Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и изучение свойств плацентарного лактогена человека, расщепленная форма гормона

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение свойств плацентарного лактогена человека, расщепленная форма гормона"

^з яг?п

АКАДШЯ ОДВДШСКИХ НАУК ВСЕСОВЗНЫЙ ЭВДОКРИНОЮГВДЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи УДК 577.152.34

КРОШКА Марина Валентиновна

■«ВЬЩЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ПЛАЦЕНТАРНОГО ЛАКТОГЕЙА •ЧЕЛОВЕКА, РАСЩЕПЛЕННАЯ ФОРМА ГОРМОНА"

03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990

Работа выполнена в Институте окспорииоитальной ендокринологии ВЭНЦ АШ СССР (директор - профессор И.И.Дэдов)

Научный руководитель: ашдеыхв АШ СССР- Ю.А.Пашсоз

Официальные оппоненты: доктор хиыичоских наук, Н.Г.Абдудаев

доктор биологических науд, В. Н.Прозоровский

Ведущее учре-лдоние - Институт эволюционной физиологии и бшшо&ш

И.И.Сеченова АН СССР.

Защита диссертации состоится "_"_;_■ : ■ 1930г.

в час. на заседании специализированного совета (Д 001.23.01) Института экспериментальной эндокринологии ВЭНЦ АШ СССР' (Москва, Ц7036, уд. Дмитрия Ульянова, д. II).

С диссертацией шайо ознакомиться в библиотеке ВШЦ АШ СССР Автореферат разослан " "_ 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор биологических наук,

профессор Л.К.Старосельцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы. В настоящее время биохимия белковых гормонов является одной из актуальных областей современной эндокринологии и выделяется как самостоятельное направление.

Полипептидные гормоны являются важнейшими биорегуляторами обмена веществ в организме, выполняют множество биологических функций. В связи с этим ввделение и очистка гормонов, изучение их свойств, специфики физиологической функции и структурно-функциональной организации белковой молекулы представляет весьма пер-«пективное направление. Особый интерес в настоящее время вызыва ют различные природные модификации и варианты белково-пептидных ' гормонов, и поэтому ввделение их, изучение является непременным условием выяснения регуляции различных процессов, обусловленных биологическими эффектами гормона, а также позволит открыть новое звено а сложной системе гормональной регуляции.

Полипептидкые гормоны уникальные биорегуляторы всех видов обмена в организме и отличаются широкой полифункциональностью. Один мз аспектов полифункциональности касается природной гетерогенности белково-пептидных белков, одна из причин которой является различные посттрансляционные модификации, приводящие к образованию измененных белков, .появлению форм гормона отличных от доминирующей-.молекулы. Кодификации затрагивают не только химическую структуру белка, но и отражаются на биологических, иммунологических и физико-химических свойствах гормона.' , " • Одним из. важнейших полипептидных гормонов временной эндокринной железы беременности является плацентарный лактоген: человека |ПЛЧ). Синтез его синцитиотрофобластом происходит на протяжении всего срока беременности, в0% гормона поступает в кроеь берёмен-

ной женщины, и 10$ в амниотическую жидкость и к плоду. Концентрация ПЛЧ увеличивается на протяжении всего срока беременности пряно пропорционально нарастанию массы плаценты и плода. Гормон является одним из основных регуляторов метаболических процессов в организма матери, направленных на обеспечение роста и развития плода. Такие его эффекты как стимуляция лактации, усиления синтеза белка, участие в эритропоэзе, влияние на метаболические процессы в организме плода и другие эффекты играют определяющую роль в процессе вынашивания беременности. Клиническая значимость определения гормона на протяжении всего срока беременности обусловлена тем, что снижение его уровня свидетельствует о нарушении функции плаценты и является прогностическим признаком угрозы для состояния плода.

Б связи с этим выделение, очистка к изучение свойств и различий природных модифицированных вариантов гормона представляет весьма перспективное направление, позволяющее открыть новое звено в системе гормональной регуляции обеспечивающей сложную взаимосвязь организма матери и плода.

В литературе имеются данные о наличии высокомолекулярной формы гормона в плаценте человека. Днивр ПЛЧ является физиологической формой гормона, а не продуктом экстракции или артефактом, регуляция механизма образования дисульфидных дилеров и их биологическая значимость еще не ясны.

Представленная в настоящей работе новая расщепленная форма плацентарного лактогена человека, ранее не описанная в литературе, позволяет более глубже подойти к выяснению физиологической роли гормона в организме, и может быть основой для детального

изучения природных вариантов ПЛЧ в различные сроки беременности и состояния, а также способствовать поиску метода количественного определения данной формы гормона в циркуляции.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа является част?.'! исследований, проводимых в ИЭЭ и ХГ АМН СССР по выделению и изучению белково-пептидных гормонов. Целью настоящей работы являлось выделение и очистка, сравнительный анализ физико-химических, иммунологических и биологических свойств мономера ПЛЧ и новой расцепленной формы гормона. Сформулированная цель исследования предполагала следующие конкретные задачи:

1. Выделение и очистка Ш1Ч из плаценты человека.

I

2. Решение первой задачи повлекло за собой разработку и последующее применение оригинального способа получения гормона.

3. Разработка первого способа позволила модификацию метода и подбор условий для другого сорбента.

4. Изучение физико-химических, иммунологических и биологических свойств гормона, полученных на двух сорбентах и сравнение их путем электрофореза в ПААГ, аминокислотного состава и Н-кон-цэвых аминокислот.

5. Решение задачи выделения ПЛЧ повлекло обнаружение расщеп* ленной формы ГШ в экстракте плаценты.

6. Исследование и сравнительный анализ физико-химических, ш< ыунологических и биологических свойств нагивного гормона и расщепленной формы гормона.

Научная новизна работы. В работе представлено два принципиально новых разработанных подходов по выделению и очистке Ш1Ч. Предложенные' йе^одй-ШзрЯй&т быстро и воспроизводимо получить

высокоочищенный гормон, в достаточно мягких условиях во избежания денатурации и аггрегации материала. Разрешение проблемы получения и очистки 1ШЧ натолкнуло нас на новую форму гормона, ранее не описаннуо в литературе. Это новая расщепленная форма плацентарного лактогена человека. Проведено сравнительное исследование физико-химических свойств, аминокислотного состава, электрофоре-тической подвижности с восстановлением дисульфидных связей. Проведено определение иммунологической активности, биологической в сравнении с мономером^гормона и биологическими стандартами. Установлено ыэсто расщепление в молекуле ПЛЧ, что является результатами, имеющими приоритетный характер, и позволит пересмотреть устоявшееся представления о молекулярной биологии.данного белка.

Несмотря на то, что форма дисульфидиого диыера плацентарного лактогена человека описана в литературе, данные о существовании расщепленной форш Ш1Ч и ее характеристики получены впервые.

Теоретическая и практическая значимость работы. Представленные в работе данные свидетельствуют о тоы, что плацентарный лак-тоген человека присутствует в плаценте не только в виде мономера, дисульфидного димера, а также существует и расщепленная форма гормона. Присутствие гормона в организме в различных структурных вариантах и молекулярных форы, образованных вследствии природных посттрансляционных модификаций, способны изменять его функциональные свойства. Повышенная биологическая активность и сниженная иммунологическая расщепленной формы ПИ, в сравнении с мономером гормона, свидетельствуют о недостаточной информативности методов иммунологического анализа, используемых для оценки содержания в

- 5 -

крови беременных женщин.

Существование плацентарного лактогена человека в виде расцепленной формы служит еще одним доказательством и подтверждением общего происхождения гормонов семейства СТГ, включающее в себя гормон роста, пролактин и ШИ.

Относительная доступность и высокий конечный выход расщепленной формы ПЛЧ несомненно будут способствовать разработки специфического метода количественного определения гормона на протяжении всего срока беременности, а также позволит исследовать физиологическую роль формы, ее взаимосвязь мевду сроком беременности, концентрацией в крови и состоянием плода. Это позволит четко выявить функциональную специализацию расщепленной формы ПЛЧ, что в дальнейшем позволит проведение анализа взаимосвязи клинической симптоматики в системе мать-плод.

Представленные в работе данные по методу выделения и очистки' ПЛЧ двумя схемами, будут использованы для получения и наработки гормона в достаточных количествах, с целью разработки и внедрения имыуноферментннх тест-систем для количественного'определения гормона в циркуляции. Полученные результаты будут способствовать улуч пению работы и повышению качества диагностики в акушерстве и гинекологии, что позволит выявлению патологии на ранних сроках беременности, а такие снижению перинатальной смертности.

Апробация.работе. Материалы диссертации представлены в виде доклада и обсукдены на совместном заседании лабораторий Института экспериментальной эндокринологии и хиши гормонов АШ СССР (1989г.?

Публикации. По теме диссертации опубликовано . печатные работы.

. - б -

Объем и структура диссертации» Диссертация изложена на страницах машинописного текста и содержит таблиц и рисунков, Состоит из введения, литературного обзора, описания материалов и методов исследования, главы собственных результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы, насчитывающего отечественных и иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕШНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования.

Выделение и очистку плацентарного лактогена человека проводили модифицированным методом, разработанным в ншвей лаборатории, который включает а себя экстракцию плацентарной ткани в щелочных условиях, осаждение белка насыщенным раствором сульфата аммония, гидрофобную хроматографию плацентарного экстракта, ионообменную хроматографию. Заключительный этап ввделения гель-фильтрации на сефадексе C-I00,

Гидрофобную хроматографию проводили с использованием сорбентов: фенил-сефароза ( CL-4B " Pharmacia " Швеция) или фенил-си-ликагеля ("Фермент" СССР). Ионообменную хроматографию проводили на Toyopearl 650 М ("Toyo Soda", Япония). Гель-фильтрация на сефадексе C-I00 (" йгагвао1а " Швеция) или на Toyopearl HW-55 (" Toy о Soda" Япония).

Вертикальный электрофорез проводили в пластинах полиакрила-мидного геля в присутствии додецил-сульфата натрия по методу Лэмл-ли, используя 15/6 концентрацию акриламида для разделяющего геля.

Для иммунизации использовали морских свинок (самки) весом 250-300 г. Препарат вводили в дозе 100 миг с полным адьювантом Фрейнда подкожно в 5-6 мест в области окололопаточных лимфатичес-

ких узлов. Инъекции проводили с интервалом в 10 дней, используя группу по 5 животных. Интенсивность иммунного ответа определяли с помощью реакции Оухтерлони в агаровом геле с антисывороткой к гормону роста человека.

Сравнительный радиоиммунологический анализ мономера ПЛЧ и расщепленной формы гормона проводили в гомологичной системе, и а системе СТГ и пролактина, и определяли иммунореактивность их относительно друг друга.

Для сравнительного изучения лактагенной активности препаратов ПЛЧ использовали традиционный метод Utcoll , основанный на стимуляции гормоном пролиферации стенок зоба голубей при локальном внутрикожном введении препарата. Для каждой дозы гормона (10, 20,40 и 80 мкг) использовали группы по 7 голубей. Диаметр зоны пролиферации измеряли в каждой группе птиц и проводили статистическую обработку, вкчисляя среднее арифметическое, среднее квадратичное отклонение и ошибку средней арифметической для каждой дозы препарата. Используя эти значения, строили график прямолинейной регрессии, отражающий зависимость реакции от логарифма дозы гормона. Составив уравнение регрессии, вычисляли.соотношение активностей двух сопоставляемых препаратов.

Аминокислотный анализ гормонов проводили с использованием автоматического аминокислотного анализатора ( Biotronic, ФРГ) после гидролиза проб 5,7 н HCl в запаянных под вакуумом ампулах при П0°С ^течение 24 и 48 часов.

и -концевые аминокислоты идентифицировали по реакции с дан-сил-хлоридом с последующей хроматографией дансилпроизводных на полиамидных пластинах в 4 системах: I) вода - 90$ муравьинная кислота (100:1,5); 2) бензол - уксусная кислота (9:1); 3) н-геп-

тан-н-буганол-ледяная уксусная кислота (3:3:1); 4) этилацетат-метанол-ледяная уксусная кислота (10:1:1).

Определение аминокислотной последовательности гормона иров1 дили деградацией по методу Эдмана с идентификацией Н-концевых аминокислот в виде дансилпроизводных.

Результаты собственных исследований и их обсуждение.

Основные этапы модифицированного метода выделения и очистки ГШ4 можно представить в виде следующей схемы:

1) экстракция плацентарной ткани при рН 8,0-8,5»

2) Гидрофобная хроматография плацентарного экстракта при рН 8,3 на колонке с фенил-сефарозой или фенил-силикагелем.

3) ионообменная хроматография на Тоуореаг1 при рН 8,3.

4) Гель-фильтрация на сефадексе С-100 или ТоуореагХ Ы»-55 при рН 8,3.

5) лиофилизация материала.

Для исследования структурно-функциональных взаимоотношений в белковой молекуле, изучения физико-химических, иммунологических и биологических свойств, необходимо наличие высокоочищенного белка в достаточных для исследования количествах. Помимо этого,белок должен сохранить высокую биологическую активность и подвергаться минимальному действию денатурирующих агентов в процессе выделения, Для решения поставленной задачи нами были введены хроматографи-ческие приемы, дающие максимальную степень очистки уке на первых этапах выделения. Использование стадии гидрофобной хроматографии на первых этапах позволяет добиться 10-20 кратной очистки материа ла, максимально избежать потерь и провести выделение в достаточно мягких условиях во избежания денатурации и аггрегации материала.

Помимо этого,, четкое определение иммунологически активной фракции на данном этапе, способствует исключению лиофилизации на протяжении всей схемы ввделения, и позволяет достичь высокой степени очисч ки при минимальных затратах рабочего времени.

Выделенный препарат плацентарного лактогека человека полностью охарактеризован для проверки модифицированного метода выделения и очистки. Электрофорётическов исследование ПЛЧ показало высокую степень очистки гормона, в присутствии додецил-сульфат натрия препарат дает одну полосу на уровне 22-23 ВДа, судя по маркеру-стандарту, даже при значительной перегрузке дорожки (рис. I).

Рис. I. Электрофорез в ПААГ с ДСН.

I - ШИ,. полученный по модифицированной схеме ввделения, ^ 2 - маркеры молекулярных весов 45000 Да - овальбумин 25000 Да - хиыотрипсиноген 17800 Да - миоглобин 12300 Да - цитохром С.

- ю -

Мт-конце вые аминокислоты ПЛЧ определяли по реакции с дансил-хлоридом в ацетоне, с последующей хроматографией на полиамидных пластинах. Высокая степень гомогенности препарата была показана на хроиатографической картине дансилированного гормона. При исследовании обнаружен интенсивно флюоресцирующий ДНС-валин, причеи примечи других аминокислот на били выявлены даае при значительной перегрузке, полиамидной пластины ДНС-проиэводными.

Анализ аминокислотного состава ПЛЧ представлен на '¿абл. I, для сравнения полученных результатов, обозначены литературные данные. Для гормона наделенного ло модифицированной схема, характор-но наличие высокого содержания аспарагиновой, глотаниновой аминокислот, серина и-лейцина.

Дяя более полной характеристики полученного ПЛЧ, было/проведено биологическое тестирование, целью этого исследования являлось количественное определение активности гормона, выракенной в международных единицах, и сравнительный анализ с биологическим стандартом гормоном роста "человека (таб. 2). При обработке полученных данных, было сделано заключение, что лаитогенная активность плацентарного лактогена человека соответствует биологической активности СТГ, что полностью подтверздает литературные данные.

Таким образом, разработанный метод для выделения плацентарного лактогена человека, позволяет получить ьысокоочищенный препарат с высокой биологической активностью и высоким конечны;.] выходом в пределах 35-36 мг/кг плацентарной ткани.

На последнем зтапе выделения и очистки плацентарного лактоге-- на из плаценты человека при гель-фильтрации на колонне с сефадек-

.с 'чошслотшй состав ПЛЧ., полуденного модифицированным методом выделения.

Аминокислоты ПлЧ по иодиф.чци-цированной схеме ПЛЧ литературные данные

2гр 55 1,0

Ьуа 9,0 9Д

Н1о 6,6 7,0

Агз 8,6 ИД

Авр 22,4 22,0

51аг П,7 11,0

Зог 17,0 17,9

от 25,6 25,2

Рхо 5,2 5,1

м? 9,4 7,3

А1а 6,3 6,4

Су а 1,9 '2,6

т 8,6 ■ 7,2

Иа*. 6,8 5,6

11а 6,2 ' 7 ">

Хои 25,д ; 25,0 •

яуг 6,4 7,7

ГЬэ 10,5 . 10,7

•э

сом С-100 (рис. 2) или Гоуореаг! ОТ-55 (рис. 3), гормон разделялся на два пика. Материал I и 2 пика собирали отдельно и лиофи лизировали. •

Рис. 2. Гель-фильтрация плацентарного лактогена человека на коленке с сефадексоы 0-100 .в 0,1 Ы НН4НС03. Размер колонки 3,9 х 99 см. Фракции по 10 мл. Скорость элюции 100 мл/час.

Рис. _ело-

века на колонке с Тоуореаг1 НШ-55 в 0,1 1! ВН4НС03. Размер колонки 5 х 80 см. Скорость элюции 100 мл/час. Фракции по 10 мл.

Сравнительные данные по биологической активности плацентарного лактогена человека и гормона роста, полученные при обработке 7 значений в каядой ;руппе, соответствующей определенной дозе препарата (10, 20, 40 и

80 мкг)

Препарат

СТГ

ЛИ

Доза (в ыкг) 10 20

40

Средний диаметр зоны пролиферации (в мм) 8 II 14,5

Среднее квадратичное отклонение 1,27 2,07 2,55

Ошибка средней

арифметической 0,48 0,78 0,97

80 10 20 40 80 21,5 7 10,5 14,5 21,5

I

3,68 2,81 1,52 2,75 4,88 1,39 1,06 0,58 1,04 1,85

В качестве В-концевого остатка I пик имел дв§ аминокислоты вадин и лейцин, в отличии от единственного валина во 2 пике. Электрофорез в ПААГ с ДСН показал высокую степень чистоты препаратов I и 2 пиков, судя по маркерам-стандартам, молекулярная масса равнялась 23-24 ВДа и 22-23 ВДа соответственно. После восстановления дисульфидных связей^-меркаптоэтанолом материал 2 пика давал также одну полосу на уровне 22-23 ВДа, в отличии от I пика, который распадался на две полосы с молекулярной массой 15-16 ВДа "и 7-8 ВДа. (рис. 4).

При разработке модифицированного метода вццеления и очистки плацентарного лактогена материал первого пика однозначно отбра-

•• ' *

Рис. 4. Электрофорез в ПЛАТ в присутствии ДСН после восстановления £ -меркодтоэганолом. I,- ПИ 2 пик; 2 - ШИ I пик; 3 - маркеры-стандарты молекулярных гасс.

сывался в связи с наличие! двух и-концевых аминокислот, хртя при иммунодиффузш по методу Оухтерлони, с аитисывороткой к ШЕ1| препарат давал линии'преципитации. Результаты электрофорегическа-го исследования в ПААГ после восстановления дисульфидных связей £ -меркаптоэтанолом - наличие двух фрагментов с молекулярной массой 25-16 НДа и 7-8 ВДа, две П-кощевыз аминокислоты валин и лейцин, позволили сделать предположение, что материал I пика представляет собой расщепленную форму плацентарного лактогена человека, в отличии от 2 пика, который является мономером гормона.

С целью подтверждения наших предположений был проведен срав-

нителышй анализ аминокислотных составов мономера и расщепленной формы ПЛЧ. Данные по аминокислотному составу двух препаратов представлены в табл. 3.

Таблица 3.

АшиокислотниЛ состав ПЛЧ и расщепле: Г эй формы гормона.

Аминокислоты 1ШЧ Расщеплен-f пая форма ПЛЧ Амино'ис-1 лоты J ПЛЧ , Расщеплен ная^орма

Тгр Й а- Oly 13,9 15,1

1уа 9,2 . 8,8 Ala 13,3 15

Hia 5,2 5,1* Сув 1,9 2,0

Ar з 7,8 7,2 Val 10,4 11,6

Aap 21,6 20,0 Hot 6,5 5,9

Ihr 9,9 10,6 lie 6,2 5,8

■ 8er 14,2 13,8 Lau 26,3 24,0

Qlu 30,1 29,7 Туг 5,1 4,3

Pro 8,4 9,6 Phe 8,2 7,7

Аминокислотный состав мономера ПЛЧ очень сходен с расщепленной формой гормона, для обоих характерно высокое содержание аспа-рагиновой, глютаминовой аминокислот, лейцина и серина.

Анализ полученных результатов позволяет сделать вывод, что обнарукенная нами новая форма гормона в плаценте, действительно является расцепленной формой ПЛЧ, а не артефакт.

В последние годы в литературе появилось много сообщений от-

носительно структурных вариантов гормона роста человека и пролак-тина, являющихся близкородственными гормонами с 1ШЧ, для которого описаны только высокомолекулярная форма и димер. Таким образом, информация, полученная нами относительно новой формы плацентарно-, го гормона, служит еще одним подтверждением близкого родства с семейством гормона роста.

Следующим этапом нашей работы явилось исследование лактоген-ной активности расщепленной формы Ш1Ч, сравнение с мономером и биологическим стандартом гормоном роста человека, а далее сопоставление их относительно'друг друга по активности в равных дозах на каждой птице. В таблице 4 представлены основные статистически й данные, полученные при обработке 7 значений в каждой группе соответствующих определенной дозе препарата. Используя метод дисперсионного анализа, построены дозозависише^аинии регрессии и вычислены коэффициенты корреляции. На основании всех данных, полученных по биологическому тестированию на зобных железах голубей, сделано заключе,ие, что расщепленная форма Ш1Ч обладает повышенной лактогенной активностью в сравнении с мономером гормона и соматотропином (рис. 5). '

Сравнительное биологическое тестирование расщепленной формы ПЛЧ с пролактином овцы (32 Ш/мг) показало, что лактогенная активность первого намного ниже, чем у пролактина (данные не приводятся) . Таким образом можно сделать вывод, что расщепленная форма плацентарного лактогена человека обладает высокой лактогенной активностью, в 4 раза превышающей активность мономера и гормона роста человека. , "

Следующий этап - исследование иммунологической активности расщепленной формы ПЛЧ и сравнительный анализ с мономером в гомо-

Сравнительные данные по биологической активности 1ШЧ и расщепленной формы гормона, полученные при статистической обработке 7 значений в каждой группе, соответствующей определенной дозе препарата (10, 20, 40 и 80 мкг)

Препараты

ПЛЧ

Расщепленная фоьаа ПЛЧ

Доза (в мкг) 10 20 40 Ш 10 20 40 80

Средний диа- 7 10,5 14,5 21,5 30,1 33,5 36,6 40,У метр зоны пролиферации (в мм)

Среднее ква- 2,81 1,52 2,75 4,88 2,55 3,17 2,2 3,5 дратичное отклонение

Ошибка сред- 1,06 0,58 1,04 1,85 0,97 1,2 0,83 1,33 ней арифметической _____ ....

логичной системе. Помимо этого радиоиммунологическое исследование расщепленной формы ПЛЧ было проведено в системе пролактина и СТГ. Радиоиммунологическое тестирование в системе пролактина было проведено для исключения наличия фрагментов пролактина или самого гор ■ ыона у препаратов ПЛЧ, что можно было предположить на основании вы сокой биологической активности расщепленной формы ПЛЧ. Радиоиммуи>> логический анализ показал, что расщепленная форма ПЛЧ проявляет ыи кую иымунореактивность, составляя приблизительно Ъ% от активности мономера ПЛЧ (рис. 6).

Методом иммунодиффузии Оухтерлони было проведено определение чувствительности расщепленной формы ПЛЧ с антисьгвороткой к ПЛЧ, и

20

'Й м Ъ

ы'

Рис. 5. Дозозависише линии регрессии Ш1Ч, расщепленной формы 1Ш и СГГ. По оси абсцисс - логарифм дозы, по оси ординат - диаметр зоны пролиферации.

1 - плацентарный лактоген человека

2 - гормон роста человека

3 - расщепленная форма ДЛЧ.

сравнении с мономером. Сравнительный анализ этих двух форы при иммунодиффузии показал: . '

- нативный гормон сработал в разведении с антисывороткой 1/32 при

концентрации антигена 0,1 мкг/ыкл.

о ■ 1 '

- расщепленная форма Ш1Ч сработала в разведении с антисывороткой

1/8 при концентрации гормона 0,5 ыкг/мкл.:

Сравнивая полученные результаты мы пришли к выводу, что иммунологическая активность расщепленной формы 1ШЧ в 20 раз ниже ак-

Рис. б. Радаоинмунологическое определение Ш1Ч л ' "расщепленной формы гормона в системе РИА-ПЛЧ. ..

I - стандарт ПЛЧ; 2 - 11ДЧ выделенный по модифицированной схеме; 3 - расщепленная форма ПЛЧ.

тивности нативного гормона.

По данным электрофоретического исследования I пика - т.е. наличию двух фрагментов 16 ВДа и 8 ВДа после восстановления дисул! фидных связей, нами было сделано предположение, что расщепление по всей видимости происходит в большой диеульфидной петле гормона Для подтвероздения этого и приблизительного анализа места расщепли ния мы провели реакцию деградации по методу Эдмана двух пиков, по лученных после гель-фильтрации на последнем этапа выделения горми

на. Второй пик показал однозначно структуру плацентарного лакто-гена человека, с П-конца - валин, глутаминовая кислота, треонин. Первый пик - две и-концевые валин и лейцин, и после деградации по Эдману получили следующие пары аминокислот: глутаминовая кислота, она оказалась одной, и затем аспарагин и треонин. Такое сочетание аминокислот по всей структуре встречается в положении 128-130. Глутаминовая кислота одна, так как после первого шага Здмана присутствует во 2 и 129 положениях. Таким образом мы приш<-ли к выводу, что место расщепления в большой дисульфидной петле гормона между связью аргинин-лейцин 127-128 (рис. 7).

Для всестороннего сравнительного анализа свойств отдельных вариантов гормона, одним из необходимых условий является единая схема выделения и очистки для всех изучаемых форм. Поэтому полученные нами две формы гормона при помощи одного метода выделений позволило провести их прямое сравнение.

Совокупность полученных данных дает основание думать, что обнаруженная расщепленная форма плацентарного лактогена человека не образуется под влиянием условий выделения гормона, а является естественной физиологической формой, присутствующей в плаценте.

ВЫВОДЫ

1. Проведено ввделение ПЛЧ общепринятым методом.

2. Разработан метод ввделения плацентарного лактогена человека из плаценты в двух модификациях, позволяющий сократить время

выделения и повысить выход и чистоту препарата ПЛЧ.

о

3. Обнаружена расщепленная форма ПЛЧ, элвдрующаяся при гель-фильтрации на сефадексе С-ЮО или Тоуореах1 1ИГ-55 перед мономерной формой гормона, характеризующаяся высоким сходством аминокислО ного состава с мономерной формой ШН, наличием двух Н -концевых аминокислот: валяном и .имеющей;й6д?<сул^фную массу 23-24

КЦа и 7-8 кДа в присутствии ДСН посла обработки ^ -моркаптоэтано-лои.

4. Показано, что расщепленная форма ПЛЧ в биологическом тесте на зобе голубей обладает биологической активностью в 4 раза превышающая активность мономерной формы ПЛЧ,;

5. Установлено, что расщепленная форма ПЛЧ обладает Ь% иммунологической активности мономерной формы ПЛЧ при радиоиммунологическом определении в гомологичной системе.

6. На основании данных, полученных при установлении Н-конце-вой последовательности расщепленной формы ПЛЧ методом Эдмана, а также данных по молекулярной массе фрагментов, выявляемых при электрофоретическом исследовании в ПААГ в восстанавливающих условиях, высказано предположение о локализации места расщепления пептидной цепи у расщепленной форда ПЛЧ иевду остатками аргинина и лейцина в положении 127-128.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИЙ..

X. Крошка М.В., Караеев B.C. Новая расщепленная форма плацентарного лактогена человека. Тезисы Краевой научно-практической конференции хирургов, март 1990г. г.Ставрополь, стр. 219-223

2. Крошка Ы.В., Караеев B.C. Новая расщепленная форма Ш1Ч с повышенной, биологической активностью. Тезисы Краевой научно-прая тической конференции хирургов. Матр 1990 г., г". Ставрополь, стр. 223-228.