Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Состояние обмена мембранных липидов в клетках соединительной ткани при системной склеродермии

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Комлева, Алла Валентиновна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. Фибробласты и их участие в процессах фиброзообразования.

1.1. Нарушение продукции компонентов внеклеточного матрикса.

1.2. Факторы, влияющие на функции фибробластов.

1.3. Нарушения свойств мембран фибробластов при склеродермии.

Глава 2. Состав мембранных липидов фибробластов человека.

2.1. Фосфолипиды культивируемых фибробластов человека.

2.2. Гликосфинголипидный состав фибробластов.

Глава 3. Метаболизм гликосфинголипидов з.клетке.

3.1. Ферменты биосинтеза.Г.

3.2. Нарушения состава и биосинтеза гликосфинголипидов.

3.3. Регуляция биосинтеза.

3.4. Деградация гликосфинголипидов в клетке.

Глава 4. Биологические функции гликосфинголипидов.

4.1. Связывание экзогенных ганглиозидов с клетками.

4.2. Регуляция клеточного роста гликосфинголипидами.

4.3. Взаимодействие с фибронектином и участие в процессах клеточной адгезии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Состояние обмена мембранных липидов в клетках соединительной ткани при системной склеродермии"

Системная склеродермия (ССД) - заболевание соединительной ткани, сопровождаемое генерализованным фиброзом. Выделяют три основных направления развития патологического процесса: 1) повреждение эндотелия сосудов; 2) иммунологические сдвиги; 3) нарушения продукции компонентов внеклеточного матрикса клетками соединительной ткани. При изучении патогенеза ССД на клеточном уровне было установлено вовлечение в патологический процесс таких клеток, как фибробласты, эндотелиальные клетки, тромбоциты, лимфоциты, моноциты и тучные клетки [75].

Широко используемой моделью для исследования механизмов развития фиброза являются монослойные культуры фибробластов, полученные из биоптатов кожи больных системной склеродермией. Главной особенностью такой модели является то, что показатели обмена и функциональные особенности клеток могут быть изучены в отсутствие влияния на них других категорий клеток и/или нейрогуморальных факторов регуляции.

К настоящему времени установлено, что фибробласты кожи больных ССД в культуре продуцируют больше коллагена, гликозаминогликанов (комплексных полисахаридов протеогликанов) и фибронектина, чем фибробласты кожи здоровых людей [28, 48, 49, 73, 119]. Повышенный синтез компонентов внеклеточного матрикса сохраняется in vitro в течение ряда клеточных генераций [4, 66, 119]. При этом у склеродермических фибробластов in vitro значительно снижена чувствительность к внешним факторам регуляции клеточного роста и биосинтеза, и, в отличие от клеток здоровых людей, они осуществляют аутокринную ростовую и секреторную стимуляцию [74, 39, 113]. Изменены также адгезионные свойства этих клеток [78]. По мнению LeRoy, возможными причинами для этого могут быть дефекты во взаимодействии клетка-матрикс, нарушения мембранно-ядерного транспорта, рецепторных систем клетки [76].

Исследования культивируемых фибробластов кожи больных ССД, проведенные в лаборатории патофизиологии соединительной ткани Института ревматологии РАМН показали, что для данных клеток характерно повышение транспорта ионов кальция через клеточную мембрану и аномальное функционирование аденилатциклазной системы [54]. Эти наблюдения могут свидетельствовать о нарушениях свойств мембран склеродермических фибробластов и позволяют предположить изменение состава основных мембранных липидов и компонентов гликокаликса при ССД.

Липидный состав фибробластов кожи больных системной склеродермией или другими заболеваниями соединительной ткани ранее не изучался. Вместе с тем в настоящее время получено большое число доказательств того, что липидный состав в значительной мере определяет функционирование рецепторных и транспортных систем клетки, адгезионные и антигенные свойства клеточной поверхности. Все сказанное свидетельствует о важности изучения состава и структуры липидов клеток больных ССД, а также установления роли этих мембранных компонентов в развитии фиброза при данном заболевании.

Цель работы: установить взаимосвязь между состоянием мембранных липидов в клетках соединительной ткани и структурно-функциональными нарушениями мембран этих клеток при системной склеродермии.

Задачи:

1) Определить состав и содержание фосфолипидов, холестерина, гликосфинголипидов в фибробластах кожи больных системной склеродермией. 2) Исследовать активность ферментов метаболизма гликосфинголипидов: а-2,3:лактозилцерамид-сиалилтраясферазы и ОМЗнейраминидазы в фибробластах кожи больных склеродермией. 3) Изучить влияние экзогенных ганглиозидов на пролиферацию склеродермических фибробластов, стимулированных факторами роста, а также на секрецию этими клетками таких компонентов внеклеточного матрикса, как сульфатированные гликозаминогликаны. 4) Оценить содержание ганглиозидов в лейкоцитах периферической крови и сыворотке крови больных системной склеродермией. Научная новизна.

Установлен ранее неизвестный фосфо- и гликолипидный состав фибробластов кожи больных ССД. Показано увеличение количества фоефолипидов и холестерина и резкое снижение содержания ганглиозидов в этих клетках по сравнению с фибробластами кожи здоровых людей. Установлено, что такое изменение состава ганглиозидов обусловлено снижением активности лактозилцерамид-сиалилтрансферазы и увеличением активности лизосомальной нейраминидазы в клетках больных ССД.

Показано, что снижение общего содержания ганглиозидов при ССД носит системный характер, о чем свидетельствуют данные об уменьшении количества ганглиозидов в лейкоцитах периферической крови и сыворотке крови больных ССД по сравнению с клетками и сывороткой крови доноров.

Выявлено, что фибробласты больных ССД менее чувствительны к модулирующему воздействию экзогенных ганглиозидов на рост этих клеток в присутствии факторов роста, чем фибробласты доноров. Показано, что экзогенные ганглиозиды стимулируют секрецию сульфатированных гликозаминогликанов фибробластами и таким образом непосредственно влияют на формирование внеклеточного матрикса.

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные в работе данные расширяют существующие представления о молекулярно-клеточных механизмах фиброзообразования при ССД.

Обнаруженные изменения состава и метаболизма основных мембранных липидов в клетках больных ССД могут определять структурно-функциональные перестройки клеток при данном заболевании. Полученные данные способствуют поиску путей коррекции нарушений гликолипидного состава и метаболизма в клетках соединительной ткани больных ССД и используются в практической работе группы патофизиологии соединительной ткани Института ревматологии РАМН при планировании и проведении исследований процессов фиброзообразования и их регуляции. Положения, выносимые на защиту: 1) Липидный состав и активность ферментов метаболизма липидов в клетках соединительной ткани больных системной склеродермией изменены по сравнению с клетками доноров. 2) Изменения в составе гликосфинголипидов могут определять снижение чувствительности клеток к воздействию факторов роста и влиять на синтез компонентов матрикса в процессе фиброзообразования. Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях. Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из литературного обзора, экспериментальной части и списка литературы. Литературный обзор содержит сведения о составе, метаболизме и биологических функциях мембранных липидов фиброблас-тов. Отдельный раздел обзора посвящен структурно-функциональным нарушениям фибробластов при ССД. Экспериментальная часть включает в себя методическую часть, результаты и их обсуждение. Основные экспериментальные данные сформулированы в выводах. Список литературы включает 136 наименований, цитируемых в алфавитном порядке.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Основным клиническим проявлением системной склеродермии является фиброз кожи и внутренних органов. Установлено, что основной причиной развития фиброза является гиперпродукция коллагена и других белков матрикса активированными фибробластами, обусловленная нарушениями структуры и функций этих клеток. При этом сигналы, ответственные за такую активацию и механизмы нарушений остаются недостаточно изученными.

1. Фибробласты и их участие в процессах фиброзообразования.

Фибробласты образуются из клеток мезенхимального происхождения. Их основная биохимическая специализация - синтез коллагенов и других белков внеклеточного матрикса. Эти клетки принимают непосредственное участие во всех сложных процессах формирования, ремоделирования и деградации матрикса, гибко определяя тем самым структуру соединительной ткани [113].

Фибробласты тесно взаимодействуют с другими типами клеток и окружающим матриксом. Молекулы межклеточного матрикса участвуют в проведении сигнала клетками в качестве самостоятельных регуляторов, а также в качестве лигандно-связывающих участков для других регуляторных факторов. Эти сигналы, в свою очередь, определяют ряд биологических функций фибробластов, таких как миграция, пролиферация, дифферен-цировка и биосинтез [125]. В процессе фиброзообразования нарушается синтез компонентов матрикса фибробластами, а также изменяются механизмы взаимодействия фибробластов с окружающим матриксом и цитокинами из очага воспаления, которые регулируют этот синтез [113].

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Комлева, Алла Валентиновна

ВЫВОДЫ

1. Содержание фосфолипидов и холестерина в фибробластах кожи больных системной склеродермией увеличено на 70% по сравнению с клетками кожи здоровых лиц. Установлено двукратное снижение содержания ганглиозидов GM3 и GM1, а также отсутствие дисиалоганглиозидов в склеродермических фибробластах. Общее содержание ганглиозидов снижено также в лейкоцитах периферической крови больных системной склеродермией по сравнению с донорами.

2. Показано изменение активности ферментов метаболизма ганглиозидов в фибробластах кожи больных системной склеродермией. Установлено снижение а-2,3:лактозилцерамид-сиалилтрансферазной активности и повышение активности лизосомальной GM3 -нейраминидазы в этих клетках по сравнению с фибробластами доноров.

3. Ганглиозиды GM3, GM1, GDI а подавляют митогенный эффект тромбоцитарного и трансформирующего факторов роста в культурах фибробластов как больных системной склеродермией, так и здоровых лиц; при этом ответ склеродермических фибробластов на модулирующее действие ганглиозидов по сравнению с клетками доноров был ниже.

4. Показан стимулирующий эффект ганглиозидов GDI а и GTlb на продукцию сульфатированных гликозаминогликанов фибробластами кожи как больных системной склеродермией, так и здоровых лиц.

5. Установленные изменения состава и обмена липидов в клетках больных системной склеродермией свидетельствуют о нарушении структуры клеточной мембраны. Эти изменения могут быть причиной снижения чувствительности клеток к внешним факторам регуляции роста и биосинтеза, что имеет ключевое значение для понимания механизмов фиброзообразования при системной склеродермии.

Заключение.

Системная склеродермия характеризуется устойчивым повышением функциональной активности фибробластов, проявляющимся через гиперпродукцию коллагеновых белков, фибронектина и протеогликанов. При этом фибробласты ССД in vitro менее чувствительны к внешним факторам регуляции и проявляют аутокринную ростовую и секреторную стимуляцию. Кроме того, у этих клеток изменены адгезионные свойства, нарушено функционирование аденилат-циклазной системы, увеличен

35 транспорт ионов кальция в клетку. Эти данные свидетельствуют о нарушении свойств мембран ССД фибробластов и позволяют предположить, что состав мембранных липидов этих клеток может быть изменен.

Сообщения о составе и обмене липидов в фибробластах больных системной склеродермией или другими заболеваниями соединительной ткани в литературе отсутствуют. Вместе с тем большое количество работ свидетельствует об изменении состава липидов и их метаболизма при различных патологических состояниях. Изучение биологических функций гликолипидов в клетке показало, что эти соединения модулируют пролиферацию, участвуют в рецепции факторов роста и других регуляторных молекул, опосредуют клеточную адгезию. Все эти данные позволяют предположить вовлечение гликолипидов в механизмы функциональных изменений фибробластов при ССД.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Материалы.

1.1. Клеточные культуры

Исследование проводили на монослойных культурах фибробластов, полученных из биоптатов кожи здоровых доноров (13 человек) и больных ССД (10 человек). Диагноз заболевания был установлен в соответствии с критериями American College Rheumatology (ранее известной как ARA) для ССД [115]. Продолжительность заболевания составляла от 1 до 8 лет. Характеристика штаммов приведена в разделе «Результаты».

Биоптаты получали из участков видимо непораженной кожи с нижней трети предплечья, в стерильных условиях резали их на кусочки в 0,25%-ном растворе трипсина и культивировали между двумя покровными стеклами до получения сплошного монослоя. Затем стекла переносили во флаконы Ру с л площадью дна 40-80 см и продолжали культивирование до формирования монослоя на поверхности флакона. Выросшие фибробласты обрабатывали 0,25%-ным раствором трипсина, суспендировали до получения суспензии из единичных клеток и переносили в новые флаконы в количестве 0,5-3,0x104 клеток в расчете на 1 см площади культурального флакона. Штаммы фибробластов, полученные таким образом, сохранялись в Банке культур на базе Института экспериментальной онкологии РАМН.

1.2. Кровь.

Образцы крови для определения сиаловых кислот в сыворотке получали от здоровых людей в возрасте от 23 до 47 лет (8 человек) и больных ССД в возрасте от 20 до 53 лет (9 человек). Кровь и биоптаты кожи были получены от разных пациентов. Все больные в данной группе - женщины, 6 больных страдали диффузной формой заболевания, из них подострое течение болезни имели 5 человек, а острое - 1. У трех человек была установлена лимитированная форма ССД и хроническое ее течение. Характеристика формы и течения заболевания дана согласно классификации проф. Н.Г. Гусевой [8]. Кровь 4 человек из данной группы больных (две больные с подострым и две - с хроническим течением заболевания) использовали для выделения лейкоцитов.

1.3. Растворители.

Для экстракции, хроматографического разделения и анализа фосфо- и гликосфинголипидов использовали очищенные по общепринятым методикам [3] растворители: хлороформ, метанол, этилацетат, дихлорэтан, н-гексан, изопропанол, диоксан, метилцеллозольв.

1.4. Адсорбенты для жидкостной и тонкослойной хроматографии.

Разделение ганглиозидов и нейтральных ГСЛ проводили на сефадексе ДЭАЭ-25 («Pharmacia», Швеция). Хроматографические колонки приготовляли по общепринятым методикам [2]. Тонкослойную хроматографию фосфолипидов проводили на силуфоловых пластинках («Merck», Германия), ганглиозиды и нейтральные ГСЛ определяли высокоэффективной тонкослойной хроматографией (ВЭТСХ) на пластинках с силикагелем HPTLC («Merck», Германия).

1.5. Реагенты для обнаружения и идентификации липидов.

Для обнаружения фосфолипидов использовали 5%-ный раствор фосфорно-молибденовой кислоты в этиловом спирте [12]. Хроматограммы опрыскивали этим раствором и прогревали при 80-100°С в течение 3 мин. Липиды обнаруживались в виде синих пятен на светло-зеленом фоне.

Количественное определение холестерина проводили ферментным способом с использованием реактива Boehringer - Mannheim (N 290 319 по каталогу «Boehringer», Германия). Непосредственно перед определением готовили водный раствор реактива концентрацией 61 мг/мл.

Резорциновый реагент [18] для качественного и количественного определения ганглиозидов и сиаловых кислот приготовляли следующим образом: 200 мг резорцина растворяли в 10 мл воды, добавляли 80 мл концентрированной соляной кислоты, 0,25 мл 0,1 М раствора сульфата меди и доводили объем раствора водой до 100 мл. Хроматограмму опрыскивали этим раствором, накрывали стеклом и нагревали 5-10 мин при 180-200°С. Вещества, содержащие сиаловую кислоту, проявлялись в виде фиолетовых пятен на белом фоне.

Реактив Байала (орциновый реагент) для обнаружения гликолипидов [9] приготовляли, растворяя ОД г орцина в 40,7 мл концентрированной соляной кислоты. К раствору добавляли 1 мл 1% треххлористого железа и доводили объем водой до 50 мл. Хроматограмму обрабатывали полученным раствором и прогревали в течение нескольких минут при 80°С. Гликолипиды проявляются в виде фиолетовых пятен на белом фоне.

Исходный реагент для определения фосфора по микрометоду Васьковского приготовляли, смешивая 400 мг гидразин хлорида в 14 мл 4 М HCl с раствором 10 г молибдата натрия в 60 мл 4 М HCl, смесь нагревали 20 мин на кипящей водяной бане, охлаждали, добавляли 14 мл концентрированной серной кислоты и доводили конечный объем до 100 мл водой. Рабочий реагент приготовляли непосредственно перед употреблением следующим образом: к 5,5 мл исходного раствора прибавляли 26 мл 0,5 М серной кислоты и доводили объем водой до 100 мл [126].

1.6. Стандартные липиды.

В качестве стандартных фосфолипидов использовались диолеоил-фосфатидилэтаноламин, диолеоил-фосфатидилхолин, фосфатидилинозит печени крупного рогатого скота; фосфатидилсерин, сфингомиелин мозга крупного рогатого скота; стандартный холестерин фирмы «Sigma», США.

Для обнаружения и идентификации нейтральных ГСЛ использовались глюкозилцерамид, лактозилцерамид, глоботриаозилцерамид и глоботетраозилцерамид, выделенные из аорты человека [15]. Ганглиозид GM3 выделяли из печени человека, ганглиозиды GM1, GDla - из мозга крупного рогатого скота; GD3 - из коровьего молока, согласно методикам [116, 112]. Меченные тритием по остатку жирной кислоты в церамидной части молекулы ганглиозиды GM1 и GDla [19] были предоставлены сотрудником Института молекулярной генетики РАН Шевченко В.П.

Для определения включения жирных кислот в фосфолипиды фибробластов использовались свободные олеиновая и пальмитиновая кислоты («Sigma», США), а также [1-14С]-олеиновая и [1-14С]-пальмитиновая жирные кислоты («Amersham», Великобритания).

1.7. Факторы роста.

Для активации фибробластов использовались фактор роста тромбоцитов PDGF-AA и трансформирующий фактор роста TGF-ßl («Sigma», США).

1.8. Нуклеотид-сахара.

Для анализа сиалилтрансферазной активности использовались аммониевая соль цитидин-5'монофосфо-Ы-ацетилнейраминовой кислоты («Sigma», США), а также аммониевая соль цитидин-5' монофосфо[ 14С]-N-ацетилнейраминовой кислоты (284 mCi/mmol) («Amersham», Великобритания).

2. Методы исследований. 2.1. Техника культивирования

Фибробласты культивировали согласно ранее описанным методикам [54]. Для всех экспериментов использовались монослойные культуры III-VII пассажей на 7-8 день культивирования. На всех этапах культивирования питательная среда содержала: среду Игла - 50%, 5%-ный раствор гидролизата лактальбумина - 30%, инактивированную нагреванием сыворотку крупного рогатого скота (КРС) - 20%, глютамин - 0,2 мг/мл, пенициллин - 100 ед./мл, стрептомицин - 0,1 мг/мл. За 20 ч до начала эксперимента культурам проводили очередную смену среды. Клетки снимали со стекла 0,25%-ным раствором трипсина (или механически в случае экспериментов по включению жирных кислот, а также анализа сиалилтрансферазной активности), отмывали средой Игла с помощью трехкратного центрифугирования при 1000 об./мин в течение 10 мин. Перед последним центрифугированием отбирали пробы на определение белка и/или подсчет клеток.

2.2. Выделение липидов.

Липиды экстрагировали из осадка клеток смесью хлороформ-метанол-вода (5:5:1), экстракт упаривали досуха и растворяли в смеси хлороформ-метанол (2:1). Аликвоты экстракта использовали для определения фосфолипидов и холестерина. Количественный анализ фосфолипидов проводили согласно микрометоду Васьковского [126]. Качественный состав и соотношение компонентов определяли тонкослойной хроматографией на силуфоловых пластинках в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (65:25:4) со стандартами. Хроматограммы проявляли раствором фосфорно-молибденовой кислоты. Относительное содержание индивидуальных фосфолипидов было определено денситометрически на микроспектрофотометре «Camag» (Швейцария).

Выделение нейтральных ГСЛ и ганглиозидов производили согласно методикам, модифицированным Проказовой [15]. Липидный экстракт

41

РОССИЙСКАЯ' ^БЛМОХ высушивали, деацилировали обработкой 0,2 М КОН в 98%-ном метаноле при 40°С в течение 30 мин. [105], нейтрализовали 0,35 М уксусной кислотой в метаноле, упаривали и диализовали против дистиллированной воды. Диализат высушивали, растворяли в 50 мл смеси хлороформ-метанол-вода (30:60:8) и наносили на колонку (1:10 см) с 0,5 г ДЭАЭ-сефадекса А-25 [131]. Нейтральные ГСЛ элюировали с колонки смесью хлороформ-метанол-вода (30:60:8), а ганглиозиды - смесью хлороформ-метанол-0,8 М водный раствор ацетата натрия [71].

Фракцию, содержащую нейтральные ГСЛ, упаривали и очищали хроматографией на колонке (1:10 см) с силикагелем ЬДО/ЮО («СЬетаро1», Чехия). Состав нейтральных ГСЛ определяли ВЭТСХ на пластинках с силикагелем в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (60:30:8) со стандартами. Хроматограммы проявляли орциновым реагентом. Для количественного определения нейтральных ГСЛ хроматограммы обрабатывали парами йода, обнаруженные зоны выскребали, помещали в пробирки и определяли сфингозин по Ои1еуеу [89].

Содержащую ганглиозиды фракцию упаривали и обессоливали с помощью Бер-Рак С18 патрона [129]. Ганглиозидный состав определяли ВЭТСХ на пластинках с НРТЬС - силикагелем в системе растворителей хлороформ-метанол-0,2%-ный СаСЬ (55:45:10) [21]. Хроматограммы проявляли резорциновым реагентом. Количественное определение производили денситометрически [21].

2.3. Аналитические методы.

2.3.1 Определение фосфора по микрометоду Васьковского [126].

Аликвоту липидного экстракта, содержащую 0,1-0,5 мкг фосфора, вносили в пробирку, подсушивали током азота и добавляли 0,1 мл 60%-ной хлорной кислоты. Пробирки прогревали 2 ч при 180-200°С, охлаждали, вносили в каждую 0,4 мл рабочего реагента и кипятили на водяной бане в течение 10 мин. Затем пробы охлаждали и промеряли оптическую плотность при 820 нм. Содержание фосфора в пробе определяли по калибровочному графику для диолеолил-фосфатидилхолина (М.в. 786Д).

2.3.2. Определение общего холестерина с помощью реактива Boehringer - Mannheim.

Аликвоты липидного экстракта, содержащие 1-10 мкг холестерина, вносили в пробирки, подсушивали, растворяли в 5 мкл изопропанола, затем добавляли 20 мкл воды и 200 мкл реактива, приготовленного, как описано выше. Содержимое пробирок перемешивали и измеряли оптическую плотность при 546 нм. Количество холестерина в пробе определяли по калибровочному графику для стандарта холестерина.

2.3.3 Определение сфингозина [89].

Хроматографические зоны с пластинки выскребали, помещали в пробирки, прибавляли 0,5 мл диоксана и 1 мл 2 M серной кислоты и гидролизовали 3 ч при 95-100°С. Затем к реакционной смеси добавляли 0,5 мл 10 M раствора едкого натра, 5 мл этилацетата и интенсивно перемешивали в течение 1-2 мин. Нижнюю фазу отделяли, а верхнюю промывали водой 2 раза по 2 мл. К промытой верхней фазе добавляли 2 мл 0,01 M ацетатного буфера pH 3,65 и 0,1 мл 0,5% раствора метилоранжа. После перемешивания слои разделяли, к верхнему слою прибавляли 1 мл 0,5 M серной кислоты и измеряли оптическую плотность при 515 нм. Количество сфингозина определяли по калибровочной кривой, построенной для цереброзидов мозга (М.в 857).

2.3.4 Определение сиаловых кислот. 2.3.4.1 Резорциновый метод.

Метод позволяет определить суммарную сиаловую кислоту. К образцу ганглиозида, содержащего ~ 5 мкг сиаловой кислоты прибавляли 0,3 мл воды и 0,3 мл резорцинового реагента. Пробы кипятили 15 мин на водяной бане, охлаждали и добавляли 0,4 мл смеси бутилацетат-бутанол (85:15). Пробирки интенсивно перемешивали и, после разделения слоев, промеряли верхний слой при 580 нм. Содержание сиаловых кислот определяли по калибровочному графику для N-ацетилнейраминовой кислоты. Чувствительность метода - 5 нмоль сиаловой кислоты [40].

2.3.4.2. Периодат-резорциновый метод [64].

Метод позволяет определять связанную сиаловую кислоту в присутствии свободной. К пробам, содержащим 5-25 нмоль сиаловой кислоты, прибавляли 0,5 мл воды, 0,1 мл 0,04 М периодата натрия, перемешивали и выдерживали 25 мин на льду. Затем в пробирки добавляли 1,25 мл резорцинового реагента, смесь выдерживали на льду еще 5 мин, после чего быстро помещали в кипящую водяную баню на 15 мин. Пробирки охлаждали и элюировали окраску 1,25 мл изобутанола. Поглощение измеряли при 630 нм.

2.3.4.3. Определение свободной сиаловой кислоты в присутствии связанной.

Освобожденную нейраминидазой сиаловую кислоту определяли тиобарбитуровым методом по Warren [128].

2.3.5. Определение белка.

Аликвоты клеточной суспензии, содержащие 10-30 мкг белка, вносили в пластиковые пробирки и осаждали центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. К осадку клеток добавляли 0,33 мл 0,8 М NaOH и выдерживали ночь при комнатной температуре. В полученных пробах определяли белок по методу Peterson (модифицированный метод Лоури) [94], используя реагент без добавления щелочи.

2.4. Определение жирнокислотного состава фосфолипидов фибро-бластов.

Общий липидный экстракт наносили на колонку с силикагелем («Silpearl», Чехия), уравновешенную хлороформом. Колонку промывали смесью хлороформ-метанол (4:1) для удаления нейтральных липидов. Фосфолипиды элюировали 20 мл смеси хлороформ-метанол (1:1). Элют упаривали, гидролизовали 0,3 M КОН в метаноле (40°С, 30 мин), нейтрализовали 0,35 M уксусной кислотой в метаноле и растворяли в 10 мл воды. Метиловые эфиры жирных кислот экстрагировали 0,5 мл гексана. Количественный анализ проводили на газовом хроматографе, модель 5890 («Hewlett-Packard», США), с масс-спектрометрическим детектором, модель 5970, оборудованным капиллярной колонкой (12 м х 0,2 мм), стационарная фаза - силикагель с размером частиц 0,33 мкм. Первоначальная температура колонки удерживалась 12 мин, а затем повышалась со скоростью 10°С/мин до 220°С. Затем температуру повышали со скоростью 20°С/мин до 290°С. В качестве внутреннего стандарта использовали метиловый эфир маргариновой кислоты. Масс-спектрометрия была выполнена сотрудником Института биотехнологии РАСХН Садовской B.JI.

2.5. Включение жирных кислот в фосфолипиды фибробластов.

Фибробласты двух штаммов здоровых доноров и двух штаммов больных ССД выращивали в 25 см флаконах, как описано выше. На 6-7 день культивирования клеткам меняли среду на бессывороточную и оставляли на ночь перед экспериментом. Экспериментальную процедуру проводили согласно [82] с небольшими модификациями.

Жирные кислоты. Для включения использовали смесь [14С]-олеиновой и [14С]-пальмитиновой жирных кислот (удельная активность ОД 5 mCi/мг) в молярном соотношении 1:1. Немеченые жирные кислоты: олеиновая - 1,4 мг и пальмитиновая - 1,3 мг были добавлены в смесь для достижения удельной активности 10 ООО dpm/нмоль. Смесь жирных кислот обрабатывали 4 мкл 5 М NaOH и 0,5 мл этанола, затем высушивали током азота, добавляли 0,4 мл 150 мМ NaCl и прогревали 5 мин при 60°С. Затем к раствору добавляли 0,5 мл 24% БСА в физиологическом растворе и оставляли на ночь. Объем полученного реагента доводили физиологическим раствором до 1 мл. Конечная суммарная концентрация олеата и пальмитата натрия - 10 мМ.

Включение в клетки.

Реагент, содержащий [14С] (1 мл) разводили 50 мл среды для культивирования клеток, добавляли 0,5 мл HEPES и инкубировали фибробласты в течение 2 ч при 37°С. Инкубацию прерывали, помещая флаконы в лед; среду удаляли, и промывали клетки 0,48% БСА в физиологическом растворе, затем трижды фосфатным буфером. Липиды экстрагировали смесью изопропанол-гексан (2:3), экстракт упаривали, перерастворяли в гексане и хроматографировали ТСХ в системе гексан-этиловый эфир-уксусная кислота (75:25:1). Область липидов обнаруживали раствором фосфорно-молибденовой кислоты, вырезали, помещали во флаконы со сцинтилляционной жидкостью Unisolve 100 и считали включение [14С]-радиоактивности с помощью жидкостного сцинтилля-ционного счетчика 125 Rack Beta («LKB-Wallas», Швеция).

2.6. Анализ GM3 - нейраминидазной активности.

Фибробласты снимали со стекла трипсинизацией и отмывали, как описано выше. Затем гомогенизировали в небольшом объеме дистиллированной воды с помощью тефлонового гомогенизатора «Weaton» (США). Аликвоты клеточного гомогената немедленно использовались для анализа нейраминидазной активности согласно [32] с модификациями. Ганглиозид GM3 предварительно суспендировали в растворе холата натрия (10 мг/мл) до концентрации 3,2 мкмоль/мл. Инкубационная проба содержала 300 мкл гомогената (300-900 мкг белка), 100 мкл суспензии GM3 и 20 мкл 1М ацетатного буфера, рН 4,2. В контрольных пробах суспензию GM3 замещали раствором холата натрия или использовали воду вместо клеточного гомогената. Образцы инкубировали 22 ч при 37°С, периодически встряхивая. Осадок отделяли центрифугированием (3000 об/мин, 5 мин) и определяли освобожденную сиаловую кислоту в супернатанте тиобарбитуровым методом [128].

2.7. Анализ а-2,3:лактозилцерамид-сиалилтрансферазной активности.

Фибробласты механически снимали с матраса, отмывали трижды PBS и лизировали в течение 45 мин при 4°С буфером, содержащим 0,1 М Tris/HCl, 100 мМ NaCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,1 мМ PMSF, 10 мкг/мл Aprotinin и 0,5% Triton Х-100 [53]. Затем суспензию центрифугировали 15 мин при 1750xg для удаления оставшейся клеточной массы. Аликвоты конечного супернатанта (100 мкл) использовали для анализа сиалилтрансферазной активности. Аналитическая проба содержала: тритоновый экстракт клеток (200-300 мкг клеточного белка), 10 мкл 1 М какодилатного буфера рН 6,2 и гликолипидный акцептор лактозилцерамид. Реакция инициировалась добавлением СМР-[14С]1Ч-ацетилнейраминовой кислоты в концентрациях 4160 мкМ. Контрольные пробы вместо экстракта клеток содержали лизирующий буфер. Пробы инкубировали 60 мин при 37°С, периодически осторожно встряхивая. Реакцию останавливали добавлением 3 мл смеси хлороформ-метанол (2:1).

Анализ продукта реакции.

Анализ образованного [14C]-GM3 проводили согласно [65] с модификациями. Липидный экстракт упаривали, растворяли в 0,5 мл 0,1 М КС1 и наносили на Sep-Pak С18 [129]. Продукты распада и непрореагировавшая CMP-N-ацетилнейраминовая кислота удалялись промывкой 5 мл 0,1 М КС1 и 20 мл воды. Ганглиозиды элюировали 10 мл метанола, упаривали и хроматографировали на пластинках HPTLC в системе растворителей хлороформ-метанол-0,2% CaCh. (55:45:10) со стандартом. Область ганглиозида GM3 выскребали, помещали во флаконы со сцинтилляционной жидкостью Unisolve 100 и подсчитывали включение на сцинтилляционном р-счетчике («ЬКВ», Швеция).

2.8. Иммунофлюоресцентная микроскопия.

Экспрессию ганглиозидных детерминант исследовали согласно [99] с модификациями. Поликлональные кроличьи аффинно-очищеные aHTH-GM3 и анти-GMl антитела были получены сотрудниками Института биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН Звездиной Н.Д. и Мартыновой Л.Е. Клетки выращивали на покровных стеклах до монослоя, как описано ранее, отмывали теплым (22 °С) 0,01 М фосфатным буфером и фиксировали в течение 10 мин 4%-ным раствором параформальдегида в фосфатном буфере, рН 7,4. Затем стекла обрабатывали 1%-ным БСА в фосфатном буфере при 22 °С в течение 30 мин для блокады неспецифических антигенных детерминант. После этого клетки инкубиро-вали при 37°С в течение 2-3 ч с антителами к ганглиозидам (150 мкг/мл) в 0,15 мкМ Трис-ЭДТА-боратном буфере (рН 7,9), содержащим 0,5%-ный БСА и 20%-ный глицерин.

В контрольных опытах фибробласты инкубировали с антителами к ганглиозидам морского ежа (aGlG2). Такой контроль позволял исключить наличие неспецифических антигенов, поскольку ганглиозиды данного класса в клетках млекопитающих не встречаются. Далее клетки трижды отмывали фосфатным буфером и инкубировали 45 мин при 37°С со вторыми антителами. В качестве вторых антител использовались конъюгированные с FITC анти-кроличьи иммуноглобулины, адсорбированные IgG человека («Serva», Германия), в разведении 1:40. После инкубации клетки снова отмывали, закрывали покровным стеклом и заключали в Mowiol («Calbiochem», США). Микрофотографии получали на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ 2.

2.9. Изучение биологических эффектов гаиглиозидов.

2.9.1. Исследование связывания экзогенных гаиглиозидов с мембраной фибробластов.

Клетки двух штаммов фибробластов доноров и двух штаммов ССД фибробластов выращивали на 12-ти и 24-х луночных платах («Costar», США) как описано выше. Концентрация клеток составляла 104 клеток на лунку. Через 48 ч после экспланации культуру клеток дважды промывали

3 3 средой Игла и затем вводили ганглиозиды [ Hj-GMl и [ H]-GDla. Ганглиозиды предварительно растворяли в 50 мьсл спирта и добавляли к среде Игла, содержащей 0,2 М HEPES. Конечная концентрация гаиглиозидов в среде составляла 13-120 нмоль/мл. Планшеты инкубировали в течение 1,5 ч при 4°С и 37°С. После окончания инкубации клетки промывали трижды средой Игла, растворяли в 150 мкл 0,2 н NaOH, нейтрализовали НС1 и переносили во флаконы со сцинтилляционной жидкостью. Включение метки подсчитывали на жидкостном сцинтилля-ционном р-счетчике L-9000 «Beckman» (США).

2.9.2. Изучение эффектов факторов роста PDGF и TGF-P на пролиферацию фибробластов и участия гаиглиозидов в клеточном ответе на ростовую стимуляцию.

Фибробласты кожи здоровых доноров и больных ССД выращивали в 48-луночных планшетах до монослоя, как описано ранее. Количество клеток составляло 7-9x104 на лунку. Для стимуляции культур использовались фактор роста тромбоцитов (PDGF) и трансформирующий фактор роста (TGF-P) в концентрациях 50 и 1 нг/мл инкубационной среды соответственно. Ганглиозиды GM3, GM1 и GDla добавляли в среду до конечной концентрации 100 мкг/мл. Перед экспериментом клеткам меняли среду, затем вводили TGF-p и инкубировали в течение 4 ч; после этого л добавляли PDGF или смесь PDGF с ганглиозидом, а также Н-тимидин (ImkCí/мл) и 14С-уридин (0,5мкС1/мл) и инкубировали еще в течение 20 ч. По окончании инкубации клетки отмывали дважды фосфатным буфером, три раза 5%-ной ТХУ при 4°С и затем этанолом. Клетки высушивали, растворяли в 150 мкл NaOH, нейтрализовали НС1 и переносили во флаконы со сцинтилляционной жидкостью. Включение 3Н-тимидина и 14С-уридина подсчитывали на счетчике L-9000 «Beckman», (США).

2.9.3. Определение влияния ганглиозидов на продукцию сульфатированных гликозаминогликанов фибробластами.

Фибробласты выращивали на 24-х луночных платах («Costar», США) как описано выше. Через 48 часов после экспланации культуру клеток дважды

35 промывали средой Игла, затем вводили Na2 SO4 (5 mkCí), ганглиозиды GM3, GDla и GTlb и инкубировали клетки в течение 24 ч. Концентрация ганглиозидов в среде составляла от 4 до 180 нмоль/мл. После инкубации культуральную среду отбирали, диализовали против дистиллированной воды, растворяли и сГАГ осаждали 1 мл этанола, содержащим 1% ацетата натрия и 100 мкг хондроитин сульфата. Осадок отделяли центрифугированием при 4°С (10000 об/мин, 10 мин), гидролизовали 0,3 N

ЫаОН и определяли количество метки в образце на счетчике Ь-9000 («Вескшап», США).

2.10. Определение уровня ганглиозидов в лейкоцитах и сыворотке крови больных ССД.

2.10.1. Выделение лейкоцитов.

Лейкоциты периферической крови здоровых людей и больных ССД получали из 20 мл венозной крови, взятой натощак и стабилизированной 1,0 мл 2,7% ЭДТА. Кровь центрифугировали (30 мин, 1000 об/мин), слой лейкоцитов отбирали пастеровской пипеткой, плазму с эритроцитами вновь центрифугировали (10 мин, 1200 об/мин), пленку лейкоцитов снова отбирали и объединяли с первой. Оставшиеся эритроциты удаляли, применяя двукратный гипотонический осмотический шок: к 0,5 мл суспензии клеток добавляли 12 мл деионизированной воды, через 30 с изотоничность восстанавливали, добавляя 4 мл 3,6% ИаС1 [5]. Лейкоциты отделяли центрифугированием, отмывали физиологическим раствором и использовали без дальнейшего разделения на фракции. Перед отмывкой клетки отбирали на счет.

2.10.2. Определение липидно-связанной сиаловой кислоты в лейкоцитах.

Осадок лейкоцитов экстрагировали 10 мл смеси хлороформ-метанол (1:1), затем 10 мл смеси хлороформ-метанол (2:1). Экстракты объединяли, упаривали и выделяли фракцию ганглиозидов, как описано выше. Уровень ганглиозидов в лейкоцитах оценивали по содержанию сиаловой кислоты в ганглиозидной фракции. Определение сиаловой кислоты проводили резорциновым методом.

2.10.3. Получение сыворотки крови.

Венозную кровь, взятую натощак, выдерживали 30 мин при комнатной температуре для свертывания, центрифугировали 40 мин при 3000 об/мин, сыворотку отделяли, вновь центрифугировали (3000 об/мин, 20 мин) и хранили до использования при -30°С.

2.10.4. Определение липидно-связанной сиаловой кислоты в сыворотке крови.

Определение липидно-связанной сиаловой кислоты производили согласно Sallay [107] с небольшими изменениями. 1 мл сыворотки экстрагировали 10 мл смеси хлороформ-метанол (1:1) при 4°С в течение ночи. Осадок отделяли центрифугированием (3000 об/мин, 10 мин) и реэкстрагировали 10 мл смеси хлороформ-метанол (2:1) в тех же условиях. Супернатанты объединяли, упаривали, перерастворяли в 0,2 мл смеси хлороформ-метанол (4:1) и наносили на колонку (1x4 см) с силикагелем («Silpearl», Чехия), уравновешенную хлороформом. Колонку промывали 5 мл смеси хлороформ-метанол (4:1) для удаления основной массы липидов. Ганглиозиды элюировали 6 мл смеси хлороформ-метанол (1:1), элюат упаривали, растворяли в 0,5 мл воды и определяли содержание сиаловой кислоты периодат-резорциновым методом [64].

3. Статистическая обработка результатов.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакета программ Graph PAD InStat (Version 1.12a, Alan Daugherty, Univ. Washington 910348 S). Достоверность отличий определяли, используя непараметрический Т-тест.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Исследование было проведено на монослойных культурах фибробластов кожи здоровых доноров (13 человек) и больных ССД (10 человек). Группу доноров составили 10 женщин и 3 мужчин в возрасте от 21 до 40 лет. В группу больных вошли 9 женщин и 1 мужчина в. возрасте от 20 до 41 года. Преобладало подострое течение болезни (штаммы СФ1 - СФ4, СФ8, СФ10); три штамма (СФ5, СФ6, СФ9) получены от больных с хроническим течением и один (СФ7) - от больной с острым течением заболевания. Характеристика клинического течения ССД дана согласно классификации проф. Н.Г.Гусевой [8].

1. Фосфолипиды.

1.1. Определение содержания фосфолипидов и холестерина в культивируемых фибробластах кожи.

В таблице 3 представлено содержание фосфолипидов (ФЛ) и холестерина в фибробластах кожи здоровых людей и больных системной склеродермией. Как видно из таблицы, общее содержание фосфолипидов в контрольных фибробластах колебалось в пределах 150-221 мкг на мг клеточного белка. Среднее содержание ФЛ в этих клетках было равным 179±25 мкг/мг белка; количество фосфолипидов в ССД фибробластах было на 70% выше и составляло 307+130 мкг/мг белка. Содержание холестерина в этих клетках было также увеличено на 70% по сравнению с фибробластами доноров и составляло 92±11 мкг/мг белка.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Комлева, Алла Валентиновна, Москва

1. Алесенко A.B. Функциональная роль сфингозина в индукции пролиферации и гибели клеток. Биохимия, 1998, 63(1),. 75-82.

2. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В., Молотковский Ю.Г., Батраков С.Г., Барсуков Л.И., Проказова Н.В. Препаративная биохимия липидов. М. «Наука», 1981, 61-62.

3. Вайсбергер А., Проскауер Э., Фиддих Д., Тупс Э. Органические растворители. М., «ИЛ», 1958.

4. Владимирцев В.А., Гусева Н.Г., Хохлова Ю.В., Оскилко Т.Г. Особенности биосинтеза коллагеновых белков в культурах фибробластов кожи больных системной склеродермией. Вопр. Ревматизма, 1981, 2, 44-50.

5. Герасимов A.A., Баканов М.И., Балаболкин И.И., Бершова Т.В. Корреляционные взаимоотношения лизосомных ферментов и циклических нуклеотидов при аллергических заболеваниях у детей. Вопр. Мед. Химии, 1988, 5, 104-107.

6. Грачева Е.В., Голованова Н.К., Кононова О.И., Козлов С.Г., Проказова Н.В., Лякишев A.A. Сиаловые кислоты сыворотки крови при атеросклерозе. Биохимия, 1995, 60(5), 718-722.

7. Гроздова М.Д., Хохлова Ю.В., Панасюк А.Ф., Гусева Н.Г. Действие адреналина на культуру фибробластов кожи в норме и при системной склеродермии. Вопр. Мед. Химии, 1982. 28(6), 51-56.

8. Гусева Н.Г. Системная склеродермия и псевдосклеродермические синдромы. М., «Медицина», 1993, 29-39.

9. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. М., «Мир», 1991, 407.

10. Дятловицкая Э.В. Гликосфинголипиды и злокачественный рост. Вопр. Мед. Химии, 1991. 37, 21-23.

11. Кашникова JI.H. Показатели метаболизма фибробластов больных системной склеродермией при воздействии эстрадиола. Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Москва, 1990.

12. Кейтс М. Техникалипидологии. М., «Мир», 1975, 680-686.

13. Красильников М.А., Шатская В.А., Мизенина O.A., Татосян А.Г. Эффект специфической активации обмена фосфатидилхолина в фибробластах хомяка, трансформированных вирусом саркомы Рауса. Биохимия, 1996, 61(3), 525-531.

14. Панасюк А.Ф. Патогенетическое значение нарушений метаболизма фибробластов при системной склеродермии. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Москва, 1989.

15. Проказова Н.В., Михайленко И.А., Гладкая Е.М., Садовская B.JL, Когтев JI.C., Мухин Д.Н., Орехов А.Н., Бергельсон Л.Д. Гликосфинголипиды аорты человека. Биоорганич. Химия, 1986. 12(10), 1405-1413.

16. Хакомори С-И. Гликосфинголипиды. В Мире Науки, 1986. 7, 12-22.

17. Хохлова Ю.В. Система циклических нуклеотидов в фибробластах кожи больных склеродермией и ревматоидным артритом. Кандидатская диссертация. Москва, 1989.

18. Хроматография в тонких слоях. Ред. Шталь Э.М. М., «Мир», 1965. 487488.

19. Шевченко В.П., Мясоедов Н.Ф., Проказова Н.В., Бергельсон Л.Д. Получение липидов, меченных тритием, гетерогенным каталитическим изотопным обменом с газообразным тритием в растворе. Биоорганич. Химия, 1981. 7, 131-135.

20. Яковлева Г.И., Мульдияров П.Я., Грицман H.H. Формирование и деструкция коллагеновых структур кожи больных системной склеродермией. Архив патологии, 1978. 11, 28-35.

21. Ando S., Chang N-C., Yu R.K. High performance thin-layer chromatography and densitometric determination of brain ganglioside composition of several species. Anal. Biochem., 1978. 89,437-450.

22. Barbul A., Hunt T.K. Growth Factors and Other Aspects of Wound Healing: Biological and Clinical Implications., 1988. New York, AR Liss Inc.

23. Bashey R., Millan A., Jimenez S.A. Increased biosynthesis of glycosaminoglycans by scleroderma fibroblasts in culture. Arthritis Rheum., 1984. 24, 1040-1047.

24. Berenson C.S., Smith T.J. Human orbital fibroblasts in culture express ganglioside profiles distinct from those in dermal fibroblasts. J. Clin. Endocrinol. Metab., 1995. 80(9), 2668-2674.

25. Bremer E.G., Hakomori S-I. GM3 ganglioside induces hamster fibroblast growth inhibition in chemically defined medium: ganglioside may regulate growth factor receptor function. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1982. 106(3), 711-718.

26. Bremer E.G., Hakomori S-I., Bowen-Pope D.F., Raines E., Ross R. Ganglioside mediated modulation of cell growth, growth factor binding and receptor phosphorylation. J. Biol. Chem., 1984. 259 (11), 6818-6825.

27. Bremer E.G., Schiessinger J., Hakomori S-I. Ganglioside-mediated modulation of cell growth. Specific effects of GM3 on tyrosine phosphorylation of the epidermal growth factor receptor. J. Biol. Chem., 1986. 261, 2434-2440.

28. Buckingham R.B., Prince R.K., Rodnan G.P. Progressive systemic sclerosis (PSS, scleroderma) dermal fibroblasts synthesize increased amounts of glycosaminoglycan. J. Lab. Clin. Med., 1983. 101, 659-669.

29. Burczak J.D., Moskal J.R., Trosko J.E., Fairley J.L., Sweeley C.C. Probol ester-associated changes in ganglioside metabolism. Exp. Cell Res., 1983. 147, 281-286.

30. Burczak J.D., Fairley J.L., Sweeley C.C. Characterization of a CMP-sialic acid:Lactosylceramide sialyltransferase activity in cultured hamster cells. Biochim. Biophys. Acta, 1984. 804, 442-449.

31. Burczak J.D., Soltysiak R.M., Sweeley C.C. Regulation of membrane-bound enzymes of glycosphingolipid biosynthesis. J. Lipid Res., 1984. 25, 15411547.

32. Cantz M., Messer H., Oligosaccharide and ganglioside neuraminidase activities of mucolipidosis I (sialidosis) and mucolipidosis II (I-cell disease) fibroblasts. Eur. J. Biochem., 1979. 97, 113-118.

33. Chatteijee S., Sekerke C.S., Kwiterovich P.O. Jr. Alteration in cell surface glycosphingolipids and other lipid classes of fibroblasts in familial hypercholesterolemia. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1976. 73(12), 4339-4343.

34. Chatterjee S. Lactosylceramide stimulates aortic smooth muscle cell proliferation. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1991.181, 554-561.

35. Cheresh D.A., Harper J.R., Schulz G., Reisfeld R.A. Localization of the gangliosides GD2 and GD3 in adhesion plaques and on the surface of human melanoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984. 81, 5767-5771.

36. Chigorno V., Tettamanti G., Sonnino S. Metabolic processing of gangliosides by normal and Salla human fibroblasts in culture. A study performed by administering radioactive GM3 ganglioside. J. Biol. Chem., 1996. 271, 21738-21744.

37. Daniel L.W., Waite M., Kucera L.S., King L., Edwards I. Phospholipid synthesis in human embryo fibroblasts infected with herpes simplex virus type 2. Lipids, 1981. 16(9), 655-662.

38. Dawson G., Matalon R., Dorfman A. Glycosphingolipids in cultured human skin fibroblasts. J. Biol. Chem., 1972. 247, 5944-5950.

39. Duncan M.R., Hasan A., Berman B. Oncostatin M stimulates collagen and glycosaminoglycan production by cultured normal dermal fibroblasts:insensitivity of sclerodermal and keloidal fibroblasts. J. Invest. Dermatol., 1995. 104(1), 128-133.

40. Dyatlovitskaya E.V., Novikov A.M., Gorkova N.P., Bergelson L.D. Gangliosides of hepatoma 27, normal and regenerating rat liver. Eur. J. Biochem., 1976. 63, 357-364.

41. Dyatlovitskaya E.V., Bergelson L.D. Glycosphingolipids and antitumor immunity. Biochim. Biophys. Acta, 1987. 907, 125-143.

42. Eggl P., Wirthensohn K., Hirsch H. Effect of hormones on phospholipid metabolism in human cultured fibroblasts. Biochim. Biophys. Acta., 1986. 862, 399-406.

43. Fishman P.H., Brady R.O. Biosynthesis and function of gangliosides. Science, 1976. 194,906-915.

44. Fishman P.H., Bradly R.M., Brown M.S., Faust J.R., Goldstein J.L. Similar content of phospholipids and gangliosides in normal and homozygous familial hypercholesterolemia fibroblasts. J. Lipid Res., 1978. 19, 304-308.

45. Fishman P.H. Recent advances in identifying the function of gangliosides. Chem. Phys. Lipids, 1986. 42, 137-151.

46. Fleischmajer R., Dessau W., Timpl R. Immunofluorescence analysis of collagen, fibronectin and basement membrane protein in scleroderma skin. J. Invest. Dermatol., 1980. 75, 270-274.

47. Fleischmajer R., Perlish J.S. Glycosaminoglycans in scleroderma and scleredema. J. Invest. Dermatol., 1972. 58, 129-132.

48. Fleischmajer R., Perlish J.S., Krieg T., Timpl R. Variability in collagen and fibronectin synthesis by scleroderma fibroblasts in primary culture. J. Invest. Dermatol., 1981. 76, 400-403.

49. Fleischmajer R. Scleroderma. A model for fibrosis. Arch. Dermathol., 1983. 119, 957-962.

50. Gay R.E., Buckingham R.B., Prince R.K., Gay S., Rodnan G.P., Miller E.J. Collagen types synthesized in dermal fibroblast cultures from patients withearly progressive systemic sclerosis (scleroderma). Arthritis Rheum., 1980. 23, 190-196.

51. Giglioni A., Chigorno V., Pitto M., Valsecchi M., Palestini P., Chidoni R. Effect of different supramolecular organization on the uptake and metabolization of exogenous GM1 ganglioside by human fibroblasts. Chem. Phys. Lipids, 1990. 55, 207-213.

52. Goldring M.B., Krane S.M. Modulation by recombinant interleukin 1 of synthesis of types I and III collagens and associated procollagen mRNA levels in cultured human cells. J. Biol. Chem., 1987. 262,16724-16729.

53. Gross H.I., Sticher V., Brossmer R. A highly sensitive fluorometric assay for sialyltransferase activity using CMP-9-fluoresceinyl-NeuAc as donor. Anal. Biochem., 1990. 186, 127-134.

54. Guan Z., Strokes B.T., Van Brocklyn J., Yates A.J. Gangliosides inhibit platelet-derived growth factor stimulated increases in intracellular calcium in Swiss 3T3 cells. Biochim. Biophys. Acta, 1992. 1136, 315-318.

55. Hakomori S-I. Glycosphingolipids in cellular interaction, differentiation and oncogenesis.^««. Rev. Biochem., 1981. 50, 433-463.

56. Hakomori S-I. Ganglioside-mediated modulation of growth factor receptor function and cell adhesion. In book: Gangliosides and Modulation of Neuronal Functions. (H.Rahmann ed.) NATO ASI Series, Springer-Verlag Berlin, Heidelberg, 1987. 7, 465-479.

57. Hakomori S-I. Bifunctional role of glycosphingolipids: modulators for transmembrane signaling and mediators for cellular interaction. J. Biol. Chem., 1990. 265, 18713-18716.

58. Hanai N., Dohi T., Nores G.A., Hakomori S-I. A novel ganglioside, de-N-acetyl-GM3 (II3NeuNH2LacCer) acting as a strong promoter for epidermal growth factor receptor kinase and as a stimulator for cell growth. J. Biol. Chem., 1988. 263,6296-6231.

59. Iber H., van Echten G., Sandhoff K. Substrate specificity of a2->3-sialyltransferases in ganglioside biosynthesis of rat liver golgi. Eur. J. Biochem., 1991. 195, 115-120.

60. Inui K. The metabolism of radiolabeled GM1-ganglioside in cultured skin fibroblasts from controls and patients with GM1-gangliosidosis. Nippon-Rinsho., 1995. 53(12), 3102-3104.

61. Jimenez S.A., Feldman G., Bashey R.I., Bienkowski R., Rosenbloom J. Coordinate increase in the expression of Type I and Type III collagen genes in progressive systemic sclerosis fibroblasts. Biochem. J., 1986. 237, 837-843.

62. Jourdian G.W., Dean L., and Roseman S. A periodate-resorcinol method for the quantitative estimation of free sialic acids and their glycosides. J. Biol. Chem., 1971.246,430-435.

63. Kadowaki H., Symanski L.A., Koff R.S. Nonspecific lipid transfer protein in the assay of a membrane-bound enzyme CMP-N-acetyl-neuraminate lactosylceramide sialyltransferase. J. Lipid Res., 1988. 29, 52-62.

64. Kahari V.-M., Multimaki P., Vuorio E. Elevated proa2(l) collagen mRNA levels in cultured scleroderma fibroblasts result from an increased transcription rate of the corresponding gene. FEBS Lett., 1987. 215(2), 331334.

65. Kikuchi K., Kadono T., Ihn H., Sato S., Igarashi A., Nakagawa H., Tamaki K., Takehara K. Growth regulation in scleroderma fibroblasts: increasedresponse to transforming growth factor-beta 1. J. Invest. Dermatol., 1995. 105(1), 128-132.

66. Kleinman H.K., Martin G.R., Fishman P.H. Ganglioside inhibition of fibronectin-mediated cell adhesion of collagen. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1979. 76, 3367-3371.

67. Krieg T., Perlish J.S., Fleischmajer R. Collagen synthesis by scleroderma fibroblasts. Ann. NY Acad. Sci., 1986. 460, 375-378.

68. Ledeen R.W., Yu R.K. Gangliosides: structure, isolation and analysis. Methods Enzymol., 1982. 83, 139-191.

69. Ledeen R.W. Biosynthesis, metabolism and biological effects of gangliosides. In Book: Neurobiology of Glycoconjugates. Eds. Margolis R.U., Margolis R.K. Plenum Press. New York and London. 1989, 43-83.

70. LeRoy E.C. Increased collagen synthesis by scleroderma skin fibroblasts in vitro. A possible defect in the regulation or activation of the scleroderma fibroblasts. J. Clin. Invest., 1974. 54, 880-889.

71. LeRoy E.C., Mercurio S., Sherer G.K. Replication and phenotypic expression of control and scleroderma human fibroblasts: responses to growth factors. Proc. Natl. Acad. Sci., 1982. 79, 1286-1290.

72. LeRoy E.C., Black C., Fleischmajer R., Jablonska S., Krieg T., Medsger T.A., Rowell N., Wollheim F. Scleroderma (systemic sclerosis): classification, subsets and pathogenesis. J. Reumatol., 1988. 15, 202-205.

73. LeRoy E.C., Smith E.A., Kahaleh M.B., Trojanowska M., Silver R.M. A strategy for determining the pathogenesis of systemic sclerosis. Arthritis Rheum., 1989. 32, 817-825.

74. Lieser M., Harms E., Kern H., Bach G., Cantz M. Ganglioside GM3 sialidase activity in fibroblasts of normal individuals and of patients with sialidosis and mucolipidosis IV. Biochem J., 1989. 260, 69-74.

75. Macher B.A., Lockney M., Moskal J.R., Fung Y.K., Sweeley C.C. Studies on the mechanism of butirate-induced morphological changes in KB cells. Exp. Cell Res., 1978. 117,95-102.

76. Macher B.A., Klock J.C., Fukuda M.N., Fukuda M. Isolation and structural characterization of human lymphocyte and neutrophil gangliosides. J. Biol. Chem., 1981. 256(4), 1968-1974.

77. Mesaric M., Decker K. Activation of GD3 synthase by sex steroid hormones in cultured rat hepatocytes. Biochem. Biophys. Res. Comm., 1990. 171, 11881191.

78. Miller M., Motevalli M., Westphal D., Kwiterovich P.O., Jr. Incorporation of oleic acid and eicosapentaenoic acid into glycerolipids of cultured normal human fibroblasts. Lipids, 1993. 28(1), 1-5.

79. Ninomiya Y., Hota R.I., Nagai Y. Glycosaminoglycans metabolism by scleroderma fibroblasts in culture. Biomed. Res., 1982. 3, 70-72.

80. Ogura K., Sweeley C.C. Mitogenic effects of bacterial neuraminidase and lactosylceramide of human cultured fibroblasts. Exp. Cell Res., 1992. 199, 169-173.

81. Ohsawa T., Senshu T. Exogenous GM1 ganglioside caused G1-arrest of human diploid fibroblasts. Flow cytometric studies. Exp. Cell Res., 1987. 173, 49-55.

82. Okada Y., Mugnai G., Bremer E.G., Hakomori S.-I. Exp. Cell Res., 1984. 155, 448-456.

83. O'Keefe E., Cuatrecasas P. Cholera toxin and membrane gangliosides. Binding and adenylate cyclase activation in normal and transformed cells. J. Membr. Biol., 1978. 42, 61-79.

84. Orekhov A.N., Tertov V.V., Smirnov V.N. Lipids in cells of atherosclerotic and uninvolved aorta. II. Lipid metabolism in primary culture. Exp. Mol. Pathol., 1985. 43, 187-195.

85. Oulevey J., Bodden E., Thiele O.W., Quantitative determination of glycosphingolipids illustrated by using erythrocyte membranes of various mammalian species. Eur. J. Biochem., 1977. 79,265-267.

86. Paller A.S., Arnsmeier S.L., Alvarez-Franco M., Bremer E.G. Ganglioside GM3 inhibits the proliferation of cultured keratinocytes. J. Invest. Dermatol., 1993. 100(6), 841-845.

87. Peltonen J., Kahari L., Uitto J., Jimenez S.A. Increased expression of type VI collagen genes in systemic sclerosis. Arthritis Rheum., 1990. 33, 1829-1835.

88. Perkins R.M., Kellie B., Patel B., Critchley D.R. Gangliosides as receptors for fibronectin. Exp. Cell Res., 1982. 141, 231-243.

89. Peterson, G.L. A simplification of the protein assay method of Lowry at al which is more generally applicable. Anal. Biochem., 1977. 83, 346-356.

90. Postlethwaite A.E., Keski-Oja J., Moses H.L., Kang A.H. Stimulation of the chemotactic migration of human fibroblasts by transforming growth factor p. J. Exp. Med., 1987. 165, 251-256.

91. Prokazova N.V., Mukhin D.N., Orekhov A.N., Gladkaja E.M., Vasilevskaja V.V., Michailenko I.A., Bushuev V.N., Bergelson L.D. Neutral glycolipids of atherosclerotic plaques and unaffected human aorta tissue. Eur. J. Biochem., 1989. 180, 167-171.

92. Reutter W., Kottgen E., Bauer C., Gerok W. Biological significance of sialic acids. In Book: Sialic Acids Chemistry, Metabolism and Function. (Ed. Schauer R.) Springer Verlag, Wien, New York 1982, 263-305.

93. Rosner H., Greis Ch., Rodemann H.P. Density-dependent expression of ganglioside GM3 by human skin fibroblasts in all-or-none fashion, as a possible modulator of cell growth in vitro. Exp. Cell Res., 1990. 190, 161169.

94. Rossi P., Karsenty G., Roberts A.B., Roche N.S., Sporn M.B., de Crombrugghe B. A nuclear factor 1 binding site mediates the transcriptional activation of a type I collagen promoter by transforming growth factor-p. Cell, 1988. 52, 405-414.

95. Ruan Sh., Lloyd K.O. Glycosylation pathways in the biosynthesis of gangliosides in melanoma and neuroblastoma cells: relative glycosyltransferase levels determine ganglioside patterns. Cancer Res., 1992. 52, 5725-5731.

96. Rudnicka L., Varga J., Christiano A.M. Elevated expression of type VII collagen in the skin of patients with systemic sclerosis: regulation by transforming growth factor-p. J. Clin. Invest., 1994. 93, 1709-1715.

97. Saito M., Rosenberg A. The fate of glucosylceramide (glucocerebroside) in genetically impaired (lysosomal P-glucosidase deficient) Gaucher disease diploid human fibroblasts. J. Biol. Chem., 1985. 260(4), 2295-2300.

98. Saito T., Hakomori S., Quantitative isolation of total glycosphingolipids from animal cells. J. Lipid Res., 1971. 12, 257-259.

99. Sakiyama H., Takahashi T., Hirabayashi Y., Taniguchi M. Change in topographical distribution of GM3 during cell spreading and growth: immunostaining with monoclonal antibody against GM3. Cell Struct. Funct., 1987. 12, 95-105.

100. Sallay S.I., Prosise W.W., Morre D.J., Matyas G.R. Ganglioside and PCA sialic acid serum levels in cancer. Cancer J., 1986. 1, 124-129.

101. Schengrund C-L., Lasusch R.N., Rosenberg A. Sialidase activity in transformed cells. J. Biol. Chem. 1973. 248, 4424-4428.

102. Schengrund C-l., Rosenberg A., Repman M.A. Ecto-ganglioside sialidase activity of herpes simplex virus transformed hamster embryo fibroblasts. J. Cell Biol., 1976. 70, 555-561.

103. Seyfried T.N., Ando S., Yu R.K. Isolation and purification of human liver hematoside. J. Lipid Res., 1978. 19, 538-543.

104. Sollberg S., Mauch C., Eckes B., Krieg T. The fibroblast in systemic sclerosis. Clin. Dermatol., 1994. 12, 379-385.

105. Spiegel S., Schlessinger J., Fishman P.H. Incorporation of fluorescent gangliosides into human fibroblasts: mobility, fate, and interaction with fibronectin.Cell Biol., 1984. 99, 699-704.

106. Subcommittee for Scleroderma Criteria of the American Rheumatism Association Diagnostic and Therapeutic Criteria Committee: Preliminary criteria for the classification of systemic sclerosis (scleroderma). Arthritis Rheum., 1980. 23, 581-590.

107. Svennerholm L., Fredman P. A procedure for quantitative isolation of brain gangliosides. Biochim. Biophys. Acta, 1980. 617, 97-109.

108. Tsuboyama A., Takaku F., Sakamoto S., Kano Y., Ariga T., Miyatake T. Characterization of gangliosides in human leucocytes. Br. J. Cancer, 1980. 42, 908-914.

109. Uitto J., Bauer E.A., Eisen A.Z. Scleroderma. Increased biosynthesis of triplehelical type I and type III procollagen associated with unaltered expression of collagenase by skin fibroblasts in culture. J. Clin. Invest., 1979. 64, 921-930.

110. Uitto J., Helin G., Helin P., Lorensen R. Connective tissue in scleroderma. Acta Derm. Venerol., 1971.51,401-406.

111. Usuki S., Lyu S-Ch., Sweeley C.C. Sialidase activities of cultured human fibroblasts and the metabolism of GM3 ganglioside. J. Biol. Chem., 1988. 263, 6847-6853.

112. Usuki S., Hoops P., Sweeley C.C. Growth control of human foreskin fibroblasts and inhibition of extracellular sialidase activity by 2-deoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-neuraminic acid. J. Biol. Chem., 1988. 263, 10595-10599.

113. Van Echten G., Sandhoff K. Ganglioside metabolism. Enzymology, topology, and regulation. J. Biol. Chem., 1993. 268, 5341-5344.

114. Varga J., Rosenbloom J., Jimenez S.A. Transforming growth factor P (TGF-p) causes a persistent increase in steady-state amounts of type I and type III collagen and fibronectin mRNAs in normal human dermal fibroblasts. Biochem. J., 1987. 247, 597-604.

115. Varga J., Rudnicka L., Uitto J. Connective tissue alterations in systemic sclerosis. Clin. Dermatol., 1994. 12, 387-396.

116. Vaskovsky V.E., Kostetsky E.J., Vasendin K.M. A universal reagent for phospholipid analysis. J. Chromat., 1973. 114, 129-141.

117. Venerando B., Roberti S., Sonnino S., Fiorilli A., Tettamanti G. Interactions of ganglioside GM1 with human and fetal calf sera. Formation of ganglioside-serum albumin complexes. Biochim. Biophys. Acta, 1982. 692, 18-26.

118. Warren L. The thiobarbituric acid assay of sialic acids. J. Biol. Chem., 1959. 234, 1971-1975.

119. Williams M.A., McCluer R.H. The use of Sep-Pak C18 cartridges during the isolation of gangliosides. J. Neurochem., 1980. 35, 266-269.

120. Yu R.K., Ledeen R.W. J. Lipid Res., 1972. 13(5), 680-686.

121. Zebda N., Pedron S., Rebbaa A., Portoukalian J., Berthier-Vergnes O. Deficiency of ganglioside biosynthesis in metastatic human melanoma cells: relevance of CMP-NeuAc: a2-3 sialyltransferase (GM3 synthase). FEBS Letters, 1995. 362, 161-164.

122. Zeigler M., Sury V., Bach G. The identification of lysosomal ganglioside sialidase in human cells. Eur. J. Biochem., 1989. 183, 455-458.- '