Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение гликосфинголипидов головного мозга свиньи и изучение их свойств

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Выделение гликосфинголипидов головного мозга свиньи и изучение их свойств"

На правах рукописи

Ветром Виктор«« Викторов на

Выделение глнкосфинголипидов головного мозга свиньи и изучение их свойств

03.00.23 - Биотехнология 05.17.08 - Процессы и аппараты химических технологий

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва-2006 ё \ Г ^

Цг

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова и на ЗАО НПО «Техкон».

Научный руководитель:

доктор химических наук, профессор

Консультант: кандидат технических наук

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор кандидат медицинских наук, Ведущая организация:

Защита диссертации состоится «Л&» СеллЬ.^^Л' 2006 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д 212,120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу: 119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Академии (119571, Москва, пр. Вернадского, 86).

Автореферат разослан «АЗ»/УМЯ^Х/ 2006 года.

Каплун Александр Петрович

Михайлова Наталья Александровна

Варламов Валерий Петрович Кречетов Сергей Петрович РХТУ им. Д.И. Менделеева

Учёный секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук

Лютик А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Полярные липиды широко применяются в медицине и косметологии, в основном для получения липосомных препаратов. Репертуар используемых полярных липидов довольно узок: основу составляют фосфатидилхолин, холестерин, для придания особых свойств в состав включают отрицательно заряженные природные фосфолипиды (фосфатидилсерин, фосфатидная кислота, фосфатидилглицерин,

дифосфатидилглицерин), гидрированные фосфолипиды, реже синтетические липиды. С этой точки зрения перспективно изучение возможности использования в липосомных препаратах ГСфЛ1, к которым относятся Ц, ЦС. Особый интерес в этом классе соединений представляет ЦС. Присутствие отрицательного заряда в молекуле ЦС, длинных насыщенных углеводородных цепей делает этот полярный липид очень полезным компонентом липосом для включения лекарственных веществ, так как отрицательный заряд и высокая температура фазового перехода должны увеличивать агрегационную устойчивость и уменьшать перекисное окисление липидов. Кроме того, литературный анализ показал, что Ц и ЦС также обладают уникальными физико-химическими и биологическими свойствами.

Недавние исследования показывают, что сфинго липиды участвуют в регуляции транскрипции, дифференцировке клеток, стрессовом ответе, и регуляции апоптоза, а также принимают участие в межклеточной сигнализации. Благодаря физико-химическим особенностям сфинголипиды биологических мембран взаимодействуют друг с другом, с другими компонентами мембран, образуя домены (rafts), которые принимают участие в регулировании мембранных процессов: эндо- и экзоцитоза, в функционировании мембранных рецепторов и ферментов. Все перечисленное говорит об актуальности разработки простых методов выделения ГСфЛ и изучения их свойств в составе надмолекулярных ансамблей.

1 Список сокращений: ГСфЛ - глюсосфинголипиды, ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия, Лс — липосомы, СМ - сфингомиелин, ТГ - триглицериды, ТСХ - тонкослойная хроматография, УЗД — ультразвуковой дезинтегратор. Ход -холестерин, ФКС — фотонная корреляционная спектроскопия, ФЛ — фосфолипиды, ФХ —

фосфатидилхолин, ФЭ - Фосфатидилэтаноламин, Ц - цереброзид, ЦС - цереброзид сульфат, ЭМ - электронная микроскопия, яФХ - яичный фосфатидилхолин.

3

Ц и ЦС присутствуют в мембранах лейкоцитов, эритроцитов, в эпителиальных клетках почек и кишечника, оболочке глаза, но основное количество этих ГСфЛ содержатся в головном и спинном мозге. Во взрослом мозге ЦС составляют 3-8% от общей сухой массы всех липидов. Поэтому именно мозг животных может рассматриваться как главный источник ГСфЛ. Цель и задачи исследования

■ Разработать технологичный метод выделения гликосфинголипидов (Ц, ЦС) из мозга свиньи.

" Отработать способы получения стабильных липосом на основе выделяемых ГСфЛ.

• Для водных дисперсий ГСфЛ исследовать физико-химические свойства, определяющие их возможное использование в косметике и медицине.

■ Изучить возможность их использования как рН-чувствительных липосом.

■ Изучить воздействие липосомных дисперсий с ГСфЛ на кожу. Научная новизна работы

• Разработана технология выделения ГСфЛ из мозга свиньи с высоким (до 30%) содержанием цереброзид сульфата, не требующая больших энергетических затрат, с использованием лишь ацетона и «гарта.

• Показано, что полученные ГСфЛ легко гидратируются с получением устойчивых дисперсий с размером частиц <200 нм без использования ультразвука или экструзии.

• Обнаружено, что эндотермический фазовый переход (с максимумом 80°С) Ц и ЦС из гелевой фазы в жидкокристаллическую, не проявляется после повторного нагревании в течение 2 ч.

• Косметические композиции на основе ГСфЛ увеличивают увлажненность и упругость кожи в большей степени, чем композиции с включением глицерофосфолипидов.

Практическая значимость работы

Полученные результаты были использованы при создании промышленной технологии выделения ГСфЛ из мозга свиньи, которая была внедрена на предприятии «Биотех-М». Разработаны косметические композиции с включением Лс на основе ГСфЛ. ГСфЛ могут быть использованы для получения липидных дисперсий для различных целей без дополнительного оборудования. ГСфЛ, выделенные по разработанной технологии, переданы для использования: как стабилизатор и биоспецифический лиганд

латексных дисперсий для определения С-реактивного белка; для стабилизации дисперсий бетулиновой кислоты; для получения липосомных форм противотуберкулезных препаратов; для инкапсуляции «Семакс» в липосомы для доставки в мозг. В настоящее время входит в состав косметической композиции, выпускаемой ЗАО НПО «Техкон»: дневной крем «Ягодное сияние».

Положения, выносимые на защиту

1. Способ выделения ГСфЛ из мозга свиньи.

2. Новый тип пролипосом на основе ГСфЛ, получение липидных наночастиц без использования ультразвука и экструзии.

3. Влияние ГСфЛ на упругость и увлажненность кожи.

Публикации По материалам работы опубликованы: 3 статьи и патент.

Апробация работы Материалы диссертации были доложены на: V Международном

форуме «Биотехнология и Современность», (Санкт-Петербург, 2004), на IX Международной научно-практической конференции «Косметические средства и сырье: безопасность и эффективность» (Москва, 2004), и на II Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии» (Москва, 2004),.

Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и'списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит УЗ рисунков и & таблиц. Список литературы включает № источников. 1. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1.1. Исследование состава

Качественный липидный состав определяли с помощью ТСХ на силикагеле в присутствии аутентичных образцов липидов. Количественный анализ проводили гравиметрически после разделения на колонке с силикагелем. Количество плазмалогенов оценивали по уменьшению ФХ и ФЭ после мягкого кислотного гидролиза. Содержание белка определяли по Бредфорду.

1.2. Устойчивость к окислению

Устойчивость к окислению исследовали по скорости накопления малонового альдегида в образцах при индукции аскорбатом железа (II). Концентрация малонового альдегида определяли в виде комплекса с тиобарбитуровой кислотой по поглощению при 540 нм.

1.3. ^"Потенциал

^-Потенциал определяли по скорости перемещения границы раздела золь-контактная жидкость в электрическом поле. Электрофорез проводили в И-образной градуированной стеклянной трубке (Рис.1), снабженной двумя кранами. Резиновым шлангом трубка соединена с сосудом, в который наливали исследуемую дисперсию. Внешняя разность потенциалов подавалась к металлическим электродам.

мин. после подачи потенциалов

1.4. Размер и морфология частиц дисперсий

Размеры Лс определяли с помощью фотонной корреляционной спектроскопии (ФКС) на приборе Ма1ует; с помощью электронной микроскопии (ЭМ) (негативное контрастирование)2 определяли размер и морфологию частиц.

1.5. Дифференциальная сканирующая калориметрия

Термограммы дисперсий ГСфЛ (0.5%) получали с помощью дифференциального адиабарного сканирующего микроколориметра ДАСМ-4 (Биоприбор, Россия)3.

2

Проводилась д.б.н. В.И.Попенко, ИМБ РАН им. Энгельгардта

3 Проводились в лаборатории д.х.н. В.Я. Гринберга, ИНЭОС РАН им. Несмеянова

1.6. Влияние ГСфЛ на свойства эпидермиса (увлажненность и упругость проницаемость лнпидного барьера для воды)4

Набухание эпидермиса при увлажнении регистрировали по увеличению его упругости. Частоту резонанса кожи определяли методом вибрационной реоэластографии.

2. ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ГСфЛ ИЗ МОЗГА СВИНЬИ

Известные методы получения ГСфЛ основаны на многостадийных экстракциях липидов из животных тканей (головного и спинного мозга) смесью хлороформ:метанол или хлороформ:этанол, дополнительной очистке продукта при помощи пиридина, ацетона, эфира или метилового спирта. К недостаткам таких способов получения ГСфЛ можно отнести длительность процесса (от 12 до 48 ч), использование значительных количеств органических растворителей, что делает процесс пожаро- и экологически опасным, возрастает себестоимость получаемого продукта.

Основная цель этой части работы — разработка простого метода выделения ГСфЛ (Ц, ЦС, Рис. 2) из головного мозга свиньи. В основе предложенного метода выделения ГСфЛ лежит различная растворимость в этиловом спирте ГСфЛ и глицерофосфолипидов при разных температурах. Глицерофосфолипиды содержат гораздо больше ненасыщенных жирных кислот, и поэтому имеют меньшую температуру фазового перехода (-15-г-5°С для ФХ, около 80°С для Ц) и поэтому лучше растворимы в органических растворителях, чем Ц и ЦС из мозга свиньи. "

Рис. 2. Структура цереброзида (11=Н) и цереброзид сульфата (К= БО^Н), наиболее представленных в мозге свиньи

Процессуальная схема, разработанного метода выделения представлена на

4 Исследования проводились в лаборатории биофизики НПО «Техкон» А.Б. Тимофеевым и Г. А. Тимофеевым

Рис. 3. Процессуальная схема получения ГСфЛ

Процесс выделения состоит из следующих основных стадий: обезвоживание и экстракция нейтральных липидов; спиртовая экстракция фосфолипидов и экстракция ГСфЛ; кристаллизация ГСфЛ с последующей дополнительной стадией промывки.

Полноту извлечения нейтральных липидов обеспечивает двухстадийная экстракция ацетоном с измельчением обезвоженного сырья после первой ацетоновой экстракции. После каждой экстракции отделение экстракта осуществляли вакуумной фильтрацией. Таким образом освобождались от воды, основной части нейтральных липидов, в том числе холестерина.

На стадиях ацетоновых экстракций основными параметрами, влияющими на степень извлечения нейтральных липидов, являются количество добавляемого экстрагента и время экстракции. В ходе эксперимента нами определялось содержание нейтральных липидов после каждой экстракции. Оптимальное количество ацетона составляет 3.0-3.5 массовых частей на одну часть исходного сырья на каждой стадии. Время экстракции на каждой стадии составляло один час. Таким образом удалось достичь степень извлечения нейтральных липидов 80-85%.

Для изучения растворимости ГСфЛ и глицерофосфолипидов в спирте при различных температурах образцы помещали в термостат и выдерживали в течение 4 ч при определенной температуре и постоянном перемешивании. Затем на обогреваемом вакуум-фильтре при температуре, соответствующей температуре фракционирования (экстракции), отделяли экстракт и определяли состав липидов. Температуру в ходе эксперимента варьировали от 15 до 75°С с интервалом 5°С. В ходе проведенных экспериментов были установлены температуры растворимости рассматриваемых классов липидов. Исходя из полученных данных, первая спиртовая экстракция проводилась при температуре 30-35°С, при которой экстрагируется в основном ФХ, ФЭ; вторая экстракция при температуре б5-70°С позволила выделить ГСфЛ. Оптимальное количество спирта составляло 4 массовых части на одну часть ацетонового порошка на каждой стадии спиртовой экстракции.

Для кристаллизации ГСфЛ из спиртового раствора его выдерживали 24 ч при 20-22°С до образования белого кристаллического осадка, который отделяли фильтрацией. Полученные кристаллы содержат примеси глицерофосфо- и нейтральных липидов. Для их удаления ввели стадию экстракции кристаллов этанолом и/или ацетоном. Выход составил 70-75% ГСфЛ от их нативного содержания в исходном обезвоженном сырье

(Таблица 1). Полученные образцы содержали незначительное количество белка (3±0.5%). Экстракция хлороформного раствора ГСфЛ физраствором понижала содержание белка в 7 раз.

Таблица 1. Состав компонентов смеси на стадиях технологического процесса, %*

Компоненты смеси Исходное сырье, св. В I ацетон, экстракт. В 11 ацетон, экстракт. I спирт, экстр. КР продукт Ацетон, промывка Спирт. Промывка

ТГ+Хол 31.6 77.8 81.5 3.0 11.2 — 5.2

ФЭ 23.2 7.9 9.5 41.1 18.2 5.7 —

ФХ 20.6 11.5 5.0 45.6 10.9 3.2 —

СМ+др. пол. 7.4 2.8 _

липиды

ц 3.6 следы следы следы 45.5 67.3 66.2

цс 2.8 следы следы следы 14.2 23.8 28.6

»относительная погрешность методов определения составляла 5-7%

3. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ ВЫДЕЛЕННЫХ ЛИПИДОВ 3.1. Получение липосом

3.1.1. Самопроизвольное образование липосом

Стандартный способ получения моноламеллярных липосом заключается в гидратации полярных липидов; при этом образуются мультиламеллярные липосомы, которые превращаются в моноламеллярные с использованием ультразвука или с помощью экструзии. Оба метода требуют значительного расхода энергии, липосомные дисперсии нагреваются, что увеличивает вероятность окисления липидов и их гидролиза. Мы обнаружили, что получаемая по предложенной схеме смесь ГСфЛ обладает уникальным свойством: гидратация в определенных условия приводит к образованию моноламеллярных липосом. Как видно из Рис. 5, средний размер полученных таким образом липосом составляет 164 нм (коэффициент полидисперсности 0.24).

Другими словами, ГСфЛ проявляют свойства пролипосом. Этим термином обозначают системы, которые при смешивании с водой самопроизвольно образуют дисперсии моноламеллярных липосом. До сих пор было известно два типа пролипосом:

1) ФЛ, адсорбированные на пористом носителе, например сорбите; и 2) раствор ФЛ в смеси спирт—глицерин—вода.

ГСфЛ обладают свойствами пролипосом, очевидно, благодаря своему составу и/или способу получения. Логично предположить, что при смешивании с водой выделяется энергия, достаточная для образования моноламеллярных однослойных липосом, например, энергия гидратации. Отдельно ни Ц, ни ЦС моноламеллярных однослойных липосом не образуют в описанных условиях.

3.1.2. Получение липосом с помощью ультразвукового дезинтегратора

Для получения более мелких липосом использовали обработку ультразвуком. При этом получали смесь липосом двух типов. На Рис. 4а показано, что наряду с липосомами с размером 97 нм, присутствует фракция с размером 190 им. Причем, как следует из гистограммы на Рис. 46, таких липосом намного меньше чем мелких. Только 20% всех липидов образует липосомы размером 190 нм.

3.2 Размер и морфология липидных ансамблей

Размер частиц, полученных на основе ГСфЛ, определенный обоими методами различались не существенно (табл. 2).

Таблица 2. Размеры частиц (нм) дисперсий, полученных наслаиванием (самопроизвольные) и с помощью УЗД, определенные ФКС и ЭМ

Метод Самопроизвольные УЗД

ФКС 164 97 190

ЭМ 140 80 180

На фотографии дисперсии, полученной наслаиванием (Рис. 6а), видны полунанотрубки и небольшое количество липосом того же диаметра (около 100 нм). В образцах, полученных с помощью УЗД, наблюдаются липосомы размером от 80 до 170 нм (Рис. 7а). После нагревания до 90°С и в том и в другом случае присутствуют подобные структуры наряду с более мелкими (Рис. 66 и Рис, 76).

50 100 диаметр (им)

20

е 1

ю

■П.

I . (Г.

■ . ■:.:■» .. <:

" ' 1

[■.....

■ 5 V-■ . "¡1 г!» \ {

10 50 100

диаметр (им)

5001000

а)

Рис. 4. Распределение частиц полученных с помощью УЗД: а) по числу, б) по объему

--; - -<- -е-Н-Ч* ^ -

1

♦ Ь

• К * .

* « |к >ч * « » I 1 > I »1

1Ь_\ I •

б)

50 100 5001000

диаметр (нм)

5. Распределение самопроизвольно образующихся частиц: а) по числу б) по

Рис. 6. Дисперсия, полученная методом наслаивания: а) до нагревания, б) после нагревания

Рис. 7. Дисперсия, полученная при помощи УЗД: а) до нагревания, б) после нагревания

Образование наноструктур с высоким аксиальным отношением отмечено для Ц и ЦС и ранее: предполагается, что эти липиды ответственны за стабилизацию участков мембран с высокой кривизной (реснички каемчатых клеток кишечника и почек). Округлые структуры нами идентифицированы как липосомы: они имеют изолированный внутренний объем, что было показано в экспериментах с загрузкой водорастворимого красителя (Рис. 10).

33. Агрегационная устойчивость

Важным свойством коллоидных систем является агрегационная устойчивость. Для оценки влияния ГСфЛ на агрегационную устойчивость проводили сравнительный анализ липосом, полученных на основе ГСфЛ, липосом на основе яичных фосфолипидов с добавлением ГСфЛ (3.5% ГСфЛ, соответствуют 1% ЦС, по массе) и липосом на основе яичных фосфолипидов. Как видно из Рис. 8, липосомы, полученные из ГСфЛ гораздо более стабильны по сравнению с липосомами из яичных фосфолипидов. Добавление всего 3 5% ГСфЛ к яичным фосфолипидам увеличивает стабильность липосом более чем в два раза.

Большая стабильность липосом, в состав которых входят ГСфЛ мозга свиньи, объясняется тем, что данные липиды за счет ЦС придают мембране липосом отрицательный заряд, что препятствует агрегации липосом. Кроме того, более насыщенные ГСфЛ увеличивают механическую прочность мембран; мембраны, липиды которых находятся в состоянии геля, менее склонны к слиянию.

3.4. Устойчивость к окислению

Другим важным свойством липосом, определяющим возможность их использования, является устойчивость к перекисному окислению.

Также как и в случае агрегационной устойчивости ГСфЛ существенно повышают устойчивость липосом из яичных фосфолипидов и к окислению (Рис. 9). Сами по себе липосомы из ГСфЛ практически не окисляются в выбранных условиях, что является следствием незначительного содержания в них ненасыщенных жирных кислот. Добавление 3.5% ГСфЛ к яичным липидам приводит к уменьшению скорости окисления липидов в 5.2 раза.

100 время, сутки

200

•липосомы на основе яичных фосфолипидов

"липосомы на основе яичных фосфолипидов с добавлением 3.5% ГСфЛ "липосомы на основе ГСфЛ

Рис. 8. Агрегационная устойчивость липосом, выраженная как отношение поглощения 1% липосомной дисперсии после (D2) и до (D1) центрифугирования (5 мин, 3000 об/мин) (Doth.= D2/D1)

с; 5 л с; о 2 X

время, ч

-липосомы на основе яичных фосфолипидов

-липосомы на основе яичных фосфолипидов с добавлением 3.5% ГСфЛ

-*— липосомы на основе ГСфЛ

-♦—липосомы на основе яичных фосфолипидов с добавлением 1% ЦС

Рис. 9. Накопление малонового альдегида при 25°С для липосом различного состава

Обнаруженный нами эффект может быть следствием: разбавления ненасыщенных липидов насыщенными, увеличения вязкости и, следовательно, уменьшения скорости диффузии кислорода и уменьшения растворимости кислорода в бислое. Представляется маловероятным, что перечисленные явления могут дать такой существенный эффект, так как содержание ГСфЛ всего 3.5%. Единственным весомым изменением является появление отрицательного заряда на липосомах из-за присутствия в ГСфЛ отрицательно заряженного ЦС. Для того чтобы проверить эту гипотезу, исследовали образец Лс из яичных фосфолипидов с добавлением 1% ЦС. Как видно из Рис. 9, практически весь антиоксидантный эффект можно приписать ЦС.

3.5. рН-Зависимая проницаемость бислоя липосом

Наиболее интригующая область липосомологии - конструирование липосом, обладающих способностью менять свойства в зависимости от внешнего стимула: температуры, рН, магнитного поля, давления, интенсивности света и т.п. В частности, рН-чувствительные липосомы способны увеличивать проницаемость мембраны в кислых средах. Это эксплуатируется для внутриклеточной доставки с помощью липосом. При поглощении липосом клеткой, они оказываются в эндосомах, в которых рН -5.5. Содержимое обычных липосом в конечном итоге попадает со всем содержимым эндосомы в лизосомы, где разрушается гидролазами. рН-Чувствительные липосомы в

кислой среде эндосом становятся способными к слиянию с мембраной этой органеллы; таким образом содержимое липосом оказывается в цитозоле.

В состав липидов мозга свиньи входят, по крайней мере, два класса полярных липидов, способных придать липосоме pH-чувствительность. Плазмапогены легко гидролизуются в слабо кислой среде до лизо-ФЛ благодаря наличию в них винилого эфира. Лизо-ФЛ дестабилизируют бислой, таким образом, способствуя увеличению его проницаемости, и способности к слиянию. ЦС обладает сульфо-группой, отрицательно заряженной в нейтральной среде, и поэтому сильно гидратированной; при подкислении происходит протонирование, в результате чего заряд нейтрализуется, что приводит к частичной дегидратации. Другими словами, при подкислении объем полярной головки ЦС резко уменьшается, что так же дестабилизирует липосому.

Были исследованы два типа липосом: из ГСфЛ и липосомы, полученные по разработанной методике, за исключением стадии экстрации спиртом, т.е. содержащих до 60% ФЛ, в том числе плазмалогены (21-28%).

Проницаемость бислоя детектировали по выходу Арсеназо III из липосом (Рис. 10) при трех значениях pH (2.5; 5.0; 7.4). Липосомы получали в растворе Арсеназо III, невключившийся краситель отделяли гельфильтрацией. В качестве контроля использовали стандартные Лс, состоящие из яФХ и Хол (7:3 моль/моль). Липосомы инкубировали при разных значения pH при 20°С, периодически отбирали пробы по 100 мкл, и на колонке с Sepharose CL-4B отделяли липосомы от вышедшего красителя, разрушали дезоксихолатом натрия; получали: фракцию 1 (дисперсия Лс с красителем) и фракцию 2 (краситель вне Лс). Эффективность включения (Е) рассчитали по формуле: E=(D1V1V(D1V, + D2V2),

где: D|, D2 — оптическое поглощение при 569 нм во фракции 1 и фракции 2, V„Vj — объем фракции 1 и фракции 2.

100 т-------

«о

г> Ф

а.

а> у

<0 5

X 2 во

80

60

40 -

20 -

г> ——ИИ-

□ рН 7.4

ШрН 5

□ рН 2.5

I

ГСфЛ с плазмзлогенами

ГСфЛ

яФХ/Хол

Рис. 10. Выход Арсеназо III из липосом при различных рН в % от исходного через 48 ч

Из графиков видно, что рН-чувствительность проявляют только Лс, в которых содержатся плазмалогены.

3.6. ^-Потенциал

^-Потенциал измеряется по электрофоретической подвижности частиц дисперсионной фазы. Для вычисления ^-потенциала определяют сдвиг (а) границы раздела золь-контактная жидкость за время т, рассчитывают электрофоретическую подвижность (.(/). Значения ц и £ дисперсионной среды принимают равными соответственно 10"3 Па с и 81.

11 = -5— = аЬ Vй эА и Эф тЕ ТУ (1) £ = -= киэф (П)

££ о

где, Е — напряженность электрического поля; Ь - расстояние между электродами; V -разность потенциалов; а — сдвиг границы раздела золь — контактная жидкость; т - время эксперимента; л - вязкость среды; е — диэлектрическая проницаемость дисперсионной среды; Ео - диэлектрическая проницаемость вакуума.

Липосомная дисперсия, полученная при помощи УЗД, в правом колене (-) через 20 мин после подключения электродов имела две границы раздела (Рис. 1). ^-Потенциал первой границы соответствует -40 мВ, второй: -94 мВ. На основании полученных

17

данных можно сделать предположение о том, что в данных условиях происходит разделение липосом, содержащих разное количество заряженного ЦС. 3.7. Дифференциальная сканирующая калориметрия

Исследовали два образца Лс: Лс, полученные наслаиванием ( Рис. 11), и Лс, полученные УЗД (Рис. 12), причем, каждую дисперсию сканировали дважды (второй раз после того, как образец охлаждался до комнатной температуры). На термограммах первого сканирования наблюдаются переходы как экзотермические, так и эндотермические. В образце, полученном УЗД, можно наблюдать два эндотермических перехода разной интенсивности. При втором сканировании экзотермические переходы не наблюдаются; соотношение энтальпии переходов для УЗД образца выравниваются. В образце, полученном наслаиванием, при втором сканировании увеличивается ширина

пика. -

Из выше приведенных данных можно сделать следующие выводы. Данные фотонной корреляционной спектроскопии свидетельствуют о наличии двух фракций липидных ансамблей, различающихся размерами. По всей видимости, Лс меньшего размера содержат меньшее количество ЦС, из-за электростатического отталкивания; в Лс меньшего размера на внутренней поверхности бислоя это особенно выражено. Измерение ^-потенциала подтверждает существование двух типов Лс с разным поверхностным зарядом. В зависимости от способа приготовления дисперсии образуются разные агрегаты. Методом наслаивания образуются в основном тубулярные наноструктуры, которые переходят в липосомы при нагревании или при озвучивании. Дисперсии ГСфЛ имеют сложное полиморфнофазовое поведение.

По литературным данным при нагревании липосомной дисперсии метастабильная гелевая фаза претерпевает экзотермический переход в стабильную гелевую фазу, что обусловлено гидратацией полярных головок и перестройкой сети водородных связей, образуемых амидными группами и гидроксилами углеводных остатков. В районе 80°С происходит главный (эндотермический) переход гель—жидкий кристалл. При охлаждении упорядоченная гелевая структура образуется при комнатной температуре только через 5 дней. Таким образом, повторное нагревание через несколько часов не выявляет эндотермического перехода. Мы наблюдали подобную картину.

_._■ ■ '-■.. . I ........ ..' ■ ' • '___

О 20 40 80 80 100 120 140

П *С

Рис. 11. Термограмма 0.5% липосомиой дисперсии, полученной методом наслаивания: 1 - первое нагревание, 2 - второе нагревание

5.5

5.0

4.5

4.0

О)

3.5

—1

3.0

2.5

2.0

1.5

20

... I,-40

60 80

°с

100

120

140

Рис. 12. Термограмма 0.5% лнпосомной дисперсии, полученной при помощи УЗД: 1 — первое нагревание, 2 - второе нагревание

3.8. Воздействие липосом на основе ГСфЛ на кожу

Такие вещества как органические растворители и детергенты нарушают барьерные функции рогового слоя кожи, так как растворяют липиды эпидермиса. Эффективный способ восстановления барьерных функций кожи - заместительная терапия. Чаще всего ее используют для предотвращения или лечения сухости и раздраженности кожи.

Одним из основных показателей функционального состояния кожи, широко используемых в косметологии, является ее упругость. Упругость - способность кожи восстанавливаться при снятии нагрузки. Различают продольную и поперечную упругость.

Продольная упругость зависит от целостности фибриллярных белков (особенно эластина), то есть от наличия сшивок между эластиновыми волокнами. Поперечная упругость зависит от содержания свободной жидкости в роговом слое кожи. Поперечная упругость так же является показателем увлажненности кожи. При избытке свободной жидкости в роговом слое происходит набухание корнеоцитов, увеличивается расстояние между клетками и уменьшается сила взаимодействия между ними, поэтому при локальном механическом воздействии силы увеличивается время, за которое происходит восстановление кожи.

Определение вязкоупругих свойств кожи проводилось методом вибрационной реоэластографии. Как принято, в качестве стандарта использовали церамид VI.

На основании полученных данных (Рис. 13) можно сделать вывод о том, что поперечная упругость кожи стабильно повышается. За счет того, что ГСфЛ имеют выраженную тенденцию к образованию межбислойных водородных связей они могут стабилизировать ламеллярные структуры эпидермиса, уменьшая тем самым трансэпидермальную потерю влаги.

На фоне повышения упругости кожи в такой же промежуток времени влажность практически не изменяется (

Рис. 14).

исходное сразу состояние после нанесения

время, ч

■контроль (чистая кожа)

"липосом ы на основе ГСфЛ (10% р-р)

церамид VI (10%)

Рис. 13. Влияние липидных композиций на показатель объемной упругости кожи; р<0.05

Повышение показателя влажности после нанесения липосом на основе ГСфЛ можно объяснить действием воды, содержащийся в липосомах.

X

К

а

ч а

80

70

30

исходное сразу 1 состояние после нанесения

время, ч

"контроль (чистая кожа)

"липосомы на основе ГСфЛ (10% р-р)

"церамид VI (10%)

Рис. 14. Влияние липидных композиций на показатель влажности кожи; р<0.05

Для подтверждения полученных результатов мы использовали метод, основанный на измерении величины куполообразного «вздутия» кожи - кутометрии, возникающего под влиянием локальной декомпрессии - отрицательного давления воздуха, создаваемого над ограниченным участком ее поверхности. Отверстие датчика, в которое под влиянием отрицательного давления втягивается кожа, соизмеримо с ее толщиной (2 мм). Чем меньше диаметр отверстия по отношению к толщине кожи, тем больший вклад в измеряемый показатель вносит упругость самого верхнего слоя кожи — эпидермиса. Чем в большей степени диаметр отверстия превышает толщину кожи, тем больший вклад в измеряемый показатель вносит толщина кожи как целого. Указанный метод реализован в серийной аппаратуре, прост в исполнении и обладает хорошей воспроизводимостью результатов, поэтому может рассматриваться в качестве «золотого стандарта». Результаты данного эксперимента подтвердили наши наблюдения о том, что упругость кожи возрастает на 33% при нанесении на кожу 10% эмульсии липосом на основе ГСфЛ.

Выводы

1. Разработана технология выделения ГСфЛ с высоким содержанием Ц (до 68%)и ЦС (до 30%), основанная на различной растворимости лнпидов мозга в спирте.

2. Показано, что гидратированные ГСфЛ обладают свойствами пролипосом.

3. Установлено, что липосомы на основе выделенной смеси ГСфЛ устойчивы к агрегации; добавление 3.5% ГСфЛ к липосомам из яичных фосфолипидов увеличивает их стабильность более чем в два раза.

4. Липосомы на основе выделенной смеси ГСфЛ практически не окисляются; добавление 3.5% ГСфЛ или 1% ЦС к липосомам на основе яичных фосфолипидов приводит к уменьшению скорости окисления липидов в 5-5.2 раза.

5. Липосомы из смеси ГСфЛ, содержащей до 60% ФЛ, в том числе плазмалогены, получаемые на стадии Э4, проявляют рН-чувствительность, увеличивают проницаемость бислоя при рН < 2.5.

6. Измерение ^-потенциала показало, что водные дисперсии ГСфЛ состоят из по крайней мере двух фракций с ^-потенциалом —40 и —94 мВ, что характеризует эти дисперсии как агрегационно устойчивые.

7. Присутствие двух фракций наночастиц (97 нм, 164 им) было так же продемонстрировано с помощью фотонной корреляционной спектроскопии.

8. При нагревании дисперсий ГСфЛ наблюдаются экзотермические переходы с максимумами переходов 54 и 60°С и эндотермический фазовый переход с максимумом 80°С соответствующий плавлению углеводородных цепей Ц, который не проявляется после повторного нагревания через 2 ч.

9. Косметические композиции на основе ГСфЛ увеличивают увлажненность и упругость кожи в большей степени, чем композиции с включением глицерофосфолипидов.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. В.В. Ветрова, А.П. Каплун, H.A. Михайлова, В.В. Красильникова, Э.И. Мухтаров, В.И. Швец. Выделение из мозга свиньи гликосфинголипидов для получения липосом. //Биотехнология. - 2005. -№2. - С. 33-38

2. В.В. Ветрова, А.П. Каплун, Э.И. Мухтаров, H.A. Михайлова. Способ получения цереброзид-цсреброзид сульфат содержащего липидного комплекса. Патент РФ RU 2274460 публ. 2006.

3. Э.И. Мухтаров, С.Э. Мухтарова, Д.И. Рощупкин, А.Б. Тимофеев, А.П. Каплун, H.A. Михайлова, В.В. Ветрова, Г.А. Тимофеев. Влияние сфинголипидов на механические свойства кожи и на проницаемость его липидного барьера для воды. Российский журнал кожно-венерических болезней. - 2005. -№5. - С. 32-35

4. Э.И. Мухтаров, А.Б. Тимофеев, С.Э. Мухтарова, H.A. Михайлова, A.II. Каплун, В.В. Ветрова, Г.А. Тимофеев, Г. Нахаева. Регуляция упругости кожи его водного баланса. //Сырье для парфюмерии и косметики. -2004. -№8 (47) - С. 28-32

5. А.Г. Марков, Я.М. Станишевский, И.А. Грицкова, А.П. Каплун, М.А. Мягкова, Н.И. Прокопов, В.Б. Скопинцев, В.В. Ветрова. Полимерные микросфсры, содержащие в поверхностном слое полярные липиды, для определения С-реактивного белка. //Материалы II Всероссийской научной конференции «Биомедицинские технологии» -2004.-№22.-С.42-51

6. В.В. Ветрова, А.П. Каплун, H.A. Михайлова, Э.И. Мухтаров Перспективы использования гликосфинголипидов в косметике. //Сборник тезисов V Международного форума «Биотехнология и Современность». - 2004. - С. 27-28

7. Э.И. Мухтаров, С.Э. Мухтарова, А.П. Каплун, H.A. Михайлова, В.В. Ветрова, Г.А. Тимофеев, Г.А. Тимофеев. Вибрационная реоэластография как экспресс-метод тестирования полезных свойств косметических препаратов. //Сборник тезисов IX Международной научно-практической конференции «Косметические средства и сырье: безопасность и эффективность». — 2004. — С. 49

Благодарности

• Руководству ЗАО НПО «Техкон» за предоставленную возможность выполнения работы.

• ООО «Биотех-М» за помощь внедрения ГСфЛ в производство.

Также выражаем благодарность: проф. д.х.н. В.Я. Гринбергу (ИНЭОС РАН им. Несмеянова), в.н.с., д.б.н. ВЛ. Попенко (ИМБ РАН им. Энгельгардта) проф. д.х.н. И.А. Грицковой (МИТХТ им. М.В. Ломоносова), A.B. Тимофееву ЗАО НПО «Техкон».

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 19.07.06 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5 Печать авторефератов (495) 730-47-74, 778-45-60

Содержание диссертации, кандидата химических наук, Ветрова, Виктория Викторовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ГЛИКОСФИНГОЛИПИДЫ И ИХ СВОЙСТВА.

1.1. Гликолипиды.

1.2. Сфинголипиды.

1.3. Цереброзиды.

1.4. Свойства.

1.4.1. Участие в межклеточных взаимодействиях.

1.4.2. Проведение сигналов, индуцируемых Фактором Некроза Опухоли.

1.4.3. Антигенная активность.

1.4.4. Образование рафтов.

1.4.5. Ингибирование активации комплемента.

1.4.6. Полиморфное поведение.

1.5. Болезни накопления.

1.6. Некоторые способы выделения ГСфЛ.

1.6.1. Общие методы.

1.6.2. Частные методы.

1.7. Перспективы использования гликосфинголипидов в косметике.

2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1. Разработка процесса выделения ГСфЛ из головного мозга свиньи.

2.1.1. Разработка выделения ГСфЛ из головного мозга свиньи.

2.1.2. Промышленное внедрение технологии выделения ГСфЛ.

2.2. Изучение выделенных липидов.

2.2.1. Агрегационная устойчивость.

2.2.2. Устойчивость к окислению.

2.2.3. {-Потенциал.

2.2.4. Размер и морфология частиц дисперсий.

2.2.5. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).

2.2.6. рН-Зависимая проницаемость бислоя липосом.

2.2.7. Определение С-реактивного белка.

2.2.8. Влияние ГСфЛ на свойства эпидермиса (увлажненность, упругость, проницаемость липидного барьера для воды).

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Материалы и методы.

3.2. Липидный состав.

3.3. Выделение сфинголипидов.

3.4. Получение пролипосом (полунанотрубок).

3.5. Определение концентрации малонового альдегида.

3.6. е-Потенциал.

3.7. Размер и морфология частиц дисперсий.

3.7.7. Фотон-корреляционная спектроскопия.

3.7.2. Электронная микроскопия.

3.8. рН-Зависимая проницаемость бислоя липосом.

3.9. Дифференциальная сканирующая калориметрия.

3.10. Определение С-реактивного белка.

3.11. Влияние ГСфЛ на свойства эпидермиса (увлажненность и упругость, проницаемость липидного барьера для воды).

4. ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение гликосфинголипидов головного мозга свиньи и изучение их свойств"

Полярные липиды применяются в медицине и косметологии, в основном для получения липосомных препаратов. Репертуар используемых полярных липидов довольно узок: основу составляют фосфатидилхолин, холестерин, для придания особых свойств в состав липосом включают отрицательно заряженные природные фосфолипиды (фосфатидилсерин, фосфатидная кислота, фосфатидилглицерин, дифосфатидилглицерин); гидрированные природные фосфолипиды, реже синтетические липиды. С этой точки зрения перспективно изучение возможности использования в липосомных препаратах ГСфЛ, к которым относятся Ц, ЦС. Особый интерес в этом классе соединений представляет ЦС. Присутствие отрицательного заряда в молекуле ЦС, длинных насыщенных углеводородных цепей делает этот полярный липид очень полезным компонентом липосом для транспорта лекарственных веществ, так как отрицательный заряд и высокая температура фазового перехода должны увеличивать агрегационную устойчивость и уменьшать перекисное окисление липидов. Кроме того, литературный анализ показал, что Ц и ЦС также обладают уникальными физико-химическими и биологическими свойствами.

Недавние исследования показывают, что сфинголипиды участвуют в регуляции транскрипции, дифференцировке клеток, стрессовом ответе, и регуляции апоптоза, а также принимают участие в межклеточной сигнализации. Благодаря физико-химическим особенностям сфинголипиды биологических мембран взаимодействуют друг с другом, с другими компонентами мембран, образуя домены (rafts), которые принимают участие в регулировании мембранных процессов: эндо- и экзоцитоза, в функционировании мембранных рецепторов и ферментов. Все перечисленное говорит об актуальности разработки простых методов выделения ГСфЛ.

Ц и ЦС присутствуют в мембранах лейкоцитов, эритроцитов, в эпителиальных клетках почек и кишечника, оболочке глаза, но основное количество этих ГСфЛ содержится в головном и спинном мозге. Во взрослом мозге ЦС составляют 3-8% от общей сухой массы всех липидов. Поэтому именно мозг животных может рассматриваться как главный источник ГСфЛ.

Основными задачами исследования были:

Разработать технологичный метод выделения гликосфинголипидов (Ц, ЦС) из мозга свиньи;

Отработать способы получения стабильных липосом на основе выделяемых ГСфЛ;

Для водных дисперсий ГСфЛ исследовать физико-химические свойства, определяющие их возможное использование в косметике и медицине;

Изучить возможность их использования как рН-чувствительных липосом;

Изучить воздействие липосомных дисперсий с ГСфЛ на кожу.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ветрова, Виктория Викторовна

4. ВЫВОДЫ

1. Разработана технология выделения ГСфЛ с высоким содержанием Ц (до 68%)и ЦС (до 30%), основанная на различной растворимости липидов мозга в спирте.

2. Показано, что гидратированные ГСфЛ обладают свойствами пролипосом.

3. Установлено, что липосомы на основе выделенной смеси ГСфЛ устойчивы к агрегации; добавление 3.5% ГСфЛ к липосомам из яичных фосфолипидов увеличивает их стабильность более чем в два раза.

4. Липосомы на основе выделенной смеси ГСфЛ практически не окисляются; добавление 3.5% ГСфЛ или 1% ЦС к липосомам на основе яичных фосфолипидов приводит к уменьшению скорости окисления липидов в 5-5.2 раза.

5. Липосомы из смеси ГСфЛ, содержащей до 60% ФЛ, в том числе плазмалогены, получаемые иа стадии Э4, проявляют рН-чувствительность, увеличивают проницаемость бислоя при рН < 2.5.

6. Измерение ^-потенциала показало, что водные дисперсии ГСфЛ состоят из по крайней мере двух фракций с ^-потенциалом -40 и -94 мВ, что характеризует эти дисперсии как агрегационно устойчивые.

7. Присутствие двух фракций наночастиц (97 нм, 164 нм) было так же продемонстрировано с помощью фотонной корреляционной спектроскопии.

8. При нагревании дисперсий ГСфЛ наблюдаются экзотермические переходы с максимумами переходов 54 и 60°С и эндотермический фазовый переход с максимумом 80°С соответствующий плавлению углеводородных цепей Ц, который не проявляется после повторного нагревания через 2 ч.

9. Косметические композиции на основе ГСфЛ увеличивают увлажненность и упругость кожи в большей степени, чем композиции с включением глицерофосфолипидов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата химических наук, Ветрова, Виктория Викторовна, Москва

1. Liebrech 0. Investigations of the brain // Ann. Chem. Pharm. 1865. V. 29. P. 134.

2. Thudichum J.L.W. Historical review of chemical investigations of the brain // Reports of the Medical Officer of Privy Council and Local Government Board. N. Ser. 1874. No. III. P. 133.

3. Thudichum J.L.W. Historical review of chemical investigations of the brain // Reports of the Medical Officer of Privy Council and Local Government Board. N. Ser. 1876. No. VIII. P. 177.

4. Thudichum J.L.W. Treatise on the Chemical Constitutional of the Brain. London. Bailliere, Tindall and Cox: 1884.

5. Klenk E.Z. Uber die zuckerhaltigen Lipoide der Formbestandteile des menschlichen Blutes // Physiol. Chem. 1935. V. 235. P. 24.

6. Aghion H. La maladie de Gaucher dans Tenfance: thesis / Faculte de medicine de Paris. Paris. 1934.

7. Carter H.E., Rothfus J.A., Gigg R. Biochemistry of the sphingolipids: XII. Conversion of cerebrosides to ceramides and sphingosine; structure of Gaucher cerebroside // J. Lipid Res. 1961. V. 2. P. 228.

8. Samuelson B., Samuelson K. Studies the origin of biliary phospholipids // J. Lipid Res. 1969. V. 10. P. 41-47.

9. Blix G.Z. The chemistry of the phospholipids // Phisiol. Chem. 1933. V. 219. P. 82.

10. Slomiany B. L., Horowitz M.I. Isolation and Characterization of a Sulfated Glyceroglucolipidfrom Alveolar Lavage of Rabbit //J. Biol. Chem. 1973. V. 248. P. 6232.

11. Slomiany B. L., Slomiany A., Horowitz M.I. Structural Study of the Blood Group A Active Glycolipids of Hog Gastric Mucosa // Biochim. Biophys. 1973. Acta. 326. P. 224.

12. Yamakawa T., Suzuki S. The chemistry of the lipids of posthemolytic residue or stroma of erythrocytes. I. Concerning the ether-insoluble lipids of lyophilized horse blood stroma // J. Biochem. Tokyo, 1951. № 38. P. 199.

13. Thierfelder H., Klenk E. Die Chemie der Cerebroside und Phosphatide. Berlin: Julius Springer. 1930.

14. Yamakawa T. In: Lipoide //16 Colloquium Mosbach/Baden. Berlin, 1966. P. 87-111.

15. Carter H.E., Greenwood F.L. Review the chemistry of the phosphatides // J. Biol. Chem. 1952. V. 199. P. 283-288.

16. Klenk E.Z. Detection of inositol in the phospholipid fraction of soybean lipids // Physiol. Chem. 1940. V. 267. P. 128.

17. Carter H.E., Johnson P., Weber E.J. Glycolipids // Ann. Rev. Biochem. 1965. V. 34. P. 109142.

18. Евстегнеева Р.П., Звонкова E.H., Серебренникова Г.А., Швец В.И. Химия липидов. М.: Химия. 1983. С. 12-13.

19. Curatolo W. Glycolipid Function // Biochim. Biopis. Acta. 1987. № 906. P. 137-160.

20. Michalec C. Biochemistry of sphingolipids. Praha:1967. Academia nakladatelstvi ceskoslovenske akademie ved.

21. Жукова И.Г., Смирнова Г.П. Гликолипиды // Успехи биологической химии. Москва. 1968. т. 9.

22. Хорст А. Молекулярная патология, пер. с польск. М.: 1967.

23. Ansel G.B., Hawthorhe N., Dawson R.M.G. Form and Functional Pospholipids // Elsevior Sci. Publ. Сотр. 1973. V. 3. P. 441-482.

24. Дембицкий B.M. Липиды морского происхождения. Необычный липид из губки Halichondria panicea // Биохимия. 1982. Т. 47. В. 2. С. 272-275.

25. Лененджер А. Биохимия. М.: «Мир». 1974. Т. 1. С 238-354.

26. Кнорре Д.Г., Мызина С.Д. Биологическая химия. М.: Высшая школа. 2000.

27. Spiegel S., Fishman Р.Н. Gangliosides as Bimodal Regulators of Cell Growth // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 141-145.

28. Laitinen J., Lopponen R., Merenmies J., Rauvala H. Binding of Laminin to Brain Gangliosides and Ingibition of Laminin-Neuron Interaction by the Gangliosids // FEBS Lrt. 1987. V. 217. P. 94-100.

29. Hakomori S., Jeanloz R. W. Isolation and characterization of glycolipids from erythrocytes of human blood A (plus), and В (plus) // J. Biol. Chem. 1961. V. 236. P. 2827.

30. Klenk E. The lipides // Angew. Chem. 1960. V. 72. P. 482.

31. Koscielak J. Blood group a specific glycolipids from human erythrocytes // Biochim. Biophys. 1963. Acta 78. P. 313.

32. Parirmeister В., Mallette M. F. Validity of the concept of energy of maintenance // Arch. Biochem. Biophis. 1955. V. 57. P. 94.

33. Yamakawa T., Suzuki S. Glycolipid of horse erythrocytes // J. Biochem. 1952. V. 39. P. 393.

34. Yamakawa T., Kiso N., Handa S., Makita A., Yokoyama S. Structure of Main Globoside of Human Erythrocytes // J. Biochem. 1962. V. 51. P. 226.

35. Cardas A. A Structural Study on a Macroglycolipid Containing 22 Sugars Isolated from Human Erythrocytes // Eur. J. Bioch. 1976. № 68. P. 177-183.

36. Dejter-Juszynski M., Harpaz N., Flowers H.M., Shron N. Blood-Group ABH-Specific Macrogiycolipids of Human Erythrocytes: Isolations in High Yield from a Crude Membrane Glycoprotein Fraction// Eur. J Bioch. 1978. № 83. P. 363-378.

37. Hakomori S. Glycosphingolipids as Differentiation-Dependent, Tumor-Associated Markers and as Regulators of Cell Proliferation // TIBS 1984. № 9. P. 453-458.

38. Рожнова У.А., Гуляева H.B., Степаничев М.Ю., Алесенко А.В. Роль сфинголипидов в передаче сигнала ФНО в различных отделах мозга. Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва.

39. Алейникова Т.Л., Авдеева Л.В., Андрианова Л.Е. и др. Биохимия / под ред. Е.С. Северина. Москва: ГЕОТАР-МЕД. 2003. С. 310-329.

40. Dorothee К., Kopitz J., Cantz M. The plasma membrane ganglioside sialidase cofractionates with markers of lipid rafts. //Biochem. and Biophys. Res. Commun. 2001. V. 283, № 4, P. 989993.

41. Taieb N„ Yahi N., Fantini J. Rafts and related glycosphingolipid-enriched microdomains in the intestinal epithelium: bacterial targets linked to nutrient absorption. // Advanced Drug Delivery Reviews. 2004. V. 56. P. 779-794.

42. Н.Н.Иванова, И.А. Василенко, А.П. Каплун, Г.А.Сенников, В.Л. Боровягин, В.И.Швец. Изучение действия водных дисперсий фосфолипидов на иммунный и неспецифический гемолиз. Биологич.мембр.-1985 T.2.-N4.-C.341-348.

43. А.П.Каплун, О.О.Бурделев, Н.Н.Иванова, Ю.М.Красиопольский, В.И.Швец. Ингибирование комплементзависимого гемолиза липосомами, содержащими цереброзидсульфат. Биоорган, химия. 2000 Т. 26. С. 123-139.

44. Svennerholm L., Bostrum К., Fredman P., Jungbjer В., MBnsson J.E., Rynmark В. M. // Biochim. Biophys. Acta. 1992. V. 1128. P. 1-7.

45. Lee A.G. Lipid phase transitions and phase diagrams. Mixtures involving lipids // BBA. 1977. vol. 472. № 3/4. P. 285-344.

46. Paul Carlson, Alex Goldstein, Kyujin Lee, Anatoly Lukyanov Self-Assembled Prodrug Tubules for Continuous Release /http://faculty.washington.edU/yagerp/whitakerannualreport.2.html.

47. Bakatselou, V., Oppenheim R.C., Dressman J.B. Solubilization and wetting effects of bile salts on the dissolution of steroids // Pharm. Res. 1991. № 8(12). P. 1461-1469.

48. Naylor L.J., Bakatselou V., Dressman J. Comparison of the mechanism of dissolution of hydrocortisone in simple and mixed micelle systems // Pharm. Res. 1993. № 10(6). P. 865-870.

49. Bou Khalil M., Carrier D., Wong P.T., Tanphaichitr N. Polymorphic phases of galactocerebrosides: spectroscopic evidence of lamellar crystalline structures // Biochim. Biophys. 2001. № 1512(2). P. 158-170.

50. Bou Khalil M, Carrier D, Wong PT, Tanphaichitr N. Polymorphic phases of galactocerebrosides: spectroscopic evidence of lamellar crystalline structures. //Biochim Biophys Acta. 2001 V. 6. P. 158-170.

51. Kulkarni VS, Brown RE. Thermotropic behavior of galactosylceramides with cis-monoenoic fatty acyl chains. //Biochim Biophys Acta. 1998 V. 17. P. 347-58.

52. Adarraga C., Fernandez De La Puebla R., Jimenez Pereperez J.A. et al. // Rev. Clin. Esp. 2002. Vol. 202. № 12. P. 635-637.

53. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В., Молотковский Ю.Г. и др. Препаративная биохимия липидов. М.: Наука. 1981. С. 159-175.

54. Степанов А.Е., Краснопольский Ю.М., Швец В.И. Физиологически активные липиды. М.: Наука. 1991. С. 100-135.

55. O'Reilly Joseph Extract from the leaves of ginkgo biloba. 2001. Патент ЕР 0731708.

56. Стекольников Л.И., Рыльцев В.В. Способ получения нервона. 1996. Патент RU 94012010.

57. Ефременко В.И., Оверченко В.В., Мисетова Е.Н., Савельева И.В., Таран Т.В., Кузякова Л.М., Ефременко Д.В. Способ получения комплекса фосфолипидов. 2002. Патент RU 2192265.

58. Saint Leger D., Francois A.M., Leveque J.L., Stoudenmayer T.J., Grove G.L., Kligman A.M. Age associated changes in stratum corneum lipids and their relationship to dryness // Dermatológica. 1988. № 144. P. 159-164.

59. Эрнандес Е.И., Марголина A.A., Петрухина A.O. Липидный барьер кожи и косметические средства. М.: «Фирма Клавель». 2003. С. 200-254.

60. Wertz P.W. et al. The composition of the ceramides from human stratum corneum and from comedones // J. Dispersion Science and Technology 1985. № 84. P. 410-412.

61. Imokava G. et al. Effects of endothelins on signal transduction and proliferation in human melanocytes // J. Soc. Cosmet. Chem. 1989. № 40. P. 273-285.

62. Elias P.M. Epidermal lipids, barrier function and desquamation // J. Invest. Dermatol. 1983. № 80. P. 44-49.

63. Loden M. Biophysical properties of dry atrophic and normal skin with special reference to effects of skin care products // Derm. Venerol. Supp. 1995. № 192. P. 1-48.

64. Scherer N.Y., Plewig G., Elias P.M. Stratum corneum lipid function // Dermatológica 1991. №183. P. 77-94.

65. Bouwstra J.A., Gooris G.S., Van der Spek J.A., Lavrijsen S., Bras W. The lipid and protein structure of mouse stratum corneum: a wide and small angle diffraction study // Biochim. Biophys. 1994. Acta 1212. P. 183-192.

66. Downing D.T. Lipid raft protein structures in the permeability barrier of mammalian epidermis // Journal of Lipid Research 1992. № 33. P. 301-313.

67. Elias P.M., Friend D.S. The permeability barrier in mammatian epidermis // The Jornal of Cell Biology 1975. № 65. P. 180-191.

68. Baker P.J., Lint T.F., McLeod B.C., Behrends C.L., Gewurz H. Modulation of C56-induced lysis polyanions and polycations // J. Immunol. 1975. № 114. P. 554-558.

69. Wertz P.M., Downing D.T. Glycolipids in mammalian epidermis: structure and function in the water barrier // Science 1982. № 217. P. 1261-1262.

70. Wiechers J.W. Skin Delivery of Cosmetics: More then Skin Deep and More then a Cosmetic Issue. // CHI Proceedinges. Prague. 2001.

71. Тюкавкина H.A., Бауков Ю.И. Биоорганическая химия. М.: Медицина. 1991. С. 457-462.

72. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М.: Медицина. 1990. С. 276-286.

73. Васьковский В. Е. Липиды // Соросовский образовательный журнал. 1997. № 3. С. 3233.

74. Костецкий Э.Я., Недашковская Е.П., Зилберс Ю.А. Способ выделения сфингомиелина из сырья животного происхождения. 1985. Патент SU 1133275.

75. Hung М., Gibbs С., Tsiang М. Biochemical characterization of rhinovirus RNA-dependent RNA polymerase // Antiviral. Res. 2002. № 56. P. 99.

76. Mueller P., Chien T.F., Rudy B. Formation and Properties of Cell-Size Lipid Bilayer Vesicles // Biophys. J. 1983. № 44. P. 375-381.

77. Huang C.-H. Studies on Phosphatidylcholine Vesicles. Formation and Physical Characteristics // Biochemistry. 1969. № 8. P. 344-351.

78. Levine Y.K., Wilrins M. H. F. Strucrure of oriented lipid bilayers // Nature. New Biol. 1971. Vol. 230. №11. P. 69-72.

79. Green J.P., Phillips M.C., Shipley G.G. Structure investigation of lipid, polypeptide, and protein multilayers // BBA. 1973. Vol. 330. P. 243-253.

80. Batzri S., Korn E.D. Single bilayer liposomes prepared with-out sonication // BBA. 1973. Vol.298. P. 1015-1019.

81. Kremer J.M., Esrer M. W., Pathmamanoharan C., Wiersema P.H. Vesicles of variable diameter prepared by a modified injection method // Biochemistry. 1977. Vol. 16. № 17. P. 3932-3935.

82. Фармацевтическая технология: Учеб. пособие / Под ред. В.И. Погорелова. Ростов н/Д: Феникс. 2002. С. 304-444.

83. Hauser Н., Phillips М. С. Structures of aqueonus dispersions of phoshpatidylserin // J. Biol. Chem. 1973. Vol. 248. № 24. P. 8585-8591.

84. Wertz P.W., Abraham W., Landmann L., Doweng D.T.R. Preparation of liposomes from stratum corneum lipids // J. Invest Dermatil. 1986. № 87. P. 582-584.

85. Эмульсии: пер. с англ. / по ред. Шермана Ф., Амбрамзона A.A. JI.: Химия. 1972. С. 211-322.

86. Schurtenberger P., Hauser Н. Characterization of the Size Distribution of Unilamellar Vesicles by Gel Filtration, Quasielastic Light Scattering and Electron Microscopy // Biochim. Biophis. 1984, Acta. 778. P. 470-480.

87. Luner, P.E., Babu S.R., Radebaugh G.W. The effects of bile salts and lipids on the physicochemical behavior of gemfibrozil // Pharmaceutical Research. 1994. № 11(12). P. 17551760.

88. Farooqui Akhlaq A., Horrocks Lloyd A. On the role of sulfolipids in mammalian metabolism // Molecular and Cellular Biochemistry. 1985. Vol. 66. № 1. P. 87-95.

89. Naylor L.J., Bakatselou V., Dressman J. Comparison of the mechanism of dissolution of hydrocortisone in simple and mixed micelle systems // Pharm. Res. 1993. № 10(6). P. 865-870.

90. Haly A.R., Snaith J.W. Specific net and multiphase states of lecitin-water systems // Chem. and Phys. Lipids. 1976. Vol. 17. № 1. P. 57-70.

91. Drummond D. C., Zignani M., Leroux J. C. // Progress Lip. Res. 2000. V. 39. P. 409-460.

92. Станишевский Я.М., Григорьевская И.И., Лобанов A.H., Кравцов Е.Г., Грицкова И.А. Тесты для экспресс-диагностики на основе латекс-агглютинации // Материалы 1-ой

93. Всероссийской научной конференции "Биомедицинские технологии". Москва: 2003. Вып. 20. С. 72-80.

94. Грицкова И.А., Прокопов Н.И., Черкасов В.Р., Ишков А.А., Яшина Н.В., Кравцов Э.Г., Ефремова Н.Б., Гжива Э., Быков В.А. Синтез полимерных суспензий для иммунохимических исследований. // Биомедицинские технологии: Докл. конф. Москва. 1994. Вып. 1.С. 62.

95. Bang L.B. Uniform latex particles. Indianapolis: Seradyn Inc. 1984. P 10-68.

96. Нечушкин А.И., Попова А.С., Подкопаев М.И. и др. Дискретные уровни функциональной активности точек акупунктуры в норме и патологии // Всесоюзная конференция по рефлексотерапии. Ленинград. 1984. С. 11-144.

97. Фролов К.В., Гончаревич И.Ф., Лихпов П.П. Инфразвук, вибрация, человек. М.: «Машиностроение». 1996.

98. Тимофеев А.Б., Больших А.С., Клочко В.А., Семенов В.Б. Устройство для вибрационного воздействия на ткани организма. 1984. А.с. СССР №1216703.

99. Фролов К.В., Гончаревич И.Ф., Лихнов П.П. Инфразвук, вибрация, человек. М.: «Машиностроение». 1996.

100. Gopinathan К. Menon. New insights into skin structure: scratching the surface // Advanced Drug Delivery Reviews. 2002. Vol. 54. Suppl. № 1. P. 3-17.

101. Timofeev G.A. The Method of Express Measurement of "Quick" Skin Mechanical Response on the Effects of Cosmetic and Raw Materials Modifying Skin Water Balance // International Conference "Skin and Environment". 2005. Moscow-St.Peterburg. P. 53.

102. Varvarova К., Hrabalek A., Dolezal P., Holas Т., Zbytovska J., L-serine and Glycine Based Ceramide Analogues as Transdermal Permeation Enhancers: Polar Head and Hydrogen bonding //Bioorganic and Medicinal chemistry Letters 2003. № 13. P. 2351-2353.

103. Биологические мембраны. Методы / под ред. Финдлея Дж., Эванса У. М.: Мир. 1990.

104. Кейтс М. Техника Липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов: Перевод с англ. / д.х.н. В.А. Вавер. М.: Мир. 1975.

105. Bradford М.М. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding // Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

106. Ланкин B.3., Гурьевич C.M., Бурлакова Е.Б. В сб. Биоантиокислители. Труды МОИП. М.: Наука. 1975. Т. 52. С 388.

107. Практикум по технологии косметических средств. Коллоидная химия поверхностно-активных веществ и полимеров / Под ред. Кима В. И., Гродского А.С. М.: Топ-Книга. 2003.

108. Foster D. Hydrodynamic fluctuations, broken symmetry, correlations functions. N.Y.: Benjamin. 1975. P. 200-310.

109. Light Scattering and Photon Correlation Spectroscopy / Eds.: Pike R., Abbiss J.B. N.Y.: Kluwer Academic Publishers. 1997.

110. Yamaguchi S. Watanabe S., Narahama. Emulsion polymerization of styrene using phospholipid as emulsifer. Immobilization of phospholipids on the latex surface // Macromol. Chem. 1989. № 196, P. 1195-1205.