Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ структуры и ретротранспозиционной активности двух вариантов мобильного элемента D. melanogaster МДГ4 (gypsy)

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ структуры и ретротранспозиционной активности двух вариантов мобильного элемента D. melanogaster МДГ4 (gypsy)"

на правах рукописи

Смирнова Юлия Борисовна

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И РЕТРОТРАНСПОЗИЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ДВУХ ВАРИАНТОВ МОБИЛЬНОГО ЭЛЕМЕНТА О.тсШодаягег МДГ4 {дурэу).

03. 00. 03. — Молекулярная Биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертациии па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1998 г.

Работа выполнена в лаборатории подвижности генома Института молекулярной биологии им.В.А. Энгельгардта РАН

Научные руководители:

академик РАН, профессор, доктор биологических наук Ю.В. Ильин кандидат биологических наук Любомирская Н.В.

Официальные оппоненты:

чл. -корр. РАН, доктор медицинских наук, профессор А.И.Корочкин доктор биологических наук Д.А. Крамеров

Ведущая организация:

Институт биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН

Защита диссертации состоится состоится 1998 года в/^." ч;

на заседании Диссертационного совета Д.002.79.01 при Институте молекулярной биологии им.В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 117334, Москва, ул. Вавилова, 32.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии им.В.А. Энгельгардта РАН

Автореферат разостлан "!?.." . .....СЗ...... . 1998 года

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы.

Одним из основных направлений современной молекулярной биологии является исследование вопросов функционирования генома эукариот, имеющего в высшей степени сложную структурную и функциональную организацию. Существенным компонентом генетического материала высших организмов являются мобильные генетические элементы. Так, у Drosophila melanogaster на долю последних приходится около 20% генома. Взаимодействие мобильных генетических элементов с другими клеточными генами носит сложный характер, причем, не только элементы влияют на экспрессию различных генов (в первую очередь близлежащих), но и клетка контолирует транспозицию мобильных генетических элементов, препятствуя их активному перемещению

Влияние транспозонов на работу генома, по—видимому, не ограничивается только функциональным взаимодействием, но осуществляется также на структурном уровне. Мобильные элементы (МЭ) могут встраиваться в различные участки генов, в их регуляторные, интронные и экзонные последовательности, что может приводить к изменению пространственной организации генетического материала и как следствие, влиять на экспрессию генов. В настоящее время известно, что большая часть спонтанных мутаций обусловлена инсерциями мобильных элементов. Поэтому транспозиции МЭ являются важнейшим фактором индивидуальной изменчивости организмов и могут играть существенную роль в процессах эволюции.

Элемент МДГ4 (gypsy) является одним из наиболее изученных ретротранспозонов Drosophila melanogaster, цикл транспозиции которого проходит через стадию обратной транскрипции.

Т.к. МДГ4 имеет сложную структуру и содержит в своем составе промотор, энхансер, сигнал полиаденилирования, а также и инсулятор — последовательность, влияющую на трехмерную структуру хроматина, то при внедрении элемента в регуляторную область гена могут происходить серии различных мутаций данного локуса. Встраивание же элемента в кодирующую часть гена приводит к полной потере генной функции. Спонтанные транспозиции мобильных элементов, как правило, происходят

чрезвычайно редко, но в некоторых системах, перемещения наблюдаются с повышенной частотой. Одним из таких примеров является система линии (МЛ) ОтозорЫ1а mela.noga.ster которая ведет свое происхождение от стабильной лабораторной линии (СЛ) и характеризуется продолженной нестабильностью: увеличенной до Ю-3 — 10~4 частотой спонтанного мутирования, нестабильным характером мутаций и активной транспозицией МДГ4 при неизменной локализации других элементов. Молекулярный анализ структурной организации МДГ4, клонированого из мух как МЛ, так и исходной для нее стабильной линии, выявил существование двух подсемейств ретротранспозона, имеющих четкие структурные различия. Изучение подобных систем является важным для понимания вопросов регуляции процессов транспозиции и взаимодействия генов на клеточном уровне.

Цель и задачи исследования. Данная работа посвящена дальнейшему исследованию структурно — функциональных различий двух вариантов МДГ4, выявленных в ходе изучения причин генетической нестабильности в Мутаторной линии С. те1аподаз1сг.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительный анализ структурных отличий двух вариантов МДГ4 на нуклеотидном уровне;

2. Создать набор гибридных конструкций содержащих различные комбинации двух вариантов МДГ4;

3. Получить стабильные трансформированные линии культуры клеток £>.Лус?ег, несущие гибридные конструкции двух вариантов МДГ4 ;

4. Провести анализ ретротранспозиционной активности гибридных конструкций МДГ4 ;

5. Сравнить кинетику амплификации и взаимовлияние двух вариантов МДГ4.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Использование в данной работе уникальной Мутаторной линии, которая ведет свое происхождение от Стабильной лабораторной линии и характеризуется всеми свойствами, известными для генетической нестабильности позволило существенно продвинуться в понимании

причин возникновения подобного явления.

Связь между транспозициями МДГ4 и генетической нестабильностью в МЛ вызывает повышенный интерес к исследованию структурной организации и транскрипционной активности элемента в этой системе. Хотя генетическая нестабильность может быть вызвана разными механизмами, наиболее вероятны в этом случае два из них: структурные изменения самого элемента (возникновение нового, более "активного" вида МДГ4) и мутации в регуляторных системах линий, приводящих к изменению уровня транспозиций МДГ4. Первая из указанных возможностей явилась предметом настоящего исследования. Впервые проведен подробный сравнительный структурно — функциональный анализ вариантов ретротранспозона МДГ4, выделенных из двух линий ОгояорЬИа те1аподаБ1ег, различающихся по уровню транспозиции этого мобильного элемента. В кодирующей области выявлено 14 аминокислотных замен. Созданы оригинальные гибридные конструкции, содержащие различные комбинации участков "активного" и "неактивного" вариантов МДГ4. Введение этих конструкций в культуру клеток Drosoph.Ua ¡\ydei позволило изучить влияние аминокислотных замен на различия в ретротранспозиционной активности двух вариантов МДГ4. Анализ способности образования новых копий ДНК гибридными элементами позволил выявить две аминокислотные замены, которые, по—видимому, оказывают существенное влияние на эффективность ретротранспозиции.

Анализ кинетики амплификации новообразованных копий МДГ4, показал, что функциональные различия двух вариантов носят количественный, а не качественный характер. Впервые продемонстрировано, что "активные" копии МДГ4 амплифицируются более эффективно, чем "неактивные", причем при совместном введении в клетки 0.куйе1 "активный" элемент способен ускорять амплификацию "неактивного", осуществляя транс—действие. Также впервые экспериментально показана зависимость скорости амплификации ретротранспозона от количества его копий.

Полученные результаты расширяют наши представления о функционально значимых участках ретротранспозонов, влияющих на активность элемента на пост—транскрипционном уровне. Использованные в работе подходы могут быть применены в структурно —

функциональных исследованиях ретротранспозонов и ретровирусов, а также в поиске мутаций, влияющих на их активность, что может иметь значительный практический интерес.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: The 3rd International Engelgardt Conference of Molecular Biology, Volga River, 1997; 8th European Students' Conference, Charité, Berlin, Germany, 1997; Keystone symposia on Molecular and Cellular Biology, Santa Fe, New Mexico, USA, 1997.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Структура и обьем работы.

Диссертация изложена на..............страницах, включая..............таблиц,

..........риунков, и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной

части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы из..........

наименований.

. Результаты исследования и их обсуждейие. '

1.1 Получение исходных конструкций. Исходные конструкции pGYP(Xho)6 и pGYP(Xho)7 (в дальнейшем сокращенно именуемые 6 и 7), были получены ранее Любмирской Н.В. и любезно предоставлены для этой работы. Они содержат клонированную полную копию элемента МДГ4 из стабильной (7) и нестабильной (6) линий! мух впоследствии модифицированную, таким образои.что 5'—длинный концевой повтор (ДКП) этих конструкций усечен до позиции — 30 относительно сайта инициации транскрипции [Arkhipova J.R., et al,1986].Т.е, указанные конструкции не содержат полноценный элемент МДГ4 (в них отсутствуют первые 200 пар нуклетидов, включая сайт рестрикции Xhol), но они могут транкскрибироваться, образуя полноразмерный РНК—продукт.

На основе этих плазмид (Рис. 1) были созданы 9 пар гибридных конструкций:

1.2. Получепие гибридных конструкций; 6/7 (Ncol) и 7/6 (Ncol) получены путем лигирования фрагментов Xhol—Ncol, размером 4.2 т.п.н., и Ncol—Xhol длиной 6.0 т.п.н. В первом случае фрагменты выделялись сответственно из плазмид 6 и 7, во втором — 7 и 6.

G/7 (AsuII) и 7/6(AsuII) созданы из набора фрагментов XhoI—AsuII длиной 7.4 т.п.н. и AsuII—Xhol длиной 2.8 т.п.н., выделенные в первом случае из плазмид 6 и 7, во втором — 7 и 6.

Конструкции 6/7(PvuII) и 7/6(PvuII) получены лигированием следующих фрагментов: EcoRI—PvuII длиной 2.7 т.п.н., выделенного в первом случае из плазмиды 6, и плазмиды 7 — во втором; PvuII—Xhol размером 4.5 т.п.н., выделенного из плазмид 7 и 6 соответственно; Xhol—EcoRI длиной 3.0 т.п.н., выделенного из плазмиды 6 в обоих случаях.

Для создания конструкций 6/7(ApaLI) и 7/6[ApaLI) использовали фрагменты Xhol—ApaLI длиной 8.1 т.п.н., ApaLI— Xhol длиной 2.1 т.п.н., которые были выделены,в из конструкций 6 и 7, и 7 и 6 соответственно.

Конструкции 6/7/6(Ncol—PvuII) и 7/6/7(Ncol—PvuII) получены путем лигирования фрагментов EcoRI—PvuII длиной 2.7 т.п.н., PvuII— Xhol длиной 4.5 т.п.н. и Xhol—EcoRI длиной 3.0 т.п.н.. В случае первой конструкции EcoRI—PvuII и PvuII—Xhol фрагменты выделяли из плазмид 6/7(Neo/) и 7/6(Ncol) соответственно, а во втором случае — наоборот. Фрагмент Xhol—EcoRI в обоих случаях был выделен из плазмиды 6.

Для создания конструкций 6/7/6(AsuII—ApaLI) и 7/6/7(AsuII— ApaU) использовали фрагменты: Xhol—ApaLI размером 8.1 т.п.н., выделенные из плазмиды 6/7(AsuII), и 7/(¡(AsuII) соответственно и ApaLI—Xhol длиной 2.1 т.п.н., полученные из плазмид 7/B(AsuII) и 6/7 {AsuII) соответственно.

Конструкции 6/7/6(ЛГсо/—AsuII) и 7/6/7{NcoI—AsuII) получены путем лигирования фрагментов Ncol—Xhol размером 6.0 т.п.н. из плазмид 7/6(AsuII) — в первом случае, и 6/7(AsuII) — во втором, и Xhol—Ncol длиной 4.2 т.п.н. из плазмид 6 и 7 соответственно.

Конструкции 6/7/6(PvuII—КрпГ) и 7/6/7 (PvuII—КрпГ) получены в результате лигирования фрагментов Xhol—Mlul длиной 5.2 т.п.н., Mlul—Kpnl длиной 1.0 т.п.н. и Kpnl—Xhol длиной 4.0 т.п.н. Фрагменты Kpnl—Xhol и Xhol—Mlul выделяли в первом случае из плазмиды 6, и 7

— во втором. Фрагмент М1и1—Крп1 выделяли из конструкций 6/7(РпШ)

— в первом случае, 7/6(РуиЩ — во втором.

Конструкции Ь/1/Ь(РуиП-МиЩ и 1/&П(Рт11-МиЩ получали ь по той же схеме, что и предыдущую пару. Единственным отличием было использование фрагментов Крп1— Х1ю1 (4.0 т.п.н.), выделенных из конструкций 7/6(Аяи11) и 6/7(Аяи1Г) соответственно.

В-1

Рис 1. Рестриктная карта базовой конструкции pGYP(Xüo)6. Сайты рестрикции: RI - EcoRI; К -Kpnl; Sm -Smal; Ба - BarnlO; С - ВдЦ- ХЪ - Xbal; N

- Ncol (кодон ATG); Ml - MJuI; Н - HindIII; Р - PsU; Pv - PvuII; As - Asull; Ap

- Apall; X - Xhol; Sp - Sphí Sal - SalGI. Звездочкой отмечены сайты рестрикции, отсутствующие в конструкции pGYP{Xbo)7, цифрами указано положение рестриктных сайтов в кодирующей части МДГ4.

Все процедуры клонироваия проводились как описано у Маниатиса с соавторами .

2. Сравнение нуклеотидной и аминокислотной последовательностей двух вариантов клонированных копий МАГ4.

На рис.2 представлена схема строения МДГ4, типичного ретротранспозона, имеющего длинные концевые повторы (ДКП). Тело ретротранспозона включает в себя: инсулятор — некодирующую белок область транскрипта, которая играет ключевую роль в воздействии на экспрессию близлежащих генов при инсерции МДГ4 в геном, и три

открытых рамки считывания (ОРС), аналогичных ретровирусным генам gag, pol, env.

Пр Рт РНКазаН Ипт

Ш

дкп

pol

env

■-1 И -2 □ -3

Рис.2 Схема строения МДГ4: 1 - длинные концевые повторы МДГ4 (ДКП); 2 -инсулятор МДГ4; 3 — кодирующая часть МДГ4. Предполагаемые домены рамки pol: Пр - протеиназа; Рт - обратная транскриптаза (ревертаза); РНКазаН; Инг -ингеграза.

Анализ нуклеотидной последовательности элемента, выделенного из МЛ (частичное секвенирование примерно 60% последовательности, а также подробный рестриктный анализ) не выявил никаких отличий данного элемента от охарактеризованного ранее [Ваеу А.А., е1 а1. 1985, Маг1ог е1 а!. 1984]. В то же время, МДГ4, клонированный из СЛ, имеет определенные отличия на нуклоотидном уровне, составляющие, в общей сложности, менее 1%. Проведенный ранее молекулярный анализ структурной организации МДГ4 в геноме D.melanogasteт показал, что клонированные из мух МЛ и СЛ варианты МДГ4 являются представителями двух, четко различимых подсемейств этого ретротранспозона. Эти подсемейства существенно различаются по представленности в геноме мух разных линий дрозофилы, а также в способности амплифицироваться в культуре клеток [Любомирская Н.В и др., 1993]. В табл.1 приведено сравнение нуклеогидных последовательностей двух вариантоп МДГ4 в нетранслируемой области. Можно видеть, что в ДКП различия составляют примерно 5% и представлены инсерциями, делециями и заменами единичных 1гуклеотидов.

Таблица 1. Сравнение нуклеотидных последовательностей в нетранслируемой области двух вариантов МДГ4. Указаны нуклеотиды, которые в копии 7К (клонированной из СЛ) отличаются от 6К (клонированной из МЛ). Полная последовательность СК не отличается от известной.

район позиция нуклеотиды 6К нуклеотиды 7 К

МДГ4 нуклеотида

82 А G

99 т С

129 С Т

131 G А

ДКП 133-134 GA GGA

181-182 TG TTG

219 т -

■251 т А

283 т С

296-297 тс СА

350 с С

433 А G

472 С т

602 А G

инсулятор 950 G Т

1005 С т

1105 А G

1171 G А

Интересен тот факт, что различий между 5' — и 3' — ДКП в составе одного элемента не обнаруживается. В районе инсулятора (табл.1), а также в кодирующей области (табл. 2) отличий значительно меньше (примерно 0.6%), причем все они представлены одиночными нуклеотидными заменами.

Более того, большинство замен в транслируемой области не меняют аминокислотной последовательности. Показаннные ранее различия в ретротранспозиционной активности двух вариантов МДГ4 связаны, очевидно, с различиями в их первичной структуре.

Таблица 2. Сравнение нухлеотидных и аминокислотных последовательностей кодирующей области двух вариантов МДГ4. Указаны нуклеотиды и аминокислотные остатки, которые в копии 7К (клонированной из СЛ) отличаются от 6К (клонированной из МЛ).

район. положение 6К 7K

мдг 4 нуклеотида нуклеотиды f аминокислоты нуклеотиды аминокислоты

ОРС 1 1241 т С

1343 G A

1568 G T

1811 Т С

2068 С Pro A Ills

2121 А G

2234 G A

2322 G Val A He

2386 G Gly A Asp

2454 л G

2896 С T

О PC 2 2928 с A

2928 с Thr A Asp

3091 с T

3107-08 АА Lys CG Arg

3784 А G

4000 Т С

4348 А G

4384 А G

4485 G Ser T Ile

4594 С T

4606 С T

5223 С Pro T Leu

ОРСЗ 5337 G Arg A His

5504 С Glu T Term

5573 С Pro T Ser

5749 С T

5902 т Phe A Leu

6070 А G

6129 Т Val С Ala

6193 G A

6362 Т G

6409 С T

6490 с T

6668 А Arg С Glu

6767 А Asn G Ser

6798 А С

6808 С T

6943 т с

3. Сравнение транспозиционной активности гибридных конструкций, содержащих различные комбинации участков "активного" и "неактивного" МДГ4.

Ранее был разработан метод определения ретротранспозиционной активности [Любомирская Н.В и др., /993], основанный на способности элемента образовывать новые копии ДНК в процессе обратной транскрипции конструкций, введенных в

культуру клеток П.Лус1е1. Исходная конструкция содержит укороченный с 5' —конца элемент МДГ4, не содержащий ХЛо/ сайг в 5' — ДКП(см.рисД4 дор.1 -2).

ЗЬоХ НэаГ Jijoi

I I -2

ЕГЁГЗД -3

Рис. 3. Схема строения МДГ4 и модель ретротранспозиции плазмидных конструкций (на примере рСУР(Хйо)б), использованных для трансфекции в клетки D.hydet 1 - длинные концевые повторы МДГ4 (ДКП); 2- кодирующая часть МДГ4. 3 — промотор белка гена теплового шока hsp70! Сайты рестрикции: Л'cö/(кодон ATG); SalGI; Pstl; Xhol. Звездочкой отмечен сайт рестрикции Pstl, отсутствующий в конструкции pGYP(JCüo)7.

Вновь образованные с помощью обратной транскрипции копии имеют восстановленный 5'—ДКП и Xhol—сайт, что легко выявляется Саузерн—блот— анализом ДНК, выделенной из

трансформированных клеток. ДНК обрабатывали рестриктазами Xhol и Pstl. Участок расщепления рестриктазы Xhol является маркером на вновь образующиеся копии, а Pstl используется как маркер, позволяющий различать два варианта МДГ4. В качестве зонда для гибридизации использовали Ncol—Pstl фрагмент длиной 1.1 т.п.н. из

первой ОРС. В этом случае введенные конструкции, в силу того, что плазмида обычно встраивается как таядемный повтор, можно идентифицировать по появлению фрагментов размером 10.2 т.п.н. в случае "неактивного" МДГ4 и 5.0 т.п.н. — в случае "активного". Вновь образованные копии, в которых восстанавливается Xhol сайт в 5' — концевом ДКП, можно обнаружить по появлению фрагментов длиной 7.0 т.п.н. и 2.2 т.п.н. соответственно.

На рис. 1 (см. раздел 1) представлена рестриктная карта базовых конструкций, использованных в настоящей работе. На их основе были получены гибридные конструкции двух типов: первая серия содержала 5' — концевые участки возрастающей протяженности одного варианта МДГ4, соединенные с соответственно убывающими по протяженности 3'—концевыми участками другого варианта МДГ4.

Серия гибридных конструкций, содержащих различные сочетания "активного" и "неактивного" МДГ4, была введена совместно с плазмидой, содержащей ген устойчивости к G418, в культуру клеток D. hydei, в которой эндогенный полноценный МДГ4 отсутствует. Трансфекция проводилась стандартным Са — фосфатным методом описанным DiNocera P.P., Dawid I.В. 1983, в смеси с плазмидой pUChsneo, содержащей ген устойчивости к антибиотику G418. Стабильные трансформированные линии отбирались по устойчивости к антибиотику G418. Суммарную ДНК из стабильных трансформированных клеточных линий выделяли через 20 — 40 сут. после трансфекции по мере достижения плотности трансформированных клеток 106\мл, обрабатывали рестриктазами Xhol и PstI и анализировали методом Саузерн —блот—гибридизации.

Анализ способности образовывать новые копии гибридными элементами показал, что в случае конструкций 6/7(Ncoi) и 7/6(Ncol), последняя амплифицируется более эффективно (полоса соответствующая новобразованной копии МДГ4 образуется значительно раньше) по сравнению с первой, т.к. полоса размером 2.2 т.п.н., соответствующая вновь образованным копиям, в линии, содержащей эту конструкцию, к моменту проведения анализа уже присутствует, в то время как в линии,

несущей конструкцию 6/7(ЛГсоТ), полосы размером 7 т.п.н., соответствующей копиям элемента с восстановленным 5' ДКП, еще не наблюдается (рис. 4 дор. 3, 4,схематически результаты также представлены на рис.5). Таким образом, нуклеотидная последовательность участка от 5' — ДКП до сайта Ысо1 (вся нетранслируемая область), по —видимому, не оказывает существенного влияния на ретротранспозиционную активность элемента. Кроме того, анализ гибридизации ДНК, выделенной из линий, содержащих различные конструкции данной серии, показывает, что области ОРС1 и начала ОРС2 (практически весь домен протеазы) до сайта Pvu.ll, а также ОРС2 и ОРСЗ после сайта АвиП, по-видимому, также не влияют на способность элемента образовывать копии ДНК, используя механизмы обратной транскрипции. Из этих опытов следует, что, вероятней всего, на различия в ретротранспозиционной активности оказывает влияние район ОРС2, расположенный между Pvu.II и АвиП сайтами рестрикции (см. рис. 1 и рис. 4 дор. 5—10,рис.5).

Чтобы исключить возможность кооперативного влияния на ретротранспозицшо близлежащих аминокислотных замен, были созданы конструкции второго типа, содержащие небольшие внутренние участки "активного" МДГ4 окруженного большими участками "неактивного", и наоборот, таким образом, чтобы в локализованном участке оставалось по одной — две аминокислотной замене. Анализ этих гибридных конструкций показал (см. рис.4, рис.5), что конструкция 7/6/7(Рш11—Крп1), содержащая лишь небольшой район "активного" МДГ4 в составе "неактивного", начинает амплифицироваться раньше, чем конструкция 6/7/6(Руи11—Крп1).

Чтобы исключить возможность кооперативного влияния на ретротранспозицию близлежащих аминокислотных замен, были созданы конструкции второго типа, содержащие небольшие внутренние участки "активного" МДГ4 окруженного большими участками "неактивного", и наоборот, таким образом, чтобы в локализованном участке оставалось по одной — две аминокислотной замене. Анализ этих гибридных конструкций показал (см. рис.4, рис.5), что конструкция 7/6/7(РуиЯ— Крп!), содержащая лишь небольшой район "активного" МДГ4 в составе "неактивного", начинает амплифицироваться раньше, чем конструкция 6/7/6 (РуиН-Л'рлТ).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

10.2 - —* 7.0 - ***

5.0 - «и» I»»

2.2

11 12 1314 15 16 1718 19 20

Рис.4 Гибридизация иР-меченного фрагмента ЛЯсвТ-Л//длиной 1.1 т.п.н. с фильтром, содержащим ДНК, выделенную из линий клеток, несущих различные конструкции, и обработанных рестриктазами ХЬо1 и РШ. Конструкции: 1— 6; 2-7;

3-6/7ЦЧсо1); 4-6/7(1Мсо1); 5-ЬП[РуиГГ)\ 6-7/6(Лт1Д); 7-6/7(Аи1#); 8-7/6(Л$ий);

4-ЬП(АраЦ\-, К-1/ЦАраИ)\ 11-6/7/6(№о/-РгаЛ); 12-7/6/7(Л'со/-Л-иВД- -13- 6/7/6(Лгго/-АжЛ|; 14-7/6/7(№о^-Ля1П); 15-6/7/6(Р№Я-ДрлД; 16-7/6/7(Рги//-Л>л//77^/7/6(Л-ц//-Аш//); 18-7/6/7(Лт|Л-Л_ти//);

19-ЬП/Ь[АтП-Ара11>; 1й-1 /ЬП\АзиН-АраИ). Размеры фрагментов указаны в тысячах пар нуклетидов (т.п.н.).

Об этом свидетельствует появление полосы размером 7 .0 т.п.н., соответсвутощей вновь образованным копиям конструкции 7/6/7 (Pvu.Il— Крп1), в то время как полоса размером 2.2 т.п.н., соответсвующая образованным с помощью обратной транскрипции копиям конструкции 6/7/6(РшИ—Крл/), еще отсутствует (рис. 4 дор. /5, /б, рис.5). Данные результаты подтверждаются также характером амплификации других

гибридных конструкций: во всех случаях, когда в конструкции присутствует участок "активного" элемента, расположенный между РшП и Крп1 сайтами (рис. 4 дор. 12, 14, 16, 18, 19, рис.5), появление полос, соотвествующих новообразованным копиям ДНК, наблюдается раньше, нежели в конструкциях, имеющих обратную организацию.

6 Ii'™ «'!->» 'I.

еты EC

ff7fVUJ E

67AsjU kVil^ij

Алпфкан) Кзсфумн<

1 -

шшшит

в7/6№х*ЛИ h'J ППИл^ e7/6MxWaJI M ЬЬК'К

+ +

&7/6РлЛ+^г1 ESO

&7FSFVUMaiI £

Л

+ +

+ + +

J

¿¡23 7в\лЛ

5Ш] 7/Wpil

Ж

] 7/В7№с№л11 1 7!&7№cMail

ЖЕ

J 7?E7RaJH^J1 Ц 7!&7Рл1МШ

ж

J 7/07A3ÜWSpdJ

Рпс.5 Сравнение способности к амплификации представленных конструкций.

Таким образом, были найдены две аминокислотные замены Thr — Asp (нуклеотид в положении 2928) и Lys—Arg (нуклеотиды в положении 3907, 3908) одна из которых или обе вместе, оказывают непосредственное влияние на эффективность ретротранспозиции. Данные аминокислотные замены расположены во второй открытой рамке считывания МДГ4. Одна из них находится на границе доменов, имеющих гомологию с протеазой и ревертазой ретровирусов . Возможно, что эта замена может оказывать влияние

на процессинг ферментативных продуктов ретротранспозона. Другая аминокислотная замена расположена во втором из семи ревертазных доменов и, соответственно, может непосредственное влиять на активность фермента. Чтобы прояснить этот вопрос, требуется более детальный сравнительный анализ ревертазной активности обоих вариантов МДГ4.

4. Изучение кинетики амплификации двух вариантов МДГ4.

Для исследования способности МДГ4 образовывать новые копии ДНК с помощью механизмов обратной транскрипции была использована описанная ранее модельная система [см.раздел 2], позволяющая не только сравнивать ретротранспозиционную активность различных вариантов МДГ4, но и наблюдать за амплификацией этого элемента. Целью этого этапа работы являлось исследование изменения во времени количества новообразованных в ходе ретротранспозиции копий ДНК двух вариантов МДГ4, а также их взаимовлияния в процессе амплификации ретротранспозона в культуре клеток, исходно не содержащей этот элемент.

Описанные ранее плазмидные конструкции рСУР(ХЛо)6 и рСУР(ХЛо)7 [см.раздел 2] вводили в культуру клеток £>.Лус1е1 линии ОН 14 как по отдельности, так и совместно. Стабильно трансформированные линии отбирались по устойчивости к антибиотику С418. Каждый из экспериментов проводился в нескольких повторностях. Чтобы зарегистрировать момент появления новообразованных копий МДГ4 и наблюдать за их амплификацией стабильные линии культивировали в течение двух месяцев с момента получения клеточных линий с плотностью клеток 106/мл. ДНК, полученную из трансформированных клеток, выделяли каждую неделю на первых этапах, и затем — через 3 недели. Выделение ДНК, обработку рестриктазами осуществляли как в разделе 2. В качестве зонда для гибридизации также использовали Мго/ — Ра И фрагмент длиной 1.1 т.п.н., выделенный из конструкции 6. Относительное количество вновь образованных копий МДГ4 определяли как отношение интенсивностей полос, соответствующих вновь образованным копиям и введенным конструкциям. Количество копий

встроенных в геномную ДНК исходных конструкций в течение времени эксперимента оставалось практически неизменным, что было определено по отношению интенсивности полос, соответствующих введенным конструкциям и клеточного гена актина (данные не приводятся). Для определения отношения интенсивности полос, выявляемых радиоавтографией после Саузерн — блот гибридизации, полученные автографы подвергали денситометрии (денситометр марки "ЗООА Computering Dencitometer Fast Scan "). Для количественного обсчета полученных путем денситометрии данных использовали программу MicroCal Origin office Version 2.8. Относительное количество вновь образованных копий МДГ4 определяли как отношение интенсивности полос, соответствующих вновь образованным копиям и введенным конструкциям с учетом фона. Для построения диаграмм использовали программу Microsoft Excel for Windows 95, Version 7. Результаты этих экспериментов представлены в виде диаграмм на рис. 6.

время, пни вр«мя, дни

I I "активная" копия ЕЯ "неактивная" копия

Рис.6 Кинетика амплификации двух вариантов МДГ4 при раздельном (а) и совместном (б) введении конструкций рСУР(Л!Ло)6 и рСУР(.Хйо)7 в культуру клеток О.ЬуЛе!

Саузерн—блот анализ геномных ДНК, выделенных из клеточных линий, трансформированных б и 7 плазмидами по отдельности, выявил значительные отличия в характере амплификации МДГ4. Появление новых копий ретротранспозона в линиях, содержащих плазмиду 7, было зарегистрировано только спустя 3 недели после получения клеточных линий с плотностью клеток 106/мл, (рис.ба). В случае плазмиды 6, новообразованные копии появлялись сразу же после получения линий. Более того, отношение между интенсивностью полос 7 т.п.н. , соответствущей ХЛо/ — фрагменту новообразованных копий МДГ4, и 10.1 т.п.н., соответствующей ХЬоГ — фрагменту введенных конструкций, всегда было меньше для' клеточных линий, содержащих плазмиду 7, чем отношение интенсивностей полос 2.2 т.п.н. и 5.2 т.п.н. в линиях, трансформированных плазмидой 6. Таким образом, оба варианта МДГ4 способны к обратной транскрипции и к образованию новых интегрированных копий ДНК в клетках 0.}\уйе1, но в случае рСУР(ХЛо) 6 эти процессы протекают более интенсивно. Результаты Саузерн —блот анализа клеточных линий, полученных в результате совместной трансфекции плазмидами 6 и 7, выявляют несколько иную картину (рис.66): появление новообразованной копии в случае "активного" МДГ4 (фрагмент 2.1 т.п.н.) наблюдалось, как и в первом случае, сразу же после получения линии. Вместе с тем, фрагмент длиной 7 т.п.н., соответствующий новообразованнвм копиям "неактивного" МДГ4 регистрировался раньше, чем в том случае, когда клетки содержали только эту конструкцию. Это указывает на возможное влияние "активной" копии на уровень амплификации "неактивной", оказывающей транс — действие как помощник. Анализ способности "активного" и "неактивного" вариантов МДГ4 к обратной транскрипции, показал что функциональные различия носят количественный, а не качественный характер. Во всех исследованных случаях"активные" копии МДГ4 амплифицируются более эффективно, чем "неактивные", причем при совместном введении в клетки О.Ьуйе1 "активный" элемент способен ускорять амплификацию "неактивного". В разделах 2, 3 было показано, что

структурные различия двух подсемейств МДГ4, ответственные за различия в ретротранспозиционной активности, затрагивают начало ревертазного домена ОРС2 ретротранспозона. Таким образом, можно полагать, что функцию помощника в обратной транскрипции "неактивного" элемента выполняет ревертаза "активного", существляющая транс—действие.

В ходе данных экспериментов выявилась также зависимость скорости амплификации ретротранспозона от количества его копий, однако более строгие выводы о характере такой зависимости можно будет сделать только после точного количественного анализа скорости образования новых копий при разных исходных условиях, различающихся по количеству встроившихся в геном введенных конструкций.

ВЫВОДЫ:

1. Проведен подробный сравнительный структурно — функциональный анализ двух вариантов ретротранспозона МДГ4 D. melanogaster.

2. Анализ кинетики амплификации новообразованных копий МДГ4 показал, что функциональные отличия двух вариантов МДГ4 в культуре клеток дрозофилы носят количественый, а не качественный характер . Во всех исследованных случаях "активные " копии МДГ4 амплифицируются более эффективно, чем "неактивные".

3. Анализ способности образовывать новые копии ДНК гибридными конструкциями, содержащими различные комбинации участков "активного" и "неактивного" МДГ4, позволил выявить две аминокислотные замеены Trp—Asp и Lys—Arg, расположенные на границе предполагаемых доменов протеазы и ревертазы гена pol, которые оказывают существенное влияние на эффективность ретротранспозиции.

4. При совместном введении в клетку двух вариантов МДГ4 "активный" элемент МДГ4 способен ускорять амплификацию ^ "неактивного", оказывая транс — действие. Выявлена также зависимость скорости амплификации ретротранспозона от количества его копий.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Н. В. Любомирская , Ю.Б. Смирнова, С.Н. Аведисов, С.А. Сурков, Ю.В. Ильин. Сравнительный анализ структуры и ретротранспозициошюй активностидвух вариантов мобильного элемента D.melanogaster МДГ4 (gypsy). Молекулярная биология, 1998,т.32, с'/° $ -¿2 9

2. Ю.Б. Смирнова, Н.В. Любомирская, академик Ю.В. Ильин. Изучение кинетики амплификации двух вариатов ретротранспозона D. melanogaster МДГ4. ДАН. 1998. в печати.

3. J.B. Smimova. Comparative analysis of retrotransposition activity of two gypsy variants. Horizontal transmission of gypsy. The material of 8th European

students conference of Charité for young doctors. Berlin, 1997, pl7

»