Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и свойства нейраминидазы Arthrobacter nicotianae

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и свойства нейраминидазы Arthrobacter nicotianae"

министерство медицинской промышленности ленинградский химико-фармацевтический институт

На правах рукописи

КОТЛЯР

Татьяна Владимировна

удк 577.152.321*18 577.112.083.

ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА НЕЙРАМИНИДАЗЫ АЯТШЮВАСТЕК ШСОПАМЕ

03.00.07 — микробиология

автор еферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ленинград — 1990

Работа выполнена на кафедре микробиологии Ленинградского химико-фармацевтического института.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Н. А. ЗАИКИНА доктор химических наук, ведущий научный сотрудник Л. К. ШАТАЕВА

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук Г. Д. К.ОБРИНСКИЙ кандидат биологических наук А. П. КАШКИН

Ведущая организация: Политехнический институт им. М. И. Калинина.

Защита состоится « г » 1990 г, в /О часов

на заседанки специализированного совета К 098.02.02 по биологическим наукам Ленинградского химико-фармацевтического института по адресу: 197022, Ленинград, ул. проф. Попова, д. 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан « ^ » 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук КАШК.ИНА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Широкое развитие биотехнологии ж внедрение ее в легкую, пищевую, медицинскую и микробиологическую промышленность ставит проблему освоения принципиально новых технологий выделения физиологически активных веществ., В области медицинской микробиологии эта задача сопряжеца с настоятельной необходимостью получения новых лечебных препаратов микробного происхождения: ферментов, гормонов, регуляторов. Среди: широкого класса пздролаз медицинского назначения особое место занимает нейраминидаза - фермент, отвечающий за регуляцию взаимодействия клеточных мембран. До настоящего времени все нейрами-нидазы получали из высокопатогенных микроорганизмов-возбудителей опасных инфекций (возбудителей холеры, газовой гангрены, стрептококковых инфекций и других), -в том числе в СССР - из холероподобных вибрионов в Горьковском НРШЭМ. Первые работы по получению нейраминидаз из непатогенных.микроорганизмов выполнены в ФРГ, Болгарии, Японии. В СССР до настоящего времени таких исследований не проводилось. Постановка подобной задачи в ■ качестве своего обоснования требует детального, сравнения физико-химических и биохимических свойств нейраминидаз патогенных и непатогенных продуцентов. Именно такое сравнение позволяет . правильно оценить перспективу перехода медицинской промышленности к новому классу продуцентов нейраминидазы - непатогенным микроорганизмам, в чем и заключается актуальность представляемой работы, которая посвящена сравнению молекулярных, биохимических и антигенных свойств нейраминидаз из разных источников.

Работа выполнена по координационному плану научно-исследовательских работ АН СССР по проблеме "Хроматография. Электро- . форез" на 1986-90 гг, а также в соответствии с комплексной программой "Фундаментальные науки - медицине".на 1985-90 гг.

Цели и задачи исследования. Исследование было предпринято с целью выделения и изучения внеклеточной нейраминидазы АхчыоЪас^ег п:5.со1;1апае , сравнения .ее свойств со свойствами коммерческого препарата нейраминидазы нехолерных вибрионов и изучения возможности замены фермента, синтезированного условно

патогенным продуцентом, аналогичным ферментом сапрофитного микроорганизма.

В задачи исследования входило:

- разработка препаративного метода получения нейраминидазы А.п1оо1;1апае с высокой специфической активностью;

- изучение физико-химических параметров фермента;

- изучение кинетики действия фермента;

- изучение антигенных свойств'фермента и влияния специфических антител на его активность.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые исследована внеклеточная нейраминидаза непатогенного продуцента А.п1со1;1авде . С помощью аффинной хроматографии на композиционном сорбенте Стропан, включающем иммобилизованную в пористую полимерную матрицу строму эритроцитов, получен высокоочищенный ' препарат фермента. Изучены физико-химические и кинетические свойства выделенной нейраминидазы, исследована ее специфичность по отношению к разным субстратам, в том числа к мембранным рецепторам эритроцитов. Проведено сравнение антигенных свойств нейраминидазы А.п1со-Цапае с антигенными свойствами коммерческого препарата нейраминидазы нехолерных вибрионов, установлено ингибирующее действие антинейраминвдазных антител на ферментативную активность.

Практическая ценность работы. Разработан эффективный метод получения высокоочищенного препарата нейраминидазы а.п1-со-Иапае , который основан на использовании аффинного сорбента отечественного производства. Метод позволяет выделять ней-раминвдазу непосредственно из культуральной жидкости продуцента, минуя предварительные стадии очистки, что значительно ускоряет процесс, уменьшает потери целевого продукта. Результаты исследования свойств выделенного фермента составляют биохимическое обоснование для замены существующего препарата нейраминидазы условно патогенного продуцента - нехолерных вибрионов - аналогичным ферментом непатогенного продуцента. Нейраминидаза А.пАсоиапае сравнима по специфичности с нейрами-нидазой нехолерных вибрионов, что делает возможным использо-

вать ее в клинической практике. Антигенность нейраминидазы A.nicotianae несколько ниже антигенности нейраминвдазы нехолерных вибрионов, что дает ей определенные преимущества при использовании в терапевтических целях.

Ап'робахшя работы. Результаты исследований были доложены на конференции молодых ученых JLQ Всесоюзного микробиологического общества (1987 г.); на I Всесоюзном симпозиуме "Препаративная хроматография физиологически активных веществ .на.поли-мерных сорбентах" (Ленинград, Ольгино, 1988 г.); на. конференции молодых ученых "Творчество молодых - научно-техническому прогрессу" (Ленинград, 1988 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из ¡введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных'результатов и их обсуждения, • ,выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 136 страницах машинописного текста, содержит 17 рисунков, II таблиц. Библиография включает IC2 наименовали®.

ЭКС1ШРШНМЛЫШГ ЧАСТЬ

■ Материалы и методы исследования .

Объектом исследования являлась нейраминидаза (КФ 3.2.I.I8) из культуральной жидкости Arthrobacter nicotiame у полученная из Института микробиологии Болгарской Академии Наук в рамках научного сотрудничества. Содержание экзофермента нейрамини-дазы определяли тиобарбитуровым методом (Aminoff , 1961), используя в качестве субстрата гликомакропептид молочной сыворотки (ГМП). В пробу брали 0,1 мл раствора субстрата (4 мг/мл) в 0,05 М ацетатном буфере рН 4,5 и 0,1 мл раствора фермента. Смесь инкубировали 20 мин при 37°. Калибровку проводили по n -ацетилнейраминовой кислоте (nana). За единицу активности принимали такое количество фермента, которое отщепляло I мкмоль nana за I мин при 37° при рН 4,5. Содержание белка определяли

по методу Лоури (ьопгу , 1951).

Препарат нейраминидазы А.п1со1;1апае получали с поморю аффинной хроматографии на композиционном сорбенте Стропан, разработанном в-Институте высокомолекулярных соединений АН СССР. Сорбент представляет собой строму эритроцитов, иммобилизованную в пористом полимерном носителе. Строма эритроцитов несет на поверхности группы с опаловыми кислотами - специфическими аффинными центрами связывания микробных нейрашнидаэ. Сорбент промывали 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 4,7. Сорбцию фермента из культуральной жидкости проводили при температуре 810°, скорость подачи раствора 50 см3/см2ч. Десорбцию проводили последовательно дистиллированной водой и 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 7,0 при температуре 43-45°; скорость пропускания растворов 30 см®/см^ч. Сорбент регенерировали 0,1 М натрий-фосфатным буфером рН 9,1.

Элгаатн с аффинного сорбента концентрировали обратным диализом в целлофановых мешках против фиколла и рехроматографи-ровали на колонке с сефадексом й -200 (размер колонки 1,6x60 см); скорость элзоции - 6 сьР/ч, элюент - 0,2 н хлорид натрия.

Молекулярную массу (м.м.) фермента определяли методом гель-фильтрации (Детерман, 1970), в качестве калибровочных веществ использовали: цитохром С (м.м. 12,3 кДа), гемоглобин (м.м. 67 кДа), декстран голубой (м.м. 2000 кДа).

Для определения содержания сиаловых кислот в субстрате проводили кислотный гидролиз гликопротеина в 0,1 н серной кислоте при 80° в течение I ч (Готтшалк, 1969) в запаянных ампулах. Кислоту нейтрализовывали сухим бикарбонатом натрия, содержание сиаловыхкислот определяли тиобарбитуровым методом.

При определении активности нейраминидазы по действию на рецепторы эритроцитов использовали 2 % суспензию эритроцитов доноров групп крови А и В. В качестве агглютинина применяли вакцинный штамм вируса- гриппа (Ин-т полиомиелита и вирусных энцефалитов АМН СССР) с титром 1:16. Серию последовательных двукратных разведений фермента в 0,2 мл раствора Рингера готовили на платах, в каждую лунку добавляли по 0,2 мл суспензии эритроцитов, выдерживали при 20° в течение I ч. Затем в каждую лунку вносили по 0,2 мл агглютинина, перемешивали и

оставляли при той же температуре на 1,5 ч. Наличие агглютинации определяли визуально.

Наличие изоформ у нейраминадазы A.nicotianae определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле (Маурер Г., 1971).

Антитела к нейраминидазач А.п1со1;1ат1ае и нехолерных вибрионов получали иммунизацией кроликов по следующей схеме: 0,5 мл раствора фермента (165 мкг белка/мл) и 0,5 мл. полного адаюванта Фрейвда вводили по 0,3 мл в область подколенных лимфатических узлов задних конечностей и по 0,2 мл в подушечки задних лап. Через 8 недель проводили реиммунизацию: по 0,1 мл фермента под кожу бедра. Инъекцию повторяли 3 раза через 7 дней. Кровь отбирали через 7 дней после последнего введения антигена. При иммунизации нейраминидазой А.п1со1;1а-пае применяли другую, схему иммунизации: 0,5 мл раствора фермента (270 мкг белка/мл) и 0,5 мл полного адъюванта Фрейнда вводили по 0,25 мл в подушечки лап. Кровь отбирали через 20 дней после иммунизации. Антитела определяли в реакции связывания комплемента (РСК) на холоду и реакции преципитации в агаре.

При определении влияния сыворотки на активность нейрами-нидазы смешивали по 0,1 мл субстрата (6 мг/мл в физиологическом растворе хлорида натрия), сыворотки, разведенной физиологическим раствором в 2 раза, и раствора фермента. Определение отщепленных сиаловых кислот проводили тиобарбитуровым методом.

Сыворотки фракционировали гель-фильтрацией на сефадексе й -200 в 0,05 М трис-буфере рН 8,0, содержащем 0,2 н хлорид натрия. Антитела во фракциях гель-фильтрацйи определяли в. РСК.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Выделение нейраминидазн А.п1со1;1апае на аффинном сорбенте.

Сорбция нейраминидазн А.а3.со1;1апае на иммобилизованной строме эритроцитов происходит в области значений рН от 4,4 до

5,0 (табл.1.).

Таблица Г

Аффинная хроматография нейраминидазы А.п1со1;1апаена сорбенте Стропан

Удельная актив- те Емкость Удельная актив- Выход

ность культураль- сорбция:, ность, ед/мг белка по ак-

ной жидкости:, сорбции ед/сьгсор-------тивно-

ед/мг оелка бента в пике I в пике П сти, %

0,669 4,4" 0,52 2,45 1,05 46,7

0,669 4,7 0,84 3,62 3,13 75,2

0,810 4,7 0,46 4,86 2,16 49,0

0,844' 4,7 '0,83 6,12 2,94 77,0

0,794' 5,0 0,65 2,70 0,99 72,4

0,678 5,6 0 0 0 -

Максимальная емкость сорбента по отношению к нейраминида-зе наблюдалась при рН сорбции 4,7. Этому же значению рН соответствует наибольшая удельная активность элюатов и максимальный выход фермента по активности. Выходные кривые процесса аффинной хроматографии: нейраминидазы при рН 4,7 представлены на рис.1. На стадии сорбции происходит полное связывание нейраминидазы аффинным сорбентом. Основная часть балластных белков проходит через колонку вместе с раствором. Следует отметить сложный механизм взаимодействия фермента со Стропаном. Фермент десорбируется в две стадии. Пик I с наибольшей удельной активностью десорбировался дистиллированной водой, т.е. при понижении ионной силы раствора по сравнению с условиями сорбции. Пик П, с меньшей удельной активностью, элюировался 0,1 М фосфатным буфером при рН 7,0, т.е.. при повышении рН раствора по сравнению с условиями'сорбции. Общая картина десорбции фермента в двух пиках сохранялась независимо от условий сорбции ■ (табл.1.). Это явление может объясняться двумя разными механизмами взаимодействия фермента с аффинным сорбентом.

На стадии десорбции водой при одновременном повышении

Рис. I. Выделение нейраминидазы А.п1со-иапае на аффинном

сорбенте Стропане.

По оси X - относительный объем пропущенного раствора.

1 - активность фракций, ед;

2 - оптическая плотность при 280 нм;

3 - концентрация белка, мкг/мл;

4' - рК.

температуры -наблюдалась картина, характерная для гидрофобных взаимодействий. Изменение ионной силы приводило к разрушению гидрофобных связей. Вторая стадия десорбции нейраминидазы. с сорбента при повышении рН раствора наблюдалась при разрыве полярных взаимодействий фермент-сорбент.

Анализ элюатов, полученных со Стропана, показал отсутствие в них свободных сиаяовых кислот, отщепленных нейраминвда-зой со стромы эритроцитов. При повторном использовании этого сорбента уменьшения сорбционной емкости практически не наблюдалось. В отличие от другого аффинного сорбента нейраминидазы - сшитой коломиновой кислоты (ЧсЫс1а г 1984) - Стропан можно использовать многократно, так как он не разрушается ферментом.

Анализ концентрированных элюатов оо Стропана методом гель-хроматографии показал, что обе активные фракции выходят одним пиком с одинаковым объемом задержки (рис.2). Таким образом,

активность

I - активность пика I; П - активность пика 2; I - оптическая плртность при 280 ни.

Рис.2. Гель-хроматография концентрированных элюатов с аффинного сорбента.

две фракции при десорбции свидетельствуют о двух различных механизмах взаимодействия нейраминидазы с сорбентом Сгропан и представляют собой один и тог же фермент. Об отсутствии у нейраминидазы А.п1со1;1апае изоформ свидетельствуют также результаты анализа культуральной жидкости и элюатов с аффинного сорбента методом электрофореза в полиакриламидном геле.

На рис.3 представлены результаты гель-хроматографического

активность Ч/сн*

0Д2

0.01

1 - нейраминидазная актив-

ность ;

2 - оптическая плотность

при 280 нм .

Ш см3 лз ао ба 60 изо

Рис.3. Гель-хроматография культуральной жидкости А.п1со1;1апае.

анализа культуральной жидкости А.п1со1:1а11ае . Активный компонент выходит одним пиком, соответствующим молекулярной массе 18СЁ20 кДа. Другие высокомолекулярные компоненты в культуральной жидкости отсутствуют. Балластные примеси, содержащиеся в

культуральной жидкости, слабо пигментированы, имеют молекулярные массы о® 7 до 14' кДа и не содержат свободных сиаловых кислот. Следует отметить, что в результате аффинной-хроматограф фии культуральной жидкости эти примеси удаляются:: на рис.2 соответствующий пик оптической плотности при 280 нм отсутствует.

Исследование протеолитической активности культуральной жидкости А.п1со1;1апае показало отсутствие в ней кислых, нейтральных и щелочных протеиназ.

2. Свойства нейраминидазы А.пАсо^апае.

На рис.4 представлены результаты определения рБ-зависй-

За 100 %^активности принята активность фермента при рН 7,0.

■ З.П КО ТО 3.0

Рис.4. РН-зависимость активности нейраминидазы А.п1со1;1£шае.

мости активности нейраминидазы А. п!с окапав по отношению к ГШ. На кривой рН-зависимости наблюдается два оптимума активности - при рН 4,5 и 7,0. Такую зависимость можно объяснить наличием в субстрате сиаловых кислот с различными типами глико-зидных связей. Возможно, что при рН.4,5 преимущественно гидро-лизуется один тип связи, а при рН 7,0 та же нейраминидаза имеет максимальную скорость расщепления другого типа связи сиало-вой кислоты с молекулой МП. Возможно также, что подобная кривая рН-зависимости обусловлена конформационными изменениями молекулы фермента, что делает ее более или менее реакционно-способной. Надо отметить высокую устойчивость нативной структуры нейраминидазы А.п1со1;1апае - фермент сохраняет по крайней мере 40 % активности в.интервале рН от 3,5 до 8,5. Следует обратить внимание и на то, что один из оптимумов активности

- 1Z -

фермента приходится на нейтральную область рН, что дает возможность использовать фермент при физиологических значениях рН, например дою воздействия на плазму или форменные элементы крови.

Максимальная скорость гидролиза ГШ нейраминидазой а.п±-со-Ыапае наблюдалась при температуре 45°,• (рис.5). При изучении термостабильности фермента было отмечено, что он стабилен . при температуре до 45° (рис.6). Прогретый в течение 10 мин при

Рис.5. Температурная зависи- Рис.6. Термостабильность ней-

50° фермент терял 17 % своей активности, а нагревание до 55° в течение того же времени полностью инактивировало нейрамини-дазу. Инактивацией фермента можно объяснить резкое снижение скорости гидролиза субстрата при температуре выше 45°.

Б ходе эксперимента были получены данные, свидетельствующие о возможном присутствии в субстрате нескольких типов связей сиаловых кислот, и, следовательно, о наличии нескольких типов фермент-субстратного взаимодействия. Поэтому константу Михаэлиса (К^) и максимальную скорость реакции (vmax) определяли при двух значениях рН, соответствующих оптимальным (рис.7). Степень сродства фермента к субстрату оказалась одинаковой для обоих значений рН и равной 0,32 мМ связанной NANA

t;c

мость активности фермента. За 100 % активности принята активность нейраминида-зы при 45°.

рашнидазы А.п1со-Ыа-пае . За 100 % активности принята активность фермента, инкубированного при 20°.

мММАЫА мин ИГ Б6ЛКО

1 - для рН 4,5

2 ~ для рН 7,0

аг. а. а а.б а.а Рис.7. Определение константы Михаэлиоа и максимально^ скорос-

ти реакции при гидролизе ГШ.

что свидетельствует о сохранении конформации центра связывания фермента при различных рН. Вероятно, связывание осуществляется не по ион-ионному механизму, а по гидрофобному или аффинному механизмам. Максимальная скорость гидролиза ГМП при рН 4,5 и 7,0 различна и составляет 0,371 и 0,134 мМ/мин*мг белка соответственно. Это свидетельствует о зависимости каталити- • ческих свойств активного центра фермента от рН, т.е. о наличии в активном центре нейрамишщазы А.п±со1;1апае ионогенных групп, что характерно и для других гидролитических ферментов (М.Диксон, Э.Уэбб, 1982).

Для проверки предположения о наличии в ГШ нескольких типов связей сиаяовых.кислот, которые расщепляются ферментом при разных значениях рН, было изучено влияние рН на ферментативный гидролиз другого гликопротеина - фетуина. В фетуине сиа-ловые кислоты присоединены к углеводным цепочкам оС 2-3 связями. Характер кривой рН-зависимости активности фермента при гидролизе фетуина оказался аналогичным характеру кривой для ГШ. Два пика активности фермента наблюдались при рН 4,5 и 7,0. Константы Михаэлиса для обоих значений рН одинаковы и равны 0,42 мМ связанной мана „ Максимальные скорости реакции, как. и при гидролизе ГШ, различаются для двух значений рН: для рН 4,5 она равна 0,154 мЭД/мин'мг белка, а для рН 7,0 - 0,091 ш/ мин'мг белка. Следовательно, сложный характер рН-зависимости

— хч —

активности фермента не является результатом расщепления ней-раминидазой различных типов связей сиаловых кислот, а связан со структурными изменениями: молекулы фермента при различных рШ

Щш исследовании! активности нейраминидазы А.п1со1;1апае по отношению к рецепторам эритроцитов в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) эталоном для сравнения явилась, нейра-минидаза нехолерных вибрионов. Минимальная концентрация ферментного белка, при. которой гемагглютинация не наблюдалась, составляет 0,24 мкг/шг дом нейраминидазы А.п1сог±апае и 0,19 мкг/мл.дои нейраминидазы нехолерных вибрионов.,, что соответствует Г,Г9ТсН и 1.40-1СГ4. единицам нейраминидазной активности -В лунке. Сводные, данные по. специфичности действия обоих нейраминидаз приведены в табл.2.

............_ .... -Таблица 2

Сравнительная характеристика: свойств нейраминидазы А.п1со1;1ате и нехолерных вибрионов

Фермент Молекулярная масса» кДа Субстрат рн V мМ ^тах» мМ/мин^мг белка йнгибирую-щая активность в РГП ед

А.п1со- 180 1МП 7,0 0,32 0,134 _

ЗДалае фкпуин эритроциты 7,0 7,0 0,42 0,091 1Д9ЧСГ4

нехолер- 90 МП 5,5 0,83 0,026 -

ных виб- эритро-

рионов циты 7,0 - - 1,40'КГ4

При исследовании влияния минеральных ионов на активность нейраминидазы- А.п1соНапае обнаружено, что ионы кобальта, кадмия, цинка, магния усиливают ферментативную активность по отношению к ШГ. Ионы кальция, марганца, аммония, натрия, суль-

фаг- и хлорид-'ионы влияния на активность фермента на; оказывают. Ионы двухвалентного железа в концентрации I мМ ингибиру-ют активность нейрашнидазы на 30 %, а в концентрации 10 мМ -полностью ингибируют ее. Небольшое ингибирование.нейраминидф-зы А.п1со1;1апае в присутствии ЭДТА объясняется связывание» следовых количеств активирующих ионов, возможно, присутствующих в реакционной смеси.

3. Иммунологические исследования нейракннндазы.

Введение кроликам нейраминвдаз вызвало образование в крсь-ви антител с титром в РСК 1:800. Для получения антител к ней-раминидазе А.п1со1;1апае пришлось увеличить концентра]!щю антигена. Реакция преципитации; была положительной только с сыворотками против нейраминидазы нехолерных вибрионов с гомологичным антигеном.. Перекрестных реакций с гетерологичннм антигеном ни в реакции преципитации, ни в РСК обнаружено не было. Эти результаты свидетельствуют об отсутствии антигенного сходства нейрашнидаз двух продуцентов.

В состав сыворотки крови входят различные сиалосодержа- • щие компоненты, которые являются субстратом для нейраминидазы. Действие нейрашнидаз обоих продуцентов на нормальные в иммунные- сыворотки представлены в табл. 3. Оба фермента отщепляют сиаловые кислоты от компонентов нормальной сыворотки. Антитела, содержащиеся в иммунной сыворотке-, в значительной мере защищают сыворотку от воздействия гомологичного фериеята. Гетерологичный фермент действует на.иммунную сыворотку в большей степени, чем на нормальную, что, возможно, связано с повышенным- содержанием сиалосодержащих компонентов в иммунной сыворотке, (например, иммуноглобулинов).

Специфические антитела снижают активность гомологичного фермента не только в присутствии сыворотки, взятой в качества субстрата, но и в отношении других сиалосодержащих веществ. В присутствии иммунной сыворотки способность гомологичной нейраминидазы катализировать гидролиз ГМП значительно снижается (табл.4)..При этом, активность гетерологичного фермента; не подавляется, а введение в реакционную смесь как гетерологичной. иммунной, так и нормальной сыворотки, повышает количество от-

Таблица Б

Гидролиз сиалосодержащих компонентов нормальных и специфических иммунных сывороток нейраминидазаш A.nicotianae и нехолерных вибрионов

.Количество отцеп-. Изменение активности в

Сыворотка 'ленной nana * присутствии иммунной сы-^шшри^ка. .ленной нала , . воротки относительно

мкг/мл . нормальной, %

Нейраминшгаза нехолерных вибрионов

нормальная 42,2±5,8 100 иммунная против фермента нехолерных вибрионов 2,3±1,8 5,5 иммунная против фермента A.nicotianae 68,0*6,6 161

Нейраминидаза А.п1ср-Ь1апае

нормальная 28,2±3,3 100 иммунная против фермента нехолер- .

ных вибрионов 35,2±4,4 125 иммунная против фермента А.п1-

cotianae 9,4^1,4 33

щешгенной КАПА , по-видимому,, за счет повышения концентрации сиалосодержапщх компонентов в системе.

При фракционировании иммунных и нормальных сывороток методом гель-фильтрации получили 3 фракции белков (рис.8). Фракции собирали отдельно, лиофильно высушивали, рехроматографиро-вали в тех же условиях и вновь высушивали. Фракция Р1 содержит 193 -^-глобулины, фракция Р2 - 7 Б-^-глобулины, а РЗ -

Таблица 4

Влияние иммунных и нормальных сывороток- наг активность нейраминидазы по отношению к Ш1

к отшйп- Изменение активности

^присутствии сыворот-

Сыворотка

Нейраминидаза нехолерных вибрионов

без сыворотки нормальная иммунная против фермента нехолерных вибрионов иммунная против фермента А.па-со-^апае

4СёЗ,0 59±5,е

8*4±1,4

11428,0

100 145

21

282

Нейраминидаза А.пз.со1:1апае

без сыворотки нормальная иммунная против фермента нехолерных вибрионов иммунная против фермента А.п1-

со1;1апае

33±3,5 40±2.8

63^4,9

9,8±1,2

100 121

193

30

альбумины (риЬагадаа а., ТзисЫуа J., 1969). Антитела к гомологичной нейраминидазе обнаружены только во фракции Р2.

Для определения влияния белковых фракций сыворотки на нейраминидазную активность, их подвергали диализу против физиологического раствора. Концентрацию белка в диализатах дозволили до одинаковой величины, равной концентрации белка в наиболее разбавленной фракции. Для фракции Р1 она составила

е&50 з.о

2.0 • 1.0 •

10 за 50 7а Объем элюциц

Рис.8. Ге ль-фильграция иммунной сыворотки против нейрамини-дазы А.п3.со-11апае «, Аналогичные кривые получены при гель-фильтрации нормальной сыворотки и сыворотки протиз нейраминидазы нехолерных вибрионов.

4 ыг/мл, а для., фракций Р2 и РЗ - 14 мг/мл. Изменение ферментативной активности нейраминидазы под действием фракций иммунных сывороток определяли по. отношению к. активности в присутствии соответствующей фракции нормальной сыворотки (табл.5).

Таблица 5'

Влияние . фракций иммунных и нормальных сывороток на активность нейраминидазы А,п1со1;1апае и нехоле.рных вибрионов по отношению к ГМП

Сыворотка ' Фракция Количество от- Изменение активности щеплешгой мама в присутствии фракций мкг/шт иммунных сывороток, %

I 2 3 4

Нейраминидаза нехолерных вибрионов

нормальная ЕГ Р2 РЗ 44,5±3,3 42,С£3,3 40,0±3,1 100 100 100 .

иммунная против фермента нехолер- . Р1 Р2 47±3,5 21±1,9 105 50

I 2 3 4

ных вибрионов РЗ ЗТ±ЗД 94

иммунная против Р1 44„5±3,7 100

фермента А.п1- Р2 52±4,2 122

со1;1апае РЗ 42^3,3 106

Нейраминидаза А.п1со1;1апае

нормальная Р1 42±3,3 100

Р2 47±4,4 100

РЗ 47±4,2 100

иммунная против Р1 42±2,8 100

фермента нехолер- Р2 47±3,7 100

ных вибрионов РЗ 4'7±4,2 100

иммунная против ,Р1 42-2,8 100

фермента А.Моог!- Р2 23±1,9 50

апае РЗ 47±4,2 100

Как видно из таблицы, антитела, ингибирующие активность гомологичных нейраминидаз, находятся во фракции 7 б-¿'-глобулинов, в то время как две другие фракции заметного влияния на каталитическую способность ферментов не оказывают. Таким образом, иммунологическими методами доказано отсутствие антигенного родства, и, следовательно, структурного сходства молекул нейраминидазы А.п1сог1апае и нехолерных вибрионов. Антитела к ферментам в значительной мере ингибируют активность гомологичного фермента, не оказывая влияния на гетерологич-ньй фермент. Отмечена меньшая иммуногенность нейраминидазы А.п3.со1;1апае По сравнению с нейраминидазой нехолерных вибрионов, что имеет большое.значение при использовании ферментов в терапевтических целях.

ВЫВОДЫ

1. Впервые выделена нейраминидаза (КФ 3.2.1.18) непатогенного продуцента Аг*ЬгоЪас1;ег пхсо^аиае с помощью аффинной хроматографии на композиционном сорбенте Стропане, представляющем собой иммобилизованную в пористую полимерную матрицу строму эритроцитов.

2. Показано, что максимальная емкость сорбента по отношению к нейраминидазе наблюдается при рН сорбции 4,7.

3. Молекулярная масса нейраминидазы А.п1с<Шапае составляет 180*20 кДа. Фермент активен в области значений рН от 3,5-до 8,5. Активность фермента активируется ионами Со , с а. ,

шгибируется ионами Уе 2+, додецилсульфатом натрия.

4. Определены кинетические параметры процессов ферментативного гидролиза ГМП и фетуина. Константы Михаэлиса для значений рН 4,5 и 7,0 оказались одинаковыми и.составляли 0,32 мМ связанной нейраминовой кислоты для ГШ и 0,42 мМ связанной нейрами-новой кислоты для фетуина. Максимальные скорости гидролиза для этих значений рН оказались разными - при рН 4,5 она равна 0,371 мОДДшн'мг белка для ГМП и 0,Г54 мЭД/мин'мг белка для фетуина? при рН 7,0 максимальная скорость реакции составляет 0,Г34 мВД/мин'мг ¿елка для ГМП и 0,091 мЩ/мин*мг белка для фетуина.

5. Специфичность нейраминидазы А.Шсо1;1апае по отношению к рецепторам донорских эритроцитов сравнима со специфичностью коммерческое .препарата нейраминидазы нехолерных вибрионов: инги-бирующая активность в реакции торможения гемагглютинации составляет ГДЭЧСГ^Вд Для нейраминидазы А.п1со1;1апае и 1,40'М"4 Ец для нейраминидазы нехолерных вибрионов.

6. Перекрестные серологические реакции между нейраминидазами А.п1со1;1апае и нехолерных вибрионов и соответствующими иммунными сыворотками не наблюдаются, что позволяет сделать вывод об отсутствии антигенного сходства между молекулами ферментов обоих продуцентов.

7. Антитела к. нейраминидазам двух продуцентов ингибируют активность гомологичного фермента по отношению к сывороточным гли-копротеинам и ГМП и не оказывают влияния на активность гетеро-

логичного фермента. Ингибирущие антитела находятся во фракции сыворотки, содержащей i S-^-глобулины.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Котляр Т.В., Шатаева Л.К., Заикина H.A., Чернова И.А., Аб-рашев И.Р. Нейраминидаза непатогенных микроорганизмов рода Arthrobacter ' .// Прикл. биохимия и микробиол. - 1989. - Т.ХХУ, вып. 4. - С.467-472.

2. Котляр Т.В., Чернова И.А., Шатаева Л.К. Сравнение биохимических характеристик микробных нейраминидаз. //Прикл. биохимия и микробиол. - 1989. - Т.ХХУ, вып. 6. - С.757-761.

3. Чернова И.А., Котляр Т.В., Таранюк З.Е., Самсонов Т.В. Аффинная хроматография микробных нейраминидаз.// Тез. докл.

I Всес. симп. по препаративной хроматографии физиологически активных веществ на полимерных сорбентах. - Л.: Наука, 1988. -С.16.

4. Т.В.Котляр. Нейраминидаза непатогенных микроорганизмов рода Артробактер.//Тез. докл. конф. молодых ученых "Творчество молодых - научно-техническому прогрессу" - Л., 1988. - С.31.