Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и очистка биологически активных веществ циторецепторной афиинной хроматографией

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и очистка биологически активных веществ циторецепторной афиинной хроматографией"

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи.

УДК 577.1.08

СЕРГЕЕВ Виктор Владимирович

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ ЦИТОРЕЦЕПТОРНОЙ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

03.00.04. — Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1991

Работа гыполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Академии наук СССР.

Научный руководитель: доктор биологических наук Пинаев Г. П.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Беленький Б. Г.;

кандидат биологических наук Нескоромный А. Г.

Ведущее учреждение: Всесоюзный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов Минмедпрома СССР.

Защита состоится «..Ж.».....аЩ^М-...................... 1991 г.

в ...Ш............... часов на заседании специализированного совета

Д063.57.^9 по присуждению ученой степени дхра био-

логических наук в Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная, 7/9, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан «.(5........>>...М031ш?<&........................ 1991 г.

Ученый секретарь //У

специализированного совета ^Ц^ —£ [{

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разработка методов выделения и очистки биологически активных веществ имеет больше значение для решения широкого круга фундаментальных н прикладных проблем современной биохимии. Так, получение высокоочигзенных препаратов является необходимой начальной стадией исследований биологически активных соединений /Ланчини Д., 1985/. При промышеннса выпуске биотехнологических продуктов затраты на этапе выделения и очистки составляют около 802 обдай стоимости процесса их получения, включая первоначальные генноин-лвнерные операции с организмом-продуцентом /РЬак ,1., 1986/. Наряду с фиаито-химическими методами разделения для ре гения данного круга задач широко используется аффинная хроштогра-фия, осиовыващаяся на стереоспещфгчных обратимых взаимодействиях типа "фермент-субстрат", "антиген-антитело", "гормон-рецептор". Однако, необходимость подбора специфичных гигантов в зависишстн от природы выделяемого вещества супэст-венно ограничивает область применения аффинной хроматографии. Кроет того, в ряда случаев адекватный выбор лиганда не представляется возыыныы, в особенности, на начальных стадиях изучения биологически активных составлящах поликомпонентных смесей. Швду тем, для большинства биоэффекторов (регуляторов пролиферации, лимфокинов, токсинов, антител, лектинов и т. д.) показано или является весьма вероятнш наличие рецепторов на поверхности клеток, чувствительных к действш этих веществ /Езепчук С. Е , 1086; Иэдуницяя Е Е , 1980; Голенищев Е П., 1988/. Как следствие, представляется возможной разработка варианта аффинной хрошхографин, использующего в качестве "лнгандов" рецепторы иммобилизованных клеток.

Цель и задачи исследования. Цельо работы была разработка штодики получения щггорецепторных сорбентов на полимерном (полиамидном) матриксе и апробация их эффективности для выделения и очистки биологически активных веществ различных классов. Исходя из поставленной цели, ревагись следующие задачи:

- г -

1. разработка методики количественного определения связывания пронаркотических и эукариотнческих клеток на полваыидном кзтриксе;

2. анализ отдельных этапов получения циторецепторнш сорбентов с цэяью повышения содержания клеток в юа-нобилнзатах;

3. проверка пригодности полученных сорбентов для препаративного выделения лектинов;

4. апробирование возиопмсти применения циторецепторной аффинной хроштографаи для очистки биологически активных пептидов на пришре фактора антибактериального действия препаратов интерферона;

5. оптимизация и масштабирование процесса получения фактора антибактериального действия.

Научная новизна. В результате проведенных исследований показана возможность получения циторецепторных сорбентов для сф&ошой хроматографии на основе полиамидных ыатриксов.

Разработана методика количественного определения связывания прокариотических и эукариотнческих клеток на полиамидных штриксах. Проведена оптимизация параметров процессов активации штрнкса и связывания с ним клеток. При этом обна-рухэно, что шксишльная клеточная емкость таюбилизатов достигается при обработке предварительно гидролизованного носителя 12,52 глут&ровым альдегидом при рН - 7,4 около 18 часов к послёдувдэй инкубации активированного штрикса с цветочной суспензией в течение 3-5 часов.

Получен ряд циторецепторных сорбентов на основе полиа-ьедаюго иатрикса, содержащда различные бактериальные и зука-риотические клетки. Проведена эксперименты по выделения и очистке циторецепторной хрошгографией ряда лектинов. Шлу-чзпа вдаокоочиданные препараты фатогеьагглэтинина фасоли, лектина картофеля и лектина-зародызей пшницы. Впервые обнаружены и выделены два полипептида, обладаязих геиагглюгини-рувдей активностью и являющихся, по-видимоыу, изофорквши лектина клубней картофеля.

Впервые показана возмояность применения циторецепторной хроматографии для выделения и очистки пептидов среднего молекулярного веса (шнее 10 к® на примере фактора антибакте-

ркального действия препаратов интерферона. Прозэдекы эксперименты по наспгабкрозатш процесса и увззтавЕэ опэрзЕсся-ной стабильности сорбента.

Разработана методики определения в Еогум2ирэвариг,аг& бактзрностатичесгого действия н прэдзгсктрофоретичэского концентряровзаия препаратов пептидов &дсорбщ»а ка геле гяд-роксвда аташкя.

Практическая ценность. Результаты реЗота представляет интерес при выделении и очистке гарокэго круга бггогогячески активных веп^ста как в лабораторной,тач и в проигзгэнной практике. Оятиззация парагззтров процессов сктиззцяа погна-цидного катржса и связывания с ши клеток обесязчквазт по-лучевие сорбентов с вьеокой удельной нагрузкой и скецйфз-ческой екюстьа Государственник Комитетом СССР по делай изобретения и открытий прэдлогеннкЗ мэтод получэша щяоре-цепторных сорбентов признан изобретением (авторское свидетельство К 1317933). /¡етнвированныа по оптгагззнрованЕоЯ огаме подшшидннЯ ыатрккс шеэт быть кспояьзовая дгл кшэбажа-эадки субклеточных й>акциЯ, обладает:!* ферьявтаигвной еюпз-ностьа В частности, кшгобшкзоэакньэ па водяаддвом ют-ркксе препараты ¡йЕкросоиааной фракцгш ютут пришшгтася дет определения ыутагенвоя азглакостн оозгоесках соедкаенна (авторское свидетельство н 1268823). Результаты кеслэдашнй по ввделегою н очистке лвктннов н фгхтора агшзбенгэрзшйкого действия препаратов кнтер&зрона шгут быть швдьзсвз&ц дач производства высокоочвдшшх препаратов.

Апробация работы. Результаты, пзлзданшэ а диссертационной работе, докладывались ка псоле-сеаинзре "Егмобягяовал-нда клетки" (Июлю, 1985), всесовэнои сеютарэ "Кэтодн шш-равленного скрининга антибиотиков и другет бволзтгэскн активных ввезем" (Москва, 1086), ззеодаиз свкдаг генетических аспектов проблема "Человек и биосфера" МШС ГННГ (Ордяоникидзе, 1986), региональной ковфэренщш "Естественнш науки - здравоохранение (Пермь, 1888).

Публикация, ш теш джсерташш оаубшаошшо 8 работ, в

том чисдр •> апторпюгг ови/рт'лмп'па г*Т!Р ка кзобрэтетеэ.

Обьем и структура работа Диссертация состоит из введения, 7 глав, выводов, списка литературы и щшюхания. Штернах» изложены ва 162 страницах машинописного текста, вкличая 4 таблицы и 26 рисунков. Список литературы содержит 277 наименований работ: 103 ва русском и 174 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЕ

I. Материалы и методы исследования.

1.1. Реактивы.

В качестве полиамидного матрикса для получения циторецэ-пторных сорбентов использовали носитель для жидкостной колоночной хроматографии "Polyamid Wbelm" ("Woe Im"). Исходными реактивами для приготовления активирующей смеси служили 25Z водные растворы глутарового альдегида классификации чистоты "хч" (Реанал) или "anal, grade" ("Iferck").

1.2. Культивирование микроорганизмов и подготовка биомассы для иммобилизации.

Бактериальную биомассу выращивали на мясо-пептонном бульоне при непрерывной аэрации и температуре +37°С до начала стационарной фазы роста. В ряде случаев использовали коммерчески доступные препараты микробных клеток ("Колибакте-рин" и "Белок А-содержаший реагент"). Биомассу, полученную культивированием или регидратацией лиофилизированных коммерческих препаратов, осаждали центрифугированием и пятикратно промывали забуференным физиологическим раствором.

1.а Получение зукариотических клеток.

Использовали в работе клетки перевиваемых линий Л-41 (клоновый вариант культуры J-96, полученной из костного шаге больного лейковом) и СШВ (перевиваемая линия клеток почка вибриона свиньи). Клетки выращивали на среде 199 иди ЕРШ-1640 с добавлением 10Х сыворотки крупного рогатого скота и Ю жг/мл гентамицява в стеклянных матрацах с пересевом через 6 суток.

1,4. Определение гемагглетинирупявй активности лектинов.

Тестирование гемагглюгинирупцей активности подученных препаратов лектинов проводили по методике, предложенной В. к Лхтиным /1988/.

- б -

1.5. Злегстрсфоретичэскнй asassa препаратов.

/вахиэ '-гкогогы прэпаретоз гэкгкнов и опредегзнкэ шгэку-агрзых isec аз коигояентов проводаиш агектрофорезоа в одяо-родаоа пошЕкрнлашдвсм гехэ (ПААГ) со ступенчатой Суфэрпсй сзотеиой по ^тоду Laarall U.K. /1970/. Препараты,получэпккэ сйгапоЗ rpoir»orp2feie3, прэдгарягелызо обессоливали и кон-цгптрирогааа осаддением тряжоруксусноЯ шхготсй по штодш« /Coln?n А., 1979/. Ззегагрсфорээ прэперотов фактора анткбак-гврвваьного лэйстеия, поаучэпзшс аф&Ешой хроиатогрг!;лс-й, прозодаги по штодзете /Srank R. Т., 1971/ в бхскз 1Z.5Z ШАГ, сол-ргалвго 8if кэчвтлту м 1% додецзгсульфат натрия. Гели о'с-рззшагя сероброы по ветоду /Hsukeshoven J., 1985/, msper-ннрw шеспеш а 0,1% расшэрэ гзотнокяслэго серебра э тсте-тз 20- 40 ussys и проявляя ss?su бежозш зоны 0,02% раствором фориальдегида за 3% бпсгрСозате натрет, воя ocsstäsei ссггЗнге-эн §аризра

1.5. Статсстггсэекая обргботка результатов.

Статяичесгчга оЗргбот;^ результатов прозогош! cl'ranpn-илткя бхгаэтричгся&л лэтодаьгн /йшш Г. ö., "1980/ с юноа-гогзгхзд t-s^praepsn Сткязнта и F-ргозрэдэгзкхз (¡фзтерлЗ ffisspa). йшзга рзгрссскл расщш®ш1 по 1©той7 ншшзньпя ;их?лрсггоз.

И. Гезуяьтаты и оссузденкэ.

1. Разработка штода {кшргествешзго контроля шаюбзяя-еащш кгэток ка яогналадном штриясз.

Для сталд&ртггецжп условий игюрвгнЗ бнга ргзра&геена схема ;-'iccn8p5iTj£HT02, оСоспачхгазсзя, по иашиу шеикэ, оцзику тшгаества иимсбкгивогавзга кгзток. С втой цэгьв определят разность ыеяду юхвкэстзом ödoisccu, ЕЕЗсеиной sa инкуСецет с скти2кроваа:-:ку гатрт«ом,и кожсчэствоа кесззззлгзгося датори-ага, удагэшгого при врогазазна сорбэета Еэг-гэрял! схэдашзю пщкэдэтры: щ:сло кгэток (EDS Сопераа) п сптячэскув плоткость грючных глдрояшагсв ахнхсот исходеой клеточной суспензии п прозагзочного рзстгора при дашея sasi 280, 260 и 23S км Содержание эукарнотачесгап кгэтоя определяли подсвзтои в каггзрэ Горяева, микрооргавкзвов - :з»эрэшгзн мутности сусяензгш гл фотоэлектроколорнмэтрв с зкетрзлоляцкеа по предварительно по-

егрсс'эша ;саа:Зрогоч:агы вависимэоглм ьздгу мутностью, кмиче-cseou юаонйвобраззпззйх единиц и суш* весом.

2. Оакахзацкя отдельных этапов синтава цигорецапторкш сор&затов.

Б первой серии 8шюришв20в Езучаазсь влияние продошг-*о»шяя ашшаздн полиашдаого ттрихса на содорзшке юзток s пггзз&шзаге. Вэвесху похие^здного катрктоа (разыэр чавтац 1С0-ЕЭ0 isaö суспендировали в воде и инкубировали в течэнке SO-ÄO ша яри тзкперагуре 3G-4Q°c. Граауаи отделяла декавтаии-ci, которую новгоряли 4-Б раз да удалэшш мелких частщ, Частичный ГЕДГ-ОЛ523 проводили по ызтодике /Sundaram Р. V., 1S77 /, инкубируя навеску полиамида в ЗМ KCl при тешерагуре Sü'C в

2 часов. Шсигель о?делплн фиьтрованием и промывали на Ö125SJ» фосфзтка«! буфере«, рК - 7,4. ЕаВ8СКИ по 2 Г. ЧЗУГИЧЕО

гайрэдиаоваввого ш&ркзда (з контрольной вариакте - не обработанного соляной кислотой) ннкубироёалй со 100 t¿3 12,5% pscteo-ра глутарового альдегида ка 0,02Ы фосфэгпоы буфера, pH - 7,4 в гочэнка ьарьнрузквго врешнного интервала - 1,2,4,6,18 кая 24 ¿га АгагкзкроваЕнай ыатрккс отделяли фшатрозашгам, продазали ссЗуфэревнш Фиэкологкчеекиа растворсц (SffP), pH - 7,2,и обге-япгяхв с Б см3 суспеигиа эритроцитов барана ва S3P, содэрзведзй Б 2 Ю10 моте:; з см3 или, в другом варианте, с 5 cu3 бактерн-азкхй взвеси, со£зргзг®й 3,3 х 1Ö10 клеток Е.coli ка сл3 (сугей вес - 25,6 иг). Концентрация суспензия и oön^e волнчэ-сюо клеток, июсяиое ка шелэбилизацхю. были подобраны в пред-гарртехьвш зкеп-эрггыоктах тагом образои, чтобы при уахскиальной еыгссги мзтркжз связывалось не более SOZ внесенного количества и, как дотаю,скорость реакции связывания и енкость сорбента ка лшдшзрогвгшь концентрацией клеток. Активированный штрихе вккубировала с исходной каэточзой суспензией в течение 24 часов Ери постоашоу серэшгзшаови, после чего промывали на 8мльтре 100-кратка: объешь 0.1Ш НаС1 (по ВСЮ см3 ). Как следует из рсвулътатоа экспсрх-гитов, приведенных на Рис. 1, наблядазтея кхаокэнциалъкаа ааэисшость ешсостк ыатрикеа от продолжитель-ксета активацш с выгодой на плзто в интервале 6-18 часов. Кэ-сЗгодако отьзтитъ, 450 ваблюдаеша ваконокарность не зависела о? типа клеток.

Ркс. 1. БаЗЕСЙКОСТЬ СОДЭрЕЗНЕЗ кгэток В SESS5JiE©2I3 01 пралол.-гггзгьпосгн аеткващкз пазгвшдЕОГо L-arprrraa.

По оси абцисс - длявхьЕость аягввацаи в чэлгх.

Ш оси ординат - согерпзга'з кгзтсх са граты гааябжиюага.

Кризиэ 1 я 2 - (соогаететваяпо) ЕзгззЗилязецйз зрйгрмзэтоэ барана па upeesspnzez&ao гздрагкзованзои и необработанном иатрйясаг.

Kpxsis 3 и 4 - то га для Е.С011 nrczzi U-Щ

Во второй серки зксиаршхзнтоз г.ссго?оРЛ£ось ашпше на зффзктшюсгь иымобкдвецзи щхэдойззязгьЕСЙа кккубащи шст-вйрованвого катрнкеа с каэточвоа суспензий. Вэгеска поазазгд-иых гранул (по 2г.) подпэргаги частичному гегсяотюкдг г:®рогэу и активировали гяутароззни агьдзгадои в тзчзепз 20 часов по ш-взописанной иетодккэ. Поела оказания ш г^кьтр-з актзашроЕанккЗ ьатрккс объединяли с суспензией ерэтроцнтоз барана шя, в другой варианте, с суспензией кгэток Е.coll пгаггм Ц-17, а инкубировали при постоянном аеродэвдвзтгз в течении 1,3, Б, 18 ага 24 часов. Суспензия зритрощзтоз содержала 4 х Ю10 izzqtck на са3 ЗФР, на юагзбшжзацка вносили по 10 с«3. Походная сусвеквЕЗ Е. colt М-17 содержала 3,3 х 10 1овгаток ка см3 В®, на кааЗй-лизацио вносила по 8 си 3 (сухой вес внесенных кгзток - 40,9 i

«г). По окончания инкубации юлюбнгкзаты прогашала на &ш>трэ 100-кратным объеиэм 0,1511 NaCl. Результаты эксперта нтов приведены на Рис. 2. М&ксииалъиая кхэточтгая нагрузка нэтркяга

i-f s-tf

ч-еГ

S-k*

i-й*

I

t г s ч s б

a

Рис. 2. Зависимость содержанка юаток в иимпбкгиаатв от продолаштелъности контакта суспензии с акгивированнш матриксоы.

Do оси абцисс - длительность контакта в часах, to оси ординат - количество клеток на грагш юаюбилизата Кривая 1 - вавкошюсть для эритроцитов барана кривая 2 - то вэ для Е.coll шгаш ti-17.

дсстигалась при контакте с клеточной суспензией в течение 3-5 часов и не изменялась ори увеличении продолжительности инкубации. Таким образом, представляется оптимальным для иыобали-ездка клеток ва полиамидном матриксе с разгром частиц 100800 проводить актизацгао предварительно гидролизоваиного носителя 12,51 глутаровьм альдегидом при рЯ - 7,4 около 18 часов s связывание клеток инкубацией с клеточной суспензией в течэшю З-б часов.

3. фиьенанЕЭ циторецепторных полиамидных сорбентов для выделения аффинной хроматографией лектинов.

Были проведены аксоериданты по выделении и очистке фито-геиагглптиннна сеют фасоли (®"А). агглютинина аародывей пшеницы (АЗП) и клубней картофеля (ЛКК). В качестве "лигандов" для получения какого конкретного лектина в предварительных опытах отбирались клетки, в наибольшей степени агглютинируемые нативным пропаратом.

ФГА выделяли на сорбентах, содержащих клетки EL со]1

стаым М-17, фиксированные после иммобилизации 0,12 глутаро-вш альдегидом, а тага® эритроциты человека, обработанные 0,1% и 2,5% фиксатором. В экспериментах с сорбентон, содержащим иммобилизованные клетки Е. col1 достигалась кратность очистки 9 при выходе по активности 45%, однако аналитическим электрофорезом в 12,5% ПДАГ выявлялись минорные фракции, соответствующие белковым компонентам исходного препарата.

Очистка ФГА на зритроцитарных сорбентах, фиксированных 0,12 глутаровым альдегидом, обеспечивала увеличение удельной активности в 17 раз при выходе 20%. Однако фракции элката содержали значительное количество примесей, в том числе геш-глобин. Очевидно, что данный рэиш фиксации не обеспечивает операционной стабильности сорбентов,и при воздействии кислых элвектов происходит "подтекание" внутриклетчных компонентов. Как следствие, в дальнейших экспериментах по выделают и очистке лектинов не припаялись сорбенты, фиксировавши 0,1" глутаровым альдегидов Препараты ©ГА, полученные аффкяаоЯ хроматографией на сорбенте, содержащем эритроциты человека, подвергнутые более иэсткой фиксации , были гомогенны по данным электрофореза в 12,5% ПААГ. фи анализе в идентичных условиях коммерческих образцов фятогешгглэтннина производства фарм "Pharmacia" и "Serva" выявлялись «игарнкэ компоненты.

ЛКК выделяли аффинной хроматографией на сорбентах, содержащих эритроциты человека, фиксированные 2,52 глутаровш альдегидом, Е. col i итакм U-17 и Micrococcus lysodaícticos, обработанные 0,12 фиксатором, в опытах с цкторецепторяш сорбентом на основе E.coli достигалась очистка в 116 раз при выходе по активности 50%. фи использовании других лигандов были получены существенно худшие результаты. Так, в опытах с сорбентом на основе эритроцитов человека кратность увеличения удельной активности - 7,8 при выходе 3,62, а в экспериментах с М. lysodeictlcus очистка в 80 раз, выход 102.

йгожиданнье результаты была получены при элегегрсфоретн-ческом анализе активных фракций в 12,62 ПААГ. В некоторых фракциях выявляется компонента с молекулярной массой 40 кД, идентичная преобладавшему в грубом экстракте. Шобходиш отметить, что 40 кД является общепринятой на сегодняшний

день оценкой шссы субъедншзд югекулы лзктгаа каряофэла /Casalonjua С., 1S85; Matsusoto J., 1983 /. Однако, в раде фракций, обладааслх равнш уровнем гегагиигикхрусэй аганз-ности, данная компонента нэ обпаруззтается, ко при етои ео всех анавэируешх образцах присутствуют два иогшешгкда о шлекулярзой шшсой, блзэкой к 15 кД. Взличне в препарате данных полнпэптидов не зависит от использованного лиганда и от катода получения грубого экстракта Присутствие в активных фракциях дополнительной полосы с шлэкулярзой массой около 15 кД при выделении ЛК5 сорбцией на человеческих эрет-рощэаг группы В, фжсироваиных глутаровги альдегвдоа, описано в работе /Kllpatrick D., 1980 /. Шло тагаз показано, что зтот факт еэ объясняется "подтеканием" эритроцотаршгх белков /Kilpatrik D., 1980 /. В исследовании, посвяЕрншх получении ЛПК, в том числе и афишной хроиатогрзфюй на ю-лекулярных лигаадах, пептидииэ компоненты в акгквкых фракция: ке обнаруживались /Delmotto F., 1975, Matsurato J., 1983/. Шведишиу, 1э53»о предпсшззвить, что пря хроштографки на ца-торопторных советах, & силу их более широкой епзцафж-костк, наряду с известной иэофорйой легегииа »вделается sao-форш, утрачиваэкгз при других вариантах очистки.

АЗП выделяли ка сорбентах, содергада каазбшаэоиавЕыз эритроциты барана, человека и кролика, фиксированные Z.BZ глутаровьы альдегидом, а таказ клетки Ii lysodeiotious, $ш«сироЕаннаэ 0,1% глутаровыа альдегидом. В опытам с ксполь-зованкеы в качестве лнгандов эритроцитов человека и барана наблхдался выход по активности на уровне Z4Z. Однако, при электрофоретическом анализе активных фракций было обнаружено наличие белковых пркшсей, идентичных компонентам грубого гкстракта. Препараты АЗП, не содержасяе белковых примесей, были получены хроматографией на сорбенте с имиобилизоваинкьш клетками U. lysodelcticus. Выход АЗП составил 30%, кратность очистки - 460. Паяучекныэ даннш представляется удовлетворительными по сравнению с описанными в литературе. Так,по даннш /Allen А. К. ,1973/ очистка переосаждениеы сульфатом ашо-кия,ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-целлюлозе, дважды на SE-сефадексе и на QAE-сефадексе достигалась кратность 400 при выходе ИХ.

Зге невогазованнда в вясперзизвтах с гэктинаш цчтсрецэп-торныз ссрбс-сти йвдервягзли хранэнвз при тоияературе +4° С в пргсутстзаи 0,02% азида натрия в те«гэягз 6 ¡.зсяцев бе в

ССрбЦШННЫХ 7,ар£г?горКСТ2Я?. ОяерЗЦПОЙЕЗЗ СТЗОИЕЬСОСТЬ

сорОэнтоз обеспечивала прссэдзшгэ 10 цшсгоз хрокзтогрз&чн баз сшвззюш сЗфтнсстн и спецн&гегскоЗ емюсти.

Шсдатря на то, что циторецепторная хроиатографи леети-коэ сарогсо представлена а .пятеретуре, пр¡ганение сорбентов, бактериальнш клетки, пргяткческл не опгсеео. Ш вггему гаеккв, получспке цктсрецзпторшя бгктертэдшх сорбентов обеспечивает рад технологических прэкыугэстз по сраз-венгао с зукаряотическиии аналогами. 3 частности, упрогээтся наработка биомассы, сшпжется аа счет стабягшпрус^го действия клеточной стеши цнтолиэ га стадия изгаобигззизга. На: следствие, сорбэптн, содергада бактеркалькнэ кязткя, представзшэтся более перспективная дгз про&шзевзого праа-

ПеННЯ.

•4. ЦрЕУвЕЭВКЭ цгггорецзптсрЕых сорбзвтоз для выявления сффзваой хрскз?огра$гэй фактора езгоЗахтеркгсмюго действия прзЕзрагоз кнтерфэрона

АяткСектерпальпея агтаздость некоторых партий штвр^в-рсза бкга обпарутзза в ходе работ по соэдаагэ щхясаршга-ческоа тестсгютекы для определения склгкюстн шзтер^роаа /Шчеркияа С. д., 1979/. Фкеэаво, что аютшоеть сбуозжгэга содерлзякгм в препаратах гзтерфэрояа пр:ЕггсяоЭ пэптпдкоЭ йсшюнеоти с шхзкусяряой шссой сю» Б кд. фазшшэ цзто-рекепторной хрокзтогреЯаз для вцаелевия и очкстка фзктора ентнбакг-зриального действия (ФАД) представляет ссобаЗ юте-рес с тс-ст зрения проверки оффеетизвостя кэтодз.

Для сададвЕня а очесткя ФДД бвга полусны щзторецэгэор-шзэ сорбенты, содергагзя пмюбилпзовааныз кеэткн (вегоа 51арЬу1сооосиз ер1йэпп1с11з, видаазчузстэателъного к баэорп-остатячэсиому и бактврицядпоыу действии пептида.

В первых сериях экспериментов использовались Сорбонну, фиксированные после шззобияквацни О,IX глутароЕК» агэяегэ-дсм. Связывалось на колонта скола 97Х йктивкостя, достяпитгс^

очистка в 400 раз . Хранэние сорбентов при температуре +4°С а присутствии 0,02% азида натрия в течение 6 месяцев не приводило к изменению сорбционных характеристик. Однако,при повторной использовании порции сорбента наблюдалось сшшение адсорбции ФАД на колонке до уровня 60-70% к третьему циклу хроматографии и перераспределение активности меаду ступенями елзцки. Так как хрошгофокусироЕагше на ПБИ 94, колоночная хроматография на СМ-сефадексе С-25 и реакция рН-эависишго связывания на SP-сефадексе С-25 показал!! гомогенность ФАЛ по нзоэлектрической точке, был сделан вывод о единственности носителя данного вида активности. Как следствие, выдаприве-декньге результаты объясняются, по-вядешоку, сниманием аффинитета рецепторов в результате частичной инактивации, вменение рекиш элюцги на элацнэ градиентоы ионной силы без изменения кислотности среды не сникало скорость деградации сорбента Удлинение зреыэнк фжеацик такха не приводило к увеличении операционной стабильности.

Удовлетворительные результаты были получены при дополнительной обработке циторецепторных сорбентов 2,5% глутаровым альдегидом в течение часа йиксироваиннз таким образом сорбенты оказались стабильны на протяжении 22 циклов хроматографии. Ери этом адсорбционная емкость по сравнен:® с ранее использованными сорбентам не изменилась.

Полученные результаты позволили перейти к экспериментам по масштабированию процесса. Сорбент в объеме 70 см3 , содер-жагай 20 иг сухого веса (4 х 1011 бактериальных клеток) на грзш! носителя, пошщали в колонку 2,7 х 17 см. Иерпарат интерферона в объеш 50 ем3 наносили на колонку со скоростью 2 сьР/мкя с рециркуляцией в течение часа Нз поеледуияих стадиях аффинной хроматографии скорость подачи растворов на колото' увеличивали до 180 см3/час. Результаты хроматографии приведены на рис.3. Интересно, что масштабирование процесса не только не привело к ухудшению качественных параметров, но и дало увеличение кратности очистки до 1000-1500. Выход при этоы снизился до уровня 80-90%. Кабяюдаемыэ изменения качественных параметров могут, по-видимому, объясняться увеличением количества лиганда, вступавдэго в контакт с САД при его прохождении через колонку в процессе элюции. Вследствие этого дости-

Рис. а Аффинная хроматография ФАД в ыасагабированЕОи варианте.

По оси абцисс - обгем злтата, си3. to оси ординат: слева - оптическая плотность (А |во). справа - антибактериальная активность (log ^ разведенка). 1 - элицня 0,1 И фосфат-цкгратнш* буфером, рВ - 2,5, г - то т + 1Ы МаС1.

Кривая А - Agoo , Б - антибактериальная активность агната.

гается лучшее отделение белковых примесей, но возрастает доля неэлюируемого фактора. Аналогичные со дохангэку эффекты описаны при выделении белков на шшуносорбентах /К&асттнсен Г., 1979/.

Для обессоливания и концентрирования йракцнй элштсз, полученных циторецепторной хроматографией, вами был предло-яен подход, основанный на сорбции полкпептидов активных фракций гидратом окиси алшнння с посла дуисэй авектрозлшн-ей. В предварительных зксшрЕшзтаг бкво усзаеэшазо, что практически стопроцентное свшш тщ э на гздрвзо окиси алшинш при соотношения обгедов сорбента и активной Фикции 1: го наблюдается в иетервагэ рН 4,5-5,5. «ракцяа, получэннш аффинной хроштогра^шЗ, дотетровывала этшшш-ном до рН - 5,0, и вносили гндрга? окиса мячи на раечэта БО мкл плотного осадка на 1 к* фракции. ЛЬовы «датировали в течение 18 часов, сорбент раоуопвндироваля в ¡явном обаеке

буфера для образцов и вносили в-слот на поверхности блюка ШАГ. Обнаружена гетерогенность активных фракций, полученных цкторецэпторной хроштографией, при значительной содержании дашоненты с молекулярное шссой около 10 кД. Вэсиотря на отсутствие пряме доказательств антибакгеркалькой аэтивыссти данной пептидной компоненты. высокое ее содержание в аоткв-еой фракцки при полном отсутствии в препаратах, не обдада»-еца актквЕОстью, позволяет, по нашему ынешш, предположить идеЕТКЧЕОсть данного пептида с ФАД.

Таким образом, циторецепторная хроматография обеспечивает получение высокоочищенных препаратов САД, представляющего собой пептид с относительно низкой шлекулярной массой. При васигабировании процесса наблвдается увеличение кратности очистки при незначительном снижении выхода, что, по-ввдимоыу, свидетельствует о возможности технологического применения циторецепторных сорбентов на полиамидном шт-риксе. Необходимо ответить в этой связи, что ряд клеток, использованных для получения сорбентов, доступны в больших количествах. Так, при синтезе сорбентов на основе эритроцитов человека источником клеток служила так называемая "утильная зритроыасса" - отходы производства человеческого лейкоцитарного интерферона, не находящая в настоящее время применения. Ешяасса бактериальных клеток коммерчески доступна - E.ooü U-17 выпускается в СССР под фармакопейным названием "Колибактерин", изготавливается также и препарат "Шо касса Ц lysodeictlcus лиофилизированная". Ш сегодняшний день сорбенты, содержащие микробные клетки, по-видимому. Солее перспективны с точки 8рения промышленного выпуска и применения, так как получение бактериальной биомассы не представляет существенной технологической проблемы.

ВЫВОДЫ:

1. Шказана возможность получения циторецепторных сорбентов для аф&ганой хроматографии на основе полиамидных шт-

РИКСОВ.

2. Разработана методика количественного определения связывания прокариотических и зукариотических клеток на полиамидном матриксе.

3. Оптимизированы параметры процессов активации полиамидного носителя и иммобилизации клеток, {йксимаяьная клеточная нагрузка достигается при обработке предварительно гидро-.шзоаанного штрикса 12,6% глутаровым альдегидом при рН -7,4 около 18 часов и последугаэй инкубации с клеточной суспензией в течение 3-5 часов, рзлучен ряд циторецептор-икз сорбентов,содержащих различные бактериальные и эукаг риотическке клетки.

4. Апробкровета пригодность полученных сорбентов для е«деления леэтизов. Шлучены внсокоочшзенные препараты фитоге-маггдптшшна фасоли, лектина картофеля и лектина зароды-вей ппеннцы. Шдсбраны клеточносодерлицие сорбенты для очистки каждого лектина.

5. Циторецепторная хроматография на сорбенте, содерхвдем иммобилизованные клетки БЬ. ер1йегтклз, использована для очистки фактора антибактериального действия препаратов интерферона - пептида с молекулярной массой менее 10 кД. Определен рехм фиксации иммобилизованных бактериальных клеток, обеспечивает^ операционную стабильность в течение 22 цззсюв хроматографии.

6. Доведена оптимизация режима элгзцяи и масштабирование процесса ввделения фектора антибактериального действия цкторецэпторной хроштографией на полиамидных сорбентах.

СПЖХЖ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ Ю TESE ДИССЕРТАЦИИ.

1. Ваеничнов Р. А.. Ерошша А. А., Сергеев К Е Способ определения мутагенной активности химических соединений /A.c. СССР N 1258829, ШШ С 12 N 15/00, эаявл. 27.03.86, опубл. 23.09.86.

2. Шюшпшов Р. А., Ерешша А. А., Сергеев Е В. Применение им-ш&шасванных препаратов ьшфосмальной фракции для определения мутагенной активности химических соединений в тестах с метаболической активацией // Тез. докл. на заседания секции генетических аспектов проблемы "Человек и биосфера" ШТК ГКНГ. -Ордашикидзе, 1986. -с. 97.

а Шлеева Л.И., Сергеев В. &, фвнецрв Е а К вопросу об идентификации антибактериального фактора в препаратах интерферона /ДЭП. во БЕШОШ ИЗ СССР N 10634-86.

4. Малаева л И., Сергеев Е Е , Ремеэовская Е R Определение кэоэлектрической точки антибактериального фактора препаратов человеческого альфа-интерферона / Деп. в ВИНИТИ N 7447-В-86.

5. йаюева Л. И., Пзчеркина С. А., Сергеев Е Е, Кузнецов Е Е Зксперишнтаяьнов обоснован«» возможности использования препаратов интерферона совместно с антибиотиками /Тез. докл. конф. "Естественные науки - здравоохранении". -Пэриь, 1987. -с. 16-20.

6. Ыазэвва Л.&, Сергеев ЕЕ, Кузнецов ЕЕ Автибактериаль-еай фюаор в препаратах интерферона: частичная очистка и некоторые характеристики /"Тез. дока. I съезда зпидемио-гэгев, инфекционистов и гигиенистов Туркменистана. 4.1." - Ашсабад, 1S86. -с. 37-за

7. Сергеев Е Е , Тетерева С. Е Способ получения иммуносор-бента, содержащего иммобилизованные клетки /А. с. СССР N 1317933, С 12 N 11/00, гаявл. 16.08.84., опубл. 19.09.88.

& Шлеева Л. К., Сергеев ЕЕ, Кувнецэв BLП. , Аэробов ЕЕ Частичная очистка и некоторые характеристики антибактериального фактора в препаратах интерферона //Антибиотики и химиотерапия. -1968. -9. -с.690-693.