней организации хромосомы (серый цвет) сопровождаются перераспределением конденсинов (красный) от ранней 8-фазы (а) через С2-фазу (б) раннюю (в) среднюю (г) и позднюю (д)профазу к метафазе (е). (Б) Модель организации митотической хромосомы по принципу иерархической укладки, стабилизированой «осевым клеем» (а) 30-ни фибрилла хроматина упаковывается в 100-130 нм хромонему, которая в свою очередь укладывается в 200-250 нм фибриллу, соответствующую среднепрофазной хроматиде. Данный уровень компактизации в составе локусов факультативного хроматина, примером которых является инактивированная Х-хромосома (тельце Барра) сохраняется в течение всего клеточного цикла. В метафазе эта фибрилла упаковывается в составе 500-750-нм хроматиды. (б) Осевое распределение конденсинов (красный) сосредоточено в широкой зоне, составляющей около 1/3 диаметра хроматиды. В этой зоне конденсины и, возможно, другие структурные белки хромосом действуют как система сшивок («осевой клей»), стабилизирующий структуру хромосомы. ет различные уровни иерархии хроматиновых доменов. Можно также допустить существование локальной реорганизации хроматина при переходе от поздней профазы к метафазе, которая связана с перераспредением топо-изомеразы II и конденсинов с периферии в осевые районы хроматид. Поскольку хромонемные элементы все еще выявляются на периферии конденсированных хромосом (Поляков, Ченцов, 1974), такая гипотетическая реорганизация происходит только в области хроматидной оси. В сответ-ствие с моделью рассеяных скрепок (Porrier, Marko, 2005), структурная целостность хромосомы обеспечивается межфибриллярными белковыми скрепками, рассеяными в объеме хромосомы и не формирующими выраженной белковой сердцевины. Компактизация хромосом, в соответсвие с данной моделью, сопровождается прогрессивным укорочением хромосомы и увеличением ее диаметра. Принимая во внимание данные литературы и наши наблюдения, такая модель представляется упрощенной, так как игнорирует существования высших уровней компактизации хроматина. Однако, оценки расстояний между такими гипотетическими сшивками, составляющими около 15 тпн. (Porrier, Marko, 2002), эквивалентны 125 нм сегментам 30-нм фибриллы хроматина, демонстрирующей 40-кратную компактиза-цию ДНК. По своим масштабам такие структуры ближе соответствуют хромонемным фибриллам толщиной 100 нм, чем петлевым доменам размером 50-200 тпн., постулируемым моделью радиальных петель. Такая частота сшивок может обеспечиваться за счет контактов, опосредованных кон-денсинами, между фибриллами высшего порядка (хромонемами). Очевидно, что эти контакты могут осуществляться перимущественно в осевой области хромосом, где сосредоточена основная масса конденсинов.

Принимая по внимания противоречия между предложенными ранее моделями структурной организации хромосом и нашими наблюдениями ранних этапов компактизации хромосом в митозе, мы предлагаем рабочую модель иерархической укладки, стабилизированной аксиальным клеем (рис. 5.1). Данная модель объединяет ключевые элементы трех ранее рассматривавшихся групп моделей: модели иерархической укладки, ра-диально-петлевой модели и модели хроматиновой сети. Предложенная модель постулирует следующие этапы компактизации хромосом в митозе: на начальном этапе хроматин открепляется от внутриядерных скелетных структур и хроматиновые фибриллы высшего порядка укладываются в раннепрофазные хромосомы, затем происходит их конденсация с образованием равномерно плотно упакованных среднепрофазных хроматид толщиной 200-250 нм. Дальнейшая спирализация этих хроматид дает начало ме-тафазным хромосомам. Переход от средней профазы к метафазе сопровождается перераспределением конденсинов и топоизомеразы II в осевую область хроматид. Формирующаяся осевая структура хромосомы является динамичной и представлена распределенной системой «скрепок», которая не составляет единого белкового скэффолда, но тем не менее обеспечивает стабильность хромосомы. Данная модель учитывает существование нескольких уровней укладки хроматиновых фибрилл высшего порядка, наблюдаемых с поздней G2 до средней профазы, а также объясняет, почему при механическом растяжении метафазных хромосом не наблюдается прогрессивного разворачивания высших уровней компактизации хроматина. Учитывается также зависимость механических свойств хромосом от наличия белковой осевой структуры. Предложенная модель не противоречит данным о функциональной роли конденсинов в стабилизации структуры метафазных хромосом, но не в процессе компактизации хроматина в ходе митоза (Hudson et al 2003, Gassman et al, 2004). В нашей модели движущей силой компактизации являются механизмы иерархической укладки хроматиновых фибрилл, тогда как роль конденсинов и топоизомеразы II на этом этапе заключается в «фиксации» сформированных структур высшего порядка в составе метафазной хромосомы. Причем, по всей видимости, «структурная» роль топоизомеразы II и конденсина опосредована участием неизвестных пока факторов, поскольку после формирования финальной конденсированной структуры хромосомы демонстрируют высокую пластичность в организации высших уровней упаковки хроматина в ответ на различные декомпактизующие воздействия, обратимость которых не коррелирует с физическим присутствием конденсинов в составе хромосом.

В рамках предложенной модели достаточно легко объяснить природу продольной и поперечной дифференцированное™ хромосом. Достаточно предположить, что различные фракции конденсинов (конденсин I и II) селективно связываются и участвуют в стабилизации высших уровней укладки хромонемных фибрилл в областях в- и Я-сегментов. При сохранении общих принципов упаковки хромонем различия в реакции в- и 11-сег-ментов при гипотоническом воздействии будут напрямую зависеть от свойств и частоты расположения архитектурных белков хромосом, рекрутируемых различными конденсинами. Однако для лучшего понимания механизмов реализации линейной неоднородности хромосом требуется более детальное исследование, во-первых, особенностей укладки хромонем в хромосомных сегментах различного типа, и, во-вторых, картирование архитектурных белков хромосом (и в частности, конденсиновых комплексов различного типа) в их составе.

Предложенная модель позволяет взглянуть на процесс компактиза-ции митотических хромосом под другим углом. Например, в соответствие с предсказаниями данной модели, выявление радиальных петель в изолированных хромосомах под действием растворов низкой ионной силы (Магеёеп, ЬаеттН, 1979) является проявлением формирования «сшивок» на поздних этапах компактизации хромосом, а не отражением реальных структурных элементов, ответственных за эту компактизацию. В то же время, некоторые постулаты данной модели можно проверить экспериментально. Так, например, модель предсказывает, что эксперименты по механическому растяжению хромосом должны выявить прогрессивное разворачивание высших уровней организации хромосомы при условии удаления конденсинов.

Многие ключевые вопросы тем не менее остаются открытыми. Неясна роль конденсинов и топоизомеразы II на ранних этапах митотичесой компактизации. Полностью неизвестны молекулярные механизмы, не связанные с конденсинами, которые обеспечивают компактизацию хроматина. Неясно, происходит ли существенная локальная реорганизация хроматина между средней и поздней профазой, или структурные изменения на этом этапе компактизации есть результат глобальной укладки среднепрофазной хроматиды. Ответы на эти и многие другие вопросы будут, несомненно, получены в ближайшем будущем.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Киреев, Игорь Игоревич, Москва

1. Бураков В.В., Косых М.И., Ченцов Ю.С. Перенос белков ядерного матрикса в составе периферического материала хромосом. (1999) Биологические мембраны, 16: 647-656.

2. Глазков М.В. Организация транскрипционно-неактивных участков интерфазных хромосом. (1990) Докл. АН СССР. 312: 978-980.

3. Голышев С.А., Поляков В.Ю. Структура хроматина в сайтах репликации. (2008) Цитология, 50: 29-39.

4. Горнунг Е.М., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Уровни компактизации ДНК в интерфазных и митотических хромосомах высших растений. I. Ультраструктура ядер Allium сера в условиях дифференциальной деконденсации хроматина. (1986) Цитология, 28: 484-488.

5. Горнунг Е.М., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Уровни компактизации ДНК в интерфазных и митотических хромосомах высших растений. II. Ультраструктура экспериментально деконденсированных хромосом гемантуса. (1986) Цитология, 28: 911-916.

6. Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Различия в структурной организации G- и R-сегментов, выявляемые в процессе дифференциальной деконденсации хромосом. (1985) Цитология, 27: 865-871.

7. Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Динамика структурной реконструкции митотических хромосом после их искусственной деконденсации in vitro. (1990) Цитология , 32: 449-454.

8. Киреев И.И., Зацепина О.В., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Ультраструктура митотических хромосом клеток СПЭВ в ходе их обратимой искусственной деконденсации in vivo. (1988) Цитология, 30: 926-932.

9. Клюева Т.С., Онищенко Г.Е., Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Ультраструктура интерфазных ядер клеток некоторых растений на разных стадиях клеточного цикла. (1974) Цитология, 16: 1465-1468.

10. Онищенко Г.Е., Коломиец O.JL, Ченцов Ю.С. Электронно-микроскопический анализ контактов гетеропикнотического хроматина с ядерной оболочной на примере полового хроматина. (1973) Цитология, 15: 377-382.

11. Онищенко Г.Е., Ченцов Ю.С., Иорданский А.Б. Радио-автографический анализ локализации хромосом в интерфазных ядрах. (1972) Цитология, 14: 233-239.

12. Поляков В.Ю. Электронномикроскопическое изучение хромосом Crépis capillaris. (1969) ДАН СССР, 189: 185-187.

13. Поляков В.Ю., Васин В.И., Ченцов Ю.С. Принципы структурной организации митотических хромосом высших растений. (1969) Цитология, 11: 1477-1484.

14. Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Электронномикроскопическое выявление матрикса хромосом в связи с их естественным разрыхлением. (1968) ДАН СССР, 182: 205-207.

15. Поляков В.Ю., Ченцов Ю.С. Электронномикроскопическое изучение хромосомы в интерфазных и делящихся клетках Crépis capillaris. (1969) Цитология, 2:

16. Прусов А Н., Поляков В.Ю., Зацепина О.В., Файс Д., Ченцов Ю. С. Выделение розеточно-подобных структур из частично депротеинизированного хроматина гепатоцитов крысы. (1985). Цитология. 27: 1026-1030.

17. Смирнова Е.А., Гребенщикова В.И., Ченцов Ю.С. Адаптационные свойства клеток культуры СПЭВ при действии на них гипотонии. (1986) Цитология, 28: 848-853.

18. Фролова Е.И. Тарунина М.В. Зацепина О.В. Поляков В.Ю. Ченцов Ю.С. Электронно-микроскопическое изучение минихромосом в клетках мышиных фибробластов. (1988) Цитология, 30: 1084-1090,

19. Ченцов Ю.С. Периферический материал или матрикс митотических хромосом: строение и свойства. (2000) Онтогенез, 31: 388-399.

20. Ченцов Ю.С., Поляков В.Ю. Ультраструктура клеточного ядра. (1974) "Наука", Москва, 196 стр.

21. Яровая О.В., Разин С.В. Два типа участков прикрепления ДНК к ядерному скелету в клетках асцитной карциномы Эрлиха. (1983) Молекулярная биология, 17: 303-313.

22. Aaronson RP, Blobel G. Isolation of nuclear pore complexes in association with a lamina. (1975) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 72: pp. 1007-1011.

23. Ackerman P, Glover CV, Osheroff N. Phosphorylation of DNA topoi-somerase II by casein kinase II: modulation of eukaryotic topoisomerase II activity in vitro. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82: pp. 3164-3168.

24. Adachi Y, Käs E, Laemmli UK. Preferential, cooperative binding of DNA topoisomerase II to scaffold-associated regions. (1989) EMBO J., 8: pp. 3997-4006.

25. Adolph KW. A serial sectioning study of the structure of human mitotic chromosomes. (1981) Eur. J. Cell Biol., 24: pp. 146-153.

26. Adolph KW, Cheng SM, Laemmli UK. Role of nonhistone proteins in metaphase chromosome structure. (1977) Cell, 12: pp. 805-816.

27. Aelen JM, Opstelten RJ, Wanka F. Organization of DNA replication in Physarum polycephalum. attachment of origins of replicons and replication forks to the nuclear matrix. (1983) Nucleic Acids Res., 11: pp. 1181-1195.

28. Agard DA, Hiraoka Y, Shaw P, Sedat JW. Fluorescence microscopy in three dimensions. (1989) Methods Cell Biol., 30: pp. 353-377.

29. Albani F, Perrin K, Bucci S, Ragghianti M, Mancino G, LaCroix JC. B24 protein stored in lampbrush spheres is involved in early cleavage in urodele amphibians. (1998)/. Exp. Zool., 280: pp. 142-151.

30. Alekseyenko AA, Larschan E, Lai WR, Park PJ, Kuroda MI. High-resolution chip-chip analysis reveals that the drosophila MSL complex selectively identifies active genes on the male X chromosome. (2006) Genes Dev., 20: pp. 848-857.

31. Amati B, Gasser SM. Drosophila scaffold-attached regions bind nuclear scaffolds and can function as ARS elements in both budding and fission yeasts. (1990) Mol. Cell. Biol., 10: pp. 5442-5454.

32. Amati BB, Gasser SM. Chromosomal ARS and CEN elements bind specifically to the yeast nuclear scaffold. (1988) Cell, 54: pp. 967-978.

33. Anderson DE, Losada A, Erickson HP, Hirano T. Condensin and cohesin display different arm conformations with characteristic hinge angles. (2002) J. Cell Biol., 156: pp. 419-424.

34. Andersson K, Björkroth B, Daneholt B. Packing of a specific gene into higher order structures following repression of RNA synthesis. (1984) J. Cell Biol, 98: pp. 1296-1303.

35. Andersson K, Mähr R, Björkroth B, Daneholt B. Rapid reformation of the thick chromosome fiber upon completion of RNA synthesis at the Balbiani ring genes in Chironomus tentans. (1982) Chromosoma, 87: pp. 33-48.

36. Andrade MA, Perez-Iratxeta C, Ponting CP. Protein repeats: structures, functions, and evolution. (2001) J. Struct. Biol., 134: pp. 117-131.

37. Andreassen PR, Lacroix FB, Margolis RL. Chromosomes with two intact axial cores are induced by G2 checkpoint override: evidence that DNA decatenation is not required to template the chromosome structure. (1997) J. Cell Biol, 136: pp. 29-43.

38. Anizet MP, Huwe B, Pays A, Picard JJ. Characterization of a new cell line, XL2, obtained from Xenopus laevis and determination of optimal culture conditions. (1981)/« Vitro, 17: pp. 267-274.

39. Aono N, Sutani T, Tomonaga T, Mochida S, Yanagida M. Cnd2 has dual roles in mitotic condensation and interphase. (2002) Nature, 417: pp. 197-202.

40. Apostolou E, Thanos D. Linking differential chromatin loops to transcriptional decisions. (2008) Mol. Cell, 29: pp. 154-156.

41. Arney KL, Fisher AG. Epigenetic aspects of differentiation. (2004) J. Cell. Sci., 117: pp. 4355-4363.

42. Bacher CP, Guggiari M, Brors B, Augui S, Clerc P, Avner P, Eils R, Heard E. Transient colocalization of X-inactivation centers accompanies the initiation of X inactivation. (2006) Nat. Cell Biol., 8: pp. 293-299.

43. Bajer A. Subchromatid structure of chromosomes in the living state. (1965) Chromosoma, 17: pp. 291-302.

44. Ball ARJ, Schmiesing JA, Zhou C, Gregson HC, Okada Y, Doi T, Yoko-mori K. Identification of a chromosome-targeting domain in the human condensin subunit Cnapl/HCAP-D2/Eg7. (2002) Mol. Cell. Biol., 22: pp. 57695781.

45. Bancaud A, Huet S, Daigle N, Mozziconacci J, Beaudouin J, Ellenberg J. Molecular crowding affects diffusion and binding of nuclear proteins in hetero-chromatin and reveals the fractal organization of chromatin. (2009) EMBO J., 28: pp. 3785-3798.

46. Bannister AJ, Zegerman P, Partridge JF, Miska EA, Thomas JO, Allshire RC, Kouzarides T. Selective recognition of methylated lysine 9 on histone H3 by the HP1 chromo domain. (2001) Nature, 410: pp. 120-124.

47. Barr ML, Bertram EG. A morphological distinction between neurones of the male and female, and the behaviour of the nucleolar satellite during accelerated nucleoprotein synthesis. (1949) Nature, 163: p. 676.

48. Barr ML, Carr DH. Correlations between sex chromatin and sex chromosomes. (1962) Acta Cytol., 6: pp. 34-45.

49. Basler J, Hastie ND, Pietras D, Matsui SI, Sandberg AA, Berezney R. Hybridization of nuclear matrix attached deoxyribonucleic acid fragments. (1981) Biochemistry, 20: pp. 6921-6929.

50. Bazett-Jones DP, Hendzel MJ. Electron spectroscopic imaging of chromatin. (1999) Methods, 17: pp. 188-200.

51. Bazett-Jones DP, Kimura K, Hirano T. Efficient supercoiling of DNA by a single condensin complex as revealed by electron spectroscopic imaging. (2002) Mol. Cell, 9: pp. 1183-1190.

52. Belgrader P, Siegel AJ, Berezney R. A comprehensive study on the isolation and characterization of the HeLa S3 nuclear matrix. (1991) J. Cell. Sci., 98 (Pt 3): pp. 281-291.

53. Bellini M, Gall JG. Coilin can form a complex with the U7 small nuclear ribonucleoprotein. (1998) Mol. Biol. Cell, 9: pp. 2987-3001.

54. Belmont AS, Bignone F, Ts'o PO. The relative intranuclear positions of Barr bodies in XXX non-transformed human fibroblasts. (1986) Exp. Cell Res., 165: pp. 165-179.

55. Belmont AS, Braunfeld MB, Sedat JW, Agard DA. Large-scale chromatin structural domains within mitotic and interphase chromosomes in vivo and in vitro. (1989) Chromosoma, 98: pp. 129-143.

56. Belmont AS, Bruce K. Visualization of G1 chromosomes: a folded, twisted, supercoiled chromonema model of interphase chromatid structure. (1994) J. Cell Biol, 127: pp. 287-302.

57. Belmont AS, Dietzel S, Nye AC, Strukov YG, Tumbar T. Large-scale chromatin structure and function. (1999) Curr. Opin. Cell Biol, 11: pp. 307-311.

58. Belmont AS, Sedat JW, Agard DA. A three-dimensional approach to mitotic chromosome structure: evidence for a complex hierarchical organization. (1987) y. Cell Biol, 105: pp. 77-92.

59. Belmont AS, Zhai Y, Thilenius A. Lamin B distribution and association with peripheral chromatin revealed by optical sectioning and electron microscopy tomography. (1993) J. Cell Biol, 123: pp. 1671-1685.

60. Benyajati C, Worcel A. Isolation, characterization, and structure of the folded interphase genome of drosophila melanogaster. (1976) Cell, 9: pp. 393407.

61. Berezney R, Buchholtz LA. Dynamic association of replicating DNA fragments with the nuclear matrix of regenerating liver. (1981) Exp. Cell Res., 132: pp. 1-13.

62. Berezney R, Coffey DS. Identification of a nuclear protein matrix. (1974) Biochem. Biophys. Res. Commun., 60: pp. 1410-1417.

63. Berezney R, Coffey DS. Nuclear protein matrix: association with newly synthesized DNA. (1975) Science, 189: pp. 291-293.

64. Berezney R, Dubey DD, Huberman JA. Heterogeneity of eukaryotic rep-licons, replicon clusters, and replication foci. (2000) Chromosoma, 108: pp. 471-484.

65. Berezney R, Mortillaro MJ, Ma H, Wei X, Samarabandu J. The nuclear matrix: a structural milieu for genomic function. (1995) Int. Rev. Cytol., 162A: pp. 1-65.

66. Bernardi G. The isochore organization of the human genome. (1989) Annu. Rev. Genet., 23: pp. 637-661.

67. Bernstein E, Hake SB. The nucleosome: a little variation goes a long way. (2006) Biochem. Cell Biol., 84: pp. 505-517.

68. Berrios M, Osheroff N, Fisher PA. In situ localization of DNA topoisomerase II, a major polypeptide component of the Drosophila nuclear matrix fraction. (1985) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A., 82: pp. 4142-4146.

69. Bhalla N, Biggins S, Murray AW. Mutation of YCS4, a budding yeast condensin subunit, affects mitotic and nonmitotic chromosome behavior. (2002) Mol. Biol. Cell, 13: pp. 632-645.

70. Bhat MA, Philp AV, Glover DM, Bellen HJ. Chromatid segregation at anaphase requires the barren product, a novel chromosome-associated protein that interacts with topoisomerase II. (1996) Cell, 87: pp. 1103-1114.

71. Bickmore WA, Carothers AD. Factors affecting the timing and imprinting of replication on a mammalian chromosome. (1995) J. Cell. Sei., 108 ( Pt 8): pp. 2801-2809.

72. Bickmore WA, Sumner AT. Mammalian chromosome banding an expression of genome organization. (1989) Trends Genet., 5: pp. 144-148.

73. Bickmore WA, Teague P. Influences of chromosome size, gene density and nuclear position on the frequency of constitutional translocations in the human population. (2002) Chromosome Res., 10: pp. 707-715.

74. Bjorkroth, B., Ericsson, C., Lamb, M.M., and Daneholt, B. Structure of the chromatin axis during transcription. (1988) Chromosoma, 96, 333-340.

75. Blumenthal AB, Dieden JD, Kapp LN, Sedat JW. Rapid isolation of metaphase chromosomes containing high molecular weight DNA. (1979) J. Cell Biol., 81: pp. 255-259.

76. Blumenthal AB, Kriegstein HJ, Hogness DS. The units of DNA replication in drosophila melanogaster chromosomes. (1974) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 38: pp. 205-223.

77. Bode J, Maass K. Chromatin domain surrounding the human interferon-beta gene as defined by scaffold-attached regions. (1988) Biochemistry, 27: pp. 4706-4711.

78. Bohrmann B, Kellenberger E. Immunostaining of DNA in electron microscopy: an amplification and staining procedure for thin sections as alternative to gold labeling. (1994) J. Histochem. Cytochem., 42: pp. 635-643.

79. Bolzer A, Kreth G, Solovei I, Koehler D, Saracoglu K, Fauth C, Miiller S, Eils R, Cremer C, Speicher MR et al. Three-dimensional maps of all chromosomes in human male fibroblast nuclei and prometaphase rosettes. (2005) PLoS Biol., 3: p. el57.

80. Bomar J, Moreira P, Balise JJ, Collas P. Differential regulation of maternal and paternal chromosome condensation in mitotic zygotes. (2002) J. Cell. Sci., 115: pp. 2931-2940.

81. Borland L, Harauz G, Bahr G, van Heel M. Packing of the 30 nm chromatin fiber in the human metaphase chromosome. (1988) Chromosoma, 97: pp. 159-163.

82. Bostock CJ, Sumner AT. The eukaryotic chromosome. (1978) North-Holland Pub. Co. Amsterdam/New York. 525 p.

83. Boulikas T. Nature of DNA sequences at the attachment regions of genes to the nuclear matrix. (1993) J. Cell Biochem., 52: pp. 14-22.

84. Boulikas T. Chromatin domains and prediction of MAR sequences. (1995) Int. Rev. Cytol, 162A: pp. 279-388.

85. Boulikas T, Kong C. A novel class of matrix attached regions (MARs) identified by random cloning and their implications in differentiation and carcinogenesis. (1993) Int. J. Oncol, 2: pp. 325-330.

86. Boulikas T, Kong CF. Multitude of inverted repeats characterizes a class of anchorage sites of chromatin loops to the nuclear matrix. (1993) J. Cell. Biochem., 53: pp. 1-12.

87. Bouniol-Baly C, Nguyen E, Besombes D, Debey P. Dynamic organization of DNA replication in one-cell mouse embryos: relationship to transcriptional activation. (1997) Exp. Cell Res., 236: pp. 201-211.

88. Bourgeois CA, Laquerriere F, Hemon D, Hubert J, Bouteille M. New data on the in-situ position of the inactive x chromosome in the interphase nucleus of human fibroblasts. (1985) Hum. Genet., 69: pp. 122-129.

89. Bouvier D, Hubert J, Sève AP, Bouteille M. Structural aspects of intranuclear matrix disintegration upon RNase digestion of hela cell nuclei. (1985) Eur. J. Cell Biol, 36: pp. 323-333.

90. T. Die Blastomerenkerne von Ascaris megalocephala und die Theorie der Chromosomenindividualitat. (1909). Arch. Zellforsch. 3: 181-268.

91. Bowen BC. DNA fragments associated with chromosome scaffolds. (1981) Nucleic Acids Res., 9: pp. 5093-5108.

92. Boy de la Tour E, Laemmli UK. The metaphase scaffold is helically folded: sister chromatids have predominantly opposite helical handedness. (1988) Cell, 55: pp. 937-944.

93. Branco MR, Pombo A. Intermingling of chromosome territories in interphase suggests role in translocations and transcription-dependent associations. (2006) PLoSBiol., 4: p. el38.

94. Bridger JM, Herrmann H, Miinkel C, Lichter P. Identification of an inter-chromosomal compartment by polymerization of nuclear-targeted vimentin. (1998)/. Cell. Sci., Ill ( Pt 9): pp. 1241-1253.

95. Bridger JM, Kalla C, Wodrich H, Weitz S, King JA, Khazaie K, Kràuss-lich H, Lichter P. Nuclear RNAs confined to a reticular compartment between chromosome territories. (2005) Exp. Cell Res., 302: pp. 180-193.

96. Brinkley BR, Cox SM, Pepper DA. Structure of the mitotic apparatus and chromosomes after hypotonic treatment of mammalian cells in vitro. (1980) Cytogenet. Cell Genet., 26: pp. 165-174.

97. Brockdorff N, Ashworth A, Kay GF, McCabe VM, Norris DP, Cooper PJ, Swift S, Rastan S. The product of the mouse Xist gene is a 15 kb inactive X-specific transcript containing no conserved ORF and located in the nucleus. (1992)Cell, 71: pp. 515-526.

98. Brotherton T, Zenk D, Kahanic S, Reneker J. Avian nuclear matrix proteins bind very tightly to cellular DNA of the beta-globin gene enhancer in a tissue-specific fashion. (1991) Biochemistry, 30: pp. 5845-5850.

99. Brown JM, Green J, das Neves RP, Wallace HAC, Smith AJH, Hughes J, Gray N, Taylor S, Wood WG, Higgs DR et al. Association between active genesoccurs at nuclear speckles and is modulated by chromatin environment. (2008) J. Cell Biol, 182: pp. 1083-1097.

100. Brown JM, Leach J, Reittie JE, Atzberger A, Lee-Prudhoe J, Wood WG, Higgs DR, Iborra FJ, Buckle VJ. Coregulated human globin genes are frequently in spatial proximity when active. (2006) J. Cell Biol., 172: pp. 177-187.

101. Brown KE, Baxter J, Graf D, Merkenschlager M, Fisher AG. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. (1999) M?/. Cell, 3: pp. 207-217.

102. Brown KE, Guest SS, Smale ST, Hahm K, Merkenschlager M, Fisher AG. Association of transcriptionally silent genes with ikaros complexes at centromeric heterochromatin. (1997) Cell, 91: pp. 845-854.

103. Brown SD, Avner P, Chapman VM, Hamvas RM, Herman GE. Mouse X chromosome. (1991) Mamm. Genome, 1 Spec No: p. S318-31.

104. Brun C, Surdej P, Miassod R. Relationship between scaffold-attached regions, sequences replicating autonomously in yeast, and a chromosomal replication origin in the drosophila rDNA. (1993) Exp. Cell Res., 208: pp. 104-114.

105. Bucci S, Ragghianti M, Nardi I, Bellini M, Mancino G, Lacroix JC. Identification of an amphibian oocyte nuclear protein as a candidate for a role in embryonic DNA replication. (1993) Int. J. Dev. Biol., 37: pp. 509-517.

106. Buongiorno-Nardelli M, Micheli G, Carri MT, Marilley M. A relationship between replicon size and supercoiled loop domains in the eukaryotic genome. (1982) Nature, 298: pp. 100-102.

107. Burkholder GD. Silver staining of histone-depleted metaphase chromosomes. (1983) Exp. Cell Res., 147: pp. 287-296.

108. Burry RW, Vandré DD, Hayes DM. Silver enhancement of gold antibody probes in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. (1992) J. Histochem. Cytochem., 40: pp. 1849-1856.

109. Bushey AM, Dorman ER, Corces VG. Chromatin insulators: regulatory mechanisms and epigenetic inheritance. (2008) Mol. Cell, 32: pp. 1-9.

110. Cabello OA, Eliseeva E, He WG, Youssoufian H, Pion SE, Brinkley BR, Belmont JW. Cell cycle-dependent expression and nucleolar localization of HCAP-H. (2001) Mol. Biol. Cell, 12: pp. 3527-3537.

111. Cairns BR. The logic of chromatin architecture and remodelling at promoters. (2009) Nature, 461: pp. 193-198.

112. Callan HG. Replication of DNA in the chromosomes of eukaryotes. (1972) Proc. R. Soc. Lond., B, Biol. Sci., 181: pp. 19-41.

113. Callan HG. The Croonian lecture, 1981. Lampbrush chromosomes. (1982) Proc. R. Soc. Lond., B, Biol. Sci., 214: pp. 417-448.

114. Callan HG. Lampbrush chromosomes. (1986) Mol Biol Biochem Bio-phys, 36: pp. 1-252.

115. Campos EI, Reinberg D. Histones: annotating chromatin. (2009) Annu. Rev. Genet., 43: pp. 559-599.

116. Cardenas ME, Gasser SM. Regulation of topoisomerase II by phosphorylation: a role for casein kinase II. (1993) J. Cell. Sci., 104 ( Pt 2): pp. 219225.

117. Carpenter AE, Ashouri A, Belmont AS. Automated microscopy identifies estrogen receptor subdomains with large-scale chromatin structure unfolding activity. (2004) Cytometry A, 58: pp. 157-166.

118. Carpenter AE, Belmont AS. Direct visualization of transcription factor-induced chromatin remodeling and cofactor recruitment in vivo. (2004) Meth. Enzymol., 375: pp. 366-381.

119. Carpenter AE, Memedula S, Plutz MJ, Belmont AS. Common effects of acidic activators on large-scale chromatin structure and transcription. (2005) Mol. Cell. Biol., 25: pp. 958-968.

120. Carpenter AJ, Porter ACG. Construction, characterization, and complementation of a conditional-lethal DNA topoisomerase Ilalpha mutant human cell line. (2004) Mol. Biol. Cell, 15: pp. 5700-5711.

121. Carri MT, Micheli G, Graziano E, Pace T, Buongiorno-Nardelli M. The relationship between chromosomal origins of replication and the nuclear matrix during the cell cycle. (1986) Exp. Cell Res., 164: pp. 426-436.

122. Carter D, Chakalova L, Osborne CS, Dai Y, Fraser P. Long-range chromatin regulatory interactions in vivo. (2002) Nat. Genet., 32: pp. 623-626.

123. Caspersson T, Zech L, Johansson C. Analysis of human metaphase chromosome set by aid of DNA-binding fluorescent agents. (1970) Exp. Cell Res., 62: pp. 490-492.

124. Chadwick BP, Willard HF. Multiple spatially distinct types of facultative heterochromatin on the human inactive X chromosome. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101: pp. 17450-17455.

125. Chagin VO, Stear JH, Cardoso MC. Organization of DNA replication. (2010) Cold Spring Harb Perspect Biol, 2: p. a000737.

126. Chakalova L, Carter D, Debrand E, Goyenechea B, Horton A, Miles J, Osborne C, Fraser P. Developmental regulation of the beta-globin gene locus. (2005) Prog. Mol. Subcell. Biol., 38: pp. 183-206.

127. Chambeyron S, Bickmore WA. Chromatin decondensation and nuclear reorganization of the HoxB locus upon induction of transcription. (2004) Genes Dev., 18: pp. 1119-1130.

128. Chang YC, Illenye S, Heintz NH. Cooperation of E2F-pl30 and SP1-PRB complexes in repression of the Chinese hamster DHFR gene. (2001) Mol. Cell. Biol., 21: pp. 1121-1131.

129. Chaumeil J, Le Baccon P, Wutz A, Heard E. A novel role for XIST RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. (2006) Genes Dev., 20: pp. 2223-2237.

130. Chaumeil J, Okamoto I, Heard E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and fish. (2004) Meth. Enzymol., 376: pp. 405-419.

131. Chen D, Belmont AS, Huang S. Upstream binding factor association induces large-scale chromatin decondensation. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101: pp. 15106-15111.

132. Chen D, Dundr M, Wang C, Leung A, Lamond A, Misteli T, Huang S. Condensed mitotic chromatin is accessible to transcription factors and chromatin structural proteins. (2005) J. Cell Biol., 168: pp. 41-54.

133. Chi JX, Huang L, Nie W, Wang J, Su B, Yang F. Defining the orientation of the tandem fusions that occurred during the evolution of indian muntjac chromosomes by bac mapping. (2005) Chromosoma, 114: pp. 167-172.

134. Chien R, Zeng W, Ball AR, Yokomori K. Cohesin: a critical chromatin organizer in mammalian gene regulation. (2011) Biochem. Cell Biol., 89: pp. 445-458.

135. Chien R, Zeng W, Kawauchi S, Bender MA, Santos R, Gregson HC, Schmiesing JA, Newkirk DA, Kong X, Ball ARJ et al. Cohesin mediates chromatin interactions that regulate mammalian (3-globin expression. (2011) J. Biol. Chem., 286: pp. 17870-17878.

136. Chiu SM, Xue LY, Friedman LR, Oleinick NL. Copper ion-mediated sensitization of nuclear matrix attachment sites to ionizing radiation. (1993) Biochemistry, 32: pp. 6214-6219.

137. Chow JC, Brown CJ. Forming facultative heterochromatin: silencing of an X chromosome in mammalian females. (2003) Cell. Mol. Life Sci., 60: pp. 2586-2603.

138. Christensen MO, Larsen MK, Barthelmes HU, Hock R, Andersen CL, Kjeldsen E, Knudsen BR, Westergaard O, Boege F, Mielke C. Dynamics of human DNA topoisomerases Ilalpha and Ilbeta in living cells. (2002) J. Cell Biol., 157: pp. 31-44.

139. Chuang C, Carpenter AE, Fuchsova B, Johnson T, de Lanerolle P, Belmont AS. Long-range directional movement of an interphase chromosome site. (2006) Curr. Biol., 16: pp. 825-831.

140. Chubb JR, Boyle S, Perry P, Bickmore WA. Chromatin motion is constrained by association with nuclear compartments in human cells. (2002) Curr. Biol., 12: pp. 439-445.

141. Clemson CM, Hall LL, Byron M, McNeil J, Lawrence JB. The X chromosome is organized into a gene-rich outer rim and an internal core containing silenced nongenic sequences. (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 103: pp. 7688-7693.

142. Clemson CM, McNeil JA, Willard HF, Lawrence JB. Xist RNA paints the inactive X chromosome at interphase: evidence for a novel RNA involved in nuclear/chromosome structure. (1996)7! Cell Biol., 132: pp. 259-275.

143. Cockerill PN, Garrard WT. Chromosomal loop anchorage of the kappa immunoglobulin gene occurs next to the enhancer in a region containing topoi-somerase II sites. (1986) Cell, 44: pp. 273-282.

144. Cockerill PN, Yuen MH, Garrard WT. The enhancer of the immunoglobulin heavy chain locus is flanked by presumptive chromosomal loop anchorage elements. (1987)/. Biol. Chem., 262: pp. 5394-5397.

145. Coelho PA, Queiroz-Machado J, Sunkel CE. Condensin-dependent localisation of topoisomerase II to an axial chromosomal structure is required for sister chromatid resolution during mitosis. (2003) J. Cell. Sci., 116: pp. 4763-4776.

146. Cohen SM, Cobb ER, Cordeiro-Stone M, Kaufman DG. Identification of chromosomal bands replicating early in the S phase of normal human fibroblasts. (1998) Exp. Cell Res., 245: pp. 321-329.

147. Collins TJ. Imagej for microscopy. (2007) BioTechniques, 43: pp. 25-30.

148. Comings DE. Mechanisms of chromosome banding and implications for chromosome structure. (1978) Annu. Rev. Genet., 12: pp. 25-46.

149. Comings DE. Lateral asymmetry of human chromosomes. (1978) Am. J. Hum. Genet., 30: pp. 223-226.

150. Comings DE. Arrangement of chromatin in the nucleus. (1980) Hum. Genet., 53: pp. 131-143.

151. Comings DE, Harris DC, Okada TA, Holmquist G. Nuclear proteins. IV. deficiency of non-histone proteins in condensed chromatin of drosophila virilis and mouse. (1977) Exp. Cell Res., 105: pp. 349-365.

152. Cook PR. The nucleoskeleton: artefact, passive framework or active site?. (1988) J. Cell. Sci., 90 (Pt 1): pp. 1-6.

153. Cook PR. The organization of replication and transcription. (1999) Science, 284: pp. 1790-1795.

154. Cook PR, Brazell IA. Supercoils in human DNA. (1975) J. Cell. Sci., 19: pp. 261-279.

155. Cook PR, Brazell IA. Conformational constraints in nuclear DNA. (1976) J. Cell. Sci., 22: pp. 287-302.

156. Cook PR, Brazell IA, Jost E. Characterization of nuclear structures containing superhelical DNA. (1976) J. Cell. Sci., 22: pp. 303-324.

157. Cope NF, Fraser P, Eskiw CH. The yin and yang of chromatin spatial organization. (2010) Genome Biol., 11: p. 204.

158. Costantini M, Bernardi G. Replication timing, chromosomal bands, and isochores. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 105: pp. 3433-3437.

159. Costantini M, Clay O, Auletta F, Bernardi G. An isochore map of human chromosomes. (2006) Genome Res., 16: pp. 536-541.

160. Cox LS, Laskey RA. DNA replication occurs at discrete sites in pseudo-nuclei assembled from purified DNA in vitro. (1991) Cell, 66: pp. 271-275.

161. Craig JM, Bickmore WA. Chromosome bands—flavours to savour. (1993) Bioessays, 15: pp. 349-354.

162. Craig JM, Bickmore WA. The distribution of cpg islands in mammalian chromosomes. (1994) Nat. Genet., 7: pp. 376-382.

163. Cremer T, Cremer C, Schneider T, Baumann H, Hens L, Kirsch-Volders M. Analysis of chromosome positions in the interphase nucleus of Chinese hamster cells by laser-UV-microirradiation experiments. (1982) Hum. Genet., 62: pp. 201-209.

164. Cremer T, Cremer M, Dietzel S, Müller S, Solovei I, Fakan S. Chromosome territories—a functional nuclear landscape. (2006) Curr. Opin. Cell Biol., 18: pp. 307-316.

165. Cremer T, Lichter P, Borden J, Ward DC, Manuelidis L. Detection of chromosome aberrations in metaphase and interphase tumor cells by in situ hybridization using chromosome-specific library probes. (1988) Hum. Genet., 80: pp. 235-246.

166. Croft JA, Bridger JM, Boyle S, Perry P, Teague P, Bickmore WA. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. (1999) J. Cell Biol, 145: pp. 1119-1131.

167. Csankovszki G, Panning B, Bates B, Pehrson JR, Jaenisch R. Conditional deletion of xist disrupts histone macroH2A localization but not maintenance of X inactivation. (1999) Nat. Genet., 22: pp. 323-324.

168. Cseresnyes Z, Schwarz U, Green CM. Analysis of replication factories in human cells by super-resolution light microscopy. (2009) BMC Cell Biol, 10: p. 88.

169. Cubizolles F, Legagneux V, Le Guellec R, Chartrain I, Uzbekov R, Ford C, Le Guellec K. pEg7, a new Xenopus protein required for mitotic chromosome condensation in egg extracts. (1998)7! Cell Biol, 143: pp. 1437-1446.

170. Cuvier O, Hirano T. A role of topoisomerase II in linking DNA replication to chromosome condensation. (2003) J. Cell Biol, 160: pp. 645-655.

171. D'Ambrosio C, Kelly G, Shirahige K, Uhlmann F. Condensin-dependent rDNA decatenation introduces a temporal pattern to chromosome segregation. (2008) Curr. Biol., 18: pp. 1084-1089.

172. Dean A. On a chromosome far, far away: LCRs and gene expression. (2006) Trends Genet., 22: pp. 38-45.

173. Dej KJ, Ahn C, Orr-Weaver TL. Mutations in the Drosophila condensin subunit dcap-g: defining the role of condensin for chromosome condensation in mitosis and gene expression in interphase. (2004) Genetics, 168: pp. 895-906.

174. Dekker J, Rippe K, Dekker M, Kleckner N. Capturing chromosome conformation. (2002) Science, 295: pp. 1306-1311.

175. Dhalluin C, Carlson JE, Zeng L, He C, Aggarwal AK, Zhou MM. Structure and ligand of a histone acetyltransferase bromodomain. (1999) Nature, 399: pp. 491-496.

176. Dickinson LA, Joh T, Kohwi Y, Kohwi-Shigematsu T. A tissue-specific MAR/SAR DNA-binding protein with unusual binding site recognition. (1992) Cell, 70: pp. 631-645.

177. Dietzel S, Belmont AS. Reproducible but dynamic positioning of DNA in chromosomes during mitosis. (2001) Nat. Cell Biol., 3: pp. 767-770.

178. Dietzel S, Schiebel K, Little G, Edelmann P, Rappold GA, Eils R, Cremer C, Cremer T. The 3D positioning of ANT2 and ANT3 genes within female X chromosome territories correlates with gene activity. (1999) Exp. Cell Res., 252: pp. 363-375.

179. Dijkwel PA, Wenink PW, Poddighe J. Permanent attachment of replication origins to the nuclear matrix in BHK-cells. (1986) Nucleic Acids Res., 14: pp. 3241-3249.

180. Dillon N. The impact of gene location in the nucleus on transcriptional regulation. (2008) Dev. Cell, 15: pp. 182-186.

181. Dimitrova DS, Gilbert DM. The spatial position and replication timing of chromosomal domains are both established in early G1 phase. (1999) Mol Cell, 4: pp. 983-993.

182. Dorsett D. Distant liaisons: long-range enhancer-promoter interactions in Drosophila. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev., 9: pp. 505-514.

183. Dou Y, Gorovsky MA. Phosphorylation of linker histone HI regulates gene expression in vivo by creating a charge patch. (2000) Mol. Cell, 6: pp. 225-231.

184. Drouin R, Lemieux N, Richer CL. Analysis of DNA replication during s-phase by means of dynamic chromosome banding at high resolution. (1990) Chromosoma, 99: pp. 273-280.

185. Drouin R, Lemieux N, Richer CL. Chromosome condensation from prophase to late metaphase: relationship to chromosome bands and their replication time. (1991) Cytogenet. Cell Genet., 57: pp. 91-99.

186. Drouin R, Lemieux N, Richer CL. High-resolution R-banding at the 1250-band level. III. comparative analysis of morphologic and dynamic R-band patterns (RHG and RBG). (1991) Hereditas, 114: pp. 65-77.

187. Drouin R, Messier PE, Richer CL. Dynamic G- and R-banding of human chromosomes for electron microscopy. (1989) Chromosoma, 98: pp. 40-48.

188. Dundr M, Ospina JK, Sung M, John S, Upender M, Ried T, Hager GL, Matera AG. Actin-dependent intranuclear repositioning of an active gene locus in vivo. (2007) J. Cell Biol., 179: pp. 1095-1103.

189. Dutrillaux B, Couturier J, Richer CL, Viegas-Péquignot E. Sequence of DNA replication in 277 R- and Q-bands of human chromosomes using a BrdU treatment. (1976) Chromosoma, 58: pp. 51-61.

190. Earnshaw WC, Halligan B, Cooke CA, Heck MM, Liu LF. Topoi-somerase II is a structural component of mitotic chromosome scaffolds. (1985) J. Cell Biol, 100: pp. 1706-1715.

191. Earnshaw WC, Heck MM. Localization of topoisomerase II in mitotic chromosomes. (1985) J. Cell Biol, 100: pp. 1716-1725.

192. Earnshaw WC, Laemmli UK. Architecture of metaphase chromosomes and chromosome scaffolds. (1983) J. Cell Biol, 96: pp. 84-93.

193. Earnshaw WC, Laemmli UK. Silver staining the chromosome scaffoîd. (1984) Chromosoma, 89: pp. 186-192.

194. Eide T, Carlson C, Taskén KA, Hirano T, Taskén K, Collas P. Distinct but overlapping domains of AKAP95 are implicated in chromosome condensation and condensin targeting. (2002) EMBO Rep., 3: pp. 426-432.

195. Elgin SC. Chromatin structure and gene activity. (1990) Curr. Opin. Cell Biol, 2: pp. 437-445.

196. Ellis GC, Grobler-Rabie AF, Hough FS, Bester AJ. Location and methyl -ation pattern of a nuclear matrix associated region in the human pro alpha 2(i) collagen gene. (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun., 157: pp. 500-506.

197. Ericsson C, Mehlin H, Bjorkroth B, Lamb MM, Daneholt B. The ultrastructure of upstream and downstream regions of an active Balbiani ring gene. (1989) Cell, 56: pp. 631-639.

198. Fackelmayer FO. A stable proteinaceous structure in the territory of inactive x chromosomes. (2005) J. Biol. Chem., 280: pp. 1720-1723.

199. Farnham PJ, Schimke RT. Murine dihydrofolate reductase transcripts through the cell cycle. (1986) Mol. Cell. Biol., 6: pp. 365-371.

200. Feder JN, Assaraf YG, Seamer LC, Schimke RT. The pattern of dihydrofolate reductase expression through the cell cycle in rodent and human cultured cells. (1989) J. Biol. Chem., 264: pp. 20583-20590.

201. Federico C, Andreozzi L, Saccone S, Bernardi G. Gene density in the giemsa bands of human chromosomes. (2000) Chromosome Res., 8: pp. 737746.

202. Federico C, Saccone S, Bernardi G. The gene-richest bands of human chromosomes replicate at the onset of the S-phase. (1998) Cytogenet. Cell Genet., 80: pp. 83-88.

203. Ferreira J, Paolella G, Ramos C, Lamond AI. Spatial organization of large-scale chromatin domains in the nucleus: a magnified view of single chromosome territories. (1997)7! Cell Biol., 139: pp. 1597-1610.

204. Fields AP, Kaufmann SH, Shaper JH. Analysis of the internal nuclear matrix. Oligomers of a 38 kd nucleolar polypeptide stabilized by disulfide bonds. (1986) Exp. Cell Res., 164: pp. 139-153.

205. Finch JT, Klug A. Solenoidal model for superstructure in chromatin. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 73: pp. 1897-1901.

206. Fiore M, Zanier R, Degrassi F. Reversible G1 arrest by dimethyl sulfoxide as a new method to synchronize Chinese hamster cells. (2002) Mutagenesis, 17: pp. 419-424.

207. Fischer D, Hock R, Scheer U. DNA topoisomerase II is not detectable on lampbrush chromosomes but enriched in the amplified nucleoli of Xenopus oocytes. (1993) Exp. Cell Res., 209: pp. 255-260.

208. Fox MH, Arndt-Jovin DJ, Jovin TM, Baumann PH, Robert-Nicoud M. Spatial and temporal distribution of DNA replication sites localized by immunofluorescence and confocal microscopy in mouse fibroblasts. (1991) Cell. Sci., 99 (Pt 2): pp. 247-253.

209. Freeman L, Aragón-Alcaide L, Strunnikov A. The condensin complex governs chromosome condensation and mitotic transmission of rDNA. (2000) J. Cell Biol., 149: pp. 811-824.

210. Gaginskaya E, Kulikova T, Krasikova A. Avian lampbrush chromosomes: a powerful tool for exploration of genome expression. (2009) Cytogenet. Genome Res., 124: pp. 251-267.

211. Galcheva-Gargova Z, Petrov P, Dessev G. Effect of chromatin decondensation on the intranuclear matrix. (1982) Eur. J. Cell Biol., 28: pp. 155-159.

212. Gall JG, Bellini M, Wu Z, Murphy C. Assembly of the nuclear transcription and processing machinery: Cajal bodies (coiled bodies) and transcripto-somes. (1999) Mol. Biol. Cell, 10: pp. 4385-4402.

213. Gall JG, Murphy C. Assembly of lampbrush chromosomes from sperm chromatin. (1998) Mol. Biol. Cell, 9: pp. 733-747.

214. Ganguly A, Bagchi B, Bera M, Ghosh AN, Sen A. Estimation of domain length of chicken erythrocyte chromatin. (1983) Biochim. Biophys. Acta, 739: pp. 286-290.

215. Gasser SM. Chromosome structure, coiling up chromosomes. (1995) Curr. Biol, 5: pp. 357-360.

216. Gasser SM, Laemmli UK. The organisation of chromatin loops: characterization of a scaffold attachment site. (1986) EMBOJ., 5: pp. 511-518.

217. Gasser SM, Laroche T, Falquet J, Boy de la Tour E, Laemmli UK. Metaphase chromosome structure. Involvement of topoisomerase II. (1986) J. Mol. Biol, 188: pp. 613-629.

218. Gassmann R, Vagnarelli P, Hudson D, Earnshaw WC. Mitotic chromosome formation and the condensin paradox. (2004) Exp. Cell Res., 296: pp. 3542.

219. Georgiev GP, Vassetzky YSJ, Luchnik AN, Chernokhvostov W, Razin SV. A. E. Braunstein plenary lecture. Nuclear skeleton, DNA domains and control of replication and transcription. (1991) Eur. J. Biochem., 200: pp. 613-624.

220. Gerdes MG, Carter KC, Moen PTJ, Lawrence JB. Dynamic changes in the higher-level chromatin organization of specific sequences revealed by in situ hybridization to nuclear halos. (1994) J. Cell Biol, 126: pp. 289-304.

221. Gerlich D, Hirota T, Koch B, Peters J, Ellenberg J. Condensin I stabilizes chromosomes mechanically through a dynamic interaction in live cells. (2006) Curr. Biol, 16: pp. 333-344.

222. Giet R, Glover DM. Drosophila Aurora B kinase is required for histone H3 phosphorylation and condensin recruitment during chromosome condensation and to organize the central spindle during cytokinesis. (2001) J. Cell Biol., 152: pp. 669-682.

223. Gilbert DM. Replication timing and metazoan evolution. (2002) Nat. Genet., 32: pp. 336-337.

224. Gilbert DM, Gasser SM. Nuclear structure and DNA replication. In DNA Replication and Human Disease. Ed. DePamphilis ML. (2006) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 175-196

225. Gilbert N, Bickmore WA. The relationship between higher-order chromatin structure and transcription. (2006) Biochem. Soc. Symp.,: pp. 59-66.

226. Gilbert N, Boyle S, Fiegler H, Woodfine K, Carter NP, Bickmore WA. Chromatin architecture of the human genome: gene-rich domains are enriched in open chromatin fibers. (2004) Cell, 118: pp. 555-566.

227. Gilerovitch HG, Bishop GA, King JS, Burry RW. The use of electron microscopic immunocytochemistry with silver-enhanced 1,4-nm gold particles to localize gad in the cerebellar nuclei. (1995) J. Histochem. Cytochem., 43: pp. 337-343.

228. Gilfillan GD, Straub T, de Wit E, Greil F, Lamm R, van Steensel B, Becker PB. Chromosome-wide gene-specific targeting of the drosophila dosage compensation complex. (2006) Genes Dev., 20: pp. 858-870.

229. Gimenez-Abian JF, Clarke DJ, Devlin J, Gimenez-Abian MI, De la Torre C, Johnson RT, Mullinger AM, Downes CS. Premitotic chromosome individualization in mammalian cells depends on topoisomerase II activity. (2000) Chro-mosoma, 109: pp. 235-244.

230. Ginzinger DG. Gene quantification using real-time quantitative per: an emerging technology hits the mainstream. (2002) Exp. Hematol., 30: pp. 503512.

231. Godeau F, Ishizaka T, Koide SS. Early stimulation of phospholipid methylation in xenopus oocytes by progesterone. (1985) Cell Differ., 16: pp. 3541.

232. Goetze S, Mateos-Langerak J, van Driel R. Three-dimensional genome organization in interphase and its relation to genome function. (2007) Semin. Cell Dev. Biol., 18: pp. 707-714.

233. Goldberg GI, Collier I, Cassel A. Specific DNA sequences associated with the nuclear matrix in synchronized mouse 3t3 cells. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: pp. 6887-6891.

234. Goldman MA, Holmquist GP, Gray MC, Caston LA, Nag A. Replication timing of genes and middle repetitive sequences. (1984) Science, 224: pp. 686692.

235. González-Melendi P, Testillano PS, Ahmadian P, Reyes J, Risueño MC. Immunoelectron microscopy of pena as an efficient marker for studying replication times and sites during pollen development. (2000) Chromosoma, 109: pp. 397-409.

236. González-Melendi P, Testillano PS, Mena CG, Muller S, Raska I, Risueño MC. Histones and DNA ultrastructural distribution in plant cell nucleus: a combination of immunogold and cytochemical methods. (1998) Exp. Cell Res., 242: pp. 45-59.

237. Gooderham K, Jeppesen P. Chinese hamster metaphase chromosomes isolated under physiological conditions, a partial characterization of associated non-histone proteins and protein cores. (1983) Exp. Cell Res., 144: pp. 1-14.

238. Goren A, Cedar H. Replicating by the clock. (2003) Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4: pp. 25-32.

239. Gorisch SM, Lichter P, Rippe K. Mobility of multi-subunit complexes in the nucleus: accessibility and dynamics of chromatin subcompartments. (2005) Histochem. Cell Biol., 123: pp. 217-228.

240. Gorisch SM, Richter K, Scheuermann MO, Herrmann H, Lichter P. Diffusion-limited compartmentalization of mammalian cell nuclei assessed by mi-croinjected macromolecules. (2003) Exp. Cell Res., 289: pp. 282-294.

241. Gorisch SM, Wachsmuth M, Toth KF, Lichter P, Rippe K. Histone acet-ylation increases chromatin accessibility. (2005) J. Cell. Sci., 118: pp. 58255834.

242. Greenstein RJ. Constitutive attachment of murine erythroleukemia cell histone-depleted DNA loops to nuclear scaffolding is found in the beta-major but not the alpha 1-globin gene. (1988) DNA, 7: pp. 601-607.

243. Gregson HC, Van Hooser AA, Ball ARJ, Brinkley BR, Yokomori K. Localization of human smcl protein at kinetochores. (2002) Chromosome Res., 10: pp. 267-277.

244. Groves MR, Barford D. Topological characteristics of helical repeat proteins. (1999) Curr. Opin. Struct. Biol., 9: pp. 383-389.

245. Gruber S, Haering CH, Nasmyth K. Chromosomal cohesin forms a ring. (2003) Cell, 112: pp. 765-777.

246. Grunstein M. Histone acetylation in chromatin structure and transcription. (1997) Nature, 389: pp. 349-352.

247. Guacci V, Koshland D, Strunnikov A. A direct link between sister chromatid cohesion and chromosome condensation revealed through the analysis of mcdl in s. cerevisiae. (1997) Cell, 91: pp. 47-57.

248. Gustafsson MGL, Shao L, Carlton PM, Wang CJR, Golubovskaya IN, Cande WZ, Agard DA, Sedat JW. Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination. (2008) Biophys. J., 94: pp. 4957-4970.

249. Haapala O. Chromatid macrocoiling and chromosome compaction. (1984) Hereditas, 100: pp. 17-27.

250. Haapala O, Nokkala S. Structure of human metaphase chromosomes. (1982) Hereditas, 96: pp. 215-228.

251. Hadlaczky G, Sumner AT, Ross A. Protein-depleted chromosomes. II. experiments concerning the reality of chromosome scaffolds. (1981) Chromo-soma, 81: pp. 557-567.

252. Haering CH, Lowe J, Hochwagen A, Nasmyth K. Molecular architecture of smc proteins and the yeast cohesin complex. (2002) Mol. Cell, 9: pp. 773788.

253. Hagstrom KA, Holmes VF, Cozzarelli NR, Meyer BJ. C. elegans con-densin promotes mitotic chromosome architecture, centromere organization, and sister chromatid segregation during mitosis and meiosis. (2002) Genes Dev., 16: pp. 729-742.

254. Hagstrom KA, Meyer BJ. Condensin and cohesin: more than chromosome compactor and glue. (2003) Nat. Rev. Genet., 4: pp. 520-534.

255. Hancock R, Hughes ME. Organization of DNA in the eukaryotic nucleus. (1982). Biol. Cell. 44: pp.201-121.

256. Hand R. Deoxyribonucleic acid fiber autoradiography as a technique for studying the replication of the mammalian chromosome. (1975) J. Histochem. Cytochem., 23: pp. 475-481.

257. Hand R. Human DNA replication: fiber autoradiographic analysis of diploid cells from normal adults and from fanconi's anemia and ataxia telangiectasia. (1977) Hum. Genet., 37: pp. 55-64.

258. Hanna JS, Kroll ES, Lundblad V, Spencer FA. Saccharomyces cerevisiae ctfl8 and ctf4 are required for sister chromatid cohesion. (2001) Mol. Cell. Biol., 21: pp. 3144-3158.

259. Happel N, Doenecke D. Histone hi and its isoforms: contribution to chromatin structure and function. (2009) Gene, 431: pp. 1-12.

260. Harrison CJ, Jack EM, Allen TD, Harris R. Light and scanning electron microscopy of the same human metaphase chromosomes. (1985) J. Cell. Sci., 77: pp. 143-153.

261. Hart CM, Laemmli UK. Facilitation of chromatin dynamics by sars. (1998) Curr. Opin. Genet. Dev., 8: pp. 519-525.

262. Hartman T, Stead K, Koshland D, Guacci V. Pds5p is an essential chromosomal protein required for both sister chromatid cohesion and condensation in saccharomyces cerevisiae. (2000) J. Cell Biol., 151: pp. 613-626.

263. Hartwig M. The size of independently supercoiled domains in nuclear DNA from normal human lymphocytes and leukemic lymphoblasts. (1982) Biochim. Biophys. Acta, 698: pp. 214-217.

264. Hasegawa Y, Brockdorff N, Kawano S, Tsutui K, Tsutui K, Nakagawa S. The matrix protein hnrnp u is required for chromosomal localization of Xist RNA. (2010) Dev. Cell, 19: pp. 469-476.

265. Hassan AB, Errington RJ, White NS, Jackson DA, Cook PR. Replication and transcription sites are colocalized in human cells. (1994) J. Cell. Sci., 107 ( Pt 2): pp. 425-434.

266. Hatton KS, Dhar V, Brown EH, Iqbal MA, Stuart S, Didamo VT, Schildkraut CL. Replication program of active and inactive multigene families in mammalian cells. (1988) Mol. Cell. Biol., 8: pp. 2149-2158.

267. Heale JT, Ball ARJ, Schmiesing JA, Kim J, Kong X, Zhou S, Hudson DF, Earnshaw WC, Yokomori K. Condensin i interacts with the parp-1-xrccl complex and functions in DNA single-strand break repair. (2006) Mol. Cell, 21: pp. 837-848.

268. Heard E, Disteche CM. Dosage compensation in mammals: fine-tuning the expression of the x chromosome. (2006) Genes Dev., 20: pp. 1848-1867.

269. Hebbes TR, Clayton AL, Thorne AW, Crane-Robinson C. Core histone hyperacetylation co-maps with generalized DNAse i sensitivity in the chicken beta-globin chromosomal domain. (1994) EMBOJ., 13: pp. 1823-1830.

270. Heck MM, Earnshaw WC. Topoisomerase II: a specific marker for cell proliferation. (1986) J. Cell Biol, 103: pp. 2569-2581.

271. Heck MM, Hittelman WN, Earnshaw WC. Differential expression of DNA topoisomerases I and II during the eukaryotic cell cycle. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: pp. 1086-1090.

272. Heck MM, Hittelman WN, Earnshaw WC. In vivo phosphorylation of the 170-kda form of eukaryotic DNA topoisomerase II. cell cycle analysis. (1989) J. Biol. Chem., 264: pp. 15161-15164.

273. Heitz E. Das heterochromatin der moose, 1. (1928) Jahrb Wiss Bot, 69: p. 762-818.

274. Hendzel MJ, Bazett-Jones DP. Probing nuclear ultrastructure by electron spectroscopic imaging. (1996) JMicrosc, 182: pp. 1-14.

275. Henikoff S, Ahmad K. Assembly of variant histones into chromatin. (2005) Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 21: pp. 133-153.

276. Henry, H., and Heng, Q. High resolution FISH mapping using chromatin and DNA fibers. In FISH: A practical approach. (2002). Oxford: Oxford University Press, pp. 77-91.

277. Hep 1er PK. Calcium transients during mitosis: observations in flux. (1989) J. Cell Biol, 109: pp. 2567-2573.

278. Heun P, Laroche T, Shimada K, Furrer P, Gasser SM. Chromosome dynamics in the yeast interphase nucleus. (2001) Science, 294: pp. 2181-2186.

279. Hidalgo J, Carrasco J. Regulation of the synthesis of brain métallo-thioneins. (1998) Neurotoxicology, 19: pp. 661-666.

280. Hieda M, Winstanley H, Maini P, Iborra FJ, Cook PR. Different populations of RNA polymerase II in living mammalian cells. (2005) Chromosome Res., 13: pp. 135-144.

281. Hirano T. Smc protein complexes and higher-order chromosome dynamics. (1998) Curr. Opin. Cell Biol, 10: pp. 317-322.

282. Hirano T. Chromosome cohesion, condensation, and separation. (2000) Annu. Rev. Biochem., 69: pp. 115-144.

283. Hirano T. The abcs of smc proteins: two-armed atpases for chromosome condensation, cohesion, and repair. (2002) Genes Dev., 16: pp. 399-414.

284. Hirano T, Kobayashi R, Hirano M. Condensins, chromosome condensation protein complexes containing xcap-c, xcap-e and a xenopus homolog of the drosophila barren protein. (1997) Cell, 89: pp. 511-521.

285. Hirano T, Mitchison TJ. Cell cycle control of higher-order chromatin assembly around naked DNA in vitro. (1991) J. Cell Biol, 115: pp. 1479-1489.

286. Hirano T, Mitchison TJ. Topoisomerase II does not play a scaffolding role in the organization of mitotic chromosomes assembled in xenopus egg extracts. (1993) J. Cell Biol., 120: pp. 601-612.

287. Hirano T, Mitchison TJ. A heterodimeric coiled-coil protein required for mitotic chromosome condensation in vitro. (1994) Cell, 79: pp. 449-458.

288. Hiraoka Y, Swedlow JR, Paddy MR, Agard DA, Sedat JW. Three-dimensional multiple-wavelength fluorescence microscopy for the structural analysis of biological phenomena. (1991) Semin. Cell Biol., 2: pp. 153-165.

289. Hiratani I, Leskovar A, Gilbert DM. Differentiation-induced replication-timing changes are restricted to at-rich/long interspersed nuclear element (line)-rich isochores. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 101: pp. 1686116866.

290. Hiratani I, Ryba T, Itoh M, Yokochi T, Schwaiger M, Chang C, Lyou Y, Townes TM, Schiibeler D, Gilbert DM. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. (2008) PLoS Biol., 6: p. e245.

291. Hirota T, Gerlich D, Koch B, Ellenberg J, Peters J. Distinct functions of condensin I and II in mitotic chromosome assembly. (2004) J. Cell. Sci., 117: pp. 6435-6445.

292. Ho L, Crabtree GR. Chromatin remodelling during development. (2010) Nature, 463: pp. 474-484.

293. Hock R, Carl M, Lieb B, Gebauer D, Scheer U. A monoclonal antibody against DNA topoisomerase II labels the axial granules of pleurodeles lamp-brush chromosomes. (1996) Chromosoma, 104: pp. 358-366.

294. Holloway SL, Glotzer M, King RW, Murray AW. Anaphase is initiated by proteolysis rather than by the inactivation of maturation-promoting factor. (1993) Cell, 73: pp. 1393-1402.

295. Holm C, Covey JM, Kerrigan D, Pommier Y. Differential requirement of DNA replication for the cytotoxicity of DNA topoisomerase I and II inhibitors in Chinese hamster dc3f cells. (1989) Cancer Res., 49: pp. 6365-6368.

296. Holmquist GP. Chromosome bands, their chromatin flavors, and their functional features. (1992),4m. J. Hum. Genet., 51: pp. 17-37.

297. Hopfner K, Tainer JA. Rad50/smc proteins and abc transporters: unifying concepts from high-resolution structures. (2003) Curr. Opin. Struct. Biol., 13: pp. 249-255.

298. Hopfner R, Mousli M, Jeltsch JM, Voulgaris A, Lutz Y, Marin C, Bellocq JP, Oudet P, Bronner C. Icbp90, a novel human ccaat binding protein, involved in the regulation of topoisomerase Ilalpha expression. (2000) Cancer Res., 60: pp. 121-128.

299. Horowitz-Scherer RA, Woodcock CL. Visualization and 3d structure determination of defined sequence chromatin and chromatin remodeling complexes. (2004) Meth. Enzymol., 376: pp. 29-48.

300. Houchmandzadeh B, Marko JF, Chatenay D, Libchaber A. Elasticity and structure of eukaryote chromosomes studied by micromanipulation and micropipette aspiration. (1997) J. Cell Biol., 139: pp. 1-12.

301. Howell WM, Hsu TC. Chromosome core structure revealed by silver staining. (1979) Chromosoma, 73: pp. 61-66.

302. Hozâk P, Hassan AB, Jackson DA, Cook PR. Visualization of replication factories attached to nucleoskeleton. (1993) Cell, 73: pp. 361-373.

303. Hozâk P, Jackson DA, Cook PR. Replication factories and nuclear bodies: the ultrastructural characterization of replication sites during the cell cycle. (1994)7. Cell. Sci., 107 ( Pt 8): pp. 2191-2202.

304. Hozier J, Renz M, Nehls P. The chromosome fiber: evidence for an ordered superstructure of nucleosomes. (1977) Chromosoma, 62: pp. 301-317.

305. Huberman JA, Riggs AD. On the mechanism of DNA replication in mammalian chromosomes. (1968) J. Mol. Biol., 32: pp. 327-341.

306. Jack EM, Harrison CJ, Allen TD, Harris R. The structural basis for c-banding. a scanning electron microscopy study. (1985) Chromosoma, 91: pp. 363-368.

307. Jack EM, Harrison CJ, Allen TD, Harris R. A structural basis for r- and t-banding: a scanning electron microscopy study. (1986) Chromosoma, 94: pp. 395-402.

308. Jack RS, Eggert H. The elusive nuclear matrix. (1992) Eur. J. Biochem., 209: pp. 503-509.

309. Jackson DA, Cook PR. Transcription occurs at a nucleoskeleton. (1985) EMBOJ., 4: pp. 919-925.

310. Jackson DA, Cook PR. Replication occurs at a nucleoskeleton. (1986) EMBOJ., 5: pp. 1403-1410.

311. Jackson DA, Dickinson P, Cook PR. The size of chromatin loops in hela cells. (1990) EMBOJ., 9: pp. 567-571.

312. Jackson DA, Dickinson P, Cook PR. Attachment of DNA to the nucleoskeleton of hela cells examined using physiological conditions. (1990) Nucleic Acids Res., 18: pp. 4385-4393.

313. Jackson DA, Hassan AB, Errington RJ, Cook PR. Visualization of focal sites of transcription within human nuclei. (1993) EMBOJ., 12: pp. 1059-1065.

314. Jackson DA, McCready S J, Cook PR. Replication and transcription depend on attachment of DNA to the nuclear cage. (1984) J. Cell Sci. Suppl., 1: pp. 59-79.

315. Jackson DA, Pombo A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of s phase in human cells. (1998) J. Cell Biol., 140: pp. 1285-1295.

316. Jackson DA, Pombo A, Iborra F. The balance sheet for transcription: an analysis of nuclear RNA metabolism in mammalian cells. (2000) FASEB J., 14: pp. 242-254.

317. Jackson DA, Yuan J, Cook PR. A gentle method for preparing cyto- and nucleo-skeletons and associated chromatin. (1988) J. Cell. Sci., 90 ( Pt 3): pp. 365-378.

318. Jacobson RH, Ladurner AG, King DS, Tjian R. Structure and function of a human TAFII250 double bromodomain module. (2000) Science, 288: pp. 1422-1425.

319. Jantzen K, Fritton HP, Igo-Kemenes T. The DNAse i sensitive domain of the chicken lysozyme gene spans 24 kb. (1986) Nucleic Acids Res., 14: pp. 6085-6099.

320. Jaunin F, Burns K, Tschopp J, Martin TE, Fakan S. Ultrastructural distribution of the death-domain-containing myd88 protein in hela cells. (1998) Exp. Cell Res., 243: pp. 67-75.

321. Jaunin F, Fakan S. DNA replication and nuclear architecture. (2002) J. Cell. Biochem., 85: pp. 1-9.

322. Jaunin F, Visser AE, Cmarko D, Aten JA, Fakan S. Fine structural in situ analysis of nascent DNA movement following DNA replication. (2000) Exp. Cell Res., 260: pp. 313-323.

323. Jenuwein T, Allis CD. Translating the histone code. (2001) Science, 293: pp. 1074-1080.

324. Jeppesen P, Turner BM. The inactive x chromosome in female mammals is distinguished by a lack of histone h4 acetylation, a cytogenetic marker for gene expression. (1993) Cell, 74: pp. 281-289.

325. Jeppesen PG, Bankier AT, Sanders L. Non-histone proteins and the structure of metaphase chromosomes. (1978) Exp. Cell Res., 115: pp. 293-302.

326. John S, Sabo PJ, Thurman RE, Sung M, Biddie SC, Johnson TA, Hager GL, Stamatoyannopoulos JA. Chromatin accessibility pre-determines glucocorticoid receptor binding patterns. (2011) Nat. Genet., 43: pp. 264-268.

327. Jolly C, Vourc'h C, Robert-Nicoud M, Morimoto RI. Intron-independent association of splicing factors with active genes. (1999) J. Cell Biol., 145: pp. 1133-1143.

328. Jones S, Sgouros J. The cohesin complex: sequence homologies, interaction networks and shared motifs. (2001) Genome Biol., 2: p. RESEARCH0009.

329. Kaitna S, Pasierbek P, Jantsch M, Loidl J, Glotzer M. The aurora b kinase air-2 regulates kinetochores during mitosis and is required for separation of homologous chromosomes during meiosis. (2002) Curr. Biol., 12: pp. 798812.

330. Kalandadze AG, Razin SV, Georgiev GP. cloning and analysis of nucleotide sequences permanently attached to nuclear skeleton of DNA fragments. (1988) Dokl. Akad. NaukSSSR, 300: pp. 1001-1005.

331. Kamakaka RT, Biggins S. Histone variants: deviants?. (2005) Genes Dev., 19: pp. 295-310.

332. Kanda T, Sullivan KF, Wahl GM. Histone-gfp fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. (1998) Curr. Biol., 8: pp. 377-385.

333. Käs E, Chasin LA. Anchorage of the Chinese hamster dihydrofolate reductase gene to the nuclear scaffold occurs in an intragenic region. (1987) J. Mol. Biol., 198: pp. 677-692.

334. Käs E, Izaurralde E, Laemmli UK. Specific inhibition of DNA binding to nuclear scaffolds and histone hi by distamycin. the role of oligo(da).oligo(dt) tracts. (1989) J. Mol. Biol., 210: pp. 587-599.

335. Käs E, Laemmli UK. In vivo topoisomerase II cleavage of the drosophila histone and satellite III repeats: DNA sequence and structural characteristics. (1992) EMBO J., 11: pp. 705-716.

336. Käs E, Poljak L, Adachi Y, Laemmli UK. A model for chromatin opening: stimulation of topoisomerase II and restriction enzyme cleavage of chromatin by distamycin. (1993) EMBO J., 12: pp. 115-126.

337. Kato H, Moriwaki K. Factors involved in the production of banded structures in mammalian chromosomes. (1972) Chromosoma, 38: pp. 105-120.

338. Kaufmann SH, Coffey DS, Shaper JH. Considerations in the isolation of rat liver nuclear matrix, nuclear envelope, and pore complex lamina. (1981) Exp. Cell Res., 132: pp. 105-123.

339. Kaufmann SH, Shaper JH. A subset of non-histone nuclear proteins re-versibly stabilized by the sulfhydryl cross-linking reagent tetrathionate. polypeptides of the internal nuclear matrix. (1984) Exp. Cell Res., 155: pp. 477-495.

340. Kaufmann SH, Shaper JH. Association of topoisomerase II with the hepatoma cell nuclear matrix: the role of intermolecular disulfide bond formation. (1991) Exp. Cell Res., 192: pp. 511-523.

341. Khorasanizadeh S. The nucleosome: from genomic organization to genomic regulation. (2004) Cell, 116: pp. 259-272.

342. Kim J, Daniel J, Espejo A, Lake A, Krishna M, Xia L, Zhang Y, Bedford MT. Tudor, mbt and chromo domains gauge the degree of lysine methylation. (2006) EMBORep., 7: pp. 397-403.

343. Kimmins S, Sassone-Corsi P. Chromatin remodelling and epigenetic features of germ cells. (2005) Nature, 434: pp. 583-589.

344. Kimura H, Cook PR. Kinetics of core histones in living human cells: little exchange of h3 and h4 and some rapid exchange of h2b. (2001) J. Cell Biol., 153: pp. 1341-1353.

345. Kimura H, Sugaya K, Cook PR. The transcription cycle of RNA polymerase II in living cells. (2002) J. Cell Biol., 159: pp. 777-782.

346. Kimura K, Hirano T. Atp-dependent positive supercoiling of DNA by 13s condensin: a biochemical implication for chromosome condensation. (1997) Cell, 90: pp. 625-634.

347. Kimura K, Hirano T. Dual roles of the lis regulatory subcomplex in condensin functions. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 97: pp. 11972-11977.

348. Kimura K, Rybenkov W, Crisona NJ, Hirano T, Cozzarelli NR. 13s condensin actively reconfigures DNA by introducing global positive writhe: implications for chromosome condensation. (1999) Cell, 98: pp. 239-248.

349. Kioussis D, Festenstein R. Locus control regions: overcoming hetero-chromatin-induced gene inactivation in mammals. (1997) Curr. Opin. Genet. Dev., 7: pp. 614-619.

350. Kirov N, Djondjurov L, Tsanev R. Nuclear matrix and transcriptional activity of the mouse alpha-globin gene. (1984) J. Mol. Biol., 180: pp. 601-614.

351. Kiryanov GI, Manamshjan TA, Polyakov VY, Fais D, Chentsov JS. Levels of granular organization of chromatin fibres. (1976) FEBS Lett., 67: pp. 323-327.

352. Kiryanov GI, Smirnova TA, Polyakov VYu. Nucleomeric organization of chromatin. (1982) Eur. J. Biochem., 124: pp. 331-338.

353. Kiryanov GI, Polyakov VY, Chentsov YuS. The levels of structural organization of the chromosomes. (1984). "SSR-Physiochemical biological review". 4: 283-334

354. Kleinjan DA, van Heyningen V. Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease. (2005) Am. J. Hum. Genet., 76: pp. 8-32.

355. Kohwi-Shigematsu T, Kohwi Y. Torsional stress stabilizes extended base unpairing in suppressor sites flanking immunoglobulin heavy chain enhancer. (1990) Biochemistry, 29: pp. 9551-9560.

356. Kornberg RD. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. (1974) Science, 184: pp. 868-871.

357. Kornberg RD, Klug A. The nucleosome. (1981) Sci. Am., 244: pp. 52-64.

358. Koshland D, Strunnikov A. Mitotic chromosome condensation. (1996) Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 12: pp. 305-333.

359. Krachmarov C, Tasheva B, Markov D, Hancock R, Dessev G. Isolation and characterization of nuclear lamina from ehrlich ascites tumor cells. (1986) J. Cell. Biochem., 30: pp. 351-359.

360. Kung AL, Sherwood SW, Schimke RT. Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: pp. 9553-9557.

361. G, Sudlow G, Belmont AS. Interphase cell cycle dynamics of a late-replicating, heterochromatic homogeneously staining region: precise choreography of condensation/decondensation and nuclear positioning. (1998) J. Cell Biol., 140: pp. 975-989.

362. ON MF. Gene action in the x-chromosome of the mouse (mus muscu-lus I.). (1961) Nature, 190: pp. 372-373.

363. Ma H, Samarabandu J, Devdhar RS, Acharya R, Cheng PC, Meng C, Berezney R. Spatial and temporal dynamics of DNA replication sites in mammalian cells. (1998) J. Cell Biol, 143: pp. 1415-1425.

364. MacAlpine DM, Rodriguez HK, Bell SR Coordination of replication and transcription along a drosophila chromosome. (2004) Genes Dev., 18: pp. 30943105.

365. MacCallum DE, Losada A, Kobayashi R, Hirano T. Iswi remodeling complexes in xenopus egg extracts: identification as major chromosomal components that are regulated by incenp-aurora b. (2002) Mol. Biol. Cell, 13: pp. 25-39.

366. Maeshima K, Eltsov M, Laemmli UK. Chromosome structure: improved immunolabeling for electron microscopy. (2005) Chromosoma, 114: pp. 365375.

367. Maeshima K, Laemmli UK. A two-step scaffolding model for mitotic chromosome assembly. (2003) Dev. Cell, 4: pp. 467-480.

368. Mahy NL, Perry PE, Bickmore WA. Gene density and transcription influence the localization of chromatin outside of chromosome territories detectable by fish. (2002) J. Cell Biol., 159: pp. 753-763.

369. Mahy NL, Perry PE, Gilchrist S, Baldock RA, Bickmore WA. Spatial organization of active and inactive genes and noncoding DNA within chromosome territories. (2002)/. Cell Biol., 157: pp. 579-589.

370. Manders EM, Stap J, Brakenhoff GJ, van Driel R, Aten JA. Dynamics of three-dimensional replication patterns during the s-phase, analysed by double labelling of DNA and confocal microscopy. (1992) J. Cell. Sci., 103 ( Pt 3): pp. 857-862.

371. Manders EM, Stap J, Strackee J, van Driel R, Aten JA. Dynamic behavior of DNA replication domains. (1996) Exp. Cell Res., 226: pp. 328-335.

372. Manuelidis L. Individual interphase chromosome domains revealed by in situ hybridization. (1985) Hum. Genet., 71: pp. 288-293.

373. Manuelidis L. A view of interphase chromosomes. (1990) Science, 250: pp. 1533-1540.

374. Marko JF. Micromechanical studies of mitotic chromosomes. (2008) Chromosome Res., 16: pp. 469-497.

375. Marsden MP, Laemmli UK. Metaphase chromosome structure: evidence for a radial loop model. (1979) Cell, 17: pp. 849-858.

376. Marshall WF, Straight A, Marko JF, Swedlow J, Deraburg A, Belmont A, Murray AW, Agard DA, Sedat JW. Interphase chromosomes undergo constrained diffusional motion in living cells. (1997) Curr. Biol., 7: pp. 930-939.

377. Maurer-Stroh S, Dickens NJ, Hughes-Davies L, Kouzarides T, Eisenhaber F, Ponting CP. The tudor domain 'royal family': tudor, plant agenet, chromo, pwwp and mbt domains. (2003) Trends Biochem. Sci., 28: pp. 69-74.

378. Mazzotti G, Gobbi P, Manzoli L, Falconi M. Nuclear morphology during the s phase. (1998) Microsc. Res. Tech., 40: pp. 418-431.

379. McKay RD. The mechanism of g and c banding in mammalian metaphase chromosomes. (1973) Chromosoma, 44: pp. 1-14.

380. Melby TE, Ciampaglio CN, Briscoe G, Erickson HP. The symmetrical structure of structural maintenance of chromosomes (smc) and mukb proteins: long, antiparallel coiled coils, folded at a flexible hinge. (1998) J. Cell Biol., 142: pp. 1595-1604.

381. Memedula S, Belmont AS. Sequential recruitment of hat and swi/snf components to condensed chromatin by vpl6. (2003) Curr. Biol., 13: pp. 241246.

382. Meyer BJ. Sex in the wormcounting and compensating x-chromosome dose. (2000) Trends Genet., 16: pp. 247-253.

383. Mielke C, Kohwi Y, Kohwi-Shigematsu T, Bode J. Hierarchical binding of DNA fragments derived from scaffold-attached regions: correlation of properties in vitro and function in vivo. (1990) Biochemistry, 29: pp. 7475-7485.

384. Miller M, Kloc M, Reddy B, Eastman E, Dreyer C, Etkin L. Xlgv7: a maternal gene product localized in nuclei of the central nervous system in xenopus laevis. (1989) Genes Dev., 3: pp. 572-583.

385. Mirkovitch J, Gasser SM, Laemmli UK. Scaffold attachment of DNA loops in metaphase chromosomes. (1988) J. Mol. Biol., 200: pp. 101-109.

386. Mirkovitch J, Mirault ME, Laemmli UK. Organization of the higherorder chromatin loop: specific DNA attachment sites on nuclear scaffold. (1984) Cell, 39: pp. 223-232.

387. Misteli T, Caceres JF, Spector DL. The dynamics of a pre-mRNA splicing factor in living cells. (1997) Nature, 387: pp. 523-527.

388. Mitchell JA, Fraser R Transcription factories are nuclear subcompart-ments that remain in the absence of transcription. (2008) Genes Dev., 22: pp. 20-25.

389. Moen PTJ, Johnson CV, Byron M, Shopland LS, de la Serna IL, Im-balzano AN, Lawrence JB. Repositioning of muscle-specific genes relative to the periphery of sc-35 domains during skeletal myogenesis. (2004) Mol. Biol. Cell, 15: pp. 197-206.

390. Mohrmann L, Verrijzer CP. Composition and functional specificity of swi2/snf2 class chromatin remodeling complexes. (2005) Biochim. Biophys. Acta, 1681: pp. 59-73.

391. Moran R, Darzynkiewicz Z, Staiano-Coico L, Melamed MR. Detection of 5-bromodeoxyuridine (brdurd) incorporation by monoclonal antibodies: role of the DNA denaturation step. (1985) J. Histochem. Cytochem., 33: pp. 821827.

392. Morey C, Da Silva NR, Perry P, Biekmore WA. Nuclear reorganisation and chromatin decondensation are conserved, but distinct, mechanisms linked to hox gene activation. (2007) Development, 134: pp. 909-919.

393. Morgan GT. Lampbrush chromosomes and associated bodies: new insights into principles of nuclear structure and function. (2002) Chromosome Res., 10: pp. 177-200.

394. MORISHIMA A, GRUMBACH MM, TAYLOR JH. Asynchronous duplication of human chromosomes and the origin of sex chromatin. (1962) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 48: pp. 756-763.

395. Morishita J, Matsusaka T, Goshima G, Nakamura T, Tatebe H, Yanagida M. Birl/cutl7 moving from chromosome to spindle upon the loss of cohesion is required for condensation, spindle elongation and repair. (2001) Genes Cells, 6: pp. 743-763.

396. Mullenders LH, van Zeeland AA, Natarajan AT. Comparison of DNA loop size and super-coiled domain size in human cells. (1983) Mutat. Res., 112: pp. 245-252.

397. Muller WG, Rieder D, Kreth G, Cremer C, Trajanoski Z, McNally JG. Generic features of tertiary chromatin structure as detected in natural chromosomes. (2004) Mol. Cell. Biol, 24: pp. 9359-9370.

398. Muller WG, Walker D, Hager GL, McNally JG. Large-scale chromatin decondensation and recondensation regulated by transcription from a natural promoter. (2001)/. Cell Biol, 154: pp. 33-48.

399. Mullinger AM, Johnson RT. The organization of supercoiled DNA from human chromosomes. (1979) J. Cell Sci., 38: pp. 369-389.

400. Mullinger AM, Johnson RT. Packing DNA into chromosomes. (1980) J. Cell. Sci., 46: pp. 61-86.

401. Miinkel C, Eils R, Dietzel S, Zink D, Mehring C, Wedemann G, Cremer T, Langowski J. Compartmentalization of interphase chromosomes observed in simulation and experiment. (1999) J. Mol Biol., 285: pp. 1053-1065.

402. Musio A, Mariani T, Frediani C, Sbrana I, Ascoli C. Longitudinal patterns similar to g-banding in untreated human chromosomes: evidence from atomic force microscopy. (1994) Chromosoma, 103: pp. 225-229.

403. Nakamura H, Morita T, Sato C. Structural organizations of replicon domains during DNA synthetic phase in the mammalian nucleus. (1986) Exp. Cell Res., 165: pp. 291-297.

404. Nakane M, Ide T, Anzai K, Ohara S, Andoh T. Supercoiled DNA folded by nonhistone proteins in cultured mouse carcinoma cells. (1978) J Biochem, 84: pp. 145-157.

405. Nakayama J, Rice JC, Strahl BD, Allis CD, Grewal SI. Role of histone h3 lysine 9 methylation in epigenetic control of heterochromatin assembly. (2001) Science, 292: pp. 110-113.

406. Nakayasu H, Berezney R. Mapping replicational sites in the eucaryotic cell nucleus. (1989)/. Cell Biol, 108: pp. 1-11.

407. Nasedkina TV, Slesinger SI. The structure of partly decondensed metaphase chromosomes. (1982) Chromosoma, 86: pp. 239-249.

408. Nasmyth K. Disseminating the genome: joining, resolving, and separating sister chromatids during mitosis and meiosis. (2001) Annu. Rev. Genet., 35: pp. 673-745.

409. Neuwald AF, Hirano T. Heat repeats associated with condensins, cohes-ins, and other complexes involved in chromosome-related functions. (2000) Genome Res., 10: pp. 1445-1452.

410. Nguyen VT, Giannoni F, Dubois MF, Seo SJ, Vigneron M, Kedinger C, Bensaude O. In vivo degradation of RNA polymerase II largest subunit triggered by alpha-amanitin. (1996) Nucleic Acids Res., 24: pp. 2924-2929.

411. Nowak SJ, Corces VG. Phosphorylation of histone h3: a balancing act between chromosome condensation and transcriptional activation. (2004) Trends Genet., 20: pp. 214-220.

412. Nye AC, Rajendran RR, Stenoien DL, Mancini MA, Katzenellenbogen BS, Belmont AS. Alteration of large-scale chromatin structure by estrogen receptor. (2002) Mol. Cell. Biol., 22: pp. 3437-3449.

413. O'Keefe RT, Henderson SC, Spector DL. Dynamic organization of DNA replication in mammalian cell nuclei: spatially and temporally defined replication of chromosome-specific alpha-satellite DNA sequences. (1992) J. Cell Biol., 116: pp. 1095-1110.

414. O'Neill LP, Randall TE, Lavender J, Spotswood HT, Lee JT, Turner BM. X-linked genes in female embryonic stem cells carry an epigenetic mark prior to the onset of x inactivation. (2003) Hum. Mol. Genet., 12: pp. 1783-1790.

415. Obi FO, Ryan AJ, Billett MA. Preferential binding of the carcinogen benzoa.pyrene to DNA in active chromatin and the nuclear matrix. (1986) Carcinogenesis, 7: pp. 907-913.

416. Ohnuki Y. Structure of chromosomes, i. morphological studies of the spiral structure of human somatic chromosomes. (1968) Chromosoma, 25: pp. 402-428.

417. Okada TA, Comings DE. Higher order structure of chromosomes. (1979) Chromosoma, 72: pp. 1-14.

418. Okada TA, Comings DE. A search for protein cores in chromosomes: is the scaffold an artifact?. (1980) Am. J. Hum. Genet., 32: pp. 814-832.

419. Olins AL, Olins DE. Spheroid chromatin units (v bodies). (1974) Science, 183: pp. 330-332.

420. Olins AL, Olins DE, Bazett-Jones DP. Balbiani ring hnrnp substructure visualized by selective staining and electron spectroscopic imaging. (1992) J. Cell Biol, ill: pp. 483-491.

421. Olins AL, Olins DE, Levy HA, Durfee RC, Margie SM, Tinnel EP. DNA compaction during intense transcription measured by electron microscope tomography. (1986) Eur. J. Cell Biol, 40: pp. 105-110.

422. Ono T, Fang Y, Spector DL, Hirano T. Spatial and temporal regulation of condensins I and II in mitotic chromosome assembly in human cells. (2004) Mol Biol Cell, 15: pp. 3296-3308.

423. Ono T, Losada A, Hirano M, Myers MP, Neuwald AF, Hirano T. Differential contributions of condensin I and condensin II to mitotic chromosome architecture in vertebrate cells. (2003) Cell, 115: pp. 109-121.

424. Opstelten RJ, Clement JM, Wanka F. Direct repeats at nuclear matrix-associated DNA regions and their putative control function in the replicating eukaryotic genome. (1989) Chromosoma, 98: pp. 422-427.

425. Osborne CS, Chakalova L, Brown KE, Carter D, Horton A, Debrand E, Goyenechea B, Mitchell JA, Lopes S, Reik W et al. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. (2004) Nat. Genet., 36: pp. 1065-1071.

426. Osborne CS, Chakalova L, Mitchell JA, Horton A, Wood AL, Bolland DJ, Corcoran AE, Fraser P. Myc dynamically and preferentially relocates to a transcription factory occupied by igh. (2007) PLoSBiol, 5: p. el92.

427. Oudet P, Gross-Bellard M, Chambon P. Electron microscopic and biochemical evidence that chromatin structure is a repeating unit. (1975) Cell, 4: pp. 281-300.

428. Ouspenski II, Cabello OA, Brinkley BR. Chromosome condensation factor brnlp is required for chromatid separation in mitosis. (2000) Mol. Biol. Cell, 11: pp. 1305-1313.

429. Panizza S, Tanaka T, Hochwagen A, Eisenhaber F, Nasmyth K. Pds5 cooperates with cohesin in maintaining sister chromatid cohesion. (2000) Curr. Biol., 10: pp. 1557-1564.

430. Parada L, Misteli T. Chromosome positioning in the interphase nucleus. (2002) Trends Cell Biol., 12: pp. 425-432.

431. Parada LA, Sotiriou S, Misteli T. Spatial genome organization. (2004) Exp. Cell Res., 296: pp. 64-70.

432. Patel S, Novikova N, Beenders B, Austin C, Bellini M. Live images of RNA polymerase II transcription units. (2008) Chromosome Res., 16: pp. 223232.

433. Paulson JR. Scaffold morphology in histone-depleted hela metaphase chromosomes. (1989) Chromosoma, 97: pp. 289-295.

434. Paulson JR, Laemmli UK. The structure of histone-depleted metaphase chromosomes. (1977) Cell, 12: pp. 817-828.

435. Paulson JR, Langmore JP. Low angle x-ray diffraction studies of hela metaphase chromosomes: effects of histone phosphorylation and chromosome isolation procedure. (1983)7. Cell Biol., 96: pp. 1132-1137.

436. Perumal SK, Yue H, Hu Z, Spiering MM, Benkovic SJ. Single-molecule studies of DNA replisome function. (2010) Biochim. Biophys. Acta, 1804: pp. 1094-1112.

437. Petersen J, Hagan IM. S. pombe aurora kinase/survivin is required for chromosome condensation and the spindle checkpoint attachment response. (2003) Curr. Biol., 13: pp. 590-597.

438. Phi-Van L, Stratling WH. Dissection of the ability of the chicken lyso-zyme gene 5' matrix attachment region to stimulate transgene expression and to dampen position effects. (1996) Biochemistry, 35: pp. 10735-10742.

439. Philimonenko AA, Hodny Z, Jackson DA, Hozak P. The microarchitecture of DNA replication domains. (2006) Histochem. Cell Biol, 125: pp. 103117.

440. Philimonenko AA, Jackson DA, Hodny Z, Janacek J, Cook PR, Hozak P. Dynamics of DNA replication: an ultrastructural study. (2004) J. Struct. Biol., 148: pp. 279-289.

441. Pienta KJ, Coffey DS. A structural analysis of the role of the nuclear matrix and DNA loops in the organization of the nucleus and chromosome. (1984) J. Cell Set Suppl., 1: pp. 123-135.

442. Pixton JL, Belmont AS. Newvision: a program for interactive navigation and analysis of multiple 3-d data sets using coordinated virtual cameras. (1996) J. Struct. Biol., 116: pp. 77-85.

443. Planas-Silva MD, Means AR. Expression of a constitutive form of calci-um/calmodulin dependent protein kinase II leads to arrest of the cell cycle in g2. (1992) EMBO J., 11: pp. 507-517.

444. Plath K, Fang J, Mlynarczyk-Evans SK, Cao R, Worringer KA, Wang H, de la Cruz CC, Otte AP, Panning B, Zhang Y. Role of histone h3 lysine 27 methylation in x inactivation. (2003) Science, 300: pp. 131-135.

445. Poirier M, Eroglu S, Chatenay D, Marko JF. Reversible and irreversible unfolding of mitotic newt chromosomes by applied force. (2000) Mol. Biol. Cell, 11: pp. 269-276.

446. Poirier MG, Marko JF. Mitotic chromosomes are chromatin networks without a mechanically contiguous protein scaffold. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 99: pp. 15393-15397.

447. Poirier MG, Marko JF. Micromechanical studies of mitotic chromosomes. (2003) Curr. Top. Dev. Biol., 55: pp. 75-141.

448. Pombo A. Advances in imaging the interphase nucleus using thin cryo-sections. (2007) Histochem. Cell Biol., 128: pp. 97-104.

449. Pombo A, Hollinshead M, Cook PR. Bridging the resolution gap: imaging the same transcription factories in cryosections by light and electron microscopy. (1999)/. Histochem. Cytochem., 47: pp. 471-480.

450. Price DH. Poised polymerases: on your mark.get set.go!. (2008) Mol. Cell, 30: pp. 7-10.

451. Prigent C, Dimitrov S. Phosphorylation of serine 10 in histone h3, what for?. (2003) J. Cell. Sci., 116: pp. 3677-3685.

452. Prusov AN, Polyakov VYu, Zatsepina OV, Chentsov YuS, Fais D. Rosette-like structures from nuclei with condensed (chromomeric) chromatin but not from nuclei with diffuse (nucleomeric or nucleosomic) chromatin. (1983) Cell Biol. Int. Rep., 7: pp. 849-858.

453. Puck TT, Johnson R. DNA exposure and condensation in the x and 21 chromosomes. (1996) Stem Cells, 14: pp. 548-557.

454. Pullirsch D, Härtel R, Kishimoto H, Leeb M, Steiner G, Wutz A. The trithorax group protein ash21 and saf-a are recruited to the inactive x chromosome at the onset of stable x inactivation. (2010) Development, 137: pp. 935943.

455. Ragoczy T, Telling A, Sawado T, Groudine M, Kosak ST. A genetic analysis of chromosome territory looping: diverse roles for distal regulatory elements. (2003) Chromosome Res., 11: pp. 513-525.

456. Rattner JB, Hamkalo BA. Nucleosome packing in interphase chromatin. (1979) J. Cell Biol., 81: pp. 453-457.

457. Rattner JB, Lin CC. Radial loops and helical coils coexist in metaphase chromosomes. (1985) Cell, 42: pp. 291-296.

458. Razin SV, Iarovaia OV. association of transcription-active DNA fraction with the nuclear skeleton is altered during incubation of nuclei in solutions of low ionic strength. (1986) Mol. Biol. (Most), 20: pp. 646-655.

459. Razin SV, Mantieva VL, Georgiev GP. The similarity of DNA sequences remaining bound to scaffold upon nuclease treatment of interphase nuclei and metaphase chromosomes. (1979) Nucleic Acids Res., 7: pp. 1713-1735.

460. Razin SV, Vassetzky YS, Hancock R. Nuclear matrix attachment regions and topoisomerase II binding and reaction sites in the vicinity of a chicken DNA replication origin. (1991) Biochem. Biophys. Res. Commun., 177: pp. 265-270.

461. Reeves R, Nissen MS. The a.t-DNA-binding domain of mammalian high mobility group i chromosomal proteins, a novel peptide motif for recognizing DNA structure. (1990) J. Biol. Chem., 265: pp. 8573-8582.

462. Reichenzeller M, Burzlaff A, Lichter P, Herrmann H. In vivo observation of a nuclear channel-like system: evidence for a distinct interchromosomal domain compartment in interphase cells. (2000) J. Struct. Biol., 129: pp. 175-185.

463. Renz M, Nehls P, Hozier J. Involvement of histone hi in the organization of the chromosome fiber. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74: pp. 18791883.

464. Rieder CL, Palazzo RE. Colcemid and the mitotic cycle. (1992) J. Cell. Sci., 102 (Pt 3): pp. 387-392.

465. Roberge M, Dahmus ME, Bradbury EM. Chromosomal loop/nuclear matrix organization of transcriptionally active and inactive RNA polymerases in hela nuclei. (1988) J. Mol. Biol., 201: pp. 545-555.

466. Robinett CC, Straight A, Li G, Willhelm C, Sudlow G, Murray A, Belmont AS. In vivo localization of DNA sequences and visualization of large-scale chromatin organization using lac operator/repressor recognition. (1996) J. Cell Biol, 135: pp. 1685-1700.

467. Rodman TC. Human chromosome banding by feulgen stain aids in localizing classes of chromatin. (1974) Science, 184: pp. 171-173.

468. Romig H, Fackelmayer FO, Renz A, Ramsperger U, Richter A. Characterization of saf-a, a novel nuclear DNA binding protein from hela cells withhigh affinity for nuclear matrix/scaffold attachment DNA elements. (1992) EMBOJ., 11: pp. 3431-3440.

469. Romig H, Ruff J, Fackelmayer FO, Patil MS, Richter A. Characterisation of two intronic nuclear-matrix-attachment regions in the human DNA topoisomerase i gene. (1994) Eur. J. Biochem., 221: pp. 411-419.

470. Ronne M, Stefanova V, Di Berardino D, Strandby Poulsen B. The r-ban-ded karyotype of the domestic pig (sus scrofa domestica 1.). (1987) Hereditas, 106: pp. 219-231.

471. Roth SY, Allis CD. Histone acetylation and chromatin assembly: a single escort, multiple dances?. (1996) Cell, 87: pp. 5-8.

472. Saccone S, De Sario A, Delia Valle G, Bernardi G. The highest gene concentrations in the human genome are in telomeric bands of metaphase chromosomes. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: pp. 4913-4917.

473. Sadoni N, Cardoso MC, Stelzer EHK, Leonhardt H, Zink D. Stable chromosomal units determine the spatial and temporal organization of DNA replication. (2004) J. Cell. Sci., 117: pp. 5353-5365.

474. Sadoni N, Langer S, Fauth C, Bernardi G, Cremer T, Turner BM, Zink D. Nuclear organization of mammalian genomes, polar chromosome territories build up functionally distinct higher order compartments. (1999) J. Cell Biol., 146: pp. 1211-1226.

475. Sadoni N, Zink D. Nascent RNA synthesis in the context of chromatin architecture. (2004) Chromosome Res., 12: pp. 439-451.

476. Saijo M, Enomoto T, Hanaoka F, Ui M. Purification and characterization of type II DNA topoisomerase from mouse fm3a cells: phosphorylation of topoisomerase II and modification of its activity. (1990) Biochemistry, 29: pp. 583-590.

477. Saitoh Y, Laemmli UK. Metaphase chromosome structure: bands arise from a differential folding path of the highly at-rich scaffold. (1994) Cell, 76: pp. 609-622.

478. Saka Y, Sutani T, Yamashita Y, Saitoh S, Takeuchi M, Nakaseko Y, Yanagida M. Fission yeast cut3 and cut 14, members of a ubiquitous protein family, are required for chromosome condensation and segregation in mitosis. (1994) EMBOJ., 13: pp. 4938-4952.

479. Sakaguchi A, Kikuchi A. Functional compatibility between isoform alpha and beta of type II DNA topoisomerase. (2004) J. Cell. Sci., 117: pp. 10471054.

480. Satya-Prakash KL, Hsu TC, Pathak S. Behavior of the chromosome core in mitosis and meiosis. (1980) Chromosoma, 81: pp. 1-8.

481. Sauvé DM, Anderson HJ, Ray JM, James WM, Roberge M. Phos-phorylation-induced rearrangement of the histone h3 nh2-terminal domain during mitotic chromosome condensation. (1999) J. Cell Biol, 145: pp. 225-235.

482. Sawidou E, Cobbe N, Steffensen S, Cotterill S, Heck MMS. Drosophila cap-d2 is required for condensin complex stability and resolution of sister chromatids. (2005) J. Cell Sci., 118: pp. 2529-2543.

483. Schalch T, Duda S, Sargent DF, Richmond TJ. X-ray structure of a tetra-nucleosome and its implications for the chromatin fibre. (2005) Nature, 436: pp. 138-141.

484. Schardin M, Cremer T, Hager HD, Lang M. Specific staining of human chromosomes in Chinese hamster x man hybrid cell lines demonstrates interphase chromosome territories. (1985) Hum. Genet., 71: pp. 281-287.

485. Schermelleh L, Carlton PM, Haase S, Shao L, Winoto L, Kner P, Burke B, Cardoso MC, Agard DA, Gustafsson MGL et al. Subdiffraction multicolorimaging of the nuclear periphery with 3d structured illumination microscopy. (2008) Science, 320: pp. 1332-1336.

486. Schilling LJ, Farnham PJ. The bidirectionally transcribed dihydrofolate reductase and rep-3a promoters are growth regulated by distinct mechanisms. (1995) Cell Growth Differ., 6: pp. 541-548.

487. Schmidt-Zachmann MS, Hiigle B, Scheer U, Franke WW. Identification and localization of a novel nucleolar protein of high molecular weight by a monoclonal antibody. (1984) Exp. Cell Res., 153: pp. 327-346.

488. Schmidt-Zachmann MS, Hugle-Dorr B, Franke WW. A constitutive nucleolar protein identified as a member of the nucleoplasmin family. (1987) EMBOJ., 6: pp. 1881-1890.

489. Schmiesing JA, Ball ARJ, Gregson HC, Alderton JM, Zhou S, Yokomori K. Identification of two distinct human smc protein complexes involved in mitotic chromosome dynamics. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 95: pp. 12906-12911.

490. Schneider R, Grosschedl R. Dynamics and interplay of nuclear architecture, genome organization, and gene expression. (2007) Genes Dev., 21: pp. 3027-3043.

491. Schiibeler D, Francastel C, Cimbora DM, Reik A, Martin DI, Groudine M. Nuclear localization and histone acetylation: a pathway for chromatin opening and transcriptional activation of the human beta-globin locus. (2000) Genes Dev., 14: pp. 940-950.

492. Seabright M. A rapid banding technique for human chromosomes. (1971) Lancet, 2: pp. 971-972.

493. Serra JA. Contribution to a physiological interpretation of mitosis and meiosis. II. The prophasic appearing of the spiralization. (1947) Portugaliae Acta Biol. 2: pp. 45-90

494. Shopland LS, Johnson CV, Byron M, McNeil J, Lawrence JB. Clustering of multiple specific genes and gene-rich r-bands around sc-35 domains: evidence for local euchromatic neighborhoods. (2003) J. Cell Biol., 162: pp. 981990.

495. Siddiqui NU, Stronghill PE, Dengler RE, Hasenkampf CA, Riggs CD. Mutations in arabidopsis condensin genes disrupt embryogenesis, meristem organization and segregation of homologous chromosomes during meiosis. (2003) Development, 130: pp. 3283-3295.

496. Simonis M, Klous P, Splinter E, Moshkin Y, Willemsen R, de Wit E, van Steensel B, de Laat W. Nuclear organization of active and inactive chromatin domains uncovered by chromosome conformation capture-on-chip (4c). (2006) Nat. Genet., 38: pp. 1348-1354.

497. Sinclair P, Bian Q, Plutz M, Heard E, Belmont AS. Dynamic plasticity of large-scale chromatin structure revealed by self-assembly of engineered chromosome regions. (2010) J. Cell Biol., 190: pp. 761-776.

498. Smith HC, Berezney R. DNA polymerase alpha is tightly bound to the nuclear matrix of actively replicating liver. (1980) Biochem. Biophys. Res. Commun., 97: pp. 1541-1547.

499. Smith HC, Berezney R. Nuclear matrix-bound deoxyribonucleic acid synthesis: an in vitro system. (1982) Biochemistry, 21: pp. 6751-6761.

500. Smith KP, Byron M, Johnson C, Xing Y, Lawrence JB. Defining early steps in mRNA transport: mutant mRNA in myotonic dystrophy type i is blocked at entry into sc-35 domains. (2007)/. Cell Biol., 178: pp. 951-964.

501. Smith KP, Moen PT, Wydner KL, Coleman JR, Lawrence JB. Processing of endogenous pre-mRNAs in association with sc-35 domains is gene specific. (1999)/. Cell Biol., 144: pp. 617-629.

502. Somma MP, Fasulo B, Siriaco G, Cenci G. Chromosome condensation defects in barren RNA-interfered drosophila cells. (2003) Genetics, 165: pp. 1607-1611.

503. Sonnenbichler J. Substructures of chromosomes. (1969) Nature, 223: pp. 205-206.

504. SPARVOLI E, GAY H, KAUFMANN BP. Number and pattern of association of chromonemata in the chromosomes of tradescantia. (1965) Chromo-soma, 16: pp. 415-435.

505. Sparvoli E, Levi M, Rossi E. Replicon clusters may form structurally stable complexes of chromatin and chromosomes. (1994) J. Cell. Sci., 107 ( Pt 11): pp. 3097-3103.

506. Spector DL. The dynamics of chromosome organization and gene regulation. (2003) Annu. Rev. Biochem., 72: pp. 573-608.

507. Sperry AO, Blasquez VC, Garrard WT. Dysfunction of chromosomal loop attachment sites: illegitimate recombination linked to matrix association regions and topoisomerase II. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: pp. 5497-5501.

508. Spilianakis CG, Lalioti MD, Town T, Lee GR, Flavell RA. Interchromo-somal associations between alternatively expressed loci. (2005) Nature, 435: pp. 637-645.

509. Sporbert A, Gahl A, Ankerhold R, Leonhardt H, Cardoso MC. DNA polymerase clamp shows little turnover at established replication sites but sequential de novo assembly at adjacent origin clusters. (2002) Mol. Cell, 10: pp. 1355-1365.

510. Spring H, Franke WW. Transcriptionally active chromatin in loops of lampbrush chromosomes at physiological salt concentrations as revealed by electron microscopy of sections. (1981) Eur. J. Cell Biol., 24: pp. 298-308.

511. Stack SM, Anderson LK. A model for chromosome structure during the mitotic and meiotic cell cycles. (2001) Chromosome Res., 9: pp. 175-198.

512. Stear JH, Roth MB. Characterization of hcp-6, a c. elegans protein required to prevent chromosome twisting and merotelic attachment. (2002) Genes Dev., 16: pp. 1498-1508.

513. Steen RL, Cubizolles F, Le Guellec K, Collas R A kinase-anchoring protein (akap)95 recruits human chromosome-associated protein (hcap)-d2/eg7 for chromosome condensation in mitotic extract. (2000) J. Cell Biol., 149: pp. 531536.

514. Steffensen S, Coelho PA, Cobbe N, Vass S, Costa M, Hassan B, Proko-penko SN, Bellen H, Heck MM, Sunkel CE. A role for drosophila smc4 in the resolution of sister chromatids in mitosis. (2001) Curr. Biol., 11: pp. 295-307.

515. Stief A, Winter DM, Strâtling WH, Sippel AE. A nuclear DNA attachment element mediates elevated and position-independent gene activity. (1989) Nature, 341: pp. 343-345.

516. Straub T, Becker PB. Dosage compensation: the beginning and end of generalization. (2007) Nat. Rev. Genet., 8: pp. 47-57.

517. Stray JE, Lindsley JE. Biochemical analysis of the yeast condensin smc2/4 complex: an atpase that promotes knotting of circular DNA. (2003) J. Biol. Chem., 278: pp. 26238-26248.

518. Strick R, Strissel PL, Gavrilov K, Levi-Setti R. Cation-chromatin binding as shown by ion microscopy is essential for the structural integrity of chromosomes. (2001)/. Cell Biol., 155: pp. 899-910.

519. Strukov YG, Belmont AS. Mitotic chromosome structure: reproducibility of folding and symmetry between sister chromatids. (2009) Biophys. J., 96: pp. 1617-1628.

520. Strukov YG, Sural TH, Kuroda MI, Sedat JW. Evidence of activity-specific, radial organization of mitotic chromosomes in drosophila. (2011) PLoS Biol., 9: p. el000574.

521. Strukov YG, Wang Y, Belmont AS. Engineered chromosome regions with altered sequence composition demonstrate hierarchical large-scale folding within metaphase chromosomes. (2003) J. Cell Biol., 162: pp. 23-35.

522. Strunnikov AV, Jessberger R. Structural maintenance of chromosomes (smc) proteins: conserved molecular properties for multiple biological functions. (1999) Eur. J. Biochem., 263: pp. 6-13.

523. Strunnikov AV, Kingsbury J, Koshland D. Cep3 encodes a centromere protein of saccharomyces cerevisiae. (1995) J. Cell Biol., 128: pp. 749-760.

524. Stubblefield E. Chromosome bands and the subunit structure of Chinese hamster metaphase chromosomes. (1980) Cytogenet. Cell Genet., 26: pp. 191198.

525. Stuurman N, Floore A, Colen A, de Jong L, van Driel R. Stabilization of the nuclear matrix by disulfide bridges: identification of matrix polypeptides that form disulfides. (1992) Exp. Cell Res., 200: pp. 285-294.

526. Sullivan BA, Bickmore WA. Unusual chromosome architecture and behaviour at an hsr. (2000) Chromosoma, 109: pp. 181-189.

527. Sumara I, Vorlaufer E, Gieffers C, Peters BH, Peters JM. Characterization of vertebrate cohesin complexes and their regulation in prophase. (2000) J. Cell Biol., 151: pp. 749-762.

528. Sumara I, Vorlaufer E, Stukenberg PT, Keim O, Redemann N, Nigg EA, Peters J. The dissociation of cohesin from chromosomes in prophase is regulated by polo-like kinase. (2002) Mol. Cell, 9: pp. 515-525.

529. Sumner AT. Functional aspects of the longitudinal differentiation of chromosomes. (1994) Eur JHistochem, 38: pp. 91-109.

530. Surana U, Amon A, Dowzer C, McGrew J, Byers B, Nasmyth K. Destruction of the cdc28/clb mitotic kinase is not required for the metaphase to anaphase transition in budding yeast. (1993) EMBOJ., 12: pp. 1969-1978.

531. Sutani T, Yanagida M. DNA renaturation activity of the smc complex implicated in chromosome condensation. (1997) Nature, 388: pp. 798-801.

532. Sutani T, Yuasa T, Tomonaga T, Dohmae N, Takio K, Yanagida M. Fission yeast condensin complex: essential roles of non-smc subunits for condensation and cdc2 phosphorylation of cut3/smc4. (1999) Genes Dev., 13: pp. 22712283.

533. Swann K, Whitaker M. The part played by inositol trisphosphate and calcium in the propagation of the fertilization wave in sea urchin eggs. (1986) J. Cell Biol., 103: pp. 2333-2342.

534. Swedlow JR, Hirano T. The making of the mitotic chromosome: modern insights into classical questions. (2003) Mol. Cell, 11: pp. 557-569.

535. Swedlow JR, Sedat JW, Agard DA. Multiple chromosomal populations of topoisomerase II detected in vivo by time-lapse, three-dimensional wide-field microscopy. (1993) Cell, 73: pp. 97-108.

536. Taddei A, Hediger F, Neumann FR, Gasser SM. The function of nuclear architecture: a genetic approach. (2004)Annu. Rev. Genet., 38: pp. 305-345.

537. Tavormina PA, Côme M, Hudson JR, Mo Y, Beck WT, Gorbsky GJ. Rapid exchange of mammalian topoisomerase II alpha at kinetochores and chromosome arms in mitosis. (2002) J. Cell Biol., 158: pp. 23-29.

538. Testillano PS, Sanchez-Pina MA, Olmedilla A, Ollacarizqueta MA, Tandler CJ, Risueño MC. A specific ultrastructural method to reveal DNA: the nama-ur. (1991)/. Histochem. Cytochem., 39: pp. 1427-1438.

539. Thiry M, Dombrowicz D. Anti-bromodeoxyuridine monoclonal antibody: an alternative tool for the identification of replicated DNA at the electron microscope level. (1988) Biol. Cell, 62: pp. 99-102.

540. Thoma F, Koller T. Influence of histone hi on chromatin structure. (1977) Cell, 12: pp. 101-107.

541. Thoma F, Koller T, Klug A. Involvement of histone hi in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin. (1979)/. Cell Biol., 83: pp. 403-427.

542. Tobey RA, Crissman HA. Preparation of large quantities of synchronized mammalian cells in late gl in the pre-DNA replicative phase of the cell cycle. (1972) Exp. Cell Res., 75: pp. 460-464.

543. Tobey RA, Oishi N, Crissman HA. Cell cycle synchronization: reversible induction of g2 synchrony in cultured rodent and human diploid fibroblasts. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: pp. 5104-5108.

544. Tolhuis B, Palstra RJ, Splinter E, Grosveld F, de Laat W. Looping and interaction between hypersensitive sites in the active beta-globin locus. (2002) Mol. Cell, 10: pp. 1453-1465.

545. Tóth A, Ciosk R, Uhlmann F, Galova M, Schleiffer A, Nasmyth K. Yeast cohesin complex requires a conserved protein, ecolp(ctf7), to establish cohesionbetween sister chromatids during DNA replication. (1999) Genes Dev., 13: pp. 320-333.

546. Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from poly aery lamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76: pp. 4350-4354.

547. Trask BJ, Allen S, Massa H, Fertitta A, Sachs R, van den Engh G, Wu M. Studies of metaphase and interphase chromosomes using fluorescence in situ hybridization. (1993) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 58: pp. 767-775.

548. Trojer P, Reinberg D. Facultative heterochromatin: is there a distinctive molecular signature?. (2007) Mol. Cell, 28: pp. 1-13.

549. Tsukiyama T, Daniel C, Tamkun J, Wu C. Iswi, a member of the swi2/snf2 atpase family, encodes the 140 kda subunit of the nucleosome remodeling factor. (1995) Cell, 83: pp. 1021-1026.

550. Tsutsui K, Tsutsui K, Okada S, Watarai S, Seki S, Yasuda T, Shohmori T. Identification and characterization of a nuclear scaffold protein that binds the matrix attachment region DNA. (1993) J. Biol. Chem., 268: pp. 12886-12894.

551. Tumbar T, Belmont AS. Interphase movements of a DNA chromosome region modulated by vpl6 transcriptional activator. (2001) Nat. Cell Biol., 3: pp. 134-139.

552. Tumbar T, Sudlow G, Belmont AS. Large-scale chromatin unfolding and remodeling induced by vpl6 acidic activation domain. (1999) J. Cell Biol., 145: pp. 1341-1354.

553. Udvardy A, Schedl P, Sander M, Hsieh TS. Novel partitioning of DNA cleavage sites for drosophila topoisomerase II. (1985) Cell, 40: pp. 933-941.

554. Uemura T, Ohkura H, Adachi Y, Morino K, Shiozaki K, Yanagida M. DNA topoisomerase II is required for condensation and separation of mitotic chromosomes in s. pombe. (1987) Cell, 50: pp. 917-925.

555. Uhlmann F. Chromosome condensation: packaging the genome. (2001) Curr. Biol., 11: p. R384-7.

556. Uhlmann F. Cell biology: keeping the genome in shape. (2002) Nature, 417: pp. 135-136.

557. Urlaub G, Mitchell PJ, Kas E, Chasin LA, Funanage VL, Myoda TT, Hamlin J. Effect of gamma rays at the dihydrofolate reductase locus: deletions and inversions. (1986) Somat. Cell Mol. Genet., 12: pp. 555-566.

558. Uzbekov R, Chartrain I, Philippe M, Arlot-Bonnemains Y. Cell cycle analysis and synchronization of the xenopus cell line xl2. (1998) Exp. Cell Res., 242: pp. 60-68.

559. Uzbekov R, Prigent C, Arlot-Bonnemains Y. Cell cycle analysis and synchronization of the xenopus laevis xl2 cell line: study of the kinesin related protein xleg5. (1999) Microsc. Res. Tech., 45: pp. 31-42.

560. Valenzuela L, Kamakaka RT. Chromatin insulators. (2006) Annu. Rev. Genet., 40: pp. 107-138.

561. Varga-Weisz PD, Wilm M, Bonte E, Dumas K, Mann M, Becker PB. Chromatin-remodelling factor chrac contains the atpases iswi and topoisomerase II. (1997) Nature, 388: pp. 598-602.

562. Vazquez J, Belmont AS, Sedat JW. Multiple regimes of constrained chromosome motion are regulated in the interphase drosophila nucleus. (2001) Curr. Biol., 11: pp. 1227-1239.

563. Verschure PJ, van der Kraan I, de Leeuw W, van der Vlag J, Carpenter AE, Belmont AS, van Driel R. In vivo hpl targeting causes large-scale chromatin condensation and enhanced histone lysine methylation. (2005) Mol. Cell. Biol., 25: pp. 4552-4564.

564. Verschure PJ, van Der Kraan I, Manders EM, van Driel R. Spatial relationship between transcription sites and chromosome territories. (1999) J. Cell Biol., 147: pp. 13-24.

565. Verschure PJ, van der Kraan I, Manders EMM, Hoogstraten D, Hout-smuller AB, van Driel R. Condensed chromatin domains in the mammalian nucleus are accessible to large macromolecules. (2003) EMBO Rep., 4: pp. 861866.

566. Visser AE, Jaunin F, Fakan S, Aten JA. High resolution analysis of interphase chromosome domains. (2000) J. Cell. Sci., 113 ( Pt 14): pp. 25852593.

567. Vogel W, Autenrieth M, Speit G. Detection of bromodeoxyuridine-incor-poration in mammalian chromosomes by a bromodeoxyuridine-antibody. i. demonstration of replication patterns. (1986) Hum. Genet., 72: pp. 129-132.

568. Vogelstein B, Pardoll DM, Coffey DS. Supercoiled loops and eucaryotic DNA replicaton. (1980) Cell, 22: pp. 79-85.

569. Wallace JA, Felsenfeld G. We gather together: insulators and genome organization. (2007) Curr. Opin. Genet. Dev., 17: pp. 400-407.

570. Wallace RA, Jared DW, Dumont JN, Sega MW. Protein incorporation by isolated amphibian oocytes. III. Optimum incubation conditions. (1973) J. Exp. Zool., 184: pp. 321-333.

571. Wansink DG, Schul W, van der Kraan I, van Steensel B, van Driel R, de Jong L. Fluorescent labeling of nascent RNA reveals transcription by RNA polymerase II in domains scattered throughout the nucleus. (1993) J. Cell Biol., 122: pp. 283-293.

572. Watrin E, Cubizolles F, Osborne HB, Le Guellec K, Legagneux V. Expression and functional dynamics of the XCAP-D2 condensin subunit in xenopus laevis oocytes. (2003) J. Biol. Chem., 278: pp. 25708-25715.

573. Watrin E, Legagneux V. Contribution of hcap-d2, a non-smc subunit of condensin i, to chromosome and chromosomal protein dynamics during mitosis. (2005) Mol. Cell Biol, 25: pp. 740-750.

574. Weake VM, Workman JL. Histone ubiquitination: triggering gene activity. (2008) Mol. Cell, 29: pp. 653-663.

575. Webb CD, Latham MD, Lock RB, Sullivan DM. Attenuated topoi-somerase II content directly correlates with a low level of drug resistance in a Chinese hamster ovary cell line. (1991) Cancer Res., 51: pp. 6543-6549.

576. Wei Y, Yu L, Bowen J, Gorovsky MA, Allis CD. Phosphorylation of histone h3 is required for proper chromosome condensation and segregation. (1999) Cell, 97: pp. 99-109.

577. Weintraub H, Groudine M. Chromosomal subunits in active genes have an altered conformation. (1976) Science, 193: pp. 848-856.

578. Whitaker M, Patel R. Calcium and cell cycle control. (1990) Development, 108: pp. 525-542.

579. Williams A, Spilianakis CG, Flavell RA. Interchromosomal association and gene regulation in trans. (2010) Trends Genet., 26: pp. 188-197.

580. Williams BC, Garrett-Engele CM, Li Z, Williams EV, Rosenman ED, Goldberg ML. Two putative acetyltransferases, san and deco, are required for establishing sister chromatid cohesion in drosophila. (2003) Curr. Biol, 13: pp. 2025-2036.

581. Williams RRE, Broad S, Sheer D, Ragoussis J. Subchromosomal positioning of the epidermal differentiation complex (edc) in keratinocyte and lymphoblast interphase nuclei. (2002) Exp. Cell Res., 272: pp. 163-175.

582. Wong ML, Medrano JF. Real-time per for mRNA quantitation. (2005) BioTechniques, 39: pp. 75-85.

583. Wood ER, Earnshaw WC. Mitotic chromatin condensation in vitro using somatic cell extracts and nuclei with variable levels of endogenous topoisomerase II. (1990) J. Cell Biol., Ill: pp. 2839-2850.

584. Xu J, Manning FC, Patierno SR. Preferential formation and repair of chromium-induced DNA adducts and DNA—protein crosslinks in nuclear matrix DNA. (1994) Carcinogenesis, 15: pp. 1443-1450.

585. Ye Q, Hu YF, Zhong H, Nye AC, Belmont AS, Li R. Brcal-induced large-scale chromatin unfolding and allele-specific effects of cancer-predisposing mutations. (2001) J. Cell Biol., 155: pp. 911-921.

586. Yerle M, Galman O, Echard G. The high-resolution gtg-banding pattern of pig chromosomes. (1991) Cytogenet. Cell Genet., 56: pp. 45-47.

587. Yokota H, van den Engh G, Hearst JE, Sachs RK, Trask BJ. Evidence for the organization of chromatin in megabase pair-sized loops arranged along a random walk path in the human gO/gl interphase nucleus. (1995) J. Cell Biol, 130: pp. 1239-1249.

588. Zatsepina O. V., Polyakov V. Yu., Chentsov Yu. S. Chromonema and chromomere: structural units of mitotic and interphase chromosomes. (1983) Chromosoma, 88: pp. 91-97.

589. Zatsepina OV, Polyakov VY, Chentsov YS. Differential decondensation of mitotic chromosomes during hypotonic treatment of living cells as a possible cause of g-banding: an ultrastructural study. (1989) Chromosoma, 98: pp. 109116.

590. Zatsepina OV, Polyakov VYu, Chentsov YuS. Nuclear envelope formation around metaphase chromosomes: chromosome decondensation and nuclear envelope reconstitution during mitosis. (1982) Eur. J. Cell Biol., 26: pp. 277283.

591. Zelenin MG, Zakharov AF, Zatsepina OV, Polijakov VYu, Chentsov YuS. Reversible differential decondensation of unfixed Chinese hamster chromosomes induced by change in calcium ion concentration of the medium. (1982) Chromosoma, 84: pp. 729-736.

592. Zeng W, Ball ARJ, Yokomori K. Hpl: heterochromatin binding proteins working the genome. (2010) Epigenetics, 5: pp. 287-292.

593. Zhang L, Huynh KD, Lee JT. Perinucleolar targeting of the inactive x during s phase: evidence for a role in the maintenance of silencing. (2007) Cell, 129: pp. 693-706.

594. Zink D, Bornfleth H, Visser A, Cremer C, Cremer T. Organization of early and late replicating DNA in human chromosome territories. (1999) Exp. Cell Res., 247: pp. 176-188.

595. Zirbel RM, Mathieu UR, Kurz A, Cremer T, Lichter P. Evidence for a nuclear compartment of transcription and splicing located at chromosome domain boundaries. (1993) Chromosome Res., 1: pp. 93-106.

Информация о работе

Киреев, Игорь Игоревич
доктора биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.03.04

Диссертация

Высшие уровни организации генетического аппарата эукариот и регуляция функциональной активности генома - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы