Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и изучение свойств клеточных рецепторов сывороточных белков трансферрина и альфа-фетопротеина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение свойств клеточных рецепторов сывороточных белков трансферрина и альфа-фетопротеина"

Р г в од

о г ИЮН 1997

На правах рукописи

КАНЕВСКИЙ ВЛАДИМИР ЮРЬЕВИЧ

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ КЛЕТОЧНЫХ РЕЦЕПТОРОВ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ ТРАНСФЕРРИНА И АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА

03. 00. 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1997

Работа выполнена в отделе биохимии Московского научно-исследовательского института медицинской экологии

доктор химических наук С. Е. Северин

кандидат биологических наук В. Ю. Катуков доктор биологических наук П. Г. Свешников кандидат химических наук А. Р. Хомутов

Центр биоинженерии РАН

Защита состоится 1997 года на заседании

Диссертационного Совета Д. 171. 02. 01. при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149, Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем РАЕН.

Автореферат разослан 1997 г.

Научные руководи тели:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

Ученый секретарь Диссертационного совета,

кандидат биологических наук В 0т*заднОВа

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы достигнут значительный успех в изучении и характеристике опухолевых маркеров, так как благодаря развитию техники биохимического анализа появилась возможность проведения быстрой очистки и характеристики сложных молекул. Проблема поиска и изучения опухолевых маркеров связана, во-первых, с изучением особенностей раковых клеток с целью выявления опухолеспецифических антигенов и, во-вторых, с исследованием содержания опухолеспецифических белков в биологических жидкостях для диагностики злокачественных заболеваний, контроля эффективности их лечения и прогноза течения болезни. Среди них наиболее известны и используются в клинике следующие маркеры: раковоэмбрионал&ный антиген (РЭА), углеводный антиген СА 19-9, опухолеассоциированный гликопротеин - 72 (ОАГ-72) для диагностики рака желудка; СА 125, ОАГ - 72 и маркер муцина 0VX 1 для диагностики рака яичников, гликопротеин СА 15-3 и РЭА для диагностики рака молочной железы; гликопротеин СА 19-9 для диагностики рака поджелудочной железы; простатаспецифический антиген (ПСА) для диагностики рака простаты; фрагмент цитокератина 19 CYFRA 21-1 и РЭА определяются при различных типах рака легкого, а нейроспецифическая енолаза (НСЕ) позволяет диагностировать мелкоклеточную карциному легкого, РЭА повышен при раке прямой и толстой кишки, альфа-фетопротеин (АФП)-для диагностики гепа-тоцеллюлярного рака печени, опухолей герминально-клеточного происхождения и эмбриональных карцином. Недостатком известных маркеров является тот факт, что, во - первых, все они в малых количествах (нг/мл) содержатся в здоровых тканях или биологических жидкостях, во - вторых, ни один из них не является универсальным для всех или хотя бы для большинства видов опухолей. Поэтому одной из актуальных задач ранней

диагностики злокачественных новообразований остается поиск опухолевых маркеров, универсальных для всех или хотя бы большого числа различных опухолей. Такой маркер может быть обнаружен среди белков, связанных с интенсивной пролиферацией клеток - рецепторов факторов роста и онкофе-тальных белков. В частности, известно, что экспрессия рецепторов трансферрина (ТФР) и альфа-фетопротеина (АФПР) резко увеличивается в интенсивно пролиферирующих клетках, к которым относятся эмбриональные и опухолевые клетки (Gatter К., 1983; Niitsu Y., 1987; Geuskens M., 1991; Naval G., 1985).

В последние годы появились работы, позволяющие полагать, что по уровню содержания таких рецепторов в биологических жидкостях организма возможна диагностика опухолевых заболеваний (Moro R.,1993). Для создания иммунодиагностических тест-систем для проведения скрининговых исследований содержания ТФР и АФПР в сыворотке крови и других биологических жидкостях больных при различных заболеваниях необходимо получение препаративных количеств этих белков в высокоочищенном состоянии. Поэтому разработка методов их выделения и очистки, а также их характеристика являются самостоятельными и весьма актуальными задачами.

Цель работы состояла в выделении и очистке рецепторов АФП и ТФ из тканей человека. В соответствии с этим в план работы входило:

1. Отработка наиболее оптимальных условий очистки;

2.Выбор и отработка критериев степени чистоты и активности получаемых препаратов;

3.Изучение свойств очищенных препаратов АФПР и ТФР

Научная новизна и практическая ценность. Выделены препараты рецепторов АФП и ТФ. Отработаны методы их очистки. Процесс очистки оптимизирован, достигнут высокий выход при высокой степени чистоты белков. Выход ТФР при использовании разработанного метода в пять раз превыша-

ет таковой при использовании методов, описанных в литературе. Изучены такие свойства рецептора ТФ как молекулярная масса, субъединичный состав, константа диссоциации. Проводится работа по получению монокло-нальных антител к ТФР. На их основе разрабатывается диагностический набор для определения ТФР в сыворотке крови при железодефицитных анемиях и других типах патологии крови.

Выделен, очищен до гомогенного состояния и охарактеризован рецептор АФП. Показано, что АФЛР является мембранным белком с молекулярной массой приблизительно 320-380 кДа и имеет несколько субъединиц: 62, 67. 130 и 200 кДа.

На основании иммунологического анализа методом иммуноблоттинга в составе рецептора АФП показано наличие двух АФП-подобных структур, предложена гипотетическая схема строения рецептора.

Разработанные методы и полученные результаты могут быть использованы как для создания тест - систем ранней диагностики онкологических заболеваний, так и для дальнейших исследований особенностей опухолевых процессов на уровне белков клеточной мембраны.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Апробация работы. Материалы работы были доложены на XXII конфе-ренциии IS0BM, September, 18-22, 1994, Groningen, The Netherlands;

International symposium on biology and clinical usefulness of tumor markers, February 8-11, 1995, Barcelona, Spain;

на европейском конгрессе по клинической химии, Tampere, Finland, 2-7 July, 1995;

на XXIII конференции ISOBM, September 10-13, 1995, Montreal, Canada;

на XVI конгрессе по клинической химии, London UK, 8-12 July,

1996.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследований и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего _

наименований.

Диссертационная работа изложена на __ страницах машинописного

текста, включая _ рисунков и ___ таблиц.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Материалы:

Hepes, HaJ04-фирмы Merck, трансферрин. CHAPS, Трис, Глицин, KCl, ингибитор трипсина из соевых бобов - фирмы Sigma, сефароза CL-6B -фирмы Pharmacia, нитроцеллюлоза - фирмы Costar, пероксидаза хрена-фирмы ООО "Импакт".

Методы:

Выделение АФП. АФП получали из ретроплацентарной сыворотки рожениц по методу, описанному в работе S.E.Severin и соавт. (1995).

Приготовление АФП-сефарозы и Тф-сефарозы. АФП и ТФ иммобилизовали на сефарозе-CL 6В, активированной периодатным методом (Fisher Е.А., 1988). Количество ТФ и АФП, иммобилизованных на сефарозу, составило приблизительно 1 мг бежа на 1 г сефарозы.

Выделение АФПР. 20 г эмбриональной ткани человека отмывали от кроЕИ и измельчали в гомогенизаторе Waring Blendor 3 раза по 1 минуте на максимальной скорости в гомогенизационном буфере (50 мМ Hepes pH 7.4, 100 шМ KCl, 2 мкг/мл ингибитор трипсина из соевых бобов, 50 мМ фенилметилсульфонилфторид), центрифугировали в течение 30 минут при 12000 об/мин, удаляли супернатант и осадок снова гомогенизировали и

центрифугировали. Гомогенизации и центрифугирование проводили 5 раз для удаления эндогенного АФП. Отмытый осадок гомогенизировали на Waring Blendor в гомогенизационном буфере с добавлением 1% цвиттерионно-го детергента CHAPS и обрабатывали ультразвуком 5 минут на дезинтеграторе Labsonic (Braun). Раствор перемешивали в течение 1 часа при температуре +4 °С и центрифугировали 30 минут при 12000 об/мин, к супер-натанту добавляли (NH4)2S04 до 50% насыщения и оставляли перемешиваться 1 час при +-4 0 С. Полученную суспензию центрифугировали 40 минут при 15000 об/мин, осадок растворяли в гомогенизационном буфере с 0.1% CHAPS (Буфер А) и диализовали с двумя сменами против того же буфера. Отдиализованный раствор наносили на колонку с АФП-сефарозой, предварительно уравновешенную буфером А.

Очистка АФПР. Экстракт, содержащий солюбилизированный АФПР, наносили на колонку в течение ночи, а затем промывали буферными растворами: 1) буфером А; 2) ОЛИ цитратом Na, pH 5, 0.1% CHAPS; 3) буфером А; 4) буфером А с IM KCl, которым элюируется АФПР.

Приготовление пероксидазных конъюгатов. Пероксидазные конъюгаты моноклональных антител к АФП (клоны 5Н7, 2АЗ, ЗЕ4) и АФП готовили пе-риодатным методом (D.Catt, 1991)

Гель-электрофорез белков. Электрофорез проводили по методу Laemm-li либо в градиенте ПААГ от 5 до 20%, либо в 1% ПААГ. В качестве стандартов использовали набор фирмы Pharmacia, содержащий белки: фосфори-лаза b - 94 кДа, бычий сывороточный альбумин (БСА) - 67 кДа, овальбу-мин - 43 кДа, карбоангидраза - 30 кДа, соевый ингибитор трипсина -20.1 кДа, лактальбумин - 14 кДа. Гель окрашивали нитратом серебра по методу Damerval С. (1937).

Иммуноблоттинг. Иммуноблоттинг белков проводили по методу D. Catt и соавт. (D.Catt,1991).

Хроматография. Для анализа чистоты и характеристики полученных препаратов АФПР проводили гель-фильтрацию препаратов на колонке Supe-rose-12 (Pharmacia, FPLC) в гомогенизационном буфере с IM KCl при скорости потока-0,7 мл/мин. Для калибровки колонки использовали гель-фильтрационные стандарты фирмы Pharmacia: тиреоглобулин - 669 кДа, ферритин - 440 кДа, альдолаза - 158 кДа, БСА - 67 кДа.

Иммуноферментный анализ. Характеристики связывания АФПР с АФП исследовали с помощью иммуноферментного анализа (D.Catt, 1991).

Выделение ТФР. Ткань плаценты человека, отмытую от крови (100 г влажной массы) измельчали в гомогенизаторе Waring Blendor 3 раза по 1 минуте на максимальной скорости в буфере (50 мМ Hepes pH 7.4, 100 мМ KCl.. 2 мкг/мл ингибитор трипсина из соевых бобов, 50 мкМ фенилметил-сульфонилфторид). Гомогенат центрифугировали в течение 30 минут при 12000 об/мин, удаляли супернатант и осадок повторно гомогенизировали и центрифугировали. Процедуру повторяли 5 раз для удаления эндогенного ТФ. Осадок измельчали в гомогенизационном буфере с добавлением 2% цвиттерионного детергента CHAPS и 5 минут обрабатывали ультразвуком на дезинтеграторе Labsonic (Braun). Гомогенат перемешивали в течение 1 часа при температуре +4 °С и центрифугировали 30 минут при 12000 об/мин, к супернатанту добавляли (NH4)2S04 до 50% насыщения и оставляли перемешиваться в течение 1 час при +4 °С. Полученную суспензию центрифугировали 40 минут при 15000 об/мин и собирали осадок, который растворяли в гомогенизационном буфере с 0,1% CHAPS (Буфер А) и диали-зовали с двумя сменами против того же буфера.

Очистка ТФР. Отдиализованный раствор, содержащий солюбилизирован-ный ТФР. наносили на колонку с ТФ-Сефарозой, предварительно уравновешенную буфером А. а затем промывали буферными растворами: 1) буфером

А; 2) О,1М цитратом Na, рН 5, 0.1% CHAPS: 3) буфером А; 4) буфером А с 1М КС1, которым элюируется ТФР.

Иодирование ТФ. Иодирование ТФ приводили по методу, описанному в работе W.Н. Evans (W.Н. Evans, 1987). Удельная радиоактивность 1251-ТФ составляла 1 MCi/ЗО мкл.

Измерение связывания-^-I- ТФ с солюбилизированным препаратом рецептора. Измерения проводили по методу Seligman, 1987, для этого солю-билизированный препарат рецептора в 580 мкл (40 нг) 50 мМ HEPES рН 7.4, 100 мМ КС1 инкубировали при 37°С в течение 30 минут с 1251-ТФ (от 2 до 20 нг) в 20 мкл такого же буфера. После инкубации смесь охлаждали до 4°С и добавляли 400 мкл холодного насыщенного раствора (NH4)2S04 до степени насыщения 40 %. Эту смесь затем центрифугировали при 25000g 30 минут при 4°С. Надосадочную жидкость аккуратно отбирали пастеровской пипеткой. Радиоактивность С251) измеряли в гамма-счетчике в пробирках. содержащих осадок. Так определяли общее связывание. Специфическое связывание 1251-ТФ определяли вычитанием значений неспецифического связывания из общего. Неспецифическое связывание получали добавлением 1000-кратного избытка немеченного трансферрина в каждую пробу параллельно с определением общего связывания.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для выделения и изучения АФПР и ТФР был разработан общий метод очистки мембранных белков-рецепторов из тканей человека, который включает три этапа: 1 - гомогенизация ткани; 2 - тщательное отмывание тканей от эндогенных лигандов; 3 - солюбилизация рецепторов с помощью цвиттерионного детергента CHAPS; 4 - выделение индивидуальных белков-рецепторов осуществляемое с помощью аффинной хроматографии, при которой в качестве аффинного сорбента используется связанный с сефаро-

зой природный лиганд рецептора (схема 1). При использовании данного метода возможно одновременное выделение рецепторов различных лигандов из одной порции ткани при последовательной аффинной хроматографии со-любилизированного препарата на колонках с различными сорбентами.

1. Гомогенизация ткани t

2. Многократное отмывание эндогенного лиганда рецептора

I

3. Солюбилизация рецептора с использованием CHAPS

*

Осаждение при 50% насыщении (NH4)2S04 f

Перерастворение и диализ

I

4. Аффинная хроматография на сефарозе с иммобилизованным

физиологическим лигандом рецептора

Схема 1. Схема выделения и очистки мембранных рецепторов

При выделении ТФР и АФПР первичная обработка ткани и гомогенизация в буферном растворе 50 мМ Hepes с рН 7,4, отмывка ткани от эндогенных лигандов, а также солюбилизация мембранных белков были полностью идентичны. Для разделения комплекса ТФ с ТФР и АФП с АФПР использовался 0.1М КС1, необходимый для разрушения комплексов лигандов ТФ и АФП с ТФР и АФПР, соответственно (Sarcione E.J., 1983).

Солюбилизация проводилась с использованием цвиттерионного детергента CHAPS, который имеет несколько важных преимуществ перед детергентами, которые чаще всего используются при выделении рецепторов

- и -

(Тритон-ХЮО, нонидет Р-40, дезоксихолат На, луброл и т.д.). Основными преимуществами CHAPS является отсутствие поглощения при 280 нм и то, что в отличие от тритона-ХЮО он не привносит ионных взаимодействий в белковую молекулу, так как является цвиттерионным детергентом, а также легко удаляется диализом. Кроме того, CHAPS не мешает сорбции антигена на планшет для иммуноферментного анализа. С этим детергентом белок хорошо хранится в растворе длительное время при температуре +4° С.

Солюбилизированные рецепторы осаждали при 50% насыщении (HH4)2S04, диализовали против гомогенизационного буфера, содержащего 0,1% CHAPS и наносили на колонки с АФП-сефарозой для АФПР и с ТФ-се-фарозой для ТФР в течение ночи при скорости потока 16 мл в час для лучшей сорбции.

2.Очистка и исследование свойств АФПР

При выделении АФПР на аффинной колонке с АФП-сефарозой использовалась промывка колонки буфером с рН 5 перед элюцией белка. В данном случае понижение рН необходимо для снятия неспецифически сорбированных на АФП-сефарозе белков из суспензии солюбилизированной мембранной фракции. Элюцию АФПР проводили гомогенизационным буфером с 0,1% CHAPS, 1М КС1 (рис.1). Высокая концентрация КС1 используется для полного разделения комплекса АФП с АФПР (Sarciorie E.J. ,1983).

Белок собирали (рисунок 1, пик Д), диализовали против PBS и анализировали с помощью электрофореза в 7% ПААГ и в градиентном электрофорезе 5-20% при различных условиях (рис.2:3).

Показано, что если рецептор обработан только SDS в присутствии хлороформа, на электрофореграмме появляются четыре мажорные полосы с

молекулярной массой 185 кДа, 120-130, 67 и 62 кДа (рис.2, дорожка 2).

А°280

0,40,30,20,1

п

А В С D 1 ill

il—I—i—i—i—i-

0 1 2 3 4 5 ЬРеИЯ.ЧАС

Рисунок 1. Профиль элюции белка с колонки с АФП-сефарозой после нанесения детергентного экстракта эмбриона человека. Стрелка А: буфер А ; стрелка В : 0,1 М цитрат натрия (рН 5,0) с 0,1 % CHAPS; стрелка С: буфер А: стрелка D : буфер А с 1М КС1. Объем фракции 5 мл.

Рисунок 2. Электрофорез препарата эмбрионального АФПР человека в 1% ПА-АПпик Д, рисунок 1). Дорожка 1 - белки-стандарты; дорожка 2 - АФПР невосстановленный, обработанный хлороформом; дорожка 3 - АФПР невосстановленный, необработанный хлороформом; дорожка 4 - АФПР восстановленный.

Это позволяет предположить наличие четырех субъединиц в молекуле АФПР:

62. 67. 120-130 и 185 кДа. Кроме того, вероятно, белок имеет липидное окружение и гликозилирован, так как если его не обрабатывать хлороформом, то в невосстановленном виде при окрашивании серебром белковые полосы практически не выявяются. В градиентном электрофорезе при обработке белка хлороформом и без восстанавливающего агента в области 280-300 кДа хорошо видна белковая полоса (Рис. 3, дорожка 1), что характерно для гликопротеинов с высоким содержанием углеводных цепей или липидов.

А В

1 2. ■i f*'1"' kDa i 2 kDa

( J Ё&З

Í¿S -94 - 94

188 -67 Ш' - 67

<!W-

я. -45 - 43

- 30 y"' ' - 30

- 20 . •..., ' - 20

-H - 14

Рисунок 3. Градиентный электрофорез в ПААГ 5-20% препаратов АФПР (пик Д рисунок 1) из эмбриональной (А) и опухолевой (В) тканей. Белок инкубировали в буфере без меркаптоэта-нола (невосстановленный) и с 5% меркаптоэтанолом при 80°С в течение 5 минут (восстановленный). Все препараты АФПР были предварительно обработаны хлороформом. Дорожка 1 -АФПСБ невосстановленный; 2 - АФПР восстановленный.

В восстановленной форме АФПР (после разрыва S-S связей), как видно из данных электрофореза (Рис.2, дорожка 4), большая субъединица ре-цепторной молекулы распадается на две белковые полосы в области 70 кДа. Скорее всего это дуплет 62 и 67 кДа, соответствующий описанному в литературе для АФПР (Laderoute М.Р., 1991, Moro R.,1993). Полученные результаты свидетельствуют о сложной субъединичной структуре АФПР. На рисунке 3 показана электрофореграмма градиентного электрофореза

АФПР, выделенного из эмбриональной (А) и опухолевой (В) тканей. Данная электрофореграмма показывает сходство субъединичной структуры АФПР, выделенного из эмбриональной ткани и АФПР из ткани рака молочной железы.

Анализ молекулярной массы рецептора проводился также методом гель-фильтрации в FPLC системе (Pharmacia) на колонке Superose-12 в буфере А с 1М КС1 (рис.4).

А°280НМ

0,2 -

0,15-

0,1

0,05.

0

1

А°280НМ

0,2-

0,15-

0,1-

0,05_

l l I I 40 80

Рисунок 4. Гель-фильтрация АФПР на колонке Superose-12 (FPLC, Pharmacia). А - стандарты фирмы Pharmacia, Буфер А, Объем пробь! - 200 мкл, скорость потока - 0,7 мл/мин, Б - АФПР.

МИ-

40 80 6РемЯ,МИН

При этом обнаружено несколько белковых пиков, соответствующих по молекулярной массе полосам на электрофорезе. Молекулярная масса пика 1 соответствовала 250-300 кДа; 2 - 120-130 кДа и 3 - 65-70 кДа. При дальнейшем исследовании до установления роли каждого из полученных белков в образовании АФПР эти белки сочли целесообразным называть АФП-связывающими белками (АФПСБ).

С помощью иммуноферментного анализа продемонстрировано специфическое связывание выделенных и очищенных препаратов АФПСБ с АФП, конь-югированным с пероксидазой хрена .

При исследовании взаимодействия этих белков с АФП обнаружено, что каждый из них (пики 1.2 и 3; рис.4) способен связываться с АФП, но

наиболее высокой АФП-связывающей активностью обладал белок пика 2. Таким образом обнаружено три типа АФПСБ с молекулярными массами 250-300; 120-130 и около 70 кДа, соответственно.

Уже более 15 лет назад появились факты, свидетельствующие о том, что в состав клеточных рецепторов входят такие молекулы, которые взаимодействуют не только с иммобилизованными лигандами, но и с иммобилизованными антителами к тем же лигандам (Кульберг А.Я., 1981). Поэтому было проведено исследование взаимодействия АФПСБ не только с АФП, но и с моноклональными антителами к АФП.

В таблице 1 показаны свойства трех разных клонов моноклональных антител (Мкат) к АФП, полученных в лаборатории гибридомной технологии МНИИМЗ (зав.лаб. к.б.н. В.К.Сологуб), которые использовались для окрашивания АФПСБ в иммуноблогтинге. В таблице приведена характеристика этих антител по перекрестному реагированию с АФП и сывороточным альбумином человека (САЧ) в ИФА. Клон 5Н7 взаимодействует как с АФП, так и с САЧ, клоны 2АЗ и ЗЕ4. взаимодействуют только с АФП. При исследовании взаимодействия этих клонов антител к АФП с АФПСБ показано, что при взаимодействии клона 5Н7 с разделенными с помощью электрофореза компонентами не обработанного меркаптоэтанолом АФПСБ окрашивается полоса в области 70 кДа (рисунок 5 А).

В АФПСБ, предварительно обработанном меркаптоэтанолом, ни одна из полос не окрашивается этими антителами. При взаимодействии в тех же условиях антител клона 2АЗ с АФПСБ наблюдается обратная картина (рис. 5 В). В невосстанавливающих условиях полосы отсутствуют, однако при воздействии меркаптоэтанола в области 65-70 кДа появляется одна полоса. Это свидетельствует о том, что без обработки меркаптоэтанолом антитела 5Н7 взаимодействуют с таким сайтом АФПСБ, который имеет общую детерминанту с АФП и САЧ и которая исчезает при обработке меркаптоэта-

нолом.

Таблица 1.

Характеристика моноклональных антител разных клонов к АФП.

Клоны Связывание с САЧ Связывание с АФП

5Н7 + +

2АЗ - +

ЗЕ4 - +

о А Б с

Рисунок 5. Анализ АФПСБ из эмбриональной ткани человека с помощью иммуноблоттинга. На нитроцеллюлозу переносили белки из геля после проведения электрофореза в 7% ПААГ. Дорожка 1 - АФПСБ невосстановленный; дорожка 2 - АФПСБ восстановленный. Дорожка 3 - АФП невосстановленный, дорожка 4 - АФП восстановленный. Перенесенные белки проявляли : А -антителами 5Н7 , В - антителами 2АЗ, С - антителами ЗЕ4, Д - АФП, меченным пероксидазой.

Мат 2АЗ взаимодействуют с АФПСБ только после обработки меркаптоэ-танолом. Антитела клона ЗЕ4 выявляют фрагмент 130 кДа до обработки меркаптоэтанолом, а после обработки МЭ-130 и 67 кДа (рис. 5 С), Это позволяет констатировать наличие АФП-подобной структуры в составе АФПСБ 130 и 70 кДа. Результаты проведения иммуноблоттинга представлены в таблице 2.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что АФПСБ, выделенные из эмбриональной и опухолевой тканей имеют сходство по электрофоретическим характеристикам. В состав АФПСБ входит высокомолекулярный (320-380 кДа) комплекс, имеющий три основные нековалентно связанные субьединицы. Причем в организации первой более крупной субъединицы 200-250 кДа важную роль играют Б-Б связи, так как их разрыв приводит к разделению этой субъединицы на фрагменты с молекулярными массами 62 - 67 кДа. В составе АФПСБ присутствуют, вероятно, как минимум, две различные субъединицы с близкой молекулярной массой 65-70 кДа. Одна субъединица имеет области, гомологичные АФП или САЧ, но в отличие от АФП, эта субъединица распадается при инкубации с меркаптоэ-танолом. Это говорит о том, что данная субъединица не является примесью АФП. АФПСБ, вероятно, гликозилирован и связан с липидами. При окрашивании АФПСБ конъюгатом АФП с пероксидазой в иммуноблоттинге показано взаимодействие АФП с белком 62-67 кДа в восстанавливающих условиях и 130 кДа без меркаптоэтанола, так как в условиях проведения иммуноблоттинга нативность комплекса АФПСБ 320-380 кДа теряется уже при обработке проб БОБ при проведении электрофореза (рисунок 5.0).

В иммуноферментном анализе показано, что константа диссоциации для АФПСБ, выделенного из эмбриональной ткани составляет 3x10"6М, а для АФПСБ, выделенного из опухолевой ткани - Зх10~7М (Рис.6).

Таким образом, разработан метод выделения и очистки мембранных

АФПСБ. Получены указания на сложную субъединичную структуру АФПР.

Взаимодействие разных клонов Мат к АФП с АФПСБ в иммуноблоттинге

Таблица 2

форма АФПСБ (Б-Б связи)

Клоны,АФП невосстанов. восстановл.

Мол.масса 1 :убъединицы

АФП* 130 кДа 70 кДа

5Н7 70 кДа —

2АЗ — 70 кДа

ЗЕ4 130 кДа 70;130 кДа

А°432нм

Рисунок 6. Иммуноферментный анализ АФПСБ. А-опухолевый АФПР; В-эмбриональный АФПР.

С использованием монооональных антител к АФП, меченных перокси-дазой, показано антигенное сходство АФПСБ из эмбриональной и опухолевой тканей (рак молочной железы), что позволит в последующем создать моноклональные антитела к рецептору АФП для исследования роли этого белка в процессах эмбриогенеза, регенерации и злокачественной трансформации.

Очистка, характеристика и исследование свойств ТФР

Рецептор трансферрина выделяли из плаценты человека. Первой стадией очистки была гомогенизация ткани и тщательная отмывка ее от растворимых белков, в том числе от эндогенного трансферрина. Далее гомоге-нат солюбилизировали в цвиттерионном детергенте CHAPS, белки осаждали при 50%-ом насыщении сульфатом аммония и после перерастворения в гомо-генизационном буфере наносили на аффинную колонку с ТФ-сефарозой. Для избирательной элюции ТФР были использованы условия, при которых осуществляется взаимодействие рецептора с ТФ и с трехвалентным железом при переносе железа в клетку ТФ (рисунок 7), а именно после отмывания

колонки от несвязавшихся белков экстракта.

А°гао ,

^^ А В С D

0,4-

0,2-

"It?

/

1 I 1

20 40 60

Рисунок 7. Злюция ТФР с колонки с ТФР-сефарозой после нанесения детергентного экстракта плаценты человека. Стрелка А: гомогениза-ционный буфер, содержащий 0,1% CHAPS; стрелка В : 0,1 М цитрат Na (рН 5,0) с 0,1 % CHAPS ; стрелка С : буфер А; стрелка D : буфер А с 1М КС1. Объем фракции 5 мл.

ВРЕМЯ, МИН

Рисунок 8. Электрофорез в 7% ПЛАТ препарата ТФР, полученного после очистки с помощью аффинной хроматографии на ТФР-Сефарозе. Дорожка 1 - ТФР восстановленный; дорожка 2 - ТФР невосстановленный; дорожка 3 - стандартные белки.

Меняли значение рН, промывая колонки О,1 M цитратом натрия рН 5. При этом значении рН из комплекса ТФР - ТФ - Fe3* выходит железо, но апотрансферрин сохраняет высокое сродство к рецептору. Далее после достижения базовой линии колонку промывали гомогенизационным буфером, содержащим 0,1 % CHAPS, и таким образом переводили рН колонки к физиологическим значениям (рН 7,4). При этом значении рН с колонки сходит небольшое количество трансферринового рецептора. На последней стадии (D - рисунок 7) чистый препарат ТФР элюировали гомогенизационным буфером, содержащим 0,1% CHAPS и 1М КС1 (рисунок 7). Выход белка составил 10-15 мг на 350-400 г плацентарной ткани. В то же время по литературным данным при выделении и очистке ТФР описанными методами выход ТФР составлял 2-3 мг на 400 г плацентарной ткани (G.J.Andersen, 1986). Таким образом, при использовании предлагаемого метода выделения ТФР его выход приблизительно в 5 раз выше, чем при выделении ранее описанными методами.

Полученный белок анализировали методом гель - электрофореза в 7 % ПААГ (рисунок 8) и гель-фильтрацией на колонке Superóse - 12 (FPLC)

{ 2. 3

(рисунок 9 ). С помощью электрофореза показано, что в полученном препарате белка ТФР составляет приблизительно 98 %. На рисунке 8 (дорожка 2) представлены данные электрофореза ТФР без добавления меркаптоэтано-ла, восстанавливающего S - S связи. Молекулярная масса невосстановленного бежа составляет 180 кДа. На дорожке 1 (рисунок 8) представлены данные электрофореза ТФР после обработки меркаптоэтанолом. Молекулярная масса такого белка составляет 95 кДа.

Полученные результаты свидетельствуют о субъединичной структуре ТФР и позволяют заключить, что ТФР содержит две идентичные субъединицы с молекулярными массами по 95 кДа, соединенные -S-S- связями.

На рисунке 9 представлены данные анализа выделенного препарата ТФР методом гель-фильтрации на колонке Superose-12 (FPLC). Значение молекулярной массы, определенное по результатам этого анализа подтверждает данные электрофореза и составляет 180 кДа.

Функциональную активность выделенного ТФР оценивали по его способности связывать 1251 - меченный трансферрин (рисунок 10). Константа диссоциации комплекса рецептора с трансферрином по данным анализа составила 6x10"9 М, что соответствует данным, приведенным в литературных источниках. По данным G.J.Andersen и соавт. Кд составляет 2,5хЮ"9М.

Таким образом разработан метод выделения препарата ТФР из плаценты человека, позволяющий получить высокоочищенный препарат ТФР, выход которого превышает получаемый с использованием ранее описанных методов приблизительно в 5 раз.

Данный препарат ТФР может быть использован в качестве антигена при получении моноклональных антител для создания тест - системы для диагностики различных заболеваний крови и других целей.

1MMF V

Рисунок 9. Гель-фильтрация ТФР на колонке Superose-12 (FPLC, Pharmacia). Гель-фильтрация в гомогенизационным буфере, содержащем 0,1% CHAPS, Стрелками указана подвижность стандартных белков: 1 - Тиреоглобулин - 660 кДа, 2 - каталаза - 230 кДа, 3 - альдолаза - 160 кДа, 4 - бычий сывороточный альбумин - 67 кДа; В - ТФР, объем пробы - 200 мкл, скорость потока -О,7мл/мин.

15 30 45 Ьремя ,мин.

Рисунок 10. Анализ функциональной активности препарата ТФР по его взаимодеис-твию с 1251 - меченым трансферрином. Специфическое связывание (кривая В) получили вычитанием из общего (А) связывание неспецифическое (С).

> т

I" ТРАНСФЬРРИН, НГ

ВЫВОДЫ

1. Разработан универсальный метод выделения и очистки мембранных белков-рецепторов АФП и ТФ, основанный на использовании детергента CHAPS в качестве солюбилизиругощего агента и аффинной хроматографии.

2. Показано, что АФПСБ, выделенные из эмбриональной и опухолевой тканей имеют сходство по электрофоретическим характеристикам. В состав АФПСБ входит высокомолекулярный (320-380 кДа) комплекс, имеющий четыре субъединицы. Три из них. нековалентно связанные и имеют молекулярные кассы 200-250 кДа; 120-130 кДа и около 70 кДа. Причем в организации первой более крупной субъединицы 200-250 кДа важную роль играют ди-сульфидные связи, так как их разрыв приводит к разделению этой субъединицы на фрагменты с молекулярными массами 62; 67 кДа.

3. Показано, что АФРСБ взаимодействует с различными моноклональ-ными антителами к АФП. В рецепторе присутствуют, вероятно, как минимум, две различные субъединицы с близкой молекулярной массой около 70 кДа. Одна из них имеет области, гомологичные АФП и САЧ.

4. Определены Кд комплекса АФПСБ-АФП из эмбриональной и опухолевой тканей, которые составляют ЗхЮ"6 и 3x10"7 И соответственно.

5. Использование нового метода позволило получить высокоочищенный препарат ТФР с молекулярной массой 180 кДа и Кд комплекса ТФР-ТФ, равной 5x10"9М, выход которого превышает, получаемые с использованием ранее описанных методов приблизительно в 5 раз.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. S.E.Severin, V.Yu. Kanevsky, V.K.Sologub, R.Nakachian and E.S.Severin, The purification of alpha-fetoprotein receptor from fetal

and cancerous tissues, ISOBM, XXIIng Meeting, 18-24, September, Groningen, The Netherlands, 1994, p.120.

2. S.E.Severin, V.Yu.Kanevsky, V.K.Sologub, R.Nakachian Yu.M.Luzhkov, E.S.Severin, Immunity to human alpha-fetoprotein recep tor is a model for study of anti-tumoral immunity. International sym posium on biology and clinical usefulness of tumor markers, 8-11, Feb ruary, Barcelona, Spain, 1995, p. 33.

3. H. Lahikainen, S. Severin, V. Sologub, V. Kanevsky, I. Koro mislova. Monoclonal antibodies to alpha-fetoprotein (AFP) iiraminologi cally reflecting human AFP-receptor, 11th IFCC European Congress o Clinical Chemistry, Tampere, Finland, 2-7 July, 1995, p. 737.

4. S.E. Severin, V.K. Sologub, V.Yu. Kanevsky, Yu.M. Luzhkov E.S. Severin, J. Frias Pena, R. Nakachian, J. Andreani, M. E. Severiria The mechanisms of alpha-fetoprotein receptor functioning, XXIIIrd Mee ting of the ISOBM, 10-13, September, Montreal, Canada, 1995, p.43.

5. E.S.Severin, V.Yu.Kanevsky, V.K.Sologub, Yu.M. Luzhkov, I.A.Ko romyslova, S.E.Severin, J.Frias Pena, R.Nakachian, J.Andreani, The na tural immunity against alpha-fetoprotein receptor ( AFPR ), XXIIIr Meeting of the ISOBM. September 10-13, Montreal, Canada, 1995, p.69.

6. S. Severin, V. Sologub, I.Posypanova, V. Kanevsky and M. Seve rina. Human alpha-fetoprotein receptor (AFPR) and antibodies to AFP as a tool for tumour screening, XVI Congress of Clinical Chemistr London UK, 8-12 July, 1996, p. 143.

7. V.Y. Kanevsky, L.P. Pozdnyakova, O.A. Aksenova, S.E. Severir V.Yu. Katukov, E.S. Severin, Isolation and characterization c AFP-binding proteins from tumor and fetal human tissues. Biochem. Mo] Biol. Int. 1997, (in press).

8. V.Yu. Kanevsky, L.P. Pozdnyakova, V.Yu. Katukov, S.E. Severir Isolation of the transferrin receptor from human placenta, Biochec Mol. Biol. Int., 1997, (in press).