Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Встраивание и вырезание ретротранспозона МДГ4 в геноме DROSOPHILA MELANOGASTER

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Встраивание и вырезание ретротранспозона МДГ4 в геноме DROSOPHILA MELANOGASTER"

Ее;

С";

О

сг

иэ

■— г^ 1- ^

На правах рукописи

КУЗИН АЛЕКСАНДР БОРИСОВИЧ

ВСТРАИВАНИЕ И ВЫРЕЗАНИЕ ' РЕТРОТРАНСПОЗОНА МДГ4 В ГЕНОМЕ ШОЗОРШЬА МЕЬАГОСАЭТЕЕ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

•I

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1995 г.

Работа выполнена в лаборатория подвижности генома Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН

Научный руководитель - академик РАН, профессор, доктор биологических наук Ильин Ю.В.

Официальные оппоненты - член-кореспондент РАН, профессор, доктор медицинских наук Корочкин Л.И.

доктор биологических наук Иткес A.B.

Ведущая организация - Институт биологии раззития им.Н.К.Кольцова РАН

Зашита состоится '/У " -Л 1995г. в часов на

V

заседании диссертационного совета Д 002.79.0ir при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 117964, Москва, ул.Вавилова, д.32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН Автореферат разослан

(X —¿доя».г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат химических наук / А.М.Крицын

Актуальность проблемы.

Ems в двадцатые годы 20 века на основе хромосомной теории наследственности Морганом была- высказана догма о неподвижности генома, согласно которой, каждый ген занимает определенное место на определенной хромосоме. Через несколько десятилетий зта до г v. а была подвергнута сомнению. Б.Мак-Клинток на основе генетических экспериментов высказала предположение о существовании мобильных генетических элементов, способных к транспозиции из одного сайта в другой и оказанию влияния на экспрессии прилеяаших к ним генов (B.McClintock, 1956). Erne через несколько десятилетий из генома х»вотных при анализе- активно транскрибирующихся последовательностей были выделены и охарактеризованы эти генетические элементы (Ilyin Y.V. et. al., 1978; Finnegan D.J. et.. al., 1978). Обильные элементы имеются во всех клетках зукариот и могут составлять до 10s' всея ядерной ДНК.. Ретротранспозоны - один из классов мобильных элементов, использующие в своей жизненном цикле механизм- обратной транскрипции lArchipova I.E. et.al., 1966).

Ретротранспозоны являются факторами генетического разнообразия и нестабильности живых организмов. В результате перемещения по геному' ретротранспозоны становятся причиной .многочисленных мутации. Таким образом, изучение механизмов ■ перемещения мобильных элементов (их встраивание и" вырезание) представляется важной~задачея в понимании процессов, в результате которых генетический материал клетки претерпевает изменения как бы за счет "собственных ресурсов". Хотя прошло около 20 лет активных исследования по изучению молекулярно- биологической роли ретротранспозонов, но механизмы транспозиции остаются малоизученными, а объясняется это в основном отсутствием подходящих моделей для исследования. В обычных условиях всякие перемещения ретротранспозонов происходят довольно редко с вероятностью порядка 10~6, что затрудняет работу по изучению механизмов'перемещения. Б этой связи большой интерес для изучения процессов встраивания и вырезания ретротранспозонов представляет Мутаторкая линия^ВгоБорМЛа raslanogaster (Kin A.I. et. al.,.1990, -Lyubomlrskaya N.Vv et. al., 1990), ■ в которой с высокой вероятностью (10"s-10"4 > происходят перемещения, . мобильного

элемента МДГ4. Именно ка зтоя линии и были проведены все наши эксперименты. •

Цель работы.

В настоящей диссертации делается попытка исследовать на

примере Мутаторноя линии Drosophlla me lañogaster возможность

транспозиции отдельной семьи ретротранспозона МДГ4. В частности е "

работе проанализировавши* места встоаивания МЛК5 в новые геномные

* \ , сайты с последующим вырезанием из них.

Научная новизна и практич'екое значение работы.

В данной работе получены ' новые, генетические системы на основе Мутаторноя линии Drosophlla melanogaster, более удобные для изучения генетической нестабильности, которая вызываётся перемещениями ретротранспозона МДГ4. В работе получены доводы в пользу того, что транспозиция МДГ4 в Мутаторноя линии носит сложный многофакторныя характер. В процессе транспозиции вероятно' принимает участвме две- группы факторов: гены ретротранспозона ЙДГ44' и хромосомные гены хозяина. Это предположение дает возможность обьяснить высокую частоту реверсий мутаций и появление новых мутация, вызванных перемещением МДГ4 по геному в . Мутаторной .линии. Сами реверсии, являются результатом в.ырезания. Есего ретротранспозона с точным восстановлением нуклеотидных последовательностей генов cut и forked, на 'которых изучалась транспозиция МДГ4. Активная транспозиция МЛГ4 может происходить только в присутствии транспозиционо активного варианта ретротранспозона в геноме с мутацией flan, причем частота транспозиции зависит от генного окружения данной мутации.

С практической точки зрения, мобильные элементы привлекают к себе внимание как перспективные эукариотические Бектора. Возмояность использования ре т р от ргке по з о ко в в качестве векторов требует понимания механизмов их функционирования транспозиции, ' поэтому изучение механизмов встраивания и вырезания классического представителя ретротранспозонзв МДГ4 представляется весьма важный и необходимым.

Апробация работы. . ,

Материалы, работы представлялись.. ка, МглународкоЯ конференции

ЕМВО по транспозонам ( Франция, 1993); 13-оя Европейской Drosophlla конференции 1 Греция, 1993); МедународнЬя конференции по молекулярной биологии на границе 21 века ( -Россия, .1994); конкурс научных работ ИМБ РАН (1-ое место, 1994). По материалам диссертации опубликовано в печате 4 работы. .

Обьем и структура диссертации. \ •

Работа из ложи а на 75 страницах машинописного текста, илппстрировака 7 рисунками it - 3 таблицами. Диссертация включает: обзор • литературы, экспериментальную часть, ■ обсуждение результатов, выводы и список цитируемой литературы ( всего 123 источника). ]

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1.Отбор ревертантов в линиях MSf и КБп1.

В начале работы по- изучению' механизмов интеграции и эксиизии ретротранспозонов были взяты три forked мутанта, полученные независимо друг от друга в разное время. Все три иутанта являются производными Мутаторной Линии (MS), которая ведет свое происхождение от-Стабильной Линии 1SS). (Kin A.I. et. al., 1990, Lyubomirskaya N.V. et. al., 1990, Lyubomirskaya N.f. et. al., .1993). Мутант - MSf - был обнаружен как спонтанная "мутация в MS несколько лет назад. Два других мутанта MSn и MSn", были получены в результате введения с помощью иикроинвекция в эмбрионы мух SS-линии со стабильной мутацией в white гене трзнспозиционно активного варианта МДГ4 (Kim A.I. et. al., 1994). Вводимая конструкция МДГ4 была в векторе Casperv содержащем ген white, поэтому ожидалось окрашивание глаз у трансгеных мух, но ■ эти два мутанта не имели окрашенных глаз и исходно были отобраны для анализа из-за возникшей у них •мутации forked. Для доказательства, что зто действительно трансформанты, воспользовались методом ПИР для обнаружения интегрированной в геном конструкции с МДГ4. Для-этого использовали один праймер из района длинного концевого повтора МПГ4, который давал начало для реакции полимеризации в сторону 5'-конца МДГ4, а второй - из начала кодируется части гена white с координатами 36T5-3S55 (О'Наге К. et. al.. 1934)', который давал начало для реакции полимеризации в сторону 5"-конца гена

white. В результате проведения • ПЦР образовывался фрагмент размером О.бкЬ, -полностью соответствующий ожидаемому. Четыре ревертанта из MSf-линии и четыре ревертанта : из MSn1 -линии были получены спонтанно. Ревертантов отбирали среди самцоЕ первого поколения от скрещивания мутантных самцов (w f) с самками, у которых Х- хромосомы сцеплены и маркированы yellow. Это делалось для того, чтобы -исключить кроссинговер мез^ау гомологичными X-хромосомами. Как правило, ревертанта появлялись^ пучками (см.таб. N1). Для мутанта МЗа1 было просмотрено 5214 самцов - частота реверсии составила 7.6*10"4, а для MSf просмотрели 5S03 самцов -частота реверсии составила 7.1*Ю-4.. Линии для анализа были предоставлении Кииом А.И. и Худаябергеновоп Б.М., за что автор выражает свои.благодарность.

Таблица HI.

Размер пучков реЕертантов в мутантных линиях MSn1 и MSf.

N линии ! кол-во самцов ревертантов ! кол-во самцов мутантов

w f ! w f

MSn1 *1 3 !. S3

MSn1 "2 4. • . .! 74

MSn1+3 4 ! 94

tan"4 1 ! 23

MSf*l ■ 4 ! 40

MSf *2 3 ! 26

MSf*3 1 . ! 43

MSf* 4 3 ! 41

1 **

2. Вырезание МДГ4 из локусов forked в линиях MSf, ?.'Sn и М?гГ.

Определение места встраивания МЛГ4 у мутантов и их ревертантов проводили с. использованием метога

Southern-блот-гибридизащш. На рис. 1 представлена рсстрккткзя-карта локуеа forked с известными вставками Ц2Г4. Предварительно, выделив-ДНК «з мух линий MSf, MSn1, M5ns , ¡-¡Зг* 1-4, '13 rf4 !.-4 и исходной SS-линии, обработали ее рестриктазами SalGI и KpnI. Затем провели электрофорез в Х% агарознои геле и ■ после■переноса

f

—Г

SalG1

MSf, MSn1, MSn2 fk,f 5 f 1

Kpn1 EcoRI

и

forked

.3 __ 6

.5'

3 \y 2

Рис. l. Карта локусa forked с известными вставками МДГ4 (gypsy)..

I

" i

FORKED

SS 5'-СССЛГСС(5САХССАСАТССвСАСС-3'

Mst.Msn ,MSna

* QYPSy ITR 1

i HE

Б'-СССАТССбСДГССАААХТЙЗА - GTPSY - TGTTAACTTCCACAICCGCACC-3'

- grpsy

REV ERSIOi! E5'-CCCAICCGCATCCACAICCGCACC- 3'

Рис; 2. Нукяеотздная последовательность гена forked с места встраивания.и вырезания МДГ4 I gypsy» в линиях №Sf, MSn' , MSr? и их ревертаатоЕ.

S

" - с

ДНК. на нейлоновый фильтр провели гибридизацию с 5.4kb 5alGI-EcoRI фрагментом из плазмияы содержащей участок, гена forked 0. aslanogaster с. координатами 13.1-18.5i:b (Hoover К.К. et. al., 1993 ). В линиях liSf, МЗп1 и МЗг2 фрагмент 3.5kb KpnI-Kpnl отсутствовал, а вместо него появились два новых l.SKb KpnI-Kpnl и 7.4fcb KpnI-Kpnl. У всех ревертактов и исходной 25 линии присутствовали все ожидаемые фрагменты ДНК без изменения.

После обработки ДНК мух рестриктазами Kpnl и Pstl и Scuthera-Слот-гибридизгиии с 2.3'kb KpnI-PstI фрагментом (координаты 14.6-16.9kb) из плазмиды, содержаще:! участок гека forked D.mslanogaster с координатами 13.1-13.51:Ъ. (Hoover К.К. et. al., 1993), з линиях мух M3f, MSn1 и МЗгГ вместо 2.3kb Kpnl-.Pstl фрагмента ДНК появились два новых фрагмента' l.Skb KpnI-Kpnl и 6.2kb KpnI-PstI. Во всех ревертантах и исходной SS линии никаких изменения s размере ожидаемого фрагмента ДНК обнаружено не было. Таким образом, удалось локализовать вставку МЛГ4 в локусе forked !см.рис.II и определить ориентации ретр'отранспозона. Полученные данные позволили так же'предположить, что в ревертантах произошло полное вырезание МДГ4.

Точное определение места встраивания МДГ4 s локусе forked в • i ^

линиях M3f, MSn и MSn проводилось с помошь» технологии полимеразноя цепноя реакции* (ПЦР). Были изготовлены четыре двадцатинуклеотидных праймера. При этом два праймера N1 и N2 были 'комплементарны друг другу и расположены в районе сайта .рестрикции Xhol длинного концевого повтора (ДКП1 МДГ4, а' два других были расположены Еблизи места встраивания МДГ4 в локусе forked с координатами N3 - 16325-16344 и N4 - 16940-16921 (Hoover К-К. et. al.r 1993). ПЦР проводили по стандартной методике, праймеры N1 и N4 давали фрагмент "0.62kb, а праймеры N2 и N3 - 0.4Skb. Анализ последовательности дакых фрагментов показал, .что МДГ4 встроился во всех трех случаях з одно и тоже место, вызвав при этом дупликадио сайта-мишени ТССА 'с координатами 16513-16516 (Hoover К.К. et. al., 1993) (см.рис.2). Место дупликации находится б третьем экзоне 2.5kb транскрипта гена forked. При анализе места' вырезания в ревертантах использовали праймеры N3 и N4. В результате проведения ПИР получили фрагмент ДНК размером 0.62kb. Анализируя нуклсотиднус последовательность места вырезания у получаемого фрагмента ДНК было установлен^, что УЛГ4 вырезался

полностью и последовательность гена.forked восстановилась точно у всех ô спонтанных ревертантов lcti.puc.-2 ).

Интересен eau факт трех совершенно независимых случаев встраивания ЙДГ4 в одно и тоже место с точность» до нуклеотида. Это дает основание отнести его к местам предпочтительного встраивания МДГ4.. Рассматриваемая случаи уникален. Приходится говорить о " специфичности, поскольку случайный характер встраивания, по видимому, можно отбросить. Интересно также, что саят дупликации оказался ТССА, который кэ соответствует списанным ранее местам встраивания ИДГ4. В ранних работах, было показано, что ретротранспозон МЛГ4 часто встраивается s TATA бокс различных генов D.œelanogaster, а на оснозе Солее поздних данных был предложен консенсус последовательности 5'-TAYATA-3'( где Y-пиримидиновое основание - чаща всего Т), как излюбленное место встраивания .-.¡4ДГ4 . tsandneyer S.В. et. al., 1990). В самое последнее время ка основе большей выборки нуклеотидную последовательность сайта-дупликации определили, менее строго -PyrPurPyrPur. Обнаруживаемые исключения, по-видимому,не отвергают правила встраивания ЫДГ4, а только свидетельствует, что механизм встраивания является сложным и комплексным, зависящим не только от специфичности интегразы и места встраивания, но и от других факторов, - .принимающих участзие в интеграции новых копия ретротранспозона, в настояшлй момент неизвестных.

3. Отбоо иеведтактоз в линии MScf.

Точное востаковлекие ■ нуклеотиднея последовательности гена forked в случае рэвертируюших производных из линия JSf и ISn не удивительно, т.к. система отбора резертансв бала селективна ао отношению точного вкрезаиия МДГ4. Мобильный элемент бал встроен s третий зкзок 2.5Кз трапскрипта forksü. Поэтому фенотипичееки ревертанты могли возникнуть только s результате,полного вырезания МЛГ4 с точным"восстановлением последовательности гена forked, а в случае неправильного влезания ЩГ4 с оставление^ хотя бы одного нуклеот'.*.да, мутация должка была сохраняться. Ояисанныз. ранее случаи реверсия мутация, причиной которих яелрлось встраивание ретротранспозоков в сответстзуст;;е яокусы, ' были обычно выззгны неполным удалением ыз. регуляторкой области или нитрона хозяйского гена мобильных злеаентог (Mlzrokhi L.J. -et. а!., 1925, Carbonare

» (

B.D. et. al., 1985, Junakovlc N. et. al., 1SS7). В месте встраивания ретротранспозона сохранялся один из длинных концевых повторов (ДКП) ретротранспозона, который часто становился мишенью для повторной атаки мобильным элементом, что снова приводило к восстановлению мутации. Таким образом, такие реверсии были неустойчивыми, имели высокую частоту возврата к мутантному фенотипу и авторы дахг дали название этому явлению - "генная память" ' iMizrokhi L.J. et'. al., 1985).' Было выдвинуто предположение, что вырезание и обратное встраивание ретротранспозона происходят в. результате генетической рекомбинации между его ДКП. Причем понятно, что рекомбинация между ДКП должна происходить значительно чаде, чем между дупликациями сайта-встраивания хромосомной ДКК, которые имеют длину всего 4 нуклеотида. Следовательно, точное вырезание по этому механизму должно происходить.крайне редко, ко обнаруженное нами точное вырезание ЩГ4из локуса forked в линиях MSÍ и iîSn1 происходит с высокой частотой и, по-видимому, не может быть об«яснено рекомбинацией между дупликациями хозяйской ДНК-мииени без участия каких-то еще дополнительных факторов. По этой причине, мы предполагаем существование специфического механизма точного вырезания ЫЛГ4 в генетической системе Мутатсрноа линии. .

Работая с линиями М5Г ,îf MSn1 , мы получили данные, которые говорят только о существовании неизвестного . механизма точного вырезания, но выяснить соотношение между случаями точного и неточного вырезания МДГ4 не представлялось возможным из-за селективности самой системы, о чем говорилось выше. Была создана ровая Мутаторная линия MScf, на которой, можно было определить соотношение между двумя механизмами вырезания ретротранспозона, и к тому же, она была более жесткой в- отношении контроля от~ случайного засорения линии. - Мы считали, что в этой линии кроме-мутации white должка сохраняться при реверсии ese одна видимая мутация, вызванная МСГ4, чТЬ являлось хорошим контролем от засорения.

Линия MScf была получена из лабораторной линии мух D.ne laño gas ter FM3, y В/ se- ее cv et v g2 f (tladsley D. et. al., 1985) введением в геном SS линии мутаций et ¡i t, которые фенотипически были идектифицированны как мутации et® и Г1 . Затем • самцов MScf (w 4et6 f1 ) скрещивали с самками, у которых X-

хромосомы сцеплены и имевт мутацив yellow. В потомстве от этого скрещивания просматривали только самцов, отбирая для дальнейшего анализа ревертантов по генам cut и/или forked. 'При таком скрещивании исключали генную конверсию между гомологичными X-хромосомами. Для дальнейшего анализа было отобрано: один ревертант по, гену, cut (MSc*C), два ревертанта по гену forkad (M5cf'1'l и ) и четыре-двойных ревертанта^которых реверсия

произошла- одновременно по дзуы генам cut и 4iorked tГ1"I, VSc+t*2, МБс^Г^З и MSc^f^). Как правило рзвертанты получались пучками -(см.таб. N2). Есего . было просмотрено 29394 самцов, частота реверсии составила 2.4*10"4 . Линий для анализа" были предоставлении Кимом А.И. и Худаябергеновой Б.М., за что автор выражает сво» благодарность.

Таблица N2.

Размер пучков ревертантов в мугантноя линии MScf.

N линии ! кол-во самцов ревертантоз кол-во самцов мутантоЕ

! wct6i fI+ ! V ct6* I1*

MSc+f ; j ! 74

MScf - 1 ;.*... • l

MScf ^ 2 * ж 1

MSc"f4 ! 1 ». 16

MSc*f*2 ! 7 ! ■ 24

MSc*f*3 ! 16 ! 30

MScV4 ! 6 ! 74

^ Примечание: *, -анализ на пучки нг проводился.

4 .Супрессия мутация cut и forigii в линиях

MSf. MSn1. KSns и ЩсГ. •

Одну из возможных, причин возникновения отобранных - для изучения мутация cut и forked связивапи со встраиванием Ш1Г4. Проверка такого " предположения предусматривает возшзкассть супрессирования мутация в сочетания с известными супрессораын МДГ.4 .. Для ..этого .использовали две линии мух D.selanosastsr,

г

■J о * ад»лди

MSf.MSn ,MSn ,MScf D/+, XX

cf X Q ■

| wc _

\ii v л Xa/su(Hw)9 +moda?XX

D/+ (J X (J ' )<a/su{Hwr+moda,XX

^ i

jO* MC

a .. mc Xa/su(Hw} +moda,5&

(j D /su(Hw) +moda^O .

D /su(Hw}2+moda^ -f-

a

MC „ MG

и su(Hw) +rnoda/su(Hw) ¡moda

su(Hw)2+moda/su(H\v) *moda

и с

I

Ркс.3. Схема скрещивания с целью супрессии мутации forked и

cut, вызываемых МДГ4 в новых Мутаторных линиях MSf, f.Sn1 , MSiF и

' , .!

fficf. 1 n 1

поддерживаемых на сцепленых Х-хромоссмах и несущих в своей геноме: следующие аутосомы с генами X /su(HwJ~+noda;

МС 1 а

Xa/su!Hw) +войа и D/+, о которых известно, что они могут супрессировать и модифицировать ' многие мутации вызванные встраивание« ШГ4. Линии были предоставлении Георгиевым П.Г., за что автор выражает cbod благодарность. -

В первое скрещивание брали самцов MS-линий MSf, MSn1, MSn2 и MScf и скрещивали с самками D/+,' сцеплеными с Х-хромосомами: В потомстве для дальнейшего скрепивания отбирали только самцов с фенотипом D/+. Это делалось для того, чтобы одна из аутоссм была помечена в MS-линиях, т.к. сами гены супрессоры фенотипически не проявляется (см. схему скрещивания, рис.4). Во втором скрещивании отобранных самцов скрещивали с самками Xn/su( Hwr+noda. и XQ/sufHw)MC+moda, в их потомстве отбирали только самцов с генотипом D/suiHw)2+inoda и D/suiHwJ^+moda. Данные супрессоры -рецессивные, поэтому необходимо было сгомсзкготитъ по ним исследуемые линии. Линия с супрессором su(Hw)2 содержит мутацию stb (short bristle), что затрудняет проверку супрессии мутации forked. В третье скрещивание Орали отобранных самцов и снова скрещивали с самками Xa/5uiHw)MC-t-m>da, в потомстве которых отбирали только самцов с генотипом suiHwr+Boda/sulHw^+moda и su(Hw)wc+moda /su(Hw)MC+moda и смотрели, произошла ли супрессия интересующих нас мутация или нет. Анализ потомства от этих скрещиваний показал, что мутации cut и' .forked в линии ' MScf супрессируются, в то время как мутация forked в линиях MSf, MSn1 и MSn2 не супрессируется.

5.Вырезание МДГ4 из локуса forked в линии MScf.

Для проверки того, что в новой Мутаторной линии MScf мутация forked соответствует известной уже мутации f1 (Hoover К.К. et. al., 1993), воспользовались методом' Саузерн-блот-гибридизации. ДНК из мух линия MScf. MSc"f, MScf* 1-2, MScT'i-2 и исходной S3, после обработки рестриктазами Kpnl и PstI • и фракционирования электрофорезом в агарозном геле, переносили на нейлоновый фильтр, который гибридизовали с фрагментом. 2.3kb Kpnl- PstI (координаты 14.6-16.9kb) из плазмиды, . содерзащеи участок локуса forked с координатами 13.1-16.5kb (Hoover К.¡С. et. al., 1993 >■ (см.рис.1). У мутанта MScf и MSc*f фрагмент 2.3kb KpnI-PstI отсутствовал, но

(

FORKED 5'-CTCGTATATATCCTCC-3'

'gypsy

SS

VL.TR W LTR ¥ MScf 5' CTC GTATATA AGT T - GY P SY - A AT T TATATC CTG С - 3' MSc+f

MScf 1,MScf 2..■ MSc+f+1-4

^ -gypsy

5'-CTCGTATATATCCTCC-3'

Рис. 4." Нуклеотидная последовательность гена forked в месте . встраивания и вырезания МДГ4 1 gypsy) в линии M3cf и ее резертактах. - • ' ч ' ■

вместо него появились два новых фрагмента 2.5kb Pstl-Kpnl и 5.6КЬ KpnI-KpnI. У всех остальных ревертантов и исходной S5 линии присутствовал фрагмент KpnI-PstI нормального размера 2.3kb. Таким образом показано, что действительно мутация forked соответствует f* и МДГ4 встроен в интрон гена forked. Кроме того, можно сказать, что, по-видимому, у всех ревертантов по' гену forked произошло полное вырезание МДГ4.

Точное определение места встраивания и вырезания МДГ4 в локусе forked у мутанта MScf осуществляли с помощью ПНР. Для чего были синтезированы два двадцатинуклеотиднах праимера, удаленых приблизительно на -200 нуклебтидов от предполагаемого места встраивания МДГ4 в мутации f1 (см.рис.1). Праамеры имели координата N5 - 15872-15853 и N6- 15486-15505 (Hoover К.К. et. al., 1993). Амплификации проводили по стандартной методике. Для мутанта MScf и MS с*" f брали праймеры N1 и N5 и получали фрагмент 0.4kb. Праймеры Н2 и N6 образовывали фрагмент 0.49kb. Полученные фрагмента секвенировали. по методу Сенгера. Из' анализа последовательности следовало, что сайтом дупликации геномной ДНК,_ вызванным встраиванием МДГ4, является роследователькость TATA (позиция 15672-15675) (Hoover К.К. et. al., 1993 ). Последовательность гена forked в зтсй области приведена на рисунке 4. Для ревертантов по' forked амплификацис проводили с двумя примерами из геаа.forked .N5 и" Ц5, получаемые фрагмента, размером О.ЗЭкЪ секЕенировали. Анализ последовательности места вырезания показал, что во всех случаях МДГ4 полностьо отсутствовал и последовательность гена forked восстановилась точно.

6. Вырезание МДГ4 из локуса cut §. линии MScf.

Cut мутация в MScf была идентифицированна как мутация ct6. Для уточнения места положения МДГ4 в гене cut, воспользовались известными рестрикциоиными картами локуса cut с различными вставками ( Jack J.W., et. al., 1965, Tcfcurikov N. A. et. al., 1959). Выделенную ДНК из мух линии MScf, MSc*f, MScf,'l-2, MSc*f*l-2 и исходной SS обработали рестриктазамй EcoRI и SalGI. Рестриктные пробы фракционировали с помощью электрофореза в • агарозном геле, провели блот перекос кг нейлоновый фильтр и провели гибридизацию с 2.5кЪ фрагментом SalGI-EcoF.I из г.лазмиды,

л

gypsy

Рис. 5. Карта локуса cut со вст&г.кой !'ДГ4 !gypsy) s мутации ct6 в новой Мутаторнся линии MScf.

содержащей_участок локуса cut с. координатами от -7.2 до +1.1 (Jack J.W., et. al., 1935) (см.рис.5!. Линии "MScf, КЗсГ 1 и MScf*2 вместо нормального фрагмента 2.5kb SalGI-EcoHI дали два новых фрагмента' 1.5КЪ EcoPJ- EcoRI я 8.2kb SalGI-EcoEI. У остальных ревертантов и исходной 5S линии рассматриваемый фрагмент остался без изменений. Из, предыдущих исследования было известно, что рядом с местом встраивания МИГ4 находится сайт рестрикции Clai'(Mlzrokhi L.J., et. al., 1935), поэтому тот же самый блот перегибридизовали с 1.4kb Clai- EcoHI фрагментом из плазмиды содержащей участок локуса cut с координатами от -7.2 до *1.1 (Jack J.W., et. al., 1965), но радиавтограф блота от этого не изменился. Таким образом смогли локализовать место встраивания МДГ4 в локусе cut и его ориентацию е нем. Из анализа блота можно так же предположить, что в ревертантах МДГ4 вырезался полностью.

Для локуса cut" _ не была известна нуклеотидная последовательность из района мутации ct6 , поэтому пришлось секвенировать ее по методу Максама-Гилберта от близлежащего к месту встраивания МДГ4 рестриктного сайта Clai, который был известен из работы Л.-Мизрохи с коллегами (Mizrokhl L.J., et. al., 1985). Плазмиду, в которой был проклонирован участок гена cut с координатами от -7.2 до +1.1 (Jack J.W., et; al., 1995), обрабатывали рестриктазои Clai и метили цитозиком с радиоактивным. ^ фосфором 32. Меченную пробу обрабатывали рестриктазами EcoRI я SalGI, фракционировали. рестрикты электрофорезом в 3.55 - акриламидном геле и выделяли меченные фрагменты 1.1kb Clal-SalGI и 1.4kb Clai- EcoRI. После определения нуклеотидной последовательности (прочитано было около 500 п.к.) сиитезировли праймер N7 с координатами 246-265 . (см. нуклеотидную последовательность района мутации ct6, таб.3}. С праямерами N1 и N7 провели ПИР с ДНК выделенной из мух линий MScf, MScr'l M3cf*2. Получили фрагмент ДНК размером О.бЗкЬ, который отсеквекировали по методу Сенгера при помощи праямеров1 N1 и N7. Затем был синтезирован праймер N6 с координатами 502-519, с помощью которого по методу Сенгера отсеквенироЕали около 400 'п.н. плазмиды несушея участок гена cut с координатами от -7.2 до +1.1 (Jack J., et. al.f 1985). После этого был синтезирован праямер -N9 с координатами 605-786. С помощью праямеров N2 и N9 провели ПЦР с ДНК выделенной из мух линий MScf, MScf"l и MScf*2. Получили

CUT

SS 5'-GATCGATTGTTTGCACACGTTTTTG-3'

,+gypsy

MScf V LTR fo LTR1

5'-ATTGTTTGCAAGTT -GYPSY- AATTTGCACACGTT-3'

ЕЖЗВЗГЯ9

MScf+1,MScf+2

-1-gypsy

■ MSc+f 5'-GATCGATTGTTTGCACACGTTTTTG-3'

MScTl,MScT2 MS с +f +3,MS c*f +4

-ч

Рис. 6. Нуклеотмяная последовательность локуса cut з месте встраивания МДГ4 t gypsy) в линии M5cf и ее ревертаитах.

Таблица 3.

Нуклеотидная последовательность района мутации ct6.

ТАСАСТАССА GAAATCTTTC AATGTATACA . TATSTTATTA 40

ACTATGTATT АСТТААСАТА AGAAAGATAA ААТАСААСТА 80

AAATTAAATG TAAAATGAAG GTCACTTCGA ATTTGATATT. 120

TCACTTGTTA TCTTCATACA GGCCACATTA • GCATAATATA 160

JACCAGTAAT' ТТТССССАСТ GCAGCAAAAG GGAATTGTGG 200

TTTTCGTTGT TTTGTTCCGA AGTTGGCACT GCTGTTTTGT 240

TGCTGCTGGG GAGAGCGTTC TTTGGAAGTA GTTGTCGAAA 230

TGTTTTTATT TGTCATCGAT 7AATCGCTCG AATCAACAGG '320

CCAACAGTCG TCGCAGTTGT ACGGTGGCAG TTGCCCGATT 360

CCGATTATAG TTTCATGATT CAGATTCGGA AACTGAGAAG 400

СТСАТССССТ AAGATATACA ATACATATGC GCCTGTACCT 440 -

TAAAGATACA CAAATACTCT CGGCTCTTGG •AAATGTTGCT 460

GTGTAATTGT TTTGAAGTCT CGACTCGCAG ATTGGTAGCA 520

GACTGGCTGA CAGCCAACTC GGCCTCCAGA CGCAATCCCA S50 .

ATCGCTGTTC CAAGTCCCCA GATCCAAGCC AAAACCGATC 600

GGTGATTCCG АААССААСТС ACCCAGCGAT TTGCGGGCCT 640

GTCAAATCGC TGATTGATCG ATTGTTTGCA ' CACGTTTTTG 680

TGAGCGCATT TATTGAGTAT TTTATTAATT TCAACTGATC 720

. GATGAGCTTG CCGCCTGTTA CAATTGCCGC ТСТТТТТССТ 760

■ CGTTTAACTG CTGGTCTTTT TAATTGCGTG~ AAATCGGAAT SOО

AGGGGGCTCT TGAGAGTGGC G11 lT'lHGA ATGAACTTTA 940

AATTTTGGTA ATGGACCCTT ' TGCGGCGTGC ТТААСААТТС 360

TTGAAAGACA ATAAGG 696

фрагмент ДНК размером 0,43kb. После анализа нуклеотидноя последовательности выяснили, что из-за встраивания МДГ4 в ict6 сайтом дупликации стала последовательность TGCA с координатами 657-670. Для всех оставз1ихся ревертантов и исходной SS линия с noMOiibD праямеров N8 и N9 прозели ПЦР и получили фрагмент ДНК размером О.ЗкЬ. Анализ нуклеотидноя последовательности места вырезания МДГ4 показал, что ретротранспозон ушел полностью и последовательность гена cut восстановилась точно ео Бсех случаях реверсии по локусу cut (сы.рис.6). .

Анализ ревертантов М5сГ линии показал, что во всех случаях мы имеем дело только с механизмом точного Еырезания, а не с

механизмом генетической рекомбинации. Выяснилось, что механизм точного вырезания МДГ4 является слоаиюи целенаправленным и взаимосвязанным, так как .нельзя объяснить простом совпадением четыре одновременных реверсии по анализированным нами локусам cut и forked. Точность, высокая '-частота и одновременная характер вырезания МДГ4 из разных локусов генома указывает на существование специфического механизма, который вероятно возник в результате мутации у исходной SS линии и проявляется при введении з нее транспозиционно активной копии МДГ4.~ "

ВЫВОДЫ

Работа посвящена изучению механизмов встраивания и вырезания ретротранспозона МДГ4 з Мутаторной линии Drosophila selanogaster.

1.Найдена горячая точка встраивания для МДГ4 в локусе forked. В этом локусе МДГ4 вызвает дупликация ТССА, что отличается от известного ранее консенсуса места встраивания МДГ4 5'-TAYATA-3', где Y-пиримидиковое основание.

2.Впервые показано полное вырезание из геяомнах сайтов ШГ4 с точным восстановлением нуклеотидной последовательности генов cut и forked. .

3.Впервые сделано наблюдение одновременного вырезания МДГ4 цз локусов cut -W; forked с Чочным восстановлением нуклеотидных последовательностей этих генов.

4.Получены данные, показывавшие существование специфического механизма вырезания ИДГ4, - что является уникальным для-ретротранспозонов и ретровирусов".

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Кузин А.Б., Лсбомирская Н.В., -Худаябергенова 5.М., Ким А.И., Ильин ;0.В. Горячая точка встраивания ретротранспозона МДГ4 tgypsy) и его,точное вырезание из локуса forked D.sslanogaster.

. ¿оклады.академии наук, 1984, т.333, N5,' с.636-555.

2. Аобоммрская Н.В., ОЬстак Н.Г., Кузин А.Б., Худаабергенова Б.М., Ильин П.З., Ким А.И. Введение единичной транспозиционно-активной "копии ШЗГ4 в геном стабильной линии Drcsophlla nelanogaster вызывает генетическую ' нестабильность.. Генетика. 1S94; Т.ЗО,. Кб, с.743-748. ...

3 . Kuziri Ä.3., Lyubonirskaya N.V., Khudaiberge-iova З.М..

Ilyin Y.V., Kim A.I. Precise excision of retrotransposon gypsy from loci forked and cut in genetically unstable D.nslanogaster strain. Nucl. Acids Res. 1ЭЭ4, v.22, N22, p.4641-4645..

4s Кузин А.Б., Худайбергенова Б.М., Лобомирская Н.В., Ким А.И., Ильин D.B. Точное вырезание ретротранспозона МДГ4 (gypsy) из локусов cut и forked D.melanogaster. Доклады академии наук, 1995, т.340, HI, с.135-137.