Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений

Макарова, Марина Витальевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений"

На правах рукописи

Макарова Марина Витальевна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ НЕТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МШСОБАКТЕРИЙ У ПАЦИЕНТОВ ФТИЗИАТРИЧЕСКИХ ^ УЧРЕЖДЕНИЙ

03.02.03 - Микробиология

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва - 2010

004601032

Работа выполнена в Московском городском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения города Москвы

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук, профессор Мороз Аркадий Максович Доктор медицинских наук, профессор Сельцовский Петр Петрович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Батуро Алла Петровна Доктор медицинских наук, профессор Леви Диана Тимофеевна Доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич

Ведущая организация: Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза Российской академии медицинских наук (ЦНИИТ РАМН), Москва.

Защита состоится 15 апреля 2010г. в 1200 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН (105064 Москва, Малый Казенный пер., д. 5а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИВС им. И.И.Мечникова РАМН (105064 Москва, Малый Казенный пер., д. 5а).

Автореферат разослан « » « ^¿^¿¿уттгг » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук И.ВЛковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Нетуберкулезные микобактерии - это микроорганизмы, про которые в начале второй половины XX века хорошо знали микробиологи, а в некоторых странах и клиницисты (вызываемую ими патологию называют микобактерио-зами). Но затем эта проблема была в значительной степени забыта и вновь приобрела актуальность с распространением ВИЧ-инфекции, поскольку у ВИЧ-инфицированных (особенно на стадии СПИД) часто развиваются микобакте-риозы, которые в большом числе случаев приводят к летальному исходу [Ка-toch V., 2004; Khatter S., 2008].

В настоящее время род Mycobacterium включает более 100 видов, и их число продолжает увеличиваться [Euzeby J., 2002; Katoch V., 2004]. Из них наиболее распространены М. tuberculosis и М. leprae, вызывающие у людей хорошо известные заболевания. Несколько видов микобактерий входят в так называемый М. tuberculosis complex: M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. caprae, M. pinnipedii. Остальные широко распространены в окружающей среде как сапрофиты, однако в некоторых случаях они могут быть этиологическими факторами тяжелой (вплоть до смертельной) патологии, чаще у людей, имеющих нарушения иммунитета различной природы [Модель JI.M., 1958; Зыков М.П., 1984; Лазовская А.Л., 1991; Отген Т.Ф., 1994, 1999; Новожилова И.А., 2004; Wolinsky Е., 1979, 1992; Tells С., Putnam J., 1980; Grange J., Yaters M., 1986; Wallace R. et al., 1990, 1997; Olivier К., 1998; Dawson D., 2000; Euzeby J., 2003; Heifets L., 2004; Jarzembowski J., Young M., 2008].

He входящие в M. tuberculosis complex микобактерии долгие годы называли микобактериями окружающей среды (enviromental mycobacteria), возбудителями микобактериозов, атипичными микобактериями. Однако, в последние десятилетия большинство микробиологов использует термин «нетуберкулезные микобактерии» (HTM) [Wallace R. et al., 1990,1997; Dawson D., 2000; Katoch V.,

Kumar M., 2001; Heifets L., 2004].

Значительный вклад в изучение нетуберкулезных микобактерий и вызываемой ими патологии внесли отечественные исследователи, работавшие в 5070 годы XX века: JIM. Модель, М.М. Дыхно, Н.М. Макаревич, Н.М. Рудой, Я.А. Благодарный, Т.Б.Яблокова, Т.Б. Ильина, Р.О.Драбкина, Ю.К. Вейсфейлер и др. Затем, в течение многих лет исследования в этой области продолжались лишь в некоторых регионах России, в первую очередь, в Санкт-Петербурге [Огген Т.Ф., Васильев A.B., 2005].

За это время ситуация в мире резко изменилась, число больных мико-бактериозами во многих странах возросло в десятки раз. Это явилось следствием увеличения числа лиц с серьезными нарушениями иммунитета (в первую очередь ВИЧ-инфицированных) [Marras Т., Daley С.,2002; Cole Т. et al.,2005], а также применения новых чувствительных и специфичных методов выделения и идентификации микобактерий (культивирование в автоматизированных системах с использованием жидких питательных сред, молекулярно-генетические методы и высокоэффективная жидкостная хроматография - ВЭЖХ), которые позволили существенно ускорить диагностику микобактериозов и повысить ее эффективность [Butler W., Guthertz L., 2001; Fukushima M. et al., 2003; Heifets L., 2004; Shin J. et al., 2009].

Заболевания, вызываемые разными видами HTM, характеризуются сходной с туберкулезом клинико-рентгенологической картиной, но требуют применения схем лечения, отличных от химиотерапии туберкулеза, из-за высокой их резистентности к противотуберкулезным препаратам [Отген Т.Ф., Васильев A.B., 2005; Cole T.et al., 2005]. Перед микобактериологическими лабораториями стоят важные задачи по раннему выявлению и идентификации микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ) и нетуберкулезных микобактерий. Это необходимо для своевременного проведения мероприятий по предотвращению распространения инфекции и назначения адекватной терапии.

В зарубежной литературе по данной проблеме в последние годы опубликовано много работ, исследования по изучению HTM и микобактериозов про-

грессируют стремительно [Wallace R. et al., 1990, 1997; Katoch V., 2004; Heifets L., 2004; Jarzembowski J., Young M., 2008].

К сожалению, в нашей стране понимание того, насколько важна эта проблема, еще не достигнуто, в абсолютном большинстве регионов отсутствуют также методические возможности, которые позволили бы реально идентифицировать вид нетуберкулезных микобактерий, установить диагноз микобактерио-за и назначить своевременное лечение.

Кроме того, в России микобактериозы не считаются самостоятельными заболеваниями, несмотря на то, что они включены в Международную классификацию болезней. В связи с такой ситуацией, врачи не знают особенностей течения и лечения этой патологии, нет специальных курсов обучения, не используются современные методы диагностики микобактериозов. Сегодня даже не ясно, в каких учреждениях следует лечить таких больных. Часто пациенты, страдающие микобактериозами, находятся в одних палатах с больными туберкулезом и могут инфицироваться от них, а возможно и заражать их.

Все вышеизложенное определяет актуальность и необходимость разработки комплекса методов выделения и идентификации HTM с применением всех имеющихся в настоящее время технических возможностей.

Цель исследования

Создание оптимального комплекса выделения и идентификации нетуберкулезных микобактерий (HTM) с использованием разработанных и модифицированных методов, и на этой основе изучение видового состава выделенных HTM и их чувствительности к антибактериальным препаратам.

Задачи исследования

1. Изучить эффективность использования наиболее широко применяющихся в мировой практике питательных сред: плотной яичной Левенштейна-Иенсена, плотной агаровой Миддлбрука 7Н11 и модифицированной жидкой Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) для выделения HTM.

2. Провести сравнительный анализ результатов применения для видовой идентификации микобактерий методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и микробиологических методов.

3. Разработать для видовой идентификации HTM новый молекулярно-генетический метод - биологические микрочипы, сопоставить эффективность его использования с результатами, полученными микробиологическими методами, ПДРФ и ВЭЖХ.

4. На основании результатов сравнительных исследований эффективности различных методов выделения и идентификации HTM разработать оптимальный диагностический комплекс (алгоритм), с его помощью охарактеризовать видовой спектр штаммов HTM, циркулирующих в городе Москве.

5. Проанализировать частоту повторного обнаружения у больных одного и того же вида HTM, как критерия (при наличии клинико-рентгенологических признаков заболевания) развития микобактериоза.

6. Выявить особенности чувствительности к противотуберкулезным и другим антибактериальным препаратам HTM, выделенных из диагностического материала, поступившего в Централизованную микробиологическую лабораторию МНПЦБТ из противотуберкулезных учреждений города Москвы.

Научная новизна исследования

В результате сравнительного изучения эффективности выделения HTM с помощью модифицированной жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) и плотных - агаровой (Миддлбрука 7Н11) и яичной (Левенштейна-Йенсена) питательных сред, установлено, что наибольшее число микобактерий из клинического материала удается выделить при использовании жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9. При этом срок детекции роста микобактерий в 1,9 раз короче, чем на плотной яичной и в 1,5 раза, чем на плотной агаровой среде. Поскольку на плотных питательных средах дополнительно удается получить до 10% изолятов, оигималь-

ным для выделения HTM является комплексное применение жидкой и одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред.

Выявлено (при субкультивировании на чашках с агаровой средой Мидд-лбрука 7Н11), что клинические изоляты, выделенные как в жидкой, так и на плотных питательных средах, могут содержать несколько видов микобактерий.

Впервые для идентификации видов HTM разработан и применен метод биологических микрочипов: поэтапно испытаны несколько модификаций биочипов с последовательным увеличением количества иммобилизированных в лунках с гелем специфических олигонуклеотидов. В итоге полученный «БИО-ЧИП IMS» позволяет идентифицировать 9 видов HTM: М. avium, М. intracellulars, М. scrofiilaceum, М. kansasii, М. gordonae, М. xenopi, М. marinum, М. fortui-tum, М. chelonae и дифференцировать их отМ tuberculosis complex.

При сравнительном изучении эффективности видовой идентификации микобактерий с помощью разработанных биочипов, методов ПДРФ и ВЭЖХ на большом объеме клинического материала показано, что все эти методы дают сопоставимые результаты с данными микробиологических исследований (не зависящие от того в жидкой или на плотных питательных средах выделены культуры микобактерий), но в значительно более короткие сроки. Дополнительным преимуществом биочипов является автоматизированный учет результатов с помощью программного обеспечения и возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале.

Впервые разработан и обоснован оптимальный комплекс методов (алгоритм) выделения и идентификации HTM, который включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах - плотной и жидкой, и идентификацию полученной культуры микобактерий методами ВЭЖХ и/или ПДРФ, либо биологических микрочипов (использование последнего - предпочтительнее).

HTM из клинического материала выделяли MAC, М. xenopi и М. kansasii а быстрорастущих - М. fortuitum. Клинические изоляты HTM отличались высоким уровнем устойчивости как к основным, так и к большинству резервных противотуберкулезных препаратов и чувствительностью к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.

Впервые создана коллекция клинических изолятов (548 штаммов) нетуберкулезных микобактерий (относящихся к 14 видам), идентифицированных с помощью микробиологических, молекулярно-генетических методов и ВЭЖХ.

Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику

Предложено для эффективного выделения HTM из биологического материала производить его посев на 2 питательные среды: жидкую Миддбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) и одну из плотных (агаровую или яичную). Субкультивирование на чашках с агаровой средой Мидд-лбрука 7Н11, выделенных в жидкой и на плотной яичной питательных средах культур, позволяет обнаружить несколько видов микобактерий и изучить их культурально-морфологические свойства.

Высокая степень совпадения результатов идентификации микобактерий методом ВЭЖХ с данными микробиологических исследований, а также возможность идентификации большего числа видов, по сравнению с традиционными микробиологическими методами, определяет целесообразность применения этого метода в бактериологических референс-лабораториях. Важное практическое значение имеет сокращение времени такого исследования до 24-х часов, вместо 3-4-х недель при использовании микробиологических методов.

Результаты видовой идентификации культур HTM с помощью молекулярно-генетических методов (ПДРФ и биологических микрочипов) аналогичным образом в большинстве случаев совпадают с данными микробиологических исследований, при существенном сокращении времени их получения. В связи с этим, указанные методы могут быть использованы в лабораторной практике. Преимуществом применения биочипов является простота метода,

возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале и автоматизированный учет результатов.

При неоднократном обнаружении в материале, полученном от больного, одного и того же вида HTM, при отсутствии М. tuberculosis и наличии клинико-рентгенологических проявлений заболевания, лечащим врачам в диагностическом ряду следует рассматривать микобактериоз.

При проведении химиотерапии микобактериозов следует учитывать, что HTM в большинстве случаев устойчивы к основным и резервным противотуберкулезным препаратам и чувствительны к таким фторхинолонам, как ци-профлоксацин и моксифлоксацин.

Создана коллекция, состоящая из 548 клинических изолятов нетуберкулезных микобактерий (относящихся к 14 видам), идентифицированных с помощью микробиологических, молекулярно-генетических методов и ВЭЖХ, которая может быть использована в качестве контрольной при разработке и испытании новых диагностических тест-систем.

Результаты настоящей работы внедрены в практическую деятельность Централизованной микробиологической лаборатории Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом (МНПЦБТ), обслуживающей Центр и противотуберкулезные диспансеры города Москвы. Они вошли в курс лекций и практических занятий на кафедре фтизиопульмонологии РМАПО Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

На основании результатов проведенных исследований составлены и изданы методические рекомендации:

• «Определение вида микобактерий комплексов MAIS и Mycobacterium tuberculosis методом рестрикционного анализа», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 07.02.2007;

• «Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009;

• «Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий микробиологическими методами», утвержденные Департаментом здравоохранения города Москвы 21.05.2009г.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование модифицированной жидкой питательной среды Мидд-лбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) в сочетании с одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред является оптимальным для выделения HTM из клинического материала.

2. Разработанный, путем поэтапного анализа различных модификаций с увеличением количества специфических олигонуклеотидов, иммобилизирован-ных в лунках с гелем, метод биологических микрочипов (БИОЧИП «IMS») является достоверным, простым и быстрым методом идентификации микобактерий видов: М. avium, М. intracellulare, М. scrofiilaceum, М. kansasii, М. gordonae, М. xenopi, М. marinum, M.foríuitum, М. chelonae и дифференциации их отМ tuberculosis complex.

3. Анализ сравнительного изучения эффективности видовой идентификации микобактерий с помощью биочипов, оценки ПДРФ, ВЭЖХ и микробиологических методов, показал, что все они дают сопоставимые результаты. При этом ВЭЖХ и молекулярно-генетические тесты характеризуются более высокой специфичностью и скоростью получения результатов, а преимуществом биочипов также является автоматизированный учет с помощью программного обеспечения и возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале.

4. Разработан алгоритм выделения и идентификации HTM, применение которого в лабораторной практике позволит улучшить диагностику микобакте-риозов. Он включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах (жидкой и плотной); идентификацию выделенной культуры микобактерий методом ВЭЖХ и/или одним из молекулярно-генетических методов (ПДРФ и БИОЧИП-IMS); субкультивирование на чашках с агаровой сре-

дой 7Н11 для обнаружения смешанных культур микобактерий и проведения (в случаях необходимости) идентификации вида микробиологическими методами.

5. При использовании предложенного алгоритма выделения и идентификации HTM охарактеризован их видовой состав в городе Москве: с наибольшей частотой из медленнорастущих HTM в клиническом материале обнаружены MAC, М. kansasii и М. xenopi, а из быстрорастущих - М. fortuitum. Неоднократное обнаружение в диагностическом материале, полученном от больного, одного и того же вида HTM (при отсутствии М. tuberculosis и наличии соответствующей клинико-рентгенологической симптоматики) дает основание для рассмотрения в диагностическом ряду микобактериоза.

6. HTM, выделенные от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве, отличаются высоким уровнем устойчивости как к основным, так и резервным противотуберкулезным препаратам, и в большинстве случаев чувствительны к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и мок-сифлоксацин.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на научных форумах всероссийского и международного уровней, включая научно-практические конференции и заседания Ученого совета МНПЦБТ, 8-й Российский съезд фтизиатров (Москва, 2007 г.), Всероссийскую научно-практическую конференцию «Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций» (Санкт-Петербург, 2008 г.), 4-й конгресс Евро-Азиатского респираторного общества и 5-й Международный конгресс пульмонологов Центральной Азии (Ташкент, 2008 г.), 7-ю и 8-ю Московские Ассамблеи «Здоровье Столицы» в 2008 г. и 2009 г., Европейские респираторные конгрессы (Берлин 2008 г., Вена 2009 г.), 5-й конгресс Международного противотуберкулезного союза (Дубровник 2009 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 28 работ, в том числе одна книга, 9 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 225 страницах машинописного текста по традиционному плану и включает введение, обзор литературы, главу «Материал и методы», четыре главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы, содержащий ссылки на 31 работу отечественных и 342 зарубежных авторов. Результаты исследования проиллюстрированы 27 рисунками, в виде графиков, схем, фотографий и 18 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Клинические и лабораторные штаммы микобактерий

Исследования проведены в Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ и основаны на результатах изучения клинических образцов, поступивших из противотуберкулезных учреждений города Москвы за период с января 2006 г. по ноябрь 2009 г. Всего за это время исследованы 163874 образца биологического материала, выделены 13784 культуры микобактерий, из которых к HTM отнесены 720, что составило 5,2%. 548 клинических изолятов HTM, относящихся к 14 видам, охарактеризованных не только микробиологическими, но и одним или двумя молекулярно-генетическими методами и/или ВЭЖХ, находятся в коллекции МНПЦБТ.

В качестве контролей использовали лабораторные штаммы микобактерий, находящиеся в музее Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ: М. tuberculosis H37Rv, М. bovis Ravenel, М. bovis BCG, M. avium, M. intracellularae, M. scrofulaceum, M. kansasii, M. marinum, M. fortuitum, M. che-lonae, M. gordonae, M. smegmatis, M. terrae, M. xenopi, M. malmoense, M. gas tri, M. simiae, M. phlei, M.vacca, M.flavescens, в том числе эталонные штаммы М. avium АТСС 35712, М. intracellularae АТСС 35761, М. kansasii ATСС 25101, М. marinum АТСС 11565, М. fortuitum АТСС 14467, М. gordonae АТСС 14470. Штаммы получены из ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Москва), НИИ фтизиопульмонологии (Санкт-Петербург) от профессора Т.Ф. Отген, из НИИ лепры (Астрахань) и из

микобактериологической лаборатории Еврейского медицинского исследовательского центра (Денвер, Колорадо, США) от профессора JI. Хейфеца.

2. Выделение и идентификация HTM микробиологическими методами

Выделение микобактерий осуществляли микробиологическими методами на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена (Л-Й), на чашках с плотной агаровой средой Миддобрука 7Н11, разделенных на 2 сектора: с антибиотиками/без антибиотиков (с антибиотиками - 7Н11 селективный агар - для подавления роста посторонней микрофлоры и получения чистой культуры микобактерий, без антибиотиков - для выделения штаммов микобактерий, рост которых могут ингибировать антибиотики), а также в модифицированной жидкой питательной среде Мидцлбрука 7Н9 в автоматизированной системе ВАС-ТЕС MGIT 960 (Becton Dickinson).

Биологический материал, полученный от обследуемых лиц: мокрота, промывные воды бронхов, бронхоальвеолярный лаваж, плевральная жидкость, моча, материал биопсии, и т.д., перед посевом на питательные среды для уничтожения неспецифической микрофлоры подвергали щадящей обработке с помощью Мусо-Ргер-реагента (BBL), содержащего N-acetyl-L-cysteine (NALC) и 3% NaOH. Все образцы микроскопировали на наличие кислотоустойчивых микроорганизмов после окраски флюорохромами.

Идентификацию выделенных культур микробиологическими методами проводили в соответствии с приказом МЗ РФ № 109 от 21 марта 2003г. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». Вначале культуры кислотоустойчивых микроорганизмов по морфологии колоний и способности к пигментообразованию на плотных и «косообразова-нию» (результаты микроскопии) в жидкой питательных средах предварительно делили на две группы: М. tuberculosis complex и HTM. Затем проводили дальнейшую идентификацию, основанную на оценке скорости роста, способности роста при различных температурах, в присутствии салицилового натрия, 5% NaCl и изучении биохимических свойств: способности к восстановлению нит-

ратов, теллурита калия, гидролизу Твина-80, никотинамидазной, арилсульфа-тазиой, каталазиой активности и др. С целью сокращения времени получения результатов идентификации биохимическими методами для постановки нит-ратредуктазного и ниацинового тестов использовали первичные культуры ми-кобактерий, выделенные в жидких питательных средах.

Для хроматографического и молекулярно-генетических анализов использовали культуры микобактерий, выделенные в жидкой и на плотных питательных средах, в которых наличие кислотоустойчивых микроорганизмов и отсутствие контаминации устанавливали микроскопией мазков, окрашенных по Циль-Нильсену. Для подтверждения того, что в клинических изолятах находится один вид микобактерий и проведения идентификации микробиологическими методами, в случаях необходимости исследуемые культуры субкультивиро-вали на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11.

3. Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Идентификацию микобактерий методом ВЭЖХ выполняли по методике, основанной на анализе различий в составе миколовых кислот клеточной стенки, разработанной и предложенной для использования в качестве стандартного метода определения видов, входящих в род Mycobacterium, в микобактериологи-ческих референс-лабораториях, Центром по контролю и предотвращению заболеваний (CDC, США, 1996). Разделение миколовых кислот осуществляли методом обращенно-фазовой хроматографии с помощью хроматографической системы Breeze Waters, состоящей из бинарного градиентного насоса, модуля для автоматического ввода проб, модуля для подогрева колонки, многоволнового флюоресцентного детектора, колонки Symmetry С18 5мМ 3,9x50 мм с предко-лонкой.

4. Идентификация микобактерий молекулярно-генетическими методами

В сотрудничестве с институтом молекулярной биологии им. В. А. Эн-гельгардта РАН последовательно разработаны экспериментальные версии био-

логических микрочипов «IMS», предназначенные для идентификации ряда видов HTM и дифференциации их от М. tuberculosis complex.

Метод включает в себя двухстадийную ПЦР. На первой стадии проводили амплификацию исследуемых фрагментов гена gyrB. На второй стадии использовали ДНК из амплифицированных образцов и дезоксинуклеотид, меченый флуоресцентной меткой CY-5. Полученные ПЦР продукты гибридизова-ли на чипе, содержащем набор олигонуклеотидов, специфичных для gyrB регионов разных видов микобактерий. Интерпретацию результатов гибридизации осуществляли при сравнении интенсивности флуоресцентных сигналов в ячейках, содержащих видоспецифические олигонуклеотиды, с помощью специального программного обеспечения «Imageware» (ИМБ РАН, Россия). Максимальный флуоресцентный сигнал свидетельствовал о наличии совершенного гибри-дизационного дуплекса.

Идентификация HTM с помощью ПДРФ также включала два последовательных этапа. На первом этапе проводили ПЦР фрагмента гена hsp65, на втором - осуществляли рестрикционный анализ ампликонов, полученных после проведения ПЦР. Детекцию полиморфизма длин рестрикционных фрагментов проводили с помощью электрофореза в 3% агарозном геле. По окончании электрофореза гель просматривали в трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете. После обработки рестриктазой Hin6I на электрофорезе были видны четкие отличия разных видов микобактерий, в зависимости от числа пар нуклеотидов.

5. Определение лекарственной чувствительности культур нетуберкулезных микобактерий

Лекарственную чувствительность культур HTM, выделенных на плотных и в жидкой питательных средах из клинических образцов больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез, изучали методом абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Йенсена (Приказ МЗ РФ №109 от 21,03.03г.).

6. Статистическая обработка результатов

Для обработки информации была сформирована база данных (формат Excel), включавшая паспортную информацию о пациентах, сведения о цели исследования, характере диагностического материала, диагнозе и проведенном лечении, результатах микробиологического, хроматографического и молеку-лярно-генетических исследований. Оценку достоверности различия качественных признаков и долей в группах проводили с использованием критерия Фишера (для двух параметров) и х2-критерия (для трех и более параметров). В качестве критического уровня достоверности различий принят р = 0,05. [Наглядная статистика в медицине/А. Петри, К. Сэбин//Пер. с англ. В.П. Леонова.- М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003.- 144С.].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Настоящая работа посвящена проблемам разработки и внедрения оптимального комплекса методов выделения и идентификации HTM. Следует подчеркнуть, что данные о том, каким должен быть комплекс (даже только микробиологических методов), который можно рекомендовать для этих целей, в отечественной литературе отсутствуют, а разные зарубежные авторы имеют неодинаковые мнения по этой проблеме. Что касается ВЭЖХ и молекулярно-генетических методов, то в абсолютном большинстве исследований были охарактеризованы возможности применения только одного из них, без определения его места в системе (алгоритме) выделения и идентификации HTM.

1. Выделение и микробиологическая идентификация видов HTM

1.1. Сравнительное изучение эффективности выделения HTM на разных средах

Изучена эффективность выделения микобактерий на плотной яичной питательной среде Левенштейна-Иенсена (Л-Й), в модифицированной жидкой среде Миддлбрука 7Н9 (7Н9) в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 и на чашках с плотной агаровой средой Миддлбрука 7Н11 (7Н11).

Произведено 2029 посевов, выделено 227 культур микобактерий, из них как М. tuberculosis complex идентифицировано 186 культур (81,9%) и 41 (18,1%) - как HTM (MAC - 17, М. kansasii - 8, М. xenopi - 6, M.fortuitum - 10).

Таблица 1.

Эффективность выделения микобактерий на разных питательных средах

(абс., %)

Вид микобактерий Число (%) изолятов микобактерий, выделенных на среде: Достоверность различий (р)

Левеиштейна-Йенсена (1) Миддлбрука 7Н11 (2) Миддлбрука 7Н9 (ВАС-ТЕС MGIT 960) (3)

М. tuberculosis (186) 139 (74,7) 150(80,6) 169 (90,9) Р1-2> 0,1 Pi-з < 0,01 Р2-3<0,01

MAC (17) 10 11 14

М. kansasii (8) 5 6 7

М. xenopi(6) 5 5 5

M.fortuitum (10) 7 7 9

Всего HTM (41) 27(65,9) 30(73,2) 35 (85,4) Р1-2 >0,1 Pi.} < 0,05 Р2-5>0,1

ИТОГО (227) 166 (73,1) 180(79,3) 204 (89,9) Р,.2> 0,1 Pi-з < 0,01 Р2-3< 0,01

Установлено (табл. 1), что жидкая питательная среда (7Н9) более эффективна в выделении микобактерий, чем плотные. Из 227 культур микобактерий, выделенных на вышеуказанных трех средах, 204 (89,9%) получены в жидкой питательной среде. На среде 7Н11 выделены 180 (79,3%), а на Л-Й - 166 (73,1%) культур. Что касается HTM, то больше всего культур также удалось выделить в жидкой питательной среде 7Н9 - 35 (85,4%), меньше на плотной агаровой 7Н11 -30 (73,2%), и ещё меньше на среде Л-Й - 27 (65,9%) культур.

Чаще HTM выделяли на всех трех средах -18 (43,9%), что достоверно выше, чем при других сочетаниях сред (р < 0,05), и лишь в единичных случаях только на одной среде: Л-Й - 1 (2,4%); 7Н11 - 2 (4,9%) и 7Н9 - 5 (12,2%), соответственно (табл. 2).

Таблица 2.

Частота выделения микобактерий на разных питательных средах и их комбинациях (абс., %)

Среда Число выделенных изолятов микобактерий

МАС М. kansasii М- xenopl M.fortultum Всего HTM

Только Л-Й 1 - - - 1 (2,4)

Только Миддлбрук 7Н11 1 1 - - 2(4,9)

Только Мидддбрук 7Н9 3 1 - 1 5 (12,2)

Л-Й + 7Н11 2 - - 1 3(7,3)

Л-Й + 7Н9 2 - 1 2 5 (12,2)

7Н9 + 7НИ 3 2 2 - 7 (17,1)

На всех средах 5 4 3 6 18 (43,9)

ИТОГО 17 8 6 10 41 (100,0)

Таблица 3.

Эффективность выделения HTM на средах Левенштейна-Йенсена и Миддлбрука 7Н9

Вид микобактерий Число HTM выделенных на среде: Достоверность различий (р)

Лсвсиштейна-Йенсена Миддлбрука 7U9 1_(ВАСТЕС MGIT 960)

абс. % абс. %

МАС{ 106) 64 60,4 83 78,3 <0,02

М. kansasii (51) 31 60,8 43 84,3 <0,01

М. xenopi (42) 35 83,3 39 92,9 <0,05

М. gordonae (16) 10 62,5 13 81,3 <0,02

М. marinum (6) 4 66,7 5 83,3 >0,05

Всего медленнорастущие (221) 144 65,2 183 82,8 <0,05

M.fortuitum (71) 48 67,6 51 71,8 >0,05

М chelonae (11) 7 63,6 8 72,7 >0,05

M.flavescens (8) 6 75,0 7 87,5 >0,05

Всего быстрорастущие (90) 61 67,8 66 73,3 >0,05

ВСЕГО HTM (311) 205 65,9 249 80,1 <0,05

Дополнительно на значительно большем количестве материала было проведено сравнение эффективности использования двух сред - Левенштейна-Йенсена и Миддлбрука 7Н9, которые постоянно применяют в микробиологи-

ческой лаборатории МНПЦБТ (табл. 3). Частота выделения HTM оказалась также в 1,2 раза выше в жидкой питательной среде, в большей степени это относилось к MAC, М. kansasii, М. xenopi, М. gor dome.

Следует отметить, что обнаружение роста микобактерий в системе ВАС-ТЕС MGIT 960 (в модифицированной жидкой среде Миддлбрука 7Н9) происходило на 10-20 дней раньше (табл. 4), чем на плотных средах. Среднее время детекции роста в этой среде составило 19,8±5,2 дней, по сравнению с 30,5±3,9 днями на среде 7Н11 и 37,2±4,5 днями на среде Левенштейна-Иенсена (т.е. в 1,5 и 1,9 раз быстрее, соответственно).

Таблица 4.

Сроки выделения культур HTM на разных питательных средах

Вид микобяктерпй Длительность культивирования (дни) ■1 ' на среде: Различия в длительности культивирования (коэффициент) : Достоверность различив (Р)

Лсвспштсй-па-Йепссна (П Миддлбру-ка 71Ш (2) Миддлбрут ка 7119 (3)

MAC (П) 38,6 ±3,2 30,1 ±2,7 22,Ъ ± 3,4 (1)-(3)~1,У (2НЗ)- 1,4 Pi-2 > 0,05 />м<0,01 Pi-з < 0,05

М. kansasii (8) 30,2 ±8,6 26,5 ±4,6 16,1 ±4,9 (1Н2)~ 1,1 (¡ИЗ)- 1,9 (2ИЗ)~\,1 pul > 0,05 Pi-3< 0,01 Р2-3 < 0,01

М. xenopi(6) 40,4 ±6,9 30,6 ±5,1 22,8 ±5,1 (1)-(2)-\, 3 (1)-(3)~ 1,8 (2ИЗ)~ 1,3 Pi-2 > 0,05 риз < 0,01 Р2-з > 0,05

M.fortuitum (10) 38,4 ±2,1 34,5 ± 4,6 16,8 ±8,6 (1)-(2)~ 1,1 am- 2,3 (2НЗ)- 2,1 Р/.2 > 0,05 pi-з < 0,01 Р2-3< 0,01

ВСЕГО (41) 37,2±4,5 30,5±3,9 19,8±5,2 (1)-(2)~1,г анз)-1,9 (2)-(3) -1,5 Pi-2 >0,05 Pi-з < 0,01 Pi-3< 0,05

Эти данные подтверждены и при исследовании на значительно большем материале с использованием только сред Левенштейна-Йенсена и Мидцлбрука 7Н9 (табл. 5).

Вместе с тем, дополнительное (к среде 7Н9) культивирование на плотных средах (7Н11 и/или Л-И) обеспечивало более полное выделение микобактерий (по данным L. Heifets, 1997 до 10% HTM вырастает только на плотных средах).

Таблица 5.

Сроки выделения культур HTM на средах Левенштейна-Йенсена и Миддлбрука 7Н9

Вид микобактерий Длительность культивирования (дни) па среде; Различия в длительности культивирования (коэффициент) Достоверность различий (р)

Левеиштей-на-Йснсена Миддлбрука 7В9

МАС(\Щ 35,9 ±2,7 18,4 ±3,0 2,0 <0,01

М. капжи (51) 28,4 ±4,2 15,3 ±3,6 1,9 <0,01

М. хепор1(42) 36,2 ±3,9 20,8 ±3,5 1,7 <0,01

М. goгdonae(1б) 40,1 ±4,1 20,3 ± 2,2 2,0 <0,01

М. таппит (6) 33,3 ± 2,6 20,2 ±4,9 1,6 <0,01

М./опшШт (71) 37,8 ±1,7 16,2 ±5,1 2,3 <0,01

М. ске!опае (IV) 22,2 ±3,9 13,2 ±0,9 1,7 <0,01

М.Аауе.чсепя (8) 23,4 ±3,2 14,1 ±0,3 1,7 <0,01

ВСЕГО (311) 34,5±3,0 17,6±3,5 2,0 <0,01

В ходе проведенных исследований выявлено, что недостатком метода выделения микобактерий в жидких питательных средах является невозможность наблюдения за морфологией и хромогенностью колоний.

Преимущество яичных сред (в частности, Л-Й) - устойчивость к высыханию, а, следовательно, пригодность для инкубации в течение длительного периода. Однако, при росте контаминатов происходит разжижение среды, что приводит к прерыванию инкубации и потере клинически значимых штаммов микобактерий.

Следует также отметить, что агаровая среда Миддлбрука 7Н11, благодаря простому химическому составу, менее подвергалась контаминации, а наличие в ней гидролизата казеина способствовало росту штаммов, наиболее требовательных к условиям культивирования.

Кроме того, использование чашек с агаровой средой 7Н11 позволяло провести первичную идентификацию вида микобактерий по морфологии колоний и выбрать наиболее информативные биохимические тесты для окончательной

идентификации, получить чистую культуру в случаях обильного роста кокга-минантов и обнаружить смешанные культуры микобактерий.

Вместе с тем, следует иметь в виду, что недостатком применения чашек с агаровой средой 7Н11 в условиях централизованных микробиологических лабораторий с большим потоком исследований являются неудобства, связанные с серьезными трудозатратами по инкубированию и просмотру большого количества чашек, однако в пробирочном варианте эта среда может успешно применяться в комплексе выделения микобактерий. Исходя из вышеизложенного, целесообразнее агаровые чашки использовать для субкультивирования изоля-тов, полученных на плотной яичной или в жидкой питательных средах.

Необходимо подчеркнуть, что ни на одной из изученных питательных сред не удалось выделить из клинических образцов культуры микобактерий в 100% случаев, что является важным доводом для применения их комбинаций.

Самый высокий процент контаминации посевов наблюдался на среде JI-Й (11,2%), а самый низкий на среде 7Н11 (5,3%), 7,2% образцов было контамини-ровано в среде 7Н9.

В итоге проведенных исследований разработан оптимальный микробиологический комплекс методов выделения HTM: культивирование диагностического материала на модифицированной жидкой питательной среде Мидгщбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) в сочетании с использованием одной из плотных сред.

1.2. Идентификация видов HTM, выделенных в Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ

При изучении видового спектра выделенных в Центре HTM было установлено (табл. 6), что две трети из них относились к медленнорастущим (по классификации Runyon) и одна треть к быстрорастущим.

Самым распространенным видом были М. avium complex, что согласуется с известным (по данным зарубежных авторов) значением MAC в патологии человека. Вторыми по частоте выделения были М. fortuitum (однако, как одно-, так и повторное выделение быстрорастущих микобактерий, требует тщатель-

ного изучения наличия и особенностей симптомов заболевания для оценки их этиологической значимости). Затем следовали М. катаяИ и М. хепори У двоих больных М. хепор1 были обнаружены в операционном материале (содержимое туберкулемы, каверны), что даже при однократном их определении может служить подтверждением диагноза микобактериоза.

Таблица 6.

Частота обнаружения микобактерий при использовании микробиологических методов

Виды микобактерий Количество

Группа микобактерий всего в т.ч. в ассоциации %

М. tuberculosis complex М. tuberculosis 230 20* 27,3

М. bovis 2 0,2

ВСЕГО 232 20 27,6

Нетуберкулезные микобактерии

Медленнорастущие MAC 203 16** 24,1

М. kansassii 78 9,3

М. xenopi 83 9,9

М. gordonae 25 3,0

М. marinum 6 0,7

М. scrofulaceum 5 0,6

Прочие**** 6 0,7

Всего 406 16 48,3

Быстрорастущие M.fortuitum 169 8*** 20,1

М. chelonae 18 2,1

M.flavescens 15 1,8

Прочие**** 1 0,1

Всего 203 8 24,1

ВСЕГО HTM 609 24 72,4

ИТОГО 841 44 100,0

* В 14 пробах - с MAC и в 6 - с M.fortuiíum

** В 14 пробах -с М. tuberculosis и в 2 - с M.fortuiíum

*** В 2 пробах - с MAC и в 6 - с М. tuberculosis

**** Прочие (М. gastri, М. simiae - 2, М. szulgai, М. terrae, М. malmoensae, М. smegmatis)

232 культуры микобактерий в результате комплексного микробиологического исследования были отнесены к М. tuberculosis. В данном разделе работы

речь идет о тех культурах, которые первоначально вызвали трудности при дифференциации от HTM. В первую очередь, это культуры с нетипичной для М. tuberculosis морфологией колоний, выделенные на среде Л-Й от больных, длительно получавших противотуберкулезную терапию; в жидкой питательной среде - контаминированые посторонней микрофлорой или смешанные культуры микобактерий (М. tuberculosis + М. fortuitum, М. tuberculosis + MAC). При микроскопии мазков из таких культур не наблюдалось характерного расположения клеток в виде «кос» - проявление корд-фактора при росте в жидкой питательной среде, и морфология клеток М. tuberculosis была измененной.

Изучена также частота повторного выделения от больных одного и того же вида HTM (рис. 1) (это важно, т.к. повторное обнаружение HTM с большой вероятностью указывает на его этиологическую роль в развитии микобактерио-за).

Всего HTM повторно обнаружены у 114 больных; в 47 случаях (41,2%, что достоверно больше, чем другие виды микобактерий, р < 0,05) это были MAC, в 24 (21,1%) - М. kansasii, в 25 (21,9%) - М. fortuitum, в 12 (10,5) - М. xenopi, в 4 (3,5%) - М. flavescens и по 1 случаю (0,9%) - М. gordonae и М. smeg-matis.

Всего 114 случаев повторного выделения

□ М. gordonae □ М. kansatsii a MAC EJ М. xenopi

U M./lavescenx □ М. fortuitum □ М. smegmarís

б) частота повторного обнаружения

Рис. 1. Частота повторного выделения нетуберкулезных микобактерий (в %)

Двукратно выделили один и тот же вид HTM от 73 больных (64,0%), трехкратно - от 29 (25,4%) и более четырех раз - от 12 (10,5%) больных.

Здесь имеет смысл особо обратить внимание на случаи трехкратного и более обнаружения HTM у одного и того же больного. По критериям Американского торакального общества (Wallace R.et al., 1997) это является (при наличии клинико-рентгенологической симптоматики) важным диагностическим признаком микобактериоза. Всего трехкратно и более HTM были выделены от 41 больного - 36,0% всех случаев их повторного обнаружения (в т.ч. MAC- от 20, М. kansasii - от 8, М. fortuitum - от 8, М. xenopi - от 4, М. flavescens - от одного больного).

2. Применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения вида HTM

Содержание миколовых кислот, анализируемых методом ВЭЖХ, в бактериальной клетке является устойчивым фенотипическим признаком, характерным для каждого вида микобактерий, что позволяет получать достоверные, воспроизводимые результаты. Высокая чувствительность метода за счет применения флуоресцентного детектора дает возможность анализировать культуры, выделенные в жидких питательных средах, даже с небольшим содержанием бактериальных клеток, что значительно сокращает сроки идентификации.

Рис. 2. Анализ миколовых кислот М. avium с помощью метода ВЭЖХ: а - М. avium АТСС 35712 (из музея МНПЦБТ); б - культура № 4-М. avium, выделенная от больного

На рисунке 2 в качестве примера представлены хроматограммы, полученные при анализе миколовых кислот музейного штамма М. avium АТСС35712 и штамма, выделенного от больного, также идентифицированного, как М. avium.

Таблица 8.

Сравнительные данные идентификации микобактерий микробиологическими методами и ВЭЖХ *

Методы % совпадений

Группа микобактерий Вид микро-биоло-гяче-ские высокоэффск- тивпая жидкостная хроматография

М. tuberculosis com- М. tuberculosis 98 97

plex М. bovis 2 - 99,0

М. bovis BCG - 2

Медленнорастущие MAC 94 89 94,7

нетуберкулезные микобактерии М. kansasii 30 28 93,3

М. xenopi 37 35 94,6

М. gordonae 15 13 86,7

М. scrofulaceum 3 2 66,7

М. szulgai 1 1

М. таг'тит 1 1

М. gastri 1 1

М. terrae complex 1 1

Всего 183 171 93,4

Быстрорастущие нетуберкулезные микобактерии М. fortuitum 30 28 93,3

М. chelonae 5 5 100,0

М. flavescens 4 1 25,0

М. smegmatis 1 1

Всего 40 35 87,5

Всего HTM 223 206 92,4

ИТОГО 323 305 94,4

* В таблице за 100% взяты результаты микробиологического исследования, с которыми сопоставлены данные ВЭЖХ (в таблице не учитывали, что в ряде случаев окончательная идентификация была основана на результатах использования комплекса методов, включая ВЭЖХ и молекулярно-генетические исследования)

Совпадение результатов, полученных с помощью ВЭЖХ и бактериологических методов, имело место в 94,4% случаев; в том числе для медленнорастущих HTM - в 93,4%, быстрорастущих - в 87,5% (в целом для HTM - в 92,4%), а М. tuberculosis complex - в 99,0% (табл. 8.). При этом следует подчеркнуть, что идентификация вида HTM культуральными и биохимическими методами занимает до трех недель, тогда как применение ВЭЖХ сокращает это время до 24

часов (статистически достоверные различия результатов идентификации мико-бактерий микробиологическими методами и ВЭЖХ отсутствуют).

Проведено также сопоставление результатов идентификации методом ВЭЖХ культур микобактерий, выделенных в жидкой и на плотной питательных средах. Всего были проанализированы 243 культуры (сопоставляли данные идентификации только наиболее часто выделяемых культур). В целом совпадение результатов, полученных двумя методами при идентификации культур, выделенных в жидкой питательной среде, имело место в 93,4%, а на плотной - в 93,0% случаев (табл.9).

Таблица 9.

Результаты идентификации микобактерий, выделенных на плотной (Л-Й) и в жидкой (7Н9) питательных средах, с помощью ВЭЖХ

Результаты микробиологиче- скнх исследований (число выделенных культур) Выеокоэффективиая жидкостная хроматография, культуры со среды:

Левенштейна-Йенсена Миддлбрука 7Н9

абс. % совпадений абс. % совпадений

МАС(78) 74 94,9 74 94,9

M.fortuitum (65) 60 92,3 61 93,8

М. xenopi (38) 35 92,1 35 92,1

М. kansassii (32) 30 93,8 30 93,8

М. chelonae (12) 11 91,7 И 91,7

М. gordonae (11) 10 90,9 10 90,9

М. flavescens (7) 6 85,7 6 85,7

ВСЕГО (243) 226 93,0 227 93,4

Таким образом, независимо от того проводили с помощью ВЭЖХ анализ изолятов, выделенных в жидкой или на плотной питательных средах, получены практически идентичные данные, однако, использование культур с жидкой среды предпочтительнее из-за сокращения сроков получения результатов.

3. Молекулярно-генетические исследования для идентификации

HTM

Молекулярно-генетические методы в настоящее время широко используются для видовой идентификации микроорганизмов. После того, как был

полностью расшифрован геном ряда микобактерий, произошел существенный прогресс в разработке методов их идентификации и соответствующих диагностических тестов. Достаточно сложной задачей является поиск геномной мишени, при молекулярно-генетическом анализе которой возможна идентификация вида HTM (выбор мишени осложняется большим сродством геномов различных представителей рода Mycobacterium). В настоящее время, для этой цели используют инсерционные последовательности (IS900, IS901, IS1245, IS1561, IS2404), структурные гены (rpoB, gyrB, hsp65, secAJ, recA, sodA, ген 16S rRNA, область ITS гена 16SrRNA) микобактериальной ДНК.

На основе изучения микобактериального генома и исследований возможных генетических мишеней, приемлемых для видовой идентификации микобактерий, разработаны различные методы молекулярно-генетического определения вида микобактерий: полимеразная цепная реакция (ПЦР), ПЦР в сочетании с гибридизационным анализом, гибридизация in situ, ПЦР в сочетании с ре-стрикционным анализом (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов), се-квенирование. Чаще всего с этой целью используют ПЦР в сочетании с гибридизационным или рестрикционным анализом.

В настоящем исследовании для определения вида HTM были использованы два молекулярно-генетических метода - биологические микрочипы, разработанные совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, и вариант определения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена hsp65 в модификации МНПЦБТ.

3.1. Разработка и испытание биологического микрочипа (биочипа) для идентификации HTM

Одним из интенсивно развивающихся направлений биотехнологии нуклеиновых кислот в последнее время является использование микроматриц ДНК для анализа нуклеотидных последовательностей. В этой группе методов на небольшой по размеру поверхности стекла или другого твердого носителя иммобилизуют в виде правильно расположенных микропятен небольшие фрагменты ДНК с известной последовательностью нуклеотидов, которые далее использу-

ют для гибридизации с анализируемыми образцами нуклеиновых кислот. При совпадении первичной структуры ДНК микропятна и анализируемого образца на поверхности стекла образуются правильные ДНК-ДНК гибриды, которые обнаруживают по появлению сигналов в данных участках микроматрицы, например, в виде микроскопической флуоресцирующей точки. Твердые носители с нанесенными на них микроматрицами ДНК получили название микрочипов ДНК.

В настоящее время в Российской Федерации лицензированы две тест-системы с использованием биологических микрочипов, которые применяют во фтизиатрической практике. Это тест-система «ТБ-БИОЧИП», позволяющая одновременно выявлять М. tuberculosis в клиническом материале и определять их устойчивость к рифампицину и изониазиду, и тест-система «ТБ-БИОЧИП-2» -для определения лекарственной устойчивости М. tuberculosis к фторхинолонам (обе тест-системы разработаны в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, совместно с МНПЦБТ).

Идея создания биологических микрочипов для определения видов HTM возникла в связи с нарастающей актуальностью проблемы их идентификации и ускоренной лабораторной диагностики микобактериозов.

Предложенный метод основан на анализе видоспецифического участка гена gyrB, размером 371 п.н. и сегодня позволяет идентифицировать девять видов HIM (М. avium, М. intracellular, М. scrofulaceum, М. kansasii, М. gordonae, М. xenopi, М. marinum, М. fortuitum, М. chelonae) и дифференцировать их от М. tuberculosis complex. Разработку метода проводили поэтапно, с последовательным увеличением количества иммобилизированных в гелевых лунках биочипа специфических для разных видов микобактерий олигонуклеотидов. ДНК-ДНК гибридизация происходит в трехмерном измерении, что является отличительной особенностью данного вида биочипов от используемых за рубежом.

Ген gyrB ответственен за синтез ß-субъединицы фермента ДНК-гиразы (топоизомеразы II типа), которая индуцирует образование отрицательных сверхвитков в релаксированной кольцевой молекуле ДНК микобактерий в про-

цессе ее репликации. По данным Н. Kasai и соавт. (2000), ген gyrB является отличной мишенью для идентификации вида микобактерий. В отличие от таких генов как 16S-23S rRNA, 16S-23S rRNA ITS, регион gyrB обладает большей вариабельностью нуклеотидной последовательности и вследствие этого более высокой видоспецифичностью. Анализ гена gyrB, помимо идентификации тех видов, которые можно определить и с помощью изучения нуклеотидных последовательностей других (вышеуказанных) генов, позволяет дифференцировать М. kansasii от М. gastri, М. malmoense от М. szulgai, М. marinum от М. ulcerans, а также виды, входящие в М. tuberculosis complex, за исключением М. bovis BCG.

На сайте GenBank были взяты нуклеотидные последовательности гена gyrB разных видов микобактерий и с помощью программы Vector NTI 10, AlignX (Invitrogen, США) проведено их выравнивание относительно друг друга.

Ген gyrB представлен как консервативными областями, так и вариабельными видоспецифичными участками. Консервативные участки наиболее подходили для дизайна праймеров, а полиморфные вариабельные участки - это регион подбора видоспецифичных олигонуклеотидных зовдов. В работе М. Fuku-sbima и соавт. (2003) с целью видовой идентификации микобактерий предложено анализировать участок гена gyrB размером около 184 п.н. Вместе с тем, по результатам проведенного выравнивания нуклеотидных последовательностей этого гена стала очевидной целесообразность расширения данной (анализируемой) области, которая в итоге составила около 400 (371) п.н., тем самым, была повышена специфичность метода. Построение дендрограммы производили с помощью программы Vector NTI 10 (Invitrogen, США) и алгоритма Clustal W (рис. 3).

При анализе дендрограммы, построенной для 20 видов микобактерий, установлено, что, выбранная область гена gyrB, подходит для создания тест-системы для видовой идентификации микобактерий, а именно «БИОЧИП IMS».

енот—— IW-tfU

Рис. 3. Дендрограмма последовательности гена gyrB для некоторых видов микобакггерий, построенная на основании программы Vector NTI10 (Invitrogen, США) и алгоритма Clustal W

«БИОЧИП IMS» содержит 49 видоспецифичиых дискриминирующих иммобилизованных олигонуклеотидов, 3 маркерные ячейки для позиционирования изображения и 20 резервных ячеек. Гелевые ячейки, содержащие видос-пецифичные дискриминирующие олигонуклеотиды, объединены в 4 группы.

На рисунке 4 представлена картина гибридизации видоспецифических олигонуклеотидных зондов, иммобилизированных на биологическом микрочипе «IMS», с меченными флуоресцентной меткой комплементарными последовательностями ДНК ампликонов, полученных после проведения двухстадийной ПЦР, где в качестве матрицы использовали ДНК, выделенную из исследуемых культур микобактерий. Оценку результатов осуществляли с помощью программного обеспечения.

»ыш ||имт1*1Ч.:1И«1«1 «л*. 1 ы*| 1

М. intracellulare J Р

1 I МмМ^МММ&НеОДОНЗвМ C^CMMTto i^.fj^wtJ.Ui^L'. if;- 1 | * я. Г е - 1 _j«W.tMS61 1 /,2*.™*. -I | Po. |[ :.2l-w—. - J'iia^Ui :T2J 'OQ 1

Рис. 4. Анализ гибридизационной картины биочипа «IMS» с помощью программного обеспечения (гибридизационная картина, характерная для М. intracellulare)

При использовании предпоследнего варианта экспериментальной версии биочипов «EMS» изучены 187 культур микобактерий, выделенных из клинических образцов в жидкой и на плотной питательных средах. Был отмечен высокий процент совпадения результатов (92,6%) с данными микробиологических исследований (статистически достоверные различия результатов, полученных при использовании двух методов, отсутствовали) (табл. 10.).

В таблице не представлены результаты идентификации 39 культур HTM, принадлежащих к видам и подвидам, для определения которых данная версия биочипов «IMS» не предназначена (отрицательный результат их идентификации подтвердил специфичность методики). Но это было существенным недостатком данной версии биологических микрочипов, так как одним из видов, который невозможно было идентифицировать, оказались М. xenopi, часто выделяемые из биологического материала больных с подозрением на микобактери-альную инфекцию.

Таблица 10.

Видовая идентификация микобактерий с помощью экспериментальной версии биологических микрочипов «ШБ» и микробиологическими методами

зг п/п Вид микобактерий Микробиологическая идентификация БИОЧИП Число совпадений результатов (%)

1. М. tuberculosis М. tuberculosis 24 23 96,0

М. bovis 1 1

2. MAC М. avium 64 58 95,3

М. intracellulare 3

3. М. kansasii 20 18 90,0

4. M.fortuitum 18 16 88,9

6. М. gordonae 16 14 87,5

7. М. scrofulaceum 3 2 66,7

8. М. chelonae 1 1 100,0

9. М. marinum 1 1 100,0

ИТОГО 148 137 92,6

В связи с этим, на гелевую микроматрицу биочипа внесли дополнительные олигонуклеотидные зонды, специфичные в отношении данного вида микобактерий. Для проверки их специфичности, из собранной коллекции были выбраны ДНК культур, идентифицированных микробиологическими методами и ВЭЖХ как М. xenopi, а методом ПДРФ гена hsp65 как М. xenopi/M. gordonae и показавшие отрицательный результат гибридизации на предыдущей версии биочипов. После проведения идентификации 32 таких культур с помощью новой версии биочипов, было получено совпадение результатов в 100% случаев (в сравнительных исследованиях - их данные приведены в разделе 3.3., представлены результаты использования последней версии биочипа, с помощью которой можно идентифицировать и М. xenopi).

3.2. Видовая идентификация микобактерий с помощью ПДРФ Изучена также эффективность использования для идентификации HTM метода оценки полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) в модификации, ранее разработанной в МНПЦБТ (Краснова М.А., Макарова М.В. и др., 2006). Это было важно для последующего сравнения результатов, получен-

ных с помощью биологических микрочипов и ПДРФ (исследование ПДРФ проведено на значительно большем материале, чем в вышеуказанной работе).

Данная тест-система основана на ПДРФ гена hsp65 и предназначена для идентификации следующих видов микобактерий: М. avium, М. intracellulare, М. scrofulaceum, М. kansasii, М. fortuitum/M. chelonae, М. xenopi/M. gordonae, М. marinum, и их дифференциации от М. tuberculosis complex.

С использованием метода оценки ПДРФ исследованы 342 культуры микобактерий, выделенных на плотной (Л-Й) и в модифицированной жидкой (7Н9) питательных средах (табл. 11.).

Таблица 11.

Видовая идентификация микобактерий с помощью определения ПДРФ в сравнении с микробиологическими методами

Ж Вид микобактерий Микробиологическая идентификация ПДРФ reua hsp65 Число совпадений результатов (%)

1. М. tuberculosis 41 39 95,1

2. MAC М. avium 106 91 97,2

М. intracellulare 12

3. М. kansasii 57 57 100,0

4. М. xenopi/ М. gordonae М. xenopi 42 48 92,3

М. gordonae 10

5. М. marinum 5 3 60,0

6. М. scrofulaceum 2 2 100,0

7. M.fortuitum/ М. chelonae M.fortuitum 69 74 93,7

M. chelonae 10

ВСЕГО 342 326 95,3

Результаты проведенных исследований свидетельствовали о том, что распределение по частоте выявления видов HTM при использовании микробиологических методов и ПДРФ, в основном совпадало (в 95,3% случаев в целом), статистически достоверные различия данных, полученных при использовании двух методов, отсутствовали.

3.3. Сравнение результатов использования биочипов и других методов идентификации HTM

Представляло особый интерес оценить эффективность разработанного последнего варианта биологических микрочипов (включающего определение М. xenopi) для идентификации микобактерий в сравнении с данными, полученными с помощью ПДРФ и ВЭЖХ. Количество положительных результатов оценивали по отношению к показателям определения HTM микробиологическими методами (табл. 12).

Таблица 12.

Сопоставление результатов идентификации HTM, полученных с помощью биологических микрочипов, ПДРФ и ВЭЖХ, с данными микробиологических исследований (%)

Группа HTM Вид Методы п процент совпадений

Бночнп ПДРФ ВЭЖХ

абс. % абс. % абс. %

Медленнорастущие те (56) 53 94,6 52 92,9 52 92,9

М. kansasii (34) 31 91,2 33 97,1 32 94,1

М. xenopi (22) 21 95,5 31 93,9 21 95,5

М. gordonae (11) 10 90,9 10 90,9

М. marinum (3) 3 2 3

М. scrofiilaceum (3) 2 3 3

Всего (129) 120 93,0 121 94,0 121 94,0

Быстрорастущие M.fortuitum (42) 40 95,2 45 93,8 39 92,8

М. chelonae (6) 5 5

Всего (48) 45 93,8 45 93,8 44 91,7

Всего HTM (177) 165 93,2 166 93,8 165 93,2

Полученные тремя вышеуказанными методами данные при идентификации как медленнорастущих (биочип - 93,0% совпадений с результатами микро-кробиологических исследований, ПДРФ - 94,0%, ВЭЖХ - 94,0%), так и быстрорастущих (93,8%, 93,8%, 91,7% - соответственно) HTM вполне сопоставимы (статистически достоверные различия отсутствовали).

Основными причинами частичного несовпадения результатов идентификации HTM методом ВЭЖХ, молекулярно-генетическими и микробиологиче-

сними методами, являлись с одной стороны - вариабельность кулыуральных свойств разных штаммов внутри одного вида микобактерий, а с другой - схожесть этих свойств у некоторых представителей разных видов, большое сродство геномов разных видов микобактерий, а также «относительный» субъективизм в интерпретации результатов микробиологических тестов, хроматографи-ческих профилей и электрофореграмм (ПДРФ).

Таким образом, молекулярно-генетические методы («БИОЧИП IMS», ПДРФ) и ВЭЖХ показали высокую информативность при идентификации нетуберкулезных микобактерий - имел место высокий процент совпадения их результатов с данными, полученными с помощью микробиологических методов, при существенном сокращении времени проведения анализов. Необходимо подчеркнуть, что наиболее перспективным для идентификации HTM в практических микробиологических лабораториях может быть использование биологических микрочипов, поскольку этот метод прост в исполнении, стандартизирован и автоматизирован.

4. Виды HTM в городе Москве и характеристика их лекарственной чувствительности

Данные литературы свидетельствуют о том, что в разных регионах земного шара имеются различия как в частоте обнаружения разных видов HTM, так и в их чувствительности к противотуберкулезным (ПТП) и другим антибактериальным препаратам [Отген Т.Ф., Васильев A.B., 2005; Литвинов В.И. и др.,2008; Adle-Biassette Н., et al, 2003; Heifets L., 2004; Katoch V., 2004].

В связи с вышеизложенным, проанализирована частота обнаружения разных видов HTM в городе Москве с помощью разработанного оптимизированного комплекса исследований и определен спектр их чувствительности к антибактериальным препаратам.

4.1. Характеристика видов HTM в городе Москве

Установлено (рис. 5), что чаще среди HTM обнаруживали MAC (241 культура - 33,5%, что достоверно больше, чем других видов НТМ,/> < 0,01), М. fortuitum (209 культур - 29,0%, что достоверно больше —р < 0,01 — чем для всех

остальных видов HTM, за исключением MAC), М. xenopi (92 культуры - 12,8%), М. kansasii ('90 культур - 12,5%), реже М. gordonae (25 культур - 3,5%), М. che-lonae (20 культур - 2,8%), М. ßavescens (17 культур - 2,4%), ещё реже М. scrofulaceum (7 культур - 1,0%), М. marinum (6 культур - 0,8%), М. simiae (4 культуры - 0,6%), М. terrae (3 культуры - 0,4%), по две культуры (0,3%) М. gas-tri и М. smegmatis и по одной культуре (0,1%) М. szulgai, М. malmoense.

29,0

□ MAС UM.fortuitum UM. xenopi ОМ. kansasii UM. gordonae

ÜM.cheionae ОМ.ßavescens □ M. scrofulaceum □ M. marinum UM. simiae UM. terrae ШM. gastri □ V/. smegmatis ИM. szulgai UM. malmoense

Рис. 5. Виды нетуберкулезных микобактерий, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез

Эти данные отличаются от таковых, полученных в исследованиях, проведенных в других регионах мира, в частности, из медленнорастущих HTM М. xenopi в ряде стран находятся на втором месте по частоте обнаружения (после MAC). В Москве М. kansasii и М. xenopi выделяли практически с одинаковой частотой; среди быстрорастущих HTM в некоторых регионах мира наиболее часто обнаруживают М. chelonae, в Москве - М. fortuitum [Литвинов В.И. и др., 2008; Katoch V., Kumar М., 2001; Marras Т., Daley С., 2002].

Также проведен анализ частоты обнаружения HTM в клиническом материале за период 2006-2009 гг. (по годам). Он свидетельствует о существенном увеличении их количества в последние два года. Если в 2006 г. выделено 88

(2,5%), в 2007 г. - 90 (2,7%), то в 2008 г. - 278 (7,5%) и за 10 месяцев 2009 года - 264 (8,0%) изолятов HTM (от общего числа микобактерий) (рис. 6). Увеличился и процент выделения HTM по отношению к общему числу выполненных посевов (2006-2007гг. - 0,2%, 2008 г. - 0,6%, 2009 г. - 0,7%, в среднем за весь период 0,4%).

2,5

P2009-UHS > 0,05

до

2,7

Р20Ш007 <0,01

Р2007-2006 > 0,05

2006 2007 2008 2009(10мес.)

Годы

Рис. 6.2. Частота обнаружения HTM за период 2006-2009 гг.

Низкий показатель выделения HTM в 2006-2007 годы связан с отсутствием оптимальных методических возможностей, поскольку организация данного вида исследований только начиналась. В связи с этим, не все выделенные в лаборатории культуры HTM идентифицировали до вида, часть из них (полученные в жидкой питательной среде) только дифференцировали от микобактерий туберкулезного комплекса и при подсчете не учитывали. Начиная с 2008 года, выделение и идентификацию HTM проводили с использованием разработанного алгоритма, с применением вышеописанного набора питательных сред, моле-кулярно-генетических методов (ПДРФ, биочипы) и ВЭЖХ, что позволило ускорить процесс идентификации микобактерий и повысить его специфичность.

Благодаря этому, за последние годы ряду больных был установлен диагноз ми-кобактериоза (некоторым - вместо туберкулеза) и назначена соответствующая терапия; положительная динамика процесса в большинстве случаев подтвердила правильность диагноза.

4.2. Чувствительность HTM к антибактериальным препаратам Изучена чувствительность выделенных в городе Москве изолятов нетуберкулезных микобактерий к противотуберкулезным и ряду других антибактериальных препаратов: стрептомицину, изониазиду, рифампицину, этамбутолу, канамицину, этионамиду, циклосерину, ПАСК, капреомицину, офлоксацину, левофлоксацину, ципрофлоксацину, моксифлоксацину. Оценивали также частоту множественной лекарственной устойчивости - МЛУ (по критериям ВОЗ -как минимум к изониазиду и рифампицину), устойчивости ко всем препаратам основного ряда, XDR (по критериям ВОЗ - к рифампицину + изониазиду + к одному из фторхинолонов + к капреомицину/канамицину), устойчивости к одному фторхинолону или любому из антибактериальных препаратов.

Установлено, что выделенные культуры MAC в большинстве случаев устойчивы к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, этамбутолу, этионамиду, ПАСК, капреомицину, офлоксацину, левофлоксацину, в половине случаев - к канамицину, циклосерину и, как правило, чувствительны к ципрофлоксацину, моксифлоксацину. Устойчивость MAC ко всем противотуберкулезным препаратам основного ряда вьивили в 66,7% случаев, к одному фторхинолону- в 54,3% случаев, а хотя бы к одному антибактериальному препарату - в 86,4% случаев. Множественной лекарственной устойчивостью обладали 79,2% выделенных изолятов MAC, XDR среди них обнаружено не было.

М. kansasii в большинстве случаев проявляли резистентность к изониазиду и ПАСК, в половине случаев оказались чувствительными к основным и резервным противотуберкулезным препаратам. Устойчивость М. kansasii ко всем препаратам основного ряда определили в 21,6% случаев, МЛУ - в 32,4%, XDR - не было, устойчивость к одному фторхинолону выявлена в 16,2% случаев, а к одному антибактериальному препарату - в 73,0% случаев.

У М. xenopi в 2/3 случаев обнаружена устойчивость к рифампицину, этамбутолу и ПАСК, в половине - к изониазиду, офлоксацину, этамбутолу, в 1/3 случаев - к стрептомицину, этионамиду. К остальным антибактериальным препаратам этот вид HTM был чаще чувствителен. МЛУ у М. xenopi выявили в 33,3 % случаев, устойчивость ко всем противотуберкулезным препаратам основного ряда в 27,8% случаев, XDR у М. xenopi не обнаружена. К одному фторхинолону этот вид HTM был устойчив в 29,4% случаев, а к одному антибактериальному препарату - в 52,9% случаев.

M.fortuitum в 100% случаев проявляли устойчивость к стрептомицину и изониазду, почти в 100% - к рифампицину, этамбутолу, этионамиду, канами-цину, циклосерину, ПАСК и капреомицину, в половине случаев - к офлоксацину, левофлоксацину, и в 1/3 случаев к ципрофлоксацину и моксифлоксацину. МЛУ определяли в 94,6% случаев, устойчивость ко всем противотуберкулезным препаратам основного ряда - в 92,7%, XDR - в 3,8% случаев, устойчивость к одному фторхинолону обнаружена в 37,8% и к одному антибактериальному препарату - в 96,4% случаев.

О чувствительности к антибактериальным препаратам других выделенных видов HTM, делать выводы пока сложно из-за малого числа наблюдений.

Всего к стрептомицину оказались резистентными 63,9% медленнорастущих и 94,1% быстрорастущих HTM (в целом 73,1%), изониазиду 82,7%, 98,5% и 87,5%, соответственно; рифампицину - 59,6%, 88,2% и 68,3%, соответственно; этамбутолу - 62,2%, 86,8% и 69,6%, соответственно; канамицину - 39,5%, 81,8% и 53,8%, соответственно; этионамиду - 61,0%, 97,7% и 73,5%, соответственно; циклосерину - 33,3%, 87,7% и 51,7%, соответственно; ПАСК -88,6%, 92,5% и 89,9, соответственно; капреомицину - 31,0%, 83,3% и 46,3%, соответственно.

Что касается фторхинолонов, то к офлоксацину были устойчивы 51,7% медленнорастущих и 53,4% быстрорастущих HTM (в целом 52,3%), к левофлоксацину - 40,3 %, 48,8% и 43,2%, соответственно; к ципрофлоксацину -

16,7%, 25,0% и 18,8%, соответственно; к моксифлоксацину - 8,5%, 26,1% и 13,4%, соответственно (рис. 7).

□ Цнпрофлоксацнн □ Офлоксшош

□ Левофлоксацин □ Моксифлоксашш

Q МЛУ О Ко всем «репяратам основного ряда Q XDR О К фторхааолоаам (хотя бы к одмому)

Q Xow бы к од «ому препарату (любому)

Рис. 7. Частота устойчивости нетуберкулезных микобактерий к антибактериальным

препаратам

Множественная лекарственная устойчивость обнаружена в 52,6% случаев у медленнорастущих HTM и в 86,8% случаев у быстрорастущих (62,9% в целом), устойчивость ко всем ПТП основного ряда в 42,9%, 83,6% и 55,4% соответственно. XDR у медленнорастущих HTM отсутствовала, а у быстрорастущих выявлена в 3,1% случаев (в целом в 1,0%). Устойчивость к одному фтор-хинолону имела место в 36,0%, 38,6% и 36,9% соответственно, а к одному антибактериальному препарату - в 75,0%, 96,7% и 82,4% случаев соответственно.

Представленные данные свидетельствуют о том, что в городе Москве имеются определенные особенности чувствительности HTM к основным и резервным ПТП, и другим антибактериальным препаратам. При этом можно выделить два «положительных» момента - преимущественное сохранение чувствительности к таким фторхинолонам как ципрофлоксацин и моксифлоксацин, а

у ряда HTM и к трем резервным 11111 (канамицину, капреомицину и циклосе-рину).

Учитывая, что материал для исследования поступал из большинства противотуберкулезных диспансеров города Москвы, под наблюдением которых состоят больные туберкулезом и лица из групп риска заболевания туберкулезом из двух третей населения города, можно считать, что полученные результаты дают достоверное представление о видовом составе HTM и их лекарственной чувствительности в городе в целом.

Суммируя данные проведенных исследований, следует обратить внимание на то, что впервые было проведено сравнительное изучение наиболее эффективных современных методов выделения и идентификации HTM (микробиологических, молекулярно-генетических, ВЭЖХ), в результате для практического использования предложен их оптимальный комплекс (алгоритм). Также охарактеризованы особенности распространения разных видов HTM в городе Москве (включая данные об их лекарственной чувствительности), что чрезвычайно важно для практического здравоохранения.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что нетуберкулезные микобактерии в последние годы с возрастающей частотой обнаруживаются в клиническом материале, полученном от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез. В результате культурального исследования 163766 образцов такого материала, поступившего из противотуберкулезных учреждений города Москвы за период с января 2006 по ноябрь 2009гг., было получено 13784 изолятов микобактерий, из них к HTM отнесены - 720 (5,2 %) культуры. При этом если в 2006 г. выделено 88 (2,5%), в 2007 г. - 90 (2,7%), то в 2008 г. - 278 (7,5%) и за 10 месяцев 2009 года - 264 (8,0%) изолятов HTM (от общего числа выделенных микобактерий).

2. Наибольшее число HTM из клинического материала удается выделить при использовании модифицированной жидкой среды Миддлбрука 7Н9 в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 (85,4%), в сравнении с агаровой средой Миддлбрука 7Н11 (73,2%) и яичной средой Левенштейна-Йенсена

(65,9%). При этом срок детекции роста микобактерий при использовании жидкой питательной среды - 19,8±5,2 дней, что в 1,9 раз короче, чем на плотной яичной (37,2±4,5 дней) и в 1,5 раза, чем на плотной агаровой среде (30,5±3,9 дней).

3. Для видовой идентификации HTM разработан метод биологических микрочипов (БИОЧИП IMS), на основе поэтапного испытания различных вариантов биочипов с увеличением количества иммобилизированных в лунках с гелем специфических олигонуклеотидов (увеличение числа идентифицируемых HTM). БИОЧИП «IMS» позволяет идентифицировать 9 видов HTM: М. avium, М. intracellular, М. scrofiilaceum, М. kansasii, М. gordonae, М. xenopi, М. mari-пит, М. fortuitum, М. chelonae и дифференцировать их от М. tuberculosis complex.

4. Использованные для видовой идентификации микобактерий методы -микробиологические, биочипы, ПДРФ, ВЭЖХ дают сопоставимые результаты. При этом ВЭЖХ и молекулярно-генетические методы характеризуются более высокой специфичностью и скоростью получения результатов, а преимуществом биочипов также является автоматизированный учет с помощью программного обеспечения.

5. Разработан оптимальный комплекс методов (алгоритм) выделения и идентификации HTM, который включает выделение микобактерий с помощью культивирования биологического материала на двух питательных средах (жидкой и плотной) и применение ВЭЖХ и/или одного из молекулярно-генетических методов (ПДРФ, биочип - последний предпочтительнее) для определения вида выделенной культуры.

6. Охарактеризован видовой состав HTM, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез, в городе Москве. Установлено, что с наибольшей частотой среди медленнорастущих HTM из клинического материала выделяются MAC (33,6%), М. xenopi (13,2%) и М. kansasii (12,7%), а быстрорастущих -М. fortuitum (28,5%). Неоднократное обнаружение в материале, полученном от больного, одного и того же вида HTM, при отсутствии М. tuber-

culosis и наличии соответствующей клинико-рентгенологической симптоматики, дает основание для рассмотрения лечащим врачом в диагностическом ряду микобактериоза.

7. Установлено, что большинство клинических изолятов HTM, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве отличается высоким уровнем устойчивости как к основным, так и к большинству резервных противотуберкулезных препаратов и чувствительностью к таким фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.

8. Поскольку материал для исследования поступал в Централизованную микробиологическую лабораторию МНПЦБТ из противотуберкулезных диспансеров, в которых состоят на учете больные туберкулезом и лица из групп риска развития туберкулеза из двух третей населения города, данные видовой идентификации HTM и определения их чувствительности к антибактериальным препаратам отражают ситуацию в целом в городе Москве.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для эффективного выделения HTM из биологического материала рекомендуется его посев на две питательные среды: жидкую (Миддбрука 7Н9 в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) и одну из плотных (агаровую или яичную).

2. Для обнаружения смешанных культур микобактерий, получения чистой культуры и изучения культурально-морфологических свойств рекомендуется культуры HTM, выделенные в жидкой и/или на плотной питательных средах, субкультивировать на чашках с агаровой средой 7Н11.

4. Поскольку при использовании ВЭЖХ имеет место высокая степень совпадения результатов определения вида микобактерий с данными микробиологических исследований, этот метод может быть рекомендован для их определения в бактериологических референс-лабораториях, тем более что идентификация вида микробиологическими методами занимает до 3-4-х недель, тогда как применение ВЭЖХ сокращает ее время до 24 часов.

5. Результаты видовой идентификации культур нетуберкулезных микобактерий с помощью молекулярно-генетических методов - ПДРФ и биологических микрочипов, также как и ВЭЖХ, в большинстве случаев совпадают с данными микробиологических исследований, в связи с этим и быстрым получением результатов, данные методы также могут быть рекомендованы для практического использования. При этом преимуществом применения биочипов является простота метода и автоматизированный учет результатов с помощью программного обеспечения.

6. При неоднократном обнаружении у больного одного и того же вида HTM (в сочетании с клинико-рентгенологическими проявлениями заболевания) в диагностическом ряду рекомендуется рассматривать микобактериоз.

7. При проведении химиотерапии микобактериозов следует учитывать то, что HTM, как правило, устойчивы к основным и большинству резервных противотуберкулезных препаратов и чувствительны к фторхинолонам (ципрофлок-сацину и моксифлоксацину).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Краснова М.А. Идентификация микобактерий комплекса «MAIS» и М. tuberculosis методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена hsp65 / Макарова М.В., Скотникова О.И., Мороз А.М. // БЭБиМ. - 2006. - №8.-с. 188-191.

2. Макарова М.В. Нетуберкулезные микобактерии: классификация, эпидемиология, патология у людей и животных, лабораторная диагностика // Пробл. туб. и болезней легких.- М. - 2007. - №10. - с.7-17.

3. Краснова М.А. Применение молекулярно-генетических методов для определения вида микобактерий «MAIS» и М. tuberculosis complex / Макарова М.В., Дорожкова И.Р., Скотникова О.И., Мороз А.М. // Пробл. туб. и болезней легких. - М. - 2007. - №11. - с.29-33.

4. Макарова М.В. Изучение чувствительности нетуберкулезных микобактерий к химиопрепаратам / Фрейман Г.Е. // Туберкулез и болезни легких. -М. - 2009. - №7. - с.55-58.

5. Макарова М.В. Изучение чувствительности нетуберкулезных микобактерий, выделенных на плотных и жидких питательных средах, к противотуберкулезным препаратам / Фрейман Г.Е. // Туберкулез и болезни легких. - М. -2009. - №8. - с.49-51.

6. Макарова М.В. Частота обнаружения разных видов нетуберкулезных микобактерий в Москве / Краснова М.А., Фрейман Г.Е., Литвинов В.И. // Туберкулез и болезни легких. - М. - 2009. - №9. - с.29-32.

7. Макарова М.В. Выделение микобактерий на разных питательных средах и их идентификация / Левченко Т.Н., Фрейман Г.Е. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - М. - 2009. - №3. - с.7-10.

8. Макарова М.В. Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Краснова М.А., Мороз А.М. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - М. - 2009. - №3. - с.64-66.

9. Макарова М.В. Идентификация нетуберкулезных микобактерий / Краснова М.А. // Российский медицинский журнал.- М. - 2009. - №1. - с.27-29.

10. Литвинов В.И.. Нетуберкулезные микобактерии / Макарова М.В., Краснова М.А.// Изд.ЗАО «Информационные технологии в медицине». - 2008, 254 С.

11. Краснова М.А. Определение вида микобактерий комплексов MAIS и Mycobacterium tuberculosis методом рестрикционного анализа / Макарова М.В., Скотникова О.И. //Методические рекомендации №3. - М. - 2007. - 17С.

12. Макарова М.В. Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Краснова М.А. // Методические рекомендации №18. - М. - 2009. - 18 С.

13. Макарова М.В. Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий микробиологическими методами / Краснова М.А., Фрейман Г.Е. // Методические рекомендации №19. - М. - 2009. - 22 С.

14. Краснова М.А. Определение вида микобактерий комплекса MAIS и М. tuberculosis complex молекулярно-генетическими методами / Макарова М.В., Дорожкова И.Р., Скотникова О.И., Мороз А.М. // Научные труды (к 80-летию ведущего противотуберкулезного учреждения г.Москвы) Под редакцией академика РАМН В.ИЛитвинова. М.: МНПЦБТ. - 2007. - с.200-204

15. Макарова М.В. Нетуберкулезные микобактерии (обзор литературы) // Научные труды (к 80-летию ведущего противотуберкулезного учреждения г. Москвы) Под редакцией академика РАМН В.ИЛитвинова. М.: МНПЦБТ. -2007. - с.233-246

16. Скотникова О.И. Применение современных технологий для определения вида микобактерий и чувствительности Mycobacterium tuberculosis к лекарственным препаратам / Носова Е.Ю., Галкина К.Ю., Краснова М.А., Макарова М.В., Мороз А.М. // Туберкулез в России. Материалы VIII Российского съезда фтизиатров. - М.- 2007. - с.127-128.

17. Krasnova М.А. Species identification of mycobacteria in Moscow State / Makarova M.V. // В сб. тезисов «ERS». - Берлин. - 2008. - c.86

18. Литвинов В.И. Молекулярно-генетические технологии при туберкулезе / Носова Е.Ю., Макарова М.В., Краснова М.А., Мороз А.М. // Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций: Материалы Всерос. На-учн.-практ. конф. Под ред. Ю.Н. Левашова - С-Пб. - 2008. - с. 252-254

19. Макарова М.В. Выявление и идентификация нетуберкулезных микобактерий / Краснова М.А. // Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций: Материалы Всерос. Научн.-практ. конф./ Под ред. Ю.Н. Левашова - С-Пб. - 2008. - с. 254-256

20. Краснова М.А. Видовая идентификация микобактерий / Макарова М.В.// Научные труды 4-го конгресса Евро-Азиатского респираторного общества и 5-го международного конгресса пульмонологов Центральной Азии. - Ташкент. -2008.- с.92

21. Литвинов В.И. Нетуберкулезные микобактерии (Библиографический указатель) / Макарова М.В., Краснова М.А.// Изд.ЗАО «Информационные технологии в медицине». - 2008. - 96 С.

22. Макарова М.В. Нетуберкулезные микобактерии (выделение, идентификация) / Краснова М.А. // Тезисы докладов. VII Московская ассамблея «Здоровье столицы» 18-19 декабря 2008 г. - М.: ГЕОС, 2008. - с.149.

23. Адамбеков Д.А. Туберкулез и микобактериозы /Литвинов В.И., Макарова М.В., Гергерт В.Я., Сабодаха М.А. И В кн. «Микробиология и иммунология зооантропонозных инфекций» под ред.Д.А.Адамбекова, В.И.Покровского, В.И.Литвинова. - Бишкек, 2008. - с.298-375.

24. Makarova М. Isolation and identification of non-tuberculous mycobacteria (NTM) / Krasnova M. // European respiratory society, Austria, September 12-16, 2009. - p.2465.

25. Krasnova M.A. Mycobacteria identification using the experimental version of biological microchips / Makarova M.V. // 5th Congress of the International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. Abstract Book, 27-30 May 2009, Du-brovnik, Croatia. - p. 109

26. Макарова M.B. Видовая идентификация нетуберкулезных микобактерий / Краснова М.А. // Тезисы докладов. VIH Московская Ассамблея «Здоровье столицы» 17-18 декабря 2009 г. - М.: ГЕОС, 2009. - с. 218.

27. Макарова М.В. Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / Краснова М.А. // Сб.тр. к 85-летию со дня рождения М.М.Авербаха. Изд.ЗАО «Информационные технологии в медицине». - М. - 2010. - с.95-100.

28. Краснова М.А. Идентификация микобактерий молекулярно-генетическими методами /Макарова М.В. //Сб.тр. к 85-летию со дня рождения

М.М.Авербаха. Изд.ЗАО «Информационные технологии в медицине». -2010. - с.105-109.

Отпечатано в типографии "ООО Мирея" Тираж ЮОэкз. 48 полос Тел.: 963-06-11,963-08-18 г. Москва, ул. Потешная 6/2

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Макарова, Марина Витальевна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: НЕТУБЕРКУЛЕЗНЫЕ МИ-КОБАКТЕРИИ.

1.1. Классификация, обнаружение в окружающей среде, заражение человека и животных, эпидемиология.

1.2. Патогенность нетуберкулезных микобактерий, пути заражения, роль макроорганизма, виды патологии, вызываемой HTM.

1.3. Выделение, идентификация микобактерий, диагностика микобактериозов.

1.4. Лечение, лекарственная чувствительность.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Выделение и идентификация микобактерий микробиологическими методами.

2.1.1. Выделение микобактерий.

2.1.2. Первичная идентификация микобактерий кулъту-ралъными методами.

2.1.3. Биохимические методы идентификации, микобактерий

2.2. Высокоэффективная жидкостная хромотография (ВЭЖХ) для видовой идентификации микобактерий-.

2.3. Молекулярно-генетические методы идентификации1 микобактерий

2.3.1. Определение видовой принадлежности микобактерий методом гибридизации на. олигонуклеотидном. микрочипе «IMS».

2.3.2. Определение вида нетуберкулезных микобактерий с помощью оценки полиморфизма длин рестрикци-онных фрагментов (ПДРФ).

2.4. Определение лекарственной чувствительности нетуберкулезных микобактерий.

2.5. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ НЕТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ И ИХ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ.

3.1. Выделение HTM на разных питательных средах.

3.2. Идентификация видов, HTM, выделенных в Централизованной микробиологической лаборатории МНПЦБТ.

3.3. Микробиологические характеристики отдельных видов нету беркулезных микобактерий.

ГЛАВА 4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

ГЛАВА 5. ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ МОЛЕКУ-ЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИМИ МЕТОДАМИ.

5.1. Разработка и испытание биологического микрочипа (биочипа) для идентификации HTM.

5.2. Видовая идентификация микобактерий с помощью определения полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) гена hsp

5.3. Сравнительные данные использования «БИОЧИП IMS» и других.методов идентификации HTM.

ГЛАВА 6. ЧАСТОТА ОБНАРУЖЕНИЯ РАЗНЫХ ВИДОВ НЕТУБЕРКУЛЕЗНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ В ГОРОДЕ МОСКВЕ И ИХ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ

6.1. «Спектр HTM» в городе Москве. ¡

6.2. Изучение чувствительности нетуберкулезных микобактерий к антибактериальным препаратам.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений"

Актуальность проблемы

Нетуберкулезные микобактерии - это микроорганизмы, про которые в начале второй половины XX века хорошо знали микробиологи, а в некоторых странах и клиницисты (вызываемую ими патологию называют микобактериозами). Но затем эта проблема была в значительной степени забыта и вновь приобрела актуальность с распространением ВИЧ-инфекции, поскольку у ВИЧ-инфицированных (особенно на стадии СПИД) часто развиваются микобактериозы, которые в большом числе случаев приводят к летальному исходу [Katoch V., 2004; Khatter S., 2008].

В настоящее время род Mycobacterium включает более 100 видов, й их число продолжает увеличиваться [Euzeby J., 2003; Katoch V., 2004]. Из них наиболее распространены; M tuberculosis и M. leprae, вызывающие у людей хорошо известные заболевания. Несколько видов микобак-терий входят в так называемый М. tuberculosis complex: M. tuberculosis; M. bovis, M. africanum, M. microti, M. canetti, M. caprae, M. pinnipedii. Остальные широко распространены в окружающей среде как сапрофиты, однако в некоторых случаях они могут быть этиологическими факторами тяжелой (вплоть до смертельной) патологии, чаще у людей, имеющих нарушения иммунитета различной природы [Модель JI.M., 1958; Зыков М.П., 1984; Лазовская А.Л., 1991; Оттен Т.Ф., 1994, 1999; Новожилова И.А., 2004; Wolinsky Е., 1979, 1992; Tellis С., Putnam J., 1980; Grange J., Yaters M., 1986; Wallace R. et al., 1990, 1997; Olivier К., 1998; Dawson D.3 2000; Euzeby J., 2003; Heifets L., 2004; Jarzembowski J., Young M., 2008].

2004].

Значительный вклад в изучение нетуберкулезных микобактерий и вызываемой ими патологии внесли отечественные исследователи, работавшие в 50-70 годы XX века: JIM. Модель, М.М. Дыхно, Н.М. Макаре-вич, Н.М. Рудой, Я.А. Благодарный, Т.Б. Яблокова, Т.Б. Ильина, P.O. Драбкина, Ю.К. Вейсфейлер и др. Затем, в течение многих лет исследования в этой области продолжались лишь в некоторых регионах России, в первую очередь, в Санкт-Петербурге [Оттен Т.Ф., Васильев A.B.,

2005].

За это время ситуациям мире резко изменилась, число больных микобактериозами, во многих странах возросло в десятки раз. Это-явилось следствием-увеличения числа лиц с серьезными нарушениями иммунитета" (в первую очередь ВИЧ-инфицированных) [Marras Т., Daley С., 2002; Cole Т. et al., 2005], а также применения новых чувствительных и специфичных методов' выделения и идентификации микобактерий (культивирование в автоматизированных системах с использованием жидких питательных сред, молекулярно-генетические методы и высокоэффективная жидкостная* хроматография - ВЭЖХ), которые позволили существенно ускорить диагностику микобактериозов и повысить ее эффективность [Butler W., Guthertz L., 2001; Fukushima M. et al., 2003; Heifets L., 2004; Shin J. et al., 2009].

Заболевания, вызываемые разными видами HTM, характеризуются сходной с туберкулезом клинико-рентгенологической картиной, но требуют применения схем лечения, отличных от химиотерапии туберкулеза, из-за высокой их резистентности к противотуберкулезным препаратам [Оттен Т.Ф., Васильев A.B., 2005; Cole T.et al., 2005]. Перед мико-бактериологическими лабораториями стоят важные задачи по раннему выявлению и идентификации микобактерий туберкулезного комплекса (МБТ) и нетуберкулезных микобактерий. Это необходимо для своевременного проведения мероприятий по предотвращению распространения инфекции и назначения адекватной терапии.

В зарубежной литературе по данной проблеме в последние годы опубликовано много работ, исследования по изучению HTM и микобак-териозов прогрессируют стремительно [Wallace R. et al., 1990, 1997; Ка-toch V., 2004; Heifets L., 2004; Jarzembowski J., Young M., 2008].

К сожалению, в нашей стране понимание того, насколько важна эта проблема, еще не достигнуто, в абсолютном большинстве регионов отсутствуют также методические возможности, которые позволили бы реально идентифицировать вид нетуберкулезных микобактерий, установить диагноз микобактериоза и назначить своевременное лечение.

Цель исследования

Задачи исследования

1. Изучить эффективность использования наиболее широко применяющихся в мировой практике питательных сред: плотной яичной Левенштейна-Йенсена, плотной агаровой Миддлбрука 7Н11 и модифицированной жидкой Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) для выделения HTM.

2. Провести сравнительный анализ результатов применения для видовой идентификации микобактерий методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), оценки полиморфизма длин рестV рикционных фрагментов (ПДРФ) и микробиологических методов.

3. Разработать для видовой идентификации HTM новый молеку-лярно-генетический метод - биологические микрочипы, сопоставить эффективность его использования с результатами, полученными микробиологическими'методами, ПДРФ и ВЭЖХ.

Научная новизна исследования

В результате сравнительного изучения эффективности выделения HTM с помощью модифицированной жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной-системе BAGTEC MGIT 960) и плотных — агаровой (Миддлбрука 7Н11) и яичной (Левенштейна-Йенсена) питательных сред, установлено, что наибольшее число мико-. бактерий из клинического материала удается выделить при использовании жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9. При этом срок детекции роста микобактерий в 1,9 раз короче, чем на плотной яичной и в 1,5 раза, чем-.на плотной агаровой среде. Поскольку на плотных питательных средах дополнительно удается; получить до: 10% изолятов, оптимальным для i выделения:- HTM является' комплексное: применение жидкой и одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред.

Выявлено (при.; субкультивировании, на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11), что клинические изоляты, выделенные как в жидкой, так и на плотных питательных средах,, могут содержать несколько видов микобактерий.

Впервые для идентификации видов HTM разработан и применен метод биологических микрочипов: поэтапно испытаны несколько модификаций биочипов с последовательным увеличением количества им-мобилизированных в лунках с гелем специфических ол игону к л еотидов. В итоге полученный «БИОЧИП IMS» позволяет идентифицировать 9 видов HTM: М. avium, М. intracellulars; М scrofulaceum, М. kansasii, М. gordonae, М. xenopi, М. marinum, M.fortuitum, М chelonae и дифференцировать их от М. tiiberculosis complex.

При сравнительном изучении эффективности видовой идентифит кации микобактерий с помощью разработанных биочипов, методов .ПДРФ и ВЭЖХ. на большом объеме клинического материала показано, что все эти методы дают сопоставимые результаты с данными микробиологических исследований (не зависящие от того в жидкой или на плотных питательных средах выделены культуры микобактерий), но в значительно более короткие сроки. Дополнительным преимуществом биочипов является автоматизированный учет результатов с помощью программного обеспечения и возможность идентификации микобактерий непосредственно в клиническом материале.

Впервые разработан и обоснован оптимальный комплекс методов (алгоритм) выделения и идентификации HTM, который включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах -плотной и жидкой, и идентификацию полученной культуры микобактерий методами ВЭЖХ и/или ПДРФ, либо биологических микрочипов (использование последнего - предпочтительнее).

Впервые с помощью разработанного алгоритма охарактеризован видовой состав HTM, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез в городе Москве. С наибольшей частотой среди медленнорастущих HTM из,клинического материала выделяли MAC, М. xenopi и М. kansasii а быстрорастущих - М. fortuitum. Клинические изоляты HTM отличались-высоким уровнем устойчивости как к основным, так и к большинству резервных противотуберкулезных препаратов и чувствительностью к таким- фторхинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.

Практическая значимость работы и внедрение результатов в практику

Предложено для эффективного выделения HTM из биологического материала производить его посев на 2 питательные среды: жидкую Миддбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) и одну из плотных (агаровую или яичную). Субкультивирование на чашках с агаровой средой Миддлбрука 7Н11, выделенных в жидкой и на плотной яичной питательных средах культур, позволяет обнаружить несколько видов микобактерий и изучить их культур ально-морфологические свойства.

Высокая степень совпадения результатов, идентификации микобактерий методом, ВЭЖХ с данными микробиологических исследований, а также возможность идентификации большего числа видов, по сравнению с традиционными микробиологическими методами, определяет целесообразность применения этого метода в бактериологических референс-лабораториях. Важное практическое значение имеет сокращение времени такого исследования до 24-х часов, вместо 3-4-х недель при использовании микробиологических методов.

Результаты видовой идентификации культур HTM с помощью мо-лекулярно-генетических методов (ПДРФ и биологических микрочипов) аналогичным образом? в большинстве случаев' совпадают с данными микробиологических исследований, при- существенном сокращении времени их получения. В связи-с этим, указанные методы' могут быть использованы в лабораторной практике. Преимуществом применения* биочипов является простота метода, возможность.идентификации микобактерий- непосредственно^ В' клиническом, материале* и автоматизированный учет результатов.

При неоднократном обнаружении в материале, полученном от больного, одного* и того же вида HTM, при отсутствии М. tuberculosis и наличии клинико-рентгенологических проявлений заболевания, лечащим врачам в диагностическом ряду следует рассматривать микобакте-риоз.

При проведении химиотерапии микобактериозов следует учитывать, что HTM в большинстве случаев устойчивы к основным и резервным противотуберкулезным препаратам и чувствительны к таким фтор-хинолонам, как ципрофлоксацин и моксифлоксацин.

Результаты настоящей работы внедрены в практическую деятельность Централизованной микробиологической лаборатории Московского научно-практического центра борьбы с туберкулезом (МНПЦБТ), обслуживающей Центр и противотуберкулезные диспансеры города Моек-, вы. Они вошли в курс лекций и практических занятий на кафедре фти-зиопульмонологии РМАПО Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

На основании результатов проведенных исследований составлены и изданы методические рекомендации:

• «Идентификация микобактерий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии», утвержденные Департаментом- здравоохранения города Москвы 21.05.2009;

Основные положения, выносимые на защиту

1. Использование модифицированной жидкой питательной среды Миддлбрука 7Н9 (в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) в сочетании с одной из плотных (агаровой или яичной) питательных сред является оптимальным для выделения HTM из клинического материала.

2. Разработанный, путем поэтапного анализа различных модификаций с увеличением количества специфических олигонуклеотидов, им-мобилизированных в лунках с гелем, метод биологических микрочипов (БИОЧИП «IMS») является достоверным, простым и быстрым методом идентификации микобактерий видов: М. avium, М. intracellulars, М. scrofiilaceum, М. kansasii, М. gordonae, М. xeriopi, М. marinum, М. fortui-tum, М. chelonae и дифференциации их от М. tuberculosis complex.

4. Разработан алгоритм выделения и идентификации HTM, применение которого в лабораторной практике позволит улучшить диагностику микобактериозов. Он включает: культивирование биологического материала на двух питательных средах (жидкой и плотной); идентификацию выделенной культуры микобактерий методом ВЭЖХ и/или одним из молекулярно-генетических методов (ПДРФ и БИОЧИП-IMS); субкультивирование на чашках с агаровой средой 7Н11 для обнаружения смешанных культур микобактерий и проведения (в случаях необходимости) идентификации вида микробиологическими методами.

Апробация работы

Материалы диссертации представлены на научных форумах^ всероссийского и международного уровней, включая научно-практические; конференции и заседания Ученого* совета МНПЦБТ, 8-й Российский) съезд фтизиатров. (Москва, 2007 г.), Всероссийскую научно-практическую конференцию «Актуальные вопросы лечения туберкулеза различных локализаций» (Санкт-Петербург, 2008 г.),. 4-й конгресс ЕвроАзиатского респираторного обществами 5-й Международный конгресс; пульмонологов. Центральной Азии (Ташкент, 2008 г.), 7-ю и. 8-ю Московские Ассамблеи«Здоровьс Столицы» в.2008. г. и 2009 г., Европейские респираторнью конгрессы«(Берлин!2008¿г.,'Венш 2009> г.); 5-й. конгресс Международного противотуберкулезного союза (Дубровник 2009 г.).

Публикации !

По теме, диссертации опубликовано- 28 работ, в том числе одна книга, 9 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ.

Структура и объем-диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Макарова, Марина Витальевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что нетуберкулезные микобактерии в последние годы с возрастающей частотой обнаруживаются в клиническом материале, полученном от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез. В результате культурального исследования 163766 образцов такого материала, поступившего из противотуберкулезных учреждений, города Москвы за период с января 2006 по ноябрь 2009гг., было получено 13784 изолятов микобактерий, из них к HTM отнесены - 720 (5,2 %) культуры. При этом если в 2006 г. выделено 88 (2,5%), в 2007 г. - 90 (2,7%), то в 2008 г. - 278 (7,5%) и за 10 месяцев 2009 года - 264 (8,0%) изолятов HTM (от общего числа выделенных микобактерий).

2. Наибольшее число HTM из клинического материала удается выделить при использовании модифицированной жидкой среды Мидд-лбрука 7Н9 в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 (85,4%), в сравнении с агаровой средой Миддлбрука 7Н11 (73,2%) и яичной средой Левенштейна-Иенсена (65,9%). При этом срок детекции роста микобактерий при использовании жидкой питательной среды - 19,8±5,2 дней, что в 1,9 раз короче, чем на плотной яичной (37,2±4,5 дней) и в 1,5 раза, чем на плотной агаровой среде (30,5±3,9 дней).

3. Для видовой идентификации HTM разработан метод биологических микрочипов (БИОЧИП IMS), на основе поэтапного испытания различных вариантов биочипов с увеличением количества иммобилизиро-ванных в лунках с гелем специфических олигонуклеотидов (увеличение числа идентифицируемых HTM). БИОЧИП «IMS» позволяет идентифицировать 9 видов HTM: М. avium, М. intracellalare, М. scrofulaceum, М. kansasii, М. gordonae, М. xenopi, М. marinum, М. fortuitum, М. chelonae и дифференцировать их от М. tuberculosis complex.

4. Использованные для видовой идентификации микобактерий методы - микробиологические, биочипы, ПДРФ, ВЭЖХ дают сопоставимые результаты. При этом ВЭЖХ и молекулярно-генетические методы характеризуются более высокой специфичностью и скоростью получения результатов, а преимуществом биочипов также является автоматизированный учет с помощью программного обеспечения.

6. Охарактеризован видовой состав HTM, выделенных от больных туберкулезом и лиц с подозрением на туберкулез, в городе Москве. Установлено, что с наибольшей частотой среди медленнорастущих HTM из клинического материала выделяются MAC (33,6%), М. xenopi (13,2%) и М. kansasii (12,7%), а быстрорастущих - М. fortuitum (28,5%). Неоднократное обнаружение в материале, полученном от больного, одного и того же вида HTM, при отсутствии М. tuberculosis и наличии соответствующей клинико-рентгенологической симптоматики, дает основание для рассмотрения лечащим врачом в диагностическом ряду микобакте-риоза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для эффективного выделения HTM из биологического материала рекомендуется его посев на две питательные среды: жидкую (Мидцб-рука 7Н9 в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960) и одну из плотных (агаровую или яичную).

3. Культурально-морфологические и биохимические свойства разных штаммов одного и того же вида микобактерий вариабельны, что может приводить к неправильной их идентификации. При наличии в лаборатории более точных методов (например, молекулярно-генетических и ВЭЖХ), использование микробиологических тестов целесообразно лишь в отдельных (спорных) случаях. 4. Поскольку при использовании ВЭЖХ имеет место высокая степень совпадения результатов определения вида микобактерий с данными микробиологических исследований, этот метод может быть рекомендован для их определения в бактериологических референс-лабораториях, тем более что идентификация вида микробиологическими методами занимает до 3-4-х недель, тогда как применение ВЭЖХ сокращает ее время до 24 часов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Макарова, Марина Витальевна, Москва

1. Авербах М.М. (ред.) Иммунология и иммунопатология туберкулеза. М. Медицина. -1980.-318С.

2. Авербах М.М., Мороз A.M., Апт A.C. и др. Иммуногенетика инфекционных заболеваний. — М.: Медицина. 1985. - 253 С.

3. Александрова А.Е., Васильев A.B., Лозовская М.Э. Новые подходы к лечению микобактериозов легких/ЛТробл. туб. 1991. - №4. - с. 15-17.

4. Апт A.C. Генетические аспекты выявления группы риска по туберкулезу // Пробл. туб. 2001. - № 6. - с. 67-79.

5. Васильев A.B., Оттен Т.Ф. К вопросу о тактике ведения больных микобактериозом легких // Пробл. туб. 1991. - № 4. - с. 13-15.

6. Вейсфейлер Ю.К. Биология и изменчивость микобактерий туберкулеза и атипичные микобактерии. Экспериментальные и теоретические исследования. Будапешт.: Академия наук Венгрии. 1975. - 334 С.

7. Вишневский Б.И., Иванова Л.Л., Колечко Н.Г. и др. клиническое значение микобактерий туберкулеза с различными биологическими свойствами // Пробл, туб. 1991. - № 1.-е. 51-54.

8. Воробьев A.A., Бадукшанова Н.М., Дорожкова И.Р. и др. Идентификация микобактерий методом газожидкостной хроматогра-фии//Пробл. туб. 1991. -№ 7. - с. 46-50.

9. Драбкина P.O., Гельфер П.И., Клименко М. Т. Значение «атипичных» микобактерий при поражении почек // Пробл. туб. 1977. - № 10. -с. 80-81.

10. Дыхно М.М. Сравнительное изучение и методы дифференциации туберкулезных микобактерий, атипичных штаммов и кислотоустойчивых сапрофитов. Дисс. док.мед.наук. М. - 1963

11. Зыков М.П. Советская микобактериология на современном эта-пе//Сов. Мед. 1984. - № 1. - с. 64-68.

12. Ильина Т.Е., Вишневский Б.И., Войтова Д.И. и др. Микобакте-риозы легких в 1965-1980 гг. (по материалам ЛНИИТ) // 6-я конф. фтизиатров и пульмонологов Латвии: Тез. докл. Рига, 1981.-е. 120-121.

13. Калинина O.A. Гуморальный иммунитет при заражении и иммунизации микобактериями комплекса Mycobacterium avium-intracellularae-scrofulaceum (MAIS). Автореф. дисс. канд.мед.наук. -M.- 1992.-19 С.

14. Корзюков Ю.А. Болезни аквариумных рыб. М.:Колос. 1979.174 С.

15. Кочетков Б.И., Девятова А.И. Эффективность комплексной терапии микобактериозов легких в зависимости от видовой принадлежности возбудителя//Тер. арх. 1987. - № 7. - с. 80-82.

16. Краснова М.А., Макарова М.В., Скотникова О.И., Мороз A.M. Идентификация микобактерий комплекса «MAIS» и М. tuberculosis методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена hsp65// БЭБиМ. 2006. - №8.- с. 188-191.

17. Лазовская А.Л. Нерешенные проблемы микобактериозов// Пробл. туб. -1991.-№4.- с. 18-19.

18. Литвинов В.И., Гергерт В.Я., Мороз A.M. и др. Иммунология туберкулеза: современное состояние проблемы// Вестник РАМН. — 1999. №7.-с. 8-11.

19. Литвинов В.И., Макарова М.В., Краснова М.А. Нетуберкулезные микобактерии. М.: МНПЦБТ.-2008.- 256 С.

20. Макаревич Н.М. Атипичные микобактерии: методы идентификации, источники выделения, значение в клинике. Дисс. док.мед.наук. -М. 1973.

21. Макаревич Н.М. Чувствительность атипичных микобактерий к различным противотуберкулезным препаратам//Сб. научн. тр. т. 20. -М.: ЦНИИТ. - 1976. - с. 148-150.

22. Макаревич Н.М., Рудой Н.М., Ильина Т.Б. и др. Распространение нетуберкулезных микобактерий в отдельных регионах Советского Союза и их роль в заболевании человека//Сб. научн. тр. Фрунзе.: Киргиз. НИИ. - 1985. - с. 73-79.

23. Модель JT.M. Биология туберкулезных микобактерий и иммунология туберкулеза. М: Медгиз. - 1958. - 314 С.

24. Найманов А.Х. Аллергологическая диагностика микобактери-альных инфекций крупного рогатого скота//Автореф. дисс.д-ра ветеринарных наук. М. - 1993. - 29 С.

25. Новожилова И.А. Микобактериозы: прошлое, настоящее и будущее //Пробл.туб. и болезней легких. 2004. - № 9. - с. 3-9.

26. Оттен Т.Ф. Чувствительность некоторых видов нетуберкулезных микобактерий к антибиотикам и химиопрепаратам широкого спектра действия//Проблемы и перспективы развития бактериологии во фтизиатрии.-М.- 1988.-с. 87-91.

27. Оттен Т.Ф. Особенности бактериологической диагностики и этиотропной терапии микобактериоза легких: Автореф. дис. д-ра мед. наук.-СПб. 1994.-41 С.

28. Оттен Т. Ф. Микобактериоз легких: клинико-бактериологические критерии диагностики // БЦЖ. 1999. - № 3. - с. 17-19.

29. Оттен Т.Ф., Васильев A.B. Микобактериоз. СПб.: Мед. пресса.-2005.-224 С.

30. Оттен Т.Ф., Макроусов И.В., Нарвская О.В. и др. Возможности и перспективы бактериологической диагностики микобактериоза// Пробл.туб. и болезней легких. 2004. - № 5. - с. 32-35.

31. Покровский В.И., Гордиенко С.П., Литвинов В.И. Иммунология бактериальных инфекций. Руководство для врачей. М. - 1993. -306 С.

32. Покровский В.И., Адамбеков Д.А.Литвинов В.И. Иммунология бактериальных инфекций. Руководство для врачей. Москва-Бишкек. -1994.-c.145.

33. Финкель Е.А., Михайлова Л.В., Соколова М.А. и др. Некоторые бактериологические аспекты изучения нетуберкулезных микобакте-рий//4-й съезд фтизиатров Казахстана: Тез. докл. Алма-Ата. - 1992. - с. 126-127.

34. Ablordey A., Kotlowski R., Swings J. et al. PCR amplification with primers based on IS2404 and GC-rich repeated sequence reveals polymorphism in Mycobacterium ulcerans // J. Clin. Microbiol. 2005. - v. 43. - p. 448-451.

35. Adekambi Т., Revnaud-Gaubert M., Greub G. et al. Amoebal co-culture of "Mycobacterium massiliense" sp. nov. from the sputum of a patient with hemoptoic pneumonia // J. Clin. Microbiol. 2004. - v. 42. - p. 54935501.

36. Adle-Biassette H., Huerre M., Breton G. et al. Non-tuberculous mycobacterial diseases // Ann. Pathol. 2003. - v. 23. - p. 216-235.

37. Ahkee S., Srinath L., Huang A. et al. Clinical significance of my-cobacterium other than tuberculosis isolated from respiratory specimens at a university hospital // J. Ky. Med. Assoc. 1995. - v. 93. - p. 53-55.

38. Ahrens P., Giese S., Klausen J. et al. Two markers, IS901-IS902 and p40 identified by PCR and by using monoclonal antibodies in Mycobacterium avium strains // J. Clin. Microbiol. 1995. - v. 33. - p. 1049-1053.

39. Aldabagh В., Tomecki K. Cutaneous nontuberculous mycobacterial infections // Dermatol. Nurs.- 2009.-v.21(4).-p.l79-182.

40. AI Jarad N., Demertzis P., Jones D. et al. Comparison of characteristics of patients and treatment outcome for pulmonary non-tuberculous mycobacterial infection and pulmonary tuberculosis // Thorax. 1996. - v. 51.— p. 137-139.

41. Al-Mahruqi S, van-Ingen J, Al-Busaidy S, et al.Clinical relevance of nontuberculous Mycobacteria, Oman. // Emerg. Infect. Dis.- 2009. -v.15(2)- p.292-294.

42. Alvarado-Esquivel C., García-Corral N., Carrero-Dominguez D. et al. Molecular analysis of Mycobacterium isolater from extrapulmonary specimens obtained from patients in Mexico. // BMC. Clin. Pathol.- 2009.-v.9-p.l

43. Amfah G., Bonsu F., Tetteh C. et al. Buruli ulcer in Ghana: results of a national case search // Emerg. Infect. Dis. 2002. - v. 8. - p. 176-170.

44. Andréjak C., Thomsen V., Johansen I. et al. Nontuberculous Pulmonary Mycobacteriosis in Denmark: Incidence and Prognostic Factors // Am. J. Respir. Crit. Care Med.- 2010.- v. 181(5).-p.514-521.

45. Appelberg R., Castro A., Pedrosa J. et al. Role of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha during T-cell-independent and -dependent phases of Mycobacterium avium infection // Infect. Immun. — 1994. v. 62. -p. 3962-3971.

46. Arend S, van Soolingen D, Ottenhoff T. Diagnosis and treatment of lung infection with nontuberculous mycobacteria.// Curr Opin Pulm Med. -2009- v.l5(3)-p.201-208.

47. Armstrong K., James R., Dawson D. et al. Mycobacterium haemo-philum causing perihilar or cervical lymphadenitis in healthy children // J. Pe-diatr. 1992. - v. 121.-p. 202-205.

48. Bailey W. Treatment of atypical mycobacterial disease // Chest. -1983. -v. 84. -№ 5. P. 625-628.

49. Balcewicz-Sablinska MK, Gan H, Remold HG. Interleukin 10 produced by macrophages inoculated with Mycobacterium avium attenuates mycobacteria-induced apoptosis by reduction of TNF-alpha activity. // J. Infect. Dis. 1999.- v.l80(4)-p. 1230-1237.

50. Ballarino G., Olivier K., Claypool R., et al. Pulmonary nontubercu-lous mycobacterial infections: Antibiotic treatment and associated costs // Respir. Med.- 2009.-v.l03(10).-p.l448-1455.

51. Banks J., Jenkins P., Smith A. Pulmonary infections in Mycobacterium malmoense a review of treatment and response // Tubercle. — 1985. -v. 66.-p. 197-203.

52. Begg D., O'brien R., Mackintosh C. et al. Experimental infection model for Johne's disease in sheep // Infect. Immun. — 2005. — v. 73. p. 5603-5611.

53. Behr M., Falkinham J. Molecular epidemiology of nontuberculous mycobacteria // Future Microbiol.- 2009,- v.4.-p. 1009-1020.

54. Benator D., Gordin F. Nontuberculous mycobacteria in patients with human immunodeficiency virus infection // Semin. Respir. Infect. — 1996.-v. 11.-p. 285-300.

55. Bennett S., Peterson D., Johnson D. et al. Bronchoscopy-associated Mycobacterium xenopi pseudoinfections // Am. J. Respir. Crit. Care Med. -1994.-v. 150.-p. 245-250.

56. Beran V., Matlova L., Dvorska L. et al. Distribution of mycobacteria in clinically healthy ornamental fish and their aquarium environment // J. Fish Dis. 2006. - v. 29. - p. 383-393.

57. Biçmen C, Coçkun M, Gündüz A, et al. Identification of atypical mycobacteria isolated from clinical specimens by line probe assay (LIPA) // Mikrobiyol Bui. 2007.- v.41(4)-p.503-510.

58. Biehle J., Cavalieric S., Saubolle M. et al. Evaluation of E test for susceptibility testing of rapidly growing mycobacteria // J. Clin. Microbiol. — 1995.-v. 33.-p. 1760-1764.

59. Biet F., Boschiroli M., Thorel M. et al. Zoonotic aspects of Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC) // Vet. Res. 2005. - v. 36. - p. 411-436.

60. Black W., Berk S. Cooling towers a potential environmental source of slow-growing mycobacterial species // AIHA J. - 2003. - v. 64. -p. 238-242.

61. Blackwood K., Cheng H., Gunton J. et al., Evaluation of recA sequences for identification of Mycobacterium species // J. Clin. Microbiol. -2000.-v. 38.-p. 2846-2852.

62. Blyth C., Best E., Jones C. et al. Nontuberculous mycobacterial infection in children: a prospective national study // Pediatr Infect Dis J.- 2009.-v.28(9).-p.801-805.

63. Boddinghaus B., Rogall T., Flohr T. et al. Detection and identification of mycobacteria by amplification of rRNA // J. Clin. Microbiol. 1990. -v. 28.-p. 1751-1759.

64. Bodle EE, Cunningham JA, Della-Latta P, et al. Epidemiology of nontuberculous mycobacteria in patients without HIV infection, New York City // Emerg Infect Dis.- 2008. v. 14(3) - p.390-6.

65. Böttcher J., Gangl A. Mycobacterium avium ssp. Paratuberculosis -combined serological testing and classification of individual animals and herds // J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health. 2004. - v. 51. - p. 443-448.

66. Böttger E. Mycobacterium genavense: an emerging pathogen // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1994. - v. 13. - p. 932-936.

67. British Thoracic Society. Management of opportunistic mycobacterial infections: Joint Tuberculosis Committee guidelines 1999 // Thorax. -2000.-v. 55.-p. 210-218.

68. Brooker W., Aufderheide A. Genitourinary tract infection due to atypical mycobacteria // J. urol. 1980. - v. 124. - № 2. - P. 242-244.

69. Broussard G, Ennis D. Mycobacterium marinum produces long-term chronic infections in medaka: a new animal model for studying human tuberculosis // Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol. 2007 -v.145(1)-p.45-54.

70. Brown-Elliot B., Wallace R., Onyi G. et al. Activities of four mac-rolides, including clarithromycin, against Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chelonae, and M. chelonae-like organisms // Antimicrob. Agents Chemother. 1992. - v. 36. - p. 180-184.

71. Brown-Elliott B., Wallace P. Clinical and taxonomic status of pathogenic non-pigmented or late-pigmented rapidly growing mycibacteria // Clin. Microbiol. Rev. -2002. v. 15. - p. 716-746.

72. Bruijnesteijn van Coppenraet L., Kuijper E., Lindeboom J. et al. Mycobacterium haemophilum and lymphadenitis in children // Emerg. Infect. Dis.-2005.-v. 11.-p. 62-68.

73. Buijtels P., van-der-Sande M., de-Graaff C., et al., Nontuberculous mycobacteria, Zambia.Emerg // Infect Dis.- 2009. v. 15(2) - p.242-9.

74. Butler W., Guthertz L. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of Mycobacterium species // Clin. Microbiol. Rev.- 2001 v. 14(4) - p.704-26.

75. Butler W., Jost K., Kilburn J. et al. Identification of Mycobacteria by High-Performance Liquid Chromatography//J. Clin. Microbiol. -1991.-v. 29(1 l).-p.2468-2472.

76. Butler W., Kilburn J. Identification of major slowly growing pathogenic mycobacteria and Mycobacterium gordonae by high-performance liquidchromatography of their mycolic acids //J Clin. Microbiol.-1988.- v.26(l). -p.50-53.

77. Cage G. Direct identification of Mycobacterium species in BAC-TEC 7H12B medium by high-performance liquid chromatography // J. Clin. Microbiol. 1994.-v.32(2).-p.521-524.

78. Casal M., Casal M. Preliminary multicenter supveillance of atypical mycobacteria in some European countries // Clinical Mycobacteriology. -1998.-p. 77-81.

79. Cassidy P., Hedberg K., Saulson A. et al. Nontuberculous mycobacterial disease prevalence and risk factors: a changing epidemiology // Clin. Infect. Dis. -2009.-v. 49(12).-p.l24-129.

80. Castro C., Puerto G., Garcia L. et al. Molecular identification of non-tuberculous mycobacteria // Biomedica. 2007. - v. 27. - p. 439-446.

81. Caugant D., Sandven P. Mycobacteria other than tuberculosis isolated from patients in Norway 1995-1998 // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1999. -v. 3, № 9. - Suppl. - p. 187-188.

82. Chakrabarti A., Sharma M., Dubey M. Isolation rates of different mycobacterial species from Chandigarh (north India) // Indian J. Med. Res. -1990.-v. 91.-p. 111-114.

83. Chemlal K., Huys G., Laval F. et al. Characterization of an unusual Mycobacterium: a possible missing link between Mycobacterium marinum and Mycobacterium ulcerans // J. Clin. Microbiol. 2002. - v. 40. - p. 23702380.

84. Claydon E., Coker R., Harris J. Mycobacterium malmoense infection in HIV positive patients // J. Infect. Dis. 1991. - v. 164. - p. 432-433.

85. Cloud J., Neal H., Rosenberry R. et al. Identification of mycobacte-rium ssp. by using a commercial 16S ribosomal DNA sequencing kit and additional sequencing libraries // J. Clin. Microbiol. 2002. - v. 40. - p. 400406.

86. Cole T., Kewman D., Boninger M. Development of medical rehabilitation research in 20th-century America//Am J Phys Med Rehabil. 2005. -v. 84(12).-p.940-54.

87. Collins C., Grange J., Yates M. Mycobacteria in water // J. Appl. Bacteriol.- 1984,-v. 57.-p. 193-211.

88. Couto I., Machado D., Viveiros M.,et al. Identification of nontuber-culous mycobacteria in clinical samples using molecular methods: a 3-year study // Clin. Microbiol. Infect.- 2009. Epub ahead of print.

89. Crow H., King C., Smith E. et al. A limited clinical, pathologic, and epidemiologic study of patients with pulmonary lesions associated with atypical acid-fast bacilli in the sputum // Am. Rev. of Tuberc. 1957. - v. 75. - p. 199-222.

90. Cummins C. Ornithine in mucopeptide of Gram-positive cell walls // Nature. 1965. - v. 206. - p. 1272.

91. Cvetnic Z., Spicic S., Benic M. et al. Mycobacterial infection of pigs in Croatia //Acta. Vet. Hung. 2007. - v. 55. - p. 1-9.

92. Da Costa Cruz J. Mycobacterium fortuitum un novo bacilo acido-resistente patogenico para o homen // Acta. Med. 1938. - v. 1. - p. 298-301.

93. Daley C. Nontuberculous mycobacterial disease in transplant recipients: early diagnosis and treatment // Curr Opin Organ Transplant.- 2009.-v.l4(6).-p.619-624.

94. Daniel T., Illner J., Boom W.N. Immunology of Tuberculosis. In.: Tuberculosis. International Approach. L.Reichman, E.Heishfield, eds. Marcel Dekker. New York. - 2000. - p. 187-214.

95. Davidson P. The diagnosis and management of disease caused by M. avium complex, M. kansasii, and other mycobacteria // Clin, chest. Med. -1989.-v. 10. №3. - p. 431-443.

96. Dawson D. Mycobacterial terminology // J. Clin. Microbiol. -2000.-v. 38.-p. 3913.

97. Debrunner M., Salfînger M., Brandli O. et al. Epidemiology and clinical significance of nontuberculous mycobacteria in patients negative for human immunodeficiency virus in Switzerland // Clin. Infect. Dis. 1992. — v. 15.-p. 330-345.

98. Del Beccaro MA, Mendelman PM, Nolan C. Diagnostic usefulness of mycobacterial skin test antigens in childhood lymphadenitis // Pedi-atr. Infect. Dis. J. 1989 - v.8(4)-p.206-10.

99. De March Ayuela P. Infections caused by environmental mycobacteria in Spain // Med. Clin. (Bare). 2000. - v. 114. - p. 318-319.

100. Deutz A., Spergser J., Wagner P. et al. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in wild animal species and cattle in Styria/Austria // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. 2005. - v. 118. - p. 314-320.

101. Di Lonardo M., Isola N., Ambrogg M. et al. Mycobacteria in HIV infected patients in Buenos Aires // Tuber. Lung Dis. 1995. - v. 76. -p. 185-189.

102. Ding L., Lai C., Lee L. et al. Abdominal nontuberculous mycobacterial infection in a university hospital in Taiwan from 1997 to 2003 // J. Formos. Med. Assoc. 2006. - v. 105. - p. 370-376.

103. Dorman S., Subramanian A. AST Infectious Diseases Community of Practice.Nontuberculous mycobacteria in solid organ transplant recipients // Am. J. Transplant.- 2009.-v.9.- p.63-69.

104. Drancourt M. Out-of-water: emerging, nontuberculous mycobacteria// Clin. Microbiol. Infect. 2009.-v.l5(10).-p.887.

105. Dunne A., Kim-Berger H., Zimmermann S. et al. Atypical mycobacterial tuberculosis a diagnostic and therapeutic dilemma? Case reports and review of the literature // Otolaryngol. Pol. - 2003. - v. 57. - p. 17-23.

106. Duvall C. Studies in atypical forms of tubercle bacilli isolated directly from the human tissues in cases of primary cervical adenitis // J. Exp. Med. 1984. - v. 9. - p. 403-429.

107. Eda S., Elliott B., Scott M. et al. New method of serological testing for Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis (Johne's disease) by flow cytometry // Foodborne Pathol. Dis. 2005. - v. 2. - p. 250-262.

108. Eddyani M., Ofori-Adjei D., Teugels G. et al. Potential role for fish in trans mission of Mycobacterium ulcerans disease (Buruli ulcer): an environmental study // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - v. 70. - p. 56795681.

109. El Amin N., Hanson H., Pettersson B. et al. Identification of nontuberculous mycobacteria: 16S rRNA gene sequence analysis vs. conventional methods // Scand. J. Infect. Dis. 2000. - v. 32. - p. 47-50.

110. Ellner J., Goldberger M., Parenti D. M.avium infection and AIDS: A therapeutic dilemma in rapid evolution // J. Infect. Dis. 1992. - v. 165.-p. 577-580.

111. Elston D. Nontuberculous mycobacterial skin infections: recognition and management // Am. J. Clin. Dermatol. 2009.-v.l0(5).- p.281-285.

112. Esteban J., Fernandez Roblas R., Ortiz A. et al. Pseudo-outbreak of Mycobacterium gordonae: usefulness of randomly amplified polymorphic DNA analysis to assess the clonality of the isolates // Clin. Microbiol. Infect. -2006. v. 12.-p. 677-679.

113. Esther C., Henry M., Molina P. et al. Nontuberculous mycobacterial infection in young children with cystic fibrosis // Pediatr. Pulmonol. -2005.-v. 40.-p. 39-44.

114. Esther C. Jr, Esserman D., Gilligan P.et al. Chronic Mycobacterium abscessus infection and lung function decline in cystic fibrosis // J. Cyst. Fibros.- 2010.-v.9(2).-p. 117-123.

115. Euzeby J. List of bacterial names with standing in nomenclature — Genus Mycobacterium. 2003. — p. 12.

116. Fabry W., Schmid E., Ansorg R. Comparison of the E test and proportional dilution methods for susceptibility testing of Mycobacterium kansasii // Chemotherapy. 1995. - v. 41. - p. 247-252.

117. Falkinham J. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria // Clin. Microbiol. Rev. 1996. - v. 9. - p. 177-215.

118. Falkinham J. Nontuberculous mycobacteria in the environment // Clin. Chest Med.-2002.-v. 23.-p. 529-551.

119. Falkinham J. Mycobacterial aerosols ánd respiratory disease // Emerg. Infect. Dis. 2003. - v. 9. - p. 763-767.

120. Falkinham J. Surrounded by mycobacteria: nontuberculous mycobacteria in the human environment // J. Appl. Microbiol.- 2009.-v. 107(2).-p.356-367.

121. Fan M., Hadjiliadis D. Incidence and management of mycobacterial infection in solid organ transplant recipients // Curr. Infect. Dis. Rep.-2009.-v.ll(3).-p.216-222.

122. Feldman R., Hershfield E. Mycobacterial skin infection by an unidentified species. A report of 29 patients // Ann. Intern. Med. 1974. - v. 80.-p. 445-452.

123. Field S., Cowie R. Lung disease due to the more common nontuberculous mycobacteria // Chest. 2006. - v. 129. - p. 1653-1672.

124. Froman S, Lechtman M, Scammon L, et al. Mycobacteriophage lysates as serologic antigens // Am. Rev. Respir. Dis. 1961-v.83-p,.901-2.

125. Fukushima M., Kakinuma K., Hayashi H. et al. Detection and identification of Mycobacterium species isolates by DNA microarray // J. Clin. Microbiol.- 2003.- v.41(6).-p.2605-2615

126. Gauthier D., Vogelbein W., Ottinger C. Ultrastructure of Mycobacterium marinum granuloma in striped bass Morone saxatilis // Dis. Aquat. Organ. 2004. - v. 62. - p. 121-132.

127. Gay J., De Young D., Roberts G. In vitro activities of norfloxacin and ciprofloxacin against Mycobacterium tuberculosis, M. avium complex, M. chelonei, M. fortuitum, and M. kansasii // Antimicrob. Agents Chemother. 1984. - v. 26. - p. 94-96.

128. Ghadiali A., Strother M., Naser S. et al. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis strains isolated from Crohn's disease patients and animal species exhibit similar polymorphic locus patterns // J. Clin. Microbiol. 2004. - v. 42. - p. 5345-5348.

129. Giron RM, Maiz L, Barrio I, et al. Nontuberculous mycobacterial infection in patients with cystic fibrosis: a multicenter prevalence study // Arch Bronconeumol.- 2008 -v.44(12)-p.679-84.

130. Glassroth J. Pulmonary disease due to nontuberculous mycobacteria // Chest.- 2008.- v. 133(l).-p.243-251.

131. Good R., Snider D. Isolation of nontuberculous mycobacteria in the United States, 1980 // J. Infect. Dis. 1982. - v. 146. - p. 829-833.

132. Goslee S, Wolin sky E. Water as a source of potentially pathogenic mycobacteria // Am. Rev. Respir. Dis. 1976- v.l 13(3)-p.287-92.

133. Grange J. Infection and disease due to the environmental mycobacteria // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1987. - v. 81. - p. 179-182.

134. Grange J., Yates M. Infections caused by opportunist mycobacteria: a review // J. R. Soc. Med. 1986. - v. 79. - p. 226-229.

135. Grange J., Yates M., Pozniak A. Bacteriologically confirmed nontuberculous mycobacterial lymphadenitis in southeast England: a recent increase in the number of cases // Arch. Dis. Child. 1995. - v. 72. - p. 516517.

136. Grant I. Mycobacterium paratuberculosis and milk // Acta. Vet. Scand. 2003. - v. 44. - p. 261-266.

137. Griffith D. Nontuberculous mycobacteria // Curr. Opin. Pulm. Med. 1997. - v. 3. - p. 139-145.

138. Griffith D. Nontuberculous mycobacterial lung disease // Curr. Opin. Infect. Dis.- 2010. Epub ahead of print.

139. Griffith D., Girard W., Wallace R. Clinical features of pulmonary disease caused by rapidly growing mycobacteria: an analysis of 154 patients // Am. Rev. Respir. Dis. 1993. - v. 147. - p. 1271-1278.

140. Grifftth D., Brown B., Giard W. et al. Adverse events association with high dose rifabutin and macrolide containing regimens for the treatment of M. avium lung disease // Clin. Infect. Dis. 1995. - v. 21. - p. 594-598.

141. Grubek-Jaworska H, Walkiewicz R, Safianowska A, et al. Nontuberculous mycobacterial infections among patients suspected of pulmonary tuberculosis // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis.- 2009 v.28(7)p.739-744.

142. Guerrero C., Bernasconi C., Burki D. et al. A novel insertion element from Mycobacterium avium, IS 1245, is a specific target for analysis of strain relatedness// J. Clin. Microbiol. 1995. - v. 33. - p. 304-307.

143. Guthertz L., Damsker B., Bottome E. et al. Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare infections in patients with and without AIDS//J. Infect. Dis. 1989. - v. 160.-p. 1037-1041.

144. Guthertz L., Lim S., Jang Y. et al. Curvilinear-gradient highperformance liquid chromatography for identification of mycobacteria // J. Clin. Microbiol. -1993.-v.3 l(7).-p. 1876-1881.

145. Haider A., Schliep T., Zeana C. Nontuberculous mycobacterium disease with pleural empyema in a patient with advanced AIDS // Am. J. Med. Sei.- 2009.-v.338(5).-p.418-420.

146. Han X., De I., Jacobson K. Rapidly growing mycobacteria: clinical and microbiologic studies of 115 cases // Am. J. Clin. Pathol. 2007. -v. 128.-p. 612-621.

147. Hänsch H., Smith D., Mielke M. et al. Mechanisms of granuloma formation in murine Mycobacterium avium infection: the contribution of CD4+ T cells // Int. Immunol. 1996. - v. 8. - p. 1299-1310.

148. Harris N., Barletta R. Mycobacterium avium subsp. paratubercu-losis in Veterinary Medicine // Clin. Microbiol. Rev. 2001. - v. 14. - p. 489-512.

149. Hartman T., Swensen S., Williams D. Mycobacterium avium-intracellulare complex: evaluation with CT // Radiology. 1993. - v. 187. -p. 23-26.

150. Hartmann P., Plum G. Immunological defense mechanisms in tuberculosis and MAC-infection // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 1999. - v. 34.-p. 147-152.

151. Hautmann G., Lotti T. Atypical mycobacterial infections of the skin // Dermatol. Clin. 1994. - v. 12. - p. 657-668.

152. Haverkort F. National atypical mycobacteria survey, 2000 // Commun. Dis. Intell. -2003. v. 27. - p. 180-189.

153. Hawkins C., Gold W., Whimbey E. et al. M. avium complex infections in patient with acquired immunodeficiency syndrome // Ann. Intern. Med.- 1986.-v. 105.-p. 184-188.

154. Heifets L. Synergistic effect of rifampin, streptomycin, ethionamide, and ethambutol on Mycobacterium intracellulare // Am. Rev. Respir. Dis. 1982. - v. 125. - p. 43-48.

155. Heifets L. MIC as a quantitative measurement of the susceptibility of Mycobacterium avium strains to seven antituberculosis drugs // Anti-microb. Agents Chemother. 1988. - v. 32. - p. 1131-1136.

156. Heifets L. (ed.) Clinical Mycobacteriology // WB Saunders, Philadelphia. 1996. - 639 P.

157. Heifets L. Mycobacterial infections caused by nontuberculous mycobacteria // Semin. in Respir. Crit. Care Med. 2004. - v. 25 (3). - p. 283-295

158. Henry M., Inamdar L., O'Riordain D. et al. Nontuberculous mycobacteria in non-HIV patients: epidemiology, treatment and response // Eur. Respir. J. 2004. - v. 23. - p. 741-746.

159. Herbst L., Costa S., Weiss L. et al. Granulomatous skin lesions in moray eels caused by a novel Mycobacterium species related to Mycobacterium triplex // Infect. Immun. 2001. - v. 69. - p. 4639-4646.

160. Hernandez-Divers S., Shearer D. Pulmonary mycobacteriosis caused by Mycobacterium haemophilum and M. marinum in a royal python // J. Am. Vet. Med. Assoc. 2002. - v. 220. - p. 1661-1663.

161. Hettick J., Kashon M., Simpson J. et al. Proteomic profiling of intact mycobacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization time-offlight mass spectrometry // Anal. Chem. 2004. - v. 76. - p. 5769-5776.

162. Ho T., Rommelaere M., Coche E. et al. Nontuberculous mycobacterial pulmonary infection in renal transplant recipients // Transpl. Infect. Dis.- 2009.-v. 19. Epub ahead of print.

163. Hoy J., Rolston K., Hopfer R. et al. Mycobacterium fortuitum bacteremia in patients with cancer and long-term venous catheters // Am. J. Med.- 1987.-v. 83.-p. 213-217

164. Hoffman P., Fräser D., Robicsek F. et al. Two outbreaks of sternal wound infections due to organisms of the Mycobacterium fortuitum complex//J. Infect. Dis. 1981. - v. 143. - p. 533-542.

165. Holland S. Nontuberculous mycobacteria // Am. J. Med. Sei. -2001.-v. 321.-p. 49-55.

166. Hoover D., Graham N., Bacellar H. et al. An epidemiologic analysis of Mycobacterium avium complex disease in homosexual men infected with human immunodeficiency virus type 1 // Clin. Infect. Dis. 1995. -v. 20.-p. 1250-1258.

167. Horsburgh C. M.avium complex infection in the acquired immunodeficiency syndrome //N. Engl. J. Med. 1991. - v. 324. - p. 1332-1338.

168. Horsburgh C. Epidemiology of disease caused by nontuberculous mycobacteria // Semin. Respir. Infect. 1996. - v. 11. - p. 244-251.

169. Horsburgh C., Mason U., Farhi D. et al. Disseminated infection with Mycobacterium avium-intracellulare // Medicine. (Baltimor) 1985. - v. 64.-p. 36-48

170. Horsburgh C., Selik R. The epidemiology of disseminated non-tuberculous mycobacterial infection in the Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) // Am. Rev. Respir. Dis. 1989. - v. 139. - p. 4-7.

171. Hosker H., Lam C., Ng T. et al. The prevalence and clinical significance of pulmonary infection due to non-tuberculous mycobacteria in Hong-Kong // Respir. Med. 1995. - v. 89. - p. 3-8.

172. Hoy J., Rolston K., Hopfer R. et al. Mycobacterium fortuitum bacteremia in patients with cancer and long-term venous catheters // Am. J. Med.- 1987.-v. 83.-p. 213-217.

173. Huang C, Tsai Y, Shu C, et al.Clinical significance of isolation of nontuberculous mycobacteria in pulmonary tuberculosis patients // Respir. Med. -2009.-v.l03(10).-p. 1484-1491.

174. Huebner R., Schein M., Cauthen G., et al. Usefulness of skin testing with mycobacterial antigens in children with cervical lymphadenopa-thy //Pediatr. Infect. Dis. J. 1992. -v.ll(6)-p.450-6.

175. Igari H., Kikuchi N., Kawashima T. et al. The isolation of non-tuberculous mycobacteria and the pulmonary infections of nontuberculous mycobacteria in the general hospital // Kekkaku. 1994. - v. 69. - p. 483490.

176. Ingram C., Tanner D., Durack D. et al. Disseminated infection with rapidly growing mycobacteria // Clin. Infect. Dis. 1993. - v. 16. - p. 463-471.

177. Isaac-Renton J., Allen E., Chao C. et al. Isolation and geographic distribution of Mycobacterium other than M. tuberculosis in British Columbia, 1972-1981 // Can. Med. Assoc. J. 1985. - v. 133. - p. 573-576.

178. Iseman M. Mycobacterium avium complex and the normal host: the other side of the coin // Engl. J. Med. 1989. - v. 321. - p. 896-898.

179. Iseman M., Buschman D., Ackerson L. Pectus excavatum and scoliosis thoracic anomalies associated with pulmonary disease caused by M. avium complex // Am. Rev. Respir. Dis. 1991. - v. 144. - p. 914-916.

180. Iseman M., Marras T. The importance of nontuberculous mycobacterial lung disease // Am. J. Respir. Crit. Care. Med.- 2008.-v. 178(10).-p.999-1000.

181. Jacobson M., Hopewell P., Yajco D. et al. Natural history of disseminated Mycobacterium avium complex infection in AIDS // J. infect. Dis. -1991. v. 164. - № 5. - p. 994-998.

182. Jarzembowski J., Young M. Nontuberculous mycobacterial infections// Arch Pathol Lab Med. 2008. - v. 132(8). - p. 1333-41.

183. Jeong Y., Lee K., Koh W. et al. Nontuberculous mycobacterial pulmonary infection in immunocompetent patients: comparison of thin-section CT and histopathologic findings // Radiology. 2004. - v. 231. - p. 880-886.

184. Jesudason M., Gladstone P. Non tuberculous mycobacteria isolated from clinical specimens at a tertiary care hospital in South India // Indian J. Med. Microbiol. 2005. - v. 23. - p. 172-175.

185. Jun H., Jeon K., Um S., et al. Nontuberculous mycobacteria isolated during the treatment of pulmonary tuberculosis / /Respir. Med.- 2009.-v.l03(12).-p. 1936-1940.

186. Kalita JB, Rahman H, Baruah KC. Delayed post-operative wound infections due to non-tuberculous Mycobacterium // Indian J. Med. Res. 2005 -v.l22(6)-p.535-9.

187. Kasai H., Ezaki T., Harayama S. Differentiation of phylogeneti-cally related slowly growing mycobacteria by their gyrB sequences//.!. Clin. Microbiol. 2000. - v. 38. - p. 301-308.

188. Katoch V. Mechanisms of drug resistance in mycobacteria. In: Sygnal R L, Sood O P eds. Drug resistance: mechanisme and mangment. Proc 4 th. Annual Ranbaxy Science Foundation symposium. New Delhi. 1997. -p. 41-46.

189. Katoch V. Infections due to non-tuberculous mycobacteria (NTM) // Indian J. Med. Res. 2004. - v. 120. - p. 290-304.

190. Katoch V. Kumar M. Atipical mycobacterial infections. In: Sharma SK eds.: Tuberculosis Ist ed. New Delhi Jaypece Bradhers Medical Publishers (P) Ltd. -2001. p. 439-451.

191. Kaufmann S.Y. Is the development of a new tuberculosis vaccine possible? Nature Med. 2000. - v. 6. - p. 955-960.

192. Kawahara S., Nagare H. Nontuberculous mycobacteriosis; the present status and in the future. The view of development of new drugs against tuberculous mycobacterial infections // Kekkaku. 1998. - v. 73. - p. 77-82.

193. Kawata N., Kawahara S., Tada A. et al. Antimycobacterial susceptibility against nontuberculous mycobacteria using brothmic NTM // Kekkaku. 2006. - v. 81.-p. 329-335.

194. Kent M., Whipps C., Matthews J. et al. Mycobacterium in ze-brafish (Danio rerio) research facilities // Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 2004. - v. 138. - p. 383-390.

195. Kessler A., Kourtis A. Mycobacterium abscessus as a cause of pacemaker infection // Med. Sei. Monit. 2004. - v. 10. - p. 60-62.

196. Khatter S., Singh U., Arora J. et al. Mycobacterial infections in human immuno-deficiency virus seropositive patients: role of nontuberculous mycobacteria// Indian J Tuberc. 2008. - v. 55(1). - p.28-33.

197. Kiehn T., White M., Pursell K. et al. A cluster of four cases of Mycobacterium haemophilum infection // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1993.-v. 12.-p. 114-118.

198. Kiehn T., White M. Mycobacterium haemophilum: an emerging pathogen // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1994. - v. 13. - p. 925-931.

199. Kiehn T., Cynamon M., Inderlied C. et al. Antimycobacterial susceptibility testing for Mycobacterium tuberculosis: tentative standards // National Committee for Clinical Laboratory Standards document M24-T, December. 1995. - v. 15.-p. 1-31.

200. Kim B-J., Lee S-H., Lyu M-A. et al. Identification of mycobacterial species by comparative sequence analysis of the RNA polymerase gene// J. Clin. Microbiol. 1999. - v. 37. - p. 1714-1720.

201. Kim H., Mun H., Kim H. et al. Differentiation of Mycobacterial species by hsp65 duplex PCR followed by duplex-PCR-based restriction analysis and direct sequencing // J. Clin. Microbiol. 2006. - v. 44. - p. 3855-3862.

202. Kobashi Y, Mouri K, Miyashita N, et al. Clinical usefulness of QuantiFERON TB-2G test for the early diagnosis of pulmonary Mycobacterium kansasii disease // Jpn. J. Infect. Dis. 2009 - v.62(3) - p.239-241.

203. Koh W., Kwon O., Lee K. Nontuberculous mycobacterial pulmonary diseases in immunocompetent patients // Korean J. Radiol. 2002. — v. 3. — p. 145-157.

204. Kurashima A. Radiographic findings of pulmonary nontuberculous mycobacteriosis other than Mycobacterium avium complex // Kekkaku -2009.-v.84(8).-p.577-583.

205. Kuritsky J., Bullen M., Broome C. et al. Sternal wound infections and endocarditis due to organisms of the Mycobacterium fortuitum complex: a potential environmental source // Ann. Intern. Med. 1983. - v. 98.-p. 938-939.

206. Kuze F., Kurasawa T., Bando K. et al. In vitro and in vivo susceptibility of atypical mycobacteria to various drugs // Rev. Infect. Dis. — 1981.-v. 3.-P- 885-897.

207. Kwapinski J. Antigenic structure of the actinomycetales. XI. spectra of serological activities of the plasm antigens // Zentralb. Bacteriol. -1966.-v. 200.-p. 380-390.

208. Kwapinski J., Snyder M. Antigenic structure and serological relationships of Mycobacterium, Actinomyces, Streptococcus, and Diplococcus //J. Bacteriol. 1961.-v. 82.-p. 632-639.

209. La Bombardi V., Katariwala R., Pipia G. The identification of mycobacteria from solid media and directly from VersaTREK Myco bottles using the Sherlock Mycobacteria Identification HPLC system // Clin. Microbiol. Infect.- 2006.-v.l2(5).-p.478-481.

210. Lai C., Tan C., Chou C. et al. Increasing incidence of nontuberculous mycobacteria, Taiwan, 2000-2008 // Emerg. Infect. Dis.- 2010.-v.l6(2).-p.294-296.

211. Lai K., Stottmeier K., Sherman I. et al. Mycobacterial cervical lymphadenopathy // J.A.M.A. 1984. - v. 251. - p. 1286-1288.

212. Laussucq S., Baltch A., Smith R. et al. Nosocomial Mycobacterium fortuitum colonization from a contaminated ice machine // Am. Rev. Respir. Dis.- 1988.-v. 138.-p. 891-894.

213. Lebrun L., Weill F., Lafendi L. et al. Use of the INNO-LIPA-MYCOBATERIA assay (version 2) for identification of Mycobacterium avium intracellulare scrofulaceum complex isolates // J. Clin. Microbiol. -2005. v. 43. - p. 2567-2574.

214. Leite C., da Silva Rocha A., de Andrade Leite S. et al. A comparison of mycolic acid analysis for nontuberculous mycobacteria identification by thin-layer chromatography and molecular methods // Microbiol. Immunol. 2005. - v. 49. - p. 571-578.

215. Lerner C., Safdar A., Coppel S. Mycobacterium haemophilum infection in AIDS // Infect. Dis. Clin. Prac. 1995. - v. 4. - p. 233-236.

216. Leung K., Yip C., Cheung W. et al. Development of a simple and low- cost real-time PCR method for the identification of commonly encountered mycobacteria in a high throughput laboratory // J. Appl. Microbiol.- 2009.-v.l07(5).-p. 1433-1439.

217. Lewis A., Lasche E., Armstrong A. et al. A clinical study of the chronic lung disease due to nonphotochromogenic acid-fast bacilli // Ann. Intern. Med. 1960. - v. 53. - p. 273-285.

218. Leysen D., Haemers A., Pattyn S. Mycobacteria and the new quinolones // Antimicrob. Agents Chemother. 1989. - v. 33. - p. 1-5.

219. Li Z., Kang X., Yang Y. Detection and identification of the DNA between Mycobacterium tuberulosis and Mycobacterium nontubercu-losis by triplex polymerase chain reaction technique // Zhonghua Jie He He HuXi Za Zhi. 1998. - v. 21.-p. 547-551.

220. Lillis J., Ansdell V., Ruben K. Sequelae of World War II: an outbreak of chronic cutaneous nontuberculous mycobacterial infection among Satowanese islanders// Clin. Infect. Dis. 2009. - v.48(l 1) - p.1541-1546.

221. Linares M., Pelaez M., Casal M. Application of high-perfomance liquid crtromatography for identification of atypical mycobacteria // Clinical Mycobacteriology. 1998. - p. 185-188.

222. Linares M., Pelaez M., Casal M. Isolation of atypical mycobacteria from mycobacteria reference center in Spain // Int. J. Tuberc. Lung Dis. -1999. -v.3.-№9. -p. 181-182.

223. Liu Z., Cai X., Zhu P. et al. Study on species identification of Mycobacteria by gas chromatography analysis of whole-cell fatty acid // Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2005. - v. 28. - p. 403-406.

224. Lovodic-Sivcev B., Vukelic A. Changes in the kidneys in patients with successire findings of Mycobacterium xenopi and Mycobacteriumfortuitum in urine: report of 16 cases // Med. Pregl. 1999. - v. 52. - № 9-10. -p. 334-342.

225. Lu D., Heeren B., Dunne W. Comparison of the Automated Mycobacteria Growth Indicator Tube System (BACTEC 960/MGIT) with Lowenstein-Jensen medium for recovery of mycobacteria from clinical specimens //Am. J. Clin. Pathol. -2002.- v.ll8(4).-p.542-545.

226. McSwiggan D., Collins C. The isolation of M. kansasii and M. xenopi from water systems // Tubercle. 1974. — v. 55. — p. 291-297.

227. Mahaisavariya P., Chaiprasert A., Khemngern S. et al. Nontu-berculous mycobacterial skin infections: clinical and bacteriological studies // J. Med. Assoc. Thai. 2003. - v. 86. - p. 52-60.

228. Maloney S., Welbel S., Daves B. et al. Mycobacterium absces-sus pseudoinfection traced to an automated endoscope washer: utility of epidemiologic and laboratory investigations // J. Infect. Dis. 1994. - v. 169. -p. 1166-1169.

229. Marras T., Daley C. Epidemiology of human pulmonary infection with nontuberculous mycobacteria // Clin. Chest Med. 2002. - v. 23. -p. 553-567.

230. Marras T., Daley C. A systematic review of the clinical significance of pulmonary Mycobacterium kansasii isolates in HIV infection // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2004. - v. 36. - p. 883-889

231. Marsollier L., Andre J., Frigui W. et al. Early trafficking events of Mycobacterium ulcerans within Naucoris cimicoides // Cell Microbiol. -2007.-v. 9.-p. 347-355.

232. Martin-Casabona N., Bahrmand A., Bennedsen J. et al. Non-tuberculous mycobacteria: patterns of isolation. A multicountry retrospective survey // Int. J. Tuberc. Lung. Dis. 2004. - v. 8. - p. 1186-1193.

233. Matos E., Santana M., de Santana M. et al. Nontuberculosis mycobacteria at a multiresistant tuberculosis reference center in Bahia: clinical epidemiological aspects // Braz. J. Infect. Dis. 2004. - v. 8. - p. 296-304.

234. Mattila J., Katila M., Vornanen M. Slowly growing mycobacteria and chronic skin disorders // Clin. Infect. Dis. 1996. - v. 23. - p. 10431048.

235. Meissner G., Anz W. Sources of Mycobacterium avium-complex infection resulting in human disease // Am. Rev. Respir. Dis. 1977. -v. 116.-p. 1057-1064.

236. Miguez-Burbano M., Flores M., Ashkin D. et al. Non-tuberculous mycobacteria disease as a cause of hospitalization in HIV-infected subjects // Int. J. Infect. Dis. 2006. - v. 10. - p. 47-55.

237. Mishina D., Katsel P., Brown S. et al. On the etiology of Crohn disease // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. - v. 93. - p. 9816-9820.

238. Mohamed A., Kuyper D., Iwen P. et al. Computational approach involving use of the internal transcribed spacer 1 region for identification of Mycobacterium species//J. Clin. Microbiol. 2005. - v. 43. - p. 3811-3817.

239. Mondragón-Barreto M., Vázquez-Chacón C., Barrón-Rivero C. et al. Comparison among three methods for mycobacteria identification // Salud Publica Méx.- 2000.-v.42(6).-p.484-489.

240. Morris AJ Relier LB. Reliability of formation in BACTEC media for presumptive idtntification of mycobacteria // J. Clin. Microbiol.- 1993.

241. Munjal S., Tripathi B., Paliwal O. Progressive immunopa-thological changes during early stage of experimental infection of goats with Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis // Vet. Pathol. 2005. — v. 42.-p. 427-436.

242. Nalan P., Patel A. The epidemiology of human nontuberculous myco-bacterial disease in Queens land: 1985 to 1994 // Aust. and N. Z. J. Med. 1997. - v. 27. - № 2. - p. 216.

243. Narang R, Narang P, Mendiratta DK.Isolation and identification of nontuberculous mycobacteria from water and soil in central India // Indian. J. Med. Microbiol.- 2009 v.27(3) - p.247-250.

244. Nightingale S., Byrd L., Southern P. et al. Incidence of M. avium-intracellulare complex bacteremia in human immunodeficiency viruspositive patients // J. Infect. Dis. 1992. - v. 165. - p. 1082-1085.

245. Nightingale S., Cameron D., Gordin F. et al. Two controlled trials of rifabutin prophylaxis against Mycobacterium avium complex infections in AIDS // N. Engl. J. Med. 1993. - v. 329. - p. 828-833.

246. Nolt D., Michaels M., Wald E. Intrathoracic disease from nontuberculous mycobacteria in children: two cases and a review of the literature //Pediatrics.-2003.-v. 112.-p. 434.

247. O'Brien D., Currie B., Krause V. Nontuberculous mycobacte-rium disease in Northern Australia: a case series and review of the literature // Clin. Infect. Dis. 2000. - v. 31. - p. 958-968.

248. O'Brien R. The epidemiology of nontuberculous mycobacterial disease // Clin. Chest Med. 1989. - v. 10. - p. 407-418.

249. Olivier K. Nontuberculous mycobacterial pulmonary disease // Curr. Opin. Pulm. Med. 1998. - v. 4. - p. 148-153

250. Oliveira M., Fraga A., Torrado E. et al. Infection with Mycobacterium ulcerans induces persistent inflammatory responses in mice // Infect. Immun. 2005. - v. 73.-p. 6299-6310.

251. Ordway D., Henao-Tamayo M., Smith E. et al. Animal model of Mycobacterium abscessus lung infection // J. Leukoc. Biol. 2008. - v.

252. Ostroff S., Hutwagner L., Collin S. Mycobacterial species and drug resistance patterns reported by state laboratories 1992 // 93rd American

253. Society for Microbiology General Meeting, May 16, 1993. Atlanta, GA. -v. 9.-p. 170.

254. Park H., Jang H., Song E. et al. Detection and genotyping of Mycobacterium species from clinical isolates and specimens by oligonucleotide array // J. Clin. Microbiol. 2005. - v. 43. - p. 1782-1788.

255. Park H, Suh G, Chung M, et al. Comparison of clinical and radiographic characteristics between nodular bronchiectatic form of nontuber-culous //J. Korean Med Sei.- 2009. -v.24(3)-p.427-32.

256. Parti R., Srivastava S., Gachhui R. et al. Murine infection model for Mycobacterium fortuitum // Microbes Infect. 2005. — v.l.- p. 349-355.

257. Pate M., Jencic V., Zolnir-Dovc M. et al. Detection of mycobacteria in aquarium fish in Slovenia by culture and molecular methods // Dis. Aquat. Organ. 2005. - v. 64. - p. 29-35.

258. Patel J., Leonard D., Pan X. et al. Sequence-based identification of Mycobacterium species using the MicroSeq 500 16S rDNA bacterial identification system // J. Clin. Microbiol. 2000. - v. 38. - p. 246-251.

259. Patz E., Swenson S., Erasmus J. Pulmonary manifestation of nontuberculous mycobacteria // Radiol. Clin. North Am. 1995. - v. 33. - p. 719-729.

260. Piersimoni C., Scarparo C. Extrapulmonary infections associated with nontuberculous mycobacteria in immunocompetent persons // Emerg. Infect. Dis. -2009.-v.l5(9).-p.l351-1358.

261. Pinner M. Atypical acid fast microorganisms // Am. Rev. Tu-berc. 1935. - v. 32. - p. 424-445.

262. Pizzi R, Miller J.Amputation of a Mycobacterium marinum-infected hindlimb in an African bullfrog (Pyxicephalus adspersus). // Vet Ree.- 2005 v. 156(23) - p.747-8.

263. Polverosi R., Guarise A., Balestro E. et al. High-resolution CT of nontuberculous mycobacteria pulmonary infection in immunocompetent, non-HIV-positive patients // Radiol Med.- 2009,-v. 14. Epub ahead of print.

264. Portaeis F. Epidemiology of mycobacterial diseases // Clin. Dermatol. 1995. - v. 297. - p. 207-222.

265. Prearo M, Zanoni RG, Campo Dall'Orto B, Pavoletti E, et al. Mycobacterioses: emerging pathologies in aquarium fish // Vet Res Commun. 2004 Suppl v.315-317.

266. Primack S., Logan P., Hartman T. et al. Pulmonary tuberculosis and Mycobacterium avium-intracellulare: a comparison of CT findings // Radiology. 1995. - v. 194.-p. 413-417.

267. Primm T., Lucero C., Falkinham J. Health impact of environmental mycobacteria // Clin. Microbiol. Rev. 2004. - v. 17. - p. 98-106.

268. Prince D., Peterson D., Steiner R. et al. Infection with Mycobacterium avium complex in patients without predisposing conditions // N. Engl. J. Med. 1989. - v. 321. - p. 863-868.

269. Razonable R. Nontuberculous mycobacterial infections after transplantation: a diversity of pathogens and clinical syndromes // Transpl. Infect. Dis.- 2009.-v.l l(3).-p.191-194.

270. Reddy V., Luna-Herrera J., Gangadharam P. Pathobiological significance of colony morphology in Mycobacterium avium complex // Mi-crob. Pathog.- 1996.-v. 21.-p. 97-109.

271. Reuss A., Wiese-Posselt M., Weimann B. et al. Incidence rate of nontuberculous mycobacterial disease in immunocompetent children: a prospective nationwide surveillance study in germany // Pediatr. Infect. Dis. J.-2009 v.28(7)- p.642-644.

272. Richardson E., Samson D, Banaei N. Rapid Identification of Mycobacterium tuberculosis and nontuberculous mycobacteria by multiplex, real-time PCR// J. Clin. Microbiol.- 2009 v.47(5) - p.1497-1502.

273. Richter E., Wessling J., Lügering N. et al. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis infection in a patient with HIV, Germany // Emerg. Infect. Dis. 2002. - v. 8. - p. 729-731.

274. Roque S., Nobrega S., Appelberg R. et al. IL-10 underlies distinct susceptibility of BALB/c and C57BL/6 mice to Mycobacterium avium infection and influences efficacy of antibiotic therapy // J. Immunol. 2007. -v. 178.-p. 8028-8035.

275. Rosezweig D. Pulmonary mycobacterial infections due to Mycobacterium intracellulare-avium complex: clinical features and course in 100 consecutive cases // Chest. 1979. - v. 75. - p. 115-119.

276. Roth A., Fischer M., Hamid M. et al. Differentiation of phy-logenetically related slowly growing mycobacteria based on 16S-23S rRNA gene internal transcribed spacer sequence // J. Clin. Microbiol. 1998. - v. 36.-p. 139-147.

277. Roux A., Catherinot E., Ripoll F. et al. Jean-Louis Herrmann for the OMA Group.Multicenter study of prevalence of nontuberculous mycobacteria in patients with cystic fibrosis in France // J. Clin. Microbiol. -2009.-v.47(12).-p.4124-4128

278. Rushton S., Goodfellow M., O'Donnell A. et al. The epidemiology of atypical mycobacterial diseases in northern England: a space-time clustering and generalized linear modelling approach // Epidemiol. Infect. -2007.-v. 135.-p. 765-774.

279. Sakatani M. Nontuberculous mycobacteriosis: the present status of epidemiology and clinical studies // Kekkaku. 1999. - v. 74. - № 4. - p. 377-384.

280. Sakatani M. The non-tuberculous mycobacteriosis // Kekkaku. -2005.-v. 80.-p. 25-30.

281. Sakatani M., Nakajima Y. Treatment of non-tuberculous pulmonary mycobacteriosis // Kekkaku. 2006. - v. 81. - p. 35-50.

282. Sampaio J., Artiles N., Pereira R. et al. Mycobacterium simiae infection in a patient with acquired immunodeficiency syndrome // Braz. J. Infect. Dis.-2001.-v. 5.-p. 352-355.

283. Samra Z., Kaufman L., Pitlik S. et al. Emergence of Mycobacterium simiae in respiratory specimens // Scand. J. Infect. Dis. 2005. - v. 37. -p. 838-841.

284. Sarmentó de Castro R., Vasconcelos O., Horta A. et al. Atypical mycobacteria infections // Acta. Med. Port. 1999. - v. 12. - p. 371-379.

285. Scarparo C., Piccoli P., Rigon A. et al. Direct identification from MB/BacT alert 3D bottles: comparative evaluation of two commercial probe assays //J. Clin. Microbiol. 2001. - v. 39. - p. 3222-3227.

286. Schaad U., Votteler T., McCracken H. et al. Management of atypical mycobacterial lymphadenitis in childhood: a review based on 380 cases // J. Pediatr. 1979. - v. 95. - p. 356-360.

287. Schroder K., Kazda J., Muller K. et al. Isolation of Mycobacterium simiae from the environment // Zentralbl. Bakteriol. 1992. - v. 277. -p. 561-564.

288. Schulze-Robbecke R. Mycobacteria in the environment // Immun. Infect. 1993. - v. 21. - p. 126-131.

289. Shafer R., Sierra M. Mycobacterium xenopi, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium kansasii, and other non-tuberculous mycobacteria in an area of endemicity for AIDS // Clin. Infect. Dis. 1992. - v. 15. - p. 161-162.

290. Sherer R., Sable R., Sonnenberg M. et al. Disseminated infection with Mycobacterium kansasii in the Acquired Immunodeficiency Syndrome // Ann. Intern. Med. 1986. - v. 105. - p. 710-712.

291. Shin J., Lee H., Cho E., et al. Targeting the rpoB gene using nested PCR-restriction fragment length polymorphism for identification ofnontuberculous mycobacteria in hospital tap water // J. Microbiol.- 2008 -v.46(6)-p.608-614.

292. Siddiqi S.H., Laszlo A, Buthler W. R. et el. Bacteriological investigation of unusual mycobacteria isolated from immuno-compromised patients // Diagn. Microbiol. Infect. DIS. 1993.- v. 6.-p. 321-323

293. Singh S., Gopinath K., Shahdad S. et al. Nontuberculous mycobacterial infections in Indian AIDS patients detected by a novel set of ESAT-6 polymerase chain reaction primers // Jpn. J. Infect. Dis. 2007. - v. 60. - p. 14-18.

294. Smith D., Hansch H., Bancroft G. et al. T cell independent mechanisms of granuloma formation in M. avium infection: role of TNFa and IFNy//Immunology. 1997. - v. 92. - p. 413-419.

295. Somoskovi A, Mester J, Hale Y, Parsons L, Salfinger M. Laboratory diagnosis of nontuberculous mycobacteria // Clin. Chest. Med.- 2002.-v. 23(3).-p.585-597.

296. Sorlozano A., Soria I., Roman J. et al. Comparative evaluation of three culture methods for the isolation of mycobacteria from clinical samples //J. Microbiol. Biotechnol.- 2009.- v.l9(10).-pl259-1264.

297. Stager C., Libonati J., Siddiqi S. et al. Role of solid media when used in conjunction with the BACTEC system for mycobacterial isolation and identification// J. Clin. Microbiol.- 1991.-v.29(l).-p.l54-157.

298. Starke J. Mycobacterial infections // Handb. Clin. Neurol. -2010.-v.96.-p.l59-177.

299. Stavri H., Branaru-Gheorghiu M., Moldovan O. et al. Rapid immunochromatographic serum assay of nontuberculous mycobacterial infections // Roum. Arch. Microbiol. Immunol. 2005. - v. 64. - p. 42-49.

300. Steadham J. High-catalase strains of M. kansasii isolated from water in Texas // J. Clin. Microbiol. 1980. - v. 11. - p. 496-498.

301. Steadham J., Stall S., Simmank J. Use of the BACTEC system for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis, M. kansasii, and M. avium complex // Diagn. Microbiol. Infect. 1985. - v. 3. - p. 33-40.

302. Stracher A., Sepkowitz K. Atypical mycobacterial infections in HIV disease // AIDS Reader. 1995. - p. 14-25.

303. Swaim L., Connolly L., Volkman H. et al. Mycobacterium marinum infection of adult zebrafish causes caseating granulomatous tuberculosis and is moderated by adaptive immunity // Infect. Immun. 2006. - v. 74.-p. 6108-6117.

304. Swenson J., Wallace R., Silcox V. et al. Antimicrobial susceptibility testing of 5 subgroups of Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium chelonae // Antimicrob. Agents Chemother. 1985. - v. 28. - p. 807-811.

305. Szabo I. Mycobacterium chelonei endemy after heart surgery with fatal consequences // Am. Rev. Respir. 1980. - v. 121. - p. 607-611.

306. Tabarsi P, Baghaei P, Farnia P, et al. Nontuberculous mycobacteria among patients who are suspected for multidrug-resistant tuberculosis-need for earlier identification of nontuberculosis mycobacteria // Am. J. Med.-2009.-v.337(3)-p. 182-184.

307. Tanaka H., Yamada Y., Ito E. Differential diagnosis of pulmonary mycobacterial infection; radiological findings mimicking tuberculous ornontuberculous mycobacterial pneumonia // Kekkaku.- 2009.-v.84(8).-p.585-590.

308. Tanaka I., Anno I., Leite S. et al. Comparison of a multiplex-PCR assay with mycolic acids analysis and conventional methods for the identification of mycobacteria //Microbiol. Immunol.- 2003.-v.47(5).-p.307-312.

309. Tellis C., Putnam J. Pulmonary disease caused by Nontubercu-losis mycobacteria // Med. Clin. North Am. 1980. - v. 64. - p. 433-446.

310. Thibert L., Lapierre S. Routine application of high-performance liquid chromatography for identification of mycobacteria / /J. Clin. Microbiol.- 1993 .-v.31 (7).-p. 1759-1763.

311. Thorel M., Huchzermeyer H., Michel A. Mycobacterium avium and Mycobacterium intracellulare infection in mammals // Rev. Sci. Tech. -2001.-v. 20.-p. 204-218.

312. Timpl A., Runyon E. The relationship of atypical acid-fast bacteria to human disease: a preliminary report // J. Lab. Clin. Med. 1954. — v. 44.-p. 202-209.

313. Tomioka H. Bacteriology of mycobacteria: taxonomic and morphological characteristics // Nippon. Rinsho. 1998. - v. 56. - p. 3001-3007.

314. Torkko P., Suomalainen S., Iivanainen E. et al. Characterization of Mycobacterium bohemicum isolated from humam, veterinary, and environmental sources // J. Clin. Microbiol. 2001. - v. 39. - p. 207-211.

315. Tortoli E. Impact of genotypic studies on mycobacterial taxonomy: the new mycobacteria of the 1990s // Clin. Microbiol. Rev. 2003. - v. 16.-p. 319-354.

316. Tortoli E. Clinical manifestations of nontuberculous mycobacteria infections // Clin. Microbiol. Infect. 2009.-v.l5(10).-p.906-910.

317. Tortoli E., Bartolom A., Burrinic et al. Identification of nontuberculous mycobacteria: conventional tests versus HPLC of micolic acids: a four year experience // Clinical Mycobacteriology. 1998. - p. 189-191.

318. Tortoli E., Nanetti A., Piersimoni C. et al. Performance assessment of new multiplex probe assay for identification of mycobacteria // J. Clin. Microbiol.-2001.-v. 39.-p. 1079-1084.

319. Tortoli E., Bartolom A., Böttger E. et al. Burden of unidentifiable mycobacteria in a reference laboratory // J. Clin. Microbiol. 2001. - v. 39. -p. 4058-4065.

320. Tortoli E., Rogasi P., Fantoni E. et al. Tuberculosis-like infection, due to a novel mycobacterium, mimicking MDR-TB // Clin Microbiol Infect.- 2009.- v. 14. Epub ahead of print.

321. Torvinen E., Suomalainen S., Lehtola M. et al. Mycobacteria in water and loose deposits of drinking water distribution systems in Finland // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - v. 70. - p. 1973.

322. Tremblay V, Ayad T, Lapointe A, et al. Nontuberculous mycobacterial cervicofacial adenitis in children: epidemiologic study // J. Otolaryngol. Head Neck Surg.- 2008- v.37(5) p.616-22.

323. Trott K., Stacy B., Lifland B. et al. Characterization of a Mycobacterium ulcerans-like infection in a colony of African tropical clawed frogs (Xenopus tropicalis) // Comp. Med. 2004. - v. 54. - p. 309-317.

324. Tsai H., Kunin C., Lee S. et al. Fish gambler's tenosynovitis caused by Mycobacterium marinum: environmental investigation of a fishing pond in Southern Taiwan // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2007. - v. 59. - p. 227-230.

325. Tsukamura M., Kita N, Shimoide H. et al. Studies on the epidemiology of nontuberculous mycobacteriosis in Japan // Amer. Rev. resp. Dis. 1988. -v. 137. - № 6. - p. 1280-1284.

326. Wagner D., Young L. Nontuberculous mycobacterial infections: a clinical review // Infection. 2004. - v. 32. - p. 257-270.

327. Wallace R., Jones D., Wiss K. Sulfonamide activity against Mycobacterium fortuitum and Mycobacterium chelonae // Rev. infect. Dis. -1981. v. 3. - p. 898-904.

328. Wallace R., Swenson J., Silcox V. et al. Spectrum of disease due to rapidly growing mycobacteria // Rev. Infect. Dis. 1983. - v. 5. - p. 657679.

329. Wallace R., Nash D., Tsukamura M. et al. Human disease due to Mycobacterium smegmatis // J. Infect. Dis. 1988. — v. 158. - p. 52-59.

330. Wallace R.} Musser J., Hull S. et al. Diversity and sources of rapidly growing mycobacteria associated with infections following cardiac surgery // J. Infect. Dis. 1989. - v. 159. - p. 708-716.

331. Wallace R., O'Brien R., Glassroth J. et al. Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria (ATS statement) // Amer. Rev. resp. Dis. 1990. - v. 142. - p. 940-953.

332. Wallace R., Glassroth J., Griffith D. et al. Diagnosis and treatment of disease caused by nontuberculous mycobacteria (American Thoracic Society Statement) // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1997. - v. 156. - p. 125.

333. Wallace R., Brown-Elliott B., Ward S. et al. Activities of line-zolid against rapidly growing mycobacteria // Antimicrob. Agents Chemother. 2001. - v. 45.-p. 764-767.

334. Wayne L., Sramek H. Agents of newly recognized or infrequently encountered mycobacterial diseases // Clin. Microbiol. Rev. 1992. -v. 5.-p. 1-25.

335. Weitzman I., Osadezyl D., Corrado N. et al. Mycobacteriumthermoresistibile: a new pathogen for humans // J. Clin. Microbiol. 1981. — v. 14. p. 593-595.

336. Wenger J., Spika J., Smithwick R. et al. Outbreak of Mycobacterium chelonae infection associated with use of jet injectors // J.A.M.A. -1990.-v. 264.-p. 373-376.

337. Whipps C., Dougan S., Kent M. Mycobacterium haemophilum infections of zebrafish (Danio rerio) in research facilities // FEMS Microbiol. Lett. 2007. - v. 270. - p. 21-26.

338. Williams M., Yakrus M., Arduino M. et al. Structural analysis of biofilm formation by rapidly and slowly growing nontuberculous mycobacteria // Appl. Environ. Microbiol. -2009. v.75(7) - p.2091-8.

339. Winter S., Bernard E., Gold J. et al. Humoral response to disseminated infections by Mycobacteria avium-intracellulare in the acquired immunodeficiency syndrome and haity cell leukemia // J. Infect. Dis. 1985. -v. 151.-p. 523-527.

340. Wolinsky E. Nontuberculous mycobacteria and associated disease // Am. Rev. Respir. Dis. 1979. - v. 119. - p. 107-159.

341. Wolinsky E. Mycobacterial diseases other than tuberculosis // Clin. Infect. Dis. 1992. - v. 15. - p. 1-12.

342. Wolinsky E. Mycobacterial lymphadenitis in children: a prospective study of 105 nontuberculous cases with long-term follow-up // Clin. Infect. Dis. 1995. - v. 20. - p. 954-963.

343. Wolinsky E., Rynearson T. Mycobacteria in soil and their relation to disease-associated strains // Am. Rev. Respir. Dis. 1968. — v. 97. — p. 1032-1037.

344. Woodley C., Kilburn J. In vitro susceptibility of Mycobacterium avium complex and Mycobacterium tuberculosis strains to a spiro-piperidyl rifamycin // Am. Rev. Respir. Dis. 1982. - v. 126. - p. 586-587.

345. Woods G., Washington J. Mycobacteria other than Mycobacterium tuberculosis: review of microbiologic and clinical aspects // Rev. infect. Dis. -1987,-v. 9.-p. 275-294.

346. Woods G. The mycobacteriology laboratory and new diagnostic techniques // Infect. Dis. Clin. North Am. 2002 -v. 16(l)-p. 127-44.

347. Yano T., Okuda S., Kato K. et al. Mycobacterium kansasii osteomyelitis in a patient with AIDS on highly active antiretroviral therapy // Intern. Med. 2004. - v. 43. - p. 1084-1086.

348. Yates M., Paznik A., Uttley H. et al. Isolation of environment mycobacreria from clinical specimens in South-East England: 1973-1993 // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 1997. - v. 1. - № 1. - p. 75-80.

349. Yeager H., Raleigh J. Pulmonary disease due to Mycobacterium intracellular // Am. Rev. Respir. Dis. 1973. - v. 108. - p. 547-552.

350. Zaugg M., Salfmter M., Opravil M. et al. Extrapulmonary and disseminated infections due to Mycobacterium malmoense: case report and review // Clin. Infect. 1993. - v. 16. - p. 540-549.

351. Zhang O., Kennon R., Koza M. et al. Pseudoepidemic due to a unique strain of Mycobacterium szulgai: genotypic, phenotypic, and epidemiological analysis // J. Clin. Microbiol. 2002. - v. 40. - p. 1134-1139.

352. Zenone T., Boibieux A., Tigaud S. et al. Non-tuberculous mycobacterial tenosynovitis: a review // Scand. J. Infect. Dis. 1999. - v. 31. -p. 221-228.

Информация о работе

Макарова, Марина Витальевна
доктора биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.02.03

Диссертация

Выделение и идентификация нетуберкулезных микобактерий у пациентов фтизиатрических учреждений - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы