Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и изучение физико-химических и функциональных свойств антимикробных пептидов из лейкоцитов павиана гамадрила

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение физико-химических и функциональных свойств антимикробных пептидов из лейкоцитов павиана гамадрила"

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Цветкова Елена Викторовна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ

ИЗ ЛЕЙКОЦИТОВ ПАВИАНА ГАМАДРИЛА

Рарю Ишпайгуаз Ь. /

03.00.04. - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2007

003055395

Работа выполнена на кафедре биохимии Санкт-Петербургского Государственного Университета и в лаборатории общей патологии Отдела общей патологии и патофизиологии ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН

Научный руководитель доктор биологических наук, профессор

Кокржов Владимир Николаевич

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Морозов Владимир Игоревич

доктор биологических наук Черныш Сергей Иванович

Ведущее учреждение. Институт эволюционной физиологии и биохимии им И.М Сеченова РАН

Защита диссертации состоится «_ » 2007 г. в час на заседании

диссертационного совета Д 212.232.09 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Санкт-Петербургском Государственном Университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А М. Горького Санкт-Петербургского Государственного Университета.

Автореферат разослан «_/££» ^¿/Д/'^Д-- 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

З.И. Крутецкая

Общая характеристика работы Актуальность проблемы Павиан гамадрил (Papio hamadryas), относящийся к семейству мартышкообразных, является низшей узконосой обезьяной, которая, наряду с макакой резус, наиболее широко используется в биологических и медицинских экспериментах, в том числе при изучении иммунитета при инфекционных заболеваниях. При моделировании инфекционных процессов на обезьянах необходимо учитывать, что защитные факторы низших обезьян могут отличаться от таковых человека. В этой связи несомненный интерес представляет изучение факторов врожденного иммунитета у низших обезьян и, в частности, катионных антимикробных пептидов (АМП) лейкоцитов крови. Согласно современным взглядам эти пептиды, которые у млекопитающих представлены, главным образом, дефенсинами и кателицидинами, являются одними из ключевых молекулярных компонентов системы врожденного иммунитета (Lehrer, Ganz, 2002). Среди высших приматов наиболее полно изучены а-дефенсины лейкоцитов крови человека (Schneider et al., 2005) У низших узконосых обезьян а-дефенсины из лейкоцитов крови были выделены, очищены и охарактеризованы по структурным и антимикробным свойствам только у макаки резус (Tang et al., 1999b). Поиск лейкоцитарных АМП у макаки резус привел, кроме того, к открытию нового подсемейства дефенсинов: 9-дефенсинов, которые по структурным и функциональным свойствам существенно отличаются от других АМП млекопитающих (Tang et al., 1999а; Leonova et al., 2001). Поиск новых представителей этого мало изученного, но весьма перспективного в плане разработки новых фармакологических препаратов, подсемейства дефенсинов у павиана гамадрила также представляется актуальным

Цель исследования. Целью настоящей работы были поиск и изучение физико-химических и функциональных свойств антимикробных пептидов из лейкоцитов крови павиана гамадрила.

Задачи исследования.

1 .Выделение и очистка антимикробных пептидов из лейкоцитов павиана гамадрила,

2 Изучение физико-химических и структурных свойств выделенных антимикробных пептидов;

З.Изучение функциональных свойств выделенных пептидов;

Научная новизна работы. В результате проведенного исследования из лейкоцитов крови павиана гамадрила выделены три новых антимикробных пептида PHD1-3 (Papio hamadryas defensin), первичная структура которых позволяет отнести их к подсемейству а-

дефенсинов Кроме того, выделены два других антимикробных пептида, которые по ряду физико-химических и функциональных свойств (молекулярная масса, аминокислотный состав, характер антимикробной активности) принадлежат к подсемейству б-дефенсинов Получены приоритетные данные об антимикробной активности выделенных пептидов т vitro. Впервые установлено, что а-дефенсин PHD3 павиана гамадрила и 0-дефенсин RTD-1 макаки резус взаимодействуют с цитоплазматической мембраной грамотрицательной бактерии Е coli различным образом Проанализирована гемолитическая активность а-дефенсинов и 6-дефенсино-подобных пептидов павиана гамадрила. Основные положения, выносимые на защиту.

1 Из лейкоцитов крови павиана гамадрила выделено и охарактеризовано по физико-химическим свойствам шесть катионных антимикробных пептидов' На основании результатов определения первичной структуры доказана принадлежность трех пептидов к семейству а-дефенсинов. Структурно-функциональный анализ двух пептидов позволяет отнести их к семейству б-дефенсинов.

2 а-Дефенсины PHD1-3 и 9-дефенсино-подобные Пептиды 2054 и 2047 павиана гамадрила являются эффективными антимикробными агентами с широким спектром микробоцидного действия.

З.а-Дефенсяны и 8-дефенсины взаимодействуют с цитоплазматической мембраной Е coli различным образом, что может свидетельствовать о разных механизмах бактерицидного действия изученных пептидов.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты исследования вносят вклад в понимание закономерностей возникновения и формирования разнообразия АМП дефенсинового семейства у приматов, в том числе и у человека. Полученные данные могут быть полезны при сравнительном изучении иммунитета при инфекционных заболеваниях у низших обезьян и человека. 9-Дефенсины низших обезьян, благодаря сочетанию широкого спектра антимикробной активности, низкой цитотоксичности и легкости синтеза, представляются перспективными для создания на их основе лекарственных препаратов

Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались на заседании Отдела общей патологии и патофизиологии ГУ НИИЭМ РАМН, кафедры биохимии СПбГУ, Ученого Совета НИИ физиологии им. Ухтомского в 2004-2006 гг., а также на научной конференции «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины» (Россия, Санкт-Петербург, 2000) и объединенном иммунологическом форуме (Россия, Екатеринбург, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано б научных работ, из них 1 статья в реферируемом журнале, 2 статьи в сборниках научных работ, 3 тезисов Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 142 страниц машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 237 источников, из них 227 - зарубежных авторов Работа проиллюстрирована 48 рисунками и 7 таблицами

Материалы и методы исследования Стабилизированная трилоном Б (конечная концентрация антикоагулянта 0.15%) цельная кровь обезьян, была получена из НИИ физиологии им ак И П. Павлова (Санкт-Петербург) от двух взрослых самок и одного самца павианов гамадрилов Рарю hamadryas и двух взрослых самок макак резусов Macaca mulatto

После гемолиза эритроцитов четырехкратным объемом 0,84% раствора хлорида аммония кровь центрифугировали при 400 g в течение 5 мин, после чего осажденную лейкоцитарную массу использовали для выделения АМП. К осадку лейкоцитарной массы добавляли 20 мл 10% уксусной кислоты (УК) и разрушали клетки гомогенизацией на холоду (+4°С). Клеточный гомогенат центрифугировали при 20000 g в течение 1 ч. Супернатант подвергали ультрафильтрации через фильтр с номинально отсекаемой молекулярной массой (НОММ) 10 кДа (фильтр «Amicon» УМ-10). Ультрафильтрат концентрировали на фильтре с НОММ 1 кДа (фильтр «Amicon» YM-1). Дальнейшее разделение фракций как ультрафильтрата, так и материала, не прошедшего через фильтр «Amicon» YM-10, осуществлялось методом препаративного электрофореза в ПААГ в кислой буферной системе (5% УК) в присутствии мочевины (Harwig et al, 1994) в аппарате для препаративного электрофореза («Вю-Rad», модель AG501-X8).

Окончательную очистку фракций, обладающих антимикробной активностью, осуществляли методом обратно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) на хроматографе «Gold System» (Beckman, США) Использовали хроматографические колонки (диаметр частиц сорбента 5мкм) «Alltech» С-4 (250x4 6 мм), «Alltech» С-18 (250x4.6 мм) и «Zorbach» С-18 (150x4 6 мм), уравновешенные либо 0.1% раствором трифторуксусной кислоты (ТФУ) (Merck, Германия), либо 0.15 мМ раствором тетрабутиламмония (Sigma, США), либо 0.13% раствором гептафтормасляной кислоты в воде. Пептиды элюировали линейным градиентом ацетонитрила (Вектон, Россия) либо от 0 до 60%, либо от 10 до 40% в течение 1 ч Пробы по 1 или 0.5 мл собирали на коллекторе фракций (Beckman SC, США) при скорости элюции 1 мл/мин.

На каждом этапе очистки проводили электрофоретический анализ препаратов в ПААГ в кислой буферной системе (Panyim, Chalkey, 1969) и в щелочной буферной системе в присутствии ДС-Na (Schagger, von Jagow, 1987).

Приблизительную оценку молекулярной массы пептидов с помощью электрофореза в денатурирующих условиях проводили по методу Вебера и Осборн (Weber, Osborn, 1969) Точные молекулярные массы пептидов определяли с помощью масс-спектрометрического анализа на времяпролетном масс-спектрометре Voyager DE (Perceptive Biosystem Inc , США) на базе Центра Коллективного Пользования фонда ТВН.

Возможное наличие дисульфидных связей в выделенных пептидах оценивали, окисляя их надмуравьиной кислотой (Marchmi et al., 1993). Чтобы определять количество присутствующих в молекуле остатков цистеина, а также число, образованных дисульфидных связей использовали метод их восстановления 1.4-дитиотриетолом и последующего алкилирования йодоуксусной кислотой (Sigma, США).

Определение аминокислотного состава выделенных пептидов проводилось сотрудниками университета Эмори (Атланта, Калифорния, США) на автоматическом аминокислотном анализаторе «Beckman Instrument Model 6300».

Определение аминокислотной последовательности в молекулах пептидов методом автоматической деградации по Эдману было выполнено на автоматическом секвенаторе «Porton Model 2090Е» в Калифорнийском университете Лос-Анджелеса (Лос-Анджелес, США) и в Научно-Учебном Центре Института биоорганической химии им. ММ. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (Москва) на секвенаторе «491 Precise» (РЕ Applied Biosystem, США)

Концентрации пептидов с неизвестной структурой определялись по методу Вулфа (Wolf, 1983). Концентрации пептидов с известной первичной структурой рассчитывали методом, предложенным Пейсом (Расе et al., 1985).

В качестве тест-микробов использовали грамотрицательную бактерию Escherichia coli, штамм ML-35p; грамположительные бактерии Listeria monocytogenes, штамм EGD и Staphylococcus aureus, штамм MRSA АТСС 33591; низший гриб Candida albicans, штамм 820.

Антимикробную активность пептидных фракций в экстрактах определяли методом наложения ПААГ с исследуемыми пептидами на агарозный гель, содержащий тестируемые микроорганизмы (Lehrer et al, 1991).

Для определения антимикробной активности индивидуальных фракций использовали метод радиальной диффузии пептидов в агарозном геле, содержащем

тестируемые микроорганизмы (Lehrer et al., 1991). При изучении влияния на антимикробную активность пептидов повышенной ионной силы среды в агарозный гель добавляли NaCl в конечной концентрации от 0 до 0.2 М. При изучении влияния на антимикробное действие пептидов pH среды, pH натрий-фосфатного буфера, используемого для приготовления агарозного геля, изменяли от 5.8 до 8.2 Для изучения влияния на антимикробную активность сывороточных белков в агарозный гель, содержащий микроорганизмы, была добавлена стерильная жидкая сыворотка крови эмбрионов коров (Биолот, Россия) в конечных концентрациях 5%, 10% и 15%.

Для определения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) тестировались последовательные разведения пептидов в 0.01% УК в два раза, начиная с 50 мкМ. МИК полученных пептидов определяли путем построения линейных регрессий зависимости антимикробной активности, определенной методом радиальной диффузии, от концентрации пептидов. Точка пересечения графика регрессии с осью абсцисс принималась за МИК.

Микробоцидное действие выделенных пептидов оценивалось методом подсчета выживших колониеобразующих единиц (КОЕ) после инкубации микроорганизмов с изучаемыми и контрольными пептидами

При изучении влияния пептидов на проницаемость внешней и цитоплазматической мембран грамотрицательной бактерии Ecoli ML35p оценивали увеличение проницаемости мембран бактерии для хромогенных маркеров - о-нитрофенил-ß-D-галактопиранозида, субстрата для фермента ß-галактозидазы, локализованного в цитоплазме бактерии и нитроцефина, субстрата для фермента ß-лактамазы, находящегося в периплазматическом пространстве (Lehrer et al., 1989) При нарушении целостности мембран они становятся проницаемыми для субстратов и продуктов ферментативных реакций За ходом ферментативных реакций можно наблюдать спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность при длине волны 486 нм (для продукта гидролиза нитроцефина) или 420 нм (для о-нитрофенола).

Для определения гемолитической активности выделенных пептидов суспензию

эритроцитов человека инкубировали с исследуемыми пептидами по стандартной

методике Положительным контролем (100% лизис) служил детергент Тритон Х-100,

отрицательным - 0.01% УК. Процент гемолиза подсчитывали по формуле:

г ,0/, ОР540 (проба)- ОР540 (отрицательный контроль)_

Гемолиз (%)=-г х 100%

OD540 (положительный контроль)- OD540 (отрицательный контроль)

Значение концентрации пептида, при которой вызванный гемолиз составлял 50% от

положительного контроля, принимали за 50% эффективную концентрацию (ЭК50).

а-Дефенсины кролика NP-1 и NP-2, дефенсин человека HNP-1 и протегрин свиньи PG-1 были получены из экстрактов лейкоцитарной массы (Harwig et al., 1993; Kokryakov et al., 1993). б-Дефенсин макаки резус RTD-1 был очищен из лейкоцитарной массы по той же схеме, что и АМП из лейкоцитов павиана гамадрила

Статистическую обработку результатов опытов проводили с использованием традиционных методов вариационной статистики. Представленные данные являются усредненными значениями (среднее ± стандартное отклонение), полученными в трех независимых экспериментах, каждый эксперимент проводился в трипликате. При обработке данных использован пакет программ Statistica 5 и Sigma Plot 9.0. Анализ гомологии полученных пептидов проводили с помощью программы CLUSTAL W (httpV/www.ebi ac.uk./clustalw).

Результаты исследования и их обсуждение 1.Выделение и очистка антимикробных пептидов из лейкоцитарной массы павиана гамадрила

Электрофоретический анализ уксуснокислых экстрактов из лейкоцитов павиана гамадрила в кислой буферной системе выявил наличие нескольких высокоосновных пептидных фракций по подвижности сравнимых с а-дефенсинами кролика NP-1-5 и умеренно катионных, сравнимых с а-дефенсинами человека HNP-1-3 (Рис.1, а). Тестирование их антимикробной активности методом наложения ПААГ на агарозные гели, содержащие микроорганизмы, показало, что эти фракции проявляют антимикробную активность в отношении бактерий Е coli и L monocytogenes (Рис. 1, б, в) После ультрафильтрации экстрактов через фильтр с НОММ 10 кДа ультрафильтрат подвергался фракционированию методом препаративного электрофореза (Рис.2). На рисунке видно, что наибольшую антимикробную активность проявляют фракции с №№ 44-48 и №№56-58 Эти фракции были подвергнуты ОФ ВЭЖХ, что позволило получить два высокоочщценных антимикробных пептида с молекулярными массами2054 Да и 2047 Да Препаративному электрофорезу был также подвергнут материал, не прошедший через фильтр (Рис 3) Из рисунка видно, что антимикробная активность проявляется в широком диапазоне фракций от №35 до №105. Из фракций с №№35-45 методами ОФ ВЭЖХ было очищено три антимикробных пептида с молекулярными массами 3939 Да, 3782 Да, 3725 Да и пептид с молекулярной массой 2054 Да, выделенный ранее из ультрафильтрата (Рис.4) Из фракций №№50-57 был выделен пептид с молекулярной массой 2047 Да, также обнаруженный ранее в ультрафштьтрате Наконец, из фракций №№78-105 был очищен еще один антимикробный пептид с молекулярной массой 3483 Да.

э б в

i з з t г з I 7

Рис.! а. Блок ПААГ после электрофореза экстрактов павиана гамадрила в кислой буферной системе в присугствие мочевины.

б, АгарозныЙ гель с культурой E.coli, после наложения геля а.

в. Агарозный гель с культурой L. monocytogenes, после наложения геля а.

1 и 2 - уксуснокислые экстракты лейкоцитов самца И самок павиана гамадрила соответственно; 3 - а-дефенсины кролика NP-1-5 (снизу вверх).

AiM

о.оз 1—

70

- А280

---L. monocytogenes \ '

- - E.coli

С albicans ^ 30

во :ао

Номера фракций

Рис .2, Профиль злюцнн ул ьтраф ил ьтрета УМ-10 с препаративной колонки ПААГ (сила тока 10 мА, скорость элю или 20 мл/ч) и антимикробная активность фракций в отношении 3-х микроорганизмов.

Аззп с. тс -

--A2S0

I )--E.coli

Д ' V1 --------[..monocytogenes

11.', У ..........С.albicans

ISC 20С

Номера фракций

Рис.3. Профиль элтоцик материала, не прошедшего через фильтр УМ-10 с препаративной КОЛОНКИ ПААГ (сила тока 20 ьлА, скорость элющш 20 мл/ч) и антимикробна активность фракций в отношении 3-х микроорганизмов.

apefc-j" слюцки ■ мн

этюции, мин

Рис 4 а Профиль элюции фракции №41 с колонки «Alltech» С-18, забуференной 0 1% раствором ТФУ в воде, линейным градиентом ацетонитрила от 0% до 60% за 1 час. Пик 1 содержит Пептид 3725 Да, пик 2 - Пептид 2054 Да, пик 3 - Пептид 3782 Да, пик 4 - Пептид 3939 Да. 6 Рехроматография пика 1 с колонки «Alltech» С-18, забуференной 0.15 мМ раствором тетрабутиламмония в воде, линейным градиентом ацетонитрила от 0% до 30% за 1 час в Рехроматография пиков 3 и 4 с колонки «Alltech» С-18, забуференной 0.1% раствором ТФУ в воде, линейным градиентом ацетонитрила от 10% до 40% за 1 час раствором тетрабутиламмония в воде, линейным градиентом ацетонитрила от 0% до 30% за 1 час Скорость элюции 1 мл/мин 2,Определение первичных структур выделенных пептидов

Электрофоретический анализ в кислой буферной системе нативных и окисленных надмуравьиной кислотой пептидов выявил наличие дисульфидных связей в молекулах всех шести пептидов. Для пептидов с молекулярными массами 3939 Да, 3782 Да и 3725 Да в лаборатории проф. Лерера в Калифорнийском университете Лос-Анджелеса были определены первичные структуры методом автоматической деградации по Эдману (Рис.5). Анализ первичных структур этих пептидов выявил консервативное расположение шести остатков цистеина, двух - глицина, двух - аргинина и глутаминовой кислоты, характерное для изученных ранее а-дефенсинов, что позволяет отнести эти пептиды к данному подсемейству дефенсинов (Lehrer et а]., 1993). В связи с этим мы им дали название PHD1-3 (Papio hamadryas defensm), порядковые номера присвоены в соответствие с электрофоретической подвижностью в направлении к катоду в ПААГ

РНШ. КК1СКСК1СНСЬОЬЕУУГвУСГЬНСКЬАЕРССК 3939 Да

РН02 Р1СКСК16НСЬСЬЕУ¥ГвУСГЬНСЛЬАНРССВ1 3782 Да

РНОЗ РТСРСКЬСЕСЗККЕЗУ5вЗСЫ1ЫвК1УЗЬССК 3725 Да

Рис 5. Первичные структуры а-дефенсинов павиана гамадрила РН01-3. Жирным шрифтом выделены инвариантные остатки аминокислот, свойственные всем представителям семейства а-дефенсинов

Анализ частичной N-концевой аминокислотной последовательности Пептида 3483, определенной в Институте биоорганической химии РАН в Москве, выявил сходство с а-дефенсином человека HNP-1, а определение количества дисульфидных связей методом их восстановления с последующим алкилированием показало наличие трех дисульфидных связей, что также характерно для а-дефенсинов. Анализ степени структурной гомологии PHD1-3 с а-дефенсинами других видов приматов, выявил, что PHD3 наиболее близок к RMAD-5 (90% гомологии), а-дефенсину лейкоцитов макаки резус, который в свою очередь проявляет сходство с HD-5, а-дефенсином человека продуцируемого клетками Панета в тонком кишечнике. Первичные структуры PHD1 и 2 оказались наиболее схожи с RED-1 (69% гомологии), одним из шести кишечных а-дефенсинов макаки резус. Таким образом, у павиана гамадрила, также как у макаки резус в отличие от человека в лейкоцитах крови экспрессируются гомологи как лейкоцитарных, так и кишечных а-дефенсинов человека.

Настоящее исследование было связано и с поиском у павиана гамадрила 9-дефенсинов, представители которых на уровне белкового продукта были найдены пока только у макаки резус. 9-Дефенсины макаки резус (RTD) имеют молекулярные массы около 2 кДа, состоят из 18 аминокислотных остатков (а о.), которые образуют уникальную макроциклическую структуру (Tang et al., 1999а). Предшественники 0-дефенсинов транслируются с двух различных мРНК и после их процессинга фрагменты, состоящие из 9 а о., образуют зрелую молекулу 9-дефенсинов посредством их соединения пептидными связями В ходе пост-трансляционной пептидной рекомбинации образуются как гетеродимерная RTD-1 (Tang et al, 1999), так и гомодимерные RTD-2 и RTD-3 изоформы

\~J. I

с-у-с-н-Е**

Пептид 2054

-сада»

C-I-C-R-I RTD-1

г*

Пептид 204"

Рис 6 Предполагаемые первичные структуры Пептидов 2054 и 2047 павиана гамадрила. Для сравнения приведены первичные структуры 9-дефенсинов RTD-1 и RTD-3 макаки резус. Справа приведена консенсусная последовательность молекулы 8-дефенсина (по Nguyen et al., 2003)

0-дефенсинов (Leonova et al, 2001) Нгуен и соавт. (Nguyen et al., 2003), проанализировав образцы ДНК 21 вида приматов, вывели консенсусную аминокислотную последовательность для 0-дефенсинов (Рис.6). Для пептидов с молекулярными массами 2054 Да и 2047 Да определение первичной аминокислотной последовательности классическим методом деградации по Эдману оказалось невозможным, что может служить косвенным подтверждением их макроциклической структуры Сравнительный анализ аминокислотного состава этих пептидов (состоящих из 18 а.о.) и RTD1-3, выявил сходство по парам: Пептид 2054 и RTD-1; Пептид 2047 и RTD-3 (Таб.1). На основании консенсусной последовательности и аминокислотного состава были предложены

предполагаемые первичные структуры для Пептидов 2054 и 2047 (Рис.6).

Аминокислота RTD1 RTD2 RTD3 Пептид 2054 Пептид 2047

Цис 6 6 б 6 €

Apr 5 6 4 8 4

Фен У 0 2 iE 2

Тре % 0 2 Я] 2

Вал а! 2 0 31 г

Гли 0 2 2 31 2

Лей i 2 0 0 0

Иле 0 2 ч 0

Таблица 1. Сравнительный анализ аминокислотного состава 0-дефенсинов макаки резус и 6-

дефенснно-подобных антимикробных пептидов павиана гамадрила З.Изучение функциональных свойств выделенных пептидов

Определение МИК выделенных пептидов показало, что они проявляют антимикробный эффект против 4-х тестируемых микроорганизмов в микромолярных

концентрациях (Таб 2). а-Дефенсины PHD1-3 и Пептвд 3483 схожи по характеру и

Микроб Ecoh L monocytogenes S aureus С albicans

Пептиды Среда без NaCl Среда + 0,1 М NaCi Среда без NaCl Среда + 0,1 М NaCl Среда без NaCl Среда + 0,1 М NaCl Среда без NaCl Среда + 0,1 М NaCl

PHD1 1.7±0 4 3 5±0 6 2 0±0.3 1.3±0.4 4 6±0 8 7.1±1.2 4.6±0.6 6 3±0 9

PHD2 1.7±0 2 3.4±0.5 1 5±0 4 1.3±0 3 4 1±1.0 14±3.4 2.5±1 0 5 6±1.2

PHD3 1 9±0.6 3 6±0.7 1.1±0 2 1.8±0.5 2 5±0.5 6 9±1 6 3.4±0.6 4.3±0.6

Пептид 3483 2 4±0 7 7 1±0 9 2 2±0 6 1 8±0.4 3.5±0.8 >50 3.9±0 7 >50

Пептид 2054 1.5±0 3 2.0±0.3 1 6±0 3 1 7±0 4 2.5±0.6 3 6±1 2 1.6±0.4 6 5±1 5

Пептид 2047 1 7±0 3 2 2±0 4 1.5±0 2 1.9±0 3 1.7±0 3 4 5±1.0 1.4±0.2 7.4±2.0

RTD-I 1.8±0.4 1 9±0 3 1 4±0.3 1 6±0 2 2.1±0 5 2 0±0.8 1 7±0 3 3.9±0.9

PG-1 1.2±0 2 1 0±0.3 0 9±0.2 0 9±0.2 1.2±0 3 1.1±0.2 1 1±0 2 1.5±0.3

NP-1 1 2±0 3 2 1±0.2 1.2±0 3 0.9±0 3 1.4±0.5 1.7±0.6 1 2±0.4 3.6±0.6

HNP-1 1.7±0 4 7 6±1.5 1 7±0 2 1,9±0 6 4 1±1 2 >25 2.6±0 8 >25

Таблица 2. Минимальные ннгибирующие концентрации выделенных антимикробных

пептидов (мкМ), определенные методом радиальной диффузии в среде, не содержащей №С1 и в присутствии 0.1 М

эффективности антимикробного действия с а-дефенсином человека HNP-1, a RTD-1 и 9-дефенсино-иодобные пептиды павиана гамадрила с дефенсином кролика NP-1 в средах, не содержащих NaCl При добавлении в агарозный гель 0 1 М NaCl активность RTD-1 и Пептидов 2054 и 2047 в отношении L monocytogenes, Е coli и S aureus практически не изменялась, в отношении С.albicans уменьшение активности было более заметным У а-дефенсинов павиана и человека в этих условиях увеличение МИК наблюдается не только в отношении С. albicans, но и в отношении Ecoli и S сшгеиг.Микробоцидное действие выделенных пептидов также оценивали методом подсчета выживших КОЕ после инкубации микроорганизмов с изучаемыми и контрольными пептидами Все выделенные пептиды проявляют бактерицидный и фунгицидный эффекты в микромолярных концентрациях. Показано, что при повышении содержания NaCl в среде, антимикробная активность 9-дефенсина RTD-1 и 9-дефенсино-подобних Пептидов 2054 и 2047 в отношении S aureus сохраняется, в то время как у а-дефенсинов снижается, в отношении Ecoli антимикробная активность 6-дефенсина RTD-I и 8-дефенсино-подобных Пептидов 2054 и 2047 несколько снижается, в то время как а- дефенсинов полностью ингибируется (Таб 3) Противогрибковая же активность в этих условиях ингибировалась у всех изучаемых пептидов

Также показано, что изменение pH среды в интервале от 5.8 до 8 2 не оказывает существенного влияния на антимикробную активность тестируемых пептидов Поскольку связывание АМП с мембранами микроорганизмов происходит, главным образом, за счет электростатического взаимодействия положительно заряженных а о. АМП с отрицательно

заряженными компонентами мембран (липополисахариды, фосфатидилглицерол,

Микроорганизм Содержание в агаоозном геле NaCl Пептиды

ОМ 0 1М 0 15М 0 2М

L. monocytogenes 1 0±0 3 0 8±0 3 0 8±0.3 0 8±0.2 NP-2

1.2±0,2 1 5±0 4 1 2±0 4 1.0±0 3 PHD3

1 2±0.3 1.3±0 5 1 1±0 3 1.4±0 4 RTD-1

1 4±0 3 1,4±0 5 1 0±0 3 2 0±0 5 Пептид 2054

Е coli 1 4±0 4 3 5±0 5 >25 >25 NP-2

2 2±0 5 3 9±0 5 >25 >25 PHD3

1 9±0 4 2 2±0.4 4 1±0.5 5 8±0 8 RTD-1

2 0±0 5 2 1±0.5 3 9±0 6 6 8±0 9 Пептил 2054

С albicans 1 0±0 3 3.9±0 7 >25 >25 NP-2

3 5±0 8 5 2±1 2 >25 >25 PHD3

1 9±0 3 4 5±0 6 >25 >25 RTD-1

1,6±0 4 4 9±0 7 >25 >25 Пептил 2054

S aureus 0 9±0 3 I 0±04 2 8±0 3 3.8±0 2 NP-2

2.0±0 6 5 2±0 7 5 6±0 4 8 0±0 3 PHD3

1.8±0 5 2 2±0 4 1 5±0 3 2 4±0 4 RTD-1

2 1±0 5 2 0±0 5 1 6±0.3 2 3±0 5 Пептид 2054

Таблица 3. Минимальные ингибирующие концентрации некоторых из выделенных

антимикробных пептидов (мкМ), определенные методом радиальной диффузии, в зависимости от содержания №аС1 в среде

Микроорганизм Соде ржание в агасозном геле сывооотки Пептиды

0% 5% 10% 15%

L monocytogenes 0 8±0 1 0 9±0 2 1 8±0.5 2 5±0 6 NP-2

1.2±0 3 3 6±0 8 3 2±0 2 >25 PHD3

0 9±0 2 1 1±0 2 1 7±0.5 4.3±0 9 RTD-1

1 1±0 3 1 3±0 2 1 5±0 4 3 8±0 8 Пептид 2054

Е coli 1 2±0 4 3 1±0 6 6 0±1.1 >25 NP-2

2.0±0 5 >25 >25 >25 PHD3

1 3±0 3 3 2±0 5 12 6±2 4 >25 RTD-1

1 5±0 4 4.2±1 0 15.2±3.2 >25 Пептид 2054

С. albicans 1 5±0 5 >25 >25 >25 NP-2

2 6±0 6 >25 >25 >25 PHD3

1.9±0 4 >25 >25 >25 RTD-1

1 8±0 3 >25 >25 >25 Пептид 2054

S aureus 1 1±0 2 1 7±0 3 3 8±0 4 3 7±0 5 NP-2

2 4±0 3 4.6±0 7 >25 >25 PHD3

2 0±0 4 5 6±0 5 7.6±0 7 7.8±0 9 RTD-1

2 1x0.3 4 3±0.5 6 3±0 6 6 9±0 8 Пептид 2054

Таблица 4. Минимальные ингибирующие концентрации некоторых из выделенных

антимикробных пептидов (мкМ), определенные методом радиальной диффузии, в зависимости от содержания в среде сыворотки крови

кардиолипин), сохранение суммарного положительного заряда в этом интервале pH должно способствовать и проявлению их антимикробной активности.

Тестирование антимикробной активности пептидов в присутствии сыворотки крови эмбрионов коров показало, что с увеличением концентрации сыворотки активность всех исследуемых пептидов уменьшается или даже полностью ингибируется (Таб.4) Не выявлено различий в изменении антимикробной активности между а- и 9-дефенсинами в этих условиях тестирования Для многих АМП известно, что они могут связываться с некоторыми белками сыворотки крови, что приводит к уменьшению антимикробной активности. Так, HNP-1 может связываться с ингибитором протеаз аг-макроглобулином (Panyutich, Ganz, 1991), с ингибиторами сериновых протеаз (серпинами), включая ai-ингибитор протеаз, ai-антихимотрипсин, аг-антиплазмин и антитромбин III (Panyutich et al, 1995) Полагают, что такое взаимодействие может предотвращать гемолиз эритроцитов и представлять защитный механизм организма против повреждающего воздействия собственных АМП.

Общепринято считать, что в основе бактерицидного действия многих АМП лежит их взаимодействие с цитоплазматической мембраной микроорганизмов, приводящее к нарушению ее целостности вследствие образования пор различной структуры. Как видно на рисунке 7, все исследуемые пептиды обладают способностью повышать проницаемость внешней мембраны Е coli, хотя и в различной степени В то же время, если а-дефенсины PHD3 и NP-2 и протегрин свиньи PG-1 вызывали увеличение проницаемости цитоплазматической мембраны, то 0-дефенсины не оказывали такого выраженного воздействия (Рис.8) Между тем эти пептиды в концентрации вдвое меньшей в первые 15

ь

1 ^ —•— контроль

М>-2

РНПЗ

—*— ГЬти 3483

70 мин

50 60 70 Время инкубации, мин

Рис 7. Кинетика изменения проницаемости наружной мембраны ЕсоН МЬ35р для хромогенного маркера (продукт гидролиза нитроцефина) при действии выделенных и контрольных антимикробных пептидов (концентрация пептидов 5 мкМ). В контрольную пробу вместо пептидов добавлен равный объем буфера

■ кошроль

■ ЫР-2 РШЗ /

■ Пегтгац 3483

$

„Г

40 50 60 70 Время инкубации, мин

50 60 70 Время инкубации, мин

Рис.8. Кинетика изменения проницаемости внутренней мембраны Е.соЬ МЬ35р для хромогенного маркера (продукт гидролиза о-нитрофенил-|3-0-галакгопиранозида) при действии выделенных и контрольных антимикробных пептидов (концентрация пептидов 5 мкМ). В контрольную пробу вместо пептидов добавлен равный объем буфера.

мин инкубации вызывают уменьшение количества жизнеспособных КОЕ на три порядка Вероятно, основной мишенью для поражающего действия а-дефенсина РНБЗ павиана гамадрила, также как и для некоторых других а-дефенсинов и протегрина РО-1, является именно цитоплазматическая мембрана. Механизм же микробоцидного действия 9-дефенсинов, по-видимому, отличается от такового а-дефенсинов и протегрина. Баффи и соавт. (Ви£(у й а1., 2004) с помощью методов ЯМР показали, что КЛТ)-1 и Рв-1 воздействуют на липидный бислой по-разному. Рв-! полностью его «прошивает», тогда

как RTD-1 связывается с поверхностью бислоя, возможно, вызывая образование так называемых «липидных цилиндров». Данные ЯМР свидетельствуют о менее выраженном воздействии на бислой RTD-1 по сравнению с PG-1, что согласуется с нашими данными по проницаемости мембраны Е coh. Это различие авторы связывают с отсутствием амфипатических свойств у молекулы RTD-1, которые присущи большинству изученных АМП Точные механизмы бактерицидного действия RTD-1 и других 9-дефенсинов пока остаются невыясненными

Наряду с этим показано, что выделенные пептиды (PHD3, Пептид 3483, Пептид 2054, Пептид 2047) не проявляют гемолитической активности в отношении эритроцитов человека в концентрациях, на порядок превышающих их МИК, что в сочетании с широким спектром антимикробной активности делает некоторые из этих пептидов перспективными для разработки новых лекарственных препаратов.

Выводы

1.Из лейкоцитов крови павиана гамадрила Рарю hamadryas выделены, очищены до гомогенного состояния и охарактеризованы по физико-химическим и структурным свойствам три а-дефенсина PHD1, PHD2, PHD3.

2 Пептиды с молекулярными массами 2054 и 2047 павиана гамадрила по совокупности физико-химических и антимикробных свойств можно отнести к семейству 0-дефенсинов

3.а-Дефенсины PHD1-3 и 9-дефенсино-подобные Пептиды 2054 и 2047 павиана гамадрила проявляют антимикробную активность в отношении грамположительных бактерий L monocytogenes и S aureus, грамотрицательной бактерии Е coli и низшего гриба C.albicans в микромолярных концентрациях, причем антимикробная активность а-дефенсинов PHD1-3 и 9-дефенсино-подобных Пептидов 2054 и 2047 различается в присутствии повышенных концентраций NaCl

4.Антимикробная активность а-дефенсина PHD3, 9-дефенсина RTD-1 макаки резус и 9-дефенсино-подобного Пептида 2054 павиана гамадрила не изменяется в широком диапазоне рН, но ингибируется при добавлении в среду сыворотки крови.

5 а-Дефенсин PHD3 павиана гамадрила, в отличие от 9-дефенсина RTD-1 макаки резус и 9-дефенсино-подобного Пептида 2054 павиана гамадрила, вызывает увеличение проницаемости внешней и цитоплазматической мембран грамотрицательной бактерии Е coh

б.а-Дефенсин PHD3 и 9-дефенсино-подобные Пептиды 2054 и 2047 павиана гамадрила не вызывают гемолиза эритроцитов при концентрациях, на порядок превышающих их минимальные ингибирующие концентрации.

Список публикаций по теме диссертации

1. Бородина Е В.. Алешина Г.М., Леонова JIЕ , Кокряков В.Н. Антибиотические пептиды нейтрофильных гранулоцитов обезьяны Papio hamadryas // Тезисы научн. конф. «Актуальные проблемы фундаментальных исследований в области биологии и медицины». СПб. Наука. 2000. С 25.

2. Кокряков В Н., Алешина Г.М, Шамова О В, Леонова Л.Е., Лодыгин П А, Цветкова Е В , Берлов М.Н., Краснодембская А.Д., Меныпенин А В Антибиотические пептиды как регуляторные молекулы // Сб. статей «Нервная система». Изд СПбГУ. 2004. Выл 37 С 52-63.

3. Цветкова Е.В. Алешина Г.М, Леонова Л.Е., Лерер Р.И., Кокряков ВН. Антимикробные пептиды нейтрофильных гранулоцитов обезьяны Рарю hamadryas // Тез докл. объединенного иммунологического форума. Russian Journal of Immunology. 2004. Vol 9. P 78.

4. Леонова Л E., Цветкова Е.В , Алешина Г.М, Орлов Д.С., Лерер Р.И, Кокряков В Н Циклические дефенсины обезьян Mmulatta и Р hamadryas И Материалы конгресса «Высокие технологии». Современные наукоемкие технологии. 2004 №4 С. 39.

5. Цветкова Е В . Алешина Г М., Леонова Л.Е., Шамова О В., Андреева Ю.В., Кокряков В.Н. а-Дефектны нейтрофильных гранулоцитов обезьяны P.hamadryas как молекулярные факторы врожденного иммунитета // Сб статей «Нервная система» Изд СПбГУ. 2005. Вып. 39. С. 178-182.

6. Цветкова Е В.. Алешина Г.М., Шамова О.В., Леонова Л.Е , Лерер Р.И., Кокряков В.Н. а-Дефенсины из лейкоцитов крови обезьяны Рарю hamadryas // Биохимия. 2006. Т. 71. Вып. 8. С. 1083-1090.

Подписано в печать 12.03.07. Формат 60x841/16.

Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. листов 0,93. Тираж 100 экз. Заказ № 8

ЦОП типографии Издательства СПбГУ 199061, С-Петербург, Средний пр., д.41.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цветкова, Елена Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 .Современные представления о врожденном иммунитете млекопитающих

1.1.1 .Системы распознавания врожденного иммунитета млекопитающих 13 1.1.2.Гуморальные и клеточные эффекторы врожденного иммунитета млекопитающих

1,2.Нейтрофильный гранулоцит в защитных реакциях организма

1.2.1 .Хемотаксис нейтрофильных гранулоцитов

1.2.2.Адгезия нейтрофильных гранулоцитов на поверхности объектов фагоцитоза 19 1.2.3.Эндоцитоз, формирование фаголизосомы, инактивация и киллинг фагоцитированных микробных клеток

1.3 .Микробоцидные факторы нейтрофильных гранулоцитов

1.3.1 .Кислородзависимые факторы инактивации микроорганизмов

1.3.2.Кислороднезависимые факторы инактивации микроорганизмов

1.4.Антимикробные пептиды как молекулярные факторы врожденного иммунитета млекопитающих 24 1.4.1 .Классификация антимикробных пептидов 24 1.4.2.Общие структурные особенности антимикробных пептидов млекопитающих и механизмы их антимикробного действия

1.4.3.Свойства антимикробных пептидов отличные от антимикробной активности

1.4.4.Гены антимикробных пептидов, их экспрессия и постгрансляционная модификация антимикробных пептидов млекопитающих 36 1.4.5.Экспрессия антимикробных пептидов в клетках и тканях организма млекопитающих

1.5.Антимикробные пептиды как возможные фармакологические агенты 45 2.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 46 2.1 .Получение лейкоцитарной массы, обогащенной нейтрофильными гранулоцитами 46 2.2.Экстрагирование катионных пептидов из лейкоцитов павиана гамадрила

2.3.Ультрафильтрация экстрактов

2.4.Выделение и очистка а-дефенсинов из экстракта лейкоцитов человека 47 2.4.Выделение и очистка а-дефенсинов из экстракта лейкоцитов кролика

2.5.Выделение и очистка тета-дефенсина ЯТТЫ из экстракта лейкоцитов макаки резус

2.6.Методы электрофоретического разделения и анализа пептидов

2.6.1 .Электрофорез в полиакриламидном геле в кислой буферной системе 48 2.6.2.Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия 48 2.6.3.Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле в кислой буферной системе

2.7.0бращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

2.8.Методы определения молекулярной массы пептидов 51 2.8.1 .Определение молекулярной массы методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия

2.8.2.0пределение молекулярной массы методом масс-спектрометрии МА1Л)1-ТОР

2.9.0пределение аминокислотного состава пептидов

2.10.Определение аминокислотной последовательности в молекулах пептидов 53 2.11.Определение наличия дисульфидных связей в молекулах пептидов с помощью окисления надмуравьиной кислотой 53 2.12.Определение количества дисульфидных связей в молекулах пептидов с помощью их восстановления и последующего алкилирования

2.13.Методы определения концентраций пептидов

2.14.Методы определения антимикробной активности пептидов 54 2.14.1.Микроорганизмы 54 2.14.2.0пределение антимикробной активности методом наложения гелей 55 2.14.3.Определение антимикробной активности методом радиальной диффузии пептидов в агарозном геле 56 2.14.4.0пределение минимальных ингибирующих концентраций пептидов 56 2.14.5.0пределение микробоцидного действия полученных пептидов 57 2.15.Определение влияния пептидов на проницаемость наружной и цитоплазматической мембран Е.соИ МЬ35р 57 2.1 б.Определение гемолитической активности пептидов 59 2.17.Статистическая обработка результатов 60 3 .РЕЗУЛЬТАТЫ 61 3.1.Получение лейкоцитарной массы обезьян, обогащенной нейтрофильными гранулоцитами

3.2.Выделение и очистка антимикробных пептидов из лейкоцитарной массы павиана гамадрила

3.3.Определение молекулярных масс выделенных пептидов методом масс-спектрометрии MALDI-TOF

3.4.0пределение наличия и количества дисульфидных связей в молекулах выделенных пептидов

3.5.0пределение аминокислотного состава выделенных пептидов

З.б.Определение первичной структуры выделенных пептидов

3.7.Выделение и очистка циклического О-дефенсина RTD-1 из экстракта лейкоцитов макаки резус

3.8.Изучение антимикробных свойств выделенных пептидов 85 3.8.¡.Определение минимальных ингибирующих концентраций выделенных пептидов 85 3.8.2 .Микробоцидное действие выделенных пептидов 90 3.8.3.Изучение влияния различных условий среды на антимикробную активность выделенных пептидов

3.8.Изучение влияния выделенных пептидов на проницаемость наружной и внутренней мембран Е. coli ML 3 5р

3.9.Изучение гемолитической активности выделенных пептидов в отношении эритроцитов человека 100 4.0БСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 102 4.1 .Получение лейкоцитарной массы обезьян, обогащенной нейтрофильными гранулоцитами 102 4.2.Выделение и очистка антимикробных пептидов из лейкоцитарной массы павиана гамадрила 102 4.3.Определение первичных структур выделенных пептидов павиана гамадрила

4.4.Выделение и очистка циклического 0-дефенсина RTD-1 из лейкоцитов макаки резус

4.5.Изучение антимикробных свойств выделенных пептидов 113 4.5.1.Определение минимальных ингибирующих концентраций и микробоцидной активности выделенных пептидов 113 4.5.2.Влияние различных условий среды на антимикробную активность выделенных пептидов 116 4.5.2.1.Изменение антимикробной активности выделенных пептидов в зависимости от содержания NaCl в среде

4.5.2.2.Изменение антимикробной активности выделенных пептидов в зависимости от pH среды

4.5.2.3.Изменение антимикробной активности выделенных пептидов при добавлении в среду сыворотки крови

4.6.Влияние выделенных пептидов на проницаемость наружной и внутренней мембран Е. coli ML 35p

4.7.Гемолитическая активность выделенных пептидов в отношении эритроцитов человека

5.ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и изучение физико-химических и функциональных свойств антимикробных пептидов из лейкоцитов павиана гамадрила"

Использование обезьян в разнообразных медико-биологических исследованиях обусловлено их уникальным биологическим сходством с человеком по ряду генетических и физиологических параметров, что делает их подчас незаменимыми экспериментальными животными. Одним из наиболее перспективных направлений использования обезьян в биомедицинских исследованиях является инфекционная патология. На обезьянах удается воспроизвести в относительно адекватной форме большое количество инфекционных заболеваний, присущих человеку, причем значительная часть таковых не воспроизводится ни на одном другом животном. Наиболее широко используются в экспериментальной медицине низшие узконосые обезьяны макака резус (Macaca mulatto) и павиан гамадрил (Papio hamadryas), относящиеся к семейству мартышкообразных приматов (Лапин и др., 1987). Основой изучения инфекционных заболеваний в опытах на обезьянах является создание и сравнительное исследование той или иной модели инфекции и установления сходства и различия с аналогичными заболеваниями человека. При моделировании инфекционных процессов на обезьянах необходимо учитывать, что защитные факторы низших обезьян могут отличаться от таковых человека. В этой связи несомненный интерес представляет сравнительное изучение факторов врожденного иммунитета у низших обезьян и человека, в частности, катионных антимикробных пептидов (АМП) лейкоцитов крови. Накопленные к настоящему моменту данные позволяют сделать вывод о том, что эти пептиды являются одними из ключевых молекулярных компонентов системы врожденного иммунитета млекопитающих (Кокряков, 2006; Bevins, 2003). Для понимания закономерностей их возникновения и отбора в процессе эволюции необходимо дальнейшее накопление знаний о структурных и функциональных свойствах АМП у разных видов животных. Несмотря на то, что общее число известных АМП постоянно растет и уже превысило 1000, количество изученных АМП млекопитающих относительно невелико (http://www.bbcm.univ.trieste.it/). Подавляющее большинство охарактеризованных пептидов у животных этого класса образуют два семейства: дефенсины (Lehrer et al., 1993) и кателицидины (Zanetti et al., 1995; Lehrer, Ganz, 2002). Среди высших приматов из лейкоцитарных АМП наиболее полно изучены а-дефенсины лейкоцитов крови человека (Schneider et al., 2005). Среди низших узконосых обезьян а-дефенсины из лейкоцитов крови были выделены, очищены и охарактеризованы по структурным и антимикробным свойствам только у макаки резус (Tang et al., 1999b). Поиск лейкоцитарных АМП у макаки резус привел, кроме того, к открытою нового подсемейства дефенсинов: 9-дефенсинов, которые по структурным и функциональным свойствам существенно отличаются от других АМП млекопитающих (Tang et al., 1999а; Leonova et al., 2001). Во-первых, 0-дефенсины являются макроциклическими пептидами, циклическая структура которых формируется пептидными, а не дисульфидными связями, как у d- и ß-дефенсинов. Ранее пептиды с такой макроциклической структурой были описаны только у бактерий (Salomon, Farias, 1992; Martinez-Bueno et al., 1994) и высших растений (Derua et al., 1996). Во-вторых, мРНК для пептидной цепи 0-дефенсина RTD-1 (rhesus thêta defensin) макаки резус (первого открытого представителя 9-дефенсинов) транскрибируется с двух различных генов и зрелая молекула пептида образуется в результате соединения пептидными связями двух молекул-предшественниц (Tang et al., 1999а). Таким образом, был открыт принципиально новый способ образования пептидных молекул посредством пост-трансляционной рекомбинации пептидов-предшественников. В третьих, молекулы 0-дефенсинов лишены амфипатичности, свойства, присущего практически всем известным АМП и, согласно современным воззрениям, необходимого для осуществления ими микробоцидной функции. Это может означать, что и механизмы антимикробного действия этих пептидов отличны от уже изученных.

Поиск новых АМП представляет интерес и с практической точки зрения, поскольку АМП животного происхождения могут послужить химическими матрицами новых антимикробных препаратов. Появление многочисленных микробных штаммов устойчивых к классическим антибиотикам заставляет искать новые классы антимикробных агентов. Широкий спектр антимикробной активности, которая сохраняется и при повышенном содержании в среде NaCl, низкая цитотоксичность в отношении клеток макроорганизма, небольшой размер молекул и легкость синтеза делает 0-дефенсины привлекательными объектами в этом смысле. Специальный интерес представляют антивирусные свойства 0-дефенсинов. Обладая способностью связывать гликопротеины вирусных оболочек 0-дефенсины in vitro предотвращают заражение клеток вирусами гриппа, герпеса, иммунодефицита человека. В настоящий момент активно и всесторонне изучаются антивирусные свойства ретроциклинов, химически синтезированных на основе знания структуры псевдогенов 0-дефенсинов человека, у которого трансляция этих пептидов невозможна из-за наличия стоп-кодона, локализованного в той части мРНК, которая кодирует сигнальную последовательность молекулы-предшественницы (Cole et al., 2004; Leikina et al., 2005).

Поскольку на уровне пептидного продукта 0-дефенсины были найдены пока только у макаки резус, представляет интерес поиск других представителей этого нового и недостаточно изученного подсемейства дефенсинов у родственных видов обезьян. Эти данные могут быть полезны для понимания закономерностей возникновения и формирования разнообразия АМП дефенсинового семейства у приматов, в том числе и у человека.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы были поиск и изучение физико-химических и функциональных свойств антимикробных пептидов из лейкоцитов крови павиана гамадрила. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи: 1 .Выделить и очистить до гомогенного состояния антимикробные пептиды из лейкоцитов павиана гамадрила;

2.Изучить физико-химические свойства, определить первичную структуру выделенных антимикробных пептидов;

3.Изучить антимикробные свойства выделенных пептидов в отношении тестовых микроорганизмов в зависимости от условий среды;

4.Изучить изменение проницаемости внешней и цитоплазматической мембран грамотрицательной бактерии E.coli под воздействием выделенных антимикробных пептидов;

5.Изучить гемолитическую активность выделенных пептидов в отношении эритроцитов человека.

Научная новизна

В результате проведенного исследования из лейкоцитов крови павиана гамадрила выделены три новых антимикробных пептида, относящихся к подсемейству а-дефенсинов и названных PHD1-3 (Papio hamadryas defensin). Получены приоритетные данные об антимикробной активности PHD1-3 в отношении грамположительных бактерий Listeria monocytogenes и Staphylococcus aureus, грамотрицательной бактерии Escherichia coli и низшего гриба Candida albicans, сопоставимое с антимикробной активностью а-дефенсина человека HNP1. Наряду с этим, выделены два новых антимикробных пептида, которые по ряду признаков (молекулярная масса, аминокислотный состав, характер антимикробной активности) принадлежат к недавно открытому подсемейству 0-дефенсинов. Определены минимальные ингибирующие концентрации выделенных 9-дефенсиноподобных пептидов павиана гамадрила в отношении 4-х микроорганизмов, в том числе и в зависимости от различных условий среды. Впервые показано, что а-дефенсины и 0-дефенсин 1Ш)-1 макаки резус взаимодействуют с цитоплазматической мембраной грамотрицательной бактерии Е.соН различным образом. Получены данные о гемолитической активности выделенных пептидов. Предложен метод получения 9-дефенсина ИЛТИ макаки резус и 0-дефенсиноподобных пептидов из лейкоцитов крови павиана гамадрила.

Основные положения, выносимые на защиту

1.Из лейкоцитов крови павиана гамадрила выделено и охарактеризовано по физико-химическим свойствам шесть катионных антимикробных пептидов. На основании результатов определения первичной структуры доказана принадлежность трех пептидов к семейству а-дефенсинов. Структурно-функциональный анализ двух пептидов позволяет отнести их к семейству 0-дефенсинов.

2.а-Дефенсины РНБ1-3 и 9-дефенсино-подобные Пептиды 2054 и 2047 павиана гамадрила являются эффективными антимикробными агентами с широким спектром микробоцидного действия.

3.Антимикробная активность а-дефенсинов РН01-3 и 9-дефенсино-подобных Пептидов 2054 и 2047 павиана гамадрила различается в присутствии повышенных концентраций

4.Антимикробная активность а-дефенсина РШ)3 и 0-дефенсино-подобного Пептида 2054 павиана гамадрила не изменяется в широком диапазоне рН, но ингибируется при добавлении в среду сыворотки крови.

5.а-Дефенсины и 0-дефенсины взаимодействуют с цитоплазматической мембраной Е.соН различным образом.

6.а-Дефенсин РШ)3 и 9-дефенсино-подобные Пептиды 2054 и 2047 павиана гамадрила не вызывают гемолиза эритроцитов человека при концентрациях, на порядок превышающих минимальные ингибирующие концентрации.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 142 страниц машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы из 237 источников, из них 227 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 48 рисунками и 7 таблицами.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Цветкова, Елена Викторовна

выводы

1.Из лейкоцитов крови павиана гамадрила Papio hamadryas выделены, очищены до гомогенного состояния и охарактеризованы по физико-химическим и структурным свойствам три а-дефенсина PHD1, PHD2, PHD3.

2.Пептиды с молекулярными массами 2054 и 2047 павиана гамадрила по совокупности физико-химических и антимикробных свойств можно отнести к семейству 9-дефенсинов.

3.а-Дефенсины PHD1-3 и 9-дефенсино-подобные Пептиды 2054 и 2047 павиана гамадрила проявляют антимикробную активность в отношении грамположительных бактерий L.monocytogenes и S.aureus, грамотрицательной бактерии E.coli и низшего гриба С.albicans в микромолярных концентрациях, причем антимикробная активность а-дефенсинов PHD1-3 и 0-дефенсино-подобных Пептидов 2054 и 2047 различается в присутствии повышенных концентраций NaCl.

4.Антимикробная активность а-дефенсина PHD3, 0-дефенсина RTD-1 макаки резус и 9-дефенсино-подобного Пептида 2054 павиана гамадрила не изменяется в широком диапазоне pH, но ингибируется при добавлении в среду сыворотки крови.

5.а-Дефенсин PHD3 павиана гамадрила, в отличие от 9-дефенсина RTD-1 макаки резус и 9-дефенсино-подобного Пептида 2054 павиана гамадрила, вызывает увеличение проницаемости внешней и цитоплазматической мембран грамотрицательной бактерии E.coli.

6.а-Дефенсин PHD3 и 6-дефенсино-подобные Пептиды 2054 и 2047 павиана гамадрила не вызывают гемолиза эритроцитов при концентрациях, на порядок превышающих их минимальные ингибирующие концентрации.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цветкова, Елена Викторовна, Санкт-Петербург

1. Кокряков В.Н. Очерки о врожденном иммунитете // СПб. Наука. 2006. Стр. 261.

2. Лапин Б.А., Джикидзе Э.К., Фридман Э.П. Руководство по медицинской приматологии // М. Медицина. 1987. Стр. 192.

3. Пигаревский В.Е. Лизосомально-катионный тест // Патол. Физиол. Эксперим. Терапия. 1975. № 3. Стр. 86-88.

4. Плескач В.А., Алешина Г.М., Арцыбашева И.В., Шамова О.В., Кожухарова И.В., Гойло Т.А., Кокряков В.Н. Цитотоксическое и митогенное влияние антимикробных пептидов нейтрофилов на культивируемые клетки // Цитология. 2000. Т. 42. Стр. 228-233.

5. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. Нейтрофилы. Моноциты/макрофаги // СПб. Наука. 2000. Стр. 231.

6. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология // М. Медицина. 2002. Стр.536.

7. Шамова О.В., Лесникова М.П., Кокряков В.Н. и др. Действие дефенсинов на уровень кортикостерона в крови и иммунный ответ при стрессе // Бюл. Эксперим. Биол. Мед. 1993. Т. 115. Стр. 646-649.

8. Шубич М.Г., Авдеева М.Г., Вакуленко А.Д. Адгезивные межклеточные взаимодействия // Арх. патолог. 1997. Т. 59. Стр. 3-9.

9. Янковский О.Ю. Токсичность кислорода и биологические системы // СПб. Наука. 2000. Стр. 294.

10. Ярилин А.А. Основы иммунологии // М. Медицина. 1999. Стр. 608.

11. Abraham S.N., Arock М. Mast cells and basophils in innate immunity // Sem.Immunol. 1998. Vol. 10. P. 373-381.

12. Abuja P.M., Zenz A., Trabi M., Craik D.J., Lohner K. The cyclic antimicrobial peptide RTD-1 induces stabilized lipid-peptide domains more efficiently than its open-chain analogue // FEBS Letters. 2004. Vol. 566. P. 301-306.

13. Agerberth В., Gunne H., Odeberg J., Kogner P., Boman H.G., Gudmundsson GH. FALL-39, a putative human peptide antibiotic, is cysteine-free and expressed in bone marrow and testis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 195-199.

14. Akira S., Taga T., Kishimoto T. Interleukin-6 in biology and medicine // Adv. Immunol. 1993. Vol. 54. P. 1-78.

15. Ayabe T., Satchell D.P., Wilson C.L., Parks W.C., Selsted M.E., Ouellette A.J. Secretion of microbicidal alpha-defensins by intestinal Paneth cells in response to bacteria // Nat. Immunol. 2000. Vol. 1. P. 113-118.

16. Bals R., Wang X., Meegalla R.L., Wattler S., Weiner D.J., Nehls M.C., Wilson J.M. Mouse beta-defensin 3 is an inducible antimicrobial peptide expressed in the epithelia of multiple organs // Infect. Immun. 1999a. Vol. 67. P. 3542-3547.

17. Bals R., Weiner D.J., Meegalla R.L., Wilson J.M. Transfer of a cathelicidin peptide antibiotic gene restores bacterial killing in a cystic fibrosis xenograft model. J. Clin. Invest. 1999b. Vol. 103. P. 1113-1117.

18. Becker M.N., Diamond G., Verghese M.W., Randell S.H. CD14-dependent lipopolysaccharidc-induced beta-defensin-2 expression in human tracheobronchial epithelium // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 29731-29736.

19. Befus A.D., Mowat C., Gilchrist M., Hu J., Solomon S., Bateman A. Neutrophil defensins induce histamine secretion from mast cells: Mechanisms of action // J. Immunol. 1999. Vol. 163. P. 947-953.

20. Bellm L., Lehrer R.I., Ganz T. Protegrins: New antibiotics of mammalian origin // Expert. Opin. Investig. Drugs. 2000. Vol. 9. P. 1731-1742.

21. Bevins C.L., Jones D.E., Dutra A., Schaffzin J., Muenke M. Human enteric defensin genes: chromosomal map position and a model for possible evolutionary relationship // Genomics. 1996. Vol. 31. P. 95-106.

22. Bevins C.L. Antimicrobial peptides as effector molecules of mammalian host defense. // Contrib. Microbiol. 2003. V. 10. P. 106-148.

23. Blond A., et al. The cyclic structure of microcin J25, a 21-residue peptide antibiotic from Escherichia coli 11 Eur. J. Biochem. 1999. Vol. 259. P. 747-755.

24. Boman H.G. Peptide antibiotics and their role in innate immunity // Annu. Rev. Immunol. 1995. Vol. 13. P. 61-92.

25. Borregaard N., Cowland J.B. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte //Blood. 1997. Vol. 89. P. 3503-3521.

26. Buffy J.J., McCormick M.J., Wi S., Waring A., Lehrer R.I., Hong M. Solid-state NMR investigation of selective perturbation of lipid bilayers by cyclic antimicrobial peptide RTD-1 // Biochemistry. 2004. Vol. 43. P. 9800-9812.

27. Bulet P., Dimarcq J.L., Hetru C. et al. A novel inducible antibacterial peptide of Drosophila carries an O-glycosylated substitution // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 1489314897.

28. Bulet P., Stocklin R., Menin L. Anti-microbial peptides: from invertebrates to vertebrates // Immunol. Rev. 2004. Vol. 198. P. 169-184.

29. Butterworth A.E. The eosinophil and its role in immunity to helminth infection // Curr.Top.Microbiol.Immunol. 1977. Vol. 77. P. 127-168.

30. Cabiaux V., Agerberth B., Johansson J., Homble F., Goormaghigh E., Ruysschaert J.M. Secondary structure and membrane interaction of PR-39, a Pro+Arg-rich antibacterial peptide // Eur. J. Biochem. 1994. Vol. 224. P. 1019-1027.

31. Campanelli D., Demetrs P.A., Nathan C. F., Gabay J.E. Azurocidin and a homologus serine protease from neitrophils. Differential antimicrobial and proteolytic properties // J. Clin. Invest. 1990. Vol. 85. P. 904-915.

32. Ceccarelli A.V., Cole A.M., Park A.K., Tahk S., Yoshioka D., Ganz T. Therapeutic effect of a pig-derived peptide antibiotic on porcine wound infections // Comp. Med. 2001. Vol. 51. P. 75-79.

33. Charlet M., Chernysh S., Philippe H. et al. // Innate immunity. Isolation of several cysteine rich antimicrobial peptides from the blood of a mollusk Mytilis edulis II J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 21808-21813.

34. Chitnis S.N., Prasad K.S. Seminalplasmin, an antimicrobial protein from bovin seminal plasma, inhibits peptidoglycan synthesis in Escherichia coli II FEMS Microbiol. Lett. 1990. Vol. 60. P. 281-284.

35. Cole A.M., Ganz T., Liese A.M., Burdick M.D., Liu L., Stricter R.M. Cutting edge: IFN-inducible ELR-CXC chemokines display defensin-like antimicrobial activity // J. Immunol.2001. Vol. 167. P. 623-627.

36. Cole A.M., Shi J., Ceccarelli A., Kim Y.H., Park A., Ganz T. Inhibition of neutrophil elastase prevents cathelicidin activation and impairs clearance of bacteria from wounds // Blood. 2001. Vol. 97. P. 297-304.

37. Cole A.M., Hong T., Boo L.M., Nguyen T., Zhao C., Bristol G. Retrocyclin: a primate peptide that protect cells from infection by T- and M-tropic strains of HIV-1 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2002. Vol. 99. P. 1813-1818.

38. Cole A.M., Wang W., Waring A.J., Lehrer R.I. Retrocyclins: using past as prologue // Curr. Protein Pept. Sci. 2004. Vol. 5. P. 373-381.

39. Craik D.J., Daly N.L., Bond T., Waine C. Plant cyclotides: a unique family of cyclic and knotted proteins that defines the cyclic cystine knot structural motif // J. Mol. Biol. 1999. Vol. 294. P. 1327-1336.

40. Daher K.A., Selsted M.E., Lehrer R.I. Direct inactivation of viruses by human granulocyte defensins // J. Virol. 1986. Vol. 60. P. 1068.

41. Dathe M., Wieprecht T. Structural features of helical antimicrobial peptides: their potential to modulate activity on model membranes and biological cells // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1462. P. 71-87.

42. Dathe M., Nikolenko H., Meyer J., Beyermann M., Bienert M. Optimization of antimicrobial activity of magainin peptides by modification of charge // FEBS Lett. 2001. Vol. 501. P. 146-150.

43. Derua R., Gustafson K.R., Pannell L.K. Analysis of the disulfide linkage pattern in circulin A and B, HIV-inhibitory macrocyclic peptides // Bioch.Bioph.Res.Com. 1996. Vol. 228. P. 632-638.

44. Diamond G., Bevins C.L. P-Defensins. Endogenous antibiotics of the innate host defense response // Clin. Immunol. Immunopathol. 1998. Vol. 88. P. 221-225.

45. Diamond G., Kaiser V., Rhodes J., Russell J.P., Bevins C.L. Transcriptional regulation of p-defensin gene expression in tracheal epithelial cells // Infect. Immun. 2000. Vol. 68. P.113-119.

46. Dinarello C.A. Biologic basis for interleukin-1 in disease // Blood. 1996. Vol. 87. P. 2095-2147.

47. Ellison R.T., Giehl T J. Killing of gram-negative bactera by lactoferrin and lysozyme //J. Clin. Invest. 1991. Vol. 88. P. 1080-1091.

48. Elsbach P., Weiss J. The bacterial/permeability-increasing protein (BPI), a potent element in host-defense against gram-negative bacteria and lipopolysaccharide // Immunobiology. 1993. Vol. 187. P. 417-429.

49. Epstein J., Elchbaum Q., Sheriff S., Ezekowitz R.A. The collectins in innate immunity // Curr. Opin. Immunol. 1996. Vol. 8. P. 29-35.

50. Frank R.W., Gennaro R., Schneider K., Przybylski M., Romeo D. Amino acid sequences of two proline-rich bactenecins. Antimicrobial peptides of bovine neutrophils // J. Biol. Chem. 1990. Vol. 265. P. 18871-18874.

51. Frazer I.F., Koziel H., Ezekowitz R.A. The serum mannose-binding protein and the macrophage mannose receptor are pattern recognition molecules that link innate and adaptive immunity // Semin. Immunol. 1998. Vol. 10. P. 363-372.

52. Gabay J.E., Almeida R.P. Antibiotic peptides and serine protease homologs in human polymorphonuclear leukocytes: defensins and azurocidin // Curr. Opin. Immunol. 1993. Vol. 5. P. 97-102.

53. Gallo R.L, Kim K.J, Bernfield M, Kozak C.A, Zanetti M, Merluzzi L, Gennaro R. Identification of CRAMP, a cathelin-related antimicrobial peptide expressed in the embryonic and adult mouse // J. Biol. Chem. 1997. Vol. 272. P. 13088-13093.

54. Gallo R.L., Huttner K.M. Antimicrobial peptides: An emerging concept in cutaneous biology // J. Invest. Dermatol. 1998. Vol. 111. P. 739-743.

55. Ganz T., Metcalf J.A., Gallin J.I., Boxer L.A., Lehrer R.I. Microbicidal/cytotoxic proteins of neutrophils are deficient in two disorders: Chediak-Higashi syndrome and "specific"granule deficiency // J. Clin. Invest. 1988. Vol. 82. P. 552-556.

56. Ganz T., Lehrer R.I. Defensins // Curr.Opin.Immunol. 1994. Vol. 6. P. 584-589.

57. Ganz T., Lehrer R.I. Antimicrobial peptides of leukocytes // Curr. Opin. Hematol. 1997. Vol. 4. P. 53-58.

58. Ge Y., MacDonald D., Henry M.M., Hait H.I., Nelson K.A., Lipsky B.A., Zasloff M.A., Holroyd K.J. In vitro susceptibility to pexiganan of bacteria isolated from infected diabetic foot ulcers // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1999. Vol. 35. P. 45-53.

59. Gennaro R., Dewald B., Horisberger U., Gubler H.U., Baggiolini M. A novel type of cytoplasmic granule in bovine neutrophils // J. Cell Biol. 1983. Vol. 96. P. 1651-1661.

60. Gennaro R, Skerlavaj B, Romeo D. Purification, composition, and activity of two bactenecins, antibacterial peptides of bovine neutrophils // Infect. Immun. 1989. Vol. 57. P. 3142-3146.

61. Ghosh D., Porter E.M, Shen B., Lee S.K., Wilk D.J., Crabb J.W., Drazba J., Yadav S.Y., Ganz T., Bevins C.L. Paneth cell trypsin is the processing enzyme for human defensin-5 // Nat. Immunol. 2002. Vol. 3. P. 583-590.

62. Gonzales C. et al. Bacteriocin AS-48, a microbial cyclic polypeptide structurally and functionally related to mammalian NK-lysin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000. Vol. 97. P. 11221-11228.

63. Gordon S. Development and distribution of mononuclear phagocytes: relevance to inflammation // Inflammation: basic principles and clinical correlates. Philadelphia. Lippincott Williams & Wikins. 1999. P. 35-49.

64. Green S.J. Nitric oxide in mucosal immunity // Nat. Med. 1995. Vol. 1. P.515-517.

65. Greenberg S. Biology of phagocytosis // Inflammation: basic principles and clinical correlates. Philadelphia. Lippincott Williams & Wikins. 1999. P. 681-703.

66. Boman H.G. Structure of the gene for porcine peptide antibiotic PR-39, a cathelin gene family member: Comparative mapping of the locus for the human peptide antibiotic FALL-39 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. Vol. 92. P. 7085-7089.

67. Gudmundsson G., Agerberth B., Odeberg J., Bergman T., Olsson B., Salcedo R. The human gene FALL39 and processing of the cathelin precursor to the antibacterial peptide LL-37 in granulocytes // Eur. J. Biochem. 1996. Vol. 238. P. 325-332.

68. Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. Inside the neutrophil phagosome: oxidant, myeloperoxidase, and bacterial killing // Blood. 1998. Vol.92. P. 3007-3017.

69. Hancock R.E.W., Falla T., Brown M. Cationic bactericidal peptides // Adv. Microb. Physiol. 1995. Vol. 37. P. 135-175.

70. Hancock R.E., Lehrer R. Cationic peptides: A new source of antibiotics // Trends Biotechnol. 1998. Vol. 16. P. 82-88.

71. Harder J., Siebert R., Zhang Y., Matthiesen P., Christophers E., Schlegelberger B., Schroder J.M. Mapping of the gene encoding human beta-defensin-2 (DEFB2) to chromosome region 8p22- p23.1 // Genomics. 1997a. Vol. 46. P. 472-475.

72. Harder J., Bartels J., Christophers E., Schroder J.M. A peptide antibiotic from human skin //Nature. 1997b. Vol. 387. P. 861.

73. Harder J., Bartels J., Christophers E., Schroder J.M. Isolation and characterization of human beta-defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. P. 5707-5713.

74. Harwig S.S.L., Chen N., Park A., Lehrer R. Purification of cysteine-rich bioactive peptides from leucocytes by continuous acid-urea-polyacrilamide gel electrophoresis // Anal. Biochem. 1993. Vol. 208. P. 382-386.

75. Harwig S.S.L., Tan L., Qu X.D., ChoY., Eisenhauer P.B., Lehrer R.I. Bactericidal properties of murine intestinal phospholipase A2 // J. Clin. Invest. 1995. Vol. 95. P. 603-610.

76. Harwig S.S.L., Waring A., Yang H.J., Cho Y., Tan L., Lehrer R.I. Intramolecular disulfide bonds enhance the antimicrobial and lytic activities of protegrins at physiological sodium chloride concentrations // Eur. J. Biochem. 1996. Vol. 240. P. 352-357.

77. Helmerhorst E.J., Breeuwer P., van't Hof W., et al. The cellular target of histatin 5 on Candida albicans in the energized mitochondrion // J. Biol. Chem. 1999. Vol. 274. P. 72867291.

78. Hill C.P., Yee J., Selsted M.E., Eisenberg D. Crystal structure of defensin HNP-3, an amphiphilic dimer: mechanisms of membrane permeabilization // Science. 1991. Vol. 251. P. 1481-1485.

79. Holtje J.V. Lysozyme substrates 11EXS. 1996. Vol. 76. P. 105-110.

80. Huang H.J., Ross C.R., Blecha F. Chemoattractant properties of PR-39, a neutrophil antibacterial peptide // J. Leukoc. Biol. 1997. Vol. 61. P. 624-629.

81. Huang H.W. Action of antimicrobial peptides: two-state model // Biochemistry. 2000. Vol. 39. P. 8347-8352.

82. Huttner K.M., Bevins C.L. Antimicrobial peptides as mediators of epithelial host defense // Pediatr. Res. 1999. Vol. 45. P. 785-794.

83. Janeway C.A.Jr., Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology// Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 1989. Vol. 54. P. 1-13.

84. Johnson G.B., Brunn G.J., Piatt J.L. Activation of mammalian Toll-like receptors by endogenous agonists // Crit. Rev. Immunol. 2003. Vol. 23. P. 15-44.

85. Klebanoff S.J. Oxygen metabolites from phagocytes // Inflammation: basic principles and clinical correlates. Philadelphia. Lippincott Williams & Wikins. 1999. P. 721-769.

86. Koo S.P., Bater A.S., Yeaman M.R. Diversity in antistaphylococcal mechanisms among membrane-targeting antimicrobial peptides // Infect. Immun. 2001. Vol. 69. P. 49164922.

87. Latal A., Degovics G., Epand R.F., Epand R.M., Lohner K. Structural aspects of the interaction of peptidyl-glycylleucine-carboxyamide, a highly potent antimicrobial peptide from frog skin, with lipids // Eur. J. Biochem. 1997. Vol. 248. P. 938-946.

88. Lawyer C., Pai S., Watabe M., Borgia P., Mashimo T., Eagleton L., Watabe K.

89. Antimicrobial activity of a 13 amino acid tryptophan-rich peptide derived from a putative porcine precursor protein of a novel family of antibacterial peptides // FEBS Lett. 1996. Vol. 390. P. 95-98.

90. Lehrer R., Barton A., Daher K., Harwig S., Ganz T., Selsted M. Interaction of human defensins with Escherichia coli. Mechanism of bactericidal activity // J. Clin. Invest. 1989. Vol. 84. P. 553-561.

91. Lehrer R.I., Lichtenstcin A.K., Ganz T. Defensins: Antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells//Annu. Rev. Immunol. 1993.Vol. 11.P. 105-128.

92. Lehrer R.I., Ganz T. Cathelicidins: A family of endogenous antimicrobial peptides // Curr. Opin. Hematol. 2002. Vol. 9. P. 18-22.

93. Lehrer R.I., Ganz T. Defensins of vertebrate animals // Curr. Opin. Immunol. 2002. Vol. 14. P. 96-102.

94. Lencer W.I., Cheung G., Strohmeier G.R., Currie M.G., Ouellette A.J., Selsted M.E., Madara J.L. Induction of epithelial chloride secretion by channel-forming cryptins 2 and 3 // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 8585-8589.

95. Leonova L., Kokryakov V.N., Aleshina G., Hong T., Nguyen T., Zhao C., Waring A. J., Lehrer R.I. Circular minidefensins and posttranslational generation of molecular diversity // J. Leukoc. Biol. 2001. Vol. 70. P. 461-464.

96. Li J., Post M., Volk R., Gao Y., Li M., Metais C., Sato K., Tsai J., Aird W., Rosenberg R.D., Hampton T.G., Selike F., Carmeliet P., Simons M. PR39, a peptide regulator of angiogenesis // Nat. Med. 2000. Vol. 6. P. 49-55.

97. Linzmeier R., Michaelson D., Liu L., Ganz T. The structure of neutrophil defensin genes // FEBS Letter. 1993. Vol. 321. P. 267-273.

98. Liu L., Zhao C., Heng H.H., Ganz T. The human beta-defensin-1 and alpha-defensins are encoded by adjacent genes: Two peptide families with differing disulfide topology share acommon ancestry // Genomics. 1997. Vol. 43. P. 316-320.

99. Magor B.G., Magor K.E. Evolution of effectors and receptors of innate immunity // Develop. Compar. Immunology. 2001. Vol. 25. P. 651-682.

100. Martinez-Bueno M. et al. Determination of the gene sequence and molecular structure of the enterococcal peptide antibiotic AS-48 // J. Bacteriol. 1994. Vol. 176. P. 6334-6339.

101. Matzinger P. The danger model: a renewed sense of self // Science. 2002. Vol. 296. P. 301-305.

102. May R.C., Machevsky L.M. Phagocytosis and the actin cytoskeleton // J. Cell Sci. 2001. Vol. 114. P. 1061-1077.

103. Medzhitov R., Janeway C.A.Jr. Innate immunity // N. Engl. J. Med. 2000. Vol. 343. P. 338-344.

104. Mahoney M.M., Lee A.Y, Brezinski-Caliguri D.J., Huttner K.M. Molecular analysis of the sheep cathelin family reveals a novel antimicrobial peptide // FEBS Lett. 1995. Vol. 377. P. 519-522.

105. Mallow E.B., Harris A., Saizman N., Russell J.P., DeBerardinis J.R., Ruchelli E., Bevins C.L. Human enteric defensins: Gene structure and developmental expression // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271. P. 4038-4045.

106. Matsuzaki K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for self-defense? Magainins and tachyplesins as archetypes // Biochim. Biophys. Acta. 1999. Vol. 1462. P. 1-10.

107. Mavri J., Vogel H.J. Ion pair formation of phosphorylated amino acids and lysine and arginine side chains:a theoretical study // Proteins. 1996. Vol. 24. P. 495-501.

108. Medzhitov R., Preston-Hurtburt P., Janeway C.A. Jr. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity // Nature. 1997. Vol. 388. P. 394-397.

109. Michaeklson D., Rayner J., Couto M., Ganz T. Cationic defensins arise from charge neutralized propeptides: A mechanism for avoiding leukocyte autotoxicity? // J. Leukoc. Biol. 1992. Vol. 51. P. 634-639.

110. Miyasaki K.T., Bodeau A.L., Ganz T., Selsted M.E., Lehrer R.I. In vitro sensitivity of oral, gram-negative, facultative bacteria to the bactericidal activity of human neutrophil defensins // Infect. Immun, 1990. Vol. 58. P. 3934-3940.

111. Morrison G.M., Davidson D.J., Dorin J.R. A novel mouse beta defensin, Defb2, which is upregulated in the airways by lipopolysaccharide // FEBS Lett. 1999. Vol. 442. P. 112116.

112. Morrison G., Kilanowski F., Davidson D., Dorin J. Characterization of the mouse beta defensin 1, Defbl, mutant mouse model // Infect. Immun. 2002. Vol. 70. P. 3053-3060.

113. Moser C., Weiner D.J., Lysenko E., Bals R., Weiser J.N., Wilson J.M. ß-Defensin 1 contributes to pulmonary innate immunity in mice // Infect. Immun. 2002. Vol. 70. P. 30683072.

114. Muller W.A. Migration of leukocytes across the vascular intima. Molecules and mechanisms // Trends Cardiovasc. Med. 1995. Vol. 5. P. 15-20.

115. Muller W.A. Leukocyte-endothelial cell adhesion molecules in transendothelial migration // Inflammation: basic principles and clinical correlates. Philadelphia. Lippincott Williams & Wikins. 1999. P. 585-593.

116. Murphy C.J., Foster B.A., Mannis M.J., Selsted M.E., Reid T.W. Defensins are mitogenic for epithelial cells and fibroblasts // J. Cell Physiol. 1993. Vol. 155. P. 408-413.

117. Nagaoka I., Hirata M., Sugimoto K., Tsutsumi-Ishii Y., Someya A., Saionji K., Igari J. Evaluation of the expression of human CAP 18 gene during neutrophil maturation in the bone marrow//J. Leukoc. Biol. 1998. Vol. 64. P. 845-852.

118. Nagaoka I, Hirota S, Yomogida S, Ohwada A., Hirata M. Synergistic actions of antibacterial neutrophil defensins and cathelicidins // Inflamm. Res. 2000. Vol. 49. P. 73-79.

119. Nguyen T.X., Cole A.M., Lehrer R.I. Evolution of primate 0-defensins: a serpentine path to a sweet tooth // Peptides. 2003. Vol. 24. P. 1647-1654.

120. Okrent D.G., Lichtenstein A.K., Ganz T. Direct cytotoxicity of polymorphonuclear leukocyte granule proteins to human lung-derived cells and endothelial cells // Am. Rev. Respir. Dis. 1990. Vol. 141. P. 179-185.

121. Olsson I., Odeberg H., Weiss J., Elsbach P. Bactericidal cationic proteins of human granulocytes // Neutral proteases of human polymorphonuclear leukocytes. Eds. K.Havemann, A.Janoff. Baltimor-Munich. 1978. P. 18-32.

122. Ouellette A.J. Paneth cell antimicrobial peptides and the biology of the mucosal barrier// Am. J. Physiol. 1999. Vol. 277. P. G257-G261.

123. Pace C.N., Vajdos F., Fee L., Grimsley G., Gray T. How to measure and predict the molar absorption coefficient of a protein // Protein Sci. 1995. Vol. 4. P. 2411-2423.

124. Panyutich A., Ganz T. Activated a2-macroglobulin is a principal defensin-binding protein // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1991. Vol. 5. P. 101-106.

125. Panyutich A.V., Hiemstra P.S., van Wetering S., Ganz T. Human neutrophil defensin and serpins form complexes and inactivate each other // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1995. Vol. 12. P. 351-357.

126. Panyutich A., Shi J., Boutz P.L., Zhao C., Ganz T. Porcine polymorphonuclear leukocytes generate extracellular microbicidal activity by elastase-mediated activation of secreted proprotegrins // Infect. Immun. 1997. Vol. 65. P. 978-985.

127. Pardi A., Zhang X.L., Selsted M.E., Skalicky J.J., Yip P.F. NMR studies of defensin antimicrobial peptides. Three-dimensional structures of rabbit NP-2 and human HNP-1 // Biochemistry. 1992. Vol. 31. P. 11357-11364.

128. Park C.B., Kim H.S., Kim S.C. Mechanism of action of antimicrobial peptide buforin II: buforin II kills microorganisms by penetrating he cell membrane and inhibiting cellular functions //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. Vol. 244. P. 253-257.

129. Peiser L., Mukhopadhyay S., Gordon S. Scavenger receptors in innate immunity // Curr. Opin. Immunol. 2002. Vol. 14. P. 123-128.

130. Perregaux D.G., Bhavsar K., Contillo L., Shi J., Gabel C.A. Antimicrobial Peptides initiate IL-1 beta posttranslational processing: A novel role beyond innate immunity // J.1.munol. 2002. Vol. 168. P. 3024-3032.

131. Poltorak A., He X., Smirnova I. et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene// Science. 1998. Vol. 282. P. 2085-2088.

132. Porter E.M., van Dam E., Valore E.V., Ganz T. Broad-spectrum antimicrobial activity of human intestinal defensin 5 // Infect. Immun. 1997. Vol. 65. P. 2396-2401.

133. Prodinger W.M., Wurzner R., Erdei A., Dierich M.P. Complement // In: Paul W.E., ed. Fundamental immunology. N.-Y., Lippincott-Raven. 1999. P. 967-996.

134. Regoli D., Barabe J. Pharmacology of bradykinin and related kinins // Pharmacol. Rev. 1980. Vol. 32. P.l.

135. Reiter B. The biological significance of lactoferrin // Int. J. Tiss. Reac. 1983. Vol. 1. P. 87-96.

136. Rice W.G., Ganz T., Kinkade J.M.J., Selsted M.E., Lehrer R.I., Parmley R.T. Defensin-rich dense granules of human neutrophils // Blood. 1987. Vol. 70. P. 757-765.

137. Ritonja A., Kopitar M., Jerala R., Turk V. Primary structure of a new cysteine proteinase inhibitor from pig leucocytes // FEBS Lett. 1989. Vol. 255. P. 211-214.

138. Romeo D., Skerlavaj B., Bolognesi M., Gennaro R. Structure and bactericidal activity of an antibiotic dodecapeptide purified from bovine neutrophils // J. Biol. Chem. 1988. Vol. 263. P. 9573-9575.

139. Rosen H., Klebanoff S.J. Bactericidal activity of a superoxide anion-generating system. A model for the polymorphonuclear leukocytes // J. Exp. Med. 1979. Vol. 149. P. 27.

140. Rotenberg M.E., Hogan S.P. The eosinophil // Annu.Rev.Immunol. 2006. Vol. 24. P. 147-174.

141. Salomon R.A., Farias R.N. Microcin 25, a novel antimicrobial peptide produced by Escherichacoli//J. Bacteriol. 1992. Vol. 174. P. 7428-7435.

142. Salzman N.H., Polin R.A., Harris M.C., Ruchelli E., Hebra A„ Zirin-Butler S., Jawad A., Porter E.M., Bevins C.L. Enteric defensin expression in necrotizing enterocolitis // Pediatr. Res. 1998. Vol. 44. P. 20-26.

143. Schägger H, Von Jagow G: Tricine sodium dodeculsulphate - polyacrilaaamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1-100 kDa // An. Biochem. 1987. Vol. 166. P. 368-379.

144. Schibli D.J., Hwang P.M., Vogel H.J. Structure of the antimicrobial peptide tritripticin bound to micelles; a distinct membrane-bound peptide fold // Biochemistry. 1999. Vol.38. P. 16749-16755.

145. Schneider J.J., Unholzer A., Schaller M., Schäfer-Körting M., Körting H.C. Human defensins // J. Mol. Med. 2005. Vol. 83. P. 587-595.

146. Schutte B.C., McCray P.B. ß-Defensins in lung host defense // Annu. Rev. Physiol. 2002b. Vol. 64. P. 709-748.

147. Scocchi M., Skerlavaj B., Romeo D., Gennaro R. Proteolytic cleavage by neutrophil elastase converts inactive storage preforms to antibacterial bactenecins // Eur. J. Biochem. 1992. Vol. 209. P. 589-595.

148. Scocchi M, Wang S, Zanetti M. Structural organization of the bovine cathelicidin gene family and identification of a novel member // FEBS Lett. 1997. Vol. 417. P. 311-315.

149. Scocchi M., Wang S., Gennaro R., Zanetti M. Cloning and analysis of a transcript derived from two contiguous genes of the cathelicidin family // Biochim. Biophys. Acta. 1998. Vol. 1398. P. 393-396.

150. Scocchi M. Novel cathelicidins in horse leukocytes // FEBS Lett. 1999. Vol. 457. P. 459-464.

151. Scott M.G., Vreugdenhil A.C., Buurman W.A., Hancock R.E., Gold M.R. Cutting edge: Cationic antimicrobial peptides block the binding of lipopolysaccharide (LPS) to LPS binding protein // J. Immunol. 2000a. Vol. 164. P. 549-553.

152. Segal A. W. How neutrophil kill microbes I I Ann. Rev. Immunol. Vol. 23. P. 197-223.

153. Selsted M.E., Szklarek D., Ganz T., Lehrer R.I. Activity of rabbit leukocyte peptides against Candida albicans II Infect. Immun. 1985. Vol. 49. P. 202-206.

154. Selsted M.E., Harwig S.S. Determination of the disulfide array in the human defensin HNP-2. A covalently cyclized peptide // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264. P. 4003-4007.

155. Selsted M.E., Novotny M.J., Morris W.L., Tang Y.-Q., Smith W., Cullor J.S. Indolicidin, a novel bactericidal tridecapeptide amide from neutrophils // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267. P. 4292-4295.

156. Sepulveda C., Puente J. Natural killer cells and the innate immune system in infectious pathology // Rev. Med. Chil. 2000. Vol. 128. P. 1361-1370.

157. Shai Y. Mechanism of the binding, insertion and destabilization of phospholipids bilayer membranes by alpha-helical antimicrobial and cell non-selective membrane-lytic peptides // Biochem. Biophys. Acta. 1999. Vol. 462. P. 55-70.

158. Shai Y., Oren Z. From «carpet» mechanism to de novo designed diastereomeric cell-selective antimicrobial peptides // 2001. Peptides. Vol. 22. P. 1629-1641.

159. Singh P.K., Parsek M.R., Greenberg E.P., Welsh M.J. A component of innate immunity prevents bacterial biofilm development // Nature. 2002. Vol. 417. P. 552-555.

160. Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity // Nature. 1981. Vol. 292. P. 246-248.

161. Stolzenberg E.D., Anderson G.M., Ackermann M.R., Whitlock R.H., Zasloff M. Epithelial antibiotic induced in states of disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. Vol. 94. P. 8686-8690.

162. Storici P, Scocchi M, Tossi A, Gennaro R, Zanetti M. Chemical synthesis and biological activity of a novel antibacterial peptide deduced from a pig myeloid cDNA // FEBS Lett 1994. Vol. 337. P. 303-307.

163. Takenchi O., Hoshino K., Kawai T. et al. Differential roles of TLR2 and TLR4 in recognition of gram-negative and gram-positive bacterial cell wall components // Immunity. 1999. Vol. 11. P. 443-451.

164. Tam J.P., Lu Y.A., Yang J.L. Marked increase in membranolytic selectivity of novel cyclic tachyplesins constrained with an antiparallel two-p- strand cystine knot framework // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2000a. Vol. 267. P. 783-790.

165. Tam J.P., Wu C., Yang J.L. Membranolytic selectivity of cystine-stabilized cyclic protegrins // Eur. J. Biochem. 2000b. Vol. 267. P. 3289-3300.

166. Tanabe H., Yuan J., Zaragoza M.M., Dandekar S., Henschen-Edman A., Selsted M.E., Ouellette A.J. Paneth cell a-defensins from rhesus macaque small intestine // Infect. Immun. 2004. Vol. 72. P. 1470-1478.

167. Tang Y.Q., Selsted M.E. Characterization of the disulfide motif in BNBD-12, an antimicrobial beta-defensin peptide from bovine neutrophils // J. Biol. Chem. 1993. Vol. 268. P. 6649-6653.

168. Tang Y.Q., Yuan J., Osapay G., Osapay K., Tran D., Miller C.J., Ouellette A.J., Selsted M.E. A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated alpha-defensins // Science. 1999a. Vol. 286. P. 498-502.

169. Tang Y.Q., Yuan J., Miller C.J., Selsted M.E. Isolation, characterization, cDNA cloning, and antimicrobial properties of two distinct subfamilies of a-defensins from rhesus macaque leukocytes // Infect. Immun. 1999b. Vol. 67. P. 6139-6144.

170. Theilgaard-Mónch K., Porse B.T., Borregaard N. Sistems biology of neutrophil differentiation and immune response // Curr. Opin. Immunol. 2006. Vol. 18. P. 54-60.

171. Thomas C.A., Li Y., Kodama T., Suzuki H., Silverstein S.C., El Khoury J. Protection from lethal gram-positive infection by macrophage scavenger receptor-dependent phagocytosis // J. Exp. Med. 2000 Vol. 191. P. 147-156.

172. Trabi M., Schirra H.J., Craik D.J. Three-dimensional structure of RTD-1, a cyclic antimicrobial defensin from rhesus macaque leukocytes // Biochemistry. 2001. Vol. 40. P. 42114221.

173. Tran D., Tran P.A., Tang Y.Q., Yuan J., Cole T., Selsted M.E. Homodimeric 0-defensins from rhesus macaque leukocytes // J. Biol. Chem. 2002. Vol. 277. P. 3079-3084.

174. Travis S.M., Anderson N.N., Forsyth W.R., Espíritu C., Conway B.D., Greenberg E.P., McCray P.B.J., Lehrer R.I., Welsh M.J., Tack B.F. Bactericidal activity of mammalian cathelicidin-derived peptides//Infect. Immun. 2000. Vol. 68. P. 2748-2755.

175. Tsutsumi-Ishii Y., Hasebe T., Nagaoka I. Role of CCAAT/enhancer-binding protein site in transcription of human neutrophil peptide-1 and -3 defensin genes // J. Immunol. 2000. Vol. 164. P. 3264-3273.

176. Uematsu N., Matsuzaki K. Polar angle as a determinant of amphipathic alpha-helix-lipid interactions: a model peptide study // Biophys. J. 2000. Vol. 70. P. 2075-2083.

177. Valore E.V., Ganz T. Posttranslational processing of defensins in immature human myeloid cells // Blood. 1992. Vol. 79. P. 1538-1544.

178. Varkey J., Nagaraj R. Antibacterial activity of human neutrophil defensin HNP-1 analogs without cysteines //Antimicrob. Agents Chemother. 2005. Vol. 49. P. 4561-4566.

179. Vergne I., Constant P., Laneelle G. Phagosomal pH determination by dual fluorescence flow cytometry // Anal. Biochem. 1998. Vol. 255. P. 127-132.

180. Vieira O.V., Botelho R.J., Grinstein S. Phagosome maturation: aging gracefully // BiochemJ. 2002. Vol. 366. P. 689-704.

181. Vunnam S., Juwadi P., Merrifield R.B. Synthesis and antibacterial action of cecropin and proline-arginine-rich peptides from pig intestine // J. Pept. Res. 1997. Vol. 49. P. 59-66.

182. Wade D., Boman A., Wahlin B., Drain C.M., Andreu D., Boman H.G., Merrifield R.B. All-D amino acid-containing channel-forming antibiotic peptides // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. Vol. 87. P. 4761-4765.

183. Wang W., Cole A.M., Hong T., Waring A.J., Lehrer R.I. Retricyclin, an antiretroviral theta-defensin is a lectin // J. Immunol. 2003. Vol. 170. P. 4708-4716.

184. Wang W., Owen S.M., Rudolph D.L., Cole A.M., Hong T., Waring A.J., Lai R.B., Lehrer R.I. Activity of a- and 0-defensins against primary isolates of HIV-1 // J. Immunol. 2004. Vol. 173. P. 515-520.

185. Weiss J., Elbach P., Olsson I., Odeberg H. Purification and characterization of a potent bactericidal and membrane active protein from granules of human polymorphonuclear leukocytes // J. Biol. Chem. 1978. Vol. 253. P. 2664-2672.

186. Weiss T.M., Yang L., Ding L., Waring A.J., Lehrer R.I., Huang H.W. Biochemistry. 2002. Vol. 41. P. 10070-10076.

187. White S.H, Wimley W.C, Selsted M.E. Structure, function, and membrane integration of defensins // Curr. Opin. Struct. Biol. 1995. Vol. 5. P. 521-527.

188. Wolf A. Critical reappraisal of Waddell's technique for ultraviolet spectrophotometric protein estimation // Anal. Biochem. 1983. Vol. 129. P. 145-155.

189. Wright S.D., Tobias P.S., Ulevitch R.J., Ramos R.A. Lipopolysaccharide (LPS) binding protein opsonizes LPS-bearing particles for recognition by a novel receptor on macrophages // J. Exp. Med. 1989. Vol. 179. P. 1231-1241.

190. Wu M., Maier E., Benz R., Hancock R. Mechanism of interaction of different classes of cationic antimicrobial peptides with planar bilayers and with the cytoplasmic membrane of Escherichia coli // Biochemistry. 1999. Vol. 38. P. 7235-7242.

191. Yamaguchi S., Hong T., Waring A., Lehrer R.I., Hong M. Solid-state NMRinvestigations of peptide-lipid interaction and orientation of a P-sheet antimicrobial peptide, protegrin// Biochemistry. 2002. Vol. 41. P. 9852-9862.

192. Yamauchi K., Tomita M., Giehl T.J., Ellison R.T. Antibacterial activity of lactoferrin and a pepsin-derived lactoferrin peptide fragment // Infect. Immun. 1993. Vol.61. P. 719-728.

193. Yan H., Hancock R.E. Synergistic interactions between mammalian antimicrobial defense peptides // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. Vol. 45. P. 1558-1560.

194. Yang D., Chen Q., Chertov O., Oppenheim J.J. Human neutrophil defensins selectively chemoattract naive T and immature dendritic cells // J. Leukoc. Biol. 2000. Vol. 68. P. 9-14.

195. Yang D., Biragyn.A., Kwak L.W., Oppenheim J.J. Mammalian defensins in immunity: More than just microbicidal // Trends Immunol. 2002. Vol. 23. P. 291-296.

196. Yang L., Weiss T.M., Lehrer R.I., Huang H.W. Crystallization of antimicrobial pores in membranes: magainin and protegrin // Biophys. J. 2000. Vol. 79. P. 2002-2009.

197. Yang L., Harroum T.A., Weiss T.M., Ding I., Huang H.W. Barrel-stave modele or toroidal model? A case study on melittin pores // Biophys. J. 2001. Vol. 81. P. 1475-1485.

198. Yasin B., Harwig S.S.L., Lehrer R.I., Wagar E.A. Susceptibility of Chlamydia trachomatis to protegrins and defensins // Infect.Immun. 1996. Vol. 64. P. 709-713.

199. Yasin B., Wang W., Pang M., Cheshenko N., Hong T.,2 Waring A.J., Herold B.C., Wagar E.A., Lehrer R.I. 0-Defensins protect cells from infection by herpes simplex virus by inhibiting viral adhesion and entry//J. Virol. 2004. Vol. 78. P. 5147-5156.

200. Yeaman M.R., Yount N.Y. Mechanisms of antimicrobial peptide action and resistance // Pharm. rev. 2003. Vol. 55. P. 27-55.

201. Yu Q., Lehrer R.I., Tam J.P. Engineered salt-insensitive a-defensins with end-to-endcircularized structures // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 3943-3949.

202. Zanetti M, Litteri L., Gennaro R., Horstmann H., Romeo D. Bactenecins, defense polypeptides of bovine neutrophils, are generated from precursor molecules stored in the large granules // J. Cell Biol. 1990. Vol. 111. P. 1363-1371.

203. Zanetti M., Gennaro R., Romeo D. Cathelicidins: A novel protein family with a common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain // FEBS Lett. 1995. Vol. 374. P. 1-5.

204. Zasloff M. Reconstructing one of nature's designs // Trends Pharmacol. Sci. 2000. Vol. 21. P. 236-238.

205. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms // Nature. 2002. Vol. 415. P. 389-395.

206. Zeya H.I., Spitznagel J.K. Antibacterial and enzymic basic proteins from leukocyte lysosomes: Separation and identification// Science. 1963. Vol. 142. P. 1085-1087.

207. Zhang L„ Scott M.G., Yan H., Mayer L.D., Hancock R.E.W. Interaction of polyphemusin 1 and structural analogs with bacterial membranes, lipopolysaccharide, and lipid monolayers // Biochemistiy. 2000. Vol. 39. P. 14504-14514.

208. Zimmermann G.R., Legault P., Selsted M.E., Pardi A. Solution structure of bovine neutrophil beta-defensin-12: The peptide fold of the beta-defensins is identical to that of the classical defensins // Biochemistry. 1995. Vol. 34. P. 13663-13671.

209. Zhu Q., Singh A.V., Bateman A., Esch F., Solomon S. The corticostatic (anti-ACTH) and cytotoxic activity of peptides isolated from fetal, adult and tumor-bearing lung // J. Steroid Biochem. 1987. Vol. 27. P. 1017-1022.