Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение энтомопатогенных бацилл и изучение их свойств

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение энтомопатогенных бацилл и изучение их свойств"

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ

На правах рукописи

ИРМА ЖАНЕТ САНАЕРИЯ

ВЫДЕЛЕНИЕ ЗНТ0ШПАТ0ГЕННЫХ БАЦИЛЛ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Алматы - 1994

Работа выполнена в Казахском государственном национальном университете им.Аль-Фараби на кафедре микробиологии.

Научный руководитель: член-корр.НАН РК Член-корр доктор биологических наук,профессор- М.Х.Шигаева

Ведущая организация: Казахский сельскохозяйственный институт

Официальные оппоненты:доктор биологических наук М.А.Дубицкий

кандидат биологических наук К.Н.Кайши-беков

Защита диссертации состоится "_"_ 1994 г. в

_часов на заседании специализированного совета Д 53.24 01

по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук при Институте микробиологии и вирусологии НАН РК по адресу : 480100, Алматы, ул. Богенбай батыра, 103.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии НАН РК.

Автореферат разослан "_" _1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук Н.А.Айтхожина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы:Вредные для человека и растений насекомые накосят значительный ущерб здоровью, ограничивают сельскохозяйственное производство, К эффективным способам контроля за численностью насекомых-переносчиков болезней и вредителей растений относятся биологические инсектициды. Научной основой для развития биологических средств борьбы с вредными насекомыми явились исследования по изучению болезней насекомых, начатые еще в начале XIX века.Впервые'патогенные для насекомых микроорганизмы были использованы для контроля их численности (И.Мечниковым и ё'НегеПа 1899).Однако, планомерный характер эти исследования приобрели после 1 успешного применения спор об-лигаткого паразита японского жука Вас. рорИНае для ограничения его развития. Начиная с 60-х годов, основное внимание ученых было обращено на факультативные формы патогенов, особенно, бактерий вида Вас. 1Ьиг1пд,1епз1в. На основе различных сероти-пов этого вида производится 20 препаратов с высокой инсектицидной активностью против ряда вредителей культурных растений. В то же время промышленность производит лишь единичные препараты, изготовленные с помощью других видов энтомопатоген-ных бацилл Вас. зрЬаеггсиз и Вас. БиЬЫИБ (Препараты защиты растений,1994).

Несмотря на широкое использование многочисленных разновидностей Вас. 1Ьиг1г£1епз1з, изыскания новых активных штаммов этого вида продолжаются. Другие представители факультативных спорообразующих патогенов исследуются значительно меньше.

В связи с изложенным представляется целесообразным расширить поиск и изучение кс-вых штаммов спорообразующих бактерий с широким спектром энтомопатогенноп активности.

В виду того,что автор работы является гражданином Колумбии, страны, которая расположена в тропическом климате,где существует огромное разнообразие вредных для человека и растений насекомых и их развитие происходит в течение всего года,есть возможность применить полученный опыт на родине.Хотелось бы добавить,что в Колумбии проводятся клинические исследования в

борьбе против малярии (доктор Elkim Patarroyo).переносчиками которой являются комары рода Aedes aegipty.Результаты исследований диссертации могут быть использованы для получения препаратов, контролирующие численность этого рода комаров.

Цель и задачи исследования:Целью настоящей работы было выделение новых штаммов бацилл с инсектицидной активностью против комаров и вредителей сельскохозяйственных растений и изучение их свойств. В соответствии с поставленной целью определены следующие задачи:

- Выделение из природных субстратов и отбор культур рода Bacillus

- Определение энтомопатогенной активности выделенных культур.

- Идентификация перспективных энтомопатогенных штаммов и определение круга их хозяев.

- Разработка новых способов контроля роста энтомопатогенных бацилл.

Научная новизна:Выделены новые штаммы Вас. thuringiensis с широким спектром инсектицидной активности . Впервые показано знтомопатогенное действие Вас. megaterium в отношении личинок комаров родов Си lex, Aedes, Anopheles, колорадского жука и малого хрущвка. На среде SD выявлены различия в сроках спорообразования у трех штаммов.Бас. thuringiensis и Вас. megaterium.

Впервые лазерная нефелометрия использована для изучения динамики роста бацилл.

Практическая значимость.Культура Вас., thuringiensis -штамм U,Вас., megaterium -штамм Е могут быть использованы для контроля численности комаров . Спорокристаллический комплекс штаммов Вас.. thuringiensis в сочетании с экзотоксинами могут быть использованы в борьбе с жуками и личинками комаров рода Culex.

• Апробация: Результаты работ докладывались на теоретических семинарах (на проблемном совете по биотехнологии), на кафедре микробиологии,на студенческих конференциях молодых ученых биологического факультета КазНГУ им. Аль-Фараби.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела, включающего описание объектов и методов исследования,6 разделов,содержащих описание экспериментальных работ,выводов, списка цитированной литературы,

включающего 159 наименований,из которых 99 - на иностранных языках.Работа изложена на 1.01 страницах машинописного текста, иллюстрирована 16 таблицами и 8 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Объекты и методы исследований.

Объектом исследования служили 101 культура бактерий,выделенных из 22 образцов (почва,вода,тушки птиц,погибших от эпизоотии) Курдайского перевала,озера СорОулак,Семипалатинского ядерного полигона в 1992 г. и из 15 образцов (экскременты животных , почвы , насекомых, растительные'остатки) Семипалатинского ядерного полигона в 1993 г.При изучении физиолого-биохимических свойств исследуемых культур с целью последующей идентификации в качестве контроля использовали типовые штаммы Вас.. thurlnglensls и Вас., sphaericus, полученные из лаборатории биоконтроля института зоологии АН РК.

Выделение микроорганизмов из почвенных образцов проводили по стандартной методике (Егоров,1976).

При выделен™ микроорганизмов из насекомых .части тела,в зависимости от размера,растирали в 1,0-3,0 мл стерильного фи-

ЪТЖЪ Trr^TTTrTTaQirrsr'Q ^CjjOT S'™""'^» ITw C/j"** "Ol* W 2 "00 J lull* rc 0 *

в среду.куль тивирования.

При анализе микрофлоры птиц их разделывали и соответствующие органы (печень,желудок,а также лапки и оперенье)растирали в 1,0 - 3,0 мл стерильного физиологического раствора.Полученную суспензию вносили по 0,1 мл в среду культивирования. Инкубирование проводили при 30 С в течение трех суток. Для выделения микрофлоры использовали общепринятые среды-РПА и МПА,а также селективные -BAST,SD,NYST- для видов Вас. thuringiensis к Вас. sphaericus.(Kalfon,1983;Yousten,1985; Myers,1979).

Инсектицидные свойства эндотоксинов изучали в инсектарии Института Зоологии АН. стандартным методикам (Бзрбалюва 1976).Учет результатов проводили через 7 суток, повторкость экспериментов 3-х кратная.

Изучение морфологических и физиолого-биохимических признаков выделенных культур,необходимых для идентификации, проводили по общепринятым методикам (Вегееу,1880;Смаеберт,1984).

Для изучения роста и споруляции перспективных энтомопато-генных штаммов был использован стандартный метод (Ralfen, 1983) и метод лазерной нефелометрии.Установка для лазерной нефелометрии, разработанная Голубевой H.A.(1990) включает два волоконно-оптических световода,юстировочную систему и блок регистрации. Оптическая плотность микробных культур определяется по коэффициенту светорассеяния и экстинции лазерного излучения.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Выделение знтомопатогенных культур.

После культивирования на универсальной питательной среде РПА (тушки птиц,погибшие насекомые)и МПА( почва,вода, экскременты крупного рогатого скота и растительные остатки),проводили анализ количественного и качественного состава микрофлоры.

Количество культур выделенных из различных субстратов составляло: из водоемов -13, из почвы -30,из организмов птиц -28, из организмов насекомых -28 и из растительных остатков и экскрементов животных -2.

йзоляты выделенных культур представляли собой колонии,типичной для рода Bacillus морфологии: округлые, плоские, с равным или чуть волнистым краем, зернистой или волокнистой структурой, матовые или блестящие, светло-серого цвета. Под микроскопом все йзоляты представляли собой палочки, образующие споры и положительно окрашивающиеся по Граму. При росте в жидкой питательной среде они давали муть, слизистый осадок, иногда пристеночное кольцо.

В соответствии с целью работы предстояло проверить наличие и уровень энтомопатогенной активности выделенных культур.

Изучение энтомопатогенной активности выделенных культур.

Первичную оценку энтомоцидного действия культур выделенных из Курдайской области,а также озера Сорбулак, проводили на личинках комаров родов Culex и Anopheles,активно участвующих в распространении инфекций человека (Mulligan,1984). Полученные рсЗуЛЬТатЫ ПОКаЗЫБЗйх, ЧТО ИЗ 48 йЗ"учскНЫХ КУ'ЛЬхур оНТОмОПаТО-

генной активностью обладали 17 ; из них достаточно высокой ларвицидной активностью (свыше 50% гибели тест-организмов)отличались 10 штаммов: K-S ,М ,К-12, КВ(4), КВ(5), К-40, М-35, М-37, М-36,К-10.На этих штаммах было изучено ларзицидкое действие на личинках комаров трех видов при трех дозах (10 ,10 , 10 ).

Результаты показывают, что внимания заслуживают штаммы: К-8, М, KB(4), KB(5), К-12, К-40, М-35, М-37, М-36,К-10. Проверка их энтомопатогенной активности на еще более широком круге хозяев выявила большую эффективность штаммов М,М-36,М-35.

Таким образом, из всех изученных штаммов, обладающих достаточно высокой степенью эффективности в отношении широкого круга хозяев,включая личинок комаров, были выбраны 10 штаммов, которые хранились в обычных лабораторных условиях, на скошенном МПА , при температуре 9 С для последующего подробного изучения.

Из образцов Семипалатинского ядерного полигона в 1992 г было отобрано 13 культур, относящихся к роду Bsc.

Первичную оценку энтомопатогенного действия этих штаммов проводили на представителях жесткокрылых и двукрылых.

В отношении малого хрущака эффективность штаммов В,Е, и Y составляла 20-60% . Из штаммов, обладающих энтомопатогенным действием в отношении личинок комаров рода Culex только три штамма обладали достаточно высоким уровнем активности: (L -70%; Е - 80%, Y - 90%).Что касается комаров рода Aedes,то значительный эффект отмечен у штаммов: В-100%, R-100%, 1-70%,Е-60%.Из штаммов, обладающих энтомоцидным действием в отношении личинок комаров рода Anopheles (А,В,I,R,E,Y),три демонстрировали достаточно высокий уровень патогенности: В-100%, 1-60%, Y-100%. Дез штамма (В и Y) обладали еысоким энтомоцидным действием в отношении личинок комаров трех видов, личинок жуков и хрущака.

Таким образом, для дальнейшего изучения были отобраны 5 перспективных штаммов: I.B.E.R.Y.

В 1993 г,из образцов Семипалатинского полигона выделено 40 культур рода Bacillus.

Первичную оценку энтомоцидного действия этих штаммов проводили на вредных насекомых - представителях отрядов жесткокрылых и таракановых, а также на индифферентных членах экосис-

- б -

тем - моллюсках ([Р1апогЫв вр) и дафниях, представляющих важную хозяйственную ценность. Максимальной энтомопатогенной активностью в отношении наиболее широкого круга хозяев обладал один штамм - ЛБ-8. Он был активен по отношению к четырем видам насекомых:личинки мучного хрущака, малый хрущак, амбарный долгоносик и черный таракан, и вызывал 20-40%% гибели.

На энтомоцидную активность к личинкам комаров было проверено 23 штамма.В их число еошли только те штаммы, которые обладали патогенным действием по отношению к трем видам жесткок-

По результатам испытания этих штаммов на личинках комаров было установлено,что только 4 штамма (Ль5,ЛБ12,14,22/2) давали до 80 7. гибели.

В результате изучения микрофлоры из образцов Семипалатинского ядерного полигона в 1993 году было отобрано к дальнейшему изучению 10 штаммов, активных в отношении жесткокрылых,таракановых и двукрылых (личинок комаров).

Изучение энтомопатогенной активности культур род: Bacillus, позволило выявить 25 перспективных штаммов,которые отвечают высокому уровню энтомопатогекност!

(К-10, М, К-12, К-8, М-36, М-35, E,R) и действию на широком круг« хозяев (М-36,Кв(8),М,К-8,

М-Зо,М-о7,Кв(5),К-40,1,Б^Л,ЛБ8,ЛБЗ,ЛБ5,ЛБ10,ЛБ12,2, 7/1, 14, 22/2,26). Эти результаты подтверждают факт о том, что природные субстраты являются средой обитания энтомопатогенных бацилл с разным уровнем и диапазон инсектицидного действия.Большинство известных в биологии инсектицидных средств для борьбы < вредными насекомыми выпускаются на основе штаммов,выделенных i природе.Однако, задача заключается не только в поиске, но и i разработке более эффективных штаммов.

Изучение таксономических значимых признаков и идентифика ция культур.

Прежде чем заняться разработкой более эффективных штаммо было необходимо провести их идентификацию . В эту группу вошл штаммы с узко специфическим действием в отношении определенны видов насекомых,а также штаммы,знтомопатогенные в отношени широкого круга хозяев.При зтом отмечалось 40-60%% гибели крс

вососущих и 20-80%% гибели жесткокрылых и таракановых.Важным для идентификации морфологических признаков является локализация эндоспоры внутренней клетки.Были выделены две группы с центральным ( ЛБ-З.ЛВ-б.К-^.К-^ЛБ-В^Л.гб.ЛБ^.В.М^.Квб, Kb4,Y,R,I, К-40.ЛБ10) и субполярным ( 22/2,М-38,М-35,М,К-8,2, 14,Е) расположением споры.

Физиолого-биохимические свойства наиболее перспективных штаммов, необходимые для определения их видовой принадлежности. Результаты показаны в таблица 1 .

По совокупности исследованных тестов,штаммы 22/2,ЛБЗ,ЛБ5, ЛБ8,М-36,М-35,М,К-10,К-12 были отнесены к виду Вас. thu~ ringiensis.aiu штаммы не образуют кислоту из арабинозы,маннита и ксилозы,гидролизуют крахмал,желатин'и казеин,растут на среде с цитратом натрия и при 2-х,5-ти и 7-ми % NaCl, нет роста на на 10Z NaCl,нет роста при t-47°C, не образуют газа из глюкозы и не растут в анаэробных условиях. В то же время, отмечена способность к денитрификации и образование каталазы.

Пять штаммов(Кв-4,В,Кв-5,ЛБ12,М-37) на основании приведенных тестов были^отнесены к виду Вас. cereus, который очень близок по свойствам к Вас. thuringiensis,но эти два вида бактерий различаются способностью к формированию кристаллов.

Штаммы К-40 и I идентифицированы как Вас.' larvae,штаммы 2 и 14 - Вас. alvei, штаммы 26 и 7/1 - Вас. brevis, штамм Y Вас. subtilis.mam Е - Бас. megaterium, штамм R - Вас. lentimorbus.mram ЛБ-10 - Вас. apia- rius.

Результаты проведенной идентификации подтверждают данные литературы (Вейзер,1972),что энтомоцидные свойства в целом характерны для рода Bacillus.В настоящее время широкое применение нашли лишь несколько наиболее изученных видов:Вас. thurlngiensis, Вас. sphaericus и Вас. popilliae, и только совсем недавно ученые начали рассматривать возможность применения в качестве микробиологических средств защиты растений другие виды рода Bacillus.

. Особый интерес представляет штамм Е,определенный как Вас. megaterium,который показал высокую энтомопатогенную активность в отношении личинок комаров рода Culex.Данных энтомопатогенной активности этого вида в литературе не необнаружено.

со к* гэ - О СО со -.2 0) сл СО гл ь* г

га ю гч 1 О N и О а » ™ ю 01 г 1 со сл з: 1 со СП з: Ч М Е И 1 К

: Я О £ а : = Я & Зэ й» I а н г е СО Субстрат лцелеиия___

+ + 1 1 4- 4- 4> * + + + + + А Йназровность

+ + + + + 4- 4- 4- 4- 4- 4- + + С1 Коталсза

1 1 1 ( + + 44- 1 1 ) 1 1 + 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 си -а Аробинози Нанита ? о ь о ч Я

( + 4- 4- 1 ( < ( ( 4- ( 1 СП Ксилозы а •а 0 01 о а я га озы

+ 1 + 1 + I + 1 41 41 41 41 41 + I 44-I 41 4-I со о Глюкозы Образовав за из глвь

4 1 4* 4- + 4- 4- 4- 4- 4- + + 4- . Желатнны

+ 1 1 ( 4- + + ( 1 4- 4- + + 4- У+ м Крахиала -1 я я ■а о ы я со

+ 1 1 1 _ 1 4- 4- 4-( 4- 1 1 41 ►А со Тирозина

+ + + 4- 4- 4- 4- + 4- 4- 4- + 4- Козеина

I 4- ( 1 4- 1 1 41 1 I ( 41 сл Децитиноза

+ + 4- + 4- 4- + + + 4- + ! 4- + 01 Рост на среде .ЦДТШАВ

+ 1 4- 4- + 4- + + + + 1 41 + + мо2

+ 1 4- + 4- + 4- + 4- + + + + м-Со ГО >«. -а о о ►3 а-•о

+ 1 + + + 4- 4- + 4г 4г + + + 1 к»-СО \_п X.

+ г 1 1 1 1 1 + 1 4- + I 4- + 41 1 1 + 1 1 + I ( 4-( 1 41 1 41 1 + 1 1 1 , го о го I-1- го го -0 к о V*. а

го та ГО ГО ГО ГО ГО ГО

ГО О ф -1 <0 с ш а з с-ь— 3 о ст с и 3 <т> е-1 ГЧ- Ш И с с СЧ-• И г*-гг с 1 п Л) ф э и Г4* гг с: ■7 Г 14 ф ш !Л ГО £ < Си ф ГО а го ■-1 Я) с (Я ГО О ф -1 с с 1Л (4" 7Г с п я га 3 И [Я п-тх с. ■п 5' я V-* <Ь ■Р ¡Л ш г*- С п а Й О 3 сл И ГО О ® -1 я> с И го со ГО к ы

Изучение роста и динамики спорообразования перспективных энтомопатогенных штаммов из группы Вас. Ыиг1П[?1епЕ15.

Из идентифицированных штаммов.обладающих высоким уровнем энтомопатогенности и широким диапазоном действия,для дальнейших исследований отобраны 3 штамма (М-36,М,М-35), идентифицированных нами как Вас. ЬЪиг1п^1еп512, являющихся перспективными для возможного использования в производстве.

У этих штаммов были подробно изучены рост и динамика спорообразования при культивировании на агаризовакной к жидкой среде ББ.

Микроскопирование препаратов культур, выращенных на твердой среде 30,показало,что у культуры М-36 появление спор наблюдалось после 16 часов культивирования, у культуры М - после 12 часов. Максимальная скорость спорообразования отмечалась у культуры М-35; споры появляются уже через 8 часов культивирования. У типового штамма Вас. ЬЬинп^е^Б уаг.1вг. споры на твердой среде появились после 16 часов .

Микроскопические исследования показали, что рост на твердой среде сопровождается изменением морфологии клеток. В начале вегетативные клетки представлены подвижными палочками с закругленными концами, расположенными по 2-4 в цепочках. Перед споруляцией появляются короткие неподвижные палочки с обрубленными концами.

Изучение макроморфологии показало,что для всех культур характерны округлые,шероховатые колонии,с ровными краями, с кратером в центре,кремового цвета,консистенция маслянистая.Однако у культуры М и типовой культуры Вас. 1Ьиг1п^1епв1Б уаг. гягаеИепзхв, наряду с Быше описанными, встречались гладкие выпуклые,иногда амебовидные колонии.Эти изменения обычно связаны с утерей плазмидов, содержащих морфологическую информацию (51аЪ1у е1 е1. 1978)Микроскопирование культур,выращенных в жидкой среде показало, что у штамма М-36 споры появляются после 22 часов, у культуры М - после 20 часов, у культуры М -35 образование спор начиналось после 24 часов, тогда как у типового штамма Вас. 1Ьиг1п£1ег&15 уагЛяг.- после 22 часов куль-тирования.

В серии последующих экспериментов была изучена динамика

роста и накопления биомассы исследуемых культур при выращивании в жидкой среде- (рис.1). Полученные данные показывают, что культура М по скорости накопления и величине биомассы превосходит все остальные. Так, после 12 часов культивирования коли-

<з

чество живых клеток в этой культуре составляло 2.7x10 , тогда как у культуры М-36- после 14 часов культивирования , у культуры М-35 и типовой культуры - после 16^часов культивирования эти величины составляли 7.7x10 , 6.9x10 и 7.3x10 кл/мл, соответственно.

Следует также отметить, что культуры М-35, М-36 и типовая культура обладают меньшей скоростью адаптации, так как у них лаг-фаза занимает больше времени. Изучение динамики спорообразования этих культур показало, что ни одна из культур не образует споры ранее 20 часов.

Данные, полученные при изучении роста этих культур чашечным методом Коха, подтверждаются тем, что до 20 часов на кривой роста ни у одной из культур не обнаруживается характерной для начала спорообразования ступенчатости.

РИС.1. Кривые роста жизнеспособных клеток исследуемых культур на агаризованной среде БО:-*-: штамм'М;-»штамм М-36-^-: штамм М-35;^,- типовой штамм Вас. ¿/з иг1гтепз15 гаг.

хвгаеИепзхв.

-1—I—I—I—|—|—1—|—|—г

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 время,ч

Необходимо отметить,что в настоящее время внимание микробиологов сосредоточено на исследованиях, направленных на промышленное производство и использование спорообразующих энтомо-патогенных бактерий.Полученные результаты,позволяют заключить, что агаризованная среда БО способствует образованию спор в более короткий срок, в то. время как жидкая среда ЗБ благоприятна для роста вегетативных клеток, так как в ней спорообразование запаздывает (ШЛегель 1987).В промышленности используются жидкие среды. Следовательно,необходимо продолжить исследования в

плане оптимизации жидких питательных сред для культивирования отобранных культур.

Изучение роста и динамики спорообразования Bacillus

У штамма Е,идентифицированного как Вас. те^аЬеггит с высокой знтомопатогенной активностью стандартным методом изучена динамика роста и спорообразования при культивировании на ага-

типоеой штамм Вас. грлаег!сия,сходный по морфологическим признакам с вас. тераЬепит.

Микроскопирование препаратов культур показало, что клетки этих штаммов не образуют цепочки; в первые 12 часов клетки тонкие и удлиненные, после 12 часов - ввдны обособленные темные участки и клетки укорачиваются. После 24 часов появляются споры,которые в последующие '2 часа освобождаются из клеток. Споры у Е не изменяют форму материнской клетки, распо-

ложены терминально или центрально.В отличие от него у Вас. БрЬаегасиз споры изменяют форму клеток и расположены везде терминально.

Данные полученные при выращивании в жидкой среде (рис.2) показали, что скорость накопления и величина биомассы,а также начало спорообразования у обо:« культур сходны.

i i i i i т í i г 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 время,ч В итоге,можно сделать следующий вывод: штамм Е по физио-лого-биохимическим свойствам и по морфологическим, признакам вегетативных клеток сходен с Вас. sphaericus,который изучен в борьбе против комаров,поэтому в дальнейшем следует обратить внимание на этот штамм в промышленном производстве,так как он

megaterium - штамм Е.

120| 105Н 9СН 7SH 60-1 45-1 30-1 15]

РИС.2. Кривые роста жизнеспособных клеток на агаризован-ной среде БЮ: —.—Вас. тера-Ьеггит-,—Вас. врЬаеПсиз.

эффективен для разных насекомых. Динамика роста на двух средах (Poly.SD) штамма Вас. megaterium и типовых штаммов Вас. thuringiensis var. israeliensis и Вас. sphaericus 2297 изучена методом лазерной нефелометрии. Предварительно устанавливались оптимальные длины волн проходящего света .Наилучшие результаты получены в интервале от 550 до 650 нм. Результаты приведены на рис.3.Показано,что коэффициент све-топропускания падает,когда начинается спорулирующий процесс у штаммов Вас. sphaericus и Вас. megaterium на обеих средах.

Д.о

-,-,--!-j.

2 4 6 8 10 12 РЯС.3. Изучение скорости

п-1-i-1-1—^-i-i—г—г

14 16 18 20 22 24 26 28 30 роста и динамики споробразования

методом лазерной нефелометрии:Вас. thuringiensis var.israeliensis-*—iВас.sphaericusВас.megaterium (на среде POLY) —Вас. megaterium (на среде SD)—«—гТ-козффициент свето пропускания Д, отн.ед. на 550 нм. и стандартным методом Вас. megaterium---на среде SD . ( ) начало спорообразования.

После изучения роста Вас. megaterium на среде SD стандартным методом и с помощью лазерной нефелометрии установлена более высокая чувствительность лазерной нефелометрии. Она позволяет в более ранние сроки улавливать изменения, происходящие в культуре (нарастание числа' клеток и

- lo -

подготовка к формированию спор).

Таким образом доказано, что лазерный луч может быть не только средством воздействия на обменные биохимические процессы, но и средством регистрации и передачи информации о состоянии исследуемой среды.

Надо отметить, что к созданию принципиально новых высокочувствительных измерительных устройств приводит совместное использование лазерной техники и оптических волокон.

Изучение изменчивости знтомопатогенных признаков при длительном хранении.

Уже было сказано о значении выделения и изучения споробра-зующих энтомопатогенов.но после выполнения этой задачи предстоит не менее важное - сохранение их действия по времени.Из данных литературы известны тси метода хранения знтомопатоген-ных бактерий при небольших сроках (Bui la,1974). В ходе исследований проведена проверка устойчивости эндотоксинов (комплекс токсинов , ассоциированный со спорами и мембраной клеток) (Bechtel, 1976) и экзотоксинов,выявленных энтомопатогенов на более длительный срок хранения.

Для изучения эндотоксинов были отобраны 14 штаммов, выделенных из разных природных субстратов и показавших высокую степень знтомопатогенной активности. Изученные штаммы хранились в течение одного года на скошенном МПА при 9 С и в течение одного месяца при -8 С.По истечении срока хранения проверялась их энтомопатогенная активность:fee. thuringiensis - 5 , Вас. cereus - 4 , Вас. larvae - 2 , Вас. megaterium - 1 , Вас.. subtilis — 1 , Вас. lentiworbus - 1.Оценку изменчивости признака знтомопатогенной активности проводили на представителях жесткокрылых, комарах рода Culex и моллюсках.

В большинстве случаев энтомопатогенная активность снизилась в 2-3 раза. Наиболее стойкими после одного года хранения был признак знтомопатогенной активности в отношении личинок комаров рода Culex,так как он сохраняется на 60 % от общего количества испытанных штаммов.

Проверка устойчивости экзотоксинов было проведена на тех же штаммах на личинках комаров рода Си 1ех,хрущаке и на моллюсках.

Штаммы М-36.М, и К-10,Esc. thuringiensis и штамм Е Вас. megaterium обладают максимальным знтомопатогекным действием (100 %) на личинки комаров рода Culex.После года хранения у этих штаммов энтомоцидное действие сохраняется.

Результаты показывают,что знтомопатогенная активность экзотоксинов более устойчива к хранению. Это можно объяснить тем,что эндотоксины продуцируются плазмидами (Faust,1979).Эти плазмиды могут быть утеряны при обычном культивировании,и следовательно, продуцирование токсина (Stahly et al,1978).Позтому после длительного хранения рекомендуется обратить внимание на энтомоцидность экзотоксинов.Кроме того из данных литературы известно,что бактериальные препараты, состоящие из спорокрис-таллического комплекса, не обладают патогенным действием на некоторые насекомые. Перспективными в этом отношении являются штаммы способные продуцировать бета-экзотоксин, который вызывает высокую и быструю гибель тлей и паутинного клещика (Неу-дачина,1935).

ВЫВОДЫ

1. Из природных субстратов выделено 22 штамма рода Bacillus вызывающих гибель личинок кскзрсв рода Culex,а 21 штамм,токсичных для личинок рода Anopheles.

Z. Бациллы, обладающие инсектицидными свойствами, представлены видами: Вас. thuringiensis, Вас. cereus ,Вас. megaterium,Вас. lentimorbus, Вас. subtilis, Вас. larvae, Вас. brevis, Вас. aplarius.

3. Выделены три новых штамма (М,М-35,М-36) Вас. thuringiensis с широким спектром инсектицидного действия,из них штамм М отличается высокой скоростью роста и спрообраэова-ния.

4. Впервые показал энтомопатогенность Вас. megaterium.Штамм Е этого вида токсичен для комаров рода Си lex, Anopheles и Aedes, а также для колорадского жука и малого хрущака.

5. Выявлено, что активность споро-кристаллических комплексов быстрее утрачивается, чем способность продуцировать экзотоксин.

6. Показаны возможности использования методов лазерной не-елометрии для изучения динамики роста популяции бацилл.

7. И нсектицидная активность экзотоксинов против личинок шаров рода Culex сохраняется при хранении выделенных штаммов

М, Е, К-10 ) в экстремальных условиях.

8. Выделенные активные штаммы могут служить основой для олучения инсектицидных препаратов.

Основные результаты исследований достаточно освещены в 3 аучных трудах:

1. "Выделение активных штаммов знтомопатогенных бактерий". Вестник КазНГУ" сер. биология.-1994.-вып.2.-С.23-32.

2. "Сравнительное изучение роста и спорообразование энто-опатогенных бактерий из группы Вас. thurlngiensis". "Вестник азНГУ" сер. биология .-1994.-вып.2.-С.14-22.

3. "Изучение изменчивости знтомопатогенных признаков при лительном хранении"."Вестник КазНГУ" сер.биология.-1994.-вып. . -С.10-17.

nvilll я nv oimmAKI

22 strains of the genera Вас., originating from natural substrates, were lethal to the mosquito larvae Culex, and 21 strains were toxic for the larvae of genera Anopheles. The following Вас. demonstrated insecticidal activity: B. thuringiensis, B. csreus, B. megaterium, B. lentimorbus, B. subtllis, B. larvas, В. brevis, В. apiarius. Isolated 3 strains of Вас. thuringiensis with a wide spectrum of insecticidal activity. Strain E Вас. megaterium is toxic to the mosquito, genera Culex, Anopheles, and Aedes, and also for the Colorado ladybug and other insects of coleoptera. Demonstrated that the activity of the spor-crystal complex was lost at a faster rate than the activity produced by the exotoxins. Displayed the possibility for the use of laser-nifilometrian methods for the study of the growth dynamics of Вас. populations. The insecticidal activity of isolated cr.tcmcphatogenic cultures keeps for a year when the strains are preserved in inclínate agar in the refridgerator. The resulting active strains can be used as a base for the production of insecticidal preparations.

TYÜIHI

Culex туысына жататын маса личинкаларын слт1рет!н,табиги субстраттан Bacillus туысына жататын 22 штамм бвл!н1п алынды жене Anopheles туысынын личинкасы кер! ecepiH тигчветш 21 штамм алынды. Инсектицидт! курылысты бациллалар турлер1: Вас. thuringiensis,Вас. cereus,Bac. megaterium,Вас.lentimorbus,Вас. subtllis,Вас. larvas,Вас. brevis,Вас. apiarius. (М, М-35, М-36) Вас. thuringiensis-nin, жаца 3 птамм бел!- Hin алынды. Олардьщ 1ш1нен М штаммы баскаларынан тез осет1щц- ri жэяе cnopaTYsyi тез етет1нд1П жагыкан артык,. Вас. megaterium алгаа рет энтомопатогенч1л1г1н керсетть Ал осы турд!ц Е штаммы Culex, Anopheles жэке Aedes туысыкыц масаларына жене де ксщьгз-дарга зиянды acepiH ткггзед!. Спора-кристалдык комплексте рдi к активтШПн экзотоксин бол!п mbifapy касиет1не караг"акда тез жоГалады. Bacillus популяциясы осу динамикасын зерттегекде ла-зерл1 нефелометрия «áícíh кдлдану мумк!нд1ктер1 корсетЬтген. Culex туысыкыц масадарыньщ личинкаларына ^арсы зкзотоксин-дерд1н инсектецидт! активтШгг,бодШп алынган (М.Е.К-10) штаммдарда колайсыз жа^айларда сакталады. Еол1н1п злынган штаммдар инсектицидт! препараттар дайындауда Heris бола алзды.