Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация нетуберкулезных микобактерий и выбор оптимальной комбинации методов для их видовой дифференциации

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация нетуберкулезных микобактерий и выбор оптимальной комбинации методов для их видовой дифференциации"

На правах рукописи

Майорова Ангелина Александровна

Идентификация нетуберкулезных микобакгерий и выбор оптимальной комбинации методов для их видовой дифференциации.

03 00 07 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва, 2007 г

00Э1В0232

003160232

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич кандидат биологических наук Степашшша Валентина Николаевна Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Кочеровец Владимир Иванович доктор биологических наук, Скотникова Ольга Ивановна.

Ведущая организация - Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН

Защита состоится « $ » иЛхд/лЛ Ш7 в на заседании диссертационного

совета в Федеральном государственном учреждении науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по адресу 125212, Москва, ул. адм Макарова, 10

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им Г Н Габричевского

Автореферат разослан « 3 у> &2007 года Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук С Ю. Комбарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы В последние годы резко возросла частота заболеваний, вызываемых нетуберкулезными микобактериями (НТМБ) Главным образом это связано с увеличением количества людей, страдающих иммунодефицитами, в том числе СПИДом, а также с усовершенствованием методов идентификации микобактерий [Falkinham J О III, 1996, Bonard D at al, 2004, Martin-Casabona N at al, 2004] Традиционно микобактериозы не относят в группу опасных инфекций, так как считается, что они не передаются от человека к человеку [Зыков М П, Ильина Т Б, 1978, Falkinham J О III, 1996] Однако эти заболевания могут протекать очень тяжело, нередко приводя к летальному исходу [Зыков М П, Ильина Т Б, 1978, Грузевский А А, 1999]

Заболевания, вызываемые нетуберкулезными микобактериями, у больных без серьезных нарушений иммунной системы, обычно ограничиваются поражением легких, лимфы или кожи [Falkinham JO III, 1996] Диссемикированные формы микобактериозов у них встречаются редко Микобактерии часто поражают легкие у людей, страдающих хроническими заболеваниями - пневмокониозом, силикозом, бронхоэктазами, саркоидозом, коллагенозом и другими заболеваниями [Зыков М П, Ильина Т Б , 1978, Mairas Т К at al, 2002, Ergin A at al, 2004] Нетуберкулезные микобактерии могут быть причиной послеоперационных осложнений или травм [Falkinham J О П1, 1996] Микобактериозы по своей клинической картине и течению очень похожи на заболевания, вызываемые микобактериями туберкулеза [Зыков М П, Ильина Т Б, 1978, Ellis S.M at al, 2002]

Нетуберкулезными микобактериями инфицировано от 25 до 50 % больных СПИДом в США и Европе [Falkinham J О III, 1996] Риск развития микобактериозов и бактериемии в отсутствии профилактики у ВИЧ - инфицированных больных составляет 10-20% в год [Holland SM, 2001] У пациентов со СПИДом обычно развиваются диссеминированные формы микобактериозов, что также является следствием имммунодифицитного состояния [Falkinham J О П1, 1996]

Род Mycobacterium включает около 100 охарактеризованных видов [Pnmm Т Р at al, 2004, Katoch VM, 2004] Описано более 20 видов нетуберкулезных

з

микобактерий, способных вызывать заболевания человека [Ellis SM at al, 2002] Различные нозологические формы заболеваний могут быть вызваны одним видом и, наоборот, причиной сходных по клиническим проявлениям заболеваний могут быть разные виды микобактерий [Elbs SM at al, 2002] Следовательно, для лечения микобактериозов требуются разные схемы лечения [Hegmbothom М L, 2001] Своевременное выявление заболевания и адекватная терапия являются необходимыми условиями успешного выздоровления пациента Однако, к настоящему времени не существует универсальных методов для быстрой и дешевой идентификации нетуберкулезных микобактерий Цель работы

Идентификация клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, циркулирующих в Центральном и Приволжском федеральных округах России и выбор оптимальной комбинации методов для определения видовой принадлежности Задачи исследования

1 Охарактеризовать штаммы нетуберкулезных микобактерий с помощью культуральных и биохимических методов

2 Провести видовую идентификацию штаммов НТМБ с помощью молекулярно-генетических методов

3 Оценить дифференциально-диагностическую способность отдельных методов для идентификации микобактерий

4 Определить лекарственную устойчивость клинических и лабораторных штаммов нетуберкулезных микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам

5 Создать коллекцию клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, охарактеризованных культуральными, биохимическими и молекулярно-генетическими методами

Научная новизна работы Предложены комплексы методов для идентификации нетуберкулезных микобактерий 1) ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК, 2) рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК и 3) высокопроизводительная жидкостная хроматография миколовых кислот (high performance liquid chromatography - HPLC) В случаях генетически близкородственных видов, как, например М kansasn/M gastri и М, ulcerans/M marinum, имеющих сходные последовательности

генов, но различающихся своими микробиологическими свойствами, рекомендуется применять сочетание генетических и микробиологических тестов Создана коллекция нетуберкулезных микобактерий Определена лекарственная устойчивость штаммов нетуберкулезных микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам Впервые проведено изучение клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, полученных от больных, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России, с помощью как традиционных микробиологических, так и современных молекулярно-генетических методов

Практическое значение работы Создана коллекция нетуберкулезных микобактерий, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам, которую можно использовать в качестве стандартной панели для определения видовой принадлежности клинических штаммов Проведен анализ ряда основных методов, позволяющих осуществлять идентификацию НТМБ и их внутривидовую дифференциацию Своевременная идентификация позволяет назначать больным, как туберкулезом, так и микобактериозами адекватную схему лечения или вносить в нее коррективы в течение нескольких суток

Основные положения, выносимые на защиту.

1 Проведена сравнительная характеристика методов, используемых для идентификации НТМБ (ПЦР-секвенирование гена 16Б рРНК, рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 168-238 рибосомной ДНК и НРЬС) для применения в повседневной практике Применение культуральных и биохимических тестов и ПЦР-секвенирование гена 16Б рРНК в 99 % случаев позволяет определить видовую принадлежность НТМБ

2 Обнаружена внутривидовая вариабельность вида М /огшпит При использовании метода рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 168-235 рибосомной ДНК выявлено пять геногрупп данного вида микобактерий

3 При определении лекарственной устойчивости клинических и лабораторных штаммов НТМБ к основным противотуберкулезным препаратам - стрептомицину, изониазиду, канамицину, этамбутолу и рифампицину выявлена высокая устойчивость к этим препаратам

4 Выявлено, что среди НТМБ, выделенных от больных легочной формой

микобактериозов, проживающих в Центральном я Приволжском федеральных округах России, преобладают виды М avium, М intracellulare и М kansasii Создана коллекция НТМБ, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам Апробация работы Результаты работы доложены на заседании Ученого Совета ФГУН Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии, 26 января 2007 г Результаты работы обсуждены на VII Российском съезде фтизиатров (Россия, Москва, 2003 г) и на VH межгосударственной научно-практической конференции (Россия, Оболенск, 3-5 октября 2006 г)

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы, в том числе две работы в изданиях, рекомендованных ВАК России

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, результатов, обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 11 работ отечественных и 147 работ зарубежных авторов Работа содержит 13 рисунков и 14 таблиц

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы.

Всего в работе использовано 103 штамма микобактерий Лабораторные штаммы М fortuitum, М chelonei, М scrofiilaceum, М gordonae, М avium, М smegmatis (М), М smegmatis (Н), М bovis 1, М bovis 2, М bovis 3 и 54 клинических штамма, выделенных от людей предоставлены Медведевой ИМ (Московская медицинская академии имени И М Сеченова) Штаммы НТМБ выделены от больных (возрастная груши 56-84 лет), находившихся на учете в региональных туберкулезных диспансерах на протяжении 3-7 лет Периодически, при обострении заболевания, больные получали стандартное противотуберкулезное лечение Это были пациенты с затяжными, трудно поддающимися печению заболеваниями легких Все они, согласно историям болезни, имели диагноз туберкулез легких (различные формы) Диагноз подтвержден рентгенологически

Шесть штаммов НТМБ получены от Ильиной Е А (областной противотуберкулезный диспансер, г Нижний Новгород), которые были выделены из мокроты пациентов с предварительным диагнозом - микобактериоз В работе исследованы штаммы, полученные от Левачевой В А, выделенные из мокроты 15

б

пациентов с диагнозом туберкулез легких из областного противотуберкулезного диспансера, г Тула Тринадцать штаммов нетуберкулезных михо бактерий, выделенных от животных (крупного рогатого скота и свиней) получены из Научно-исследовательского ветеринарного института (г Нижний Новгород) от Лазовской AJI Лабораторные референс-штаммы M tuberculosis H37Rv, M gordonae, M fortuitum и M ulcerans были любезно предоставлены доктором Barry Clifton III (National Institutes of Health, MD, USA) Штамм M bovis BCG получен из ГИСКа имени Тарасевича. Для культивирования микобактерий использовали среду Левенштейна-Йенсена Культуру хранили в лактозно-глицериновой защитной среде при температуре -70°С

Микробиологическую идентификацию микобактерий проводили в соответствии с приказом № 109 от 21 марта 2003 г Учитывали скорость роста культуры при 37°С, способность к росту при 22°С, 45°С, а так же морфологию и цвет колоний, использовали тест на определение способности микобактерий к росту на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей 1000 мкг/мл салицилово-кислого натрия, 500 мкг/мл паранитробензойной кислоты, 5% хлористый натрий Ниациновый тест проводился согласно методике, предложенной Кубиком и Кильбурном, в модификации Бараускене Способность микобактерий использовать амиды (мочевину, никотинамид и пиразинамид) в процессе метаболизма определяли по методу Такэ Наличие формамидазной активности проверяли по модифицированной методике Дыхно

Активность и термостабильность катал азы определяли по методикам Kent Р Т et al, 1985 Определение нитратредуктазной активности осуществляли по методу Грисса [Методические рекомендации по проведению микробиологических исследований на туберкулез M, 2001] Определение уровней устойчивости штаммов НТМБ к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, канамицину и этамбутолу на среде Левенштейна-Йенсена проводили методом абсолютных концентраций [Приказ № 109]

Выделение хромосомной ДНК осуществляли по методу Маниатис Т и др, 1984 Наличие инсерционного элемента IS 6110 выявляли амплификацией с использованием праймеров, нуклеотидная последовательность которых опубликована в работе Dubiley S et al, 2005 Сполиготипирование выполняли по

методике Kamerbeek J., Schouls L., et al, 1997. ПЦР - секвенирование фрагмента гена, кодирующего синтез I6S рРНК выполняли по методике Kirschner Р. et а!., 1998. Метод рсстрикшонного анализа амппифкцированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рДНК осуществляли по методике Lappayawichit Р. et al., 1996. HPLC выполняли вд методике Butler W.R. et al, 2001.

Результаты исследования и их обсуждение.

Дифференциация культур на ыетуберкулезные микобактерчи и микобактерии туберкулезного комплекса.

Нетуберкулезпые микобактерии б отличие от микобактерий туберкулёзного комплекса растут на среде Левенштейпа-Йенсена, содержащей салициловокислый натрий иди /з-нитробензойнуто кислоту. Инссрщгонный элемент IS6710 присутствует в геномах штампов только туберкулезного комплекса, что дозволило нам использодаь его в качества маркера для дифференциации туберкулезных и негуберкч'лезных микобактерий (Рис 1). Микобактериальные культуры (и=83), которые выросли на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением салицилата натрия и паранитробензойной кислоты, и в геномах которых отсутствовал элемент IS 6110, были отнесены в группу НТМБ.

М — маркер; 1 - М tuberaüosis H37Rv; 2, 3 - клинические штаммы из областного противотуберкулезного диспансера, г, Тула; 4 - М. bovis B-D, 5 - М. bovis B-R, 6 - М. bovis B-l; 7 - М. gordonae; 8 - М. forluitum, 9 - М. ulcerans.

Рис. 1. Результаты электр офоретического разделения продуктов ПЦР с ДНК, выделенной из микобактерий.

Таким образом, проведенные исследования показали, что как микробиологические, так и моле кулярно-генетические методы позволяют эффективно дифференцировать микобактерии на туберкулезные и нетуберкулезные.

М I 2 3 4 S 6 7 S 9

Культуральные и биохимические характеристики штаммов Н'1МБ.

При анализе штаммов НТМБ учитывались следующие характеристики морфология и пигментация колоний, рост при 22°С, 37°С, 45°С, скорость роста, рост на среде с 5% ЫаС1, определение каталазной амидазной и нитратредуктазной активности, определение термостабильной каталазы

М стит (п=31) - нефотохромогенные медленнорастущие микобактерии, образующие сухие, шероховатые (24 штамма - 77%) и гладкие, влажные колонии (7 штаммов - 23%) Все кулыуры росли на среде Левенштейна - Йенсена при 22°С и 37°С, у 22 из 31 исследованной кулыуры (71%) наблюдался рост при 45°С, для всех культур характерна положительная каталазная, никотинамидазная и пиразинамидазная активность, отсутствие формамидазной активности, отсутствие способности использовать мочевину в процессе жизнедеятельности, отсутствие роста на среде с добавлением 5% №С1, отрицательная нитратредуктазная активность (кроме одной культуры), у 23 из 31 культуры (74%) обнаружена термостабильная каталаза. Различий в микробиологических характеристиках между штаммами, выделенными от людей и от животных, найдено не было

М 1гигасе11и1аге (п=12) - нефотохромогенные медленнорастущие микобактерии, образующие сухие, шероховатые колонии При биохимическом и бактериологическом иследовании получены следующие результаты' отсутствие роста на среде Левенштейна - Йенсена с добавлением 5% ЫаСЦ рост при 22°С и 37°С, отсутствие роста при 45°С, положительная каталазная, никотинамидазная и пиразинамидазная активность, отсутствие формамидазной активности, отсутствие уреазы, отрицательная нитратредуктазная активность, у 9 из 12 культур (75%) обнаружена термостабильная каталаза

М. gordonae (п=3) - скотохромогенные медленнорастущие микобактерии, образующие гладкие, влажные колонии Штаммы растут на среде Левенштейна-Йенсена при 22°С и 37°С, но не растут при 45°С, добавление 5% ЫаС1 в среду Левенштейна-Йенсена ингибирует их рост Штаммы М gordonae характеризуются положительной каталазной активностью, наличием термостабильной каталазы, отсутствием формамидазной, никотинамидазной и пиразинамидазной активности, отрицательной нитратредуктазной активностью Уреаза выявлена только у одного штамма

Э

M kansasu (n=15) - медленнорастущие штаммы, образующие сухие, шероховатые фотохромогенные колонии, растут при температуре 22°С и 37°С, рост при 45°С отсутствует Для всех культур характерна нитратредуктазная и уреазная активность. Рост на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl отсутствует Культуры характеризуются положительной каталазной активностью, наличием термостабильной каталазы, отсутствием формамидазной и пиразинамидазной активности Положительная никотинамидазная активность выявлена у б штаммов M kcmsasii (40%)

M scrofiilaceum (n=4) - медленнорастущие штаммы, образующие скотохромогенные гладкие, влажные колонии Культуры растут при температуре 22°С и 37°С, рост при 45°С отсутствует Рост на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl отсутствует Культуры характеризуются положительной каталазной активностью, наличием термостабильной каталазы, способностью использовать мочевину в процессе жизнедеятельности Отсутствие формамидазной и пиразинамидазной активности характерно для всех культур, а положительная нитратредуктазная и никотинамидазная активность выявлена только у одного штамма M scrofiilaceum

Штамм M ulcérons (п=1) характеризуется появлением отдельных сухих, шероховатых нефотохромогенных колоний через 5-6 недель после посева Культура характеризуется отсутствием роста на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl, ростом при 22°С, отсутствием роста при 37°С и 45°С, наличием термостабильной каталазы, отсутствием формамидазной, никотинамидазной и пиразинамидазной активности, отрицательной каталазной и нитратредуктазной активностью

При биохимическом и бактериологическом исследовании M smegmalis (n=2) выявлены следующие свойства культур- рост на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% NaCl, рост при 22°С, 37°С и 45°С, появление отдельных нефотохромогенных гладких, влажных колоний менее чем через одну неделю после посева Оба штамма используют никотинамид, формамид и мочевину в процессе метаболизма. Для них характерно наличие термостабильной каталазы, положительная нитратредуктазная и каталазная активность, отрицательная пиразинамидазная активность

ю

Для М /отшит (п=13) получены следующие результаты культуральньтх и биохимических тестов рост при 22°С и 37°С, отсутствие роста при 45°С, появление нефотохромогенных шероховатых, сухих колоний колоний менее чем через неделю после посева На среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% КаС1 рост отмечен у 6 культур из 13 (46%) Все анализированные культуры используют никотинамид, формамид и мочевину в процессе метаболизма Положительная каталазная и нитратредуктазная активность, а также наличие термостабильной каталазы характерно дня всех исследованных культур Отрицательная пиразинамидазная активность выявлена только у трех пггаммов М /огШШт (23%) Различий в микробиологических характеристиках между штаммами, выделенными от людей и от животных, найдено не было

Для культуры (п=1) М реге%гтит были получены следующие результаты культуральных и биохимических тестов рост при 22°С и 37°С, отсутствие роста при 45°С, появление нефотохромогенных шероховатых, сухих колоний менее чем через неделю после посева Отмечен рост на среде Левенштейна-Йенсена с добавлением 5% №С1 Для культуры характерны положительная никотинамидазная, формамид азная, уреазная и пир азинамидазная активность, положительная каталазная и нитратредуктазная активность, а также наличие термостабильной каталазы

Для штамма М сИе1опае/М аЬзсеззия получены следующие результаты культур альных и биохимических тестов рост при 22°С и 37°С, отсутствие роста при 45°С, появление нефотохромогенных шероховатых, сухих колоний менее чем через одну неделю после посева, способность использовать пиразинамид, никотинамид, формамид и мочевину в процессе метаболизма, положительная каталазная активность, наличие термостабильной каталазы и отсутствие нитратредуктазной активности Добавление 5% №С1 в среду Левенштейна-Йенсена ингибировало рост этой культуры

Микробиологические методы тестирования сохраняют свою важность, так в случаях генетически близкородственных видов, как, например М ката$п/М gastп и М и1сегагк/М тагтит, имеющих сходные последовательности генов, но различающихся своими культур альными и биохимическими свойствами, рекомендуется применять сочетание генетических и микробиологических тестов

В результате работы создана коллекция нетуберкулезных микобактерий, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам Коллекцию можно использовать в качестве стандартной панели дня определения видовой принадлежности клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий Выявлено, что среди нетуберкулезных микобактерий, выделенных от больных легочной формой микобактериозов, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России преобладают виды М avium-complex иМ kansasn

Использование щЦ'-секвенирования гена 16S рРНК для видовой идентификации нетуберкулезных микобактерий.

В основе метода ПЦР-секвенирования гена 16S рРНК лежит амплификация участка гена 16S рРНК с последующим секвенированием двух гипервариабельных регионов В результате ПЦР микобактериальной ДНК образуется фрагмент между 9 и 1036 положениями нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК в геноме референс-штамма М tuberculosis H37Rv Секвенирование амплификата осуществляли с использованием двух праймеров (Рис 4) Нуклеотидная последовательность регионов А (150 пн) и В (70 пн) исследуемого штамма сравнивалась с известными последовательностями для разных видов

При секвенировании фрагментов гена 16S рРНК у 27 штаммов НТМБ в гипервариабельном регионе А выявлены нуклеотидные замены в следующих позициях 123/Т—»С, 124/G—»А, 182/А->Т, 184/G->A, 185/G->A, 188/Т-+С, 198/G-+C, 213/А-ч-Т, 229/А—>G и делеция в позиции 210-211 CGCT-+C--T, в гипервариабельном регионе В обнаружена замена 461/С—>Т У четырех культур, кроме вышеперечисленных, обнаружена дополнительная замена 129/G—»А Полученные результаты позволили отнести исследованные культуры к виду М avium Для этого виза характерна внутривидовая вариабельность последовательности 16S рРНК гена в 129 позиции

У 12 штаммов НТМБ при секвенировании выявлены нуклеотидные замены в следующих позициях 123/Т-»С, 124/G-+A, 182/А-»Т, 183/С-+Т, 184/G-+T, 185/G—»A, 187/A-+G, 188/Т—С, 198/G-+C, 199/Т—А, 213/А->Т, 229/A-+G, 262/С—Т и делеция в позиции 210-211 CGCT-+C-T в гипервариабельном регионе А, в регионе В - замена 461/С—>Т По результатам секвенирования эти штаммы идентифицированы как вид М mtracellulare

iz

У двух исследованных культур НТМБ выявлены нуклеотидные замены в следующих позициях гена 16S рРНК 124/G-»A, 138/Т-+А, 173/G-+A, 184/G->A, 188/Т—+С, 189/G-+A, 196/Т-»С, 213/А->Т, 229/A->G, 262/С-*Т и делеция в позиции 210-211 CGCT—»С--Т в регионе А, в регионе В обнаружены замены 461/С—>Т, 468/A-+G, 469/ Т—» С У одного штамма, в отличие от двух вышеуказанных культур, в 186 позиции обнаружена замена G-+A По результатам секвенирования штаммы отнесены к виду М gordonae, для которого характерна внутривидовая вариабельность в последовательности 16S рРНК гена

При секвенировании фрагментов гена 16S рРНК у 15 штаммов НТМБ в регионе А обнаружены нуклеотидные замены в следующих позициях 123/Т—»С, 124/G-+A, 138/Т—А, 139/Т—С, 184/G—T, 185/G-»T, 187/А— G, 188/Т-^С, 194/Т-»С, 213/А—Т, 229/А—>G и делеция в позиции 210-211 CGCT—>С—Т Последовательность региона В идентична соответствующей последовательности М tuberculosis-complex Согласно полученным результатам культуры относятся к двум генетически близким видам М kansasit/M gastrt, имеющим одинаковую последовательность 16S рРНК гена

У четырех культур НТМБ в регионе А гена 16S рРНК обнаружены замены в следующих позициях 123/Т-»С, 124/G->A, 184/G-»T, 185/G-+T, 187/А-» G, 188/Т—>С, 194/Т—>С, 213/А—»Т, 229/А-Ю, 285/Т-»А, 262/С->Т, и делеция в позиции 210-211 CGCT—С--Т В регионе В замены 453-454/ТС->СТ, 459-460-461/ТТС—♦ ACT, 463-464-465/СТС—>TGT, 468/А-Ю, делеция позиций 456-457-458 Полученные результаты позволили отнести эти штаммы к виду М scrofulaceum

У одного штамма НТМБ выявлены замены в следующих позициях 189/G—>Т, 196/Т—>С, 213/A-VT, 229/А-Ю, 260/G—A и делеция в позиции 210-211 CGCT-»C-T в регионе А, в регионе В обнаружены замены 454/С—>Т, 461/С—>Т Согласно результатам эти штаммы принадлежат к виду М ulcerans/M marinum У этих двух видов последовательность регионов А и В гена 16S рРНК одинакова

При секвенировании фрагментов гена 16S рРНК у двух штаммов НТМБ обнаружены замены в следующих позициях 140/С—>Т, 173/G—»А, 181-182/СА—»TG, 184/G—>Т, 187-188/АТ—»ТС, 194/Т-Ю, 200/G-+A, 202/Т—G, 2I3/A->T, 229/A-»G, 262/C—>T, делеция в позиции 210-211 CGCT—»С—Т, замены и инсерция в позициях 177-178-179/GGA—»САСС, 196-197/ТТ—CTG в регионе А, замены 440/С—G, 443-444/ТС-+СА, 452-453/GT—>CG, 455/С-+А 469/T-+G, 478/G-*T, 482/G—С, 491/С—>G

и делеция 456-467 нуклеотидов в регионе В Полученные результаты позволили отнести эти штаммы к виду М йтедпаия

У одного штамма НТМБ в регионе А гена 16Б рРНК выявлены замены в следующих позициях 140/С—Т, 185/0-+С, 187/А-+С, 189/Ст->Т, 194-195-196/ТСТ-чОТО, 213/А—>Т, 229/А—Ю, 260/<3->А, 262/С—Т, делеция в позиции 210211 СОСТ—С--Т, замены 440-441/СС—АТ, 443-444/ТС->Ш, 452-453ЛЗТ—СО, 455/С—А, 469/Т—в, 478-479/СК}—СС, 481-482ЛЗО—АТ, 491/С—й и делеция 456467 нуклеотидов в регионе В У 12 штаммов НТМБ, кроме вышеперечисленных замен, обнаружены замены в позициях 173/0—А и 177/С-Т По результатам секвенирования эти штаммы относятся к виду М /огшиит, для которого характерна внутривидовая вариабельность

При секвенировании фрагментов гена 16Б рРНК у одного штамма в регионе А обнаружены замены в следующих позициях 140/С—Т, 173/0—»А, 177/0—Т, 182/А—в, 185/0—»С, 186/0—А, 187/А—С, 189/0—Т, 191/А—С, 194-195-196ЯСТ—йТС, 213/А—Т, 229/А—в, 260/0—А, 262/С—Т, делеция в позиции 210211 СвСТ—С-Т, замены 440-441/СС—АТ, 443-444/ТС—ОО, 452-453ЛЗТ—СО, 455/С—А, 469/Т—в, 478-479/00—СС, 481-482/Ш-»АТ, 491/С—О и делеция 456467 нуклеотидов в регионе В Полученные результаты позволили отнести исследованную культуру к видуМ реге&тит

У одного штамма в регионе А гена 16Э рРНК обнаружены замены в позициях 139/Т—С, 140/С—Т, 184-185-186-187/ОША—АС АС, 189/0—Т, 194-195-196-197/ТСТТ—ОТвА, 204/0—»С, 213/А—Т, 260ЛЗ—А, 262/С—Т, делеция в позиции 210-211 СОгСТ—С--Т, замены 440-441/СС—ОТ, 443-444/ТС—Ш, 452-453-454-455ЛЗТСС—СОАА, 469/Г—О, 478-479/00—СС, 481-482/00-»АС, 491/С—О и делеция 456-467 в регионе В По результатам сиквенса гипервариабельных регионов 16Э рРНК гена, культура была идентифицирована М сИе1опае/М аЬясезниз Эти два вида имеют одинаковую нуклеотидную последовательность гипервариабельных регионов А и В

Таким образом, метод ПЦР-секвенирования гена 168 рРНК позволяет эффективно определять видовую принадлежность нетуберкулезных микобактерий Достоинства метода заключаются в высокой специфичности, быстром получении результатов анализа и возможности обнаружения ДНК единичных

И

микобактер иаль ных клеток в клиническом материале. Данный метод позволяет идентифицировать широкий спектр видов микобактерий, включая патогенные виды для человека и животных, а также сапрофитные микобакгерии.

Исследование коллекции нетуберкулезных микобактерий рестрикционным анализом амплифицированного фрагмента опейсерной последовательности 168-238 пжшсомной ЛНК.

В качестве альтернативного метода был использован метод рестрикционного анализа амплифициров энного фрагмента спейсерной последовательности 168-238 рибосомной ДНК. Кроме определения видовой принадлежности нетуберкулезных микобактерий этот метод позволяет выявить внутривидовую вариабельность.

В полимеразной цепной реакции образцов ДНК, выделенных из 13 штаммов М. /опи'Иит и одного штамма М. реге§гтит получено несколько вариантов ПЦР-продуктов, различающихся по размеру (470-425 п.н.) и количеству (1 или 2) фрагментов спейсера 165-238 рДНК (Табл. 1, Рис. 2),

У 7 штаммов амплифицируется два фрагмента спейсера 165-238 рДНК. Шесть ю них образуют ПЦР-продукт размером 470/425 п.н. и относятся к геногруште М. /отшит I. Один штамм, образующий два фрагмента размером 450/425 гш, относятся к 1-еногруппе М /огШШт II. У семи штаммов М. /огШПит амплифицируется один фрагмент спейсера 168-238 рДНК. Штаммы, образующие амплификаты 470 п.н., отнесены нами к паттерну М. /огШПит X. Д;ш дополнительного изучения пяти штаммов М. /опшшт, формирующих в результате ПЦР фрагмент 450 п.н., проведен рестрикшюнный анализ с использованием фермента Нае 10. Четыре штамма с рестрикциониьши профилями 220/140/100 п.н. обозначены нами как М. /отшит У и один штамм с профилем 240/220 п.н. - М. /огШит Ъ {Табл. 1, Рис. 3).

М - маркер; 1 -М./огШ^Шт (470/425 п.н ); 2-М./огЫШт (470/450 п.н.); 3 -М. /оПиИит (450 п.н.); 4 - М. /огШЫт (470 п.н.), 5-М. $те$таИи (450 п.н.).

М 1 13 А 5 Рис. 2. Электрофореграмма фрагмента спейсера 168-238 рДНК различных быстрорастущих микобактерий.

У двух образцов ДНК, выделенных из штаммов М. ще^па^ получены фрагменты спейсера 165-238 рДКК размером 450 п.н. При рестрикции ПЦР-продуктов исследованных штаммов ферментом Нае\II генерируются фрагменты 200/110 п.н. (Табл. 1, Рис. 2). Полученные данные позволяют дифференцировать М. Ьтй£таШ от М. /огПШит Y и М. /огШИит Ъ,

М - маркер; 1 - М. smegmaiis (200/110 п.н.); 2 - М. fortuitum (220/140/100 п.н.); 3-М. fortuitum (220/140/100 п.н.); 4-М. fortuitum (240/220 п.н.).

Рис. 3. Электрофореграмма рестрикции амшшфицированного фрагмента спейссра 1ÓS-23S рДНК (450 п.н.) микобактерий рестриктазой HaéUl.

При амплификации ДНК, выделенной из штамма М. cheíoriae/M. abscessus, получен фрагмент спейссра размером 450 п.н. При рестрикции ПЦР-продукта ферментом НаеШ образуются фрагменты 215/125/105 п.н. Полученные данные позволяют дифференцировать М. cheionae/M. abscessus, М. smegmatis, М. fortuitum Y и М. fortuitum Z.

В результате амплификации ДНК, выделенной из двадцати штаммов М. tuberculosis complex получены ПЦР-продукгы размером 370 п.н. Фрагменты рестрикции, продуцируемые НаеШ, имеют длину 215/95/55 п.н. Профиль рестрикции М. tuberculosis complex отличается от профилей рестрикции НТМБ, но не имеет различий между видами внутри комплекса (Табл. 1).

При рестрикции ПЦР-продуктов спейсера Í6S-23S рДНК 31 штамма М. avium ферментом НаеШ генерируются фрагменты ДНК 130/115/80/40 п.н. (Табл. 1, Рис. 4.).

При амплификации спейсера 16S-23S рДНК штаммов Ы. kansasii получены ПЦР-продукты 370 п.н. Известно два вида паттернов, присущих этому виду Амплификат одного из них рестрицируется НаеШ на фрагменты 170/130/65 п.н. (М. kansasii II), а амплификат другого не рестрицируется Нас III (М kansasii I) ILappayawichit ?. et al., 1996]. ПЦР-продукт спейсера 16S-23S рДНК (370 п.н.) 15 анализируемых штаммов М. kansasii при обработке ферментом НаеШ не рестрицируется. Проведена дополнительная обработка ферментом BstXI и получены

фрагменты размером 215/150 п.н. Эти результаты позволяют отнести штаммы к группеМ квпваяИ I (Табл. 1).

Таблица 1.

Результаты исследования коллекции микобактерий методом ре стрикцноиного анализа амплифицнрованного фрагмента спеисерной последовательности 165-235

рибосом ной ДНК.

Кг Зады Размер ПЦР продукта Размер рсстрикционных фрагментов (НаеШ) Размер рсстрикцноннъга фрагментов С&Ш) Размер рестрикционнь фрагментов Кол-во OB

1. М. tuberculosis а 370 пк w 215/95/55 п.н. - 76 '

1. М. avium а 370 пн H.H. - - ЗТ

М. intracellulars ж 370 пн т 200/130/40 П н - *240/105/25 п.н. 12

4. и scrofulaceum « 370 пп « 130/110/95/40 п.н. - - 4

5. A4, ulcerans » 370 пн ж 215/155 п.н - - i

б M. kansasn я/ 370 пн Не рестрицируегся ¡к 215/150 п.н. - 15

7. M. gordonae « 370 пн ......Не " реетршируется = 205/155 п.н. - 3

ъ M. smegmans ж 450 пн «200/110 п.в. - - 2

У. U " ' chelonae/M. abscessus » 450 пн «215/125/105 п.н. ' 1

10. M.fortuitum I в 470/425 пн - - 6

11. M.fortuitum II т 450/425 пн - - Г"

12. M. fortuiium я 470 пн - - - 2

Ii. M.fortuitum Y я 450 пн = 220/140/100 п.н. - ■ 4

14. M.fortuitum «450 пн = 240/220 п.н. - ' 1

м 1

М - маркер; ] - М. tuberculosis complex, 2 - М. utcerans; 3 -М. intracellulars, 4 -М. avium; 5 -М scrofulaceum.

Рис. 4. Продукты рестрикции амшшфнцировашюго фрагмента спейсера 165-238 рДНК (370 п.н.) микобактерий рестриктазойНаеШ,

Амплификат спейсера 16S-23S рДНК (370 пн) штаммов M gordonae ферментом НаеIII не рестрицируются При дополнительной обработке ПЦР-продукгов ферментом BstXl образуются фрагменты размером 205/155 п н (Табл 1) Штаммы M scrofulaceum из нашей коллекции были отнесены к группе M scrofulaceum II, так как амплифицированные участки спейсера 16S-23S рДНК (370 пн) расщепляются рестриктазойНаеШ на фрагменты 130/110/95/40 пн (Табл 1) По опубликованным данным генетическая разнородность фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рДНК вида M scrofulaceum выражается в различии профилей рестрикции Описаны следующие паттерны полиморфных по длине фрагментов рестрикции ферментом НаеIII M scrofulaceum I - 200/130/40 пн, M scrofulaceum II - 130/110/95/40 пн, M scrofulaceum III - 180/130/40 пн, M scrofulaceum IV - 180/170 п н [Lappayawichit P et al, 1996]

У штаммов, относящихся к виду M mtracellulare, при обработке рестрикгазами НаеIII и Mspl ПЦР-продукта (370 пн) образуются фрагменты ДНК длиной 200/130/40 пни 240/105/25 п н, соответственно (Табл 1) Рестрикция ферментом Mspl осуществляется для дифференциации M mtracellulare и M scrofulaceum I, так как профиль рестрикции НаеШ для вышеперечисленных видов одинаков У штамма M ulcerans при амплификации участка спейсера 16S-23S рДНК образуется один фрагмент размером 370 пн При обработке продукта ПЦР рестриктазой НаеIII генерируются фрагменты 215/155 п н

Полученные данные показывают, что метод рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК позволяет определять видовую принадлежность нетуберкулезных микобактерий Кроме этого метод позволил выявить внутривидовую вариабельность штаммов M fortuitum Достоинства метода заключаются в высокой специфичности, быстром получении результатов анализа и возможности обнаружения ДНК единичных микобактериальных клеток в клиническом материале Метод является альтернативой более дорогому и требующему специального оборудования методу секвенирования

Высокопроизводительная жидкостная хроматография миколовых кислот (high performance liquid chromatography- HOPLO.

В работе были исследованы 37 штаммов из нашей коллекции НТМБ (М avium - 15, M. intracellulare - 3, M. gordonae -2, M. kansasii/M. gastri - 5, M scrojulaceum -2, M. fortuitum — 9, M. chelonae/M. abscessus - 1). В качестве негативного контроля для HPLC использовали Candida albicans, микроорганизм, не продуцирующий миколо»ке кислоты вообще, в качестве позитивного - Mycobacterium avium. Образцы взяты из коллекции Центра контроля и предупреждения заболеваний (США).

В результате HPLC для 20 мякобакхериальных культур были подучена сходные хроматографические паттерны, являющиеся характерными для группы MAIS, которая включает такие виды как М. avium, M. intracellulare, M. scrofalaceum (рис. 5). Методы ПЦР - секвенирования фрагмента гена, кодирующего синтез 16S рРНК и ресгрикционный анализ амплнфицированиого фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК позволили определить видовую принадлежность культур группы MAIS. Две из них принадлежали к виду Ai scrojulaceum, четырнадцать - идентифицированы как вид M avium, четыре - M. intracellulare.

Для пяти мвкобактериальпых культур получены хроматографические паттерны, являющиеся характерными М. кат>ачи/М. gastri (рис, 5). В результате сравнения по луче надо; хроматогра фических паттернов с референсньши, две микобактериальные культуры были идентифицированы как М. gordome (рис. 6). Результаты видовой идентификации совпадают с данными, полученными методами ПЦР - секвенирования фрагмента гена, кодирующего синтез 16Б рРНК и рестрикционного анализа амштифитщрованного фрагмента спейсерной

последовательности 168-238 рнбосомной ДНК. В результате НРЬС для девяти микобактериальных культур получены одинаковые хроматографические паттерны, являющиеся характерными для М. /опиШапМ. реге%ппит (рис, 6).ПЦР -секвенирование и рестрнкционный анализ обеспечивает дифференциацию внутри комплекса видов М. рПшШт/Ы. реге^тит. Все культуры идентифицированы какМ /огШИит. Кроме этого, рсстрикционный анализ позволил (угнести исследованные культуры к различным геногрушпш вида М. /опийит. Для одной культуры получен хроматографический паттерн, соответствующий М, сЫ1оше/Ы. аЫсе$$ш (рис. 6). Ни один из использованных нами методов не позволил разделить эти два генетически близких вида.

Рис. 6. Хроматограмма миколовых кислот А-М.яогсЬте Б - М. /огШИит'М. реге^тит В - М. ске1опае/М. аЪвсеззиа

Таким образом, метод НРЬС позволяет определить видовую принадлежность микобактерий. Однако его дифференциально-диагностическая способность несколько ниже, чем у методой ПЦР-секЕенированвя гена 168 рРНК и рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 168-238 рнбосомной ДНК в связи со сходным составом миколовых кислот у близкородственных видов.

Лекарственная устойчивость Н'ГМБ.

Определение уровней устойчивости штаммов НТМБ к стрептомицину, изониазиду, рифампицину, канамицину и этамбутолу на среде Левенштейна-Йенсена проводили методом абсолютных концентраций (приказ № 109 от 21 марта 2003 г )

Лекарственной устойчивостью ко всем проверенным препаратам в максимальных концентрациях обладали следующие виды нетуберкулезных микобактерий M chelonae/M abscessus,M peregrmum и M ulcérons

Высокий уровень лекарственнной устойчивости отмечен для штаммов M fortuitum Три штамма (23%) устойчивы ко всем пяти препаратам в максимальных концентрациях Все штаммы этого вида устойчивы к концентрации 50 мкг/мл стрептомицина и к 50 мкг/мл рифампицина Три штамма (23%) устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл, восемь штаммов (61,5%) - устойчивы к концентрации 5 мкг/мл и два штамма (15,5%) устойчивы только к критической концентрации этого препарата (1 мкг/мл) Одиннадцать штаммов (85%) устойчивы к концентрации 50 мкг/мл канамицина, один штамм (61,5%) - устойчив к концентрации 30 мкг/мл Только один штамм чувствителен к канамицину Четыре штамма (31%) устойчивы к концентрации этамбутола 5 мкг/мл, шесть - только к концентрации 2 мкг/мл

Семь штаммов M avium (22%) устойчивы ко всем пяти препаратам в максимальных концентрациях 25 штаммов M avium (80,6%) устойчивы к концентрации стрептомицина 50 мкг/мл, шесть (19,4%) - устойчивы к концентрации 10 мкг/мл Одиннадцать штаммов (35,5%) устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл, 19 штаммов (61,3%) - устойчивы к концентрациям 5 мкг/мл и один штамм (3,2%) устойчив только к критической концентрации этого препарата (1 мкг/мл) Устойчивы к канамицину (50 мкг/мл) - 27 штаммов (87%) и только четыре штамма M avium (13%) чувствительны Устойчивы к концентрации 5 мкг/мл этамбутола - 28 штаммов (90,3%) К критической концентрации этого препарата устойчивы три штамма (9,7%) К критической концентрации рифампицина устойчивы четыре штамма M avium (13%) Устойчивы к концентрации рифампицина 50 мкг/мл - 27 штаммов (87%)

Два штамма M intracellular (17%) устойчивы ко всем пяти препаратам в максимальных концентрациях Три штамма M intracellular (25%) устойчивы к

концентрации стрептомицина 50 мкг/мл, девять (75%) - устойчивы к концентрации 10 мкг/мл Шесть штаммов (50%) устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл и шесть штаммов (50%) - устойчивы к концентрации 5 мкг/мл Устойчивы к канамицину (50 мкг/мл) - девять штаммов (75%) и только три штамма М mtracellulare (25%) чувствительны Устойчивы к концентрации 5 мкг/мл этамбутола-девятъ штаммов (75%) К критической концентрации этого препарата устойчивы три штамма (25%) Устойчивы к рифампицину (50 мкг/мл) - девять штаммов (87%) К критической концентрации этого препарата устойчивы три штамма М. mtracellulare (25%)

Шесть штаммов М kansasn (40%) устойчивы к концентрации стрептомицина 50 мкг/мл, девять (60%) - устойчивы к концентрации 10 мкг/мл Три штамма (20%) устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл, три штамма (20%) - устойчивы к 5 мкг/мл и девять штаммов М hansasii (60%) устойчивы к критической концентрации этого препарата Устойчивы к канамицину (50 мкг/мл) все штаммы (100%) Шесть штаммов М kansasn (40%) устойчивы к этамбутолу (5 мкг/мл), шесть штаммов (40%) устойчивы только к концентрации 2 мкг/мл этого препарата Три штамма (20%) чувствительны к этамбутолу. Устойчивы к рифампицину (50 мкг/мл) - 12 штаммов (80%) Три штамма М kansasn (20%) чувствительны к этому препарату

Штаммы М scrojulaceum устойчивы к концентрации изониазида 25 мкг/мл, устойчивы к концентрации стрептомицина 10мкг/мл и устойчивы к критической концентрации этамбутола (2 мкг/мл) Штаммы М scrojulaceum чувствительны к канамицину и рифампицину Штаммы М smegmatts устойчивы к максимальным концентрациям стрептомицина (50 мкг/мл), изониазида (25 мкг/мл) и рифампицина (50 мкг/мл), чувствительны к этамбутолу и канамицину Штаммы М gordonae устойчивы к концентрации стрептомицина 10 мкг/мл и изониазида 5 мкг/мл Два штамма устойчивы к концентрации рифампицина 50 мкг/мл Штаммы М gordonae чувствительны к канамицину

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о высоком уровне устойчивости НТМБ к основным противотуберкулезным препаратам В настоящее время методы тестирования лекарственной чувствительности т vitro разработаны только для М tuberculosis Существует необходимость разработки методов тестирования лекарственной устойчивости нетуберкулезных микобакгерий

гг

В результате проведенного исследовании создана коллекция штаммов нетуберкулезных микобактерий, включающая в себя 83 штамма, относящихся к 10 видам (М avium, M tntracellulare, M gordonae, M kansasii, M scrofitîaceum, M ulcerans, M smegmatis, M fortuitum, M peregrmum, M chelonae/M abscessus) Штаммы охарактеризованы с помощью микробиологических, культуральных, биохимических и молекулярно-генетических методов Определена лекарственная устойчивость клинических и лабораторных штаммов нетуберкулезных микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам

гз

Выводы.

1 Определен видовой состав клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, выделенных от больных, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России Создана коллекция штаммов нетуберкулезных микобактерий, охарактеризованная культур альными, биохимическими и молекулярно-биологическими методами

2 Показано, что каждый из использованных методов - ПЦР-секвенирование гена 16Б рРНК, рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 168-238 рибосомной ДНК и НРЬС можно использовать для идентификации нетуберкулезных микобактерий.

3 Установлено, что для дифференциации некоторых генетически близкородственных видов, как, например М катскп/М ¿сят и М икегат/М таппит, имеющих сходные последовательности генов, лучше осуществить с помощью культуральных и биохимических тестов

4 При рестрикционном анализе амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 168-238 рибосомной ДНК установлена внутривидовая вариабельность штаммов М /огШШт Выявлено пять различных геногрупп данного вида микобактерий

5 Определена лекарственная устойчивость клинических штаммов НТМБ Лекарственной устойчивостью к пяти основным противотуберкулезным препаратам (стрептомицину, изониазиду, рифампицину, канамицину и этамбутолу) обладали следующие виды нетуберкулезных микобактерий М сШопае/М аЬхсеявш, М /оНиПит и М тшт-сотр1ех Штаммы М ясго/и!асеит чувствительны к рифампицину и канамицину, штаммы М зтеярпаПй чувствительны к этамбутолу и канамицину

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1 Майорова А А, Степаншина В Н, Шемякин И Г Видовая идентификация микобактерий методом ПЦР - секвенирования гена 16S rRNA // Туберкулез сегодня Тез докл VII Российского съезда фтизиатров -М,2003 - С 111

2. Майорова А А, Степаншина В Н, Коробова О В , Шемякин И Г, Лазовская А Л, Ильина ЕА Использование ПЦР-секвенирования гена 16S рРНК для видовой идентификации микобактерий нетуберкулезного комплекса // Молекулярная генетика, микробиология, вирусология - 2004 - 3 - С 11-20

3 Майорова А А, Степаншина В Н, Шемякин И Г, Коробова О В Исследование коллекции микобактерий нетуберкулезного комплекса рестрикционным анализом амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК // Проблемы туберкулеза и болезней легких - 2004 - 11 - С 34-37

4 Майорова А А, Степаншина В Н, Миронова Р И, Шемякин И Г Видовая идентификация микобактерий методом HPLC Сборник тезисов "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита "Группы восьми" и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств", Материалы VII межгосударственной научно-практической конференции Россия, Оболенск, 3-5 октября 2006 г, с 114

Принятые обозначения и сокращения

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека НТМБ - нетуберкулезные микобактерии пн - пар нуклеотвдов ПЦР - полимеразная цепная реакция

рибосомная ДНК - нуклеотидная последовательность, кодирующая РНК спейсер - нуклеотидная последовательность, разделяющая кодирующие области в геноме

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита ЕМВ - этамбутол

HPLC - (high performance liquid chromatography) - высокопроизводительная

жидкостная хроматография

IS - инсерционная последовательность

MAIS - группа включающая виды М avium, М intracellulare, М scrofulaceum

Подп в печ 26 09 2007 г Формат 60 х 841/1в Объем 1,5 п л Тираж 100 экз Заказ 1977

ГУП МО «Серпуховская типография» Министерство по делам печати и информации Московской области

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Майорова, Ангелина Александровна

Принятые обозначения и сокращения.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Микобактерии - общая характеристика.

1.2. Таксономия.

1.3. Микобактериозы.

1.4. Чувствительность к лекарственным препаратам нетуберкулезных микобактерий.

1.5. Характеристика основных патогенных нетуберкулезных микобактерий.

1.5.1 Медленнорастущие микобактерии.

1.5.1.1. М. avium-complex.

1.5.1.2. М. kansasii.

1.5.1.3. М. scrofulaceum.

1. 5.1.4. М. malmoense.

1.5.1.5. М. szulgai.

1.5.1.6. М. xenopi.

1.5.1.7. М. ulcerans.

1.5.1.8. М haemophilum.

1.5.2. Быстрорастущие микобактерии

М. chelonae, М. fortuitum, M.abscessus.

1.6. Методы видовой идентификации.

1.6.1. Детекция микобактерий.

1.6.2. Дифференциация нетуберкулезных микобактерий и микобактерий туберкулезного комплекса.

1.6.2.1. Культуральные методы, применяемые для идентификации М. tuberculosis.

1.6.2.2. Молекулярно-генетические методы, применяемые для идентификации М. tuberculosis.

1.6.3. Идентификация нетуберкулезных микобактерий.

1.6.3.1. Идентификация нетуберкулезных микобактерий с помощью культуральных и биохимических тестов.

1.6.3.2. Высокопроизводительная жидкостная хроматография high performance liquid chromatography - HPLC).

1.6.3.3. Газожидкостная хроматография.

1.6.3.4. Идентификация нетуберкулезных микобактерий, основанная на генетических различиях.

1.6.3.4.1. Методы, основанные на гибридизации.

1.6.3.4.2. Полимеразная цепная реакция.

ГЛАВА 2. Материалы и методы.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Микробиологические методы.

2.2.1. Бактериоскопический метод.

2.3. Культуральные методы исследования.

2.3.1. Рост микобактерий при разных температурах.

2.3.2 Скорость роста микобактерий.

2.3.3. Пигментация колоний микобактерий.

2.3.4. Рост микобактерий на средах с салициловокислым натрием и с паранитробензойной кислотой.

2.3.5. Рост микобактерий на среде с 5% хлористым натрием.

2.4. Биохимические методы.

2.4.1. Ниациновый тест.

2.4.2 Определение каталазной активности.

2.4.3. Определение термостабильности каталазы.

2.4.4. Определение нитратредуктазной активности.

2.4.5. Определение амидазной активности.

2.5. Определение лекарственной устойчивости in vitro.

2.6. Молекулярно-генетические методы.

2.6.1. Выделение микобакгериальной ДНК.

2.6.2. Амплификация IS6//0 элемента.

26.3. Метод сполиготипирования.

2.6.4. ПЦР - секвенирование фрагмента гена, кодирующего синтез 16S рРНК.

2.6.5. Метод рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК.

2.7. HPLC.

Глава 3. Результаты.

3.1. Исследуемый материал.

3.2. Идентификация культур туберкулезного комплекса.

3.3. Культуральные и биохимические характеристики штаммов нетуберкулезных микобакгерий.

3.4. Использование ПЦР-секвенирования гена 16S рРНК для видовой идентификации нетуберкулезных микобакгерий.

3.5. Исследование коллекции штаммов нетуберкулезных микобакгерий методом рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК.

3.6.HPL C.

3.7. Лекарственная устойчивость нетуберкулезных микобактерий.

Глава 4. Обсуждение.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация нетуберкулезных микобактерий и выбор оптимальной комбинации методов для их видовой дифференциации"

В последние годы резко возросла частота заболеваний, вызываемых нетуберкулезными микобактериями (НТМБ). Главным образом это связано с увеличением количества людей, страдающих иммунодефицитами, в том числе СПИДом, а также с усовершенствованием методов идентификации мико-бактерий нетуберкулезного комплекса [22, 48, 63, 65, 90, 91]. Традиционно микобактериозы не относят к группе опасных инфекций, так как считается, что они не передаются от человека к человеку [3, 48]. Однако заболевание может протекать очень тяжело, приводя к летальному исходу [1,3].

Заболевания, вызываемые нетуберкулезными микобактериями, у им-мунокомпетентных пациентов ограничиваются поражением легких, лимфы или кожи [12, 48]. Диссеминированные формы микобактериозов у них практически не встречаются. Микобактерии поражают легкие у людей, страдающих хроническими легочными заболеваниями - пневмокониозом, силикозом, бронхоэктазами, саркоидозом, коллагенозом и другими заболеваниями [3, 41, 44, 54, 73, 87, 88, 101, 102]. Микобактерии могут быть причиной послеоперационных осложнений или травм [48]. Заболевания, вызванные нетуберкулезными микобактериями, по своей клинической картине и течению очень похожи на заболевания, вызываемые микобактериями туберкулеза [41, 98,99].

Согласно данным литературы, нетуберкулезными микобактериями инфицировано от 25 до 50 % больных СПИДом в США и Европе [48]. Риск развития микобактериозов и бактериемии в отсутствии лекарственной профилактики у ВИЧ - инфицированных больных с количеством клеток CD4 менее 100 клеток/мл составляет 10-20% в год [69, 150]. У пациентов со СПИДом обычно развиваются диссеминированные формы микобактериозов, что является следствием имммунодифицита [38,48, 49, 59, 73,110,147,157].

Род Mycobacterium включает около 100 охарактеризованных видов [73, 111]. Описано более 20 видов, способных вызывать заболевания человека [41]. В последнее время появляются сообщения о микобактериозах, причиной которых являются микроорганизмы, ранее считавшиеся не патогенными для человека. Клинический материал может содержать и сапрофитные виды микобактерий, попавшие в образцы случайно или при питье пациентом некипяченой воды, употреблении грязных фруктов и овощей [10, 150]. Получение ложноотрицательного результата может быть связано с тем, что некоторые микобактерии не растут на обычных средах, применяемых в лабораториях для культивирования М. tuberculosis, или у них не совпадает оптимум роста с оптимумом роста М. tuberculosis [150]. По сравнению с микобактериями туберкулеза, нетуберкулезные микобактерии обладают пониженной кислото - и щелочеустойчивостью, что может приводить их к гибели при общепринятой обработке клинического материала.

Различные нозологические формы заболеваний могут быть вызваны одним видом и наоборот причиной сходных по клиническим проявлениям заболеваний могут быть разные виды микобактерий [1, 11, 41, 48, 65]. Для лечения микобактериозов, вызванных микобактериями разных видов, требуются разные схемы лечения, так как они имеют разную лекарственную чувствительность [64, 116, 155]. Своевременное выявление заболевания и адекватная терапия являются необходимыми условиями успешного выздоровления пациента.

Проанализировав ряд наиболее часто используемых методов идентификации НТМБ, можно сделать заключение, что к настоящему времени не существует универсальной методологии, достаточно чувствительной, быстрой и простой в исполнении. Только используя сочетание нескольких методов, можно достаточно точно и надёжно идентифицировать и дифференцировать микобактерии нетуберкулезного комплекса.

Цель исследования. Идентификация клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, циркулирующих в Центральном и Приволжском федеральных округах России и выбор оптимальной комбинации методов для определения видовой принадлежности.

Для достижения поставленной цели потребовалось решить ряд конкретных задач:

1. Охарактеризовать штаммы нетуберкулезных микобактерий с помощью культуральных и биохимических методов.

2. Провести видовую идентификацию штаммов НТМБ с помощью молеку-лярно-генетических методов.

3. Оценить дифференциально-диагностическую способность отдельных методов для идентификации микобактерий.

4. Определить лекарственную чувствительность клинических и лабораторных штаммов нетуберкулезных микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам.

5. Создать коллекцию клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, охарактеризованных культуральными, биохимическими и молеку-лярно-генетическими методами.

Научная новизна работы.

Предложены комплексы методов для идентификации нетуберкулезных микобактерий: 1) ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК, 2) рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК и 3) высокопроизводительная жидкостная хроматография миколовых кислот (high performance liquid chromatography - HPLC). В случаях генетически близкородственных видов, как, например М. kansasii/M. gastri и М. ulcerans/M. marinum, имеющих сходные последовательности генов, но различающихся своими микробиологическими свойствами, рекомендуется применять сочетание генетических и микробиологических тестов. Создана коллекция нетуберкулезных микобактерий. Определена лекарственная чувствительность штаммов нетуберкулезных микобактерий к основным противотуберкулезным препаратам. Впервые проведено изучение клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, полученных от больных, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России, с помощью как традиционных микробиологических, так и современных мо-лекулярно-генетических методов.

Практическое значение работы.

Создана коллекция нетуберкулезных микобактерий, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам, которую можно использовать в качестве стандартной панели для определения видовой принадлежности клинических штаммов. Проведен анализ ряда основных методов, позволяющих осуществлять идентификацию НТМБ и их внутривидовую дифференциацию. Своевременная идентификация позволяет назначать больным, как туберкулезом, так и микобактериозами адекватную схему лечения или вносить в нее коррективы в течение нескольких суток.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Проведена сравнительная характеристика методов, используемых для идентификации НТМБ (ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК, рестрик-ционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК и HPLC) для применения в повседневной практике. Применение культуральных и биохимических тестов и ПЦР-секвенирование гена 16S рРНК в 99 % случаев позволяет определить видовую принадлежность НТМБ.

2. Обнаружена внутривидовая вариабельность вида М. fortuitum. При использовании метода рестрикционного анализа амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 16S-23S рибосомной ДНК выявлено пять геногрупп данного вида микобактерий.

3. При определении лекарственной устойчивости клинических и лабораторных штаммов НТМБ к основным противотуберкулезным препаратам - стрептомицину, изониазиду, канамицину, этамбутолу и рифам-пицину выявлена высокая устойчивость к этим препаратам.

4. Выявлено, что среди НТМБ, выделенных от больных легочной формой микобактериозов, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России, преобладают виды М. avium, М. intracellulare и М. катази. Создана коллекция НТМБ, включающая 83 штамма, относящихся к десяти видам.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Майорова, Ангелина Александровна

Выводы.

1. Определен видовой состав клинических штаммов нетуберкулезных микобактерий, выделенных от больных, проживающих в Центральном и Приволжском федеральных округах России. Создана коллекция штаммов нетуберкулезных микобактерий, охарактеризованная культуральными, биохимическими и молекулярно-биологическими методами

2. Показано, что каждый из использованных методов - ПЦР-секвенирование гена 168 рРНК, рестрикционный анализ амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 168238 рибосомной ДНК и НРЬС можно использовать для идентификации нетуберкулезных микобактерий.

3. Установлено, что для дифференциации некоторых генетически близкородственных видов, как, например М. катайи/М. gastri и М. и1сегат/М. тагтит, имеющих сходные последовательности генов, лучше осуществить с помощью культуральных и биохимических тестов

4. При рестрикционном анализе амплифицированного фрагмента спейсерной последовательности 168-238 рибосомной ДНК установлена внутривидовая вариабельность штаммов М. /огШИит. Выявлено пять различных геногрупп данного вида микобактерий

5. Определена лекарственная устойчивость клинических штаммов НТМБ. Лекарственной устойчивостью к пяти основным противотуберкулезным препаратам (стрептомицину, изониазиду, рифампицину, канамицину и этамбутолу) обладали следующие виды нетуберкулезных микобактерий: М. ске1опае/М. аЫсеБхт, М. /огШНит и М. аушт-сотр1ех. Штаммы М. Бсго/иШсеит чувствительны к рифампицину и канамицину, штаммы М. ше^таИъ чувствительны к этамбутолу и канамицину.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Майорова, Ангелина Александровна, Оболенск

1. Грузевский A.A. Современные данные о роли фотохромогенных микобак-терий в патологии человека (обзор литературы) // Проблемы туберкулеза. 1999. - №6. - Р. 58-61.

2. Дорожкова И.Р., И.М. Медведева. Проблема лекарственной устойчивости возбудителя туберкулёза на современном этапе // Туберкулёз и экология. -1997.-№2.-С.25-27.

3. Зыков М.П., Ильина Т.Б. Потенциально-патогенные микобактерии и лабораторная диагностика микобактериозов.- М.: Медицина, 1978. 176 с.

4. Ильина Т.С., Смирнов Г.Б. Мигрирующие генетические элементы и их роль в эволюции бактерий // В сб.: Итоги науки и техники, сер. Микро-биол.- 1979.-С.99-153.

5. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Пер. с англ. / Под ред. Баева A.A., Скрябина К.Г. М.: Мир, 1984. - 479 с.

6. Методические рекомендации по проведению микробиологических исследований на туберкулез. М., 2001. С. 68.

7. Определитель бактерий Берджи: В 2 т. / Под ред. Дж Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уиллнелса.: Пер. с англ. М.: Мир, 1997 - Т. 2. -368 с.

8. Оттен Т.Ф. Микобактериоз. Санкт-Петербург, 2005. - 224 с.

9. Приказ № 109 от 21 марта 2003 г. О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации. М.: Министерство здравоохранения РФ.

10. Туберкулез. Патогенез, защита, контроль / Под ред. Блума Б.Р.: Пер. с англ. М.: Медицина, 2002. - 696 с.

11. Филиповский А.В. Значение микобактерий комплекса avium intracellu-lare в инфекционной патологии (обзор литературы) // Проблемы туберкулеза. - 1999. - №5. - Р. 45-48.

12. Abshire R, Cockrum Р, Crider J. Topical antibacterial therapy for mycobacterial keratitis: potential for surgical prophylaxis and treatment // Clin. Therapeutics. 2004. - Vol. 26. - No. 2. - P. 191-196.

13. Adekambi Т., Drancourt M. Dissection of phylogenetic relationships among 19 rapidly growing Mycobacterium species by 16S rRNA, hsp65, sodA, recA and rpoB gene sequencing // IJSEM. 2004. - Vol. 54. - P. 2095-2105.

14. Allen B.W. Mycobacteria: general culture methodology and safety consideration // Methods in molecular biology, vol. 101: mycobacteria protocols. / Ed. by: T. Parish and T. G. Stoker. Totowa, NJ: Humana Press Inc. - 1998. - P. 15-31.

15. Au W.Y., Cheng V.C., Ho P.L., Yuen K.Y., Hung I., Ma S.Y., Lie A.K., Liang R., Kwong Y.L. Nontuberculous mycobacterial infections in Chinese hematopoietic stem cell transplantation recipients // Bone Marrow Transplant. 2003. -Vol. 32.-P. 709-714.

16. Bauer J., Andersen A.B., Kremer K., Miorner H. Usefulness of spoligotyping to discriminate IS6J JO low-copy-number Mycobacterium tuberculosis complex strains cultured in Denmark //J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - No. 8. - P. 2602-2606.

17. Brown-Elliott B.A., Wallace R.J., Jr. Clinical and taxonomic status of pathogenic nonpigmented or late-pigmenting rapidly growing mycobacteria // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - Vol. 15. - No. 4. - P. 716-746.

18. Butler W.R., Guthertz L.S. Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of Mycobacterium species // Clin. Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 14. -No. 4. - P. 704-726.

19. Butt A.A., Janney A. Arthritis due to Mycobacterium fortuitum II Scand. J. Infect. Dis. 1998. - Vol. 30. - P. 525-527.

20. Cave D.M., Murray M., Nardell E. Molecular epidemiology of Mycobacterium tuberculosis // Tuberculosis and the tubercle bacillus. / Ed. by: Cole S.T., Eisenach K.D., Mc Murray D.N., Jacobs W.R., Jr. Washington: ASM Press. -2000. - P. 33-46.

21. Chang C.T., Wang L.Y., Liao C.Y., Huang S.P. Identification of nontubercu-lous mycobacteria existing in tap water by PCR-restriction fragment length polymorphism // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - Vol. 68. - No. 6. - P. 3159-3161.

22. Collins D. M., Stephens D. M. Identification of insertion sequence, IS 1081, in Mycobacterium bovis II FEMS Microbiol. 1991. - Vol. 31. - P. 11-16.

23. Collins D.M., Gicquel B. Genetics of mycobacterial virulence // Molecular genetics of mycobacteria. / Ed. by: Hatfull G.F. and Jacobs W.R., Jr. Washington: ASM Press. - 2000. - P. 173-190.

24. Cook V.J., Turenne C.Y., Wolfe J., Pauls R., Kabani A. Conventional methods versus 16S ribosomal DNA sequencing for identification of nontuberculous mycobacteria: cost analysis // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. - No. 3. - P. 1010-1015.

25. Covert T.C., Rodgers M.R., Reyes A.L., Stelma G.N. Occurrence of nontuberculous mycobacteria in environmental samples H Appl. Environ. Microbiol. -1999. Vol. 65. - No. 6. - P. 2492-2496.

26. Drobniewski F.A., Uttley A.H.C. Mycobacterial speciation // Methods in molecular biology, vol. 101: mycobacteria protocols. / Ed. by: T. Parish and T. G. Stoker. Totowa, NJ: Humana Press Inc. - 1998. - P. 323-349.

27. Ellis S.M., Hansell D.M. Imaging of non-tuberculous (atypical) mycobacterial pulmonary infection // Clin. Radiol. 2002. - Vol. 57. - P. 661-669.

28. El-Zaatari F.A.K., Osato M.S., Graham D.Y. Etiology of Crohn's disease: the role of Mycobacterium avium paratuberculosis // Trends Mol. Med. 2001. -Vol. 7.-No. 6.-P. 247-252.

29. Ergin A., Hascelik G. Non tuberculous mycobacteria (NTM) in patients with underlying diseases: results obtained by using polymerase chain reaction-restriction enzyme analysis between 1997-2002 // New Microbiol. 2004. -Vol. 27. - P. 49-53.

30. Ergin A., Kocagoz T. and US D. Evaluation of 120 mycobacterial strains isolated from clinical specimens to the species level by polymerase chain reaction restriction enzyme analysis // Scand. J. Infect. Dis. - 2000. - Vol. 32. - P. 657-662.

31. Eriksson M., Bennet R., Danielsson N. Non-tuberculous mycobacterial lymphadenitis in healthy children: another "lifestyle disease"? // Acta Paediatr. -2001.-Vol. 90.-P. 1340-1342.

32. Falkinham J.O. III. Epidemiology of infection by nontuberculous mycobacteria // Clin. Microbiol. Rev. 1996. - Vol. 9. - No. 2. - P. 177-215.

33. Falkinham JO. III. Nontuberculous mycobacteria in the environment // Clin. Chest Med. 2002. - Vol. 23. - P. 529- 551.

34. Galassi L., Donato R., Tortoli E., Burrini D., Santianni D., Dei R. Nontuber-culous mycobacteria in hospital water systems: application of HPLC for identification of environmental mycobacteria // J. Water Health. 2003. - Vol. 1. -No. 3.-P. 133-139.

35. Gordon S. V., Heym B., Parkhill J., Barreil B., Cole S.T. New insertion sequences and a novel repeated sequence in the genome of Mycobacterium tuberculosis H37Rv // Microbiology. 1999. - No. 145. - P. 881-892.

36. Griffith D.E. Management of disease due to Mycobacterium kansasii // Clin. Chest Med. 2002. - Vol. 23. - P. 613- 621.

37. Harris N.B., Barletta R.G. Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis in veterinary medicine I I Clin. Microbiol. Rev. 2001. - Vol. 14. - No. 3. - P. 489-512.

38. Haverkamp M.H., Arend S.M., Lindeboom J.A., Hartwig N.G., van Dissel J.T. Nontuberculous mycobacterial infection in children: a 2-year prospective surveillance study in the Netherlands // Clin. Infect. Dis. 2004. - Vol. 39. - P. 450-456.

39. Haverkort F. National atypical mycobacteria survey, 2000 // CDI. 2003. -Vol. 27.-No. 2.-P. 180-189.

40. Heginbothom M.L. The relationship between the in vitro drug susceptibility of opportunist mycobacteria and their in vivo response to treatment // Int. J. Tu-berc. Lung Dis. 2001. - Vol. 5. - P. 539-545.

41. Henry M.T., Inamdar L., O'Riordain D., Schweiger M., Watson J.P. Nontuberculous mycobacteria in non-HIV patients: epidemiology, treatment and response // Eur. Respir. J. 2004. - Vol. 23. - P. 741-746.

42. Hidaka E., Honda T., Ueno I., Yamasaki Y., Kubo K., Katsuyama T. Sensitive identification of mycobacterial species using PCR-RFLP on bronchial washings // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. - Vol. 161. - P. 930-934.

43. Hoenerhoff M., Kiupel M., Sikarskie J., Bolin C., Simmons H., Fitzgerald S. Mycobacteriosis in an american bald eagle (Haliaeetus leucocephalus) // Avian Diseases. 2003. - Vol. 48. - No. 2. - P. 437-441.

44. Holland SM. Nontuberculous Mycobacteria // Am. J. Med. Sci. 2001. - Vol. 321.-No. 1.-P. 49-55.

45. Huang T.-S., Lee S.S.-J., Chen Y.-S., Tu H.-Z., Huang W.-K., Liu Y.-C. Discordant molecular characterization results in a Mycobacterium avium complex strain isolated from an AIDS patient // J. Med. Microbiology. 2005. - Vol. 54. -P. 681-683.

46. Katoch V.M. Infections due to non-tuberculous mycobacteria (NTM) // Indian J. Med. Res. 2004. - Vol. 120. - P. 290-304.

47. Kelly P.M., Scott L., Krause V.L. Tuberculosis in east timorese refugees: implications for health care needs in East Timor // Int. J. Tuberc. Lung Dis. -2002. Vol. 6.-No. 11.-P. 980-987.

48. Kennedy M.P., O'Connor T.M., Ryan C., Sheehan S., Cryan B., Bredin C. Nontuberculous mycobacteria: incidence in Southwest Ireland from 1987 to 2000 // Respir. Med. 2003. - Vol. 97. - P. 257-263.

49. Kent P. T., Kubica G.P. Public health Mycobacteriology. A guide for the level III laboratory. Atlanta: Center for Disease Control, PHS, HEW, 1985. - 210 p.

50. Kirschner P., Böttger E.C. Species identification of Mycobacterium using rDNA sequencing //Methods in molecular biology, vol. 101: mycobacteria protocols. / Ed. by: T. Parish and T. G. Stoker. Totowa, NJ: Humana Press Inc. -1998.-P. 349-361.

51. Klein J.L., Brown T.J., French G.L. Rifampin resistance in Mycobacterium kansasii is associated with rpoB mutations I I Antimicrob. Agents Chemother. -2001. Vol. 45. - No. 11. - P. 3056-3058.

52. Kremer L., Baulard A.R., Besra G.S. Genetics of mycolic acid biosynthesis // Molecular genetics of mycobacteria. / Ed. by: Hatfull G.F. and Jacobs W.R., Jr. Washington: ASM Press. - 2000. - P. 173-190.

53. Lappayawichit P., Rienthong S., Rienthong D., Chuchottaworn C., Chaiprasert A., Panbangred W., Saringcarinkul H., Palittapongarnpim P. Differentiation of

54. Mycobacterium species by restriction enzyme analysis of amplified 16S-23S ri-bosomal DNA spacer sequences // Tuber. Lung Dis. 1996. - Vol. 77. - P. 257263.

55. Le Dantec C., Duguet J-P., Montiel A., Dumoutier N., Dubrou S., Vincent V. Chlorine disinfection of ftypical mycobacteria isolated from a water distribution system // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - Vol. 68. - No. 3. - P. 10251032.

56. Lee H., Park H.-J., ChoO S.-N., Bai G.-H., Kim S.-J. Species identification of Mycobacteria by PCR-restriction fragment length polymorphism of the rpoB gene// J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - No. 8. - P. 2966-2971.

57. Legrand E., Filliol I., Sola C., Rastogi N. Use of spoligotyping to study the evolution of the direct repeat locus by IS6110 transposition in Mycobacterium tuberculosis II J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - No. 4. - P. 1595-1599.

58. Leitritz L., Griese M., Roggenkamp A., Geiger A.M., Fingerle V., Heesemann J. Prospective study on nontuberculous mycobacteria in patients with and without cystic fibrosis // Med. Microbiol. Immunol (Berl). 2004. - Vol. 193. - P. 209-217.

59. Marras T.K., Daley C.L. Epidemiology of human pulmonary infection with nontuberculous mycobacteria // Clin Chest Med. 2002. - Vol. 23. - P. 553-67.

60. Marras TK., Daley CL. A systematic review of the clinical significance of pulmonary Mycobacterium kansasii isolates in HIV infection I I J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 2004. - Vol. 36. - No. 4. - P. 883-889.

61. McGarvey J., Bermudez L.E. Pathogenesis of nontuberculous mycobacteria infections // Clin. Chest. Med. 2002. - Vol. 23. - P. 569- 583.

62. McGarvey J.A., Bermudez L.E. Phenotypic and genomic analyses of the Mycobacterium avium complex reveal differences in gastrointestinal invasion and genomic composition // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69. - No. 12. - P. 72427249.

63. Nolt D., Michaels M.G., Wald E.R. Intrathoracic disease from nontuberculous mycobacteria in children: two cases and a review of the literature // Pediatrics.2003. Vol. 112. - No. 5. - P 434-439.

64. O'Brien D.P., Currie B.J., Krause V.L. Nontuberculous mycobacterial disease in northern Australia: a case series and review of the literature // Clin. Infect. Dis. 2000. - Vol. 31. - P. 958-967.

65. Ohkusu K., Bermudez L.E., Nash K.A., MacGregor R.R, Inderlied C.B. Differential virulence of Mycobacterium avium strains isolated from HIV-infected patients with disseminated M. avium complex disease // JID. 2004. - Vol. 190. -P. 1347-1354.

66. Parish, T., and N. G. Stoker. Mycobacteria bugs and bugbears // Methods in molecular biology, vol. 101: mycobacteria protocols. / Ed. by: T. Parish and T. G. Stoker. Totowa, NJ: Humana Press Inc. - 1998. - P. 1-13.

67. Pfiffer G.E., Brown-Elliot B.A., Wallace R.J., Jr. General characteristic of Mycobacteria // Manual of clinical microbiology. / Ed. by: Murray P., and others. Washington: ASM Press. - 2003. - P. 532-559.

68. Phillips M.S., von Reyn C.F. Nosocomial infections due to nontuberculous mycobacteria I I Clin. Infect. Dis. 2001. - Vol. 33. - P. 1363-1374.

69. Primm T.P., Lucero C. A., Falkinham III J.O. Health impacts of environmental Mycobacteria // Clin. Microbiol. Rev. 2004. - Vol. 17. - No. 1. - P. 98-106.

70. Queipo J. A., Broseta E., Santos M., Sánchez-Plumed J., Budía A., Jiménez-Cruz F. Mycobacterial infection in a series of 1261 renal transplant recipients // Clin. Microbiol. Infect. -2003. Vol. 9. - P. 518-525.

71. Reilly A.F., McGowan K.L. Atypical Mycobacterial infections in children with cancer // Pediatr. Blood Cancer. 2004. - Vol. 43. - P. 698-702.

72. Rieder H.L. Interventions for Tuberculosis Control and Elimination // International union against tuberculosis and lung disease. 2002. - Paris. France. -251 p.

73. Ringuet H., Akoua-Koffi C., Honore S., Varnerot A., Vincent V., Berche P., Gaillard J.L., Pierre-Audigier C. hsp65 sequencing for identification of rapidly growing mycobacteria // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - No. 3. - P. 852-857.

74. Rodríguez J.C., Cebrián L., López M., Ruiz M., Royo G. Mutant prevention concentration: a new tool for choosing treatment in nontuberculous mycobacterial infections // Int. J. Antimicrobial Agents. 2004. - Vol. 24. - No. 1. - P. 352-356.

75. Ruiz M., Rodríguez J.C., Escribano I., García-Martínez J., Rodriguez-Valera F., Royo G. Application of molecular biology techniques to the diagnosis ofnontuberculous mycobacterial infections // APMIS. 2001. - Vol. 109. - No. 12.-P. 857-864.

76. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1977. - Vol. 74. - P. 5463-5467.

77. Scorpio A., Lindholm-Levy P., Heifets L., Gilman R., Sddiqi S., Cynamon M., Zhang Y. Characterization of pncA mutations in pyrazinamide-resistant Mycobacterium tuberculosis II Antimicrob. Agents Chemother. 1997. - Vol. 41. -No. 3. - P. 540-543.

78. Sebban M., Mokrousov I., Rastogi N., Sola C. A data-mining approach to spacer oligonucleotide typing of Mycobacterium tuberculosis II Bioinformatics. 2002. - Vol. 18. - No. 2. - P. 235-243.

79. Selby W. Pathogenesis and therapeutic aspects of Crohn's disease // Veterinary Microbiology. 2000. - Vol. 77. - P. 505-511.

80. Shinnick T.M., Good R.C. Mycobacterial taxonomy // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1994. - Vol. 13. - No. 11. - P. 884-901.

81. Smith M.B., Schnadig V.J., Boyars M.C., Woods G.L. Clinical and pathologic features of Mycobacterium fortuitum infections. An emerging pathogen in pa-tientsw AIDS // Am. J. Clin. Pathol. 2001. - Vol. 116. - P. 225-232.

82. Sola C., Devallois A., Horgen L., Maisetti J., Filliol I., Legrand E., Rastogi N. Tuberculosis in the Caribbean: using spacer oligonucleotide typing to understand strain origin and transmission // Emerg. Infect. Dis. 1999. - Vol. 5. - P. 404-414.

83. Somoskovi A., Mester J., Hale Y.M., Parsons L.M., Salfinger M. Laboratory diagnosis of nontuberculous mycobacteria // Clin. Chest. Med. 2002. - Vol. 23. - No. 3. - P. 585-597.

84. Spyridis P., Maltezou H.C., Hantzakos A., Scondras C., Kafetzis D.A. Mycobacterial cervical lymphadenitis in children: clinical and laboratoryfactors of importance for differential diagnosis // Scand. J. Infect. Dis. 2001. - Vol. 33. -P. 362-366.

85. Tanaka M. T., Small P.M., Salamon H., Feldman M.W. The dynamics of repeated elements: Applications to the epidemiology of tuberculosis // PNAS. -2000. Vol. 97. - No. 7. - P. 3532-3537.

86. Telenti A. Genetics of drug resistance in tuberculosis // Tuberculosis. 1997. -Vol. 18.-No. 1.-P. 55-64.

87. Thomsen V.O., Andersen A.B., Miorner H. Incidence and clinical significance of non-tuberculous mycobacteria isolated from clinical specimens during a 2-y nationwide survey // Scand. J. Infect. Dis. 2002. - Vol. 34. - P. 648-653.

88. Turenne C.Y., Tschetter L., Wolfe J., Kabani A. Necessity of quality-controlled 16S rRNA gene sequence databases: identifying nontuberculous Mycobacterium species 11 J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - No. 10. - P. 3637-3648.

89. Wagner D., Young L.S. Nontuberculous mycobacterial infections: a clinical review // Infection. -2004. Vol. 32. - No. 5. - P. 257-270.

90. Wallace R.J., Jr, Brown B.A., Griffith D.E. Nosocomial outbreaks/pseudo-outbreaks caused by nontuberculous mycobacteria // Annu. Rev. Microbiol. -1998.-Vol. 52.-P. 453-490.

91. Wallace R.J., JR., Brown-Elliott B.A., Ward S.C., Crist C.J., Mann L.B., Wilson R.W. Activities of linezolid against rapidly growing mycobacteria // An-timicrob. Agents Chemother. 2001. - Vol. 45. - No. 3. - P. 764-767.

92. Weinstock D.M., Feinstein M.B., Sepkowitz K.A., Jakubowski A. High rates of infection and colonization by nontuberculous mycobacteria after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation // Bone Marrow Transplant. 2003. -Vol. 31.-P. 1015-1021.

93. Woods G.L. Susceptibility testing for mycobacteria // CID. 2000. - Vol. 31. -P.1209-1215.

94. Woods G.L. The mycobacteriology laboratory and new diagnostic techniques // Infect. Dis. Clin. North Am. 2002. - Vol. 16. - No. 1. - P. 127-144.

95. Zhang Y., Mann L.B., Wilson R.W., Brown-Elliott B.A., Vincent V., Iinuma Y., Wallace R.J., Jr. Molecular analysis of Mycobacterium kansasii isolates from the United States // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42. - No. 1. - P. 119-125.