Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-биологическая роль энтомопатогенных бактерий лесных биоценозов Монголии, их трофические потребности

ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Эколого-биологическая роль энтомопатогенных бактерий лесных биоценозов Монголии, их трофические потребности"

На правах рукописи

Р Г Я о

Совд Дэлгэрмаа

ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ ЛЕСНЫХ БИОЦЕНОЗОВ МОНГОЛИИ, ИХ ТРОФИЧЕСКИЕ ПОТРЕБНОСТИ

03. 00. 16 - "Экология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Иркутск - 2000

Работа выполнена на кафедре микробиологии биолог почвенного факультета Иркутского государственного университет;

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Т.В. Завезенова

Официальные оппоненты: Плешанов A.C., д.б.н.; с.н.с.

Чемерилова В.И., к.б.н., доцент

Ведущая организация: Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск

Защита состоится 13 декабря 2000 г. в 14 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д.063.32.06 Иркутске государственного университета по адресу: г. Иркутск, ул. Су> Батора, 5, ауд. 219 (Байкальский музей им. проф. М.М. Кожов почтовый адрес: 664003, Иркутск, ул. Ленина, 3, а/я , НИИ Биологии при ИГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИГУ. Автореферат разослан 13 ноября 2000 г.

Ученый секретарь специализированного совета,

кандидат биологических наук Е.С. Купчинская

/7^/6. П 4 96-6,0

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

На современном этапе в мировой практике все большее ■шмание уделяется разработке и использованию эффективных и гзопасных для человека и окружающей среды средств защиты чтений в лесных биоценозах и сельскохозяйственных культур г вредных насекомых.

По практическому использованию наибольшую известность элучили кристаллообразующие бактерии. В отличии от омических средств защиты, биопрепараты не нарушают угественные биоценозы, не аккумулируются во внешней среде, Зладают избирательным действием на насекомых и способны 1ерживать размножение вредителей на безопасно хозяйственном ювне.

Для создания эффективных и безопасных средств защиты чтений одним из условий является использование высоко-фулентных, фагоустойчивых, длительно сохраняющих свои юйства возбудителей болезней насекомых, которые приспо-эблены к условиям массового размножения и сохранению ста-^льности продуцирования споро-кристаллического комплекса.

До сих пор основным способом получения высокоэффектных штаммов является метод выделения из насекомых, погиб-их в природных биоценозах от бактериозов, и несомненное тчение имеет географическое происхождение штаммов.

Новизна и научная ценность работы.

Впервые исследованы лесные биоценозы Монголии с целью зиска, выделения возбудителей болезней насекомых, отбора лсоковирулентных штаммов - продуцентов средств защиты ютений. В лесных биоценозах Монголии собраны для бакте-1ального анализа 560 гусениц сибирского шелкопряда и антич-зй волнянки, из которых выделено 50 штаммов кристаллообра-'ющих бацилл. Для работы отобраны 17 штаммов Bacillus uringiensis. Определены основные морфо-культуральные физио-)го-биохимические свойства, серологическая принадлежность, зучены трофические потребности культур, что позволило здобрать основу питательной среды для массового накопления юмассы в условиях малотоннажного производства.

Цель исследований.

Поиск и отбор высоковирулситмых штаммов ВааПиз thuringiensis для их дальнейшего использования в качестве продуцентов микробиологических средств защиты.

Задачи исследований.

1. Определение серологических свойств исследуемых штаммов;

2. Определение морфо-культуральных признаков;

3. Изучение влияния различных температурных режимов на процесс споруляции и инклюзиообразования исследуемых штаммов;

4. Определение биологической активности на гусеницах насекомых;

5. Изучение трофических потребностей исследуемых штаммов.

Положения, выносимые на защиту.

■ энтомопатогенные бактерии Вас. 1Ьиг^1егш5 являются компонентом лесных биоценозов Монголии;

■ в лесных биоценозах Монголии обнаружены различные серотипы Вас. Шипг^егшБ;

■ высокая вирулентность и биологическая активность обусловлены способностью культур образовывать фермент лецитиназу;

■ при замене источников азота и углерода в среде идет увеличение титра микробных тел;

■ при содержании глюкозы размеры спор и инклюзий меньше, чем на среде с мелассой;

■ при различных содержаниях зерноотходов на среде с мелассой размер кристаллов исследуемых культур больше, чем на среде с глюкозой;

■ оптимальной средой для культивирования монгольских штаммов является среда с 2 % содержанием мелассы и зерноотходов.

Практическая значимость. В результате обследования очагов массового размножения насекомых в биоценозах Монголии выделены и отобраны

ивные, высоковирулентные штаммы, изучены их трофические гребности для подбора компонентов питательной среды. Апробация работы.

Основные результаты исследований опубликованы в 4 Зотах. Положения диссертации докладывались на Байкальском ждународном студенческом форуме "Безопасное развитие ^ионов" (Иркутск, 1996), на XI съезде Русского энтомо--ического общества (Санкт-Петербург, 1997), на юбилейной 1ференции Госкомприроды Иркутской области (Иркутск, 98), на региональной научно-практической конференции ^разнообразие микроорганизмов Восточно-Сибирского регио-и их научно-практическое использование" (Иркутск, 1999).

Результаты исследований.

Отобранные 17 штаммов по серологическим признакам несены к следующим серовариантам: тринадцать к IY эоварианту - Вас. thuringiensis subsp.dendrolimus; два - к Y эоварианту - Bac.thuringiensis subsp.galleriae; два - к III эоварианту - Bac.thuringiensis subsp.alesti.

По морфологическим признакам крупные вегетативные етки формирует штамм М-48-9-7 (subsp.dendrolimus): длина 4,3 0,3, ширина 1,3 ± 0,2 . Крупные споры наблюдаются у 10 "аммов: длина 2,0 ± 0,1,ширина1,1 ± 0,5. Крупные кристаллы наружены у штамма М-35-8-1 (subsp.alesti): длина 2,0 ± 0,4, фина 0,9 ± 0,2. (табл. 1)

Мелкие размеры спор и кристаллов характерны для штаммов -15 (subsp.dendrolimus), М-25, М-27 (subsp.galleriae). (табл. 1)

Наиболее характерным признаком идентификации исталлофоров является наличие параспоральных включений. У следуемых штаммов серотипов subsp.dendrolimus и subsp.alesti исталлы четко ромбовидные с четко очерченными прямыми аями. У subsp.galleriae (М-25, М-27) кристаллы округлой |рмы и обладают высокой патогенностью для большинства дов насекомых.

В результате опытов по выявлению различных температур на ст бактерий Bac.thuringiensis установлен температурный апазон роста для культивирования монгольских штаммов. Для

Морфологические признаки исследуемых штаммов

Штамм Величина, мкм Соотношение спор и кристаллов

вегетативных клеток спор кристаллов

длина ширина длина ширина длина ширина

М-5 3,6 ± 0,3 1,5+ 0,02 2,0 ±0,01 1,1 ±0,1 1,9 ±0,03 1,0 ±0,001 1,18 : 1

М-12 2,9 ±0,4 1,3 ±0,02 2,0 ±0,09 1,1 ±0,5 1,9 ±0,02 0,9 ±0,01 1 : 1

М-15 2,5 ±0,3 1,2 ±0,02 1,5+ 0,02 0,9 ±0,2 1,8 ±0,03 1,0 ±0,02 1 : 1

М-16 3,8± 0,4 1,6 ±0,03 2,0 ±0,03 0,8 ±0,2 2,0 ±0,007 1,0 ±0,05 1 : 1,3

М-17 3,6 ±0,3 1,5 ±0,02 2,0 ±0,01 1,1 ±0,1 2,1 ±0,03 0,9 ±0,07 1,1 : 1

М-25 2,7± 0,2 1,3 ±0,04 1,9'±0,03 0,8 ±0,3 1,8 ±0,02 1,01 ±0,02 1 : 1,2

М-27 2,7 ±0,2 1,3 ±0,04 1,9 ±0,03 0,8 ±0,3 1,9 ±0,02 1,2 ±0,01 1 : 1,2

М-31 3,6±0,3 1,5 ±0,02 2,0 ±0,01 1,1 ±0,1 2,1 ±0,03 0,9 ±0,06 1,1 1

М-34 3,6 ±0,3 1,5 ±0,02 2,0 ±0,01 1,1±0,1 2,1 ±0,02 0,8 ±0,04 1,1 1

М-35 3,6 ±0,3 1,5 ±0,02 2,0 ±0,01 1,1±0,1 2,08 ±0,08 0,9 ±0,01 1,1 1

М-39 3,6± 0,3 1,5 ±0,02 2,0 ±0,01 1,1±0,1 2,1 ±0,03 0,89 ±0,04 М 1

М-87-4 3,6 ±0,3 1,5 ±0,02 2,0 ±0,01 1,1+0,1 1,9 ±0,02 1,2 ±0,04 1,1 1

М-84-4 3,6 ±0,3 1,5+ 0,02 2,0 ±0,01 1,1 ±0,1 1,9 ±0,02 1,2 ±0,01 1,1 1

М-2-10 3,3 ±0,3 1,5+0,02 2,0 ±0,01 1,1±0,1 2,1± 0,03 0,88 ±0,08 1,1 1

М-35-8-1 3,5 ±0,7 1,2 ±0,1 1,7 ±0,1 1,0±0,1 2,1 ±0,02 0,9 ± 0,02 1 : 1

М-35-14-5 4,2 ±0,4 1,4 ±0,3 1,8 ±0,2 1,0 ±0,2 2,0 +0,04 1,0 ±0,06 1,1:1 !

М-48-9-7 4,3 ±0,3 1,3 ±0,2 1,6 ±0,1 1,1± 0,2 2,0 ±0,02 0,9 + 0,03 1:1 |

ВасЛЬипг^епз^ зиЬзр.ёепёгоНтиз (М-12), Васл11ипп§1еп515 зиЬэр.акзи (М-35-8-1) этот диапазон находится в пределах от 15° С до 30° С.

Скорость роста бактерий при разных температурах

Уср 120

= ......- - I

20 25 30 35

УСР = Ср, / Ср,п„ х 100 %, где УСР - уровень скорости роста. Ср, - скорость роста бактерий при разных температурах, Сртач - скорость роста бактерий при Э1 пи мальмом температуре культивирования.

Одним из характерных физиолого-биохимических признаков ¡пщилл группы 11н1ппу1еп.ч1х является образование зцетилметилкарбинола. Все исследуемые штаммы образуют ЛМК. Кроме М-35-8-1, М-35-14-5 (зиЬзр.а^П), М-48-9-1 ¡511Ь5р.с1епс1го1ппи5), остальные монгольские штаммы проявляют различную степень уреазной активности'. У культур М-35-8-1, М-48-9-7 зона гидролиза крахмала 1-4 мм, тогда как у других юна составляет от 7 мм до 10-12 мм.

Отличительной чертой всех исследуемых монгольских итаммов является их высокая лецитиназная активность, что твлястся показателем высокой биологической активности.

Пигментообразование отмечено только у штаммов 4-35-8-1, М-35-14-5 (зиЬ5р.а1ез11). На яично-солевой среде эбразуют пигмент розового цвета; на картофеле М-35-8-1 -келтый пигмент, М-35-14-5 - розовый.

Все штаммы пептонизируют молоко н разжижают желатину. Ча молоке культуры М-16, М-31 (зиЬзр.скпскоПтиБ) образуют

плотный сгусток, что связано с наличием у них сычужного фермента.

Решающим показателем перспективности бактериальных культур, используемых в борьбе с вредителями, является их патогенность для насекомых. В связи с тем, что каждый вид насекомого специфически реагирует на заражение различными энтомопатогенными бациллами, большое значение для оценки их эффективности имеет правильный выбор тест-объекта (Toumanoff, Vago, 1954 ; Krieg, 1964; Зурабова, 1968).

Тест-насекомые, на которых проверялась биологическая активность наиболее активных бацилл исследуемых штаммов, содержались в садках по 10-20 штук (гусеницы крапивницы, зимней пяденицы, непарного шелкопряда), которых кормили листьями растений, обработанных суспензией исследуемых штаммов в разведении 10"' и 10"5. Результаты опытов представлены на диаграммах.

Биологическая активность штаммов на гусеницах непарного шелкопряда

4,5 4

З.'о

3 2.5 2 1,5 1

0,5

О

1 - штамм М-25 Вас. ¡Ьиг. зиЬэр. £а!1епае,

2 - штамм М-35-8-1 Вас. Шиг. эиЬБр. а1езп,

3 - штамм М-12 Вас. Лиг. виЬзр. с]епс1гоПти5,

4 - штамм К-78 Вас. Лиг. зиЬэр. скпёгоНтиз

s

Биологическая активность на гусеницах крапивницы

13 16

14 -

12 10

iJi

t i

Ut: ¡fe

m

Щ

f-' Viv

¿ft'-

1 - штамм М-25 Вас. thur. subsp. galleriae,

2 - штамм M-35-8-1 Вас. thur. subsp. alesti,

3 - штамм М-12 Вас. thur. subsp. dendrolimus.

4 - штамм K-78 Вас. thur. subsp. dendrolimus

Биологическая активность штаммов на гусеницах пяденицы зимней

20 -18 [ 16 ( 14}

12 +■

I

10 -

I

Ш

1 - штамм М-25 Вас. thur. subsp. galleriae,

2 - штамм М-35-8-1 Вас. thur. subsp. alesti,

3 - штамм М-12 Вас. thur. subsp. dendrolimus.

4 - штамм К-78 Вас. thur. subsp. dendrolimus

Из диаграмм видно, что против гусениц непарного шелкопряда (Ocneria dispar) наиболее активен штамм М-25 (subsp.galleriae). Этот штамм вызывает 100 % гибель при концентрации 10"1 и 70 % - при концентрации 10"5. Против гусениц крапивницы и пяденицы зимней (Agíais urticae и Olierophtera brumata L) наиболее эффективен штамм М-12 (subsp.dendrolimus). Гибель гусениц составила 100 % в разведении 10"'. Взятый для сравнения регенирируемый штамм К-78 (subsp. dendrolimus № 49) был активен для всех гусениц, вызывая 100 % - 80 % гибель. Штаммы М-25 (subsp.galleriae), М-35-8-1 (subsp.alesti) менее патогенны для гусениц крапивницы и пяденицы зимней.

После серии опытов по определению биологической активности некоторых исследуемых штаммов, проведенных на гусеницах разных насекомых было выявлено, что штамм М-25 (subsp.galleriae) обладает более высокой биологической активностью по сравнению с другими монгольскими штаммами, но его активность менее высока по сравнению с типовым штаммом К-78 (subsp.dendrolimus).

Для выявления трофтческих потребностей исследуемых культур были использованы зерноотходы в качестве источника азота, а глюкоза и меласса в качестве источника углерода.

Из таблицы 5 видно, что при добавлении глюкозы в среду с зерноотходами идет увеличение титра бактерий и процентное содержание спор к общему числу микробных тел.

В таблице 6 показано наиболее интенсивное потребление глюкозы на средах содержащих мучку ячменную и отруби, менее интенсивное - на средах приготовленных из серой мельничной пыли и ячменной лузги.

В ходе эксперимента глюкоза была заменена мелассой, которая в своем составе содержит сахарозу, рафинозу, микро-и макроэлементы. Опыты проводились на средах следующего состава: зерноотход - 1 %, 2 %, 3 %, меласса - 2 %, СаС03 - 0,5 %, К2НР04 - 0,1 %, NaCl - 0,05 %, агар-агар - 1,5 %, вода. Так как все штаммы дают скудный рост на лузге ячменной,то в опытах использовали три вида зерноотходов: отруби, серая мельничная пыль и кормовая мучка ячменная. Для проведения опытов

ю

Накопление микробных тел (вегетативных клеток и спор) на средах, обогащенных глюкозой в 48-часовой культуре (средние данные 3-х повторностей)

Отходы Штамм Титр микробных тел, млн/мл Количество спор, % к общему числу микробных тел

опыт контроль опыт контроль

Отруби М-25 ...........590............... ..............560.............. ................42.7 31.0..........

Серая пыль 200 110 41,7 40,0

Мучка 350 390 63,0 55,3

Лузга 240 120 64,0 26,7

Отруби М-12 590 600 48,7 .........40,0

Серия пыль 210 150 76,0 52,7

Мучка 430 410 68,8 60,0

Лузга 130 100 59,7 35,4

Отруби М-35-8-1 360 340 65,0 56,7

Серая пыль 290 270 78,8 60,0

Муч ка 620 600 49,9 40,3

Лузга 210 180 57,0 29,7

Отруби М-15 700 640 48,0 39,7

Серая пыль 305 270 56,7 45,0

Мучка 560 510 54,0 48,3

Лузга 300 270 62,8 50,6

Отруби .....К-78 ...................550................. 570 40,0 ..............32,7

Серая пыль 220 120 68,9 42,0

Мучка 360 380 55,4 57,5

Лузга 220 110 65,9 30,9

Потребление редуцирующих веществ (глюкозы) при культивировании на белковых средах

Отходы Штамм Содержание моносахарида, %

начальное конечное расход

Отруби 1,89 1,75 0,14

Серая пыль М-25 1,83 1,74 0,09

Лузга ячменная 1,91 1,85 0,06

Мучка ячменная 2,1 1,91 0,19

Офуби 1 .XV 1,73 0,16

Серая пыль М-12 1,8.4 1,80 0,03

Лузга ячменная 1,91 1,82 0,09

Мучка ячменная 2,1 1,85 0,16

Отруби 1,89 1,72 0,17

Серая пыль М-15 1,8.4 1,79 0,04

Лузга ячменная 1,91 1,83 0,08

Мучка ячменная 2,1 1,90 0,20

Отруби 1,89 1,80 0,09

Серая пыль 1,83 1,74 0,09

Лузга ячменная 1,91 1,87 0,04

Мучка ячменная 2,1 1,89 0,21

Отруби 1,89 1,74 0,15

Серая пыль К-78 1,83 1,73 0,1

Лузга ячменная 1,91 1,83 0,08

Мучка ячменная 2,1 1,92 0,18

использовали штаммы трех серовариантов: М-25 (subsp.galleriae), М-12 (subsp.dendrolimus), М-35-8-1 (subsp.alesti). Для контроля взята культура К-78 - Bacillus thuringiensis subsp.dendrolimus Tal., регенирирующая в 1978 году.

При увеличении зерноотходов с 1 % до 2 % идет увеличение спорообразования, а с 2 % до 3 % идет снижение процесса. Самым оптимальным соотношением зерноотхода к основе среды является 2 % содержание отходов. При анализе данных эксперимента самой продуктивной средой на которой наблюдается высокое спорообразование исследуемых штаммов является среда: для М-25 и М-12 содержащая 2 % отрубей, а для М-35-8-1 - 2 % кормовой мучки (см. рис. 1).

При увеличении зерноотхода с 1 % до 3 % идет изменение накопления титра микробных тел. Как видно из графиков, самый высокий титр исследуемые культуры дают на средах, содержащих 2 % зерноотхода. Для штамма М-25 наиболее высокий титр наблюдается на средах с 2 % отрубей и кормовой мучки ячменной. Для штамма М-35-8-1 на среде с 2 % кормовой мучки ячменной титр равен 1092 млн.спор/мл. Для культуры М-12 наиболее высокие титры на средах с 2 % отрубями и кормовой мучки ячменной (1060 и 1142 млн.спор/мл.).

На средах с зерноотходами при различных источниках углерода более равномерное усвоение углерода осуществляется культурой Bacillus thuringiensis subsp.alesti. Выход спор и инклюзий начинается через 72 часа и заканчивается через 120 часов. На среде с глюкозой этот штамм через 72 часа образует кристаллы длиной 1,8 ± 0,008 мкм, шириной 0,8 ± 0,002 мкм; через 120 часов длина инклюзий 1,9 ± 0,01, ширина 0,9 ± 0,01 мкм. Идет увеличение спор и инклюзий.

Культуры М-12, М-25 на среде с мелассой образуют крупные кристаллы и полный выход спор и инклюзий наблюдается через 48 часов, тогда как на глюкозе этот процесс заканчивается через 120 часов.

Проведены эксперименты по выяснению влияния различных зерноотходов на процесс споруляции и морфологию инклюзий. Микроорганизмы выращивались на средах содержащих зерноотход и мелассу. Установлено, что различные источники

Количество вегетативных клеток, спор и инклюзий Bacillus thuringiensis в одном поле зрения микроскопа

(средняя из 25 полей зрения)

Штамм Вид отхода 1-суточная культура 3-х суточная культура Соотношени спор и кристаллов

вегетативные клетки вегетативные клетки споры инклюзии размеры инклюзий

длина ширина

М-12 отруби 32,7± 0,4 5 ±0.25 28.5 ±0,2 30 ±0,2 1,9 ±0,04 0,9 ± 0,04 1 : 1,05

мучка ячменная 16,7± 0,5 1,1+0,2 33 ± 0,6 36 + 0,4 2,0 ±0,02 0,9 ±0,02 I : 1,1

серая пыль 39 ±0,73 21.5 ±0,47 33.1± 0,54 34 ±0,6 1,7 ±0,01 0,7 ±0.01

М-25 отруби 27,2± 1,18 4 ±0,33 27.4± 1,02 28 ± 1,07 1,9 ±0,005 0,9 ±0,005

мучка ячменная 22 ±0,29 8 ±0,25 45 ± 0,34 32 ±0,36 1,8 ±0,02 1,0 ±0,01 1,4 : 1

серая пыль 34± 0,6 9.8+ 0,2 36 ±0,45 36,8 ± 0,62 1,9 ±0,02 0,9 ±0.01

М-35-8-1 отруби 24,4 ±0,3 19 ±0,22 21 ±0,38 24,5 ± 0,36 1,9 ±0,02 0,8 ±0,01 1 : 1,1

мучка ячменная 36 ±0,55 16.2 ±0,6 34 ±0,58 36 ±0,7 1,9 ±0,02 1,1 ± 0,01 1 : 1,1

серая пыль 11,8± 0,2 2.3 ±0,26 23 ±0,5 34 ± 0,32 1.6 ±0,01 0,7 ±0,01 1 : 1,5

К-78 отруби 19 ±0,28 15 ±0,03 17 г 0,3 19 ±0,2 1,9 ±0,02 0,8 ±0,01 1 : 1,1

мучка ячменная 22 ±0.3 1.3 ±0,3 34 ±0,5 34 ±0.4 1,9 ±0,01 0.7 ±0.01

серая пыль 37 ±0,57 17.6 ±0.5 32 ±0,4 33 ±0.59 1,06 ±0.01 0.7 + 0,02

Таблица 8

Количество вегетативных клеток, спор и инклюзий Bacillus thuringiensis в одном поле зрения микроскопа

(средняя из 25 полей зрения)

Источник углерода 1-суточная культ ра З-сугочная культ\ра 5-суточная культура

вегета .'и- III,1С клетки вегетативные клетки споры инклюзии размер инклюзий вегетативные клетки споры инклюзии размер Ш1КЛЮ31:

длина | ширина длина 1 ширина

М-12 (subsp. dendrolimus)

глюкоза 31± 0,05 13,9+ 0,3 19± 0,48 12.4± 0,24 1,7± 0,05 0,6± 0,04 2,5+ 0,2 27± 0,6 20± 0,48 1,6+0,13 0.7± 0,0i

меласса 32,7± 0,4 5± 0,25 28,5± 0,2 30± 0,2 I 1.9± 0,04 0,9± 0,04 - - - - -

М-25 (subsp. galleriae)

глюкоза 35,4± 0,97 20± 0,68 19± 0,2 19+ 0.27 1,7± 0.03 0,8± 0,04 8+ 0,24 35+0,60 36± 0,60 0,8+ 0.3 0.8± 0,0.;

меласса 27,2± 1,18 4+ 0.33 27.4± 1.02 2S± 1,07 1.9+ 0,005 1,9± 0,005 - - - - -

М-35-8-1 (subsp. alesti)

глюкоза 35+ 0,41 19± 0,33 24=0,31 ¡2.^ 0,39 1.8а: 0,008 0,3_ J.C02 2± 0,19 39± 0,37 40± 0,39 1,9±0,01 о.9± о.о:

меласса 24,4+0.3 19± 0.22 21± 0,38 24.5± 0,36 1.9± 0,02 0,8± 0,01 12± 0,29 30± 0,2 32± 0,52 1,9+0.02 0.8± 0,Г

K-7S (subsp. dendrolimus)

глюкоза 28+ 0,04 16± 0,23 16+ 0,34 17± 0,12 1,9± 0,01 0,9± 0,01 6,6± 0,2 27± 0,4 28± 0,45 1,9+0,02 о.9± о.о:

меласса 19± 0,28 15± 0,03 17= 0,3 19+ 0.2 1,9± 0,02 0,8± 0,01 5,7± 0,3 25± 1,6 25± 1,6 1,9+0,02 0.9+ 0,0:

Рис. 1. Накопление титра на средах с зерноотходами

М-25 (виЬвр. даПемае)

М-35-8-1 (виЬвр. а1е$1()

Ч э«риоот*ода

•/, зерно от «ода

М-12 («иЬэр. с1епйгоПти5) / —

1 2

эерноотюда

К-78 (эиЬвр. Ьепс^го^тиз)

эврмоотход»

- рост на отрубях. рост на серой поши рост на мучке ячменной

юта по разному влияют на ход спорообразования и формирования 1клюзии (табл. 7).

На среде с отрубями все штаммы через 48 часов образуют споры инклюзии. Самые крупные кристаллы образуют штаммы М-25 и 1-12. Размеры варьируют: у М-12 длина от 1,7 до 2,0 мкм. ширина г 0,8 до 1,0 мкм; у М-25 длина от 1,8 до 2,1 мкм, ширина от 0,8 до О мкм. Штамм М-35-8-1 крупные кристаллы образует на среде с учкой ячменной. Инклюзии имеют ромбовидные, длина варьирует г 1,8 до 2,1 мкм, ширина от 0,8 до 1,0 мк.

При сравнении кристаллов на средах с зерноотходами с азличными источниками углерода необходимо отметить, что нклюзии на средах с мелассой имеют крупный размер. На среде с иокозой полный выход спор и инклюзий наблюдается через 120 асов, тогда как на среде с мелассой этот процесс завершается через 8 часов.(табл. 8)

Таким образом, самой оптимальной средой для культивирования сследуемых штаммов является среда, содержащая 2 % мелассы и 2 в зерноотходов. Для штаммов М-12 (subsp.dendrolimus) и М-25 ¡ubsp.galleriae) оптимальной средой является среда с 2 % мелассы и % отрубей, на которой штаммы образуют крупные кристаллы с олным выходом спор и инклюзий. Для штамма М-35-8-! ;ubsp.alesti) среда с 2 % мелассы и 2 % кормовой мучки ячменной вляется оптимальной.

ВЫВОДЫ:

1.По реакции агглютинации 17 штаммов отнесены: 13 к V серотипу - Bacillus thuringiensis subsp.dendrolimus; 2 штамма к Y еротипу - Bacillus thuringiensis subsp.galleriae; 2 штамма к И серотипу - Bacillus thuringiensis subsp.alesti.

2. При изучении влияния различных температур на морфологию хтаммов трех серовариантов выявлено, что для М-12 и М-35-8-1 емпературный диапазон находится в пределах от 15° С до 30° С, для 4-25 от 15° С до 40° С.

3. Отличительной чертой монгольских штаммов является ысокая лецитиназная активность. Штаммы М-16, М-31 subsp.dendrolimus) имеют сычужный фермент, который

проявляется в образовании плотного сгустка в молоке. Штаммь сероварианта а1еБЙ способны образовывать пигмент.

4. Штамм М-25 обладает более высокой биологическо? активностью по сравнению с другими монгольскими штаммами Гибель гусениц составила 100 % при разведении культуры 10"'.

5. Самой оптимальной средой для культивирования монгольски? штаммов является: для М-12 и М-25 среда с 2 % мелассы и 2 °/ отрубей, для М-35-8-1 - с 2 % мелассой и 2 % кормовой мучю ячменной.

6. Самой высоковирулентной культурой, которую можнс использовать в качестве продуцента микробиологических средст! защиты, является штамм М-25 (БиЬБр^аПепае).

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1.3авезенова Т. В., Совд Дэлгэрмаа. Эколого-географическа: характеристика энтомопатогенных микроорганизмов, выделенных и: лесных биоценозов Монголии. // Тезисы выступлений. Байкальски! международный студенческий форум "Безопасное развити< регионов". - Иркутск, 1996.-С. 18-19

2. Завезенова Т.В., Совд Дэлгэрмаа. Энтомопатогенньи микроорганизмы, обнаруженные в лесных биоценозах Монголии. / Сб."Проблсмы энтомологии в России". - XI съезд Российской энтомологического общества. - Санкт-Петербург, 1998. - Т. 1 . - С 160-161

3. Совд Дэлгэрмаа, Завезенова Т.В. Внедрени! микробиологического метода защиты леса от насекомых вредителе! в Монголии. // Сб. "Современные проблемы экологии природопользования и ресурсосбережения Прибайкалья" Материалы юбилейной конференции Госкомприроды Иркутске! области. - Иркутск, 1998. - С. 236

4. Совд Дэлгэрмаа. Подбор питательных сред дл: культивирования бацилл группы Йшпг^ег^Б, выделенных и биоценозов Монголии. // Сб. "Биоразнообразие микроорганизмо] Восточно-Сибирского региона и их научно-практическо! использование". - Иркутск, 1999. - С. 57

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Совд Дэлгэрмаа

ВВЕДЕНИЕ.

Г л а в а 1. ЭНТОМОПАТОГЕННЫЕ БАКТЕРИИ В ЗАЩИТЕ

РАСТЕНИЙ.

1.1. История изучения энтомопатогенных микроорганизмов.

1.2. Характеристика группы Вас. Шипг^егшз.

Е л а в а 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Изучение морфологических и культуральных свойств.

2.3. Изучение физиолого-биохимических свойств.

2.4. Методика дифференциации серологических вариантов при помощи Н- и О-антигенов.

2.5. Основные среды для изучения пищевых потребностей исследуемых штаммов.

Е л а в а 3. ЛЕСА МОНЕОЛИИ, ИХ ОСНОВНЫЕ ВРЕДИТЕЛИ.

Е л а в а 4. ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДУЕМЫХ КУЛЬТУР.

4.1. Серологические свойства.

4.2. Основные морфологические и культуральные признаки изучаемых культур

4.3. Влияние различных температур на рост и развитие культур.

4.4. Физиолого-биохимические признаки.

4.5. Биологическая активность выделенных культур.

4.6. Трофические условия культивирования кристаллофорных бацилл

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эколого-биологическая роль энтомопатогенных бактерий лесных биоценозов Монголии, их трофические потребности"

Вредная деятельность многих насекомых приносила и приносит колоссальные убытки народному хозяйству. Насекомые - вредители уничтожают садовые и полевые культуры, лесные массивы, являются переносчиками различных заболеваний домашних животных и человека, вредят в различных отраслях народного хозяйства и в быту. Все это потребовало разработки различных методов борьбы с этими вредителями с целью ограничения их деятельности или полного уничтожения. Методы борьбы с вредными насекомыми делят на химические, механические, физические и биологические. Из всех категорий истребительных мероприятий наибольшее значение приобрел химический метод борьбы. Это объясняется тем, что сравнительно небольшим ассортиментом ядохимикатов можно погубить разнообразные группы вредных насекомых, приносящих ущерб в самых различных отраслях деятельности человека.

Однако в последнее время, в связи с широким применением ядовитых веществ в борьбе с вредными насекомыми сельского хозяйства, обнаружились весьма серьезные отрицательные стороны их применения: уничтожение, помимо вредных насекомых, их антагонистов-хищников и паразитов; привыкание насекомых к их действию; аккумуляция их в организме животных и передача их по пищевой цепочке другим животным, накопление в окружающей среде, вредность для человека и теплокровных животных.

В последнее время после значительного спада вновь возрождается интерес к биологической защите. Разновидностью биологического метода защиты считается метод использования для борьбы с вредными насекомыми различных микроорганизмов.

Знаменитые работы JI. Пастера, посвященные болезням шелковичных червей, вызванным микроорганизмами, положили начало развитию микробиологического метода борьбы (Pasteur, 1870).

В последние годы внимание ученых обращено на изучение различных энтомопатогенных микроорганизмов - вирусов, бактерий, грибов, простейших, как эффективных и безопасных агентов защиты растений. Большое внимание уделяется разработке микробиологического метода борьбы с таким опасным вредителем хвойных лесов Сибири и Дальнего Востока, как сибирский шелкопряд.

Леса Монголии занимают около 15 млн. га (около 8 % всей территории), из которых на лиственницу приходится около 49,3 %. Леса интенсивно вовлекаются в промышленную эксплуатацию. К истощению лесных ресурсов приводят пожары и вредные насекомые.

В лесах Монголии широко распространены такие вредители, как сибирский шелкопряд, античная волнянка, пяденица Якобсона. Они поедают хвою деревьев, уничтожая тем самым большие лесные массивы. Эти вредители широко распространены в лесах Хэнтэйского хребта, Богда-Ула и Центрального аймака, нагорного Хангая.

Основным методом борьбы с хвоелистогрыущими вредителями леса в Монголии является химический, который имеет ряд отрицательных факторов. Лесные массивы Монголии приурочены к населенным пунктам, поэтому химикаты, применяемые против насекомых-вредителей, особенно опасны для человека и теплокровных животных.

Поэтому разработка микробиологических средств защиты в условиях Монголии является актуальной.

В результате проведенных исследований выделены местные штаммы кристаллообразующих бацилл, показана их высокая эффективность против вредных насекомых.

В лесных биоценозах Монголии собраны для бактериального анализа 560 гусениц сибирского шелкопряда и античной волнянки, из которых выделено 50 штаммов кристаллообразующих бацилл. Для работы были отобраны 17 штаммов Bacillus thuringiensis. Как отмечал Э. К. Африкян (1973), для азиатского континента характерно преобладание штаммов 4 серотипа - Вас. thuringiensis subsp. dendrolimus. Для всех этих штаммов характерно наличие кристаллов кубической и ромбической формы, которые, попав в кишечник насекомого, вызывают паралич, растворяясь под действием щелочной среды кишечника.

Данная работа посвящена изучению штаммов кристаллофорных бацилл, выделенных из погибших гусениц насекомых, собранных в лесных биоценозах Монголии.

Цель исследований. Поиск и отбор высоковирулентных штаммов Bacillus thuringiensis для их дальнейшего использования в качестве продуцентов микробиологических средств защиты.

Задачи исследований.

1. Определение серологических свойств исследуемых штаммов;

2. Определение морфо-культуральных признаков;

3. Изучение влияния различных температурных режимов на процесс споруляции и инклюзиообразования исследуемых штаммов;

4. Определение биологической активности на гусеницах насекомых;

5. Изучение трофических потребностей исследуемых штаммов.

Практическая значимость. В результате обследования очагов массового размножения насекомых в биоценозах Монголии выделены и отобраны активные, высоковирулентные штаммы, изучены их трофические потребности для подбора компонентов питательной среды.

Апробация работы. Основные результаты исследований опубликованы в 4 работах. Положения диссертации докладывались на Байкальском международном студенческом форуме "Безопасное развитие регионов" (Иркутск, 1996), на XI съезде Русского энтомологического общества (Санкт-Петербург, 1997), на юбилейной конференции Госкомприроды Иркутской области (Иркутск, 1998), на региональной научно-практической конференции Биоразнообразие микроорганизмов Восточно-Сибирского региона и их научно-практическое использование (Иркутск, 1999).

Заключение Диссертация по теме "Экология", Совд Дэлгэрмаа

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе освещено изучение микробиологических характеристик штаммов группы Bacillus thuringiensis, выделенных из лесных биоценозов Монголии. Проведены эксперименты по изучению культуральных, физиолого-биохимических свойств 17 штаммов группы Bacillus thuringiensis. По серологическим характеристикам 13 штаммов (М-5, М-12, М-15, М-16, М-17, М-31, М-34, М-35, М-39, М-87-4, М-84-4, М-2-10, М-48-9-7) отнесены к Bacillus thuringiensis subsp. dendrolimus; два штамма (М-25, М-27) - к Bacillus thuringiensis subsp. galleriae; два штамма (М-35-8-1, М-35-14-5) - к Bacillus thuringiensis subsp. alesti.

По размеру колоний штаммы разделены на три группы:

1) мелкие - размер колоний от 3 до 12 мм (М-31, М-34, М-87-4, М-84-4);

2) средние - размер от 8 до 15 мм (шт. М-5, М-12, М-15, М-16, М-17, М-25, М-27, М-35, М-39, М-48-9-7, М-35-14-5);

3) крупные - размер от 15 до 17 мм (М-2-10, М-35-8-1).

Результаты физиолого-биохимических реакций, проведенных на исследуемых штаммах, сравнивали с ключом, предложенным в 1962 г. французскими учеными Баржак и Бонфуа (Barjac H.de, Bonnefoi А., 1962). При сопоставлении можно заметить, что выделенные из биоценозов Монголии штаммы, обладают большей лецитиназной активностью, что, по Туманову, является признаком высокой биологической активности. Интересно отметить, что штамм М-16 имеет сычужный фермент, образуя плотный сгусток в молоке.

Штаммы серотипа alesti М-35-8-1, М-35-14-5 образуют на солевой среде розовый пигмент, а на картофеле штамм М-35-14-5 образует желтый пигмент, а М-35-14-5 - розовый пигмент.

При определении биологической активности были взяты штаммы М-25, М-35-8-1, М-12. Для контроля был взят штамм К-78 (регенерация типового штамма № 49 subsp. dendrolimus). Объектом определения биологической iZ€ активности были взяты непарный шелкопряд, зимняя пяденица и крапивница. Все исследуемые штаммы показали высокую биологическую активность.

Гибель тест-насекомых была 90-100 %.

При изучении биологии микроорганизмов важное место занимает вопрос о составе питательных сред. Для эксперимента были взяты зерноотходы как источники азота, а в качестве источника углерода использованы глюкоза и мелассы.

На средах, содержащих различные зерноотходы, обогащенные глюкозой, у исследуемых штаммов больший выход спор, чем на средах, не содержащих глюкозу (табл. 17). Для опыта были взяты 4 штамма: М-25 (subsp. galleriae), М-35-8-1 (subsp. alesti), М-12 и М-15 (subsp. galleriae). Наиболее высокий титр (накопление микробных тел) дали штаммы на средах с отрубями и мучкой ячменной, обогащенной глюкозой. При определении потребления глюкозы (табл. 18) важное место занимает вид отхода. Наиболее полно потребляют глюкозу штаммы на средах, содержащих отруби и мучку ячменную. Штамм М-35-8-1 (subsp. alesti) на среде с мучкой ячменной потребляет моносахарид в большом количестве (0,21 %). Наименьшее потребление глюкозы наблюдается на средах, содержащих серую мельничную пыль и лузгу ячменную.

Все штаммы, включая и контроль К-78, на среде с мучкой ячменной хорошо усваивает глюкозу.

В ходе эксперимента глюкоза была заменена мелассой, которая преимущественно состоит из сахарозы. Были взяты три вида зерноотходов (отруби, кормовая мучка ячменная, серая мельничная пыль). Штаммы трех серотипов: М-25 ( subsp. galleriae), М-12 (subsp. dendrolimus), М-35-8-1 (subsp. alesti) выращивали на питательной среде с добавлением зерноотходов. По таблице 20 видно, что при увеличении зерноотхода с 1 до 2 % у штамма М-25 (subsp. galleriae) на отрубях идет увеличение спорообразования (до 73 %), а на кормовой мучке снижается (с 43,7 до 14,3 %). На 2 % серой мельничной пыли спорообразование увеличивается с 26,3 до 36,7 %. При увеличении зерноотходов до 3 % идет снижение спорообразования на всех средах. Для штамма М-35-8-1 (зиЬэр. акБЙ) при увеличении отрубей с 1 до 2 % спорообразование увеличивается с 69 до 75 %, на отрубях - с 30 до 38 %. При увеличении зерноотхода с 2 до 3 % на отрубях накопление спор увеличивается до 45,5 %, тогда как на кормовой мучке и серой мельничной пыли идет снижение спорообразования.

Для штамма М-12 (эиЬзр. с1епс1гоНтш) при увеличении отрубей с 1 до 2 % идет увеличение спорообразования (с 70 до 81,2 %), на кормовой мучке и серой мельничной пыли увеличение с 51,5 до 66,7 % и с 35,7 до 46,0 % соответственно. При увеличении зерноотходов до 3 % идет снижение спорообразования. На отрубях спорообразование составило 56,5 %, на серой мельничной пыли - 22,5 %, на кормовой мучке- 48,5 %.

При изменении количества зерноотходов с 1 до 3 % идет изменение накопления титра микробных тел.

Для штамма М-25 (эиЬзр. £а11епае) при увеличении отрубей с 1 до 2 % титр увеличивается почти в 2 раза (с 656 млн. спор/мл до 1038 млн. спор/мл), на серой мельничной пыли титр с 536 млн. спор/мл до 778 млн. спор/мл, на кормовой мучке - с 506 млн. спор/мл до 972 млн. спор/мл.

Для штаммов М-35-8-1 (зиЬзр. аЬэй) и М-12 (зиЬБр. с^пёгоНтш) титр увеличивается на средах с 2 % зерноотходов, а при 3 % - снижается. Самый высокий титр культуры дают на средах с 2 % отрубей и кормовой мучкой ячменной.

Если сравнить накопление микробных тел на средах с зерноотходами, содержащих глюкозу и мелассу, то можно заметить, что при замене глюкозы мелассой титр на всех видах зерноотходов увеличивается. Это связано со сложным составом мелассы, содержащей дисахариды. Как мы знаем, источники углеродного питания влияют на процесс спорообразования, накопление титра микробных тел.

Таким образом, самой оптимальной питательной средой, на которой идет высокое накопление титра и большой выход спор являются: для штаммов М-25 (subsp. galleriae) и М-12 (subsp. dendrolimus) среда с 2 % содержанием отрубей, а для М-35-8-1 (subsp. alesti) - среда с 2 % содержанием кормовой мучки ячменной.