Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИИ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ И ИХ ПРИРОДНЫХ ИНГИБИТОРОВ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "АФФИННАЯ ХРОМАТОГРАФИИ СЕРИНОВЫХ ПРОТЕИНАЗ И ИХ ПРИРОДНЫХ ИНГИБИТОРОВ"

АКАДЕМИЯ НАТК СССР ОРДВНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БЮХНШШюшшА.Н.БШ

гб'Об V

На права* рукопиож

чкмкм Клваа Владимировна

АФФИННАЯ РОХА10ГРАФИН GSFUHQBtg ПГОТЩАЗ И И!

природных ингибиторов '

03.00.04 т 0яож»г*чвовая хш*я

Автореферат дисоврттяи аа соискание учено! степени яандидвта биологических ваук

Москва - 1S79

Работа выполнена в лаборатории белка г нуклеиновых кислот ордена Левина Института биохимии ни. А.Н.Баха АН СССР.

- НаучшИ руководитель: кандидат биологических наук В.В.ИОСОЛОВ.'

■ Официальные оппоненты: '

доктор биологических наук Н.Б. ЛИВАНОВА, кандидат химических наук У.И.ХУРПШ.

Ведущее предприятие: Кафедра химии природных соединений Химического факультета Московского гооударствеиного университета им. Ы.В.Ломоносова.

Защита диссертанта состоится " аМ^^Л-1979 г. в " ~ " чао. на заседании Специализированного совета (К 002.86.01) го присутаеяию ученой степени кандидата наук при Институте биохимии имени А.Н.Баха АН СССР (117071. Москва. В-71, Ленинские проспект, д.33, корп.2)*

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литература АН СССР (Ленинский пр., д.33, корп.1).

• Автореферат разослан "_■ ■_1579 г.

Ученый секретарь-Специализированного совета -

кандидат биологических наук

М.И. МОЛЧАНОВ .

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность проблемы. Настоящая работа посвящена разработке новых методов выделения я очистки протеолитнческнх ферментов класса сержяовых протеиназ и их природных ингибиторов* Актуальность этой проблемы связана с той важной ролью, которую протеолитическив ферменты играют в процессах обмена веществ, а также с их рас туши использованием в научных исследованиях, народном хозяйстве к медицине. Большинство существующих до настоящего времени методов выделе гася протеиназ представляют собой сложные многоступенчатые процессы, которые часто сопровождаются значительными потерями фермента.

Природные ингибиторы про теиназ в последние года привлекает широкое в ни isa ни е ис сле до ва теле 9, что связано с их важной ролью в регуляши активности протеолитических ферментов ia tiyo . . Изучение,природных ингибиторов открывает ro-вые перспективы в изучении белок-белковых взаимодействий, структуры активных центров протеиназ и механизма их действия, Кроме того,' природные ингибиторы протеиназ нашли практическое' применение в медицине в качестве терапевтических ; средств при лечении ряда заболеваний.

Успешное разрешение многих вопросов, связанных о использованием протеиназ и их природных ингибиторов в научных исследованиях, в народной хозяйстве и медицине, в значительной мере определяется возможностью их получения в чистой виде наименее трудоемким и наиболее эффективным способом.

Щль работы. Целью настояпей работы была разработка новых простых г эффективных методов выделения и очистки сери-новых протеиназ'и их природных ингибиторов. <

Научная новизна работы. В результате проведенных исследования предложены' новые методы очистки и выделения несколь- -кнх проreoлогических ферментов. Методы основаны на использована* для хроматографии протеиназ в качестве сорбентов иммобилизованных природных ингибиторов ферментов.

Предложен простой споооб иммобилизации ингибиторов про-^ теиваз, содержащих в реактивном центре остатки лизина, а также принципиально вощй способ остановки протеолиза путем связывания активной протеиназы с иммобилизованным ингибитором. ■ ■'•. ■ ' .

Разработав метод аффинной хроматографии для получения высокоактивных ингибиторов - про теина э . из различны* источников растительного »животного происхождения. '

Практическое, значение работа. Разработанные методически« подходы могут Сыть использованы для очистки различных протееэ из природного сырья, а также для выделения нх природных ингибиторов. Существенное практическое значение имеет способ остановки реакций протеолиза в любой заданный момент без применения жестких воздействий, основаашЯ на связывайте фермента с иммобилизованным ингибитором. Это особенно важно при из учеши биологических объектов, когда надо исключить, возможность протеолиза без повреждения других ферментативных оистем. Исследование некоторых свойств иммобилизованных ферментов значительно расширяет представления о возможностях их регионального использования как в области аффинной хроматографии, так и в других областях ; научных исследований.

. Апробащя работы. Результаты исследования доложены на I и П Всесоюзных симпозиумах по получению и применению иммобилизованных .ферментов.

Публикации. По материалам диссерташв.опубликовано 11 печатных работ.

Объем работы. Диссертавдонная работа состоит из введения,' обзора литературы,•экспериментальной части, приложения, заключения, общих выводов и списка цитируемой литературы (187 ссылок). Работа изложена на 187 страницах машинописного текста, включает 21 таблицу и 26 рисунков.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Мате риала и методы исследования

В работе использованы трипсин фирмы, "spofa" , паре-кристаллиэованный из сульфата нагнан t а так« продажные препараты трипсина, хиыотрипсина и каялакреина» которые tac-пользовали без дополнительное очйбткиi Были использованы-препараты ингибиторов из сои производства фирмы *ввада1* и из легких крупного рогатого cKofra - препарат коятрикал (ИР). Частично очищенный препарат ингибитора иэклубяей картофеля получали по модифигаро ванному методу Ыапусимы ( Morlher е. , 1963). Препараты овомукоида выделяли из яичного белка птиц (курица, утки-кряквы и перепелка) по методу. Лайауивера в Меррея { 1Дпшг«атег t Murray , 1947). В качестве носителя для иммобилизации протеиааз и ингибиторов применялись порошкообразная целлюлоза, сефадекс о -200 и сефароза 43 и 63. Иммобилизацию соевого иагибитора трипсина осуществляли присоединением белка к даазобенэоилпроиэводному целлюлозы ( Campbell et ei. , 1951). Присоединение химо трипсина к сефадексу о -200 проводили с помощью 2-ащ-но-4,&-дихлор- 3 -триаэива ( kaj- , Lilly ,1970), а иммобилизации трипсина и пшотрн псина ва сефарозе, активирован- ной броьедиаяом, осуществляли по методу Аксена и Пора та ( Axen «t al. , 1967)• Эстеразну» активность трипсина, химотрипсина .а калликреиеа определяли тетраметрически по методу Шверта и др. Î Schwert et ai. , 1948). В качестве субстратов исвользотала этиловый эфир N, Х-^ензоил- 1 -аргинина (БАЭЭ) - для трипсина и кадликреяна и этиловый эфир ацетил- L -тирозина (АТЭЭ) - для химотрипсина. Протеолита-ческу® активность ферментов определяли гидролизом казеина. Концентрации белков определяли по оптической плотности -белковых растворов, используя соответствующие величины Ejqq» взятые из литературы, а также по методу Лоури ( Lowrj et

al. , 195t). Содержание 'ашнных групп в бедках определяли по реакции с пинтядргном. Активность ингибиторов протеиааз определяли по их способности подавлять астераэную или про- .

теолитическую активность ферментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ .

А. Очистка сротеиваз методом аффинной хроматографии о использование « ишюбализоващшх ингибиторов."

Трудности получения активных препаратов протеинаэ, в частности трипсина, в^начительяоД мере обусловлены их способности) подвергаться автолизу в процессе выделения и очистки (Мосолов, 1971). Учитывая продолжительность большинства обычных методов очистки ферментов, это приводит я сличению выхода а активности получаемого препарата. Чтобы взбежать указанных выше недостатков и снизить вероятность автолиза в процессе выделения, было предложено проводить очистку про-теиназ с помощью адсорбции на нерастворимых природных ингибиторах. В качестве адсорбентов для очистки трипсина и ферментного препарата аз Аок. Гга<11ав использовали нерастворимые производные природных ингибиторов из сон и картофеля. Ингибиторы переводили в иммобилизованное состояние путем их ковалентного присоединения к п-дназобевзоилцеллюлозе в фосфатном буфере» рН 7,7, при 4-5°С. В указанных условиях и 0(5 г цедлплоэн присоединялось 40-50 мг ингибитора из бобов сои ила клубней картофеля.

Изучение специфичности иммобилизованного соевого ингибитора трипсина проводили путем суспендирования его в присутствии различных белков при рН 7,7 и оценки количества связанного белка. Проведенные опыты показали высокую избирательность иммобилизованного, соевого ингибитора по отношению к активному трипсину, В то же время иммобилизованный ингибитор почти не связывал ДИФ-проиэводное трипсина.

Хорошая избирательность иммобилизованного ингибитора позволила использовать его для очистки трипсина от продуктов оамопе ревэривания. ' Трипсин подвергали сшоперевариванию в ячейке татратора при рН 7,5 и 25°С в течение ЭО и 60 ш, Автолизагы в 1/15 М фосфатном буфере, рН 7,7, добавляли к оуеоевэии, содержащей 0,5 г иммобилизованного ингибитора . Смесь перемешивали и центрифугировали. После про-

мывания осадка деоорбпию белка проводили 0,01 я НС1 ; . В исходном растворе, «втолизатах и кислом олгеге определяя! 8 с те раз ну» актавиость; (субстрат БАЭЭ) в содержаше ашвно-го азота. Получеянне результаты представлены в тебл.1, из которой ешшо, что удельная активность материала в кислом влиаге не только значительно превосходила удельную активность автолизата, но бнла значительно выше, чем у походного препарата тринсяка. Содержание аыишшх групп на молекулу в кислом элюате имело то же значение, что у исходного фермента. Тышм образом, подученный материал может быть охаракте-_ ржзоваи, как высокоактивный препарат трипсина, свободный от продуктов сашперевариваниа.

J ' - . л

Таблица 1

Освобождение трипсина от продуктов самопереварнва-нля с помощью ишобализова иного ингибитора из-coa

Материал

Ферментативная активность ■

1лкэкв рАЭЭ,,* лиа.мг балка

Содержание ИН2-групп

моль/Ьоль белка

Исходный феркеят 41.0 100,0 12,0

Автолизат 30 шв. 23*3 58,8 20.0

Автолизат 60 мин. ■ 1&.-9 ; • 41,2 23,2

Автолизат 30 кин.. 122,7

.после очистка 50,3 ,.'. 12,6

Автолизат 60 мин. : 12,5

после очистки 113,0

Сделанный вывод подтверждается также результатами гелево Я хроматографии фермента, очищенного с помощью иымобилизо-ванного ингибитора^ ;на сефадексе 0-100 ;(-рис.1>.

ГисЛ. Хроматография на се-фадексе с-100 исходного препарата, трипсина (I), 30-минутногоавголизага трипсина (о) и автолизата после очистки на иммобилизованном ингибиторе £111).

20 40 60 80 огГъёг^мл

Полученные результаты позволяет сделать выход о том, что деградированные, лишенные ферментативной активности ферменты, не вэанмодействуют с иммобилизованным ингибитором. Такая иэбира те ль нооть иммобилизованного ингибитора создает широкие возможности его применении для очистки трипсина и других протеиназ сходной специфичности.

Препараты трипсина растворяли в фосфатном буфере рН 7,7 и инкубировали о иммобилизованным ингибитором 25 кин. После промывания суспензии исходным буферным раствором эдшию трипсина осуществляли о помощью 0,2 к КС1 , рИ 2,3.

Из таблши 2 видно, что активность всех трех исоледо-ванных препаратов трипсина в результате применения иммобилизованного ингибитора значительно возрастает, достигая во всех трех случаях 73-74 мкэкв ЕАЭЭ/лоп.мг белка.

: Таблица 2 Очистка препаратов трипсива о пошлы) иммобилизованного ингибитора из сон

Препарат

Трипсин кристаллический X Трипсин кристаллический Ц Трипсин кристаллический "Сдофа" Трипсин крист. X после очистка Трипсиа крист. П после очистки Трипсиа "Спофа" после очистки

Ферментативная активность

мкэкв БАЭЭ %

мин.мг белка

50,6 100,0

40,2 79,4

52,4 102,7

73,8 145,6

74,2 146,6

73,3 144,8

Для очистки трипсиаоподобяой протеаэы лог. Гга<11ав была использована аналогичная процедура, но ингибитор из сод был заменен на ингибитор_нэ клубней картофеля. Увеличение протеолитической активности фермента соответствовало

Полученные данные-указывают на широкие перспективы очистка препаратов протеолитических ферментов с применением иммобилизованных ингибиторов. Использование последних имеет больше преимущества по сравнению с другими методами очистки. связанное с тем, что блокирование активного центра ферецепта при взаимодействии о ингибитором исключает возможность самопереваривания в процессе очистки.

Б. Остановка протеолиза о помощью иммобилизованных ингибиторов.

Способность нерастворимых ингибиторов бистро образовывать комплексы с протеиназами, показанная выше, мог-ет найти применение при решении такого практически важного вопроса, как остановка протеолиза белков. Использование для этой цели. иммобилизованных ингибиторов, способных избирательно связывать фермент в присутствии продуктов протеолиза, дает возможность не только получить продукты протеолиза, свобод-

ные примес^ фермента, но и вприашпе регенерировать фермент* Врэыолнооть остановки тряптичесяого протеолнэа о помощью ршобил^зованвнг ингибиторов из сои была' продемонстрировав р схема которого изображав- на риоурке 2,

(ыборущчнша/ть&уъшТрипсин (5Ш)

<ЩФ

2чоса, 25*с

(Щ7}

ИммаВи/лвоВонныи

цнгиоитор, центрифугирование

2часа25°с

(ЦО)

НодосодоШзЯ жидкость

^2мссг25'с

(Цг) .

Осхздокрмпо-отизаоанноао ингибитора

Гис .2. Схема ошта по остановке протеолиза с помощью шшобнлкзованного ингибитора.

1рфры в скобках указывают содержание аминного азота, выраженное как число аминных групп ва молекулу белка.

К раствор; сывороточного альбумина в 0.1 И фосфатном буфере» рН 7(6, добавляла трипсин а смесь инкубировали 2 ча-оа при 25°С. Затем к одной.части гидролизата добавляли суо-пензию иммобилизованного ингибитора, смесь центрифугировали х надосадочнуп жидкость инкубировали дополнительно 2 часа при 25°С. Другу® часть гидролизата инкубировали в течение 2— часов_ при 25°С, не подвергая его предварительной 'обработке иммобилизованным ингибитором. В исходном растворе сывороточного альбумина и в гидролизате ва каждом этапе определяли содержание амишшх групп. Полученные результаты убедительно указывают на отсутствие протеолиэа в той;части гидролизата, которая была обработана нерастворимы« ингибитором.

Таким образом, применение иммобилизованного ингибитора позволяет полностью остановить прогеолиа белка. Кроне того* специально проведенные опыты по регенерации фермента, используемого для триптического протеолиэа, показывают возможность его частичной регенерации в активной форме (выход S3-5CS по активности).

Аффинная хроматография наллякреина.

Калликреины - ферменты класса сериновых протеиназ -представляют большой интерес для ¡широкого круга исследователей и находят интенсивное применение в медицине при лечении ряда заболеваний..Низкое содержание калликреина в исходном материале (плазме крови, внутренних органах животных) ж их лабильность затрудняют получение высокоактивных препаратов ферментов. В связи сэтим представилось целесообразным_ применить для его очистки метод аффинной хроматографии. Известно, что основной п&нкретический ингибитор трипсина способен подавлять активность калликреина из внутренних органов, Поскольку ингибитор содержит функционально важный остаток лизина, была разработана специальная процедура, обесие-чивапцая защиту ингибитора в процессе связывания о сефаро-зой, активированной бромшаном. Для защиты остатка лизина в реактивном центре ингибитора, использовали его комплексооб-раэование о трипсином; у которого аминяые группы были подвергнуты ацатилированип обработкой уксусным ангидридом. Это

было необходимо для того, чтобы исключить связывание фермента ©матрицей,

Таким образом, способ получения иммобилизованного панкреатического ингибитора включал три последовательные стадии (рио.З): •

1, Образование комплекса ингибитора о апетилтрипсином.

2, Присоединение полученного комплекса к сефарозе 4Б, активированной бромцианом.

3, Диссоциация комплекса в кислой среде с образованием «ммобидизованного ингибитора и свободного ада тилтрипсина.

ПТИ + ацетил трипсин

<<1

Комплекс ПТУ' аиетиптрипсш+ИМ

октибир. ИммоНилизаЗанный комплекс

ПТИ ~ ацетттрипсш \рН2,0

1 I' ;

Яцетилтрипсин . Иммо5тизвоанныа ( 6растборе) ПТИ

Рис.3. Получение ивдобилиэованного панкреатического ингибитора трипсина. ПТИ - панкреатический ингибитор трипсина.

Содержание активного панкреатического ингибитора на поверхности сефарозы 4В рассчитывали на основании количества а да тилтрипсина, освобожденного при диссоциации комплекса, а такие определением активности иммобилизованного ингибитора по отношению к трипсину. Содержание активного ингибитора в 1 мл сефзроэн, определенное двумя способами, дало совпадаю-

ще значения (53-1СГ3 ^М и 59-10~3 ¿Ii). Это свидетельствует о том, что связывание, ингибитора с сефарозой осуществ-. лилось почти исключительно через а минные группы ингибитора, не входящие в его реактивный центр*

Полученный сорбент был применен для очистки продажного препарата калликреана " Deport Kall lier ein* , Так

как источником получения препаратов калликренна бала поджелудочная железа, шжно было допустить присутствие в них примеси трипсина. В связи с этим очистку калликренна проводили в две стадии. На первой стадии раствор препарата в 0,1 M трио-HCl буфере, pH 8,0, содержащем' 0,5 M KCl , смешивали с 3-6 мл суспензии иммобилизованного овомукоида для сорбции трипсина и возможно других примесей. Суспензии перемешивали 10 мин на холоду, фильтровали через стеклянный фильтр и полученный раствор пропускали через колонку с иммобилизованным панкреатическим ингибитороы. Колонку промывали иоходяым буферным раствором до полного вымывания веществ, поглошатеих при 280 нм и злюще фермента осуществляли 0,1 M ацетатным буфером, pH 4,1.

Таблица 3

Очиотка калликренна на колонке о иммобилизованным панкреатическим ингибитором трипсина

№ опыта До очистку □осле очистки Выход, % ■ (по активности)

удельная*'-' актив- . ность суммарная активность удельная активность суммарная активность

1 0,4 79 27,9 59 74,5

2 • 0,4 155 33,8 114 73,5

3 0,4 135 38,4 120 89,0

4 . - 0,3 ' — 41,8 ■ —

Удельная активность выражена в мкэкв гидролизовавкого БАЭЭ/Ъшн.мг белка.

В таблице 3 приведены результаты очистки калликреива. Полученные результаты показывают, что применение аффинной хроматографии позволяют значительно увеличить удельную активность каллиуреина по сравнению с исходной,

Данные изоэлектрического фокусирования исходного н очидеввого препарата калликреина (рио.4) свидетельствуют, что очищенный препарат был практически гоиэгенен и содержал основной белковый компонент.с изоэлектрнческой точкой при рН 4,12.

Гис.4. Изоэлектрическое фокусирование препарата кадлякреаа а - до очистки, б - после очистка, 1 - градиент рН, 2 -

Применение аффинной хроматографии для выделения природных ингибиторов протеи на з

1. Выделение ингибиторов протеиваз из яичного бедка. Растущее использование природных ингибиторов протеиназ в научных исследованиях, медицине, а также в препаративных целях для очистки ферментов методом аффинной хроматографах выдвигает задачу разработки эффективных методов их выделения и очистки* Применение для этих го лей аффинной хроматографии с использованием иммобилизованных ферментов в качестве сорбентов представляется наиболее целесообразным.

. В ваших опытах для ьаделенкя протеинаэ из бедка яиц разданных видов ртиц был использЬзан химотрипсиа, иммобилизованные аа сефадексе в Дм очистки рвомукогао^, полученных с помощью датода 1а2нуиве рз иМеррея, 100 иг препарата растворяли в ОД И фосфатном буфере,* pH 7,f> и фильтровали через колонку, содержащую иммобилизованный химотрипсин. Колояку прокнвали до полного'исчезновения в элюате веществ, поглоадшнх при 280 ни» Элюшю сорбированных йелког выводила с помощью гляцияов^ео- HCl буфера, рВ 2,2. Результаты очистки * различных овоааукоидов »лтодом аффинной хроматографии приведены в таблиш 4."

■ Таблица 4

Очистка иагабиторов из яичного белка методом аффинной хроматографии на колонке с химотрипсиа-сефадек-оом '

Удельная активность ' . {мг фермента/мг ингвбитора?

Личный - № отношению к по отношению к хеш-

белок трипсину ' трипсину

исходный препарат эладт очи-(рН 2,2) стка исходный препарат элюат очи-СрИ 2,2) стка

Курида 0,93 0,80 0,85 0,012 0,71 59,0

Утки 0,80 1,07 0,85 ' 1,25 1,5

Перепелки о;оо 1,25 Ü6 0,13 1.22 ' 9,4

Полученные даване показывают, что материал, сорбированный при рН 7,6 на колонке с иммобилизованным химо трипсином, характеризовался более высокой кнгибпторяой активностью по отношению к химотрипсину по сравнению с исходными препаратами овомукоидов. Особенно большое увеличение активности веб-, лодалось в олучае препарата овомукошш из белка куряаадх яиц. Это связано с наличием в нем двух различных белков ( Rhodes at el. , I960) собственно овомукоида, который

является ингибитором трипсина и оэоингибитора, подавдягаего активность хиштрипсина. Использование иммобилизованного химотрипсина позволило отдалить овомукоид от овоингибитора и получить последний в чистом воде (табл.4, рие.б).

Рис.5, Ингибиторная активность по отношению к химотрипсину исходного препарата куриного ово-мукоида (1) и оэоингибитора (2), полученного яа колонке о химотрип-син-сефадексом. :

Применение аффинной хроматографии в данном случае позволяет в одну стадию, выделить в чистом виде белок, содержание которого в исходном препарате мало (меные 2?).

2. Выведение, ингибиторов,протеиназ, из клубнейм картофеля. Для выделения ингибиторов из клубней картофеля использовали как иммобилизованный трипсин, так и химотрипоин (носитель - сефароза 6В). С этой шлью белки, экстрагированные из клубней картофеля и осажденные сульфатом аммония, растворяли в фосфатном буфере, рИ 7,6 а фильтровали через аффинную колонку. Злюци» специфически сорбированных белков проводили с помощью 2%-аой уксусной кислоты. Из результатов очистки'препарата ингибиторов из картофеля, приведенных на рве.6 видно, что активность очищенных ингибиторов составляла 1,2 мг связанного фермента ва 1 мг ингибитора. Это соответствует очистке ингибиторов химотрипсина в 6 pas и ингибиторов трипсина в 10 раз.

а го so /г*г UHSt/fit/mapo

Bio,6. Ингибироваяие проreoлигнческой активности трипсина (А) и химотриасина (Б) препаратами из картофеля, 1 - исходный препарат, 2 - после аффинной хроматографии.

Некоторые свойства препаратов, ишофиляэоваяяих пустея паз

Изучение свойств иммобилизованных протеиваз имеет боль-■шое значение для ах наиболее радаояального использования в качестве специфических сорбентов при аффинной хроматографии. Различные способы злюции сорбированных белков предполагает использование не только крайних значений рН, но такие различных поверхностно-активных веществ, мочевины и т.д. Таким образом, изучение вопроса о том, как влияют вышеупомянутые вещества на свойства иммобилизованных ферментов, а также о возможности длительного использования иммобилизованных ферментов приобретает важное практическое значение. Было прослежено изменение эсгеразяоЗ активности ишобилиэованных ферментов в течение двух дат о момента их получения. Исследовано также влияние различных кокценграшЗ мочевины я цо-де'цалсульфата натрия ( ses ), а также повышенных температур на ферментативную активность иммобилизованных трипсина и химотриасина. В результате было установлено, что зстераз-ная активность иммобилизованного трипсина и химотриасина (носитель - сефароза 6В) практически не менялась в течение

двух лет о момента их получения и составляла 7б# и 20? соответственно от активности ферментов в растворе.

Для определения влияния по вы пенных температур на асте-рааную активность иммобилизованных трипсина и пвдо трипсина суспензии иммобилизованных ферментов перемешивали в специальной термостатированной ячейке при различных температурах. Через опреде^нные интервалы времена отбирала пробы суспеазии для определения в них эстеразной активноега.

Полученные результаты показали, что иммобилизация ферментов приводит к повышена».их устойчивости к действию повышенных, температур. В отличие от ферментов, находящихся в, растворе, иммобилизованный трипсин и химотрипсин сохраняют 405Е активности после 5 часов пакубаши при 57°С (рис.?)

Ьге.7. Влияние повышенных температур, на эстетзазкую ъктив-иость вшобилизованшх хдаотрипсинаШ и трипсина (Б). . - нативный Фермент (37°С>.

Наиболее существенное снаненае активности .иииобилизо-ванвых ферментов происходит в первый час инкубации щри повышенной температуре, В последующем активность падала значительно медленнее., на основания чего могао -сделать тдредподо-лепке о наличия -лабильной" * "•стабильной" фракций имыоба-

лязованннх ферментов. Об а тон же свидетельствуют результаты по изучении влияния мочевины на эстеразную активность иммобилизованных трипсина и химотришина (рис.8).

Суспензию иммобилизованного фермента инкубировали в присутствии 8М мочевины при рН 7,9 и 25°С. Через заданные промежутки времени пробы суспензии отбирали и в них определяли »стеразную активность. Как показали опыты, за 45 мин инкубации в указанных условиях потеря эстеразной активности для иммобилизованного трипсина составляла 20%, а для химо-трипсина - 33% (рис.8). Такой *е процент потери активности наблвдается и при более длительвом времени инкубации ферме вго в в 8 М мочевине.

Рис.8, Действие 6 мочевины на эствразную активность . иммобилизованного трипсина (1) и химотрипсина (2), (Разбавление ыочешны в 50 раз) '

С целью изучения влияния на эстеразную актив-

ность иммобилизованного трипсина суспензию иммобилизованного фермента перемешивали 15 мин при рН 7,9 и 25°С в присутствии различных концентраций детергента. Эстеразную активность определяли в стандартных условиях*

Из полученных результатов (рио.9) видно, что яммобили-

зеванный фермент обладает значительно более высокой устойчивостью х действию детергента по сравнения с яатявним ТРИПСИНОМ! .

Рис.9. Влияние SDS на эстераэную активность трипсина, 1 - фермент в растворе; 2 - иммобилизованный фермент.

Повышенная устойчивость иммобилизованных ферментов к действия sos. и мочевины открывает возможность использования этих веществ для злющи связанных ингибиторов.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод получения высокоочищеиного препарата трипсина с применением иммобилизованного белка-ингибитора из сои (ингибитора Кунитш). Метод включает две последовательные стадии: связывание активного фермента с иммобилизованным ингибитором при нейтральном значении рН и его десорбцию при кислой значении рН. Очищенный трипсин свободен от примеси продуктов автолиза и обладает высокой удельной активность». ' ■ '

2. Предложен способ получения иммобилизованных ингиби-

торов протеиааэ, содержащих в реактивном прнтре остатки :ли-эина. Существо способа состоит в'присоединении ингибитора к. сефарозе, активизированной Оромдоавом, в форме комплекса с трипсином, аминнве группы которого подвергнуты адатилирова-нию. . ■ ^ ■ ■ '"■..■.■■!*■

3. Разработан способ получения высокоочишенных препаратов калликреина, включающий последовательную аффинную хроматографию на иммобилизованном оаомукоиде и затем - на иммобилизованной панкреатическом ингибиторе. Очищенный препарат

. о одержит один основной белковый компонент орН 4,12 и имеет высокую удельную активность.

4. Исследованы некоторые.свойства иммобилизованного трипсина я химотрипсина, полученных присоединением ферментов к сефарозе, активированной бромшаном. Иммобилизованные ферменты сохраняют высокую удельную активность охарактеризуются высокой устойчивостью к действию денатурирующих факторов.

5. На основе использования в качестве биоспецифических сорбентов иммобилизованных трипсина и химотрипсина разработаны простые методы получения высокоактивных препаратов ингибиторов протеиваз.

6. Предложен новый принцип остановки реакций протеоли-88, основанный на связывании активных ферментов с иммобилизованным ингибитором. Способ может найти широкое применение в тех случаях, когда Необходимо исключить протеолиз без применения жестких воздействий, что особенно важно в биологических системах. Существенным преимуществом способа является возможность ре гене рати про теазы и ее'повторного использования.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации;

2) Мосолов B.S., Лушникова Е,В, 1969. Авторское свидетельство А 252266, Бюллетень № 29»

2) Шеолов В.В., Лушникова В.В.' 1970. Принцип очистки пеп-тидгздролаз, основанный на применениинерастворимых ин-

• гибиторов белковой природы. Еиохкжм, 35. вып.З,- 440-447.

3) Мосолов В.В., Лушникова Е.В, 1970. Остановка аротеолиза при помощи нерастворимых' ингибиторов. Докл. АН СССР, 191, 951.

4) Мосолов В.В., Лушникова В.В. 1973* Нерастворимые ферменты, их получение, свойства и применение. Успехи биологической химии, 14, 146-171..

5) Иевлева Б.В., Федуркина Н.В., ¡¿осолов В.В.. 1974. Присоединение Л-химотрипсияа к амияохлор- s -триазякил-сефадексу и использование иммобилизованного фермента для очистка ингабиторов химотрипсина. - Материал» I Всесоюзного симпозиума по получению и применению иммобилизованных ферментов, Таллия, стр.66.

6) Мосолов В.В., Иевлева Е.В., Федуркина Н.В.. Соколова В.В. 1974. Некоторые свойства иммобилизованных ферментов трипсина и химотрипсияа в их взаимодействие с природными ингибиторами. - Материалы I Всесоюзного симпозиума по применению и получению иммобилизованных ферментов, Таллин, стр.64. -

7) Мосолов В.В,, Федуркина Н.ф'.'» Иевлева Е.В. 1974. Очистка ъ свойства ингибиторов протеиааз из яичного белка некоторых видов птиц. Прикл. биохи». и макробиол. X, вып.З, 415-419* -'

8) Лушникова Е.В., федуркина Н.В., Соколова Е.В., Кротова Л.И., Мосолов В.В. 1975. Получение биоспещфкческих сорбентов. Езоспещфичеекая хроматография. Метода современной биохимии, М., "Наука", етр.5-8.

9) Иевлева Е.В., Мосолов В.В., 1S75. Некоторые свойства иммобилизованных трипсина и сС-химотрипсина и их применение для очистки ингибиторов протеинаэ из картофеля. Прикл. биохим. и'микробиол., XI, вып.З, 427-432.

-10) Мосолов В.В., Иевлева Б.В. Шатернихов В.А., Саиевкова * Н.ф* 1976. Очжоюи панкреатического валликреина методом ' аффинной хроматографах. Прикл. биохии. в инхробиол., Ш. вып.4 , 572-577.

11) Иевлева Е.В., Иэсолов В.В.. Шатерянков В. А., Саывннова Н.Ф* 1377.. Получение биоспещфического сорбента для очистки панкреатического вадликренна. - Интервала II Всесоюзного симпозиума по получению х применению иммобилизованных ферментов. Абовян, стр.5.

ЭАК. 1г»5 ТИР. 180 ВЦ ВН11НКС*. ПОД. К ПЕЧАТИ 21.02 197®.' Т-С3708.