Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, изучение и практическое использование актиномицетов рода FRANKIA

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, изучение и практическое использование актиномицетов рода FRANKIA"

П оц

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ БИОХИМИИ К ФИЗИОЛОГИИ ШКГООРГАШЗМбВ

СТУПАРЬ Олег Сергеевич

ВЫДЕЛЕНИЕ, ИЗУЧЕНИЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АКТИНОМИЦЕТОВ РОДА ШИША (специальность 03.00.07 - микробиология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

На правах рукописи

УДК 579. 873. 31

Пущино 1991

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР.

Научный руководитель:

член-корреспондент АН СССР. Калакуцкий Л. В. Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Т. П. Преображенская доктор биологических наук И. Н. Гоготов Ведущее учреждение:

Институт микробиологии и вирусологии АН УССР, Киев

Защита состоится (.(-¿-6 А-г-м! 1991 г.

в час. ЗСмин. на заседании Специализированного .совета Д 00.2. 69.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, г.Пущино московской обл.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР.

Автореферат разослан " ¿'¡з'" Со-* 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного совета

кандидат биологических наук В. М. Вагабов

_ '. ГОБ!М ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

г"'''.А^туадьность проблемы. Симбиотическая фиксация атмосферного - V даот^.^моорганизмами является одним из основных процессов в 'природеТ'обеспечивающим почву связанным азотом и, следовательно, имеющим прямое отношение к повышению плодородия почв, увеличению продуктивности сельского и лесного хозяйства. Очевидность нежелательных побочных последствий неорганизованного применения минеральных азотных удобрений, а таюке высокие энергетические затраты, связанные с их производством, . служат существенными стимулами исследования биологической азотфиксаЦии. По мнению сйециалистов, в ближайшие годы основным путем развития этих исследований будет изучение и дальнейшая оптимизация деятельности естественных симбиозов.

Из трех типов наиболее известных азотфиксирующих симбиозов - клубеньковых бактерий с бобовыми, цианобактерий с папоротниками и голосеменными растениями и актиномицетов с покрытосеменными растениями - последний тип симбиоза, привлекает в настоящее время возростающее внимание исследователей. Этот симбиоз занимает первое место среди других по таксономическому разнообразию растений -хозяев, характеризуется высокой эффективностью и играет важную роль в природных экосистемах. Актиноризные растения в возростаю-щей степени используются в народном хозяйстве при рекультивации и мелиорации земель, создании лесозащитных полос и искуственных лесов, в. плодовом хозяйстве и медицине.

Чистые культуры актиномицетов-симбионтов рода Л-апЪ'а удалось изолировать лишь в 1978 году и до настоящего времени их выделение в чистую культуру продолжает оставаться одной из актуальных задач, как в плане развития представлений об' объеме этого рода и его экологическом разнообразии, так и с практической целью - для выявления наиболее эффективных форм актиноризного симбиоза

Дель и задачи исследования. Основной целью настоящей работы явилось выделение в чистую культуру возможно большего числа актиномицетов рода Ргапк!а и выяснение перспектив их практического применения. В число задач входили следующие:

1. Обследование корневых систем |актиноризных растений, произрастающих "на территории СССР с целью выявления азотфиксирующих корйевых клубеньков.

2. Выделение в чистую культуру актиномицетов-симбионтов из корневых клубеньков актиноризньи растений.

3. Характеристика изолятов по морфологическим, физиологи-

- г -

чески« и культуралъкым признакам, по особенностям химического строения, а также изучение их инфекционности и эффективности.

4. Подбор условий культивирования штаммов Frankia spp.

5. Изучение влияния инокуляции актиномицетами рода Frankia на рост актиноризных растений как в лабораторных условиях, так и в открытом грунте.

Научная новизна подученных результатов, и их практическая значимость. В результате работы впервые обнаружены и ' описаны ааотфиксирущие клубеньки на корнях эндемика северовостока СССР - ольхи камчатской; -Впервые выделены в чистую культуру актиноми-цеты рода Frankia из корневых клубеньков шефердии серебристой.

В результате работы впервые показано существенное влияние микроэлементов на рост актиномицетов рода Frankia; указаны пути возможной оптимизации состава питательных сред для культивирования Frankia spp.

Изучены морфологические, физиологические и культуральные признаки значительного массива штаммов Frankia spp., особенности их химического строения и инфекционность. Рассмотрены варианты группировки штаммов по указанным признакам и сделан вывод о нецелесообразности формального описания видов на их основе в настоящее время.

Отобраны высокоинфекционные и эффективные штаммы Frankia spp. , обеспечивающие значительную стимуляцию роста растений-хозяев в условиях закрытого грунта

Испытание чистых культур Frankia spp. для инокуляции ольхи и облепихи в условиях открытого грунта показало, что инокулиро-ванные растения обладают повышенной приживаемостью и скоростью роста.

Структура диссертации. - Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследований; результатов исследований и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы ( 157 ссылок). Работа изложена на _ страницах машино-.

лисного текста; содержит 25 таблиц, 16 рисунков.

Апробация работы и публикации. Материалы работы докладывались на IV Симпозиуме социалистических стран nd биотехнологии (Варна, ВНР, 1986), VII Международном конгрессе по азотфиксации (Кельн, ФРГ, 1988), V Мэвдународном симпозиуме по экологии микроорганизмов (Киото, Япония, 1989), Всесоюзной конференции "Микроорганизмы - стимуляторы и ингибиторы роста растений и живот-

шх" (Ташкент, 1989.), ВДНХ СССР (Бронзовая медаль, 1988г.).

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ и получены 2 авторских свидетельства на изобретения.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Объекты исследования. Обследование корневой системы актино-рианых растения проводили в местах их естественного произроста-ния, дендрариях ботанических садов и искуственных посадках. Коллекционные штаммы Frankia spp. ArI4, Atri2 и AirI3 были любезно предоставлены д-ром Бейкером ( МиддлбурсКий колледж, США); штаммы AvcIl.R. 1 и Ап2-1 - д-ром Аккермансом (Вагенингенекий сельскохозяйственный университет, Нидерланды). Штамм Frankia sp. 44 LS был получен от сотрудника ВКМ к. б. н. Шарой Л. С.

Питательные среды. ОС-1 (состав г/л): KgHP04 - ОД5; NaH2P04*2H20 - 0,1; KCl 0,1; KfeS04*7H20 - 0,1; триптон - 2,5; дрожжевой экстракт - 0,25; натрий уксуснокислый - 0,5; твин 80 -0,5; микроэлементы (мг/л): FeNaSffTA - 5; HgBOg - 0,75; MnS04*5H20 -0,4; ZnS04*7H20 - 0,3; (NH4)бМо?0„4*4Н20 -.0,1; CoS04*7H20 -0,01. Среда стерилизуется при 121 С°в течении 30 минут. В работе также использовали среды Позмоговой (Позмогова, 1971) с 0,5% глюкозы, Qmod (Lalonde, Calvert, 1979) и Ридер с 1% глюкозы (Акименко с соавг', 1975).

Выделение'культур проводили по методу Лалонда.(Lalonde et al., 1981) с некоторыми модификациями. Культуры эндофитов идентифицировали как Frankia sp. по их характерной морфологии - наличию спорангиев с неподвижными спорами на субстратном мицелии согласно определению рода по Лешевалье (Lechevalier,

-echeval 1er, 1379).

Микроскопия. Изучение строения корневых клубеньков актино-эизных растений проводили по методу Суетина (Суегин с соавт. L984), Шкроскопироваяие чистых культур актиномицетов проводили ja микроскопе МБИ-б с фазовым контрастом, все измерения осуществляли с помощью окуляр-микрометра

Анализ углеводного состава гидролизатов клеток проводили согласно методике Мэрта с соавт. (Mort et al., 1983).

Изучение химического строения пигмента проводили по методике Gerber и Lechevalier (1984). Влияние пигмвяха на рост бакте-эий, дрожжей и грибов оценивали по степени ингибирования их рос-га на жидкой среде. Рост тест-организмов оценивали по весу сухой 5иомассы после 48 часов культивирования.

- 4 -

Опыты до инокуляции растений.

Во всех вегетационных опытах в условиях теплицы, использовали предварительно стерилизованные ЗОХ перекисью водорода семена Инокулят • для обработки растений готовили в виде водной суспензии биомассы штаммов ГгапИа грр. Выращивание растений проводили при естественном освещении в течение всего периода вегетации. Температуру в зимний период поддерживали на уровне 8-10° С, в летнее время - близкой к естественной. Проростки ежедневно поливали водопроводной водой.

В условиях открытого грунта использовали семена или саженцы местных растений без предварительной обработки. Предварительно гомогенизированную, как указано выше, биомассу франкий вносили в прикорневую зону растений методом полива. Затем растения выращивали в условиях естественного увлажнения в течении всего периода наблюдений.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Встречаемость корневых клубеньков у актиноризных растений В СССР. .

Под термином "актинорйзные растения" понимаются, согласно рекомендациям Конференции по симбиотичеекой азотфиксации растений с клубеньками, образованными агстиномицетами (Тоггеу, Гзеркепа, 1979), двудольные цветковые растения, образующие кор-' невые клубеньки в симбиозе с азотфиксируодими актиномицетами рода РгапШа. Данный симбиоз наблюдается у представителей 22 родов покрытосеменных растений, относящихся к 8 семействам. Эти растения распространены! в основном, в зоне умеренного климата, но отдельные представители встречаются в Арктике (дриада, некоторые виды ольхи) и тропиках (казуарина и некоторые виды восковницы)

Наш было обследовано 33 вида растений, относящихся к 10 родам (Табл.1). Исследования проводили как в природных ценозах, так и в дендрариях ботанических садов и искуственных посадках.

Корневые клубеньки были обнаружены у 13 видов ольхи, 4 видов восковницы, 4 видов лоха, 2 видов кориарий, а также у коллеции крестовидной (Co.iJei.ja сгиааЬа), облепихи крушиновидной (Ш ррорЬае гЬатпо1ёеБ), цеанотуса лазурного (СеапоИтиз агигеиБ) и шефердии серебристой (51тер1те1хНа агеегЛеа).

Корневые клубеньки ольхи камчатской, описанные нами впервые, отличаются по анатомическому строению от ранее известных. Они характеризуются крайне низким содержанием клеток с веществами фенольной природы во внешних слоях клубенька. Изучение анато-

Таблица 1

Наличие корневых клубеньков у различных видов актино-ризных растений, произростаюпщх в СССР.

Вид растения

Характер насаждений,* место произростания

Наличие клубеньков

Al ñus barbata, A. firma, A. japónica, Anepalensis, A. tinctoria var. glabra

Afruticosa, A. glutinosa, A. rubra,

A sinuata ssp. kamtschati ca

Atenuifolia

A colaensis

A fruticosa

A glutinosa, A.lncana

A hirsuta, A sinuata ssp.

kamtschatica

Casuarina equise ti folia

C. stricta Ceanottus azareus Colletia cruciáta, C. infausta Coriaria japónica, C. rrtyrti folia Bryas integrifolia

D. integrifolia, D. punctata

D. integrifolia

Elaeagnus angustí folia, E.argentea

E. viridis

Blppophae rbamnoides Ityrica carolirtensis M. cerífera M. gale, M. tomentosa Shcphcrdia argentea

ДБС, г. Батуми. +

ДБС, г.Шсква +

ДВС, г. Куйбышев +

Щ, Мурманская обл. + Щ, Чукотский нац. округ, +

Щ, Московская обл. +■

Щ, Камчатская обл. + ДЕС, г. Батуми , -ДБС, г. СухЗ^ми

ДВС, г. Сухуми +•

ДЕС, г.Сухуми +

ДЕС, г. Сухуми + Щ, Чукотский нац. округ ПЦ, Магаданская обл. ПЦ, Мурманская обл.

ДДР, Московская обл. +

ДБС, г. Батуми +

Ш, Московская обл. +

ДБС, г. Батуми +

Ш, г.Сухуми +

ДВС, г. Москва +

ДБС, г. Куйбышев +

* : Щ - природный ценоз; ДВС - дендрарий ботанического сада; ЦДР - питомник декоративных растений; Ш - плодовый питомник;

- б -

мического строения корневого клубенька камчатской ольхи, произ-роетающей в дендрарии Главного ботанического сада АН СССР (г.Москва) показало, что пониженое содержание фенолов во внешних слоях клубенька характерно и для этих растений, причем не зависит от возраста исследованного клубенька. Количественное содержание фенолов в корневых клубеньках у ольхи камчатской составляет 2,4 - 4,5 мг/г клубенька, тогда как, например, у черной ольхи, выращиваемой в непосредственной близости от посадок ольхи камчатской, значительно вше и составляет 7,8 - 10,6 мг/г клубенька. На основании этих данных, следует признать, что наиболее вероятное объяснение характерного анатомического строения корне-( вого клубенька ольхи камчатской - это видовые особенности растения- хозяина.

Неоднократное обследование корневой системы двух видов дриады (окрестности г. Магадана, окрестности г. Сусумана Магаданской области, низовья реки Чаун и окрестности г. Певек-Чукотского национального округа, окрестности гг. Апатиты и Кировска Мурманской области), характерной для Арктического побережья СССР, не выявило наличия клубеньков, что подтверждает мнение Бонда (Bond, 1976) об отсутствии зндофита дриады на Евроазиатском континенте. Отсутствие корневых клубеньков у обследованных растений казуари-ны, по-видимому, также можно объяснить отсутствием подходящей формы зндофита в обследованном регионе.

2. Выделение и'характеристика изолятов Frankia spp.

Выделение актиномицетов из корневых клубеньков актиноризных растений проводили по методу Лалонда (Lalonde et al., 1981) с некоторыми модификациями. Число успешных выделений не аависело от состава питательной среды и составляло 1-85Х в зависимости от вида акгиноризного растения (Табл. 2).

Таксономическая структура рода Frarikiа не разработана до настоящего времени, поэтому нами были предприняты попытки установить возможные критерии дифференциации Franki a spp. внутри рода на основе массива культур, имеющихся в нашем распоряжении.

Сопоставление культурально-морфологических характеристик выделенных и коллекционных штаммов Frankia spp. проводили по характеру ветвления гиф на среде ОС-1, форме колоний, наличию везикул на комплексных средах, количеству и размерам спорангиев и образованию растворимого пигмента(Табл. 3).

Сравнение изолятов по способности к утилизации источников углерода показалр, что можно выделить три группы штаммов по фи-

Таблица 2

Результаты выделение актиномицетов рода Frankia из корневых клубеньков актиноризных растений.

Вид растения Время выделения Показатель Количество

успешных выделенных

выделений (%)* штаммов

Al ñus colaensis лето 1987 г. 1 2

A fruticosa лето 1986 г. 85 105

A sinuata ssp.

kamtschatica лето 1986 г. 19 26

Elaeagms argéntea лето 1986 г. 13 15

£. angustí folia осень 1985 г. 23 18

H. rhamnoides лето 1986 г. 14 30

Shepherdia argentes весна 1985 г. 10 3

* - количество выделенных культур Ргапк!а грр. в отношении к количеству использованных для выделения сегментов клубенька

Таблица 3

Культурально-морфологические особенности исследованных штаммов Frankia spp.

Морфологическая группа

1 2 3 4 5 6

Количество штаммов в группе 63 66 14 7 35 . 14

Характер ветвления* Р Р Р Ч Ч Ч

Наличие везикул на комплек~

сной среде - + - - +

Массовое образование спор + - - + - -

Максимальный размер споран-

гия (мкм) 100 20 30 70 20 30

Образование растворимого

пигмента + + + +

* - Р = ветвление редкое; Ч = ветвление частое

Биологическим признакам. Первая группа характеризуется способностью к утилизации небольшого количества источников углерода. Эти штаммы не утилизируют сукцинат, манат, фумарат, маннит, адо.-нит, инозит, глюкозу, мальтозу, сахаразу и рамнозу. Большинство штаммов второй группы растут на средах с различными сахарами, -многоатомными спиртами, ацетатом, малатом и пропионатом в качестве единственного источника углерода, однако не используют сукцинат, лактат и твины. Штаммы третьей группы способны к утилизации и этих источников углерода

Изучение инфекционности изолятов показало, что из 92 исследованных штаммов 21 инфекционен для ольхи (выделены из ольхи), 5

- для облепихи (выделены из облепихи и шефердии) и 2 - для лоха (выделены из лоха и облепихи). Только один штамм Н-113, выделенный из облепихи, образовывал клубеньки на лохе и-облепихе, тогда как все остальные изученью штаммы были инфекционны лишь к растениям одного рода Эти данные противоречат предположению Бейкера (Baker, 1987) о том, что штаммы инфекционные для одного рода растений семейства Elaeagnaoeae обязательно инфекционны- и для других. Наш данные показывают, что у некоторых штаммов этой группы спектр хозяйской специфичности ограничивается, по-видимому, одним родом.

Качественный анализ углеводов в клеточном гадролизате показал, что у всех изученных штаммов имеется рамноза, ксилоза, 2-0-метил-манноза, манноза, глюкоза и галактоза, что совпадает с данными Морта с соавторами (Mort et al., 1983). Наличие 2-0-ме-тил-маннозы у всех изученных штаммов подтверждает справедливость использования ее в качестве родового критерия Frankia.

Все исследованные штаммы имели различное содержание 2-0-ме-тил-маннозы. При этом штаммы, выделенные из ольхи характеризуют^ ся относительно низким содержанием 2-0-метилманнозы (менее 16Z)

- хемогруппа 1. В изолятах из лоха, облепихи и шефердии, наблюдается содержание 2-0-метилманнозы более 16Х (хемогруппа 2); Подобное распределение изолятов подтверждает мнение Сент-Лоурента с соавторами (St-Laurent et al., 1987) о взаимосвязи хозяйской специфичности штаммов с количеством 2-0-метил-маннозы в клеточных гидролизатах.

■ На основании исследования морфологии, состава углеводов в клеточных гидролизатах, способности изолятов к утилизации источников углерода и инфекционности были выявлены ряд групп штаммов по каждому из указанных признаков. Сопоставление данных по 24

изолятам у которых были изучены вое вышеуказанные характеристики показало, что принадлежность штаммов к этим группам не коррелирует между собой. Это указывает на необходимость поиска дополнительных критериев дифференциации Ггапк1а врр. внутри рода и подтверждает мнение Лешевалье (ЬесЬеуаНег, ¡.есЬеуаНег, 1989) об отсутствии целесообразности описания видов франкий в настоящее время.

3. Культивирование штаммов Д-ал/а'а ярр.

С целью повышения выхода биомассы инфекционных штаммов ГгаШа Брр., исследовали влияние различных компонентов питательной среды на накопление их биомассы.

Было установлено (Табл.4), что введение в состав среды 0шс1 дополнительных источников углерода и азота может обеспечивать увеличение выхода биомассы изученных штаммов ГгапМа грр.

Таблица 4

Влияние дополнительных источников углерода и азота на накопление биомассы Ггапк!а Брр. при периодическом культивировании на среде 0шс1

Дополни- Концен- Урожай биомассы тельный трация

источник, (г/л) Аг14 ,Ауо11. А1ПЗ

углерода

или азота мг/л 7. к конт- мг/л X. к конт- мг/л % к конт-

ролю ролю ролю

Среда СЗтос!

(контроль) 180 100 210 100 230 100

Сукцинат 1 160 90 .550 260 220 90

Ацетат 1 310 170 460 220 150 70

Малат 1 120 70 290 140 270 120

ЫаШЗ 1 310 170 80 40 320 140

Ш4С1 1 270 150 150 70 320 140

Ш4ШЗ 1 270 150 360 170 180 80

Шчевина 1 90 50 60 30 360 160

В ходе эксперимента было обнаружено, что разбавление питательной среды приводило к существенному повышению выхода биомассы штаммов Ггапк1 а зрр. ( Табл. 6).

Таблица 5

Накопление биомассы Frankia spp. в зависимости от концентрации среды ( в процентах к урожаю на исходной среде Qmod)

Концентрация Штаммы

среды _

ArI4 AvcIl.R.1 S13 Si 4 S15

Исходная

(контроль) 100 100 100 100 100

л 0,5 170 260 130 140 100

* 0,25 150 145 150 100 . 75

* 0,1 - 100 50 100 100 60

* 0,05 100 50 75 80 40

Этот эффект можно объяснить наличием в составе среды компонентов, • ингибирувщих рост франкий. Разбавление среды снижает концентрацию таких ингибиторов и полностью или частично устраняет их действие. Опыты по влиянию концентраций основных компонентов среды показали, что компонент, ингибирующий рост Frankia spp. на неразбавленой среде Qmod является микроэлементом/ми.

Так как комплекс микроэлементов содержит соли различных металлов, было исследовано влияние различных концентраций каждой из них на рост ряда штаммов Frankia spp.

Как видно из.рис. 1 изменение концентрации солей марганца, кобальта, молибдена, железа, меди, никеля и цинка приводило к значительному варьированию роста исследуемых штаммов' Frankia spp. Для большинства штаммов наблюдался четкий оптимум концентрации соли для достижения максимального прироста биомассы.

При изучении влияния солей меди на рост франкий было установлено, что она оказывыает ингибирующее действие во всем исследованном диапазоне концентраций. Такое действие меди принципиально отличается . от действия ионов.других металлов и указывает на необходимость исключения ее из состава комплекса микроэлементов среды Qmod. Это также показывает, что повышение накопления биомассы франкий в результате разбавления питательной среды обусловлено уменьшением концентрации меди и снижением ее- ингиби-руюшэго действия.

В результате проведенных исследований нами были подобраны

ZmSQ

-7 -S 'it -3 -t£j[H] - -» -7 -i -i ^ ^

?ио. 1. Накопление биомассы Frankia spp. В присутствии солей металлов (а X к урожаю на сред« Qraod без микроэлементов).

- - frankia sp. ArI4;------Frankia sp. Avcll.R. 1.; ........

-к--Frankia sp. 314;---- FrankiA sp. S15

Prankia. sp. SI 3

составы питательных сред обеспечивающие величину накопления биомассы ряда штаммов Frankia spp. выше, чем известное до настоящего времени.

4. Структура и биологическая активность красного пигмента.

Е процессе культивирования на средах Qmod и ОС-1 штаммы Frankia spp. S13, S14 и S15, выделенные из шефердии,- образуют красный водорастворимый пигмент. Хроматографическими методами анализа было установлено, что препарат пигмента состоит из двух компонентов. Сравнение данных по хроматографической подвижности пигментов, ИК- и УФ-спектроскопии и масс-спектрометрии исследуемых нами пигментов с литературными данными Показало, что они полностью идентичны ■ таковым пигментов S-2N и G-2A, полученным Гербер и Лешевалье (Gerber, Lechevalier, 1985) при изучении штамма G-2, выделенного из казуарины. Указанные авторы отнесли данные пигменты к бензо(а)нафгоценхинонам.

Известно, что соединения хиноидной природы растительного и микробного происхождения обладают широким спектром биологического действия (Hodnick et al., 1986; Kawai et al., 1984; Take et al. , 1986). С целью проверки возможной биологической активности полученных пигментов - исследовано их влияние на рост грамположи-тедьных бактерий Arthrobacter gl obi formi s, грамотрицательных -Pseudomonas putida и Paracoccus dem tri fi cans, дрожжей - Candida lipolytics и гриба - Fusarium decencellulare (Табл.6). Пигмент, аналогичный G-2A, заметной активности не проявлял.

Пигмент G-2N в концентрации 50 мкг/мл практически полностью подавлял рост грамположительных бактерий и дрожжей. Ингибирующзе влияние пигмента на рост гриба проявлялось в меньшей степени, а грамотрицательные бактерии оказались полностью резистентными к пигменту.

Таким образом, нами впервые было показано наличие антибиотических веществ, продуцируемых актиномицетами рода Frankia.

5. Инокуляция актиноризных растений.

Опыты по инокуляции ольхи и облепихи, т. е. внесению чистых культур эндофита в корневую зону растений (0,2 мг/растение), проведенные в условиях теплицы на стерильном субстрате, показали, что инокулированные растения, превышают контрольные по всем изученным биометрическим показателям ( Табл. 7).

Результаты опытов по инокуляции сеянцев ольхи в условиях открытого грунта, т.е. на фоне естественной популяции зндофита, также указывают на целесообразность использования чистых культур

Таблица 6

Влияние пигмента Б-2№ на накопление биомассы исследованных организмов С мг сух. вес/мл)

Микроорганизм Концентрация пигмента (ыкг/мл)

О' 12,5 25 50

Бактерии: грамположительные Arthrobacter ¿-Jobjfornjs ВКМ В-193 0,55

грамотрицательные Pseudomonas putjda ВКМ В-1301 0,82

Paracoccus denitrificans ВКМ В-1423 1,10

Дрожжи:

Candida lipolytica

ИБФМ У-155 5,90

Грибы:

Fusarium decewcellulare

ВКМ F-1179 2,30

0,09

0,88 1,15

4,30

2,70

0,07

H. о.

I,15

1,82 0,70

0,04

0,70 1,08

0,10

0,18

Таблица 7

Влияние инокуляции•на рост 3-х месячных сеянцев ольхи и облепихи в условиях теплицы на стерильном субстрате

• Биометрические Ольха Облепиха

показатели _

Без иноку- С иноку- Без иноку- С инокуляции ляцией ляции ляцией

Длина стебля (см) 2,8±0,б 11,5±0,9 6,5+0,2 11,5+0,6 Количество клубеньков на растении О 7,2+1,6 0 5,4+1,7 Объем клубеньков на

растении (мкл) 0 260+34 О 80+10

Ацетиленредукция

(мкМ этилена/растение

В час) О 5,2+0,6 О 1,4+0,2

актиномицетов рода Ггап^'а для повышения жизнестойкости и стимуляции роста растений (Табл.8). Однако, эффект инокуляции в этом случае значительно ниже, чем в теплице, и зависит от различных природно-климатических факторов.

Таблица 8

чРост сеянцев ольхи в условиях открытого грунта при инокуляции чистыми культурами Ггапкха Брр. ( в % к биометрическим показателям неинокулированных растений)

Биометрические Место проведения испытаний

показатели рас-

тений Прибалтика* Заполярье** Нечерноземье***

Длина стебля 125 110 200

Диаметр стебля 140 н. 0. Н.О.

Длина листьев 140 н. 0. н. 0.

Объем корневых

клубеньков н. о. 1 н. 0. 2800

Гибель сеянцев 29 н. 0. н. 0.

* - опытные делянки Калининградского ботанического сада (пос. Рыбачий, Куршская коса); ** - опытные делянки Полярно-ботанического сада-института Кольского филиала АН СССР (г. Апатиты Мурманской обл. , Кольский п-ов); *** - опытные делянки Лаборатории лесоведения АН СССР (Серебряноборское лесничество Московской обл., Среднерусская возвышенность); 1 - данные не определялись

Было также установлено, что ряд штаммов аффективных в теплице оказывает лишь незначительное или вообще не оказывает существенного влияния на рост ольхи в открытом грунте. Ш-видимо-му, это связано с конкурентными отношениями вносимых культур и естественной популяции эндофита По-видимому, лабораторная проверка инфекционности изолята не является достаточной для определения перспективности штамма Ргапк1а эр. в практических целях. Необходимо проведение испытаний стимулирующей активности штамма применительно к конкретным климатическим условиям, характеру грунта и, возможно, определенным видам (сортам, зкотипам) растений.

Испытание влияния инокуляции на рост облепихи показало, что для штаммов Ггапк^а грр., инфекционных для облепихи, в отличии

от указанных выше, наблюдается четкая корреляция между активностью в условиях теплицы и эффективностью в открытом грунте, данная корреляция отмечалась на всех использованных участках испытания и позволяет предположить, что эффективность штаммов Л-алМа гр. 313 и РгалИа эр. Э14 слабо зависит от условий внешней среды.

Изучение динамики стимуляции растений показывает, что стимулирующий зф£йкт однократной инокуляции при посадке саженцев облепихи наблюдается в течение, по-крайней мере, трех лет и обладает тенденцией к увеличению (Табл.9).

Таблица 9

Рост облепихи в условиях открытого грунта при инокуляции штаммом Л-апйа эр. 313 ( в % к неинокулированному контролю)

Место проведения испытаний

Биометрические _

показатели рас- Прибалтика-* Поволжье** Украина***

тений I год I год II год I год Пгод III год

Длина стебля 149 123 127 117 122 129

Дшна листьев 181 н. 0. н. 0. н. 0. Н. 0. Н.О.

Площадь листовой

пластинки 228 Н. 0. н. 0. н. 0. Н. 0. н. 0.

Вес растения н. о. Н. 0. 163 н. о. Н. 0. н. 0.

Вес корневых

клубеньков н. о. 1 1156 675 н. 0. н.о. н. о.

Гибель саженцев н. о. 100 100 36 39 39

* - опытные делянки Калининградского ботанического сада (пос. Рыбачий, Куршская коса); ** - опытные делянки ботанического сада Куйбышевского госуниверситета (г.Куйбышев, Среднее Поволжье);

*** - опытные делянки Днепропетровского госуниверситета (г. Павлоград Днепропетровской обл., Приднепровье) ! - данные не определялись

Полученные результаты позволяют рекомендовать инокуляцию саженцев облепихи указанными штаммами как средство повышения их приживаемости (снижения гибели саженцев) и стимуляции роста.

выводы.

1. Обследованы корневые системы 10 родов актиноризных растений относящихся к 7 семействам в местах естественного произ-ростания, искуственных посадках и дендрариях ботанических садов. Обнаружены корневые клубеньки у растений родов 41 ms, Ceanotffis, Colletia, Corlaría, Elaeagnus, Hippophae, Myrica и Shepherdia. Впервые описаны актиноризные клубеньки на корнях эндемика северо -востока СССР - ольхи камчатской (Alms sinuata ssp. kamtschatica Holub.} и выявлены особенности их анатомического строения.

2. Создана коллекция из 199 штаммов Frankia spp. , выделенных из из корневых клубеньков 3 видов ольхи, 2 видов лоха, облепихи крушиновидной и шефердии серебристой. Штаммы охарактеризованы по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам, а также по инфекционное™. Рассмотрены варианты группировки штаммов по указанным признакам и сделан вывод о нецелесообразности формального описания видов на их основе в настоящее время.

3. Впервые выявлены штаммы, выделенные из растений семейства EJaeagnaceae, с узким ..спектром хозяйской специфичности, т.е. ограничивающимся только растением-хозяином.

4. Оптимизированы условия выращивания для ряда штаммов Frankia spp. Впервые показано, что выход биомассы франкий можно существенно повысить ( в 2-3 раза) не только варьированием источников углерода и азота в среде культивирования, но и путем оптимизации состава микроэлементов. Определены оптимальные концентрации микроэлементов для роста 5 штаммов Frankia spp.

■ 5. Впервые показана антибиотическая активность у представителей p. Frankia (штаммы S13, S14 и S15) в отношении дрожжей, грибов и грашюложигельных бактерий. Определена структура антибиотического вещества; показано, что по хроматографической подвижности и данным Ш- и, УФ-спектроскопии и маее-спектрометрии она идентична таковой пигмента G-2N, описанного ранее Гербер и Лэшевалье.

,б. Шказана. перспективность инокуляции ольхи и облепихи в различных природно-климатических зонах Европейской части СССР для стимуляции роста растений. Из состава выделенных изолятов подобраны элективные штаммы, инокуляция которыми ольхи и облепихи в условиях открытого грунта приводит к снижению гибели сеянцев и саженцев, увеличению длины стебля и его диаметра, а также количества и размеров листьев.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Ступарь 0. С. , Парийская А. Н. - Азотфиксирующие корневые клубеньки у эндемичного вида ольхи ОиБЬекЛа Б1маЬа ББр. ка^эсЬаЫса (Яс/1)Но1иЬ - Известия АН СССР сер. биол. , 1988, N.1, стр. 147-150.

2. Меденцев А. Г., Еаскунов В. П. , Ступарь 0. С. , Нефедова М.Ю., Акименко В. К - Пигменты Ггапк^а эр. А№ 190107. Влияние на перенос электронов в дыхательной цепи бактерий и митохондрий дрожжей - Биохимия, 1989, N.6, стр.926-932.

3. Ступарь 0. С. , Новик С. Н , Асеев А. Н , Томашевский А. К1 , Добрица С. Е , Калакуцкий Л. В. - Влияние дополнительной инокуляции на рост актиноризных растений - Известия АН СССР сер. биол. , 1989, N. 6, стр. 870-876.

4. Добрица С. К , Новик С. Н., Ступарь 0. С. - Инфекционность и хозяйская специфичность штаммов Ггапк^а - Микробиология, 1990, N.2, стр. 314-320.

5. Гавристов А. В., Ступарь О. С., Жидкая Е. А. - Влияние концентрации питательной среды на рост штамма ГгалАм'а эр. БОВ 010210 - Прикладная биохимия и микробиология, 199О, N.3, стр.399 -403.

6. Ступарь 0. С. , Новик С. Н., Томашевский А. Ю. - Авторское свидетельство N 1423550 на изобретение "Игамм актиномицета Ггал/а'а эр. для получения препарата, стимулирующего рост облепихи", приоритет от 30.12.1986 г. , дата регистрации 15.05.1988

7. Ступарь О. С. , Новик С. Н., Томашевский А. Ю. - Авторское свидетельство N 1433956 , на изобретение "Штамм актиномицета Ргапк^а гр. для получения препарата, стимулирующего рост облепихи", приоритет от 30.12.1986 г. , дата регистрации 01. 06.1988

17.05.91 г. Зак. 3325Р 125 экз. Уч.-изд.л. 1.0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ЛВД АН СССР