Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение из штаммов Nocardia species LK, Rhodococcus species LK2 и Azospirillum brasilense UQ 1796 сайт-специфических эндонуклеаз и их характеристика

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Забазная, Елена Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Явление модификации-рестрикции.

1.2. Сайт-специфические эндонуклеазы и метилазы.

1.2.1. Распространение сайт-специфических эндонуклеаз и метилаз.

1.2.2. Номенклатура сайт-специфических эндонуклеаз и метилаз.

1.3. Классификация сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции.

1.4. Ферменты типа I.

1.5. Ферменты типа II.

1.6. Ферменты типа III.

1.7. Ферменты типа IV.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.2. Методы.

2.2.1. Получение бактериальной биомассы и лизата.

2.2.2. Определение ферментативной активности сайт-специфических эндонуклеаз.

2.2.3. Определение наличия ферментативной активности сайт-специфических метилаз во фракциях.

2.2.4. Определение качества препаратов сайт-специфических эндонуклеаз

2.2.5. Определение точек расщепления ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами.

2.2.6. Определение молекулярной массы эндонуклеазы

Abal.

2.2.7. Выделение плазмидной ДНК,репликативной и одноцепочечной форм фага М13.

ГЛАВА 3. Поиск штаммов, содержащих сайт-специфические эндонуклеазы.

3.1. Выделение и селекция штаммов.

3.2. Определение рестриктазной активности выделенных штаммов.

3.3. Физиолого-биохимическая характеристика и идентификация штаммов, содержащих рестриктазы.

ГЛАВА 4. Выделение и характеристика сайт-специфической эндонуклеазы из Azospirillum brasilense UQ1796.

4.1. Выделение сайт-специфической эндонуклеазы Abal.

4.2. Определение молекулярной массы сайт-специфической эндонуклеазы Abal.

4.3. Определение сайта узнавания и точек расщепления.

4.4. Некоторые свойства рестриктазы Abal.

ГЛАВА 5. Выделение и характеристика сайт-специфической эндонуклеазы из Nocardia spesies LK.

5.1. Выделение сайт-специфической эндонуклеазы Nsp LKI.

5.2. Определение сайта узнавания и точек расщепления Nsp LKI.

5.3. Некоторые свойства эндонуклеазы NspLKI.

ГЛАВА 6. Выделение и характеристика сайт-специфических эндонуклеаз из Rhodococcus species LK2.

6.1. Выделение сайт-специфических эндонуклеаз RspLKI и RspLKI I.

6.2. Определение сайтов узнавания и точек расщепления.

6.3. Некоторые свойства рестриктаз RspLKI и RspLKI1.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение из штаммов Nocardia species LK, Rhodococcus species LK2 и Azospirillum brasilense UQ 1796 сайт-специфических эндонуклеаз и их характеристика"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Открытие в 1970 г. сайт-специфических эндонуклеаз (рестриктаз) II типа (КФЗ.1.21.4) явилось решающим фактором для возникновения генной инженерии, поскольку эти ферменты обладают способностью узнавать строго определенные последовательности нуклеотидов и имеют четко определенную локализацию места расщепления молекулы ДНК. Использование рестриктаз этого типа дало возможность получать специфические фрагменты ДНК, содержащие нужные гены, картировать молекулы ДНК. Выделение рестриктаз с новыми спе-цифичностями часто приводит к созданию новых методов генной инженерии. Эндонуклеазы II типа применяются как инструмент не только в генной инженерии, но и в медицинских исследованиях, например, при детектировании единичных замен нуклеотидных пар, связанных с наследственными заболеваниями.

Несмотря на то, что в настоящее время известно около двух тысяч рестриктаз с более чем двумястами специфичностями [1], поиск новых ферментов этого типа не теряет своей актуальности. Целью таких работ является как выделение ферментов с новыми специфичностями, так и изомеров и изошизомеров уже известных рестриктаз, обладающих более высокой эндонуклеазной активностью и стабильностью, более удобных в использовании и проявляющих более низкую неспецифическую активность, чем их аналоги.

- б

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы явился поиск штаммов, содержащих сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции, очистка и характеристика рестриктаз из выделенных штаммов.

Для ее достижения были решены следующие конкретные задачи:

1) создание коллекции почвенных термофильных и мезофильных микроорганизмов;

2) определение наличия сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции в выделенных штаммах;

4) идентификация штаммов, содержащих рестриктазы;

5) выделение рестриктаз из штаммов Nocardia species LK, Rhodo-coccus species LK2 и Azospirillum brasilense\JQ1196;

6) определение активности, сайтов узнавания и точек расщепления полученных ферментов; а также определение оптимальной температуры рестрикции, оптимального реакционного буфера и изучение условий хранения выделенных рестриктаз.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Выделены новые почвенные штаммы, идентифицированные как Nocardia species LK и Rhodococcus species LK2, содержащие следующие рестриктазы:

NspLKl, являющуюся изошизомером Haelll, общий выход выделенного фермента в 3 раза превосходит общий выход фермента FniiDl, являющегося изомером ЯаеШ. Фермент обладает высокой термостабильностью . ifspLKI, являющуюся изошизомером SphI, выход фермента из штамма Rhodoccocus species LK2 превосходит выход из штамма Streptomyces phaeochromogenes в 3 раза. i?spLKII, являющуюся изошизомером BanBI. Из Azospirillum brasilense UQ1796 выделен фермент Abal. Определены сайты узнавания и точки расщепления этих ферментов, подобраны оптимальные температурные условия проведения гидролиза ДНК, состав реакционного буфера и значение рН. Исследованы условия хранения препаратов ферментов, их температурная стабильность.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Отработаны приемы получения биомассы исследуемых штаммов, подобраны условия выделения функционально чистых ферментов из штаммов Azospirillum brasilense UQ1796, No-cardia species LK и Rhodococcus species LK2. Охарактеризованы выделенные ферменты. Полученные в результате работы ферменты использовались в лаборатории молекулярной генетики института белка РАН в работе по созданию конструктов ДНК, содержащих множественные сайты узнавания и рестрикции в вариабельном нуклеотидном окружении с целью получения усовершенствованных субстратов для определения точек расщепления ДНК в случае неоднозначного расщепления узнаваемого сайта. ДНК, расщепленная выделенными ферментами использовалась в качестве маркеров длин нуклеотидов при электрофорезе в агарозном геле. Ферменты использовались для расщепления субстратов в работах по картированию генов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации были представлены на II и III Пущинских конференциях молодых ученых, проводимых в 1997 и 1998 гг.

- 8

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Выделение и характеристика микроорганизмов - продуцентов сайт-специфических эндонуклеаз.

2. Выделение и характеристика сайт-специфической эндонуклеазы

Abal.

3. Выделение и характеристика сайт-специфической эндонуклеазы Nsp LKI.

4. Выделение и характеристика сайт-специфических эндонуклеаз Rsp LKI и RspLKII.

5. Перспективы использования выделенных сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции.

ПУБЛИКАЦИИ. По теме исследования опубликовано 5 работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, б глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 95 работ зарубежных и б отечественных автора и содержит 145 страниц машинописного текста, включающего 36 рисунков и б таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Забазная, Елена Владимировна

выводы

1. Создана коллекция термофильных и мезофильных почвенных штаммов. Проведен скрининг 49 штаммов на наличие сайт-специфической эндонуклеазной активности, а в 12 из них - предварительное определение сайтов расщепления сайт-специфических эндонуклеаз. Два штамма, проявляющие наибольшую рестриктазную активность, идентифицированы как Nocardia species LK и Rhodococcus species LK2.

2. Из музейного штамма Azospirilium brasilense UQ1796 выделена сайт-специфическая эндонуклеаза Abal. Отработана методика ее выделения, определены субстратная специфичность, сайт узнавания и точки расщепления ДНК этой рестриктазой. Abal узнает палиндромную последовательность 51-T/GATCA-31 и расщепляет ее с образованием выступающего 51-GATC конца. Фермент блокируется метилированием аденина в сайте узнавания при с?<зл2-метилировании, его молекулярная масса в не-денатурирующих условиях около 34 кДа.

Оптимальными условиями для проявления активности Abal являются: буфер LRB, не содержащий NaCl, рН 7,4, и ацетатный буфер, рН 7,9; температура 48°С. Рестриктаза Abal не теряет свою активность при температуре -10°С в течение 2,5 месяцев. Хранение при 24°С в течение 14 часов приводит к уменьшению активности в 3 раза, а 28 часов - полностью инактивирует фермент.

3. Из выделенной и идентифицированной нами почвенной бактерии Nocardia species LK получен препарат функционально чистой рестриктазы NspLKI, являющийся изошизомером Haelll. Выход фермента составляет 100000 ед. на 1 г сырой биомассы, что в 3 раза превосходит общий выход такого изомера Haelll, как FnuDI, и сравним с общим выходом другого изошизомера Haelll, BsuRI.

При расщеплении ДНК плазмиды pUC18 получены фрагменты с длинами 600, 460, 450, 300, 250, 170, 110 и 90 п.н., что позволяет считать NspLKI мелкощепящей рестриктазой. NspLKI узнает палиндромную последовательность GG/CC и расщепляет ее с образованием "тупых" концов и способна расщеплять одноцепочечную ДНК.

Оптимальными условиями для проявления функциональной активности NspLKI являются ионная сила ЮОшМ NaCl, рН 7,4, температура 55°С. Фермент сохраняет свою активность при -10°С в течение трех месяцев. Хранение при температуре 20°С в течение трех суток не изменяет его активность.

4. Из выделенной и идентифицированной нами почвенной культуры Rhodococcus species LK2 выделены и очищены две сайт-специфические эндонуклеазы: RspLKI, являющаяся изошизомером SphI и RspLKII - изо-шизомер BamHI. По выходу фермента RspLKI (9000 ед. на 1г биомассы) штамм Rhodoccocus species LK2 превосходит штамм-прототип Streptomy-ces phaeochromogenes в 3 раза. Выход фермента RspLKII составил 1000 ед. на 1г биомассы.

Рестриктаза RspLKI узнает палиндромную последовательность 51-GCATG/C-3' и расщепляет ее с образованием выступающего 3'-GTAC нуклеотидного конца. #ермент RspLKII расщепляет ДНК плазмид pBR322, PACYC184, PJRD184, фага M13tgl31 в одной точке. RspLKII имеет 5 сайтов расщепления на ДНК фага А, узнает последовательность

51-G/GATCC-31 и расщепляет ее с образованием выступающего 5'-GATC нуклеотидного конца. RspLKII нечувствителен к метилированию аденина в сайте узнавания при dam-метилировании.

Оптимальными условиями для проявления активности фермента RspLKI являются ионная сила 50 mM NaCl, рН 7,4, температура 37° С. Максимальная активность эндонуклеазы RspLKII выявляется в буфере MRB с 50 mM NaCl, рН 7,4 и в ацетатном буфере, рН 7,9; при температуре 22°С. Оба фермента сохраняют свою активность при -10°С в течение трех месяцев, но хранение при 20°С в течение 2 суток снижает их активность.

5. Рестриктазы Abal и NspLKI устойчивы к тепловой инактивации, в то время как RspLKI и RspLKII полностью инактивируются при прогревании в течение 20 минут при 65°С.

6. Высокий выход и активность ферментов RspLKI и NspLKI, сохранение активности последнего при температуре 20-22°С, устойчивость всех выделенных эндонуклеаз при длительном хранении при -10° С, возможность проводить гидролиз в широком диапазоне буферов и различном температурном режиме выгодно отличают полученные рестриктазы NspLKI, RspLKI, Abal от известных препаратов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Из почвенной культуры Azospirillum brasilense UQ1796 выделена и очищена до функционально чистого состояния сайт-специфическая эн-донуклеаза Abal. Препарат получен в результате последовательной хроматографии на колонках с фосфоцеллюлозой, гепарин-сефарозой и оксиапатитом. Использование в качестве первой колонки фосфоцеллюло-зы дало возможность исключить этап преципитации нуклеиновых кислот из лизата и освободиться от значительной части олигонуклеотидов, неспецифических эндонуклеаз а также белков кислого характера, которые не связываются с катионообменниками. Таким образом был получен функционально чистый белок. Определение молекулярной массы показало, что рестриктазная активность проявляется в объеме, соответствующем молекулярной массе белка в 32-36 кДа, что соответствует литературным данным о молекулярной массе других рестриктаз [15, 48].

Как показало определение сайта узнавания и точек расщепления ДНК, выделенный фермент узнает палиндромную последовательность 51-T/GATCA-3', принадлежит ко II классу эндонуклеаз рестрикции и является изошизомером эндонуклеазы Bell. Как уже упоминалось в обзоре литературы, существуют эндонуклеазы, узнающие различные последовательности нуклеотидов, но образующие при расщеплении ДНК одинаковые концы. Например:

BamHI 5' G/G A T С С 3'

С С T A G/G Bglll 5' A/G A T С T 3'

T С T A G/A Bell 5' T/G A T С A 31

ACTA G/T Sau3AI 5' /G A T С 3' С T A G/ при этом полученные после рестрикции и последующего лигирования сайты не расщепляются ни одной из этих эндонуклеаз. Эта особенность рестриктаз широко используется в ферментативной селекции рекомби-нантных ДНК, для создания банков генов. Кроме того, подобные свойства ферментов используются для создания целого ряда генноинженерных конструкций. Эндонуклеаза R Abal может использоваться для создания селективных кассет для сайт-специфического мутагенеза [13, 99, 100].

Полученный нами изошизомер обладает активностью в широком диапазоне температур и не снижает активности более чем в 4 раза в стандартных буферах LRB, MRB, HRB. Это еще более расширяет область применения данного фермента, поскольку делает возможным совместное использование рестриктазы Abal и большинства известных рестриктаз.

Из выделенной и идентифицированной нами почвенной бактерии No-cardia species LK в результате последовательных хроматографий очищена до функционально чистого состояния сайт-специфическая эндонук-леаза NspLKI. Выделенный препарат узнает на ДНК последовательность 5'-GG/CC-3' и расщепляет ее с образованием так называемых "тупых" концов. При использовании в генноинженерных работах такое расщепление удобно, так как отпадает необходимость последующей "полировки" концов - удалении выступающих липких концов. Выделенный фермент является изошизомером Haelll, выделенного из Haemophilus aeryptius [95]. К сожалению, мы не можем сравнить общую активность полученного нами фермента и активность фермента из штамма-прототипа, поскольку последнюю измеряли методом вискозиметрии, однако можно отметить, что общая активность NspLKI сравнима с общей активностью такого изошизомера Haelll, как BsuRI [96], а общий выход фермента NspLKI в 3 раза превосходит общий выход фермента FnuDI [97], также являющегося изомером Haelll. Как и Haelll, фермент NspLKI способен расщеплять одноцепочечную ДНК, что также делает его привлекательным инструментом генной инженерии. Выделенный нами фермент обладает высокой стабильностью, он не изменяет активность при хранении в течение трех суток при температуре 20°С.

Из выделенной и идентифицированной нами почвенной культуры Rhodococcus species LK2 в результате ряда последовательных хрома-тографий выделены и очищены до функционально чистого состояния две сайт-специфические эндонуклеазы: RspLKI и RspLKII.

Фермент RspLKI относится ко II классу ( субкласс IIP) сайт-специфических эндонуклеаз, узнает на ДНК палиндромную последовательность 51-GCATG/C-31 и расщепляет ее с образованием липких

З1-концов. Таким образом, рестриктаза RspLKI является изошизомером SphI, выделенного из Streptomyces phaeochromogenes. Однако если выход фермента SphI составлял около 3000 ед. на 1г биомассы [95], то выход RspLKI равен 9000 ед. на 1 г биомассы при использовании в качестве субстрата ДНК фага X. Таким образом, по выходу фермента Rho-doccocus species LK2 превосходит штамм Streptomyces phaeochromogenes в 3 раза. Этот фермент широко используется в генной инженерии, так как содержится в полилинкере многих плазмид. В плазмиде pBR322 узнаваемая последовательность локализована в гене устойчивости к тетрациклину в точке 560 между сайтами для BamHI ( выделенный нами фермент RspLKII является изошизомером BamHI, о чем будет сказано ниже) и Sail, что может использоваться для селекции клонов. Благодаря образованию липких 3'-концов между основаниями G и С фрагменты, полученные с использованием RspLKI могут применяться в методике достройки концов ("dG-dC-tailing"), давно и широко использующейся [100].

Фермент RspLKII узнает последовательность 5'-G/GATCC-3' и расщепляет ее с образованием липких 5*-концов. Эта эндонуклеаза относится ко II классу эндонуклеаз рестрикции (IIP) и является изошизомером BamHI. Фермент RspLKII, как и BamHI, нечувствителен к dam-метилированию. Общая активность пепарата фермента составляет 18500 ед. Выход RspLKII - около 1000 ед. на 1 г сырой биомассы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Забазная, Елена Владимировна, Пущино-на Оке

1. Roberts, R.J., and Macelis, D. (1994) Restriction enzymes and their isoschizomers. Nucl. Acids Res., 22, 3628-3639.

2. Luria,S.E., Human, M.L.(1952) A nonhereditary host-induced variation of bacteriol viruses. J.Bacterid., 64, 557.

3. Luria, S.E. (1953) Host induceed modification of viruses. Gold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 18, 237.

4. Bertani, C., and Weigle, J.J. (1953) Host controlled variation in bacterial viruses. J.Bacteriol., 65, 111.

5. Arber,W., Dussoix, D.(1962) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. I. Host controlled modification of bacteriophage lambda. J.Mol.Biol., 5, 18.

6. Dussoix, D., Arber, W. (1962) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. II. Control over acceptance of DNA from infecting phage lambda. J.Mol.Biol., 5, 37.

7. Arber,W. (1965) Host controlled modification of bacteriophage. Ann.Rev.Microbiol., 19, 365.

8. Arber,W., Linn,S. (1969) DNA modification and restriction. Ann.Rev Biochem., 38, 467.

9. Boyer,H.W. (1971) DNA restriction and modification mechanisms in bacteria. Ann.Rev.Microbiol., 25, 153.

10. Arber,W. (1971) Host controlled variation in the bacteriophage lambda, Hershey A.D.,Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 83.

11. Meselson,M., Yuan,R., Heywood,J. (1972) Restriction and modification of DNA. Ann.Rev.Biochem., 41, 447.

12. Arber,W. (1974) DNA modification and restriction. Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol., 14, 1.

13. Nathans,D., Smith,H.O. (1974) Restriction endonucleases in the analysis and restruction of DNA molecules. Ann.Rev.Biochem., 44, 273.

14. Smith,H.O., and Wilcox, K.W. (1970) A restriction enzyme from Haemophilus influenzae.I.Purification and general properties. J. Mol. Biol., 51, 379.

15. Wilson, G.G., and Murray, N.E. (1991) Restriction and modification systems. Annu. Rev. Genet., 25, 585-627.

16. Barlow, D.P. (1993) Methilation and imprinting: from host-defense to gene regulation. Science, 260, 309-310.

17. Laue, F., Evans, L.R.,Jarsch,M., Brown, N.L., and Kessler, C. (1991) A complex family of class-II restriction endonucleases, Dsal-VI, in Dactylococcopsis salina. Gene, 97, 87-95.

18. Smith, H.O., and Nathans, D. (1973) A suggested nomenclature for bacterial host modification and restriction systems and their enzymes. J. Mol. Biol., 81, 419-423.

19. Shibata, Т., Ikawa, S., Kim, C., and Ando, T. (1976) Site specific deoxyribonucleases in Bacillus subtilis and other Bacillus strains. J. Bacterid., 128, 473-476.

20. Meselson,M., Yuan,R. (1968) DNA restriction enzyme from E.coli. Nature. 217, 1110.

21. Linn,S., Arber,W. (1968) Host specificity of DNA produced by Escherichia coli. X. In vitro restriction of phage fd replicati-ve form. Proc.Natl.Acad.Sci., USA., 59, 1300.

22. Studier, F.W., and Bandyopadhyay, P.K. (1988) Model for how type I restriction enzymes select cleavage sites in DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 4677-4681.

23. Sain, В., and Murray, N.E. (1980) The hsd (host specificity) genes of E. coli K12. Mol. Gen. Genet., 180, 35-46.

24. Bickle, T.A., and Kruger, D.H. (1993) Biology of DNA restriction. Microboil. Rev., 57, 434-450.

25. Kannan, P., Cowan, G.M., Daniel, A.S., Gann, A.A.F., and Murray, N.E. (1989) Conservation of organization in the specificity polypeptides of two families of type I restriction enzymes. J. Mol. Biol., 209, 335-344.

26. Fuller-Pace, F.V., Bullas, L.R., Dalius, H., and Murray, N.E. (1984) Genetic recombination can generate altered restriction specificity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6095-6099.

27. Glover, S.W., Firman, K., Watson, G., Price, C., and Donaldson, S. (1983) The alternate expression of two restriction and modification systems. Mol. Gen. Genet., 190, 65-69.

28. Price, C., Lingner, J., Bickle, A.T., Firman, K., and Glover, S.W. (1989) Basis for changes in DNA recognition by the EcoR124 and EcoR124/3 Type I DNA restriction and modification enzymes. J. Mol. Biol., 205, 115-125.

29. Gubler, M., and Bickle, Т.A. (1991) Increased protein flexibility leads to promiscuous protein-DNA interactions in type 1С restriction-modification systems. EMBO J., 10, 951-957.

30. Eskin, В., and Linn, S. (1972) The deoxyribonucleic acid modification and restriction enzymes of Escherichia coli В. II. Purification, subunit structure, and catalytic properties of the restriction endonuclease. J. Biol. Chem.,247, 6183-6191.

31. Murray, N.E., Batten, P.L., and Murray, K. (1973) Restriction of bacteriophage lambda by Escherichia coli K. J. Mol. Biol.,81, 395-407.

32. Kelly,T.J., Smith,H.O. (1970) /А restriction enxyme from Haemophilus influenzae. II. Base sequence of the recognetion site. J.Mol.Biol., 51, 379.

33. Б.Льюин Гены. Под ред.Г.П.Георгиева Пер.с англ.М.Мир:1987

34. Roberts,R.J., Macelis,D. (1992) Nucl.Acids Res., 20,2167-2180.

35. Zang,Y., Nelson,M., Nietfeldt,J.W., Burbank,D.E., and Van Etten, J.L. (1992) Characterization of Clorella virus PBCV-1 CviAII restriction and modification system. Nucl. Acids Res., 20, 5351-5356.

36. Greene,P.J., Betlach,C.M., Boyer,H.W., Goodman,H.M. (1974) The Eco RI restriction endonuclease., In Methods in Molecular Biology, Wickner R.B., Ed.,V.7, DNA Replication, Marcel Dekker, New York,1974, 87.

37. Kessler, C., and Manta, V. (1990) Specificity of restriction endonucleases and DNA modification methyltransferases a review (edition 3). Gene, 92, 1-248.

38. Hattman,S., Gribbin,C., Hutchinson III C.A. (1979) In vivo metilation of bacteriophage x 174 DNA. J.Virologe., 32, 845-851.

39. Kruger,D.H., Schoroeder,C., Reuter,M. et al (1985) DNA methylation of bacterial viruses T3 and T7 by different DNA methy-lase in Escherichia coli К 12 cells. Eur.J.Biochem., 150, 323-330.

40. Yang,C.С., Topal,M.D. (1992) Nonidentical DNA binding sites of endonuclease Nael recognize different families of sequences flanking the recognition site. Biochemistry, 31, 9657-9664.

41. Kruger, D.H., Barcak, G.J., Reuter, M., and Smith, H.O. (1988) EcoRII can be activated to cleave refractory DNA recognition sites. Nucl. Acids Res., 16, 3997-4008.

42. Pein, C.-D., Reuter, M., Cech, D., and Kruger, D.H. (1989) Oligonucleotide duplexes containing CC(A/T)GG stimulate cleavage ofrefractory DNA by restriction endonuclease EcoRII. FEBS Lett., 245, 141-144.

43. Topal, M.D., Thresher, R.J., Conrad, M., and Griffith, J. (1991) Nael endonuclease binding to pBR322 DNA induces looping. Biochemistry, 30, 2006-2010.

44. Bhagwat, A.S., Johnson, В., Weule, K., and Roberts, R.J. (1990) Primary sequence of the EcoRII endonuclease and properties of its fusions with beta-galactosidase. J. Biol. Chem., 265, 767-773.

45. Jo, K., and Topal, M.D. (1995) DNA topoisomerase and re-combinase activities in Nael restriction endonuclease. Science, 267, 1817-1820.

46. Roberts,R.J. (1976) Restriction endonucleases. CRC Critical Reviews in Biochemistry, 4, 123-164.

47. Ehrlich, M., Gama-Sosa, M.A., Carreira, L.H., Ljungdahl, L.G., Kuo, K.C., and Gehrke, C.W. (1985) DNA methylation in therm-jphilic bacteria: N4-methylcytosine, 5-methylcytosine, and N6-met-hyladenine. Nucl. Acids Res., 13, 1399-1412.

48. Ehrlich, M., Wilson, G.G., Kenneth, C.K., and Gehrke, C.W. (1987) N4-methylcytosine as a minor base in bacterial DNA. J. Bacteriol. , 169, 939-943.

49. Wang, R.Y.H., Kuo, K.C., Gehrke, C.W., Huang, L.H., and Ehrlich, M. (1982) Heat- and alkali-induced deamination of 5-methylcytosine and cytosine residues in DNA. Biochem. Biophys. Acta, 697, 371-377.

50. Wilson, G.G. (1991) Organization of restriction-modification systems. Nucl. Acids Res., 19, 2539-2566.

51. Lauster, R., Trautner, T.A., and Noyer-Weidner, M. (1989) Cytosine-specifictype II DNA methyltransferases: a conserved enzyme core with variable target-recognizing domains. J. Mol. Biol., 206, 305-312.

52. Barras, F., and Marinus, M.G. (1989) The great GATS: DNA methylation in E. coli. Trends Genet., 5, 139-143.

53. Stephenson, F.N., Ballard, B.T., Boyer, H.W., Rosenberg, J.M., and Greene, P.J. (1989) Comparison of the nucleotide and amino acids sequences of the RsrI and EcoRI restriction endonucleases. Gene, 85, 1-13.

54. Barany, F., Danzitz, M., Zebala, J., and Mayer, A. (1992) Cloning and sequencing of genes encoding the TthHB8I restriction and modification enzymes: comparison with the isoschizomeric TaqI enzymes. Gene, 112, 3-12.

55. Newman, M., Strzelecka, Т., Dorner, L.F., Schildkraut, I., and Aggarval, A.K. (1995) Structure of BamHI endonuclease bound to DNA: partial folding and unfolding on DNA binding. Science, 269, 656-663.

56. Lauster, R. (1989) Evolution of type II DNA methyltransfe-rases: a gene duplication model. J. Mol. Biol., 206, 313-321.

57. Walter, J., Noyer-Weidner, M., and Trautner, T.A. (1990) The amino acid sequence of the CCGG recognizing DNA methyltransfe-rase M BsuFI: implications for the analysis of sequence recognitionby cytosine DNA methyltransferases. EMBO J., 9, 1007-1013.

58. Klimasauskas, S., Nelson, J.L., and Roberts, R.J. (1991) The sequence specificity domain of cytosine-C5 methylases. Nucl. Acids Res., 19, 6183-6190.

59. Guschlbauer, W. (1988) The DNA and S-adenosylmethioni-ne-binding regions of EcoDam and related methyltransferases. Gene, 74, 211-214.

60. Smith, H.O., Annau, T.M., and Chandrasegaran, S. (1990) Finding sequence motifs in groups of functionally related proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 826-830.

61. Klimasauskas, S., Timinskas, A., Menkevicius, S., Butkie-ne, D., Butkus, V., and Janulaitis, A. (1989) Sequence motifs characteristic of DNAcytosine-N4.methylases: similarity to adenine and cytosine-C5 DNA-methylases. Nucl. Acids Res., 17, 9823-9832.

62. Tao, Т., Bourne, J.C., and Blumenthal, R.M. (1991) A family of regulatory genes associated with type II restriction-modification systems. J. Bacteriol., 173, 1367-1375.

63. Tao, Т., and Blumenthal, R.M. (1992) Sequence and characterization of pvuIIR, the PvuII endonuclease gene, and of pvuIIC, its regulatory gene. J. Bacterid., 174, 3395-3398.

64. Ives, C.L., Nathan, P.D., and Brooks, J.E. (1992) Regulation of the BamHI restriction modification system by a small inter-genic ORF, bamHIC, in both Escherichia coli and Bacillus subtilis. J. Bacterid., 174, 7194-7201.

65. Adams, G.M., and Blumenthal, R.M. (1995) Gene pvuIIW: apossible modulator of PvuII endonuclease subunit association. Gene, 157, 193-199.

66. Bickle,T.A. (1982) The ATP-dependent restriction endonuc-leases. In Linn S.M.,Roberts R.J. (edt.) Nucleases, Cold Spring Harbor N.Y.

67. Iida, S., Meyer, J., Bachi, В., Stalhammar-Carlemalm, M., Schrickel, S., Bickle, T.A., and Arber, W. (1983) DNA restriction-modification genes of phage PI and plasmid pl5B. J. Mol. Biol., 165, 1-18.

68. De Backer, 0., and Colson, C. (1991) Identification of the recognition sequence for the M StyLTI methyltransferase of Salmonella typhimurium LT7: an asymmetric site typical of type-Ill enzymes. Gene, 97, 103-107.

69. Vesely, Z., Muller, A., Schmitz, G.G., Kaluza, K. Jarsch, and Kessler, C. (1990) RleAI: a novel class-IIS restriction endonuclease from Rhizobium leguminosarum recognizing CCCACA. Gene, 95, 129-131.

70. Rao D.N., Eberle, H., and Bickle, T.A. (1989) Characterization of mutations of the bacteriophage PI mod gene encoding the recognition subunit of the EcoPl restriction and modification system. J. Bacterid., 171, 2347-2352.

71. Schroeder, C., Jurkschat, H., Meisel, A., Reich, J.G., and Kruger,D. (1986) Unusual occurrence of EcoPl and EcoP15 recognition sites and counterselection of type II methylation and restriction sequences in bacteriophage T7 DNA. Gene, 45, 77-86.

72. Meisel, A., Bickle, T.A., Kruger, D.H., and Schroeder, C. (1992) Type III restriction enzymes need two inversely oriented recognition sites for DNA cleavage. Nature (London), 355, 467-469.

73. Meisel, A., Mackeldanz, P., Bickle, T.A., Kruger, D.H. , and Schroeder, C. (1995) Type III restriction endonucleases translocate DNA in a reaction driven by recognition site-specific ATP hydrolysis. EMBO J., 14, 2958-2966.

74. Petrusyte, M., Bitiniate, J., Menkevicius, S., Klimasaus-kas, S., and Butkus, V. (1988) Restriction endonuclease of new type. Gene, 74, 89-91.

75. Janulaitis, A., Vaisvila, R., Timinskas, A., Klimasauskas, S. , and Butkus, V. (1992) Cloning and sequence analysis of the genes coding for Eco57I type IV restriction-modification enzymes. Nucl. Acids Res.,20, 6051-6056.

76. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии: Маниатис, Т., §рич, Э., Сэмбрук, Дж. Пер. с англ. М. Мир, 1984, 475 С.

77. Bergey's manual of systematic bacteriology/Eds.Buchman A., Gibbons W. 9th ed. Baltimore: Williams and Wilkins Co., 1989.

78. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./Под ред. §.Гер-хардта и др. Т.З. М.:Мир, 1984. С 10-46.

79. Микробиология с техникой микробиологических исследований: Лабинская А.С. М.:Медицина, 1978, 390 С.

80. New England Biolabs Catalog, 1996-1997, New England Bio-labs Inc., Beverly.

81. Brown,N.L., and Smith,M. (1980) Methods Enzymol., 65, 391-404.

82. Kieny,H.P.,Lathe,R., and Lecocq,J.P. (1983) Gene, 26,H91-99.

83. Heusterspreute,M.,Thi,V.H., Emery,S, Tournis-Gamble,S., Kennedy,N., and Davidson,J. (1985) Gene, 39, 299-304.

84. M13 cloning and sequencing handbook. Amersham. (1984) SPL Blenheim Crescent, London.

85. Мазин А.В., Кузнецов К.Д., Краев А.С. и др. (1990) Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Наука, Новосибирск, 248с.

86. Laemmli, U.K. (1970), Nature, 227, 680.

87. Yansch-Perronc, Vieira, J., and Messing, J. (1985) Improved M13 phage doning vectors and host strains: nucleotide sequence of the M13mpl8 and pUC19. Gene, 33, 103-119.

88. Нокардиоподобные микроорганизмы: Аристархова В.И. М.:Наука, 1989, 247 С.

89. Козулин С.В. Микробное получение акриламида: Автореф.дис. . канд.биол.наук. Саратов: РосНИПЧИ "Микроб", 1994, 23с.

90. Чернов А.В.,ЖелезнаяЛ.А., Матвиенко Н.И. (1995) Биохимия, 60, 1318-1325.

91. Green,P.J., Heyneker,Н.L., Bolivar,F., Rodriguez,R.L., Betlach,M.C., Covarrubias,A.A., Backman,K.,Russel,D.J., Tait,R., and Boyer H.W. (1978) Nucl.Acids Res., 5, 2373-2380.- 145

92. Middleton,J.Н., Edgell,M.H., Hutchison III,C.A. (1972) J.Virol., 10,42-50.

93. Bron,S., Murray,K., and Trayther,T.A. (1975) Mol.Gen.Genet., 143, 13-23.

94. Lui,А.С.P., McBride,B.C., Vovis,G.F., and Smith,M. (1979) Nucl.Acids Res., 6, 1-15.

95. Fuchs,L.Y., Covarrubias,L., Escalante, L. ,Sancherr,S., and Bolivar,F. (1980) Gene, 10, 39-46.

96. Gayle III R.B., Auger, E.A., Gough, G.R., Gilham, P.Т.,and Bennett, G.M. (1987) Formation of MboII vectors and cassettes using asymmetric MboII linkers. Gene, 54, 221-228.

97. Vermersch, P.S., and Bennett, G.M. (1987) The use of a selectable Fokl cassete in DNA replacement mutageneses of the R388 dihydrofolate reductase gene. Gene, 54, 229-238.

98. Chang, А.С.У. et.al. (1978) Nature, 275, 617.

99. Heusterspreute, M. et. al. (1987) Gene, 53, 299-300.